CN1328605A - 重组细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明披露重组细胞的制备方法,特别是可增强表达氨基酸序列的重组哺乳类细胞系的制备方法。本发明亦披露能制造高产量氨基酸序列的重组哺乳类细胞系。本发明的方法与重组细胞系可适广泛用途,包括高效大量制备重组蛋白质与多肽。

Description

重组细胞的制备方法
发明的领域
本发明涉及一种能表达至少一种氨基酸序列的重组细胞的制备方法。本发明具有广泛应用性，包括用于制造具有稳定性及可表达高产量的所需蛋白的重组哺乳类细胞。
发明的背景
目前已有许多制备高产量的所需氨基酸序列的尝试，借助导入外源(异种)(heterologous)核酸进入宿主细胞内，并表达宿主细胞内的核酸。真核细胞，特别是哺乳类细胞已被加以应用而产生混合的结果。例如，尽管有许多改良的高产量氨基酸序列的重组哺乳类细胞的制造方法，但大多数细胞并无法表达足够量的核酸。因此，在此领域仍迫切需要可以高表达经导入核酸的重组哺乳类细胞的制备方法。
一般而言，有二种方法可被用来增加哺乳类细胞的异种核酸表达。其一为藉由如抗药性扩增细胞筛选技术以增加该异种核酸的拷贝数量。其二为藉由如重组技术向该核酸中增加一种或更多有益控制元素，以增加细胞内该核酸的表达。参见Kaufman，R.J.及P.A.sharp于1982年发表的“分子生物期刊”(J.Mol.Biol 159：601)；Sambrook等人于1989年发表的“分子克隆”(Molecular Cloning)(第2版)、及Ausubel等人于1989年发表的“分子生物近期报告”(Current Protocols inMolecular Biology)(John Wiley&Sons，New York)。
特别是对于抗药性扩增，已有报告提出它涉及到二种基因的细胞转化，其中一种基因为编码标的氨基酸序列，如异种蛋白质；另一种基因为编码选择性基因标记(selectable gene marker)，如二氢叶酸还原酶(DHFR)。在该基因标记为DHFR的情形下，将转化细胞在选择氨甲蝶呤(MXT)药物之存在下培养。一般该MXT的细胞毒性可藉由上述DHFR的表达而予以显著地移除。转化细胞得以存活，是因其增加(扩增)DHFR拷贝数量至足够高的数量。而编码所需氨基酸序列的核酸序列亦被扩增，因此能以高表达该所需氨基酸的序列。参见前述的Kaufman，R.J.与P.A.Sharp文献。
然而，抗药性扩增及相关技术已普遍认知它具有若干缺点。例如，使用该技术会产生绝大多数的重组哺乳类细胞系(cell line)相当耗时，且需耗费数月之久。另外，已知当欲扩增异种核酸时，将负向影响到标准核酸定序的方法。另外，当需要面临长期严格的筛选压力时，很难维持足量的核酸拷贝数量。对于细胞筛选策略上，筛选期间的延长会增加费用，例如制备异种蛋白质以做为医药用途时，还会出现一些涉及法律规定等问题，除此之外，借助抗药性扩增并无法增加特定异种核酸的表达量，而使该核酸产生量不足以供研究或商业所需。
另外关于抗药性扩增的问题也包含经克隆细胞系的基因不稳定性，这样的问题亦非常显著。例如，此方法常常制造出来自不稳定基因的扩增所产生的重组细胞，如形成双微小染色体(double minute chromosomes)。当去除具筛选药物时，这些细胞可能丧失所需的特性。参见Kaufman，R.J等人于1985年发表的“分子细胞生物学”(Mol.Cell.Biol.5：1750)所引证的参考文献。
除此之外，大部份抗药性扩增技术最佳应用上需使用高特异性的细胞、载体及/或细胞生长条件。例如，大部份方法使用到以特殊方式基因操作处理的宿主细胞。这种突变细胞并不适于某些应用上。如前述的困难度涉及DHFR及MTX的抗药性扩增作用即无法适当作用于带有正常DHFR基因的细胞上，而要移除该正常基因功能时常需经过耗时费力的处理。参见Wigler等人于1980年发表的(美国)国家科学研究院会刊[PNAS(USA)]3567，及Urlaub与Chasin于1980年发表的(美国)国家科学研究院会刊77：4216。
有关使用于特殊载体及生长条件的DHFR/MTX扩增方法，已披露若干缺点。参见如上文所提及的Kaufman与Sharp发表的文献；及Schimke，R.于1984年发表的“细胞”(Cell，37：705)。以及美国专利号5,686,263、4,956,288、5,585,237和其中的参考文献。
因此对于能制造富变化性的重组细胞、及制造具基因稳定性重组细胞系等方法，相当具有实用性。特别是需要一种制造能显著降低或避免使用到高特异性的细胞、载体及/或细胞生长条件等重组哺乳类细胞系的方法。更需要一种由可制备高产量标的氨基酸序列，如异种蛋白质的方法制得的重组哺乳类细胞。
发明概述
本发明是关于制备重组细胞的方法，特别是制备基因稳定性及可高量表达至少一种氨基酸序列的重组细胞的方法。一方面，本发明提供一种制备可表达高产量异种蛋白质的重组细胞系的方法。该方法一般包含将至少一个编码氨基酸序列的一个载体导入宿主细胞中，而使该细胞接受有益于分离出可产生高产量的氨基酸序列的重组细胞系的条件。优选的是，该方法可制造出高产量氨基酸序列而又可明显减少使用高特异性的宿主细胞、载体及/或生长条件。亦提供一种由本发明方法制造的重组哺乳类细胞系。
本发明更尤其涉及一种可生成具基因稳定性及可高量表达至少一种标的氨基酸序列的重组哺乳类细胞系的方法。本发明的一个实施例，是藉由将第一个编码氨基酸序列的载体导入宿主细胞中以实质增强该氨基酸序列的表达。该第一载体包含至少一个可选择的基因，典型称为第一选择序列(first selectable sequence)；其经可操纵联结在编码氨基酸序列片段上。另外，该第一载体视需要可编码多个氨基酸序列的拷贝。该第一载体若需要可以经一次(单次)或一次以上(多次)方式导入宿主细胞中。然后于有益于表达氨基酸序列的条件下培养该宿主细胞，并分离出可在第一高表达量下表达氨基酸序列的重组细胞系(第一高表达细胞)。
本方法进一步包含将编码氨基酸序列的第二载体导入该第一高表达细胞中。该第二载体可与该第一载体相同或不同，并可视需要编码多个氨基酸序列之拷贝物。该第二载体若需要可以经一次(单次)或经一次以上(多次)方式导入至该第一高表达细胞中。在有益于表达氨基酸序列的条件下培养该含第二载体的重组细胞，并分离出可在第二高表达量表达氨基酸序列的细胞(第二高表达细胞)。
如上所论，目前已知经事先细胞筛选处理过的细胞系，特别是抗药扩增技术处理过的细胞系具有若干缺点。特别是包扩基因不稳定性，及需要使用高特异性细胞、载体及/或生长条件。本方法明显地克服上述缺点，提供可制备高产量氨基酸序列的，具有基因稳定性的细胞系。更进一步地讲，本方法一般较现有技术更具有灵活性，并对广泛载体具兼容性。几乎所有可经转染的细胞皆可使用于本发明，包括绝大多数的初级、二级或经培养的哺乳类细胞。本方法若需要亦宜于众多具选择性或非选择性的生长条件下提供特殊的可经转染的哺乳类细胞的生长。
借助直接或间接筛选可高表达氨基酸序列重组细胞系，而使本发明更具灵活性。例如，本发明的一个实施例中，可经选择至少一个由载体编码的细胞表面标记，间接选择该重组哺乳类细胞。经本发明的细胞表面标记的筛选，可促进有效分离出可高量表达该氨基酸序列的细胞系。如文中讨论的那样，得到的细胞系具有基因稳定性，并可减少或除去在细胞系制造上使用高特异性细胞、载体及/或生长条件。
本发明另一特别实施例中，第二高表达量实质上较该第一表达量高出至少约2至10倍或更多。用以决定氨基酸序列如蛋白质的方法为本项领域熟知，并包含如抗体反应性等相关技术。
在更特别的实施例中，本方法进一步包括将可编码氨基酸序列的第三载体导入该第二高表达细胞中，然后使该细胞接受有益于在比第二表达量更高的第三表达量表达氨基酸序列的条件。分离出在第三表达量表达氨基酸序列的细胞而制备细胞系(第三高表达细胞)。该第三载体优选编码至少一种标的氨基酸序列，并且可与第一或第二载体(或二者)相同或不同。若需要该第三载体可以经一次(单次)或经一次以上(多次)方式导入该第二高表达细胞中。相对第一或第二高表达细胞，该第三高表达细胞典型上表现出具有增高的氨基酸序列表达。
在本发明的另一特别实施例中，本方法进一步包含将至少一个编码氨基酸序列的载体导入该第三高表达细胞中，优选导入一个这种载体，并使该细胞接受有益于在比第三表达量更高的情况下表达氨基酸序列的条件。该方法进一步包括至少重复一次该导入及接受该等条件，优选于约2次到10次之间或更多，以分离出在比第三高表达细胞更高表达量的表达氨基酸序列的细胞系。至于该重复操作步骤的次数，可由一些参数条件订定，但特别以视所需要的表达量来制定更好。
在另一实施例中，在有益于选择出该第一载体的条件下培养该宿主细胞的步骤，又包括将宿主细胞生长于具选择性的培养基中。优选的是，该选择性培养基包含至少一种药物，且通常该药物可用以筛选该第一可选择序列。文中披露的载体，优选包含选择性核酸序列，如该第一及第四载体，其一般系编码可选择地氨基酸序列。可用来筛选载体的药物其叙述与实例如下所述。
常常优选的情况是将第二或第三载体(或二者)与至少一种其它的载体(文中有时称为“第四”或“第五”载体)，一起共同导入细胞中，而所述的其它载体编码至少一种可选择序列，特别是细胞表面蛋白质的选择性细胞表面标记。更令人惊讶地发现，共同导入编码选择性细胞表面标志载体时，可以促进产生能高表达所需氨基酸的十分有用的重组哺乳类细胞系。例如发现若依据本发明共同导入该载体，可于生成细胞系的同时，减少或完全不使用高特异性的细胞、载体及/或生长条件。除此之外，本发明方法有利于制备基因稳定性的重组细胞。
本方法另一实施例中，将第二载体导入第一高表达细胞中的步骤，还包括将第四载体导入该细胞。如文中讨论的那样，该第四载体是编码至少一种选择性序列(文中称为“第二”选择序列)，优选为具选择性的细胞表面标记。该第四载体可与本方法的其它载体相同，但大部份情形下，该第四载体不同于任何或所有该等载体。在另一实施例中，该第四载体包括操纵联结至编码标的氨基酸序列片段的第二选择序列。在更特别的实施例中，本方法还包含将细胞生长在含有至少一种可用以筛选该第二选择序列的药物的培养基中。
第四载体可编码细胞表面标记的实施例中，该方法优选进一步包含以层析法、细胞淘洗法(cell panning)、流式细胞计量术(flow cytometry)、免疫沉淀、抗体结合的至少一种方法分离出可表达选择性细胞表面标的的细胞。一般而言，该分离技术之一可用于分离可表达细胞表面标记的细胞。经过分离，可获得由载体编码的可高表达氨基酸序列的细胞系。
本方法另一实施例中，将第三载体导入第二高表达细胞中的步骤，还包括将第五载体导入该细胞。在特定实施例中，该第五载体编码至少一种选择性序列(文中称为“第三”选择序列)。该第五载体可相同或不同于本文中披露的任一载体。在更佳的实施例中，第五载体包含若需要可操纵联结于编码氨基酸序列片段的第三选择序列。此细胞接着接受易于在比第二表达量高的第三表达量下表达该氨基酸序列的条件。优选的是，此方法还包括使细胞生长在含有至少一种药物及优选一种筛选第三可选择序列的药物的选择性培养基中。
另外，优选的第五载体还包含编码可选择细胞表面标记(其可相同或不同于由第四载体编码的细胞表面标记)的序列。若需要，可选择的细胞表面标记可操纵联结于编码氨基酸序列的片段。
该方法较好又包含以层析、细胞淘洗法、流式细胞计量术、免疫沉淀、抗体结合中至少一种方法分离出由第五载体编码的，可表达选择性细胞表面标记的细胞，以视需要来分离这些由第四或第五载体(或二者)表达的可表达细胞表面标记的细胞。经过分离操作，可获得由载体编码的可高表达氨基酸序列的重组细胞系。
本发明更特别的第二高表达细胞一般比第一高表达细胞可表达至少约2倍或更多的氨基酸序列，其是藉标准蛋白质定量技术如定量凝胶电泳法、层析法及免疫技术如Western免疫印迹法)、连接免疫吸收分析技术(ELISA)及抗体反应来决定。更特别是藉抗体反应性测定时，第二高表达细胞比第一高表达细胞表达约3至约40倍的氨基酸序列。
根据标准蛋白质序列定量技术测定时，特别有兴趣的第三高表达细胞一般比第二高表达细胞表达至少约2倍以上的氨基酸序列。更特别者，以抗体反应性测定时，该第三高表达细胞比第二高表达细胞而表达约3倍至约40倍的氨基酸序列。
本方法更特别的实施例中，第一、第二、或第三载体各可独立编码第一抗药基因(文中有时称为基因标记)、选择性细胞表面标记及第二抗药基因。此实施例中，各载体经操纵联结于标的氨基酸序列的片段。另外，该第四及第五载体各可独立分别编码第三抗药基因及其它细胞表面标记。该第一、第二及第三抗药基因分可视需要互相为相同或不同。有关抗药基因及选择性细胞表面标记的更详细叙述如下。
如本发明所叙述的，先筛选适当的哺乳类宿主细胞，而不需要使用高特异性载体或生长条件以最适表达异种蛋白质。优选的是哺乳类宿主细胞不表达异种蛋白质至可测量的剂量。然而于某些情况，适当的哺乳类宿主细胞已可表达蛋白质如同种蛋白质至基础量(backgroundlevel)(ie，basal)。在此情况下，本发明可应用在提高比基础量还高的同种蛋白质的表达。或者，本方法亦可用于提高所需异种蛋白质或多胎序列的细胞表达。更特别的哺乳类宿主细胞由下列提供。
将第一载体导入哺乳类宿主细胞后，于对第一载体具选择性的生长培养基中分离出第一高表达细胞。第二高表达细胞的生成是由将编码氨基酸序列的第二载体导入第一高表达细胞中而完成的。在一个实施例中，第一及第二载体编码异种蛋白质的一个拷贝物，且二者大致上相同。导入该第二载体时，同时导入另一编码选择性细胞表面标记的载体(“第四”载体)。在有益于选择出细胞表面标记的条件下分离出该第二高表达细胞，并可视需要包含将该细胞生长于此具选择性的培养基中。此实施例中，于筛选细胞表面标记时，亦筛选出由第一及第二载体编码的，而且可高度共表达(co-expression)该所需氨基酸序列。因此，此实例可明显减少使用高特异性宿主细胞、载体及生长培养基来筛选细胞。
本发明可用以广泛制备重组细胞，且特别是能高表达至少一种所需氨基酸序列、或部份氨基酸序列，例如功能性蛋白质片段的哺乳类细胞系。例如，本发明方法可用于表达免疫标的的氨基酸序列，如免疫球蛋白链(重链或轻链)或其功能性片段。更特别的标的氨基酸将于下文讨论。
本发明与先前细胞筛选技术、特别是公知的抗药性扩增方法相比，更具有显著的优点。例如上文所论，在大部份抗药性扩增方法应用上，一般需使用高特异性的细胞系、载体及生长条件。而在许多情形下，这些细胞已经由遗传工程操作来阻断它对药物的抗药性，因而不常表现出良好的细胞生长特性。再者，该细胞可能较难以制备及/或维持，并且特别不适用于许多特殊的细胞筛选计划。本发明提供可生成重组细胞系的方法，而减少使用或不使用这些高特异性细胞系。
再者，本方法可借助将异种核酸导入宿主细胞基因体来强化重组细胞系的基因稳定性，减少或通常可完全避免形成高度不稳定的染色体。
本发明可提供其他优点，例如，本方法与先前的重组哺乳类细胞生成方法相比更具灵活性，而且可广泛用于哺乳类表达载体。相反，大多数的先前细胞筛选技术如抗药性扩增，适用于高特异性的载体上。因此，目前已知许多抗药性扩增技术的载体，因太大而难以操作处理。此外，许多先前细胞筛选技术使用的最适载体，因其专属性质而通常无法于需要时得到。本发明则可提供可与广泛的哺乳类表达载体兼容的方法来解决上述问题。
如文中所述，本文所叙述的至少一种载体可编码标的氨基酸的部份序列。如文中所示，对于特殊的完整长度(full-length)的异种蛋白质而言，第一载体可编码该蛋白质的第一部份及第二载体、第三、第四及第五载体的至少一个载体可编码该蛋白质的其它相同或不同的部份。本实施例中，载体所编码的蛋白质序列的总数(totality)实质上同于蛋白质之全长。其它实施例中，第一载体(或任何其它载体)可编码该全长蛋白质，及至少一个他种载体(如第二、第三或第四载体)可编码此蛋白质的特殊部份。而剩余载体可使用于，例如视需要导入蛋白质序列的额外部份或甚至可导入全长蛋白质序列。
本方法导入标的氨基酸序列部份而提供许多优点。例如，本方法可用于提供一个或多个氨基酸序列部份的高度控制扩增方法。即，含有完整序列的该氨基酸序列的特殊部份，在此其它序列扩增之前或同时可在特殊的细胞(如，第一或第二高表达细胞)中扩增。本发明因此提供一个或甚至数个标的氨基酸序列的连续及同步表达(sequential & coordinate expression)。
如其更特别的描述，第一载体可编码多重-亚单位蛋白(同种或异种)的第一亚单位，而第二载体可编码该相同蛋白的第二亚单位。本实例中，编码第一亚单位的第一载体导入宿主细胞中，而筛选出第一高表达细胞。编码第二亚单位的第二载体导入该第一高表达细胞，筛选出表达该第一及第二亚单位的第二高表达细胞。例如，若该多重-亚单位蛋白为二聚体时，于可增强第一及第二次单位表达之条件下，该第一高表达细胞中特别形成该蛋白质。因此，本发明尤其可用于在连续及高度控制的亚单位表达条件下的多重-亚单位蛋白的组合及其稳定度分析。
本发明特别对免疫标的蛋白，如免疫球蛋白、特别是免疫球蛋白重链与轻链等的连续及高度控制组合上特别有用。
一般而言，本发明提供扩增过程的明确弹性度与控制，促进实现多重-亚单位蛋白质组合计划的完成。例如，该方法可应用于增强亚单位的制造，如可于细胞内达到预定的高表达量。相反的，大部份先前技术且特别如抗药性扩增技术，实质上具有较低之灵活度，并且不提供亚单位组合的控制。
另一方面，本发明提供细胞系，特别是由本方法制得的重组哺乳类细胞系。该细胞系具有基因稳定性，并经特别筛选以高表达出氨基酸序列或其部份。本发明方法特别提供筛选出可高表达至少一种异种蛋白的重组哺乳类细胞。
本发明的特殊方法亦提供许多其他优点。例如可以比其它包含大部份先前的药物扩增方法更短时间内完成的筛选方法生成重组哺乳类细胞系[(有时称之为“高产量细胞系”(“high producing cell lines”)或相关用语)]。除此之外，与大多数先前的方法相比，本方法使用较少的细胞操作步骤制备出具高产量的细胞系，因此可降低人工及培养基材料的费用。
文中披露的所有文件全部并入以参考。非限制性的实施例用来说明本发明。
附图简要说明
图1A及图1B为本发明所使用的载体说明图示。图1A中为载体pJAIgG4TF编码嵌合式抗组织因子(TF)重链与轻链免疫球蛋白。图1B为载体pDRHK编码与人类免疫球蛋白k常数区融合的单链HLA-DR2/MBP分子。
图2为于T25组织培养瓶静态培养下大量制备的重组嵌合式抗-TF抗体的图示。这种可制造大量抗-TF抗体的重组细胞系，是经连续三次转染后分离。此高产量重组细胞系分别命名为H9G12、3D2A9及A11B5。
图3为在生物反应器中高量制备重组嵌合式抗-TF的图示。可制造大量抗-TF抗体的重组细胞系，是经连续三次转染后分离。第一次及第三次转染后分离的高产量重组细胞系分别命名为H9G12及A11B5。
图4为在T25组织培养瓶静态培养下大量制造的重组sc-DR2/MBP-Cκ的图示。可制造大量sc-DR2/MBP-Cκ融合蛋白的重组细胞系经连续三次转染后分离。此高产量重组细胞系分别命名为A5B4、DR2H4及B9。
发明详述
如上所述，本发明提供广泛适用的细胞制备方法，特别是重组细胞系的制备方法，特别是提供具有基因稳定性、以及可制备高表达同种或异种标的蛋白的重组哺乳类细胞系的制备方法。如文中所述，本发明相当具有灵活性、可使用于能生产高表达量蛋白质的高度实用细胞系，可明显避免使用高度特殊的细胞、载体及/或生长条件。本发明亦额外提供可制备高表达量蛋白质的重组哺乳类细胞系。
一般而言，本发明最佳应用可藉由使用已知的操作技术来完成。例如公知有下列技术：DNA分离技术、表达DNA的载体之装配与筛选、核酸纯化与分析、制备重组载体DNA的特殊方法、使用限制性酶DNA裂解技术、连接DNA、使用稳定或瞬时方式将包含载体DNA的DNA导入宿主细胞技术、用选择或非-选择培养基培养宿主细胞技术、用以筛选及维持稳定或瞬间表达DNA的宿主细胞方法。一般参见Sambrook等人及Ausubel等人的上述参考文献。
本发明一方面提供一种生成重组哺乳类细胞系的新方法。该重组哺乳类细胞系有时将称为“高产量”(“highproducing”)细胞系或相关用语。而用于细胞系制备氨基酸序列量中的“高量”(“highlevel”)及“高产量”或类似者，是指由本方法的细胞系制备的氨基酸序列量，相比亲代(parental)细胞或亲代细胞株，高出至少约2倍，且较好高出其约3倍至约40倍或更多(某些异种序列不存在于亲代细胞系内)。
本文中由重组细胞系制备的特别氨基酸序列量的测定方法，为本领域技术人员所熟知的，它包括层析方法；如蛋白质凝胶电泳，及免疫技术，如Western印迹及ELISA。更特别的是，凝胶电泳法包含使用香豆司蓝(Coumassie blue)或银染色法来检测及定量蛋白质或胜肽序列。抗体反应性分析为优选的蛋白质定量法。
该“抗体反应性”是指介于指定抗体与由细胞或细胞系制备的氨基酸序列之间的特异性结合。该名词进一步表示介于氨基酸序列[其上的抗原决定部位(epitope)]与不与其它分子结合之抗体间形成特殊专一配对；该测定是本领域公知的如西方(Western)印迹法、ELISA、RIA、凝胶移动性转移分析、免疫分析、竞争性分析、饱和度分析或其它适当的氨基酸序列结合分析。一般可参考：Harlow及Lane的“抗体：实验手册”[A Laboratory Manual，GSH Publications，N.Y.(1988)]中披露有关于上述及其它相应的分析。
该“亲代”是用以表示宿主细胞或细胞系的“祖先”(ancestor)，而其可用于制备后续的细胞系。亲代细胞的说明是为用于制备第一高表达细胞的适当宿主细胞。该第一高表达细胞又可为用于制备第二高表达细胞的亲代细胞系。若无其它说明，细胞系为来自单一祖先细胞的细胞克隆群。制备细胞系的方法为公知的，并包含熟知的连续稀释技术。可参考上文所列的Ausubel等人所列参考文献。
依据本发明之一目的，将包含至少一种选择性序列及优选为一种经操纵联结于编码该蛋白片段的选择性序列(第一选择序列)的第一载体导入细胞内，而获得可增强表达特定氨基酸序列的哺乳类宿主细胞。在细胞培养、分离出可以第一高表达量表达蛋白质细胞(第一高表达细胞)后，再将编码蛋白质的第二载体导入该第一高表达细胞内。一般优选为导入该第二载体时伴随导入另一载体(如，第四载体)，此另一载体可编码至少一种且优选为一种选择性细胞表面标记。然而，其它实施例中，第二载体可同时编码蛋白质及至少一种细胞表面标记，优选为此标记中的一种。细胞接受有利于在比第一表达量高的第二表达量下表达氨基酸序列的条件。优选的情况可筛选出至少一种细胞表面标记，并且不需使用高特异性的细胞、载体及生长条件。然后分离出可在第二表达量表达蛋白质的细胞系，以制备第二高表达细胞。
文中披露的“分离”特异性的细胞或细胞系，意指经过纯化处理达到至少约80％至95％(w/w)的均一性(homogenity)的细胞。大部份用途中，以高纯度的纯化细胞如至少约98％至99％均一性者(w/w)更佳。纯化后，细胞可应用于如细胞转染或可应用已知的连续稀释细胞系技术等的后续技术操作。
如文中所论，该第一及/或第二载体可视需要以经一次(单次)或经一次以上(多次)方式导入细胞中，优选为介于约2次至约20次之间，更佳为介于约2次至5次。至于选择一次或多次导入该第一及/或第二载体于细胞中，则可由数个参数，如指定所需的加强氨基酸序列表达量及标的的特殊氨基酸序列量来决定。
更佳的实施例中，用于筛选第二高表达细胞的条件亦包括筛选至少一个细胞表面标记，且优选为一个细胞表面标记，而该标记由被共同导入第一高表达细胞内的其中一个载体所编码。如文中讨论，这些载体可为第四或第五载体。
须强调本方法的此实施例较之先前表达系统如抗药性扩增技术具更显著的改进。例如，借助共同将载体导入细胞中的方式，经由筛选细胞表面标记而选择出第二高表达细胞，而许多可能产生的问题已于前述讨论过。更重要的是本发明连续导入第一及第二载体方式可增加表达产生氨基酸序列的量，高于氨基酸序列的总和。
“氨基酸序列”一般指由20种氨基酸内的任何氨基酸所构成的聚合物，而与氨基酸大小无关。虽然该名词于文中用以表示蛋白质，但应了解除非特别说明，该名词包含多肽和肽。此氨基酸序列可编码完整长度的蛋白质(有关于表达细胞的异种或同种蛋白质)或其部份如功能性片段。更特殊的氨基酸序列如下所述。特别优选的氨基酸序列为免疫球蛋白的重链、轻链、或其功能性片段。
该应用于氨基酸序列的“功能性片段”，是指氨基酸序列中的至少一个片段中具有至少一个完整长度氨基酸序列的活性。关于蛋白质序列，该等活性包含特异性结合及酶活性。由适当分析法测定的优选功能性片段具有至少约70％的完整长度蛋白质活性，或更优选的是介于约80％至95％者。
该“经操纵联结”是指于功能性关系中的多核苷酸组件的联结。当核酸与另一核酸置于功能性关系中，依据本发明，该核酸即为“经操纵联结”。特别是，该经操纵联结的序列可位于相同细胞内的相同或不同载体上。例如，当启动子或增强子经操纵联结于该特殊密码序列时，则该启动子或增强子能影响特殊密码序列的转录。即例如经操纵联结是指经联结的DNA序列为邻近者；并且当需要结合二种蛋白质密码区时，该经联结的DNA序列为邻近且位在密码读取框架内。然而在有些情况下，经操纵联结的序列可位于不同的载体上。如所说明的那样，编码多重亚单位蛋白质的一个亚单位的载体序列，是经操纵联结于编码该蛋白质的另一亚单位的另一载体序列(结合伙伴，binding partner)。
本发明方法可有效并高度适用于广泛的宿主细胞，特别是适合做组织培养的宿主细胞。典型的是，该宿主细胞为真核者，优选为在标准培养基制备中具良好生长特性的哺乳类细胞。大体上，本发明可使用几乎任一非-微生物细胞，不论它是否已事先经转化，只要能高量表达所需氨基酸序列者皆适用。上述各类细胞为本领域所公知，包含CHO、CV-1、HeLa及其它细胞。一般可参考上文所列的Sambrook等人及Ausubel等人的参考文献；以及美国菌种培养物保藏中心(American Tissue Type Culture Collection)(10801 University Boulerard，Manassas，Virginia)。
由上述及以下的范例更显而易见，广泛的载体以及特别是哺乳类表达载体，皆可使用于本发明。所谓特别载体一般包含作为自我复制的适当调节序列，优选为可在所需宿主细胞或细胞系中筛选出。
“载体”更特别定义为能将任一标的的核酸序列导入宿主细胞中，并能表达该标的核酸序列者。该标的核酸序列优选可编码上述氨基酸序列的所有部份或其重要部份。合适的载体可包含但不受限于：直链核酸序列、质粒、粘粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、游离体(episomes)以及外染色体DNA。另外还包括病毒DNA及病毒RNA。特别是该载体可为重组DNA。本文中“表达”(expression)或“基因表达”(gene expression)是指制备该标的核酸序列蛋白质产物，包括DNA转录及RNA转录的翻译。
可使用于本发明的更特别的载体包括至少一种具选择性核酸序列，通常为一个序列。就说明目的而言，选择性序列有时表示当该序列编码细胞内序列时的具选择性基因标记(或相关术语)，或为当该序列编码细胞表面蛋白质时的细胞表面标记(或相关术语)。
很明显，广泛种类的由载体编码的选择性序列者可兼容适用于本发明。优选的载体可促进含有被共同导入载体或其它载体的细胞或细胞筛选，可由广泛的技术包括曝露在细胞毒性药性作用下的细胞实际存活率来达成。一般可参考SouthernP.J.等人于1982年的分子应用概论[(J.Mol.Appl.Gen 1∶327)、上文所列的Sambrook等人及Ausubel等人的参考文献。
例如，本发明中使用的选择性基因标记说明，对某些营养变异型真核细胞(auxotrophic eukarytotic cell)，如中华大颊鼠卵巢(CHO)细胞而言，包括DHFR、氨基糖苷抗生素G418，潮霉素B[hygromycin B](hmB)]、新霉素磷酸转移酶II基因(neo)、嘌呤霉素(puromycin)、及腺嘌呤脱氨酶基因(adenosine deaminase gene)等。在某些情形下，经载体编码的所需氨基酸序列可自行作为充分的选择性标记、或者可正向影响该选择性标记的功能。在该氨基酸序列可自行编码该选择性标记的情况下，则载体不需包括另一不同的选择性标记。可参考Southern P.J.等人于1983年发表的“分子生物杂志”)(J.Mol.Biol.150∶1)、上文所列的Sambrook等人及Ausubel等人的参考文献，及文中披露中有关基因标记的其它参考文献。
如文中所论，该选择性核酸序列可编码合适的细胞表面标记，特别是细胞表面蛋白质。该细胞表面标记的范例包括细胞表面受体、醣蛋白、碳水化合物、蛋白质、脂蛋白质、主要组织兼容性复合物(MHC/HLA)、抗体、抗原或其功能性片段。更特别的细胞表面标记包括免疫标的的醣蛋白，如典型的T-细胞表面上的CD(分化群组)醣蛋白，诸如包括CD2、CD3、CD4、CD8及LFA-1。更特殊的标的糖蛋白为CD4分子，特别是该分子的功能性片段。可参考由InVitrogen公司提供的Capture TecTM系统。
如上文讨论及下面的示例中，可表达特殊细胞表面标记的细胞可经由一种或不同技术的组合加以分离，例如包括以层析、细胞掏盘洗选法、流式细胞记录仪、抗体结合或免疫沉降方式等至少一种方式分离出细胞。优选的方法为如下讨论的有关磁性选择(magnetic selection)的层析法。
该“功能性片段”用于定义选择性细胞表面标记，是指如CD4醣蛋白的标记部份可做为与另一免疫分子如类似单株抗体的抗体做特异性结合。上述该名词是指包括可编码功能性片段的核酸序列。
一般而言，一旦选择合适的选择性序列后，该选择性序列经操纵联结于一个或更多的调节序列，因此经编码之氨基酸序列可定位于载体；如邻近于启动子。如上述方法中，可加速表达所需氨基酸序列。曾预期一些氨基酸序列如异种或同种蛋白质含有自己的细胞或组织的特殊启动子。更包含可作为为适当的前导区(leader)的调节序列，及聚腺苷酸化序列。
在本发明的一个更特别的实施例中，氨基酸序列的表达视需要可为单-或二-顺反子。例如，当启动子经操纵联结于选择性核酸序列及标的氨基酸序列二者时，该表达为单顺反子；启动子/经编码氨基酸序列/选择性核酸序列；启动子/选择性核酸序列/经编码氨基酸序列等。另外，二顺反子表达则来自从不同启动子表达氨基酸；例如启动子/经编码氨基酸序列或选择性核酸序列。
如文中讨论，本方法可兼容适用于各种载体。当需要增强表达时，该载体典型上编码该氨基酸序列(或若干该序列)。优选的载体形式有时称为表达盒。在一实施例中，该表达盒一般包括在含有载体宿主细胞或细胞系中具有功能作用的启动子；操纵子(operator)；核糖体激活部位；氨基酸序列；及足量的3’部份，其3’部份编码多腺苷酸化作用信号，以加速细胞分泌出氨基酸序列的作用。优选的终止子为来自SV40之多聚腺苷酸化序列。如视需要，载体的表达盒或其它适当部份可包括近氨基序列5’-端的信号序列，以加速该序列之后的翻译处理。至少一种合适的基因标记或细胞表面载体可视需要定位于载体上。
包括表达盒的更特殊的合适载体示例，为包括下列的DNA载体：(i)在大肠杆菌(E.Coli)内的复制功能性起点(ori)，(ii)选择性基因标记(抗生素抗性基因，如Amp，Tet，Neo或Kan抗性)。(iii)强力病毒启动子如巨细胞病毒(cytomeglovirus，CMV)启动子及任意的CMV增强子元素，(iv)Ig-CL免疫球蛋白轻链恒定区领头序列，(v)标的氨基酸序列，(vi)连接Ig-CL外显子(exon)的完整长度的Ig-CL内含子(intron)，(vii)生长激素的多聚腺苷酸化序列，如牛生长激素(bgh)多聚腺苷酸(poly A)序列，及(viii)编码选择性真核标记DNA，如强力病毒启动子[(如猿猴病毒40(simian 40，SV40)启动子)]，该启动子是经操纵联结于抗生素抗性基因，并经融合至病毒多聚腺苷酸化序列中(如SV40 polyA序列)。另外，除第(vi)项连接于Ig-CL外显子的完整长度Ig-CL内含子外，该DNA载体可包括上述所有第(i)项至第(v)项、及第(vii)项至第(viii)项。例示的Ig-CL领头序列为小鼠kappa前导区。该完整长度Ig-CL内含子与外显子实例为完整长度的Ck基因。
需要增强表达的氨基酸序列可为宿主细胞自然产生的任一蛋白质或多肽序列，包括异种蛋白质或同种(内生性)蛋白质。大部情况下，该氨基酸序列为真核蛋白质，包含但不限于，较大的氨基酸序列如多重亚单位蛋白质的亚单位或功能性片段。更特定的氨基酸序列包含酶、免疫球蛋白、T-细胞受体、MHC/HLA分子(第I类及第II类)或其片段等。另外的特定蛋白质包括生长因子、凝血因子、细胞因子例如纤溶酶原激活物、组织因子(TF)、胰岛素、哺乳类生长激素、促红细胞生成素、IgE、尿激酶1、2、3或其片段等。本发明进一步可与其它已知、部份已知、或未知的氨基酸序列(包含编码新颖基因序列者)互相兼容。
各种不同的氨基酸序列可见于，如基因银行(Genbank)(美国国家医药图书馆，38A，8No5，Rockville Pike，Bethesda，MD 20894)，而该网址为：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov。
文中讨论的特殊载体分子量可由公知技术如琼脂凝胶电泳法来测定分子量大小，且视标的需要而施行不同的技术。然而，大部份合适的载体及特别适合的DNA载体分子量为至少约5kb，特别以介于约5kb至约35kb之间或更高。特殊氨基酸序列的分子量可由标准蛋白质定量技术，如聚丙烯醯胺凝胶电泳法测定。或者该分子量亦可由核酸序列概念翻译的对应核酸序列的分子量加以估计决定。在大多数的应用上，编码氨基酸序列的核酸分子量大小可足以编码介于约500至约300,000道尔顿大小之的蛋白质或多肽，而优选为介于约15至200,000道尔顿。
本发明可使用的更特殊载体示例如下，如pJAIgG4Tf.A8，pDRHK、及pMACS，亦可参照图1A及图1B。特别是，该pDRHK载体依据布达佩斯条约寄存于美国菌种培养物保藏中心(ATCC)，其地址已记载在前文中。该DNA载体于1997年九月十七日寄存于美国菌种培养物保藏中心，保藏号码为第20924号(AccessionNO.209274)。该pDRHK载体为哺乳类表达载体，它含有CMV启动子、小鼠IgCKappa前导肽、克隆区、小鼠kappa内含子，及人类kappa常数区外显子序列。
前文所述，本发明特征包括连续重组操作处理，涉及到连续及共同的载体导入方式，以产生能高量表达氨基酸序列的重组哺乳类细胞系。而载体导入可由许多方法完成，包含逆转录病毒转移、病毒感染，由钙-、微脂粒-、或聚凝胺-调节的转染、生物性转移(biolistic transfer)、或其它已知的技术等。更佳的导入方法包括可适用于哺乳类细胞的稳定转染，如电穿透方法。然而，于某些应用上可使用瞬时载体导入方式以提供具基因稳定的重组细胞系。
本发明的特征为，适宜哺乳类宿主细胞如CHO，以合适载体分别经一次(单次)或至少二次(多次)转染，而该载体包含至少一种选择性标记，及可编码至少一种标的的异种蛋白质。在更特定的实施例中，该宿主细胞以载体转染，该载体包含操纵联结至片段的第一选择序列(基因标记)，而该片段经操纵联结于经编码的蛋白质。许多转染方法可应用在将载体导入宿主细胞，如标准磷酸钙调节的转染，或脂转染(lipofection)技术。该经转染宿主细胞接着进行选择性生长条件，而可分离出第一高表达细胞。经转染细胞的分离方法可参照前文所列的Sambrook等人前述文献、Ausubel等人前述文献，及Wigler于1979年发表的(美国)国科学研究院会刊(76∶1376)的参考文献。
分离第一高表达细胞且可视需要由一个或组合标准技术来特性化。例如一种方法为将CHO细胞以编码新霉素基因标记(可提供G418抗性)的载体转染，而该载体系经操纵联结于蛋白质序列，如编码免疫球蛋白的序列，特别是编码抗体的序列。该可表达蛋白质序列的经转染宿主细胞系在微量滴定组织培养盘中以标准技术(如，限制稀释及生长)来加以克隆。细胞培育约数天至数星期或更久后，典型上将出现单一菌落。较好于额外操作处理过程仅使用单一菌落。可用任一已广被人接受的方法如标准免疫方法，特别是ELISA分析，来筛选出具高产量力的菌株。优选为ELISA分析法，因其可最佳地用来检测及定量抗体生成。优选的高产量细胞为ELISA分析中实质上可制备出的最高量抗体者。更佳为在每毫升培养基中可制备出约0.5至约20微克抗体的第一高产量细胞。而特别最佳者为在每毫升培养基中可制备约1至约5微克抗体的第一高产量细胞。
该第一高产量细胞特别经进一步操作处理而增加编码蛋白质序列的核酸细胞复制数量。此实例的特殊目标，为制造出具基因稳定性的能制造抗体的细胞株。一实施例中，第一高产量细胞是经由如电穿透作用而进一步以二种不同载体转染。该载体其一为编码蛋白质序列者，另一为编码适当细胞表面标记如糖蛋白且尤其是CD4或其片段者。可参考图1A。市面上可购买之编码CD4的优选载体为pMACS载体(参考下述)。此实例中，转染物经特定抗体或可能与细胞表面蛋白特异性结合的其适合的抗原结合片段处理。
该细胞的“基因稳定性”是指该细胞实质上无基因体重排过程，包含异种核酸。特别可避免的重排物包含双微小染色体。本发明方法与将该异种核酸导入宿主细胞基因体相比，以强化到最大的基因稳定度。
用来检测可表达来自载体之一的细胞表面蛋白质的细胞与由其它载体编码的蛋白质序列的细胞二者间的特异性结合方法有许多种，包括标准免疫技术如层析技术，特别为包括磁性珠的管柱层析法。该方法中，可抗细胞表面蛋白质的抗体为共价性附着在该磁性珠上，因此可藉由将细胞与磁性珠置于磁性环境下，来分离出任一可表达细胞表面蛋白质的细胞。接着从管柱中移出结合细胞，并于微量滴定组织培养盘中培养。视需要，可将细胞生长于具选择性培养基中，如补充G418之培养基。
可藉数种技术分离出第二高产量细胞。例如特别方法中，细胞置于培养基孔洞中生长一段时间，以充分制造抗体并释出于培养基中。将适合的抗Fc部位的抗-个体遗传型抗体涂覆于该微量滴定组织培养皿孔洞中，再加入细胞培养基。该包含高量抗体的培养基可由标准技术加以检测，如公知使用标记有如辣根过氧化酶(HRP)的适宜二级抗体的夹心法分析技术。优选的第二高产量细胞的分离，是由辨识培养盘中细胞数量对高抗体生成的速率。此分析方法详细说明于下且尤其包含了ELISA检测方式。优选为在约24小时内每106细胞可制造出约0.1至约10微克或更多抗体的第二高产量细胞。更佳的范围为在24小时内每106细胞可制造出约1至约5微克抗体者。
如文中讨论，又优选为相对于第一高产量细胞可制造出高出约3倍至约40倍或更多抗体的第二高产量细胞。而抗体反应性为此测定的优选方法。
该第二高表达细胞，可进一步经转染来分离出可表达较多量蛋白质的细胞系，如第三高表达细胞。例如，为了增加第二高表达细胞的抗体制造，用以转染该第一高表达细胞的二种载体将再应用来共-转染该第二高表达细胞。优选的转染法为电穿透法，但若需要也可应用其它感染方法。这种可制造出增加抗体量的高产量细胞，可经由前文提到的CD4表达细胞的磁性管柱层析法分离出此高产量细胞。视需要，该细胞可生长在非选择性或选择性培养基，如补充G418的培养基。优选的高产量细胞可制造最大抗体量，是由辨识培养皿中细胞数量对高抗体生成率来决定。
本实施例中，经选择的细胞株优选连续稀释，并应用公知方法在微量滴定组织培养盘中生长。约数天至数星期或更久后，该抗体的制备可由适当的免疫技术如ELISA加以测试。而具高抗体制造率的克隆经进一步扩增，优选为约24小时每106细胞可制备出约1至约100微克或更多抗体的克隆，更佳为24小时每106细胞可制造出于约15至约50微克抗体的克隆。另外亦可优选为可制造出相对于第二高产量细胞高出约2倍至约10倍或更多抗体的克隆。
符合上述标准的经选择克隆，优选的是依标准方法连续稀释。约数天至数星期或更久后，单一克隆可由适当的免疫方法如ELISA测试其抗体制备情况。而具有最高产量克隆(第三高表达细胞)是由下述静态培养方法选择制备。优选的第三高表达细胞在每毫升培养液中可制造约20至约200微克抗体。更优选的是每毫升培养液可制造约50至150微克抗体，最好的是每毫升培养液可制造约100微克。
亦优选为可制造出相对于第二高产量细胞高出约3倍至约40倍或更多抗体的第三高产量细胞，此数量是依据抗体反应性测定的。
另外，也可优选为可制造出相对于第一高产量细胞高出约10倍至约200倍抗体的第三高产量细胞，此数量是依据抗体反应性测定的。
适宜抗体的特定实例，为pJAIgG4TF，A8载体编码的抗-TF抗体，如图1A所示。
由本文中所述方法制造的高产量细胞系，具有广泛的实用性，可应用于如商业、研究及医药领域。例如，已发现由该方法制造出的高产量细胞，特别适用于商业规格蛋白质序列。如文中所述，下列实施例为应用中空纤维生物反应器以大量制造蛋白质序列的方法(如，每毫升的毫克量)。
本发明特别的实施例中，该制造出的重组哺乳类细胞系可产生大量的MHC复合体，特别是重组MHC单链及异二聚体复合体。该复合体记载在如1995年2月1日申请的美国申请号08/382,454、1996年1月31日申请的，申请号08/596,387，及于1996年2月15日公布的PCT申请WO96/04314号参考文件中，这些文献所披露的内容供本文参考。特别是记载在审理中的美国申请号08/382,454、08/596,387及公布的PCT申请号WO96/04314中的包括共价性联结肽的各种单链MHC融合复合体。例如，为制造出可高表达所需单链MHC复合体的重组哺乳类细胞，适合的哺乳类宿主细胞如CHO是以适合的载体转染一次(单一)或一次以上(多次)。该载体分别包含至少一种如上文定义的选择性标记，以及至少一种编码单链复合体片段。优选实施例中，该单链复合体为第二类，但于某些情形中第一类单链复合体较适用。该宿主细胞优选以编码单链复合体(其经操纵联结于选择性标记)的适合载体转染。可利用各种转染方法，如标准磷酸钙调节的转染，或脂转染技术。经转染的宿主细胞接着生长在选择性条件下，使得可分离出第一高表达细胞。经转染细胞的分离方法可参照前文所述的Sambrook等人、Ausuel等人的参考文献，以及Wigler于1979年发表在PNAS第76册第1376页的参考文献。
在更特殊的方法中，该载体包括选择性基因标记，如操纵联结至单链MHC复合体的新霉素。该宿主细胞优选以电穿透方式转染，而可表达融合蛋白质序列的经转染的宿主细胞，可经由微滴定组织培养皿中限制性稀释的方式来做无性繁殖。经由数天至数星期或更长的细胞培养，采集该经转染细胞，并稀释于非选择性或选择性培养基中，如添加G418的培养基中。如上述方法测试其上清液，其实施例如下。高产量克隆是经选择并经培养放大，采集选择出的克隆经并生长数天至数星期或更长时间，以分离出第一高产量细胞。较好第一高产量细胞于每毫升培养液中制造约1至100毫微克融合蛋白质。更好第一高产量细胞于每毫升制造约10至约50毫微克融合蛋白质。
制备单链MHC融合蛋白质的第一高产量细胞，经由下述方法进一步操作处理。该第一高产量细胞是经由二种载体进一步以如电穿透予以共-转染，此二种载体中其一可编码单链融合蛋白质，另一个可编码适宜细胞表面蛋白质，如醣蛋白及特别是CD4。编码CD4的优选的载体为市面上可购得的pMACS载体(如下文)。该转染物随后以特异性抗体或其可特异性结合细胞表面蛋白质的适宜抗原结合片段加以处理。特异性结合可以用各种方法检测，然而，优选的是使用含磁性珠粒的柱式层析法。经结合的细胞接着自管柱移除，并于微滴定组织培养盘中生长。而第二高产量细胞可生长在非选择性或选择性培养基，如添加G418的培养基中。
若需要，可制得第二高产量细胞的静态培养基。优选的是第二高产量细胞在每毫升培养液中制造出约50至约500毫微克的融合蛋白质。更优选的是该第二高产量细胞每毫升制造出约100至200毫微克融合蛋白质。
为进一步增加单链MHC复合体的制备，该第二高产量细胞可再经转染。一方法中，该第二高产量细胞经由载体混合物予以共-转染。该载体混合物为编码单链MHC融合蛋白的载体及另一个携带有选择性核酸序列并对药物如博罗霉素(puromycin)或其它适合药物具有抗性的载体的混合物。该共-转染视需要可经由任一种适当方法，如电穿透方法进行。于数天至数星期或更久的细胞培育后，采集该细胞，并重新悬浮于添加博罗霉素培养基中。目视见到具抗性菌落生成后，藉ELISA测试培养液的融合蛋白质生成。自可产生高产量蛋白质的克隆制得静态培养液。优选的第三高产量细胞于每毫升制造出约500至约5000毫克微克的融合蛋白质，更佳为该第三高产量细胞子每毫升中制造出约1000至2000毫微克的蛋白质。
若需要，该适合的第三高产量细胞可经进一步亚克隆(subclone)改善重组蛋白质的表达。优选方法为限制性稀释克隆法。另一优选方法为24小时内每毫升制造约100至约1000毫微克融合蛋白质的第三高产量细胞克隆。特佳的是24小时内每毫升制造出约200至500毫微克融合蛋白质的克隆。
编码单链MHC复合体的载体实施例为图1B所示的pBRHK载体。该载体系编码sc-DR2/MBP单链第二类MHC复合体。
本方法可依实际需要而加以变化。例如，本发明特别包括下列实施例：(1)以携带有抗药基因的表达载体的转染，(2)以表达载体及可瞬时表达细胞表面标记的载体共-转染，及(3)以该表达载体及携带有不同抗药性基因的载体共-转染。本文中讨论的细胞选择步骤可用于特别方案的实施。本发明亦可用于可编码标的的特殊重组蛋白质，如编码二种多肽序列(免疫球蛋白重链及轻链)的表达载体，使细胞再转染。优选的表达涉及到二种多肽链的协调表达。本文中讨论的特定方法及其它方法具有广泛适用性质，包括促进细胞的选择及筛选。
本发明进一步以下列实施例加以叙述。该实施例仅助于了解本发明，而非用以限制本发明。
实施例一高产量重组抗-组织因子(TF)抗体的CHO细胞的再-转染。
1.载体特性
称为pJAIgG4TF.A8(图1)的载体经过构建而表达哺乳类细胞的嵌合式抗组织因子(TF)免疫球蛋白质重链与轻链。进行起始的瞬时转染实验以测试来自pJAIgG4TF.A8载体的抗体表达情况。使用Qiagen公司的lipofectin试剂以瞬时转染COS细胞。简言之，将2.5×105细胞/孔(cell/well)接种于六孔培养盘中并于37℃培育24小时。将2微克pJAIgG4TF.A8 DNA与100微升IMDM混合。为了制造脂质复合体，将10微升脂质加至该DNA溶液中。振动混合该混合液，并于室温下培育5分钟。当DNA形成脂质复合体时，以PBS洗涤该细胞。将DNA-脂质混合物与600微升10％SSM[添加10％小牛血清(FBS)的CellGro IMDM培养基(Media Tech出品)]混合，并加入至经洗涤的细胞中。将该细胞与脂质复合体于37℃，10％CO2下培育3小时。以PBS洗涤此经转染的细胞，添加2毫升10％SSM，并于37℃及10％CO2下培养72小时。取该培养液上清液以测试生成的抗体。
2.试抗体生成的ELISA
为检测人类IgG4抗体的存在，开发出人类HC/Kappa-特异性夹心ELISA。简言之，将100微升的1微克/毫升的山羊抗-人类IgG-Fc(Fab)的R5缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.5)涂覆于Maxisorp 96孔培养盘上(NUNC出品)，并于4℃下培育过夜。以R55缓冲液(2mM咪唑，7.5mM NaCl，0.02％Tween-20)洗涤一次该培养盘孔，以塑料薄膜覆盖该培养孔并于4℃下贮存待用。为分析抗体的产生，移除R55，并加入100微升的转染物的上清液至该经覆盖的培养盘孔。37℃30分钟后，以R55缓冲液洗涤6次，然后再加入100微升的1∶800稀释(含10％FBS之PBS)的抗人类kappa链-HRP抗体(Southem Biotech出品)。将该培养盘置于37℃下培养后，以400微升的R55缓冲液洗涤6次。为检测探针抗体(probe antibody)的存在，于4分钟内加入100微升的1倍ABTS基质(Kirkegaad&Perry实验室出品)，接着添加100微升ABTS骤冷缓冲液(Kirkegaard&Perry实验室出品)。在405nm读取吸光率。以纯化的人类IgG4蛋白质做为正对照组。此分析法结果显示，此抗-TFIgG4抗体是由pJAIgG4TF.A8载体瞬时转染COS细胞所产生者。
3.测试抗体特异性的ELISA
为特别检测抗体与人类组织因子的结合，开发出第二夹心式(ELISA)。于4℃下以100微升含500毫微克/毫升重组人类-TF的R65缓冲液(100mM碳酸氢钠，pH8.2)涂覆Maxisorp 96孔培养盘上，并置放过夜。次日以R55缓冲液洗涤该培养盘、覆盖该培养盘并于4℃下贮存待用。为检测抗-TF抗体的生成，移除R55并加入100微升经转染物的上清液至此经覆盖的培养盘孔内。于37℃30分钟后，以R55缓冲液洗涤该培养孔6次，然后再加入100微升1∶800稀释(含10％FBS之PBS)的抗-人类Kappa链-HRP(Southem Biotech出品)。将该培养盘置于37℃下培育后，以400微升R55缓冲液洗涤6次。为见检测探针抗体的存在，于4分钟内加入100微升1倍的ABTS基质，接着加入100微升ABTS骤冷缓冲液。在405nm读取吸光率。以纯化的小鼠H36.D2抗-TF蛋白质做为正对照组。此分析结果显示，该抗-TFIgG4抗体是由pJAIgG4TF.A8载体瞬时转染COS细胞所产生者。
4.CHO细胞的起始稳定转染
为生成可表达重组抗-TF抗体的稳定细胞系，将CHO.K1细胞以pJAIgG4TF.A8载体转染。简言之，100微克的pJAIgG4TF.A8 DNA经由PvuI酶，于37℃下消化4小时后而成直链化。将CHO.K1细胞(ATCC CLL-61)稀释至浓度为1.25×107细胞/毫升。并将800微升的细胞加入0.4厘米的电穿孔量杯(cuvette)内并于冰上培育10分钟。加入25微克的pJAIgG4TF.A8 DNA，与细胞混合并培育10分钟。于960μF及250V下电穿透该细胞。然后将细胞置于冰上培育10分钟，将细胞悬浮液加入含10毫升10％SSM的T25培养瓶内，于37℃及10％CO2下过夜培育。24小时后，以胰蛋白酶-PBS培育并采集该细胞，将细胞重新悬浮于PBS中，并以1∶9、1∶27、1∶81稀释比稀释于添加有G418的培养基。将此经转染的细胞以100微升/孔铺于96孔盘培养盘中，并于37℃及10％CO2下培育。
如上述测试转染后细胞培养液上清液的抗体生成情况。阳性克隆(Positiveclone)经选择并培养放大。由1∶27稀释比的培养盘中之第H列、第9行中选择出克隆H9，作为高抗体产量克隆。
经限制稀释法克隆该细胞系。简言之，将经选择的克隆于PBS中稀释至1000细胞/毫升。于10％SSM中做成一系列的1∶10稀释以获得1细胞/毫升。由该等稀释度，以100微升/孔铺于96孔平底培养盘，并于37℃及10％CO2下培育。于培育三日后，各孔中添加100微升/孔的10％SSM。三星期后，单一克隆开始出现。以ELISA仅测试单一克隆的抗体生成。具有高抗体产量的克隆经扩增并选择。选克隆H9g12作为最高产量的克隆，并于静态培养下分析其抗体产量。
经选择的克隆经胰蛋白酶培养而采集，重新悬浮于10毫升10％SSM中使其浓度为1×105细胞/毫升，并加入T-25组织培养瓶中。于37℃及10％CO2下培养该细胞21天，或达到80％细胞死亡率为止。将该细胞悬浮液离心，取其上清液以ELISA分析测试其Ab的产量。H9g12克隆的最高抗体产量为3.5微克/毫升。
5.CHO-H9g12细胞系的稳定再-转染。
开发出本方法以加入较多标的基因拷贝数量至稳定的Ab-产量细胞系的基因体内。为进行此方法，将克隆H9g12以抗-人类TF mega载体pJAIgG4TF.A8以及pMACS的混合载体共-转染。该pMACS载体可瞬时表达膜结合CO4蛋白质。为了共-转染此H9g12细胞系，将1.25×107细胞/毫升细胞悬浮液800微升加入0.4厘米的电穿孔量杯内，并于冰上培育10分钟。将3∶1摩尔比的pJAIgG4TF.A8载体及pMACS DNA(40微升的1微克/毫升以PvuI酶直链化的pJAIgG4TF.A8，以及5微升1微克/毫升超螺旋pMACS)的混合物加入细胞中。于冰上培养10分钟后，于960μF及250V下电穿透该细胞。于37℃下培育该细胞10分钟，再将细胞稀释于含10毫升10％SSM的T25培养瓶中，并于37℃及10％CO2下培养72小时，以瞬时表达CD4蛋白质。此时，于室温下以5毫升PBE(含二乙胺四乙酸之PBS溶液)处理细胞直到可分离该细胞。细胞经洗涤一次并重新悬浮于380微升的PBE中，并以80微升的经细胞表面-表达的人类CD4分子具特异性的抗体标记。该抗体共价结合于磁性珠粒上，于4℃培养15至20分钟后，将此由抗体标记的细胞加入磁性层析柱中。可于其表面可表达CD4的转染后细胞预期可结合至此磁性柱上。而未经转染的细胞则由1毫升PBE溶液洗经该柱。将层析柱从磁场中移出、加入1毫升PBE流经该层析柱而自该柱洗出此经结合的细胞。以添加G418(1.5毫克/毫升)的10％SSM溶液199毫升稀释该表达CD4的细胞，并平铺于96孔平底培养盘，于37℃及10％CO2下培育该培养盘。
为测试抗体生成，如上述将100微升1微克/毫升的山羊抗-人类IgG-Fc(Fab)(Pierce出品)涂覆于Maxisorp 96孔培养盘上(NUNC出品)。于测试前24小时，更换该经再-转染细胞的培养基。经24小时，将5毫升经感染细胞的上清液加至95微升10％FBS-PBS中。加入经稀释的上清液至经涂覆的培养盘孔上，并于37℃培育60分钟。以R55缓冲液洗涤该培养盘孔6次，如上述方法使用抗-人类Kappa链抗体-HRP(Southem Biotech出品)以测试存在于上清液内的重组抗体。纯化的人类IgG4蛋白质(Biodesign出品)做为正对照组，用以建立抗体浓度的标准曲线。
克隆选择是藉比较抗体生成率对细胞数目而完成。简言之，此高产量菌株是以胰蛋白酶处理并计数之。由经计算的抗体产率及细胞数目，决定出微克抗体/106细胞/24小时的数值，将此高产量克隆经由24孔/培养盘扩增培养放大，此经选择的克隆命名为3D2。
就限制性稀释克隆而言，如上所述，以10％SSM连续稀释此经过选择的克隆，接种于96孔平底培养盘并培育。三星期后，以ELISA测试单一克隆的抗体产量。此具高抗体产量的克隆经扩增，并选择之。克隆3D2A9显示数值为2.58微克抗体/106细胞/24小时，并经选择为最佳克隆。静态培养该克隆，分析其抗体产量。
克隆3D2A9的静态培养，是由添加浓度为2×105细胞/毫升的10毫升10％SSM培养基，于T-25组织培养瓶而开始。于37℃及010％CO2下培育该细胞21天或达到80％细胞死亡率为止。将该细胞悬浮液离心，取其上清液以ELISA测试其抗体产量。克隆3D2A9的最高抗体产量为21微克/毫升。此抗体产量比该第一经转染的克隆高7倍。
3.第三次稳定转染
为进一步增加经转染的细胞的抗体产量，克隆3D2A9再次以抗人类TF mega载体pJAIgG4TF.A8以及pMACS混合物共-转染。为了共-转染此细胞系，将1.25×107细胞/毫升细胞悬浮液800微升加入0.4厘米的电穿孔量杯内，并于冰上培育10分钟。将3∶1摩尔比的pJAIgG4TF.A8载体及pMACS DNA(40微升之1微克/毫升PvuI酶直链化的pJAIgG4TF.A8以及5微升1微克/毫升的超螺旋pMACS)的混合物加入该细胞中。于冰上培育10分钟，将细胞于960μF及250V下电穿透该细胞。于37℃下培育该细胞10分钟，再添加至含10毫升10％SSM的T25培养瓶内，并于37℃及10％CO2下培养48小时以瞬时表达CD4蛋白质。此时，将此经转染细胞以抗-CD4的磁性珠粒标记，及如上述在磁性层析柱上选择。以添加G418(1.5毫克/毫升)的10％SSM溶液200毫升稀释该表达CD4的细胞。将该细胞悬浮液铺于96孔平底培养盘。于37℃及10％CO2下培养该细胞约3星期。
如上述，将100微升1微克/毫升的山羊抗-人类IgG-Fc(Fab)(Pierce出品)的R5/缓冲液涂覆于Maxisorp 96孔培养盘上(NUNC出品)。为了分析抗体产率，于测试前24小时更换经再-转染细胞的培养基。经过24小时将5微升经感染的细胞的上清液加至95微升的10％FBS-PBS中。该经稀释的上清液加至此经涂覆的孔中，并于37℃培育60分钟。以R55缓冲液洗涤该培养盘孔6次，如上述，用抗-人类Kappa链抗体-HRP(Southem Biotech出品)检测存在于该上清液内的重组抗体。以纯化的抗-TF嵌合式抗体作为正对照组，用以建立抗体浓度的标准曲线。此测试结果可选择出具高抗体产量的克隆，并将该克隆于12孔培养盘中培养扩增。待克隆长满至达80％培养盘孔，即可测试24小时上清液。此经24小时培养的上清液以1∶100稀释度以ELISA测试。细胞亦经计数，并决定微克/106细胞/24小时抗体产量。依据此数值可选择出最高抗体产量的母克隆(mother clone)A9B11及A9F12。
此经选择的克隆，如上述以10％SSM连续稀释、接种于96孔平底培养盘中并培育。三星期后以ELISA测试单一克隆的抗体产量。该具高抗体产量的克隆经扩增。经发现初级(primary)克隆A9F12C2及A9AIIBS具有最高的抗体产量，为30至40微克抗体/106细胞/24小时。该克隆经由静态培养放大。
A9F12C2克隆的静态培养，是由添加10毫升浓度为2×105细胞/毫升的10％SSM培养基稀释至T-25组织培养瓶内而开始的。于37℃及10％CO2下培育该细胞21天或达到80％细胞死亡率为止。将该细胞悬浮液离心，取其上清液以ELISA测试Ab的产量。A9F12C2克隆的最高抗体产量为52微克/毫升，此产量高出该第二经转染菌株2倍。
此经选择克隆A9F12C12如上述以10％SS连续稀释、接种于96孔平底培养盘中并培育。三星期后，以ELISA测试单一克隆的抗体产量。经发现此二级克隆A9F12C12具有最高抗体产率并以静态培养放大。该等静态培养以如前所述进行。
为决定静态培养上清液的抗体浓度，取5微升A9F12C2E7细胞上清液加至4995微升的10％PBS中。该稀释的上清液如上述以抗体ELISA分析嵌合式抗体。以纯化的抗-TF嵌合式抗体作为正对照组。此测试结果显示A9F12C2E7二级克隆于静态培养中具有最高抗体产量为52.6微克/毫升。
此经选择之克隆A9F12C2E7如上述以10％SSM连续稀释、接种于96孔平底培养盘中并培育。三星期后，以ELISA测试单一克隆的抗体产量。此三级克隆A9F12C2E7B4经选择作为最高抗体产量者并以静态培养放大。该静态培养以如前所述进行。
为决定此静态培养上清液的抗体浓度，取5微升A9F12C2E7细胞上清液加至4995微升的10％PBS中。该稀释的上清液如上述以抗体ELISA分析嵌合式抗体。以纯化的抗-TF嵌合式抗体做为正对照组。克隆A9F12C2E7B4的最高抗体产量为102.3微克/毫升(第2图)。此细胞系经扩增并冷冻。以浓度为1×106细胞/毫升做成50小瓶而做为起始种子细胞银行(initial seed cell bank)并于液态氮中贮存。此细胞系命名为cH36(嵌合式H36)。
4.生物反应器注射
以厂商提供的使用说明装设中空纤维生物反应器。将经选择的以浓度1×108细胞/毫升重新悬浮于正确容量的30％SSM中并注入生物反应器中。依据厂商使用说明来操作此生物反应器。如上述以ELISA测试最高产量。相比第三次经转染的初级克隆A11B5的抗体产量为1,100微克/毫升，此第一次转染的初级克隆H9g12的最高抗体产量为70微克/毫升(图3)。
实施例2重组HLA-DR2 MHC第二类分子的细胞系的制备方法。
1.载体特性
称为PDRHK(图1B)的载体构建成可表达哺物类细胞融合至人类免疫球蛋白Kappa恒定区的可溶性单链HLA-DR2/MBP分子。进行最初瞬间转染实验以测试来自pDHRK载体的蛋白质的表达。使用Qiagen公司的Iipofectin试剂以瞬时转染COS细胞。简言之，将2.5×105细胞/孔接种于6孔培养盘并于37℃下培育24小时。混合2微克pDRHK DNA与100微升IMDM。为了制造脂质复合体，将10微升脂质加入该DNA溶液中。振动混合该混合液并于室温下培育5分钟。当DNA形成脂质复合体，以PBS洗涤该细胞。将DNA-脂质混合物与600微升10％SSM混合并加入至经洗涤的细胞中。将该细胞与脂质复合体于37℃及10％CO2下培养3小时。以PBS洗涤此经转染的细胞，添加2毫升之10％SSM，并于37℃及10％CO2下培养72小时。取其上清液以测试重组体DR2/MBP-CK的生成。
2.测试sc-DR2/MBP-Cκ生成的ELISA
为检测sc-DRZ/MBP-C6的存在，开发出人类6/HLA-DR-特异性夹心ELISA。简言之，将100微升1微克/毫升的山羊抗-人类IgG-Kappa的PBS涂覆于Maxisorp96孔培养盘孔(NUNC出品)，并于4℃培育隔夜培养盘接着以R55缓冲液洗涤一次，以塑料膜覆盖及于40℃贮存适用。为分析重组体蛋白质产量，移除R55并加入100微升经转染的细胞上清液至该经覆盖的培养盘孔内。于37℃60分钟后，以R55缓冲液洗涤该培养孔6次，然后加入100微升1∶1000稀释(含10％FBS的PBS)的与HRP(Anergen出品，ATCC HB-55)共轭的抗HLA-DR抗体L243。于37℃下培育后，以400微升R55缓冲液洗涤6次。为检测探针抗体的存在，于5分钟内加入100微升1倍ABTS基质，再加入100微升ABTS骤冷缓冲液。在405nm读取吸光率。此分析结果显示，此scDR2/MBP-Cκ融合蛋白系由pDRHK载体瞬时转染COS细胞所生成者。
3.起始稳定转染
为生成可表达此sc-DR2/MBP-Cκ融合蛋白质的稳定细胞系，将CHO.K1细胞以pDRHK载体转染。简言之，100微克pDRHK DNA经由PvuI于37℃下切割消化4小时，将CHO.K1细胞(ATTC CCL-61)稀释至浓度为1.25×107细胞/毫升。将800微升的细胞液加入0.4公分的电穿孔量杯内并于冰上培育10分钟。加入20微克的pDRHK DNA并与该细胞液混合，并培育10分钟。于960μf及250V下电穿透该细胞，然后将细胞置于冰上培育10分钟，将细胞悬浮液加入含10毫升10％SSM的T25培养瓶内及于37℃及10％CO2下过夜培养。待24小时后，以胰蛋白酶-PBS培育而采集该细胞，将细胞重新悬浮于PBS中，并将该细胞液以1∶9、1∶27、1∶81稀释比稀释于添加有G418的培养基中，将此经转染细胞铺于96孔培养盘并于37℃及10％CO2下培养。
96孔培养盘培养的细胞上清液如上述测试。阳性克隆经选择并培养放大。于1∶27稀释比的培养盘中的第A列、第5行中选择出克隆A5，并作为高抗体产量的克隆。细胞系如上述经限制稀释法亚克隆。经筛选后此克隆A5B4经选择为最高抗体产量的细胞系，并以静态培养培养。
该经选择出的克隆是经胰蛋白酶处理而采集的，以浓度1×105细胞/毫升重新悬浮于10毫升10％SSM培养基中，并加至T-25组织培养瓶中。于37℃及10％CO2下培养该细胞21天，或达到80％细胞死亡率为止。将该细胞悬浮液离心，取其上清液做ELISA分析测试其重组体DR2生成。以A5B4克隆生成的重组sc-DR2/MBP-C6融合蛋白量为20毫微克/毫升。
4.稳定再-转染
为进行此方法，将克隆A5B4以pDRHK及pMACS的混合物共-转染。将1.25×107细胞/毫升的细胞悬浮液800微升加入至0.40厘米的电穿孔量杯内并于冰上培育10分钟。将3∶1摩尔比的pJAIgG4TF.A8载体及pMACS DNA(30微升的1微克/毫升Pvul-直链化的pDRHK，以及5微升的1微克/毫升超螺旋pMACS)的混合物加入细胞中。于冰上培育10分钟后，于960μF及250V下电穿透该细胞。于37℃下培育该细胞10分钟，再将细胞稀释至于含10毫升10％SSM的T-25培养瓶中，并于37℃及10％CO2下培育72小时，以瞬时表达CD4蛋白质。此时，于室温下以5毫升PBE处理细胞，直到可分离细胞。细胞洗涤一次并重新悬浮于380微升的PBE，并以80微升抗体标记(该抗体对于经由细胞表面-表达的人类CD4分子具有特异性)。该抗体共价结合在磁性珠粒上。于4℃下培育15至20分钟后，将此由抗体标记的细胞加入至磁性层析柱中。可于表面表达CD4的经转染的细胞预期可结合至该磁性层析柱中。而未经转染的细胞则由1毫升PBE溶液冲洗出该柱。将层析柱从磁场中移出，以1毫升PBE溶液流经该柱则可自层析柱洗出此经结合的细胞。以添加G418(1.5毫克/毫升)的10％SSM溶液199毫升稀释该表达CD4的细胞，并铺于96孔平底培养盘中，于37℃及10％CO2下培育该细胞。
三星期后，96孔培养盘的细胞上清液如上述测试其重组蛋白质。阳性菌株经选择并培养放大。经选择克隆DR22为最高产量的克隆，该细胞系冰冻保存。
将DR22克隆的冷冻保存瓶于37℃水浴下快速解冻并生长至95％存活率。细胞如上述限制性稀释克隆而连续稀释。细胞生长三星期后，以ELISA测试单一克隆的sc-DR2-Cκ产量。将具最高产量的克隆放大并选择出。经辨认克隆SR22-H4为最佳产量的克隆。如上述进行静态培养，经发现其重组蛋白质产量量为100毫微克/毫升。
5.第三次稳定转染
为进一步增加重组蛋白质的产量，初级克隆DR22-H4与pDRHK及pPUR(Clonetech出品)的混合物共-转染，该载体携带了抗博罗霉素的基因。简言之，将1.25×107细胞/毫升细胞悬浮液800微升加入0.4厘米的电穿孔量杯并于冰上培育10分钟。将3∶1摩尔比的pDRHK及pMACS DNA(25微升的1微克/毫升以PvuI直链化的pDRHK，以及5微升的1微含/毫升以PvuI直链化的pPUR)的混合物加入细胞中。于冰上培育10分钟后，于960μF及250V下电穿透该细胞。于37℃下培养该细胞数分钟再加至含10毫升10％SSM的T-25培养瓶中，并于37℃及10％CO2下培育48小时。以胰蛋白酶处理而采集该细胞，离心并将细胞重新悬浮于含G418(1.5毫克/毫升)及博罗霉素(20微克/毫升)的10％SSM中。将细胞铺于96孔平底培养盘并于37℃及10％CO2下培育。待克隆开始出现，即测试该培养基的重组蛋白质。经发现克隆A9及B9为最高产量者，并如上述于静态培养下测试。A9的静态培养的重组蛋白质产量为1,800毫微克/毫升，而B9的静态培养的重组蛋白质产量为2,108毫微克/毫升。
该细胞系是由限制稀释克隆法亚克隆之，并测试其重组蛋白质的产量。初级克隆A9D5、A9G4、A9C7、B9H3、B9G4、及B9H5经辨认为于24小时，其scDR2/MBP-Cκ产率为200至300毫微克/毫升。该克隆于静态培养的重组蛋白制备是如上述的方法进行。
本发明已参考其优选实施例加以说明。但须知在未脱离本发明的精神与范围下，熟知本领域的技术人员可作修饰或改进。

Claims (23)

1.一种具有能增加氨基酸序列表达的细胞系的制备方法，该方法包括：
(a)将第一载体导入宿主细胞中，该第一载体包括与编码该氨基酸序列片段操纵联结的第一选择序列，
(b)于有益于选择出该第一载体的生长条件下培养宿主细胞，
(c)分离出可在第一表达量表达氨基酸序列的细胞(第一高表达细胞)，
(d)将编码该氨基酸序列的第二载体导入以第一表达量表达的细胞中，
(e)使细胞接受有益于在比该第一表达量更高的第二表达量表达氨基酸序列的条件，
(f)分离出在第二表达量表达氨基酸序列的细胞以制备细胞系(第二高表达细胞)。
2.如权利要求1所述的制备方法，其中该方法进一步包括：
(g)将编码该氨基酸序列的第三载体导入该在第二表达量表达的细胞中，及使该细胞接受有益于在比该第二表达量更高的第三表达量表达氨基酸序列的条件下；及
(h)分离出在第三表达量表达该氨基酸序列的细胞以制造细胞系(第三高表达细胞)。
3.如权利要求2所述的制备方法方法，其中该方法进一步包括将编码该氨基酸序列的载体导入该第三高表达细胞中，及使该细胞接受有益于在比该第三表达量更高的表达量表达氨基酸序列的条件下，重复该导入载体与该接受条件步骤至少一次，以分离出在比该第三高表达细胞更高表达量的表达氨基酸序列高的细胞系。
4.如权利要求1所述的制备方法，其中该第(b)步骤进一步包括将该细胞生长于含有至少一种用以筛选第一选择序列的药物的选择性培养基中。
5.如权利要求1所述的制备方法，其中该第(d)步骤进一步包括将第四载体导入该细胞中，及使该细胞接受有益于在第二表达量表达氨基酸序列的条件。
6.如权利要求5所述的制备方法，其中该第四载体进一步包括第二选择序列。
7.如权利要求6所述的制备方法，其中该第四载体进一步包括与编码该氨基酸序列的片段操纵联结的第二选择序列。
8.如权利要求6所述的制备方法，其中该方法进一步包括将细胞生长于含有至少一种用以筛选第二选择序列的药物的选择性培养基中。
9.如权利要求5所述的制备方法，其中该第四载体进一步包括编码选择性细胞表面标记的序列。
10.如权利要求9所述的制备方法，其中该选择性细胞表面标记系操纵联结于编码该氨基酸序列的片段。
11.如权利要求9所述的制备方法，其中该方法进一步包括以层析、细胞淘洗法、流式细胞计量术、免疫沉淀或抗体结合方法中至少一种方法分离出可表达细胞表面标记的细胞。
12.如权利要求2所述的制备方法，其中该第(g)步骤进一步包括将第五载体导入该细胞中，及使该细胞接受有益于在第三表达量表达该氨基酸序列的条件。
13.如权利要求12所述的制备方法，其中该第五载体进一步包括第三选择序列。
14.如权利要求13所述的制备方法，其中该第三选择序列系操纵联结于编码该氨基酸序列的片段。
15.如权利要求13所述的制备方法，其中该方法进一步包括将细胞生长于含有至少一种用以筛选第三选择序列的药物的选择性培养基中。
16.如权利要求12所述的制备方法，其中该第五载体进一步包括编码选择性细胞表面标记的序列。
17.如权利要求16所述的制备方法，其中该选择性细胞表面标记系操纵联结于编码氨基酸序列的片段。
18.如权利要求16所述的制备方法，其中该方法进一步包括以层析、细胞淘洗法、流式细胞计量术、免疫沉淀或抗体结合方法中至少一种方法分离出可表达细胞表面标记的细胞。
19.如权利要求1所述的制备方法，其中该第二高表达细胞的氨基酸序列表达量以抗体反应性决定，表达出相对于该第一高表达细胞为约3倍至约40倍以上的氨基酸序列表达量。
20.如权利要求2所述的制备方法，其中该第三高表达细胞的氨基酸序列表达量以抗体反应性决定，表达出相对于该第二高表达细胞为约3倍至约40倍以上的氨基酸序列表达量。
21.如权利要求1所述的制备方法，其中该氨基酸序列编码免疫球蛋白的重链至轻链或其功能性片段。
22.如权利要求2所述的制备方法，其中该载体可各自分别编码第一抗药基因、细胞表面标记、或第二抗药基因，及进一步各该载体操纵联结于氨基酸序列。
23.一种如权利要求1、2或3所述的制备方法产生的细胞系。
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Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001271614B2 (en) * 2000-07-03 2007-05-31 Catalent Pharma Solutions, Llc Host cells containing multiple integrating vectors
US20030224415A1 (en) * 2001-06-29 2003-12-04 Gala Design, Inc. Selection free growth of host cells containing multiple integrating vectors
WO2003064659A1 (en) * 2002-01-11 2003-08-07 Genetica, Inc. Methods and compositions for optimizing recombinant expression
WO2003096966A2 (en) * 2002-05-21 2003-11-27 Resistentia Pharmaceuticals Ab Chimeric ige polypeptides and host cells
JP2006517415A (ja) * 2003-01-09 2006-07-27 ジェネンテック・インコーポレーテッド ポリペプチドの精製
US20050221429A1 (en) * 2004-01-16 2005-10-06 Cardinal Health Pts, Llc Host cells containing multiple integrating vectors comprising an amplifiable marker
WO2007085266A1 (en) * 2006-01-30 2007-08-02 Dako Denmark A/S High-speed quantification of antigen specific t-cells in whole blood by flow cytometry
WO2008116468A2 (en) 2007-03-26 2008-10-02 Dako Denmark A/S Mhc peptide complexes and uses thereof in infectious diseases
EP3620465A1 (en) 2007-07-03 2020-03-11 Dako Denmark A/S Improved methods for generation, labeling and use of mhc multimers
EP2197908A2 (en) 2007-09-27 2010-06-23 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
DK2254592T3 (da) 2008-02-28 2019-09-09 Dako Denmark As MHC-multimerer til Borrelia-diagnostik og sygdom
WO2010009735A2 (en) * 2008-07-23 2010-01-28 Dako Denmark A/S Combinatorial analysis and repair
GB0817244D0 (en) 2008-09-20 2008-10-29 Univ Cardiff Use of a protein kinase inhibitor to detect immune cells, such as T cells
US10369204B2 (en) 2008-10-02 2019-08-06 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
US20100183558A1 (en) 2008-10-17 2010-07-22 Zhennan Lai Safe lentiviral vectors for targeted delivery of multiple therapeutic molecules
EP3319631A4 (en) 2015-07-08 2019-01-09 American Gene Technologies International Inc. HIV PREMUNICATION AND IMMUNOTHERAPY
CA3011529A1 (en) 2016-01-15 2017-07-20 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta t-cells
US10137144B2 (en) 2016-01-15 2018-11-27 American Gene Technologies International Inc. Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells
JP7153332B2 (ja) 2016-02-08 2022-10-14 アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド Ｈｉｖワクチン接種および免疫療法
DK3426777T3 (da) 2016-03-09 2022-04-25 American Gene Tech Int Inc Kombinationsvektorer og fremgangsmåder til behandling af cancer
EP3468617A4 (en) 2016-06-08 2020-01-22 American Gene Technologies International Inc. INTEGRATED VIRAL ADMINISTRATION SYSTEM AND RELATED METHODS
IL300730A (en) 2016-07-08 2023-04-01 American Gene Tech Int Inc Pre-HIV vaccine and immunotherapy
EP3487507A4 (en) 2016-07-21 2020-04-08 American Gene Technologies International, Inc. VIRAL VECTORS FOR THE TREATMENT OF PARKINSON'S DISEASE
KR20190136048A (ko) 2017-04-03 2019-12-09 아메리칸 진 테크놀로지스 인터내셔널 인코포레이티드 페닐케톤뇨증을 치료하기 위한 조성물 및 방법

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3167442D1 (en) * 1980-07-07 1985-01-10 Nat Res Dev Improvements in or relating to cell lines
US4766067A (en) * 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
IL80511A0 (en) * 1985-11-05 1987-02-27 Genetics Inst Multiply amplifiable vectors for high level expression of exogenous dna
BR8805646A (pt) * 1987-02-27 1989-10-17 Gist Brocades Nv Processo para amplificacao de genes estaveis em adn cromossomico de microorganismos procarioticos
US4956288A (en) * 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
WO1989010959A1 (en) * 1988-05-06 1989-11-16 Codon Supertransformants for high expression rates in eukaryotic cells
AU644352B2 (en) * 1988-12-08 1993-12-09 Damon Biotech Inc. Expression induction method employing mutant dhfr gene
EP0587791B1 (en) * 1991-05-31 2004-04-07 Genentech, Inc. Enhancement of expression by gene targeting in endogenous retrovirus-like sequences
US5733761A (en) * 1991-11-05 1998-03-31 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5420019A (en) * 1993-02-02 1995-05-30 Xoma Corporation Stable bactericidal/permeability-increasing protein muteins
WO1995005452A2 (en) * 1993-08-12 1995-02-23 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5585237A (en) * 1993-10-25 1996-12-17 Creative Biomolecules, Inc. Methods and compositions for high protein production from recombinant DNA
US5733782A (en) * 1993-10-25 1998-03-31 Creative Biomolecules, Inc. Methods and compositions for high protein production from non-native DNA
WO1995017513A1 (en) * 1993-12-23 1995-06-29 Novo Nordisk A/S Retransformation of filamentous fungi
US5776746A (en) * 1996-05-01 1998-07-07 Genitope Corporation Gene amplification methods

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Publication number Publication date
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