KR101555658B1 - 재조합 폴리클로날 단백질의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 폴리클로날 단백질 조성물, 특히 재조합 폴리클로날 항체 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 변이성 핵산 서열의 콜렉션으로 트랜스펙션된 세포 콜렉션을 수득하는 것을 포함하며, 여기서 콜렉션 중의 각 세포는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 엔코딩하는 콜렉션의 한 구성원으로 트랜스펙션되고 이를 발현시킬 수 있다. 세포는 세포 또는 배양 상청액으로부터 수득된 폴리클로날 단백질을 발현시키기에 적합한 조건하에 배양된다. 핵산 서열은 벡터 콜렉션으로 트랜스펙션됨으로써 세포로 도입된다. 본 방법은 치료적 용도를 위한 재조합 폴리클로날 항체의 제조에 적합하다.

Description

재조합 폴리클로날 단백질의 제조 방법{METHOD FOR MANUFACTURING A RECOMBINANT POLYCLONAL PROTEIN}

본 발명은 부위-특이적 통합(integration)과 무관한 생성 시스템을 이용하여, 재조합 폴리클로날 단백질, 예컨대 면역글로불린 슈퍼패밀리로부터의 단백질, 예를 들어 가용성 또는 막-결합된 형태의 B 또는 T 세포 수용체를 생성하는 것에 관한 것이다.

감염성 질환 및 암과 같은 많은 질환에 대한 효과적인 치료제가 부족하다. 모노클로날 항체는 일반적으로 이들 모든 표적에 대해 성공적이지 않은데, 이는 부분적으로 복잡한 표적의 변이가능성 및 표적 단백질의 적응 돌연변이로 인해 모노클로날 항체 인식으로부터 면역 회피를 초래할 수 있기 때문이다. 한편, 폴리클로날 항체는, 예를 들어 바이러스, 세균 또는 암 세포에 대한 다수의 동적 표적을 표적화할 수 있다. 또한, 폴리클로날 항체는 항원이 돌연변이될 경우에도 활성을 유지시킬 가능성이 가장 높다.

시판되는 상이한 폴리클로날 항체 치료제로는 1) 정상적인 사람 도너(donor)의 혈액으로부터 분리된 정상적인 사람 면역글로불린; 2) 이전에 항체가 감염 또는 백신화에 의해 마주쳤던 특정 질환 표적, 예를 들어 바이러스에 대한 항체를 수반 하는 개별적 사람 도너의 혈액으로부터 유도된 사람 과면역 면역글로불린; 및 3) 면역화된 동물의 혈액으로부터 유도된 동물 과면역 면역글로불린을 포함하는 것이 있다.

사람 혈액으로부터 정제된 면역글로불린은 B형 간염 바이러스, 합포체성 폐렴 바이러스, 시토메갈로바이러스 및 기타 헤르페스 바이러스, 라비에스 바이러스, 보툴리늄 독소 등으로의 감염에 대해 효과적이며, 신생아 레수스 D(rhesus D) 예방에 효과적이라는 것이 입증되었다. 사람 T 세포로 면역화된 토끼의 혈액으로부터 정제된 면역글로불린은 이식 거부의 치료 또는 예방에서 T 세포 면역억제를 유도하는데 사용된다 (예를 들어, 티모글로불린). 정상 사람 면역글로불린은 면역결핍환자의 면역 시스템을 증대시키는데 사용되었으며, 다양한 자가면역 질환의 치료에 사용된다.

그럼에도 불구하고, 널리 보급된 면역글로불린 사용은 도너 혈액 원료의 한정된 공급, 배치 대 배치(batch-to-batch) 변화로 인한 문제, 및 안전성의 변화 가능성으로 인해 제한되어 왔다. 특히 동물 유도된 면역글로불린은 1980년대 및 1990년대의 동물 유도된 모노클로날 항체에 대해서 관찰되었던 것과 동일한 면역원성 문제에 직면하게 된다. 마지막으로, 기타 혈액 생성물과 마찬가지로, HIV, 헤르페스 또는 간염 바이러스 또는 프리온과 같은 감염제로 전염될 위험성이 있다. 따라서, 임상의는 폴리클로날 항체가 일부 상황하에서는 바람직한 치료제일 수 있음을 인지하고 있으나, 이들의 사용은 극히 제한적이다.

유전자이식 동물 기술로 사람 면역글로불린을 생성시키기 위한 새로운 접근법이 시도되었다. 사람 면역글로불린 유전자좌를 함유하는 유전자이식 마우스를 생성시켰다 (미국 특허 6,111,166). 이들 마우스는 충분한 사람 면역글로불린을 생성시키고, 특이적 표적에 대한 항체가 일반적인 면역화 기술에 의해 유도될 수 있다. 그러나, 더 많은 항체 수득은 마우스의 크기가 비교적 작기 때문에 제한된다. 더 큰 동물, 예를 들어 소가 또한 사람 면역글로불린 유전자를 위해 유전자이식되었다 (Kuroiwa, Y. et al. Nature Biotechnology; 2002; 20: 889-893). 그러나, 이러한 동물의 혈액으로부터 치료용 폴리클로날 항체를 생성하는 것은 복잡하다. 먼저, 동물과 사람의 면역생리가 상당히 상이할 수 있으며, 이는 유도된 면역 레퍼토리, 작용성 재배열 및 다양한 항체 반응에 있어서의 차이를 초래할 수 있다. 두 번째로, 도입된 면역글로불린 유전자좌의 유사분열 불안정성은 장기간의 항체 생성에 영향을 미칠 수 있다. 세 번째로, 동물 자체의 면역글로불린 유전자좌를 제거하여, 예를 들어 동물 항체 생성이 사람 항체의 생성을 초과하지 않게 하는 것은 기술적으로 매우 어렵다. 네 번째로, 바이러스, 프리온 또는 기타 병원체와 같은 감염제로 전염될 위험성은 동물에서 생성된 사람 항체의 투여와 수반되어 발생한다.

최근에, 생성시의 도너 이용가능성과 무관한 신규한 유형의 폴리클로날 항체가 개발되었다. 이러한 폴리클로날 항체는 요망되는 표적에 대한 면역 반응을 지니는 도너로부터의 핵산 서열을 엔코딩하는 항체를 단리시킨 다음, 요망되는 표적에 특이적으로 결합되는 항체를 스크리닝함에 의해 생성된다. 이 폴리클로날 항체는 조정된 포유동물 발현 기술에 의해 제조될 수 있고, 이는 WO 2004/061104에 개 시된 대로 각 세포의 동일한 게놈 부위로의 하나의 항체 발현 플라스미드의 부위-특이적 통합에 기초한다. 이러한 신규한 유형의 폴리클로날 항체의 일례가 레수스 D에 대한 재조합 폴리클로날 항체이다 (WO 2006/007850). 부위-특이적 통합의 이용은 각 세포가 단일 복사체를 함유하고 발현 수준 및 성장 속도가 비교적 균일하게 예측되는 세포 군집을 야기한다.

발명의 개요

본 발명은 단백질의 폴리클론성을 유지하면서, 부위-특이적 통합과 무관하고 이에 따라 생산 세포주의 선택에 관해 증가된 융통성을 제공하는, 재조합 폴리클로날 단백질을 생성하는 대안적인 방법을 제공한다. 또한, 발현 수준은 부위-특이적 통합으로 가능한 것보다 높을 수 있다.

본 발명의 접근법은 숙주 세포로의 관심있는 개개 유전자의 무작위 통합에 이어서 요망되는 특성을 지니는 단일 세포의 클로닝에 기초한다. 폴리클로날 단백질의 개개 구성원을 각각 제공하는 개개 세포 클론을 이후 혼합시켜 폴리클로날 단백질을 생성하기 위한 폴리클로날 제조용 세포주를 생성한다.

폴리클로날 항체는 일반적으로 가장 널리 공지된 폴리클로날 단백질이다. 재조합 발현 시스템에서 생성될 때 폴리클로날 항체와 같은 치료 가능성을 지닐 수 있는 가용성 형태로 수득될 수 있는 T 세포 수용체 (TcR)도 마찬가지이다. 그러나 본 발명의 재조합 발현 시스템에서는 반드시 동종일 필요가 없는 단백질, 예컨대 특정 결핍이나 질환에서 공지된 관련성을 지니는 상이한 단백질도 조합시킬 수 있다. 본 발명은 폴리클로날 항체에 의해 예시될 것이나, 폴리클로날 TcR 및 함께 제조하는 것이 요망될 수 있는 다른 폴리클로날 단백질을 포함하고자 한다. 이러한 단백질은 요망되는 경우 융합 단백질일 수도 있다.

본 발명은, 예컨대 약제학적 조성물로 사용하기 위해 하나의 컨테이너에서 재조합 폴리클로날 단백질의 대량 생산을 가능하게 한다. 본 발명의 한 가지 중요한 특징은 제조 공정 동안 폴리클로날 단백질을 구성하는 개별적 분자의 바이어스(biased) 발현이 낮은 수준으로 유지되고, 원하지 않은 배치-대-배치 변화를 최소화하며, 제조 동안 폴리클로날 항체의 구성원들의 제거를 피한다는 것이다.

일 양태에서, 본 발명은 2 내지 n개의 별개의 구성원을 포함하는 폴리클로날 단백질을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주를 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 a) 한 세트의 발현 벡터를 제공하는 단계로서, 상기 벡터 각각이 상기 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 엔코딩하는 별개의 핵산의 하나 이상의 복사체를 포함하는 단계; b) 숙주 세포를 발현 벡터가 세포의 게놈으로 부위-특이적 통합되는 것을 회피하는 조건하에 상기 발현 벡터 각각으로 따로따로 트랜스펙션시켜 세포의 2 내지 n개의 조성물을 수득하는 단계로서, 각 조성물은 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 발현시키는 단계; 및 c) 세포의 상기 2 내지 n개의 조성물을 혼합시켜 폴리클로날 세포주를 수득하는 단계를 포함한다.

바람직한 구체예에서, 폴리클로날 세포주를 폴리클로날 제조용 세포주로서 이용하고 동결 및 저장하고 폴리클로날 마스터 세포 뱅크(pMCB)로서 이용하며, 이로부터의 샘플 (예컨대, 앰플)을 해동시켜 재조합 폴리클로날 단백질의 제조 또는 폴리클로날 워킹 세포 뱅크(pWCB)의 생성을 위해 직접 이용할 수 있다.

일 구체예에서, 발현 벡터는 에피솜 벡터이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 수주 세포의 게놈으로 안정하게 무작위 통합된다. 발현 벡터는 숙주 세포의 하나 이상의 염색체에서 임의의 위치에 안정하게 통합될 수 있다.

바람직하게는 단계 b)에서 수득된 트랜스펙션된 세포를 클로닝시킨다. 일 구체예에서, 클로닝은 본원에 개시된 대로 FACS 클로닝을 이용하여 수행된다.

클론은 성장 속도, 배가 시간, 발현 수준, 생산 수준, 시간에 따른 생산 안정성, 생존력, 내구력, 강건성, 형태학, 및 복사체 수로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표준에 대해 선택될 수 있다. 바람직하게는, 클론이 하나 이상의 표준에 관한 균일성에 대해 선택된다. 보다 바람직하게는, 클론이 배가 시간 및 발현 수준에 관한 균일성에 대해 선택된다.

하나의 클론이나 하나를 초과하는 클론을 각 별개의 폴리클로날 단백질 구성원에 대해 선택할 수 있다. 따라서, 2개의 클론을 각 별개의 폴리클로날 단백질 구성원에 대해 선택하거나, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 클론을 선택할 수 있다.

상이한 별개의 구성원을 발현시키는 세포의 조성물을 1:1 비 또는 1:1 비와 상이한 비로 혼합시킬 수 있다.

바람직하게는, 발현 벡터가 폴리클로날 단백질의 코딩 서열에서의 변화를 제외하고는 동일하다.

본 방법은 단량체 및 다합체 폴리클로날 단백질 둘 모두에 적용될 수 있다.

다합체 단백질의 경우, 하나의 발현 벡터가 한 별개의 폴리클로날 단백질 구성원의 모든 서브유닛을 엔코딩할 수 있다. 대안적으로, 단계 a)의 발현 벡터의 세트는 발현 벡터의 둘 이상의 서브셋으로 구성되고, 여기서 제1 서브셋은 단백질의 하나의 서브유닛을 엔코딩하는 변이성 핵산 서열을 포함하고, 제2 서브셋은 단백질의 또 다른 서브유닛을 엔코딩하는 변이성 핵산 서열을 포함함으로써, 각 트랜스펙션이 발현 벡터의 제1 서브셋으로부터의 구성원 및 제2 서브셋에 대한 구성원으로 수행된다. 이러한 트랜스펙션은 동시에 일어나거나 순차적일 수 있다. 구체적으로, 단계 a)의 발현 벡터의 세트는 발현 벡터의 두 서브셋으로 구성될 수 있는데, 여기서 제1 서브셋은 항체 중쇄를 엔코딩하는 변이성 핵산 서열을 포함하고, 제2 서브셋은 항체 경쇄를 엔코딩하는 변이성 핵산 서열을 포함함으로써, 각 트랜스펙션이 발현 벡터의 제1 서브셋으로부터의 구성원 및 제2 서브셋에 대한 구성원으로 수행된다.

본 발현 벡터 또는 추가의 발현 벡터는 선택가능한 마커를 엔코딩하는 것이 바람직하다. 게다가, 세포는 선택가능한 마커를 발현시키는 세포의 성장을 촉진하는 조건하에 연속하여 배양된다. 이것은 유전자 생성물을 포함하는 선택가능한 마커를 이용함에 의해 가장 잘 보장되는데, 이러한 유전자 생성물은 숙주 세포에 결핍되어 있다. 일 구체예에서 선택가능한 마커는 폴리펩티드 구성원 또는 상기 폴리펩티드 구성원의 서브유닛도 엔코딩하는 전사체에 의해 엔코딩되며, 바람직하게는 선택가능한 마커가 가장 큰 서브유닛을 엔코딩하는 전사체에 의해 엔코딩된다.

본 발명의 일 양태는 폴리클로날 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 폴리클로날 단백질은 2-n개의 별개의 구성원들을 포함하고, 상기 방법은 a) 본 발명의 방법을 이용하여 수득된 폴리클로날 세포주를 제공하는 단계; b) 폴리클로날 단백질을 발현시킬 수 있는 조건하에 폴리클로날 세포주를 배양하는 단계; 및 c) 세포 또는 배지로부터 폴리클로날 단백질을 회수하고 임의로 정제시키는 단계를 포함한다.

본 발명자들은 놀랍게도 개개 클론의 분포가 재조합 약물 생성물의 산업적 제조를 위한 조건을 대표하는 생산 사이클의 모의시험 동안 유지되는 것을 확인하였다. 이것은 폴리클로날 항체의 개개 구성원에 대한 발현 벡터가 상이한 위치에 통합되고 복사체 수가 상이하기 때문에 매우 놀라운 것이다. 이것은 발현 수준 및 성장 속도 둘 모두에서 차이를 야기할 수 있었다.

예상과 달리, 제조는 폴리클로날 항체의 하나 이상의 구성원의 완전하거나 부분적인 손실을 초래하지 않았다. 상이한 세포주 사이에 심지어 성장 속도에 근소한 차이가 있는 경우에도, 폴리클로날 조성물은 경시적으로 폴리클로날 조성물의 하나 이상의 구성원의 완전하거나 부분적인 손실을 초래할 것으로 예상된다. 따라서, 본 발명의 구체예에서, 조성물의 안정성은 워킹 세포 뱅크의 해동 이후 10회를 초과하는 세포 분열 동안, 바람직하게는 15회를 초과하는 세포 분열, 예컨대 20회를 초과하는 세포 분열, 예를 들어 25회를 초과하는 세포 분열, 예컨대 30회를 초과하는 세포 분열, 예를 들어 40회를 초과하는 세포 분열, 예컨대 50회를 초과하는 세포 분열, 예를 들어 75회를 초과하는 세포 분열, 예컨대 100회를 초과하는 세포 분열 동안 유지된다.

첨부된 실시예는 조성물의 안정성이 25회를 초과하는 세포 분열 동안 허용되는 한계 내에서 유지됨을 보여준다.

분리된 트랜스펙션이 광대한 대다수의 경우에 바람직하나, 트랜스펙션 이전에 발현 벡터의 풀링(pooling)이 특정 조건하에 가능하다. 폴리클로날 단백질이 단량체인 경우, 하나의 세포가 폴리클로날 단백질의 상이한 여러 구성원을 발현시키는 것은 문제가 아니므로, 이것은 실제로 옵션이다. 폴리클로날 단백질이 다합체인 경우, 하나의 복사체만이 세포마다 삽입되도록 보장하는 수단을 이용하는 경우에만 트랜스펙션 전에 발현 벡터의 풀링이 가능하다. 그렇지 않으면 서브유닛의 요망되지 않는 스크램블링이 일어날 수 있다.

발현 벡터의 풀링이 일정한 가능성을 지닌다고 해도, 조성물의 안정성을 유지하는 것과 관련하여 덜 강건한 제조 시스템을 초래할 것으로 예상되므로, 이것은 분리된 트랜스펙션 보다 덜 바람직하다.

본 발명의 두 방법 모두에서, 폴리클로날 단백질은 보통 발현이 수행되는 세포와 자연적으로 관련이 없는 것으로 이해될 것이다.

본 발명은 변이성 핵산 서열의 라이브러리를 숙주 세포주에 도입시켜 폴리클로날 제조용 세포주로서 적합한 세포의 콜렉션을 생성하는 여러 방법을 기술한다. 이러한 방법은 라이브러리로의 세포 콜렉션의 대규모(bulk) 트렌스펙션, 라이브러리 분획으로의 세포의 분취물의 중규모(semi-bulk) 트랜스펙션, 또는 바람직하게는 숙주 세포를 라이브러리의 개개 구성원으로 트랜스펙션시키는 개별적 트랜스펙션 후, 선택시 생성된 클론을 풀링하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명은 숙주 세포주로서 포유동물 세포 (세포주 또는 세포 유형)를 사용한다.

본 발명의 일 양태에서, 폴리클로날 단백질의 개개 구성원은 독립적인 유전자 세그먼트의 쌍으로부터 엔코딩된다. 개개 구성원이 두 개 이상의 폴리펩티드 사슬로 이루어진 폴리클로날 단백질은 가용성 또는 막-결합된 형태의 항체 및 T 세포 수용체를 포함한다. 본 발명의 추가의 구체예에서, 한 쌍의 유전자 세그먼트는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 또는 T 세포 수용체 알파쇄 및 베타쇄 가변 영역이나 T 세포 수용체 감마쇄 및 델타쇄 가변 영역을 엔코딩한다.

본 발명은 재조합 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 발현시키는 세포 각 군집의 2 내지 n개 군집을 포함하는 폴리클로날 세포주를 추가로 제공하고, 세포는 게놈으로 무작위 통합된 하나 이상의 발현 구성물을 포함한다. 일 구체예에서, 하나 이상의 발현 구성물은 염색체외 엘리먼트로 무작위 통합된다. 또 다른 구체예에서, 하나 이상의 발현 구성물은 숙주 세포의 하나 이상의 염색체에서 임의의 위치에 통합된다.

세포주는 바람직하게는 포유동물 세포주, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포 (예를 들어, Sp2/0 세포, NS0, YB2/0), NIH 3T3, 섬유모세포 또는 무한증식되는 사람 세포, 예컨대 HeLa 세포, HEK 293 세포 또는 PER.C6로부터 유래된다. 그러나, 포유동물 이외의 진핵생물 세포 또는 원핵생물 세포, 예컨대 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 세균, 진균 등이 또한 사용될 수 있다.

추가의 양태에서, 본 발명은 항시적(constitutive) 프로모터에 작동가능하게 결합된 아데노바이러스 타입 5 트랜스활성화제 E1A를 엔코딩하는 안정하게 통합된 핵산을 포함하는 DHFR 네거티브 CHO 세포에 관한 것이다.

이러한 변형된 CHO 세포주는 본 발명의 다른 양태를 이끄는 실험을 위해 구성되었다. 세포주는 본원에 포함된 실시예에 제시된 대로 성장 속도와 발현 수준의 균일성 및 이들의 경시적인 안정성과 관련하여 예외적으로 안정한 것으로 판명되었으므로, 본 발명의 방법에 사용하기에 특히 적합하다. 이후의 실험은 E1A mRNA가 2회 서브-클로닝된 세포에서 검출될 수 없음을 나타내었다. 이것은 현저한 조성물의 안정성을 나타내는 결과가 오직 E1A 발현에만 기인할 수 없는 것임을 의미한다. E1A를 안정하게 발현시키는 DHFR 네거티브 CHO 세포주는 여전히 매우 안정하고 높은 발현의 세포주를 초래할 것으로 예측된다.

바람직한 구체예에서, 세포주는 동종접합 DHFR 녹아웃인 DG44 세포주로부터 유래된다. 이 세포주는 세포가 재조합 DHFR 발현 구성물을 포함하는 경우 티미딘 결핍 배지에서만 생존할 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 발명의 세포주는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 안정하게 통합된 발현 구성물의 하나 이상의 복사체를 추가로 포함한다. 관심있는 폴리펩티드는 다합체 단백질일 수 있고, 바람직하게는 다합체 단백질이 항체이다.

티미딘 결핍 배지에서의 선택을 가능하게 하기 위하여, 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 발현 구성물은 dhfr을 추가로 엔코딩한다.

바람직하게는 dhfr 및 관심있는 폴리펩티드의 하나 이상의 서브유닛이 동일한 전사체에 의해 엔코딩되고, 바람직하게는 dhfr이 가장 큰 서브유닛을 코딩하는 전사체에 의해 엔코딩된다. 이것은 요망되는 생성물, 관심있는 폴리펩티드, 및 선택 마커, dhfr간에 강력한 결합을 유도하고, 생존하는 세포가 관심있는 폴리펩티드를 발현시키도록 보장한다.

관심있는 폴리펩티드의 발현을 추가로 개선시키기 위하여, 관심있는 폴리펩티드의 발현은 전사 활성화제 E1A에 의해 트랜스활성화될 수 있는 하나 이상의 프로모터에 의해 제어될 수 있고, 바람직하게는 프로모터가 CMV 프로모터이거나 CMV 프로모터로부터 유래된다.

정의

"단백질" 또는 "폴리펩티드"는 길이 또는 번역 후 변형에 상관없이 아미노산의 임의의 사슬을 의미한다. 단백질은 2개 이상의 어셈블링된 폴리펩티드 사슬, 단백질 단편, 폴리펩티드, 올리고펩티드 또는 펩티드를 포함하는 단량체 또는 다합체로서 존재할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "폴리클로날 단백질" 또는 폴리클론성"은 바람직하게는 면역글로불린 슈퍼패밀리로부터 선택된 상이하나 상동인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 의미한다. 따라서, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동이나, 또한 폴리클로날 단백질의 개별적 구성원 사이의 아미노산 서열이 상이함을 특징으로 하는 가변성 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다. 이러한 폴리클로날 단백질의 공지된 예로는 항체 또는 면역글로불린 분자 또는 이의 유도체 (예컨대, Fab Fab₂; 단일 사슬 Fv 등), T 세포 수용체 및 B 세포 수용체를 포함한다. 폴리클로날 단백질은 단백질 분자의 규정된 서브셋으로 이루어질 수 있으며, 이는 예를 들어, 원하는 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체의 경우에 원하는 표적에 대한 공유된 결합 활성과 같은 공통의 특성에 의해 규정된다.

용어 "관심있는 폴리클로날 단백질"은, 예를 들어 표적 항원에 대한 결합 활성 또는 특이성에 의해 기술된 폴리클로날 항체의 경우, 원하는 표적에 대한 결합 활성과 같은 공통의 특성을 공유하는 규정된 폴리클로날 단백질 서브셋을 포함하며, 상기 항원은, 예를 들어 분리된 단백질, 미생물, 기생충, 세포 유형, 알레르겐 또는 탄수화물 분자, 또는 기타 구조물, 분자 또는 특이적 항체 결합의 표적이 될 수 있는 물질 또는 이들 항원의 혼합물 중 하나 이상이다.

용어 "재조합 폴리클로날 단백질 조성물의 하나의 구성원" 또는 "재조합 폴리클로날 단백질의 하나의 구성원"은 상이하나 상동인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물의 하나의 단백질 분자를 의미하며, 여기서 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동이나, 또한 폴리클로날 단백질의 개별적 구성원 간의 아미노산 서열의 차이를 특징으로 하는 가변성 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다.

용어 "가변성 폴리펩티드 서열" 및 "가변 영역"은 상호교환적으로 사용된다.

용어 "재조합 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원"은 상이하나 상동인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물 중의 하나의 단백질 분자를 의미하며, 여기서 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자에 대해 상동이나, 또한 폴리클로날 단백질의 개별적 구성원 간의 아미노산 서열의 차이를 특징으로 하는 가변성 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다.

용어 "항체"는 혈청의 작용성 성분을 나타내며, 이는 종종 분자 (항체 또는 면역글로불린) 콜렉션 또는 하나의 분자 (항체 분자 또는 면역글로불린 분자)로서 언급된다. 항체 분자는 특이적 항원 결정인자 (항원 또는 항원 에피토프)에 결합하거나 반응할 수 있으며, 이는 이어서 면역학적 효과기전을 유도할 수 있다. 개별적 항체 분자는 일반적으로, 모노특이적인 것으로 여겨지며, 항체 분자의 조성물은 (즉, 동일한 항체 분자로 이루어진) 모노클로날 또는 (즉, 동일한 항원 또는 심지어 별개의 상이한 항원상의 동일하거나 상이한 에피토프와 반응하는 상이한 항체 분자로 이루어진) 폴리클로날일 수 있다. 각각의 항체 분자는 독특한 구조를 지녀서, 이의 상응하는 항원에 특이적으로 결합할 수 있으며, 모든 천연 항체 분자는 두 개의 동일한 경쇄 및 두 개의 동일한 중쇄로 이루어진 전체적으로 동일한 기본 구조를 갖는다. 항체는 또한 집합적으로 면역글로불린으로서 공지되어 있다. 본원에 사용된 용어 항체 또는 항체들은 키메라 및 단일 사슬 항체, 및 항체의 결합 단편, 예컨대 Fab, Fv 단편 또는 scFv 단편 및 다합체, 예컨대 이합체 IgA 분자 또는 5가 IgM을 포함하고자 한다.

용어 "폴리클로날 항체"는 동일하거나 상이한 항원상의 여러 상이한 특이적 항원 결정인자에 결합하거나 반응할 수 있는 상이한 항체 분자의 조성물을 의미한다. 일반적으로, 폴리클로날 항체의 가변성은 폴리클로날 항체의 소위 가변 영역에 존재하는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명에서, 폴리클론성은 또한, 예를 들어 사람 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE, 또는 뮤린 이소타입 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 2개 이상의 항체 이소타입을 함유하는 항체 혼합물의 경우에서와 같이 소위 불변 영역에 존재하는 개별적 항체 분자간의 차이를 설명하기 위한 것으로 이해될 수 있다.

"관심있는 재조합 폴리클로날 항체"는 규정된 재조합 폴리클로날 항체 서브셋을 의미하며, 이는 원하는 표적 또는 원하는 표적 세트로의 결합능을 특징으로 하며, 상기 표적은, 예를 들어 분리된 단백질, 미생물, 기생충, 세포, 알레르겐 또는 탄수화물 분자, 또는 특이적 항체 결합의 표적이 될 수 있는 기타 구조물, 분자 또는 물질, 또는 이들의 혼합물이다.

용어 "면역글로불린"은 일반적으로 혈액 또는 혈청에서 발견된 항체 혼합물의 집합적 의미로서 사용되며, 또한 기타 공급원으로부터 유래된 항체의 혼합물을 지시하는데 사용될 수 있다.

용어 "면역글로불린 분자"는, 예를 들어 면역글로불린의 일부, 또는 임의의 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 조성물의 일부로서의 개별적 항체 분자를 의미한다.

폴리클로날 단백질의 구성원이 항원에 결합된다고 기술된 경우, 결합 상수는 1mM 미만, 바람직하게는 100nM 미만, 더욱 바람직하게는 10nM 미만인 것을 의미한다.

용어 "관심있는 변이성 핵산 분자의 라이브러리"는 "관심있는 재조합 폴리클로날 단백질"을 집합적으로 엔코딩하는 핵산 분자 콜렉션을 기술하는데 사용된다. 트랜스펙션에 사용되는 경우, 관심있는 변이성 핵산 분자의 라이브러리는 발현 벡터 라이브러리에 함유된다. 이러한 라이브러리는 전형적으로 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 1000, 10⁴, 10⁵ 또는 10⁶개 이상의 별개의 구성원들을 갖는다.

본원에 사용된 용어 "별개의 핵산 서열"은 함께 관심있는 단백질을 구성하는 상이한 폴리펩티드 사슬을 엔코딩할 수 있는 핵산 서열로서 이해되어야 한다. 별개의 핵산 서열이 하나를 초과하는 엔코딩 서열로 구성되는 경우, 이러한 서열들은 디시스트로닉(dicistronic) 전사 유닛의 형태일 수 있거나 적합한 프로모터에 작동가능하게 결합된 경우 두 분리된 전사 유닛으로서 작용할 수 있다. 유사하게, 관심있는 단백질이 3 또는 4개의 서브유닛으로 구성되거나, 선택 마커가 관심있는 단백질이나 이의 서브유닛을 코딩하는 핵산과 함께 전사 유닛으로 포함된 경우, 트리- 및 쿼트로시스트로닉(quattrocistronic) 전사 유닛의 이용이 고려될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 별개의 핵산 서열이 벡터와 같은 핵산 분자의 일부이다. 관심 있는 단백질의 완전한 분자를 발생시키기 위해 하나를 초과하는 엔코딩 서열이 요구되는 일부 예로는 B 세포 수용체, 항체 및 항체의 단편, 예컨대 Fab's 및 가변 도메인, 또는 T 세포 수용체가 있다. 세포로 도입될 때, 관심있는 완전히 어셈블링된 단백질을 함께 엔코딩하는 유전자가 동일한 벡터에 존재하여, 하나의 핵산 서열에서 함께 결합된다.

본원에 사용된 용어 "관심있는 유전자"는 관심있는 단백질의 한 구성원을 엔코딩하는 하나 이상의 유전자 세그먼트 (게놈 또는 cDNA)로 이루어진 핵산 서열을 의미한다. 복수 형태의 "관심있는 유전자들"은 관심있는 폴리클로날 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열의 라이브러리를 의미한다. 용어 "GOI"는 관심있는 유전자(들)의 약어로서 사용된다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 상이한 유전적 환경 간의 이동 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터가 벡터에 삽입된 핵산 서열의 전사를 위한 조절 요소 (적어도 적합한 프로모터)를 수반하는 경우, 본원의 벡터를 "발현 벡터"로서 칭하였다. 상기 동정된 벡터로 삽입된 핵산 서열이 본원에서 규정한 바와 같은 관심있는 단백질을 엔코딩하는 경우, 하기 용어 "관심있는 벡터" 및 "관심있는 발현 벡터"가 사용된다. 용어 "이소타입 엔코딩 벡터"는 이소타입 항체를 엔코딩하는 핵산 서열을 갖는 벡터를 의미한다. 본 명세서에서, "파지미드 벡터" 및 "파지 벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 상호교환적으로 사용된다. 본 발명은 적합한 숙주에서 원하는 단백질의 생성을 유도할 수 있는, 예를 들어 플라스미드, 파지미드 및 바이러스 게놈 또는 핵산 분자와 동일한 작용을 수행하는 기타 다른 형태의 벡터를 포함한다.

용어 "관심있는 벡터 라이브러리의 각각의 구성원"은 관심있는 벡터 라이브러리로부터 유도된 별개의 핵산 서열을 갖는 개별적 벡터 분자를 나타내는데 사용되며, 여기서 핵산 서열은 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 한 구성원을 엔코딩한다.

용어 "물질 전달"는 관심있는 핵산 서열을 한 군집의 벡터로부터 또 다른 군집의 벡터로 전달하는 것을 의미하며, 동시에 개별적 관심있는 DNA 분리물에 대해 재분류하지 않으면서 각각의 DNA에 대해서도 마찬가지다. 이러한 벡터 군집은, 예를 들어 관심있는 가변 영역, 프로모터, 리더 또는 인핸싱 요소를 함유하는 라이브러리일 수 있다. 그 후, 이들 서열은, 예를 들어 파지 벡터로부터 포유동물 발현 벡터로의 사전 분리 없이 이동될 수 있다. 특히 항체 서열에 있어서, 이러한 기술은 V_H 및 V_L 다양성간의 결합이, 예를 들어 선택 벡터 (예를 들어, 파지 디스플레이 벡터)로부터 포유동물 발현 벡터로 라이브러리를 이동시키는 동안 손실되지 않게 한다. 이에 의하여, V_H 및 V_L의 원래 쌍이 유지된다.

용어 "트랜스펙션"은 외래 DNA를 세포로 도입시키는 것을 뜻하는 광범위한 용어로서 사용된다. 이 용어는 또한, 외래 DNA를 세포로 도입시키는 기타 작용적으로 동등한 방법, 예를 들어 형질전환, 감염, 형질도입 또는 도너 세포와 억셉터 세포의 융합을 포함한다.

용어 "선택"은 특정한 특성을 습득할 수 없었던 세포로부터 이러한 특성이 습득된 세포를 분리가능하게 하는 방법을 설명하는데 사용된다. 이러한 특성은 세포 독성제에 대한 내성 또는 필수 영양소, 효소 또는 염료의 생성일 수 있다.

용어 "선택가능한 마커 유전자", "선택 마커 유전자", "선택 유전자" 및 "마커 유전자"는 선택가능한 마커를 엔코딩하는 유전자를 나타내는데 사용되며 (예를 들어, 일부 세포독성 약물 예컨대, 특정 항생물질에 대한 내성을 부여하는 유전자, 성장 배지로부터 고갈될 수 있는 필수 영양분을 생성시킬 수 있는 유전자, 검정가능한 대사산물을 생성하는 효소를 엔코딩하는 유전자, 또는 예를 들어, FACS에 의해 분류될 수 있는 착색된 단백질을 엔코딩하는 유전자), 이는 관심있는 유전자(들)과 함께 세포내로 공동도입된다.

용어 "재조합 단백질"은 단백질의 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙션된 세포주로부터 발현되는 단백질을 나타내는데 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "작동가능하게 결합된"은 기타 세그먼트와 작용적 관계에 있을 경우, 또 다른 세그먼트에 연결되는 세그먼트를 의미한다. 예를 들어, 시그널 서열을 엔코딩하는 DNA는 소포체로 폴리펩티드를 전달하는데 관여하는 리더로서 발현되는 경우, 폴리펩티드를 엔코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 또한, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사를 자극하는 경우, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

용어 "대부분의 개별적 세포"는 80% 초과, 바람직하게는 85% 초과, 더욱 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어는 99% 이상의 세포 백분율을 의미한다

본원에 사용된 바와 같은 용어 "게놈"은 세포에 존재하는 염색체의 정상적인 상보서열(complement) 뿐만 아니라, 또한 세포내로 도입되어 세포내에 존재할 수 있는 여분의-염색체 엘리먼트를 의미한다. 이러한 여분의-염색체 엘리먼트는 미니-염색체, YAC (효모 인공 염색체), MAC (마우스 인공 염색체) 또는 HAC (사람 인공 염색체)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라아제를 결합시키는데 관여하여 전사를 개시하는 DNA 영역을 의미한다.

용어 "헤드-투-헤드 프로모터"는 근접하게 위치하는 한 쌍의 프로모터로서, 프로모터에 의해 유도된 2개의 유전자 단편의 전사가 양 방향으로 발생하는 프로모터를 의미한다. 헤드-투-헤드 프로모터는 또한, 두 개의 프로모터 사이의 무관한 핵산으로 이루어진 스터퍼(stuffer)로 작제될 수 있다. 이러한 스터퍼 단편은 용이하게 500개 초과의 누클레오티드를 함유할 수 있다.

"항생물질 내성 유전자"는 세포에 대한 항생물질이 갖는 억제 또는 독성 효과를 극복하여, 항생물질의 존재하에 세포의 생존 및 계속적인 증식을 보장할 수 있는 단백질을 엔코딩하는 유전자이다.

용어 "내부 리보좀 도입 부위" 또는 "IRES"는 mRNA에 대한 정상적인 5' 캡-구조와는 상이한 구조를 나타낸다. 이 둘의 구조는 리보좀에 의해 인지되어 번역을 개시하는 AUG 코돈에 대한 스캐닝을 개시할 수 있다. 하나의 프로모터 서열 또는 두 개의 개시 AUG를 사용함으로써, 제1 및 제2 폴리펩티드 서열이 단일의 mRNA로부터 번역될 수 있다. 따라서, 단일의 바이-시스트로닉 mRNA로부터의 제1 및 제2 폴리누클레오티드 서열의 공동 번역을 가능하게 하기 위해, 제1 및 제2 폴리누클레오티드 서열은, IRES 서열의 폴리누클레오티드 서열 다운스트림의 번역을 가능하게 하는 IRES 서열을 포함하는 링커 서열을 통해 전사적으로 융합될 수 있다. 이러한 경우, 전사된 바이-시스트로닉 RNA 분자는 바이-시스트로닉 RNA 분자의 내부 IRES 서열과 캡핑된 5' 말단 둘 모두로부터 번역되어 제1 및 제2 폴리펩티드 둘 모두를 생성시킬 것이다.

용어 "유도가능한 발현"은 인듀서 분자의 상호작용이 요구되는 발현, 또는 발현이 수행되기 위한 보조억제 분자 및 조절 단백질의 방출이 요구되는 발현을 설명하는데 사용된다.

용어 "항시적 발현"은 일반적으로 유도될 수 없는 발현을 의미한다.

용어 "스크램블링(scrambling)"은, 예를 들어 면역글로불린 슈퍼패밀리로부터의 두 개 이상의 상이한 폴리펩티드 사슬로 각각 이루어진 폴리클로날 단백질의 2개 이상의 별개의 구성원들이 개별적 세포로부터 발현되는 상황을 나타낸다. 이러한 상황은 개별적 세포가 게놈으로 통합될 때, 한 쌍 이상의 유전자 세그먼트를 발생시킬 수 있으며, 여기서 각 쌍의 유전자 세그먼트는 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 엔코딩한다. 이러한 상황에서, 유전자 세그먼트로부터 발현된 폴리펩티드 사슬의 의도되지 않은 조합이 발생할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 사슬의 의도되지 않은 조합은 어떠한 치료학적 효과도 갖지 않는다.

용어 "V_H-V_L 사슬 스크램블링"은 상기 규정된 스크램블링의 한 예이다. 이러한 예에서, V_H-V_L 엔코딩 유전자 세그먼트는 한 쌍의 유전자 세그먼트로 이루어진다. V_H-V_L 폴리펩티드의 의도되지 않은 조합물이 두 개의 상이한 V_H-V_L 엔코딩 유전자 세그먼트 쌍이 동일한 세포로 통합된 세포로부터 생성되는 경우, 스크램블링이 발생한다. 이러한 스크램블링된 항체 분자는 원래의 특이성을 보유하지 않으며, 따라서 어떠한 치료학적 효과 또는 심지어 의도하지 않은 치료학적 효과도 갖지 않을 수 있다.

용어 "재조합 폴리클로날 생산 세포주"는 재조합 폴리클로날 생산 세포주를 함께 구성하는 개별적 세포가 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 하나의 구성원을 엔코딩하는 관심있는 별개의 핵산 서열의 하나 이상의 복사체를 지니고, 각각의 복사체가 각 세포의 게놈으로 통합되도록, 관심있는 변이성 핵산 서열 라이브러리로 트랜스펙션되는 단백질 발현 세포 군집을 의미한다. 재조합 폴리클로날 생산 세포주를 구성하는 세포는, 예를 들어 항생물질 선택에 의해 별개의 관심있는 핵산 서열의 통합된 복사체를 보유할 수 있는 이들의 능력에 대해 선택된다. 이러한 생산 세포주를 구성할 수 있는 세포는, 예를 들어 세균, 진균, 진핵생물 세포, 예컨대, 효모, 곤충 세포 또는 포유동물 세포, 특히 무한증식되는 포유동물 세포주 예컨대, CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 흑색종 세포 (예를 들어, Sp2/0 세포, NS0, YB2/0), NIH 3T3 및 무한증식되는 사람 세포 예컨대, HeLa 세포, HEK 293 세포 또는 PER.C6일 수 있다.

용어 "바이어스"는 재조합 폴리클로날 단백질 생성 동안의 현상으로서, 폴리클로날 벡터, 폴리클로날 세포주 또는 폴리클로날 단백질의 조성물이 무작위 유전적 돌연변이, 개별적 세포간의 증식 동력학 차이, 상이한 발현 구성물 서열간의 발현 수준의 차이, 또는 DNA의 클로닝 효과의 차이로 인해 시간의 경과에 따라 변화되는 현상을 나타내는데 사용된다.

용어 "RFLP"는 "제한 단편 길이 다형성"을 의미하며, 이로 인해 핵산 분자 단편의 이동성 겔 패턴은 제한 효소로의 절단 후에 검정된다.

용어 "5' UTR"은 mRNA의 5' 비번역된 영역을 의미한다.

용어 "부위 특이적 통합을 회피하는 조건"은 부위 특이적 통합을 수득하기 위한 임의의 가능한 방법을 포함하지 않는 트랜스펙션 공정을 언급한다. 부위 특이적 통합은, 예컨대 재조합효소의 조합물 및 숙주 세포의 염색체에서 재조합효소에 대한 인식 부위를 이용하여 달성될 수 있다. 재조합효소는 염색체의 특정 부위를 인식하는 누클레오티드 스트레치에 공유적으로 결합될 수도 있다. 부위-특이적 통합도 -비록 낮은 효율이긴 하나- 동종 재조합을 이용하여 달성될 수 있다. 통합 벡터를 이용하는 경우, 부위-특이적 통합을 회피하는 것은 종종 숙주 세포의 게놈 전체에 걸친 임의의 위치에서의 통합을 초래할 것이다.

용어 "무작위 통합"은 숙주 세포 게놈의 임의의 위치로 발현 벡터가 통합되는 것을 언급한다. 무작위의 사전적 의미는 각 항목, 본 경우에는 통합 부위에 대하여 동일한 기회가 존재한다는 것이다. 세포를 트랜스펙션시킬 때, 모든 통합 부위가 정말로 동일한 통합 기회를 나타내지는 않는데, 염색체의 몇몇 부분이 다른 것보다 더욱 통합을 일으키기 쉽기 때문이다. 특정 통합 부위로 발현 벡터를 인도하기 위해 아무것도 수행되지 않을 때, 이것은 가능한 통합 부위의 그룹 내에 있는 임의의 위치에서 통합될 것이다. 따라서, 본 발명의 문맥에서 "무작위 통합"은 발현 구성물을 소정의 위치로 인도하기 위해 아무것도 하지 않는 경우의 트랜스펙션 절차로서 이해되어야 한다. 발현 벡터를 소정의 위치로 인도하기 위한 수단의 부재는 "무작위 통합"을 확실하기 하기에 충분하다. 이에 의해, 통합 부위(들)는 트랜스펙션된 군집의 세포에서 세포로 다양할 수 있고, 정확한 통합 부위(들)는 예측될 수 없는 것으로 간주될 수 있다.

용어 "안정하게 통합된"은 숙주 세포의 게놈으로의 발현 벡터의 통합을 언급하며, 여기서 통합은 적어도 20 세대, 보다 바람직하게는 30 세대, 보다 바람직하게는 40 세대, 보다 바람직하게는 50 세대, 예컨대 75 세대, 예를 들어 100 세대 또는 이를 초과하는 동안 안정하게 유지된다.

약어: "CMV" = (사람) 시토메갈로 바이러스. "AdMLP" = 아데노바이러스 주요 후기 프로모터. SV40 폴리 A = 시미안 바이러스 40 폴리 A 시그널 서열. GFP = 녹색 형광 단백질. TcR = T 세포 수용체. ELISA = 효소 결합된 면역흡수 검정. LTR = 장(Long) 말단 반복.

도면의 설명

도 1. 폴리클로날 세포 뱅크를 생성하기 위한 공정의 개략도.

이 도면은 폴리클로날 세포 뱅크, 예컨대 폴리클로날 마스터 세포 뱅크를 수득하기 위해 요구되는 단계들을 도식적으로 설명한다. a)는 상이한 발현 벡터 N.A.₁, N.A.₂, N.A.₃ 등을 설명하고, 각각은 폴리클로날 단백질의 상이한 별개의 구성원을 엔코딩한다. b)는 발현 벡터로 트랜스펙션되는 숙주 세포를 설명한다. c)는 개개 세포의 상이한 위치에서 상이한 복사체 수로 발현 벡터를 통합하는 것을 설명한다. d)는 폴리클로날 단백질의 구성원 각각에 대한 세포 클론의 선택을 설명현다. 이러한 특정 경우에, 설명을 용이하게 하기 위해, 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원 당 하나의 클론만을 도시한다. 단계 e)는 폴리클로날 세포 뱅크를 생성하기 위해 단계 d)에서 선택된 클론을 혼합시키는 것을 설명한다.

도 2a. 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 원형 벡터

엘리먼트는 하기와 같다:

· 그 사이에 스페이서 엘리먼트를 지니는 두 동일한 헤드-투-헤드 사람 CMV 프로모터

· 중쇄 (VH + 감마 1 불변 영역) 및 경쇄 (카파 02-286)에 대한 코딩 영역

· bGH = 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열

· SV40 pA = SV40 폴리아데닐화 서열

· 중쇄 및 경쇄에 대한 게놈 리더

· IRES + DHFR = ECMV 내부 리보좀 도입 부위 및 마우스 다하이드로폴레이트 환원효소 cDNA

· pUB ori = 복제의 pUC 기점

· bla, amp = 암피실린 내성 유전자

도 2b. E1A 발현 벡터 pML29

엘리먼트는 하기와 같다: 벡터는 pcDNA3.1+에 기초한다 (Invitrogen)

CMV = 사람 CMV 프로모터

E1a = 아데노바이러스 타입 5 13S 트랜스활성화제에 대한 cDNA

bGH = 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열

SV40EP = SV40 조기 프로모터

Neo = neo 내성 유전자

SV40 폴리A = SV40 폴리아데닐화 영역

AMP = 암피실린 내성을 엔코딩하는 β-락타마아제 유전자

도 3. 5주 기간의 실험을 수행하는 동안 믹스 1-9의 IgG 함량. 상세한 것은 실시예 1을 참조한다.

도 4. 5주 배양 기간의 처음(흑색)과 끝에서(청색) 믹스 8의 조성을 나타내는 이온 교환 크로마토그램.

도 5. 9개 믹스 모두로부터의 최초(회색) 및 마지막(흑색) 샘플을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석하고, 각 개별적인 항체의 함량을 산출하여 그래프로 도시한다.

도 6. 시드 트레인 및 생물반응기 가동 내내 4개의 믹스로부터의 샘플 (실시예 5)을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 분석하고, 각 개별적인 항체의 함량을 산출하여 그래프로 도시한다.

믹스 1A-3A는 항체에 대한 단일 클론을 함유하였다. 6개의 항체를 각각 발현시키는 세포 클론들은 믹스 1A (도 6a), 믹스 2A (도 6b) 및 믹스 3A (도 6c)에서 상이하였다. 믹스 4A (도 6d)는 항체에 대한 3개의 클론을 함유하였다.

발명의 상세한 설명

재조합 폴리클로날 단백질 발현 시스템

본 발명은 바람직하게는 면역글로불린 슈퍼패밀리, 즉 면역글로불린-유사 도메인을 갖는 단백질의 패밀리로부터 선택된 재조합 폴리클로날 단백질의 안정된 생산 방법을 제공한다. 대부분의 구성원은 세포 표면 인식에 관련된다. 서열 분석은 항체, T 세포 수용체, MHC 분자, 일부 세포 부착 분자 및 시토킨 수용체가 고도로 상동임을 시사한다. 특히, 가변 영역을 함유하는 이러한 패밀리의 구성원은 본 발명에 따른 재조합 폴리클로날 단백질을 생성시키는데 적합하다. 이러한 구성원은 항체, 막 결합 항체 (B 세포 수용체), Fab 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv(scFv) 단편, T 세포 수용체 (TcR), 가용성 TcR, TcR 가변 도메인 단편, 폴리펩티드 링커 또는 기타 항체에 의해 결합된 TcR 가변 도메인 단편 또는 TcR 유래된 단편을 포함한다. 특히, 본 발명은 치료적 재조합 폴리클로날 항체 또는 TcR의 대규모 제조 및 생산을 위해 이용될 수 있다.

본 발명의 제조 방법의 주요 이점 중 하나는, 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 모든 구성원이 하나 또는 소수의 생물반응기 또는 이의 등가물 중에서 생성될 수 있다는 점이다. 또한, 재조합 폴리클로날 단백질 조성물은 공정 동안 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 개별적 구성원을 분리할 필요 없이 단일 제조물로서 반응기로부터 정제될 수 있다. 반대로, 정제된 모노클로날 항체를 혼합함으로써 재조합 폴리클로날 항체 조성물을 모방하길 원하는 경우 (예를 들어, WO 91/16074에 기술된 바와 같이), 생물반응기에서 각각의 항체가 조성물 중에 포함되도록 별도로 제조되어야 하며, 항체 역시 개별적으로 정제되어야 할 것이다. 모노클로날 혼합물의 이러한 생성은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 폴리클로날 항체 또는 기타 폴리클로날 단백질을 생성시키는 방법과 비교하여 매우 비용, 시간 및 공간 소모적이다. 이와 같이, WO 91/16074에 기술된 바와 같은 방법은 일반적으로 이러한 혼합물중에 포함될 수 있는 모노클로날 항체의 수를 실질적으로 제한할 것인 반면, 본원에 개시된 바와 같은 기술은 일반적으로 수많은 개별적 구성원을 원칙적으로는 상한없이 지니는 폴리클로날 항체를 생성시킬 수 있다.

사용된 숙주 세포주는 바람직하게는, 생약제학적 단백질 발현에 통상적으로사용되는 포유동물 세포주, 예를 들어 CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포 (예를 들어, SP2/0 세포, NS0, YB2/0), NIH 3T3, 및 무한증식되는 사람 세포 예컨대, HeLa 세포, HEK 293 세포, 또는 PER.C6이다. 본 발명에서는 CHO 세포, 보다 구체적으로 변형된 DG44 클론을 사용하였다. 이러한 특정 세포주는 CHO 세포가 재조합 항체의 제조에 광범하게 이용되고 DG44 클론이 엔코딩된 유전자의 증폭을 추가로 허락하는, 대사 선택 마커 DHFR과 함께 사용될 수 있기 때문에 선택되었다.

DG44 세포주는 발현 벡터를 엔코딩하는 E1A 트랜스활성화제로 트랜스펙션시킴에 의해 변형되었다. 이것은 관심있는 유전자가 CMV 프로모터에 작동가능하게 결합될 때, 전체적인 수율을 증가시키기 위해 수행되었다. CMV 프로모터는 E1A에 의해 트랜스활성화된다. 이 변형은 상이한 항체에 대해 균일한 성장 속도와 균일하고 높은 발현 수준을 지니는 세포 클론을 제공하는 예외적으로 안정한 세포주를 제공하였다. 따라서, 변형은 시간에 따라 조성물의 안정성을 개선시킬 것으로 여겨진다. 변형된 세포주에서 E1A 발현을 검출하기 위한 시도는 실패하였다. 따라서, 균일한 성장 속도 및 균일하고 높은 발현 수준이 E1A 발현에만 기인할 수 있을 것 같지는 않다. 본 발명에서, E1A 발현을 검출할 수 없으나, E1A 발현을 이용한 CMV 프로모터의 트랜스활성화는 심지어 더 높고 안정한 발현 수준을 여전히 초래할 수 있었을 것으로 여겨진다.

BHK-21 세포 또는 CHO 세포가 바람직하게 발현에 이용된다. 적합한 CHO 세포는 이로 제한되지 않으나 CHO-K1 및 CHO-S 세포를 포함한다. CHO-DUKX-B11 또는 DG44와 같은 CHO의 dhfr-마이너스 돌연변이체가 본 발명의 실시예 바람직한 포유동물 세포이다. 이러한 세포는 당 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 어메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (A.T.C.C.) Rockville, Md. (BHK-21) 또는 닥터 로렌스 체이신, Columbia University, New York (CHO DUKX-B11 또는 DG44)로부터 광범하게 이용가능하다. 이러한 세포는 현탁 배양액에서의 성장에 잘 순응하고/거나 (또는 혈청 비함유 조건하에) 저 혈청 농도하에 성장할 수 있고 DHFR 선택 마커와 함께 사용될 수 있다.

세포주는 바람직하게는 폴리클로날 단백질의 구성원(들)의 높고 안정한 발현을 나타내는 클론에 대해 서브클로닝되고 선택된다.

결과적으로, 당업자는 DG44 클론을 다른 클론으로 대체하고 CHO 세포를 개시된 다른 포유동물 세포로 대신하거나, 심지어 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 진균 및 세균을 포함하는 다른 유형의 세포를 이용할 수 있을 것이다. 따라서, 세포 유형의 선택은 본 발명에서 제한적이지 않다.

본 발명의 방법을 이용하여 수득될 수 있는 수율은 배양 조건 및 사용된 숙주 세포의 종을 포함하나 이로 제한되지 않는 다수의 파라메터에 의존적이다. 본 발명의 구체예에서, 그 수율은 바람직하게는 50 mg/L의 단백질을 초과하고, 예컨대 60 mg/L 초과, 예를 들어 75 mg/L 초과, 예컨대 100 mg/L 초과, 예를 들어 125 mg/L 초과, 예컨대 150 mg/L 초과, 예를 들어 200 mg/L 초과, 예컨대 250 mg/L 초과, 예를 들어 300 mg/L, 예컨대 400 mg/L 초과, 예를 들어 500 mg/L 초과, 예컨대 600 mg/L 초과, 예를 들어 700 mg/L 초과, 예컨대 750 mg/L 초과, 예를 들어 800 mg/L 초과, 예컨대 900 mg/L 초과, 예를 들어 1000 mg/L 초과, 예컨대 2 g/L 초과, 예를 들어 3 g/L 초과, 예컨대 4 g/L 초과, 예를 들어 5 g/L 초과이다.

본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질은 자연적으로 가변성인, 상이하나 상동인 단백질 분자를 포함하는 단백질 조성물을 포함하며, 이는 바람직한 구체예에서, 변이성 핵산 라이브러리가 자연적으로 발생하는 다양성을 갖는다는 것을 의미한다. 이와 같이, 각각의 단백질 분자는 조성물의 다른 분자와 상동이나, 또한 폴리클로날 단백질의 개별적 구성원 간의 아미노산 서열 차이에 의해 특징지어지는 가변성 폴리펩티드 서열의 하나 이상의 스트레치를 함유한다. 가변성 폴리펩티드 서열을 구성하는 아미노산 서열(들)에서의 차이는 하나의 아미노산만큼이나 작을 수 있다. 바람직하게는, 아미노산 서열에서의 차이는 하나를 초과하는 아미노산 차이로 만들어진다.

일반적으로, 폴리클로날 항체 또는 TcR의 자연적 가변성은 폴리펩티드 사슬의 소위 가변 영역 또는 V-영역에 존재할 것으로 여겨진다.

본 발명의 일 양태에서, 폴리클로날 단백질에서 개별적 구성원은 길이가 약 80개 내지 120개 아미노산인 가변 영역을 포함한다. 가변 영역은 초-가변(hyper-variable) 도메인, 예를 들어 상보성 결정 영역(CDR)을 함유할 수 있다.

자연적으로 발생하는 TcR에서, 각각의 가변 영역에는 4개의 CDR이 있다. 자연적으로 발생하는 항체에는 중쇄에 3개의 CDR 및 경쇄에 3개의 CDR이 있다.

본 발명의 추가의 양태에서, 폴리클로날 단백질의 개별적 구성원의 가변 영역은 길이가 1 내지 26개 아미노산, 바람직하게는 4 내지 16개 아미노산인 하나 이상의 초-가변 도메인을 함유한다. 이러한 초-가변 도메인은 CDR3 영역에 상응할 수 있다. 항체에 있어서, 각각의 가변 영역은 바람직하게는 3개의 초-가변 도메인으로 구성된다. 이는 CDR1, CDR2 및 CDR3에 상응할 수 있다. TcR에 있어서, 각각의 가변 영역은 바람직하게는 4개의 초-가변 도메인으로 구성된다. 이들은 CDR1, CDR2, CDR3 및 CDR4에 상응할 수 있다. 초-가변 도메인은 단독으로 본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질의 가변 영역내 가변 서열로 구성될 수 있다.

본 발명에 있어서, 폴리펩티드 서열에서 가변성 (폴리클론성)은 또한 예컨대, 사람 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD 및 IgE, 또는 뮤린 이소타입 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM 및 IgA와 같은 두 개 이상의 상이한 항체 이소타입을 함유하는 항체 혼합물의 경우에서와 같이, 항체 폴리펩티드 사슬의 소위 불변 영역 또는 C 영역에 존재하는 개별적 항체 분자들간 차이를 나타내는 것으로 이해될 수 있다. 이와 같이, 재조합 폴리클로날 항체는 가변 영역 (V 영역) 또는 불변 영역 (C 영역), 또는 이 둘 모두에서 개별적 항체 분자들간 서열 차이를 특징으로 하는항체 분자를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 항체가 동일한 이소타입인데, 그 이유는 이것이 후속적인 정제를 상당히 용이하게 하기 때문이다. 예컨대 이소타입 Ig1, IgG2 및 IgG4의 항체들을 조합시키는 것도 고려할 수 있는데, 이들이 모두 함께 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있기 때문이다. 바람직한 구체예에서, 폴리클로날 항체를 구성하는 모든 항체는 동일한 불변 영역을 지녀서 정제를 추가로 촉진시킨다. 더욱 바람직하게는, 항체가 중쇄의 동일한 불변 영역을 지닌다. 경쇄의 불변 영역도 별개의 항체들에 걸쳐 동일할 수 있다.

특정 항원에 결합되는 단백질을 엔코딩하는 변이성 핵산 서열을 제공하기 위해, 당 분야에 공지된 다수의 방법이 사용될 수 있다. 전형적으로, 본 발명에서는 특정 항원에 결합되는 단백질을 엔코딩하는 핵산의 동정 및/또는 분리를 가능하게 하는 스크리닝 공정을 사용하면 유리할 것이다. 이러한 여러 방법은 심플렉스(Symplex™) (Mejier et al, 2006, J. Mol. Biol, 358:764-772; WO 2005/042774), 파지 디스플레이(Kang, A.S. et al. 1991, Proc Natl Acad Sci USA 88, 4363-4366), 리보좀 디스플레이 (Schaffitzel, C. et al. 1999. J.Immunol. Methods 231, 119-135), DNA 디스플레이 (Cull, M.G. et al. 1992. Proc Natl Acad Sci USA 89, 1865-1869), RNA-펩티드 디스플레이(Roberts, R.W., Szostak, J.W., 1997. Proc natl Acad Sci USA 94, 12297-12302), 공유 디스플레이 (WO 98/37186), 세균 표면 디스플레이(Fuchs, P. et al. 1991, Biotechnology 9, 1369-1372), 효모 표면 디스플레이 (Boder, E.T., Wittrup, K.D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557) 및 진핵성 바이러스 디스플레이 (Grabherr, R., Ernst W., 2001, Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192)와 같이, 당 분야에 모두 공지되고 본 발명의 실시를 보조하는 방법들로부터 공지된, 풍부화(enrichment) 단계 또는 소위 바이오패닝(biopanning) 단계를 포함한다. FACS 및 자기 비드 분류도 표지된 항원을 사용하여 풍부화(패닝) 목적을 위해 적용될 수 있다. 면역검출 검정, 예컨대 ELISA (Dreher,M.L. et al. 1991. J. Immuno. Mthods 139, 197-205) 및 ELISPOT (Czerkinsky, C.C. et al. 1983. J Immunol Method. 65, 109-21)이 또한 바이오패닝 단계 이후에 또는 단독으로 이용될 수 있다.

관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 조성물은 규정된 단백질 서브셋을 포함하며, 이는 예를 들어, 요망되는 표적 항원에 대한 폴리클로날 항체의 경우에, 목적하는 표적에 대한 공유된 결합 활성과 같은 공통된 특성에 의해 규정되었다. 전형적으로, 폴리클로날 단백질 조성물은 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 10⁴, 10⁵ 또는 10⁶개의 별개의 변이성 구성원을 갖는다. 폴리클로날 단백질 조성물에 필요한 별개의 구성원의 수는 표적의 복잡성에 따라 좌우될 것이다. 항체의 경우, 표적화된 항원(들)의 복잡성은 폴리클로날 항체 조성물에 필요한 별개의 변이성 구성원의 수에 영향을 미칠 것이다. 작거나 심하게 복잡하지 않은 표적, 예를 들어 소형 단백질에 있어서, 2 또는 3 내지 100개의 별개의 변이성 구성원을 포함하는 폴리클로날 항체 조성물로 충분할 수 있으며, 변이체의 수가 90개를 초과하지 않거나, 심지어 80개 또는 70개를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 많은 경우에, 별개의 변이체의 수는 60개 또는 50개를 초과하지 않을 것이며, 변이체의 수가 5 내지 40개, 예컨대, 5 내지 30개인 것이 바람직하다. 한편, 더욱 복잡한 표적인 경우, 20 내지 500개의 별개의 변이성 구성원을 포함하는 폴리클로날 항체 조성물이면 충분할 수 있다. 매우 복잡한 표적인 경우, 즉 항원이 매우 상이한 분자들을 포함하는 경우, 50 내지 10,000개의 별개의 변이성 구성원을 포함하는 폴리클로날 항체 조성물이 요구될 수 있다.

포유동물에서, 항체 또는 면역글로불린 분자와 같이 혈액내에서 자유롭게 순환하거나 T 세포 수용체 및 B 세포 수용체와 같이 세포 표면상에 존재하는 자연적으로 발생하는 폴리클로날 단백질의 여러 공지된 예가 있다. 이러한 자연적으로 발생하는 폴리클로날 단백질의 다양성은 일부 포유동물에서, 이들 단백질의 가변 영역을 엔코딩하는 유전자의 유전적 재조합에 의해 달성된다. 항체는 추가로 체세포 돌연변이에 의해 이들의 다양성을 증가시키는 것으로 공지되어 있다. 본 발명은 다양성을 유도하는 서열 (예를 들어, 면역글로불린 분자 또는 TcR의 가변 도메인 또는 CDR 영역)을 분리하고, 이들로부터 라이브러리를 생성시킴으로써 이들의 자연적 다양성을 이용할 수 있다. 두 개의 독립적인 유전자 세그먼트, 예를 들어 항체 가변 중쇄 및 가변 경쇄인 TcRα 사슬과 β 사슬 또는 TcRδ 사슬과 γ 사슬로부터 엔코딩된 단백질에 있어서, 라이브러리 중의 각각의 벡터는 한 쌍의 이들 가변 영역 엔코딩 서열로 이루어질 것이다. 한 쌍의 가변 영역 엔코딩 서열의 라이브러리의 생성은 당 분야에 널리 공지되어 있다.

자연적으로 발생하는 다양성을 포함하는 라이브러리는, 예를 들어 조합 라이브러리 (가변 영역 엔코딩 서열의 무작위 페어링) 및 동족(cognate) 쌍 라이브러리 (동일한 세포로부터 유래된 한 쌍의 가변 영역 엔코딩 서열)이다 (예컨대 WO 2005/042774). 항체 또는 TcR 가변 영역과 같은, 적합한 프레임워크 (예를 들어, Soderlind, E. et al., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852-856)로 혼입되는 단리된 CDR 유전자 단편으로부터 생성된 추가의 라이브러리를 본 발명에 적용할 수 있다. 이러한 라이브러리는 바람직하게는, 요망되는 특이성을 갖는 서브-라이브러리 (관심있는 라이브러리)를 수득하기 위해 스크리닝된다.

또한, 단백질의 다양성은 인위적 방식, 예를 들어 합성 또는 돌연변이에 의해 유도될 수 있다. 돌연변이는 단일 단백질을 엔코딩하는 핵산 서열의 무작위 또는 점 돌연변이일 수 있어서, 단일 단백질의 폴리클로날 군집을 생성시킬 수 있다. 인위적 항체 라이브러리를 생성시키는 또 다른 예는 EP 0 859 841에 기술되어 있으며, 이 방법은 또 다른 CDR 라이브러리와 조합될 수 있는 가변 영역 프레임워크의 라이브러리를 생성시키는 것에 기초한다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질은 재조합 폴리클로날 항체 또는 항체 단편이다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 재조합 폴리클로날 단백질은 재조합 폴리클로날 TcR 또는 TcR 단편이다.

따라서, 본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질은 또한 상이한 이소타입 또는 더욱 바람직하게는 상이한 서브클래스로 구성될 수 있다. 면역글로불린의 폴리클론성은 면역글로불린 분자의 불변 부분이나 가변 도멘인에서 발생할 수 있거나, 불변 부분과 가변 도메인 둘 모두에서 발생할 수 있다.

항체의 치료학적 적용에 있어서, 소위 불변 영역, 특히 항체 중쇄의 폴리클론성이 흥미롭다. 다양한 면역글로불린 이소타입은 상이한 생물학적 작용 (표 1에 요약됨)을 가지며, 이는 면역글로불린의 상이한 이소타입이 상이한 양태의 자연적 면역 반응에 관련될 수 있기 때문에 치료용 항체를 사용할 경우 조합되는 것이 바람직할 수 있다 (Canfield and Morrison 1991, J.Exp.Med. 173, 1483-91; Kumpel et al. 2002. Transfus.Clin.Biol. 9, 45-53; Stirnadel et al. 2000. Epidemiol. Infect. 124, 153-162).

표 1: 사람 면역글로불린 이소타입의 생물학적 작용

	사람 면역글로불린
	IgG1	IgG2	IgG3	IgG4	IgA1	IgA2	IgM	IgD	IgE
전형적인 상보서열 활성	+++	++	++++	+	-	-	++++	-	-
대안적인 상보서열 활성	+	+	+	+++	+	-	-	+	-
태반 통과	+	++	+	++	-	-	-	-	-
세균 용해	+	+	+	+	+++	+++	+	?	?
매크로파지/기타 포식세포 결합	+	-	+	+	+	+	-	-	-
비만 세포/호염기성 결합	-	-	-	-	-	-	-	-	-
스타필로코커스 단백질 A 반응성	+	+	-	+	-	-	-	-	-

본 발명의 추가의 양태는 2-n개의 세포 군집을 포함하는 폴리클로날 세포주를 포함하는 재조합 폴리클로날 생산 세포주이며, 각 군집은 재조합 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 발현시키고, 세포는 게놈으로 무작위 통합된 발현 구성물을 포함한다. 발현 구성물은 바람직하게는 게놈으로 안정하게 통합된다. 일 구체예에서, 구성물은 하나 이상의 염색체로 통합된다.

폴리클로날 세포주에서 세포 군집의 수, n은 3 이상, 예컨대 4 이상, 예를 들어 5 이상, 예컨대 6 이상, 예를 들어 7 이상, 예컨대 8 이상, 예를 들어 9 이상, 예컨대 10 이상, 예를 들어 11 이상, 예컨대 12 이상, 예를 들어 13 이상, 예컨대 14 이상, 예를 들어 15 이상, 예컨대 16 이상, 예를 들어 17 이상, 예컨대 18 이상, 예를 들어 19 이상, 예컨대 20 이상, 예를 들어 21 이상, 예컨대 22 이상, 예를 들어 23 이상, 예컨대 24 이상, 예를 들어 25 이상, 예컨대 26 이상, 예를 들어 27 이상, 예컨대 28 이상, 예를 들어 29 이상, 예컨대 30 이상, 예를 들어 35 이상, 예컨대 40 이상, 예를 들어 45 이상, 예컨대 50 이상, 예를 들어 60 이상, 예컨대 70 이상, 예를 들어 80 이상, 예컨대 90 이상, 예를 들어 100 이상일 수 있다.

대부분의 목적을 위해, n은 50 미만일 수 있고, 예컨대 45 미만, 예를 들어 40 미만, 예컨대 35 미만, 예를 들어 30 미만일 수 있다.

본 발명의 중요한 일 구체예는 최종적으로 폴리클로날 세포주를 혼합시키기 전에 수행된 세포 클로닝 단계이다. 이 단계는 클론 바이어스의 발생을 최소화함에 의해 수득된 폴리클로날 세포 뱅크의 수율 및 안정성을 개선시킨다. 재조합 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 발현시키는 세포는 1개 이상의 클로닝된 세포로부터 유래될 수 있고, 예컨대 2개 이상, 예를 들어 3개 이상, 예컨대 4개 이상, 예를 들어 5개 이상, 예컨대 6개 이상, 예를 들어 7개 이상, 예컨대 8개 이상, 예를 들어 9개 이상, 예컨대 10개 이상, 예를 들어 11개 이상, 예컨대 12개 이상, 예를 들어 13개 이상, 예컨대 14개 이상, 예를 들어 15개 이상, 예컨대 16개 이상, 예를 들어 17개 이상, 예컨대 18개 이상, 예를 들어 19개 이상, 예컨대 20개 이상, 예를 들어 21개 이상, 예컨대 22개 이상, 예를 들어 23개 이상, 예컨대 24개 이상, 예를 들어 25개 이상, 예컨대 26개 이상, 예를 들어 27개 이상, 예컨대 28개 이상, 예를 들어 29개 이상, 예컨대 30개 이상, 예를 들어 35개 이상, 예컨대 40개 이상, 예를 들어 45개 이상, 예컨대 50개 이상, 예를 들어 60개 이상, 예컨대 70개 이상, 예를 들어 80개 이상, 예컨대 90개 이상, 예를 들어 100개 이상의 클로닝된 세포로부터 유래될 수 있다. 대부분의 목적을 위해, 클로닝된 세포의 수는 50개 미만일 수 있고, 예를 들어 20개 미만, 예컨대 15개 미만, 예를 들어 10개 미만일 수 있다.

상기 구체예의 추가의 구체예에서, 폴리클로날 단백질 (바람직하게는 면역글로불린 슈퍼패밀로부터의)을 엔코딩하는 변이성 핵산 서열은 모두, 예를 들어 도너로부터 단리된 자연적으로 발생하는 서열로부터 유래된다.

클론 다양성

폴리클로날 단백질의 특징 중 하나는, 폴리클로날 단백질이 다수의 개별적 단백질 분자로 구성되며, 여기서 각 단백질 분자는 폴리클로날 단백질의 다른 분자들과 상동이나, 폴리클로날 단백질의 개별적 구성원간의 아미노산 서열의 차이에 의해 특징지어지는 가변성도 갖는다는 것이다. 바람직하게는, 이러한 차이는 폴리클로날 단백질의 전체적인 구조 중 독특한 영역으로 제한된다. 이러한 영역은, 예를 들어 항체 또는 TcR의 가변 영역이며, 가능하게는 이들 영역의 CDR 영역으로 추가로 제한된다. 이러한 가변성은 또한 다양성으로서 설명될 수 있으며, 이는 핵산 수준 및 단백질 작용 수준, 예를 들어 표적에 대한 특이성 및 친화성 차이로 확인될 수 있다.

세포주의 클론 다양성은 재조합 폴리클로날 단백질을 발현하는 세포 풀로부터 단리된 클론에 대한 RFLP에 의해 분석될 수 있다. (RT)-PCR 생성물의 서열화는 클론 다양성을 분석하기 위한 또 다른 가능성을 나타낸다. 다양성은 또한 세포주에 의해 생성된 재조합 폴리클로날 단백질에 대한 기능 테스트 (예를 들어, ELISA)에 의해 분석될 수 있다. WO 2006/007853은 폴리클로날 세포주 및 폴리클로날 단백질의 특성규명 방법을 기술한다. 이러한 방법을 이용하여 세포주와 생성된 폴리클로날 단백질의 클론 다양성을 분석할 수 있다.

존재하는 경우, 클론 바이어스 (즉, 폴리클로날 항체를 구성하는 개별적 항체의 함량에 있어서 단계적 변화)는 트랜스펙션에 사용된 초기 라이브러리의 클론 다양성을 재조합 폴리클로날 단백질을 발현시키는 세포 (세포주)의 풀에서 발견되는 다양성과 비교함으로써 평가될 수 있다.

세포주로부터 발현된 폴리클로날 단백질의 클론 다양성은 폴리클로날 단백질에 의해 표적 범위(coverage)로서 평가될 수 있다. 이러한 경우, 충분한 다양성은 요망되는 표적 분자의 약 25 내지 100%가 폴리클로날 단백질에 의해 결합될 때 획득되는 것으로 여겨진다. 예를 들어, 폴리클로날 항체의 경우, 항체가 표적 항원의 표면상에서 동일하지 않은 에피토프의 적어도 25% 이상에 결합되는 것은 조성물에 충분한 다양성을 제공한다. 바람직하게는, 표적 범위에 의한 클론 다양성은 50% 이상이며, 심지어 더욱 바람직하게는 75% 이상이다. 항체에 있어서, 이러한 표적 범위는, 예를 들어 에피토프 맵핑에 의해 평가될 수 있었다.

대안적으로 클론 다양성은 폴리클로날 조성물의 개별적 구성원의 분포로서 평가될 수 있다. 이러한 분포는 트랜스펙션 동안 세포주로 원래 도입된 상이한 엔코딩 서열의 수와 비교한 최종 폴리클로날 단백질 조성물 중의 상이한 개별적 구성원의 총 수로서 평가될 수 있다. 이러한 경우, 충분한 다양성은 트랜스펙션에 원래 사용되는 엔코딩 서열의 50% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 예컨대 적어도 95%, 97%, 98% 또는 99%가 최종 폴리클로날 단백질의 상이한 개별적 구성원으로서 확인될 수 있는 경우에 달성되는 것으로 여겨진다. 또 다른 방식으로 발현될 때, 클론 다양성은 폴리클로날 단백질의 단 1개의 구성원이 제조 동안 소실된 경우나, 2, 3, 4 또는 5개의 구성원이 소실된 경우 충분한 것으로 고려될 수 있다.

폴리클로날 조성물의 개별적 구성원의 분포를 또한 개별적 구성원 중의 상호 분포에 의해 평가할 수 있다. 이러한 경우, 충분한 클론 다양성은 조성물 중의 어떠한 단일 구성원도 최종 폴리클로날 단백질 조성물 중의 단백질의 총 수의 75%를 초과하여 구성하지 않을 경우 달성되는 것으로 여겨진다. 바람직하게는, 어떠한 개별적 구성원도 최종 폴리클로날 조성물 중의 개별적 구성원의 총 수의 50%, 더욱 바람직하게는 25%, 가장 바람직하게는 10%를 초과하지 않는다. 폴리클로날 조성물 중의 개별적 구성원의 분포에 기초한 클론 다양성의 평가는 RFLE 분석, 서열 분석 및 단백질 분석, 예컨대 폴리클로날 조성물의 특성규명에 대해 이후에 기재된 방법에 의해 수행될 수 있다.

클론 다양성은 a) 발현 수준의 차이의 결과로서, b) 세포 증식 중 변이의 결과로서 발생할 수 있는, 클론 바이어스의 결과로서 감소될 수 있다. 이러한 바이어스가 발생하는 경우, 클론 다양성 손실의 이러한 각각의 원인은 본원에 기술된 바와 같은 방법에 따라 적은 변형에 의해 용이하게 개선된다.

연장된 기간 동안 세포주에서 개별적 세포의 세포 증식율의 변화는 재조합 폴리클로날 단백질 발현에 바이어스를 도입하여, 세포주에 의해 발현된 재조합 폴리클로날 단백질의 일부 구성원의 존재를 증가시키거나 감소시킬 수 있었다. 본 방법이 숙주 세포의 게놈으로의 무작위 통합에 기초할 수 있으므로, 위치 및 복사체 수 둘 모두가 폴리클로날 세포주의 구성원들간에 다양하다. 이것은 클론들 사이에서 증식율 및 발현 수준의 차이를 발생시킬 것이다. 유사한 증식율을 지니는 세포 클론을 선택함에 의해, 이러한 문제를 최소화한다. 추가의 가능성은 폴리클로날 단백질의 각 구성원에 대해 하나를 초과하는 클론을 이용하는 것이다. 실시예는 조성물의 안정성이, 폴리클로날 단백질의 각 구성원에 대해 단 하나의 클론을 이용할 때보다 폴리클로날 단백질의 단일 구성원을 발현시키는 3 내지 5개의 클론을 이용할 때 증가됨을 예시한다.

이러한 문제를 다루기 위한 또 다른 방법은 하나 이상의 선택 표준을 이용하여 성장 속도, 배가 시간, 발현 수준, 생산 수준, 시간에 따른 생산 안정성, 생존력, 내구력, 강건성, 형태학, 및 복사체 수로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표준에 관해 미리 설정된 특정 한계 내에서 세포가 균일하도록 하는 것이다.

증식율에 있어서 이러한 변화의 한 이유는, 초기 트랜스펙션에 사용된 출발 세포주를 구성하는 세포 군집이 이종성이라는 데에 있다. 세포주에서 개별적 세포는 연장된 기간에 걸쳐 상이하게 진화하는 것으로 공지되어 있다. 더욱 상동인 출발 물질을 보장하기 위해, 관심있는 발현 벡터로 트랜스펙션하기 전에 세포주의 서브클로닝 또는 반복된 서브클로닝을, 단일 세포 수준으로 낮춘 세포주의 한계 희석법을 이용하여 각각의 단일 세포를 신규한 군집의 세포로 성장시키며 (소위 한계 희석법에 의한 세포 서브클로닝) 수행할 수 있다.

잘 규정된 세포 군집을 확보하기 위한 단일 세포 클로닝의 대안적이고 바람직한 방법은 트랜스펙션 후 형광활성세포분류 (FACS)를 이용하는 것이다. 이것은 선택 공정 이전에 수행될 수 있다. 형광 표지된 항체는 IgG 구성물로 트랜스펙션된 세포의 풀로부터 유래된 고도로 생산적인 세포에 대한 풍부화를 위해 사용될 수 있다 (Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155). FACS 분류의 이점은 이 방법이 각 단일 세포의 발현 수준에 관한 정보를 동시에 제공하면서 단일 세포 클로닝 (웰로의 단일 세포 분류에 의해)을 조합시킨다는 것이다. 분류 절차를 추가로 개선시키기 위해, 생존력 균주를 포함시켜 죽거나 죽어가는 세포를 폐기한다. FACS 절차는 세포가 전단 스트레스를 포함하는 상당히 호된 조건을 겪게 한다. 이것은 간접적으로 세포가 이러한 조건에 대한 내성에 대해 선택됨을 의미한다. 더욱이, FACS 절차는 높은 수의 단일 세포가 분류되도록 자동화된다.

FACS 방법은 유사한 수준의 면역글로불린을 발현시키는 세포를 분류하기 위해서도 이용될 수 있어서 생산성에 관해 상동인 세포 군집을 생성한다. 유사하게, 형광 염료 5,6-카르복실플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지시킴에 의해 유사한 증식율을 나타내는 세포를 FACS 방법에 의해 선택할 수 있다.

본 발명의 중요한 구체예는 폴리클로날 항체의 각 구성원에 대한 하나 이상의 클로닝된 세포주의 생성이다. 단일 세포 클론의 생성은 다수의 표준 기술들 중 임의의 하나를 이용하여 수행될 수 있다. 그러나, 생존력 및 IgG 수준에 대해 세포를 선택하고 웰로 개별적으로 분류하는 FACS 세포 분류가 폴리클로날 마스터 세포 뱅크와 후속적인 폴리클로날 워킹 세포 뱅크를 제조하기에 적합한 안정한 클론을 제공하는 것으로 일관되게 판명되었다. FACS 분류 이전에 또는 동안에, 예컨대 Mtx로부터의 선택 압력이 제거될 수 있으나, 지속된 선택 압력은, 예컨대 누클레오시드가 없는 배지에서 성장시킴에 의해 유지되는 것이 바람직하다. 개별적인 클론은 세포 분류 후 선택 압력하에서 특정 일수의 배양 이후에 선택되는 것이 바람직하다. 클론이 분류 이후 동일한 날에 선택되기 때문에, 클론의 성장 속도는 비교적 균일할 것이다. 이에 추가하여, 콜로니를 시각적으로 조사하여 형태학 및 낮은 성장 속도에서 트랜스펙션되지 않은 원래 세포주에 비해 큰 변화를 갖는 클론을 폐기한다. 마지막으로, 항체 발현의 수준을, 예컨대 ELISA 또는 다른 분석적 기술을 이용하여 검정할 수 있고, 높고 비교적 균일한 발현 수준을 지니는 클론을 선택할 수 있다.

증식율 유도된 바이어스가 발생한다 하더라도, 개별적 구성원의 손실 또는 과다-표출(over-representation)은 최종 재조합 폴리클로날 단백질 생성물의 다양성 요건 및 시간에 따른 다양성의 안정성에 따라 반드시 중요한 것은 아니다.

숙주 세포

숙주 세포는 DNA를 이의 염색체로 통합시킬 수 있거나 미니-염색체, YAC(효모 인공 염색체), MAC(마우스 인공 염색체) 또는 HAC(사람 인공 염색체)과 같은 여분-염색체외 엘리먼트를 보유할 수 있는 임의의 세포로부터 생성될 수 있다. MAC 및 HAC는 본원에 참고문헌으로 인용된 WO 97/40183호에 상세히 기술되어 있다. 바람직하게는, 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포, COS 세포, BHK 세포, 흑색종 세포 (예를 들어, Sp2/0, YB2/0 또는 NS0 세포), 섬유모세포, 예컨대 NIH 3T3, 및 무한증식되는 사람 세포, 예컨대 HeLa 세포, HEK 293 세포, 또는 PER.C6가 사용된다. 그러나, 포유동물 이외의 원핵생물 세포 또는 진핵생물 세포 예컨대, 식물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 진균, 대장균(E.coli) 등도 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 출발 물질로서 사용되는 세포주는 세포주를 단일 세포 수준으로 소위 한계 희석한 후, 관심있는 벡터 라이브러리로 트랜스펙션하기 전에 각각의 단일 세포를 새로운 세포 군집으로 성장시킴으로써 서브-클로닝된다. 이러한 서브-클로닝은 또한 필요에 따라, 이후에 적절한 세포주를 선택하는 과정에서 수행될 수 있다. 단일 세포 클로닝의 다른 방법은 FACS 클로닝 (Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155), LEAP™ 기술 (from Cyntellect, San Diego, California, USA), 및 ClonePix (from Genetix, UK)를 포함한다.

통합을 위한 벡터

하기는 포유동물 발현 시스템의 이용에 초점을 두어 설명한 것이다. 그러나, 본 발명의 방법을 적합한 변형을 지니는 세균에서의 발현을 위해 유사하게 사용할 수 있다.

적합한 벡터는 적합한 선택 유전자를 포함한다. 포유동물 발현에 사용된 적합한 선택 유전자는 영양 선택을 가능하게 하는 유전자, 예컨대 티미딘 키나아제 유전자 (TK), 글루타민 합성효소 유전자 (GS), 트립토판 합성효소 유전자 (trpB) 또는 히스티디놀 데하이드로게나아제 유전자 (hisD)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 선택 마커로는 약물 내성을 부여하는 항대사산물 내성 유전자, 예컨대 하이포크산틴 및 티미딘 결핍 배지로 선택될 수 있고 추가로 메토트렉세이트로 선택될 수 있는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자 (dhfr), 마이코페놀산으로 선택될 수 있는 크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제 유전자 (gpt), 진핵생물 세포의 G418 또는 원핵생물 세포에서 네오마이신 또는 카나마이신으로 선택될 수 있는 네오마이신 포스포트랜스퍼라아제 유전자 (neo), 하이그로마이신으로 선택될 수 있는 하이그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제 (hyg, hph, hpt) 유전자, 푸로마이신으로 선택될 수 있는 푸로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라아제 유전자 (pac), 또는 블라스티시딘으로 선택될 수 있는 블라스티시딘 S 데아미나아제 유전자 (Bsd), 제오신 및 블레오마이신에 대한 내성을 매개하는 제오신 내성 유전자 (Sh ble)가 있다. 최종적으로, 예를 들어 유세포 분석기에 의해 분류될 수 있는 단백질을 엔코딩하는 유전자, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP), 신경 성장 인자 수용체 (NGFR) 또는 기타 막 단백질, 또는 베타-갈락토시다아제 (LacZ)도 선택 마커로서 사용될 수 있다.

선택 마커는 분리된 발현 벡터 상에 위치할 수 있어서, 선택 마커를 코딩하는 발현 벡터 및 관심있는 단백질이나 관심있는 단백질의 서브유닛을 코딩하는 하나 이상의 발현 벡터(들)로 공동-트랜스펙션을 수행할 수 있다. 선택 마커는 또한 관심있는 단백질을 코딩하는 발현 벡터에 위치할 수 있다. 후자의 경우에, 선택 마커는 또한 관심있는 단백질 또는 이의 서브유닛 중 하나를 엔코딩하는 전사체 상에 위치하는 것이 바람직하다. 이것은, 예컨대 IRES 구성물을 이용하여 수행될 수 있다. 항체와 같은 다합체 단백질의 경우에, 선택 마커는, 예를 들어 항체의 중쇄와 같은 가장 큰 서브유닛을 엔코딩하는 전사체 상에 위치하는 것이 바람직하다.

관심있는 유전자의 통합을 위한 벡터는 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 한 구성원을 엔코딩하는 DNA를 추가로 포함하며, 이는 단백질의 발현을 유도하는 포유동물 자체의 프로모터 뒤에 온다. 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 구성원이 하나 초과의 단백질 사슬을 포함하는 경우, 예를 들어 구성원이 항체 또는 T 세포 수용체인 경우, 단백질 사슬을 엔코딩하는 DNA는 각각의 사슬의 높은 수준의 발현을 유도하는 (양방향성 또는 일방향성) 포유동물 자체의 프로모터 뒤에 올 수 있다. 양방향성 발현인 경우, 발현 벡터내의 헤드-투-헤드 프로모터 배치가 사용될 수 있으며, 일방향성 발현인 경우, 예를 들어 IRES 서열과 조합된 하나의 프로모터 또는 두 개의 프로모터가 발현을 위해 사용될 수 있다. 동일한 전사체에 의해 엔코딩되고 IRES 서열에 의해 분리된 두 상이한 서브유닛을 지니는 바이-시스트로닉 발현 벡터가 유사하게 고려될 수 있다.

적합한 헤드-투-헤드 프로모터 배치는, 예를 들어 양쪽 배향 둘 모두로의 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터와 함께 AdMLP 프로모터, 양쪽 배향 둘 모두로의 연장 인자-1 프로모터와 함께 AdMLP 프로모터 또는 양쪽 배향 둘 모두로의 MPSV 프로모터와 함께 CMV 프로모터, 또는 양쪽 배향 둘 모두로의 CMV 프로모터이나 이로 제한되지 않는다.

항체의 경우, 경험에 따르면 세포에 의해 발현된 중쇄의 양이 경쇄의 양을 초과하지 않아야 한다. 따라서, 경쇄의 발현을 지시하는 프로모터는 적어도 중쇄의 발현을 지시하는 프로모터만큼 강한 것이 바람직하다.

기능적 리더 서열 또는 전위 시그널을 엔코딩하는 핵산 서열이 발현 벡터내에 포함되어, 세포 소기관과 같은 세포내의 특이적 위치 또는 내부 원형질 세망으로 유전자 생성물을 유도한다. 강한 폴리아데닐화 시그널은 단백질-엔코딩 DNA 서열의 3'측에 위치할 수 있다. 폴리아데닐화 시그널은 초기 RNA 전사체의 종료 및 폴리아데닐화를 보장하며, 이는 메세지 안정성과 상호관련된다. 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 구성원을 엔코딩하는 DNA는, 예를 들어 항체 또는 항체 단편의 중쇄와 경쇄 둘 모두를 엔코딩할 수 있으며, 각각의 유전자 서열은 임의로 포유동물 자체의 프로모터 엘리먼트 뒤에 위치하고/거나 두 개의 사슬 각각을 높은 수준으로 발현시키는 강한 폴리 A 시그널 앞에 위치한다.

통합을 위한 발현 벡터는 추가의 전사 조정 요소, 예컨대 통합 부위에서의 증가된 발현 및 안정성을 위한 UCOE (편재성 크로마틴 개방 엘리먼트), 항-리프레서 또는 인핸서를 수반할 수 있다. 인핸서는 전사에 관련된 핵 단백질과 특이적으로 상호작용하는 핵산 서열이다. UCOE는 크로마틴을 개방시키거나, 크로마틴을 개방된 상태로 유지시키며, 작동가능하게 연결된 유전자의 재현가능한 발현을 촉진시킨다 (본원에 참고문헌으로 인용된 WO 00/05393 및 Benton et al, Cytotechnology 38:43-46, 2002에 상세히 기술됨). 추가의 인핸서 또는 증진 엘리먼트로는 예컨대 문헌[Girod & Mermod 2003 ("Chapter 10: Use of scaffold/matrix attachment regions for protein production", pp 359-379 in Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed), 2003, Elsevier Science BV]에 개시된 매트릭스 어태치먼트 영역(MAR)이 있다. 항-리프레서 엘리먼트는 STAR 엘리먼트를 포함하나 이로 제한되지 않는다 (Kwaks et al Nat Biotechnol. 2003 May; 21(5):553-8). 상기 개시된 하나 이상의 조정 요소가 숙주 세포의 염색체로 통합되는 경우, 이들은 이종성 조정 엘리먼트로서 불린다.

폴리클로날 워킹 세포 뱅크 및 마스터 세포 뱅크

본 발명의 바람직한 구체예에서, 폴리클로날 마스터 세포 뱅크 (pMCB) 및 폴리클로날 워킹 세포 뱅크 (pWCB)를 이용한다.

단일 앰플의 내용물을 해동시키고 증량시킴에 의해 폴리클로날 생산 세포주를 확립하는데 이용될 수 있는 pMCB는 개개 세포주로 구성된 동결된 스톡으로부터 생성될 수 있다. 이러한 pMCB를 생성하는데 이용된 개개 세포주는 i) 단일 클론 (실시예 2에 개시됨), ii) 단일 클론의 혼합물 (실시예 2에 개시됨), 또는 iii) 클론의 풀 (선택 후 수득된 단일 콜로니의 풀)로부터 수득된다. 클론은 폴리클로날 단백질의 개개 구성원으로 개별적으로 트랜스펙션된 숙주 세포로부터 수득되고 이의 안정한 발현을 위해 선택되었다. 안정한 발현을 위한 선택은, 예컨대 선택 마커 유저자를 이용하는 당 분야에 공지된 절차에 의해 수행된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 개개 세포주는, 예컨대 i), ii) 또는 iii)에서 비롯된 세포수를 한계 희석시키거나 단일 세포 FACS 분석 및 선택하거나, 예컨대 클론픽스(ClonePix) FL과 같은 로봇을 이용하여 (하기 참조) 고 발현 클론을 선택함에 의해 클로닝되거나 서브클로닝된 세포로부터 수득된다. 상기 개시된 pMCB를 생성하기 위해 이용된 개별적인 세포주를 개별적 세포주의 동결된 라이브러리 스톡에 미리-저장할 수 있고, 이로부터 각 개별적 세포주의 앰플을 pMCB의 생성 이전에 해동 및 증량시킨다. 바람직하게는, pMCB의 다른 구성원에 의해 생성된 항체의 특성과 상이한 특성, 예컨대 상이한 항원 특이성, 상이한 친화성, 상이한 가변성 또는 CDR 영역 및/또는 상이한 불변 영역을 지니는 전장 항체를 발현한다.

pMCB를 생성하기 위해 사용된 각 세포주는 폴리클로날 단백질의 상이한 구성원을 제공한다. 바람직하게는, 폴리클로날 단백질의 각 별개의 구성원은 특정 항원에 결합된다. 추가로, 각 별개의 구성원은 각 숙주 세포의 게놈에서 임의의 부위에 위치한 다수의 인터그란트(integrant)로부터 생성되는 것이 바람직하다. pMCB는 각 별개의 세포주로부터의 미리 규정된 수의 세포를 혼합시킴에 의해 생성된다. 바람직하게는 세포를 동일한 수 (1:1 비)로 혼합시키나, 다른 비도 바람직할 수 있다 (하기 참조). 세포의 혼합물을 분취물로 동결시키며, 이들은 각 바이알에 규정된 수의 세포를 지니도록 다수의 바이알로 분배된다. 상기 바이알을 이후 제조 공정을 위해 pMCB로서 동결시키고 저장한다. 바람직하게는, pMCB를 구성하는 바이알의 수가 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500 또는 1000개 바이알을 초과한다. pMCB에 있는 별개의 바이알을 상이한 시점에 해동시켜 본질적으로 회분에서 회분으로 동일한 조성을 지니는 폴리클로날 단백질을 생성할 수 있는 폴리클로날 생산 세포주의 상이한 배치를 생성할 수 있다.

본 발명의 대안적인 접근법에서, 폴리클로날 생산 세포주를 pMCB로부터 유래된 pWCB로부터 증량시킬 수 있다. pWCB는 단일 바이알을 pMCB로부터 해동시키고, pWCB를 생성하기 위해 최초에 사용된 pMCB 바이알에서와 같이 각 pWCB 분취물에 대략 동일한 수의 세포를 지니는, 일련의 새로운 분취물 (pWCB)로 동결될 수 있는 세포의 총 수를 제공하기에 충분한 다수의 세대 동안 세포를 증량시킴에 의해 생성된다. pWCB가 고갈되었을 때, pMCB의 분취물로부터 새로운 pWCB를 생성할 수 있다. 따라서, 이러한 접근법은 동결된 라이브러리 스톡으로부터 개개 세포주를 증량하고 새로운 pMCB를 혼합시키는데 요구되는 것보다 현저히 적은 양의 작업을 요구할 것이다. 추가로, pWCB가 고갈된 경우, 배치에서 배치로 본질적으로 동일한 조성을 지니는 폴리클로날 단백질을 생성할 수 있는, 폴리클로날 생산 세포주의 추가의 배치를 생성할 가능성이 높아진다.

별개의 트랜스펙션에 의해 수득된 개개 세포주를 혼합시킴에 의해 pMCB를 생성하는 이점은 pMCB의 생성 이전에 개별적으로 트랜스펙션된 세포주를 추가로 분석하고 선택할 수 있다는 것이다. 이것은 이미 기술된 다양성 요건을 충족시키는 보다 안정한 폴리클로날 생산 세포주를 보장할 수 있다. 또한 폴리클로날 단백질이 보다 재현성 있는 방식으로 제조될 수 있다.

pMCB와 관련하여 하기에서 언급된 것이 pWCB에도 적용된다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 상기 개시된 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원의 안정한 발현을 위해 선택된 개개 세포주를 pMCB의 생성 이전에 이들의 증식율 및/또는 생산성에 관해 추가로 특성규명된다. 바람직한 구체예에서, 유사한 증식율 또는 생산성을 지니는 세포주를 pMCB의 생성을 위해 선택한다. 심지어 더욱 바람직하게는, 유사한 생산성 및 유사한 증식율을 지니는 세포주를 pMCB의 생성을 위해 선택한다. 바람직하게는, 세포주가 증식율 및/또는 생산성의 특성규명 이전에 혈청 비함유 현탁 배양에 적응된다. 대안적으로, 트랜스펙션에 이용된 부모 세포는 트랜스펙션 이전에 혈청 비함유 현탁 배양에 적응된다.

증식율은 당 분야에 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다. 포유동물 세포주에 대한 증식율은 18 내지 100시간, 바람직하게는 22 내지 40시간 및 가장 바람직하게는 24 내지 32시간이다. 생산성은 일 당 세포 당 0.5 pg (pg/(세포*일))을 초과하여야 하고, 바람직하게는 1, 1.5, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75 또는 100 pg/(세포*일)을 초과하여야 한다. 추가로, 세포주는 세포내 염색 방법에 의해 평가시 발현에 관해 상동인 세포 군집을 나타내어야 한다. 요망되는 경우 각 별개의 세포주에 대해 더욱 상동인 세포 군집을 클로닝, 예컨대 본원에 개시된 FACS 분류 방법에 의해 수득할 수 있다.

본 발명의 추가의 구체예에서, 별개의 세포주를 FACS 분류하여, 본원에 개시된 트랜스펙션 및 선택 절차 이후, 상동인 발현 수준을 지니는 세포를 동정한다.

형광 표지된 항체를 이용하여 요망되는 단백질, 예컨대 항체 또는 TcR을 높은 수준으로 발현시키는 세포를 분류함으로써 생산성에 관해 상동인 세포 군집을 생성할 수 있다. 이 기술은 분비된 단백질이 이들을 분비하는 세포의 표면 상에서 검출될 수 있다는 관찰에 기초하고, 표면 단백질의 양은 명백히 개개 세포의 발현 수준에 상응한다. 따라서 높은 생산 세포는 표지된 항체로 염색한 다음 FACS에 분석시 분류된 단일 세포일 수 있다. 이 기술은 브레진스키(Brezinsky)에 의해 기술되었다 (Brezinsky et al. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155).

대안적인 분류 기술은 세포에서 세포 표면으로 발현된 단백질에 대한 특이성을 지니는 리간드의 커플링에 기초한다. 예를 들어, 항-Fc 항체 또는 항-유전형 항체는 비오틴을 통해 세포 군집을 분비하는 단백질의 표면에 커플링될 수 있다. 개개 세포에 의해 분비된 항체는 이후 세포 표면에서 항-Fc 항체에 의해 포획된다. 이후, 높은 생산 세포를 표지된 항체로 염색하여 FACS에 의해 분류할 수 있다. 이 기술은 EP 667 896에 개시되었다.

균일한 높은 발현 수준을 갖는 세포주를 수득하기 위해, 높은 발현 수준을 갖는 단일 세포를 개시된 기술들 중 하나에 의해 수득된 FACS 프로필에 기초하여 분석한다. 이후 개개 세포 클론을 증량시키고 가능하게는 상기 개시된 대로 증식율 및 생산성에 대해 분석한다. 대안적으로, FACS 프로필에 의해 확인된 가장 높은 발현 수준을 갖는 세포의 서브풀을 분류에 의해 수집한다. 요망되는 경우, 별개의 세포주로부터의 세포의 서브풀을 유사하게 증식율 및 생산성에 관해 분석할 수 있다.

본 발명의 대안적인 구체예에서, 클론픽스 FL 로봇 (Genetix, UK)과 같은 로봇을 이용하여 높은 발현 수준 및/또는 유사한 성장 특성을 나타내는 클론을 선택한다. 이것은 다음과 같이 수행된다: 트랜스펙션 및 선택 이후에 수득된 콜로니를, 콜로니에 매우 가까운 분비된 단백질 생성물을 포획함에 의해 고-생산 콜로니의 검출을 허가하는 반-고체 배지에서 성장시킨다. 각 콜로니로부터의 생산 수준을, 세포에 의해 발현되는 단백질의 면역형광 표지에 이어서 발현 수준 및 성장 특성과 같은 소정의 선택 표준에 기초한 가장 우수한 클론의 영상 소프트웨어 선택에 의해 결정한다. 또한, 각 콜로니의 크기 (세포 증식율 반영)를 광 검출 영상화를 이용하여 로봇에 의해 평가할 수 있다. 이후 요망되는 생산 및/또는 성장 특성을 갖는 콜로니를 로봇에 의해 분리하고 추가 번식을 위해 96-웰 플레이트로 옮긴다.

바람직하게는, 유사한 생산성을 갖는 개개 세포주를 pMCB의 생성을 위해 선택한다. 바람직한 구체예에서, pMCB를 구성하는 개개 세포주를, 예컨대 단일 세포 분류, 한계 희석 또는 로봇 피킹에 의해 수득되는 높은 발현 수준을 지니는 클로닝된 세포로부터 또는 높은 발현 수준을 지니는 세포의 푸울로부터 생성한다.

본 발명에서, 트랜스펙션 및 선택 이후에 분리된 세포의 단일 콜로니로부터 수득된 개개 세포주뿐만 아니라, 예컨대 단일 세포 FACS 분류에 의해 수득된 클론으로부터 수득된 개개 세포주 둘 모두를 클로닝된 세포주라고 부른다. 바람직한 구체예에서, 이러한 클로닝된 세포주를 이용하여 pMCB를 생성한다.

본 발명의 추가의 구체예에서, pMCB의 생성시에 개개 세포주들을 상이한 비율로 혼합시킨다. 개개 세포주를 특이적 생산성 또는 결합 친화성과 같은, 개개 세포주 및/또는 상기 세포주에 의해 발현된 개개 단백질 구성원의 특성에 기초한 소정의 표준에 따라 혼합시킬 수 있다. 예를 들어, 특히 중요한 항원이나 에피토프에 결합되는 특정 항체를 발현시키는 개개 세포주를, 예컨대 2배, 3배, 5배 또는 10배 더 많은 양과 같이, pMCB의 나머지 구성원 세포주의 과량으로 공급할 수 있다. 한 구성원 세포주는 예를 들어 모든 다른 구성원에 대해 2:1 비율로 첨가될 수 있고, 예컨대 구성원 1의 4 x 10⁶개 세포와 남아있는 구성원 세포주 각각의 2 x 10⁶개 세포로 첨가될 수 있다.

pMCB에서 차별화된 비율의 개개 세포주의 접근법은, 특히 이들이 그 특성에 있어서의 유사성에 대해 선택되지 않은 경우, 개개 세포주간에 증식율 및 생산성에서의 차이를 우회하도록 조절될 수 있다. 따라서, 개개 세포주 중 하나 이상이 더 느린 증식율을 지니는 경우, 즉 보다 빠른 증식율로 특징지어진 폴리클로날 워킹 세포 뱅크의 다른 구성원에 비해 보다 긴 배가 시간을 지니나 이렇게 느린 증식율이 특정 고 생산성과 연관되지 않는 경우, 이 특정 구성원(들)을 느린 성장을 보상하기 위해 증가된 양으로 pMCB에 첨가할 수 있다. 예를 들어, 50시간의 증식율을 갖는 세포주는 pMCB를 구성하는 남아있는 세포주가 22 내지 30시간의 증식율을 지니는 경우 2:1 정량으로 첨가될 수 있다. 유사하게, 보다 짧은 배가 시간을 갖는 세포주의 비율을 감소시켜 이들이 제조 동안 우세하지 않을 것을 보장한다. 추가로, pMCB에서 개개 세포주의 비율은 pMCB로부터 생성된 폴리클로날 생산 세포주로부터 생성된 폴리클로날 단백질 생성물의 분석시에 조정될 수 있다. 이러한 조정은 예를 들어 IEX 프로필이나 동등한 특성규명 도구에 기초하여 이루어질 수 있다. 이러한 분석이 하나 이상의 특정 단백질 구성원이 나머지 구성원에 비해 증가된 양으로 생성됨을 나타낼 때, 새로운 pMCB가 생성될 수 있고, 여기서 이러한 특정 단백질 구성원을 생성하는 세포주의 비율은 감소된다. 그리고 역으로, 특정 구성원이 소량으로 생성될 때, 이러한 구성원을 생성하는 세포주의 비율이 증가된 pMCB를 생성할 수 있다.

배양 시스템

배치, 유가식-배치 및 관류 공정을 포함하나 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 배양 방식을 이용하여 본 발명의 재조합 폴리클로날 단백질을 제조할 수 있다.

단백질의 고-수준 발현을 위한 발현 시스템의 확립

세포로의 핵산 서열의 도입 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 이들 방법은 전형적으로 세포, 게놈 또는 여분의-염색체 엘리먼트로 관심있는 서열을 도입시키기 위해 DNA 벡터를 사용하는 것을 포함한다. 세포의 트랜스펙션은 리포펙션, 화학적으로 변형된 트랜스펙션, 칼슘 포스페이트 침전, 일렉트로포레이션, 미세주입, 리포좀 융합, RBC 고스트 융합, 원형질체 융합, 바이러스 형질도입 등을 포함하는 당 분야에 공지된 많은 방법에 의해 달성될 수 있다.

숙주 세포주의 트랜스펙션을 위해, 관심있는 벡터 라이브러리를 사용하며, 여기서 각각의 벡터는 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질의 한 구성원을 엔코딩하는 핵산 서열의 단지 하나의 복사체를 포함한다. 관심있는 발현 벡터 라이브러리는 관심있는 재조합 폴리클로날 단백질을 총괄적으로 엔코딩한다. 통합에 적합한 벡터는 이전 섹션에 기술되어 있다.

재조합 폴리클로날 생산 세포주의 생성 및 이러한 세포주로부터의 재조합 폴리클로날 단백질의 생성은 여러 상이한 트랜스펙션 및 제조 전략에 의해 달성될 수 있다.

도 1에 예시된 바람직한 트랜스펙션 방법은 관심있는 라이브러리를 구성하는 개별적 벡터를 별도로 이용하여 숙주 세포를 트랜스펙션시키는 높은 처리량 방법이다. 이러한 방법은 개별적 트랜스펙션으로 불린다. 개별적으로 트랜스펙션된 숙주 세포는 바람직하게는 개별적으로 선택된다. 그러나, 이들은 또한 선택 전에 풀링될 수 있다. 선택시 생성되는 개별적 세포 클론은 발현 수준, 증식율 및 통합 패턴에 관해 분석될 수 있으며, 바람직하게는, 유사한 성장 속도, 유사한 복사체 수, 유사한 발현 및/또는 유사한 강건성 수준을 갖는 것들을 폴리클로날 GOI 라이브러리 스톡을 생성하는데 사용할 수 있다. 개별적 세포 클론을 혼합시켜 스톡을 생성시키기 전, 이들이 스톡으로부터 재생된 직후 또는 짧은 증식 또는 적응 시간 후에, 요망되는 폴리클로날 세포주를 수득할 수 있다. 이러한 접근법은 조성물의 안정성을 추가로 개선시킬 수 있다.

각 세포로의 하나를 초과하는 복사체의 통합을 허락하는 트랜스펙션 환경하에, 폴리클로날 단백질이 단량체인 경우, 발현 벡터들의 혼합물을 이용한 대규모 트랜스펙션을 수행할 수 있다. 다합체 단백질의 경우, 숙주 세포의 게놈으로의 다중 통합을 허락하는 이러한 대규모 트랜스펙션은 서브유닛의 스크램블링을 초래할 것이다. 많은 경우에, 예컨대 약제학적 용도를 위한 재조합 폴리클로날 항체를 제조하는 경우에, 스크램블링은 회피되어야 한다. 다합체 단백질의 경우, 스크램블링이 허용될 수 있거나 트랜스펙션이 각 숙주 세포의 게놈으로의 단 하나의 복사체의 통합을 보장하는 조건하에 수행되는 경우, 대규모 트랜스펙션이 수행될 수 있다. 이러한 방법의 예로는 레트로바이러스 형질도입 및 스페로블라스트(sphaeroblast) 융합이 있다. 관심있는 변이성 핵산 서열의 라이브러리를 구성하는 개개 벡터는 단일 조성물로 함께 혼합될 수 있거나, 바람직하게는 각 라이브러리 구성원을 엔코딩하는 개개 벡터는 분리된 조성물이나 조성물 중 약 5 내지 50개의 별개의 벡터 라이브러리의 혼합물로 유지될 수 있다.

또 다른 방법은 트랜스펙션을 위해 조성물에 약 5 내지 50개의 개개 벡터 라이브러리를 함유하도록, 분획으로 분할된 벡터 라이브러리를 이용하는 것이다. 바람직하게는, 라이브러리의 분획이 10 내지 20개의 별개의 벡터로 구성된다. 이후 각 조성물은 숙주의 분취물로 트랜스펙션된다. 이 방법을 중규모 트랜스펙션이라고 한다. 트랜스펙션된 분취물의 수는 각 분획 중의 개개 벡터의 라이브러리의 크기 및 수에 의존적일 것이다. 예를 들어, 라이브러리가 조성물 중 20개의 별개의 변이성 구성원을 포함하는 분획으로 분할되는 100개의 별개의 변이성 구성원으로 구성되는 경우, 숙주 세포의 5개의 분취물이 원래 라이브러리의 별개의 분획을 구성하는 라이브러리 조성물로 트랜스펙션되어야 할 것이다. 숙주 세포의 분취물은 트랜스펙션 이후에 선택된다. 바람직하게는, 별개의 분취물이 따로따로 선택된다. 그러나, 이들은 또한 선택 이전에 풀링될 수 있다. 분취물은 이들의 클론 다양성에 대해 분석될 것이고 충분한 다양성을 지니는 것들만이 폴리클로날 GOI 라이브러리 스톡을 생성하기 위해 이용될 것이다.

재조합 폴리클로날 단백질 제조를 개시하기 전에 폴리틀로날 세포주의 동결된 스톡을 생성할 수 있다. 제조를 위해 요망되는 폴리클로날 세포주를 수득하기 위해, 클론을 동결된 스톡을 생성하기 전, 이들이 스톡으로부터 재생된 직후 또는 짧은 증식 및 적응 시간 후에 혼합시킬 수 있다.

상기에 개요된 제조 전략에서의 공통된 특징은 재조합 폴리클로날 단백질을 구성하는 모든 개별적인 구성원들이 하나의 컨테이너 또는 최대 약 10개의 제한된 수의 컨테이너, 예컨대 생물반응기에서 생성될 수 있다는 것이다.

발현 수준을 증가시킬 필요가 있는 경우, DHFR 유전자 또는 글루타민 합성효소(GS) 유전자, hprt (히포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라아제) 또는 트립토판 합성효소 유전자에 대한 선택을 이용하여 유전자 증폭을 수행할 수 있다. 이것은 상기 선택 마커를 포함하는 벡터의 사용을 요구한다. 본 발명의 한 구체적인 특징은 복사체 수를 비교적 낮게 유지하여 세포의 안정성을 높게 유지하는 것이다. 그러나, 세포는 낮은 농도의 MTX (예컨대 1-10 nM)을 지니는 무-누클레오시드 배지에서 실시예에 사용된 유형의 구성물에 대하여 비교적 온당한 선택 압력하에 단 일 라운드로 선택되는 것이 바람직하다. 이러한 온당한 선택 압력이 비교적 낮은 복사체 수를 초래하는 것으로 여겨진다. 온건한 선택 압력은 매우 높은 복사체 수의 불안정성을 회피하면서 높은 발현을 초래하는 균형을 이룬 복사체 수를 야기하는 것으로 여겨진다.

보다 높은 발현 수준을 달성하기 위해, 발현에 사용된 세포주는 바람직하게는 폴리클로날 단백질의 프로모터 제어되는 발현을 개선시킬 수 있는 이종성 트랜스활성화제를 포함한다. 트랜스활성화제 및 프로모터의 적합한 조합의 예가 하기 표에 언급된다 (표 2).

표 2. 트랜스활성화제/프로모터 쌍의 예

트랜스활성화제	프로모터 예	설명
렌티바이러스 Tat	긴 말단 반복(LTR)
아데노바이러스 E1A	HCMV 주요 IE 인핸서/프로모터
단순 헤르페스 바이러스 VP16	단순 헤르페스 바이러스 유전자 프로모터는 IE175이다	US6,635,475
B형 간염 바이러스 X 단백질 (HBx)	SV40조기
합성 Zn-핑거 단백질	합성	Sangamo Inc
SV40 거대T 항원	SV40 후기 프로모터
테트라시클린-제어된 트랜스활성화제 (tTA)	합성	합성 융합체
사람 시토메갈로바이러스 IE2p86	HCMV 주요 IE 인핸서/프로모터
사람 시토메갈로바이러스 IE1p72	HCMV 주요 IE 인핸서/프로모터
엡스타인-바 바이러스 R 트랜스활성화제 (Rta)	EBV 프로모터
갑상선 호르몬 수용체	성장 호르몬 프로모터
글루코코르티코이드 호르몬 수용체	유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터

바람직하게는, 세포주는 트랜스활성화제를 코딩하는 발현 구성물로 트랜스펙션되고 클론은 한계 희석법 또는 단일 세포 클로닝을 위한 기타 방법을 이용하여 선택된다. 발현 벡터는 본원에서 발현 벡터에 대해 개시된 대로 프로모터, 선택 마커 등과 같은 엘리먼트를 포함할 수 있다. 바람직하게는 트랜스활성화제의 발현을 제어하는 프로모터는 연장 인자 1 프로모터, CMV 프로모터, 메탈로티오네인-1- 프로모터 또는 유사한 것들과 같은 항시적 프로모터이다. 바람직한 구체예에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다.

관심있는 유전자의 발현을 제어하는 CMV 프로모터를 트랜스활성화시키는 것에 추가하여 세포를 스스로 안정화시키는 것으로 보이는 아데노바이러스 E1A 트랜스활성화제를 이용하는 것이 특히 바람직하다. 다른 경우에 언급된 대로, E1A 발현은 첫 번째 생성된 세포주인 ECHO에서 검출될 수 없다. 따라서, E1A와 세포의 안정화간 관련성은 본 실험에서 입증되지 않았다.

각 단백질 구성원이 두 개를 초과하는 폴리펩티드 사슬로 구성된 폴리클로날 단백질을 제조하기 위하여, 사슬의 조합이 친화성, 특이성 및 이들을 형성하는 단백질의 활성에 중요할 수 있다. 이것은 예를 들어 항체와 TcR에 대하여 보여진다. 예를 들어, 항체 가변 중쇄와 가변 경쇄의 조합이 사슬로부터 형성된 항체의 친화성 및 특이성에 영향을 미치는 것으로 공지되어 있다. 따라서, 항체를 엔코딩하는 서열의 라이브러리가 특정 표적에 친화성을 지니는 항체를 생성하는 이들의 능력에 대해 선택되었을 때, 최종 생성물에서의 가변 중쇄 및 가변 경쇄의 조합이 이에 상응하도록 보장하는 것이 요망된다. 이러한 이유로 폴리클로날 단백질의 개개 구성원을 구성하는 폴리펩티드 사슬은 바람직하게는 통합에 이용되는 동일한 벡터에 정위됨으로써 이들이 공정을 통털어 함께 유지될 것을 보장한다. 대안적으로, 숙주 세포는 중쇄 및 경쇄의 동족 쌍을 코딩하는 발현 벡터의 쌍으로 트랜스펙션될 수 있다.

하기 설명은 재조합 폴리클로날 항체 발현 세포주를 어떻게 수득하는 지에 관한 일례이다.

반대되는 전사 방향으로 정위된 두 프로모터를 지니는 항시적인 발현을 위한 보편적인 프로모터 카세트, 예컨대 가변 중쇄 및 모든 카파 또는 람다 경쇄에 의해 둘러싸인 헤드-투-헤드 구성을 고안할 수 있고, 이는 모든 구성물이 선택 마커 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 벡터로 운반되게 한다. 유도가능한 발현을 위한 프로모터 카세트도 사용될 수 있는 것으로 고려된다. 더욱이, 프로모터는 반대 방향의 전사를 초래할 테일-투-테일이나 단방향 전사를 위한 테일-투-헤드로 정위될 수 있다. 유도될 수 있는 프로모터를 발현의 제어를 위해 이용할 수 있다. 트랜스펙션 후, 세포를 바람직하게는 안정한 형질전환체를 선택하기 위한 선택적인 조건하에 배양시킨다.

이러한 조건하에 살아남은 세포를 통상적인 소형 배양 플라스크, Nunc 다층 세포 공장, 소형 고수율 생물반응기 (MiniPerm, INTEGRA-CELLine), 진탕기, 및 공동 섬유- 및 생물반응기 WAVE 백 (Wave Biotech, Tagelswangen, Switzerland) 또는 다른 일회용 용기/컨테이너로의 스피너 플라스크와 같은 상이한 배양 시스템에서 후속하여 성장시킬 수 있다. 세포를 ELISA를 이용하여 항체 생성에 대해 시험할 수 있다. 폴리클로날 세포주를 바람직하게는 혈청 비함유 배지에서 연장된 기간 동안 선택 압력하에 생존력에 대해 선택한다.

발현 시스템에서 폴리클론성의 보존에 대한 평가

본 발명에 따라서, 폴리클론성이 실제로 변경되었을 때 생산을 중단할 수 있도록 발현 시스템의 폴리클론성이 생성 동안 심각하게 변경되지 않는 것을 보장하는 것이 종종 중요하다. 이것은 변이성 핵산 서열의 상대적인 발현 수준을 모니터링함에 의해 수행된 본 발명에 따른다. 발현 수준은 예를 들어 RELP 분석, 어레이 또는 실시간 PCR을 이용하여 mRNA 수준에서 또는 예를 들어 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 질량 분광분석 또는 다양한 크로마토그래피 기술을 이용하여 단백질 수준에서 모니터링될 수 있다. 이러한 기술들을 이용하여, 다수의 모든 개개 발현 수준에 대한 기준선 값을 확립한 다음 생산 동안 배양액으로부터의 샘플을 취하여 발현 수준이 변화되었는지를 (전부 및 비교적) 측정할 수 있을 것이다. 본 발명의 통상의 실시에서, 기준선 값을 둘러싼 값의 범위를 확립할 수 있고, 비교 발현 수준이 범위 밖에서 발견되는 경우, 생산을 종료시킨다.

세포 배양 및 재조합 폴리클로날 항체의 생성

상기 기술된 바와 같이 생성된 폴리클로날 세포주는 세포의 게놈으로 삽입된 변이성 핵산 서열에 의해 엔코딩된 관심있는 폴리클로날 단백질을 발현시키기 위한 적합한 조건하에 적합한 배지중에서 성장할 수 있다. 세포 배양은 여러 단계로 수행될 수 있다. 포유동물 세포를 사용하는 경우, 선택된 세포를 바람직하게는 현탁액 및 혈정 비함유 조건하에 성장시키는 것에 적응시킨다. 혈청 비함유 배지에서 성장에 대한 적응은 또한 폴리클로날 세포주를 위해 클로닝된 세포주를 혼합시키기 전에 수행되는 것이 바람직할 수 있다. 적응은 1 또는 2 단계로 선택 압력하에 또는 선택 압력 없이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 제조된 약물 생성물의 순도를 손상시키지 않으며 제조 기간 내내 선택을 허락하는 선택 시스템을 이용한다. 일반적으로, 약제학적 용도를 위한 재조합 단백질을 제조하기 위하여, 선택 압력을 제공하기 위해 예컨대 항생제 또는 다른 저분자량 약물을 사용하는 것은 바람직하지 않은데, 그 이유는 최종 생성물이 임의의 미량의 항생제를 함유하지 않는 것을 확인할 필요가 있을 것이기 때문이다.

폴리클로날 세포주가 적합한 조건에 적응된 경우, 규모를 늘리기 시작할 수 있다. 이 시점에, 폴리클로날 워킹 세포 스톡 (폴리클로날 워킹 세포 뱅크, pWCB) 및/또는 폴리클로날 마스터 세포 뱅크 (pMCB)를 동결시킬 수 있다. 바람직하게는 30 내지 100 리터의 생물반응기를 이용하나, 더 작거나 (5-10 리터) 더 큰 (1,000, 5,000, 10,000, 15,000 리터 이하, 또는 심지어 더 큰) 생물반응기를 이용할 수 있다. 적합한 생산 시간 및 생물반응기 크기의 선택은 배치로부터의 단백질의 원하는 수율 및 세포주로부터의 발현 수준에 의존적이다. 시간은 이틀에서 3개월까지 다양할 수 있다. 발현된 재조합 폴리클로날 단백질은 세포 또는 상청액으로부터 회수될 수 있다. 재조합 단백질은 당업자에게 공지된 공정에 따라 정제되고, 특성규명된다. 정제 및 특성규명 공정의 예는, 예컨대 WO 2006/007853에 기술되어 있다.

배양 상청액으로부터 재조합 폴리클로날 단백질의 정제

배양 상청액으로부터의 특이적 단백질의 분리가, 단백질의 생리-화학적 특성에서의 차이, 예를 들어 분자량, 순전하, 소수성, 또는 특이적 리간드 또는 단백질에 대한 친화성에서의 차이를 이용하는 다양한 크로마토그래피 기법에 의해 가능하다. 이와 같이, 단백질은 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 분자량에 따라, 또는 이온-교환 (양이온/음이온) 크로마토그래피를 사용하여 또는 대안적으로 크로마토그래피포커싱을 사용하여 순전하에 따라 분리될 수 있다. 유사하게는, 단백질은 특이적인 고정된 리간드 또는 단백질에 대한 친화성에 있어서의 차이를 이용한 친화성 크로마토그래피 또는 소수성 상호작용 또는 전하 유도 크로마토그래피를 사용하여 소수성에 따라 분리될 수 있다. 이와 같이, 단백질의 복잡한 혼합물의 분리는 다양한 크로마토그래피 원리의 연속적인 조합에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 단백질 혼합물은, 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피를 사용한 순전하에 따라 초기에 분리될 수 있으며, 유사한 순전하의 단백질은 후속하여 겔여과 크로마토그래피를 이용하여 분자량에 따라 또는 고농도의 선택된 염의 존재하에 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용하여 소수성에 따라 분리될 수 있다.

이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 및 겔 여과와 같은 후속 정제 단계와 조합된 친화성 크로마토그래피는 상이한 공급원, 예를 들어 복수 유체, 세포 배양 상청액 및 혈청으로부터 IgG (폴리클로날 및 모노클로날) 및 TcR를 정제하는데 종종 사용되어 왔다. 분리가 단백질(들)과 크로마토그래피 매트릭스에 결합된 특이적 리간드 사이의 가역적인 상호작용에 근거한 친화성 정제는 용이하고도 신속한 방법이며, 이는 높은 선택성, 일반적으로 높은 용량 및 더 적은 부피로의 농축을 제공한다. 단백질 A와 단백질 G 즉, 2개의 세균 세포 표면 단백질은 F_C 영역에 대한 높은 친화성을 가지며, 다양한 종으로부터의 폴리클로날 IgG 및 이의 서브클래스를 정제하고, 면역 복합체의 흡수 및 정제를 포함한, 많은 일정한 적용을 위해 고정된 형태로 사용되었다.

친화성 크로마토그래피 후, 다운스트림 크로마토그래피 단계, 예를 들어 이온-교환 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 숙주 세포 단백질, 누출된 단백질 A 및 DNA를 제거하기 위해 수행할 수 있다.

최종 정제 단계와 같은 겔 여과는 이합체 및 기타 응집체와 같은 오염 분자를 제거하고, 샘플을 저장 완충제로 전달하는데 이용될 수 있다. 공급원 및 발현 조건에 따라, 요구되는 수준의 항체 순도를 달성하기 위한 추가의 정제 단계를 포함하는 것이 필요할 수 있다. 따라서, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 이온-교환 크로마토그래피는 단백질 A 및 겔여과 크로마토그래피와 함께 빈번하게 사용되어 치료학적 용도를 위한 항체를 정제한다.

정제를 용이하게 하기 위하여, 폴리클로날 항체의 모든 구성원이 중쇄 및/또는 경쇄의 동일한 불변 영역을 공유하는 것이 바람직하다.

기타 부류의 항체를 정제하기 위해, 대안적인 친화성 크로마토그래피 매질을 사용하여야 하는데 그 이유는 단백질 A 및 G가 IgA 및 IgM에 결합되지 않기 때문이다. 면역친화성 정제를 사용할 수 있거나 (고체상에 결합된 항-IgA 또는 항-IgM 모노클로날 항체), 대안적으로 이온-교환 및 소수성 상호작용을 포함하는 다단계 정제 방법을 사용할 수 있다.

구조적 특성규명

폴리클로날 단백질, 예컨대 항체 및 TcR의 구조적 특성규명은 혼합물의 복잡성으로 인해 고해상도를 요구한다 (클론 다양성 및 글리코실화). 전형적인 접근법, 예컨대 겔 여과, 이온-교환 크로마토그래피 또는 전기영동은 개별적 항체 사이에서 분화되기에 충분한 해상도를 지닐 수 없다. 2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (2D-PAGE)은 복합 단백질 혼합물을 프로파일링한 후, 질량 분광분석 (MS) 또는 액체 크로마토그래피 (LC)-MS (예를 들어, 프로테오믹)에 사용되었다. 단백질 전하 및 질량에 기초한 분리를 조합한 2D-PAGE는 혈청 샘플 중의 폴리클로날, 올리고클로날 및 모노클로날 면역글로불린을 구별하는데 유용한 것으로 입증되었다. 그러나, 이들 방법은 일부 제한된다. 크로마토그래피 기술, 특히 일렉트로스프레이 이온화 MS에 결합된 모세관 및 LC는 복잡한 펩티드 혼합물 검정에의 적용이 점점 더 증가하고 있다. LC-MS는 모노클로날 항체의 특성규명에 사용된다. 매우 복잡한 샘플의 검정은 크로마토그래피 시스템의 더욱 높은 해상력을 요구하며, 이는 2차원 (또는 그 초과)으로 분리함으로써 수득될 수 있다. 이러한 접근법은 1차원으로 이온-교환 및 2차원으로 임의로 MS에 결합된 역상 크로마토그래피 (또는 소수성 상호작용)에 기초할 수 있었다.

작용성 특성규명

폴리클로날 단백질은 예를 들어 동일한 표적 또는 유사한 활성에 대한 특이성을 갖는 폴리클로날 단백질을 이용한 비교성 연구를 통해 기능적으로 특성규명될 수 있다. 이러한 연구는 실험관내에서 및 생체내에서 수행될 수 있다.

폴리클로날 항체의 실험관내 작용성 특성규명은, 예를 들어 면역침전법일 수 있으며, 이는 미정제 세포 용해물로부터 표적 항원의 분석적 분리를 위한 고도로 특이적인 기술이다. 면역침전법과 다른 기술, 예컨대 SDS-PAGE를 조합하고, 단백질 염색 (코마시에 블루(Coomassie Blue), 은 염색 또는 비오틴 표지) 및/또는 면역블롯팅에 의해, 예를 들어 항원을 검출하고 정량하고, 이에 따라 항체의 작용성 특성 중 일부를 평가하는 것이 가능하다. 이러한 방법은 항체 분자의 수 또는 이들의 결합 친화성을 평가하지는 않지만, 표적 단백질의 가시화 및 이에 따른 특이성을 제공한다. 마찬가지로, 이러한 방법은 발현 공정 동안 항원에 대한 항체의 잠재적 차이 (클론 다양성의 완전성)를 모니터링하는데 사용될 수 있다.

폴리클로날 항체의 생체내 작용성 특성규명은, 예를 들어 감염 연구일 수 있었다. 마우스와 같은 실험 동물은, 예를 들어 특이적 바이러스로 감염될 수 있으며, 이러한 바이러스에 대한 폴리클로날 항체가 발생한다. 감염이 억제될 수 있는 정도는 폴리클로날 항체의 작용성을 나타낼 것이다.

치료학적 조성물

본 발명의 구체예에서, 활성 성분으로서 면역글로불린 슈퍼패밀리로부터 선택된 재조합 폴리클로날 단백질을 포함하는 약제 조성물은 포유동물의 질환을 치료하거나 예방하기 위한 것이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 약제 조성물은 활성 성분으로서 재조합 폴리클로날 항체 또는 항체 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 약제 조성물은 활성 성분으로서 재조합 폴리클로날 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체 단편 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다.

본 발명의 약제 조성물은 공지된 방식으로 제조되며, 예를 들어, 통상적인 용해, 냉동건조, 혼합, 과립화 또는 당제화 공정에 의해 제조된다. 약제 조성물은 통상적인 약제학적 실시에 따라 제형화될 수 있다 (참조 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.) ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J.Swarbrick and J.C.Boylan, 1988-1999, marcel Dekker, New York, NY).

활성 성분의 용액 및 또한 현탁액, 및 특히 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하게는 사용되며, 예를 들어 활성 성분을 단독으로 또는 만니톨과 같은 담체와 함께 포함하는 냉동건조된 조성물의 경우에, 이러한 용액 또는 현탁액이 사용 전에 생성되는 것이 가능하다. 약제 조성물은 멸균되고/거나 부형제, 예를 들어 보존제, 안정화제, 습윤제 및/또는 에멀젼화제, 가용화제, 삼투압 조절용 염 및/또는 완충제를 포함할 수 있으며, 공지된 방법, 예를 들어 통상적인 용해 또는 냉동 건조 공정에 의해 제조된다. 이러한 용액 또는 현탁액은 점도-증가 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리 비닐피롤리돈 또는 젤라틴을 포함할 수 있다.

주입 조성물은 멸균 조건하에 통상적인 방식으로 제조되며; 조성물을 앰플 또는 바이알에 넣고, 컨테이너를 밀봉시키는 것에 동일하게 적용된다.

약제 조성물은 약 1% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 20% 내지 약 90%의 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 약제 조성물은, 예를 들어 단위 용량 형태, 예컨대 앰플, 바이알, 좌제, 드래그, 정제 또는 캡슐 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 치료학적 용도

본 발명에 따른 약제 조성물은 포유동물의 질환을 치료, 완화 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물로 치료될 수 있는 질환으로는 암, 감염성 질환, 염증 질환, 알레르기, 천식 및 기타 호흡기 질환, 자가면역 질환, 심혈관 질환, 중추신경계 질환, 신진대사 및 내분비 질환, 이식 거부 및 원하지 않는 임신을 포함한다.

본 발명의 일 양태는 재조합 폴리클로날 항체 또는 항체 단편을 유효량으로 투여하여, 동물의 질환을 치료, 완화 또는 예방하는 방법이다. 추가의 양태에서, 유효량의 재조합 폴리클로날 T 세포 수용체 또는 T 세포 수용체 단편이 투여된다.

본 발명의 추가적 양태는 암, 감염, 염증 질환, 알레르기, 천식 또는 기타 호흡기질환, 면역기능부전, 자가면역질환, 심혈관 질환, 중추신경계 질환, 신진대사 질환, 내분비 질환, 이식 거부 및 원하지 않는 임신으로 구성된 군으로부터 선택된 질환을 치료하기 위한 조성물을 제조하는데 있어서 재조합 폴리클로날 항체 또는 재조합 폴리클로날 T 세포 수용체, 또는 항체나 T 세포 수용체 단편의 용도에 관한 것이다.

진단 용도 및 환경 검출 용도

본 발명의 또 다른 구체예는 진단 키트 및 환경 검출 용도용 키트, 및 이러한 키트의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따라 제조된 재조합 폴리클로날 단백질을 포함하며, 여기서 단백질은 검출가능한 표지로 표지되거나, 비-표지 검출을 위해 표지되지 않을 수 있다. 표지되는 경우, 본 재조합 폴리클로날 단백질은 표적 분자를 함유하는 것으로 예상되는 샘플로 첨가되고, 표지의 존재 또는 부재는 표적 분자의 존재 또는 부재를 나타낸다. 시험되는 샘플은 체액, 예컨대 혈액, 혈청, 혈장, 척수, 림프액 또는 소변 샘플, 또는 비포유동물 샘플, 예컨대 오염물질을 함유하는 것으로 의심되는 환경 공급원으로부터의 샘플일 수 있다. 비포유동물 샘플은 물, 공기 또는 오염된 토양일 수 있다. 비-표지 검출은 결합시 BIAcore에서 굴절 변화를 측정하는 것을 포함하며, 여기서 재조합 폴리클로날 단백질은 표적 분자를 포획하는데 사용된다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 판단되어서는 안된다.

실시예 1

항체를 발현시키는 CHO 세포 클론의 유도

발현 벡터

사용된 IgG 발현 벡터를 도 2a에 도시한다.

ElA 발현 벡터를 도 2b에 도시한다.

세포주

사용된 세포주는 로렌스 체이신 (Lawrence Chasin, Columbia University)으로부터 수득한 DHFR-네거티브 CHO 세포주 DG44의 유도체이다 (Gibco cat # 12613-014로도 이용가능함). DG44 세포를 벡터 pcDNA3.1+ (Cat # V790-20, Invitrogen)에서 아데노바이러스 타입 5 트랜스활성화제 E1A의 13S 버젼에 대해 cDNA로 트랜스펙션하였다. (NCBI 수탁 번호 AY339865, cDNA 서열:

트랜스펙턴트를 500 ㎍/ml 농도의 제네티신 (Invitrogen)으로 선택하였다. 선택 후, 세포를 한계 희석법에 의해 단일-세포 클로닝시켰다. 클론을 항체 플라 스미드(상기 도시됨)를 이용한 일시적인 트랜스펙션에 의해 CMV 프로모터의 트랜스활성화에 대해 시험하였다 (개선된 발현). 단일 클론은 일시적인 검정에서 트랜스펙션되지 않은 DG44 세포주에 비해 3배만큼 개선된 발현 수준을 나타내었다. 증가된 발현 수준이 실제의 트랜스활성화의 증거는 아니며 특히 높게 발현되는 서브-클론의 선택에 의해 야기될 수 있었다. 안정한 트랜스펙션으로 수행된 것에 비해, 선택된 풀은 야생형 DG44 세포주에 비해 4-5배 증가된 발현 수준을 나타내었다. 이 클론 (ECHO라 부름)을 2회 서브클로닝시켰고 이것은 CMV 프로모터의 트랜스활성화에 대해 안정한 것으로 나타났다 (증가된 발현). CMV 프로모터의 실제의 트랜스활성화를 측정하지 않았으나, 그럼에도 불구하고 클론은 CMV 프로모터의 조절하에 항체의 안정한 높은 발현을 나타내었다.

항체 발현 플라스미드

사용된 항체 발현 플라스미드를 상기 도시된 대로 구성하였다. 이를 위해, 상이한 백시니아 바이러스 표면 단백질에 대해 유도된 6개의 상이한 항체를 선택하였다. 이들은 이들 각각이 상이한 항체들의 믹스에서 동정 및 정량을 가능하게 하는 매우 특징적인 프로필을 이온 교환 크로마토그래피에서 지니기 때문에 선택된 것이다. 항체 (2006년 12월 4일 출원된 공동-계류중인 PCT/DK2006/000686에 개시됨, 발명의 명칭 "Anti-orthopoxvirus recombinant polyclonal antibody", WO 2007/065433으로 공개됨)는 하기와 같았다:

·Sym002-037 (클론 002-037)

·Sym002-186 (클론 002-186)

·Sym002-235 (클론 002-235)

·Sym002-286 (클론 002-286)

·Sym002-303 (클론 002-303)

·Sym002-482 (클론 002-482)

IgG ELISA

샌드위치 ELISA에 의해 IgG를 측정하였다. 간단히 말해, 96-웰 플레이트 (Maxisorp, NUNC)를 염소 항-사람 Fc (Serotec, STAR106)로 코팅한 다음 샘플 및 표준물질 (정제된 사람 모노클로날 IgG1 카파 항체)와 함께 인큐베이션하였다. 호스래디쉬 과산화효소(Serotec STARlOOP)에 컨주게이션된 염소 항-사람 카파 경쇄로 검출을 수행하였다.

ECHO 세포의 트랜스펙션

ECHO 세포를 T80 플라스크에서 10% 우태아 혈청 (FCS) (Invitrogen)과 함께 누클레오시드 (Invitrogen cat.no. 32571)를 지니는 MEM 알파 배지에서 플라스크 당 0.30 x 10⁶개 세포의 밀도로 시딩하였다. 시딩한 지 1시간 이내에, 세포를 Fugene6 (Roche)으로 트랜스펙션하였다:

·10 ㎕의 Fugene6을 490 ㎕의 둘베코의 변형된 이글 배지와 혼합시키고 5분 동안 실온에서 인큐베이션한다.

·5 ㎍의 발현 플라스미드를 첨가하고 믹스를 추가로 15분 동안 실온에서 인큐베이션한다.

·믹스를 세포 배양 플라스크에 첨가한다.

다음 날, 트랜스펙션 시약을 지니는 배지를 빨아내고, 각 플라스크를 10% 투석된 FCS (Invitrogen)(MEM알파-)를 지니는 5 ml의 MEM 알파 배지 (누클레오시드 없음)로 1회 세척하고, 10 ml의 동일한 배지를 2 nM 농도의 메토트렉세이트와 함께 첨가하였다. 이어서, 배지를 일주일에 2회 교환하였다.

15일 후, 세포를 트립신화하고, 모든 세포를 새로운 플라스크로 옮겼다. 추가로 2일의 배양 후, 배지를 교환하고, 다음 날 배지를 빨아내고, 세포를 계수하고, 생산성을 IgG ELISA에서 측정하였다. 그 결과를 표 3에 도시한다. 생산성을 수확 시간에서의 세포 수를 이용하여 일당 세포 당 피코그램으로서 계산하였다.

표 3

세포 수, 배지의 IgG 함량 및 트랜스펙션된 풀의 특이적 세포 생산성

단일-세포 클론을 생성하기 위해, 풀의 세포를 표면-결합된 항체에 대해 염색하고 단일 세포를 50% ECHO-세포 조건화된 배지 (MEM알파-)와 조건화되지 않은 50%의 동일한 배지를 함유하는 96-웰 플레이트로 분류하였다. 간단히 말해, 염색 프로토콜은 다음과 같았다:

1. 세포를 트립신화하고 계수한다.

2. 1-5 x 10⁶개 세포를 살균 FACS 튜브로 피펫팅한다.

3. 세포를 1분 동안 250 g 4℃에서 스핀 다운하고 상청액을 제거한다.

4. 세포를 2 ml의 살균된 FACS PBS (PBS + 2% FCS) (5ml)에서 세척한다.

5. 세포를 100 ㎕의 희석된 Ab/10⁶개 세포에서 1:20으로 희석된 (염소 F(ab)2 단편 항-사람 IgG H+L- PE (Beckman-Coulter, IM1626)으로 염색하고 20분 동안 인큐베이션한다 (암실에서 4℃).

6. 세포를 2 ml의 FACS PBS (5ml)에서 2회 세척한다.

7. FACS PBS (2ml)에 1-5 x 10⁶/ml로 재현탁한다.

8. 요오드화 프로피듐을 첨가한다, 10 ㎍/ml 1:100.

적당한 게이트(gate)를 설정하고, 세포를 96-웰 플레이트로 (항체 당 5개 플레이트) FACS-Aria (Beckton-Dickinson)를 이용하여 단일-세포 분류하였다.

약 1주 후에, 단일 클론의 존재에 대하여 현미경으로 웰을 검사하였다.

약 2주 후에, 단일 클론을 지니는 웰로부터의 상청액을 각각 단일 희석액에서 ELISA에 의해 검정하였고, ELISA 값 및 웰의 시각적 검사에 기초하여 각 항체를 나타내는 24개 클론을 계속된 배양을 선택하였다. 항체 발현 수준에 대한 선택과 병용된 형태학 및 세포 수에 대한 시각적 검사를 이용하여 클론을 선택하였다. 선택된 클론을 고갈 검정으로 추가로 시험하였다: 간단히 말해, 세포를 24-웰 플레이 트에 시딩하고 대부분의 세포가 치사될 때까지 성장하게 하였다. 상청액을 ELISA에 의해 검정하고 각 항체에 대한 상위 10개 클론을 혈청 비함유 현탁 배양으로의 적응을 위해 선택하였다.

혈청 비함유 현탁 배양으로의 적응

세포를 트립신화하고 계수하였다. 5 x 10⁶개 세포를 원심분리하고 10 ml의 ProCHO4 혈청 비함유 배지 (Cambrex)에 재현탁하였다. 세포를 50 ml의 세포 배양 튜브 (TRP, Switzerland)로 옮기고 진탕기 상에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 세포 밀도를 1주일에 2회 계산하였고 각 경우에 배양액을 ml 당 0.5 x 10⁶개 세포 (처음 2주 동안) 또는 ml 당 0.3 x 10⁶개 세포 (나머지 기간 동안)로 희석하였다. 4-5주 후, 대부분의 클론에 대한 배가 시간이 30시간에 접근하였고, 이 시점에 이들은 혈청 비함유 배양에 적응된 것으로 간주되었다.

적응 기간의 끝에, 세포를 ELISA로 검정하고, 10% DMSO를 지니는 배양 배지에서 동결시키고, 발현 실험을 위해 이용하였다 (하기 실시예 2 참조).

실시예 2

발현 실험

장시간 동안 혼합된 배양액의 조성적 안정성을 시험하기 위해, 클론의 다수의 믹스를 제조하였다. 적응 기간 동안 수행된 집계에 기초하여, 배가 시간을 가능한 한도로 고려하였다. 클론이 유사한 배가 시간과 매칭되도록 주의하였다. 모두 9개의 믹스를 제조하였다:

·믹스 1-5: 이들 각각에서 각 항체에 대해 단일 클론을 이용하였다.

·믹스 6: 두 클론을 각 항체에 대해 이용하였다.

·믹스 7: 5개의 클론을 각 항체에 대해 이용하였다.

·믹스 8: 3개의 클론을 각 항체에 대해 이용하였다.

·믹스 9: 모든 이용가능한 클론을 이용하였고, 각 항체에 대해 5-7개였다.

클론을 혼합시켜 각 항체를 나타내는 세포의 수가 (각 항체에 대해 1-7개 클론) 믹스 중 세포의 총 수의 1/6을 구성하도록 하였다.

실시예 1에 개시된 50 ml 배양 튜브에서 실험을 수행하였다. 사용된 배지는 ProCHO4였고 총 배양 부피는 10 ml였다. 실험을 ml 당 0.3 x 10⁶개 세포의 농도로 시작하였다. 배양액을 3일 및 4일 간격으로 ml 당 0.3 x 10⁶개 세포로 일주일에 2회 희석시켰다. ELISA 및 이온 교환 크로마토그래피 분석을 위한 샘플을 1주일에 1회 취하였다. 첫 번째 샘플을 4일째에 수득하였고 마지막 샘플을 35일째에 수득하였다.

9개의 믹스에 대한 ELISA 값을 도 3에 도시한다.

시작부터 끝까지 세포 분열의 계산된 수는 믹스에서 약 25 내지 약 27로 상이하였다. 이것은 배양액이 개시된 대로 1주일에 2회 희석되었으나 각 시점에 전체 부피를 유지하는 경우, 결국 최종 부피는 43,000 내지 152,000 리터 사이에서 변화될 것임을 의미한다. 산업에서의 대규모 포유동물 세포 배양액은 전형적으로 15,000 리터 이하인데, 이것은 본원에 개시된 혼합 실험이 배양 시간 및 세대 수에 관한 한 산업적 규모에서의 배양에 대한 올바른 모의시험임을 의미한다.

세포의 생산성이 일부 믹스에서 저하되는 경향을 지니는 5주 기간에 걸쳐 비교적 일정할 것으로 보인다.

IgG 조성물의 분석

5-10 ml의 0.22 ㎛ 여과된 배지 상청액을 1 ml 맵셀렉트 슈어(MabSelect Sure) 컬럼 (GE Healthcare) 위로 로딩시켰다. 제조자가 제시한 대로 컬럼을 10 ml PBS pH 7.4로 세척하고 0.1 M 글리신 pH 2.7로 용리시켰다. 풀링된 단백질 재료를 40 mM NaCl, 50 mM Na-아세테이트 pH 5.0에 대해 2회 투석하고 총 IgG 농도를 280 nm에서 흡광도를 측정함에 의해 결정하였다.

60 ㎍의 IgG 혼합물을 PolyLC로부터의 약 양이온 교환 컬럼 PolyCat A (100x4, 6 mm, 3 ㎛, 1500 Å) 위로 로딩시켰다. Na-아세테이트 pH 5.0 완충제에서 1 ml/분의 유속으로 72분 동안 150에서 500 mM으로의 NaCl 구배를 적용시킴에 의해 단백질을 용리시켰다. 용리물의 215 nm 흡광도를 모니터링하고 개개 IgG의 상대적인 양을 시그널의 통합에 의해 결정하였다.

도 3에서, 맵셀렉트 정제 후 믹스 8로부터의 최초 및 마지막 수확물의 IgG 조성물의 양이온 교환 분석의 크로마토그램을 도시한다. 보이는 대로, 개개 Ab가 이들 중 네 개의 기준선 분리를 지니며, 잘 분리된다. 따라서, UV 시그널의 통합은 샘플 중 상대적인 IgG 농도의 매우 정밀한 측정을 제공한다.

상기 개시된 대로 모든 믹스를 분석하고 각 믹스 중 각 항체의 함량을 게산하였다.

6개의 상이한 항체 중에서 다소 균일한 분포가 출발 샘플에서 관찰된다. 관찰된 이 차이는 믹스에 사용된 클론들간 상이한 발현 수준을 반영할 수 있다. 각 샘플의 항체 함량을 도 5에 그래프로 도시한다. 놀랍게도, 모든 항체가 모든 마지막 샘플에서 분명하게 동정될 수 있다. 또한 각 항체를 나타내는 하나를 초과하는 클론을 지니는 믹스에서 (믹스 6-9) 항체가 마지막 샘플에 더욱 균일하게 분포되는 경향이 있는 것으로 관찰된다.

실시예 3. ECHO에서 E1A의 발현

ECHO에서 E1A의 발현을 조사하기 위해, E1A mRNA의 수준을 SYBR 그린을 이용한 정량적인 역전사된 실시간 PCR (qRT-PCR)에 의해 결정하였다. qRT-PCR 방법은 표적 서열의 PCR 증폭에 기초한다. PCR은 이중 가닥 DNA에 결합될 때 녹색광을 방출시키는 DNA 결합 염료인 SYBR 그린의 존재하에 수행된다. 이것은 각 증폭 라운드 이후 이중 가닥 DNA의 실시간 정량을 가능하게 한다.

이중 가닥 DNA의 양이 적을 때, PCR의 맨 처음에, 결합된 SYBR 그린 염료로부터의 시그널은 백그라운드 노이즈와 구별될 수 없다. 그러나, 증폭 공정 동안 시그널은 노이즈를 초과하여 증가하고 이중 가닥 DNA의 생산이 뒤따를 수 있다. 이러한 방식으로, 최초에 샘플에 존재하는 표적의 상대적인 양이 특정 역치와 교차하는 SYBR 그린 시그널에 요구되는 사이클에 기초하여 결정될 수 있다. 역치에 도달하는 정확한 지점이 Ct 값이며, 이것은 초기 표적 양의 상대적인 비교를 위해 이용될 수 있다.

물질 및 방법

총 RNA를 제조자가 권고한 대로 퀴아겐(Qiagen)으로부터의 RNeasy 미니 키트 카달로그 번호 74104를 이용하여 3.0E+06 ECHO 및 Hek293 세포로부터 추출하였다. RNA 샘플의 농도 및 완전성을 진핵생물 총 RNA 나노 시리즈 II 검정을 이용한 아질런트(Agilent)로부터의 2100 생물분석기를 이용하여 측정하였다. 완전성은 1-10의 RNA 완전성 숫자(RIN)로서 결정되는데, 1은 분해된 것이고 10은 완전한 RNA이다. ECHO RNA는 9.5의 RIN을 지니고 HEK293은 8.9의 RIN을 지녔다. 각 샘플의 cDNA를 800 ng의 RNA를 출발 물질로서 이용하여 퀴아겐으로부터의 QuantiTect 역전사 키트 카달로그 번호 205311을 이용하여 만들었다. Hek293 cDNA를 25x 희석시키는 한편, ECHO cDNA를 2회 희석하였다. qRT-PCR을 스트라타겐(Stratagene)으로부터의 브릴리언트 SYBR 그린 QPCR 마스터 믹스 카달로그 번호 600548을 이용하여 스트라타겐 Mx3005P 상에서 수행하였다. 열적 사이클링 조건은 다음과 같다: 10분 동안 95℃에서 유지; 95℃에서 15s 변성, 60℃에서 1분 어닐링 및 72℃에서 30s 연장으로 된 40회 사이클; 55-95℃로부터 용융 곡선 분석. 사용된 프라이머 (E1A-696bpF: 5'-TGACTCCGGTCCTTCTAACACA-'3, E1A-772bpR: 5'-TCACGGCAACTGGTTTAATGG-'3)는 E1A 유전자의 3' 말단에서 77bp 단편을 표적화한다.

결과

qRT-PCR 검정을 이용하여 ECHO 세포에서 E1A의 발현을 분석하였고 이것은 E1A mRNA가 이 검정에서 증폭 및 검출될 수 없음을 나타내었는데, 이것은 ECHO 세포주가 E1A 단백질을 발현시키지 않음을 강력하게 시사한다. 포지티브 대조군으로서 아데노바이러스 DNA의 단편에 의해 형질전환되고 비교적 높은 수준으로 E1A를 발현하는 것으로 공지된 사람 293 세포주를 이용하였다.

qRT-PCR은 Hek293 샘플에서 증폭을 보이고, 포지티브 대조군 Ct=18.74이나, NTC (주형 대조군 없음)나 ECHO 샘플에서는 어떠한 증폭도 나타나지 않았다.

실시예 4. 생물반응기 실험을 위한 세포 뱅크의 제조

조성물의 안정성 연구를 위해 생물반응기 실험을 수행할 수 있도록 마스터 및 워킹 세포 뱅크를 제조하였다. 실험을 위해, 실시예 1에 개시된 대로 6개의 상이한 항체를 발현시키는 ECHO 세포의 클론을 이용하였다. 이용된 클론을 배양 배지 ProCHO4에서 혈청 비함유 현탁 배양에 적응시켰다.

마스터 세포 뱅크

클론을 해동시키고 소정의 기간 동안 현탁 배양에서 회수되게 하였다. 4개의 혼합된 마스터 세포 뱅크를 하기 명세에 따라서 지수(exponential) 성장하는 세포로부터 제조하였다:

·세포를 이들이 대수(logarithmic) 성장하였을 때 동결시켰다.

·6개 모두의 항체가 각 세포 뱅크에서 표시되었다.

·각 항체를 나타내는 동등한 세포 수를 혼합시켰다.

·믹스 1A-3A는 항체 당 단일 클론을 함유하였다.

·믹스 4A는 항체 당 3개의 클론을 함유하였다.

·각각 20 x 10⁶개 세포를 함유하는 10개의 앰플을 믹스 당 동결시켰다.

·동결 배지:10% DMSO를 지니는 배양 배지 (ProCHO4).

워킹 세포 뱅크

믹스 당 하나의 동결된 샘플을 해동시켰다. 믹스를 워킹 세포 뱅크의 제조 전에 8-10일 동안 배양액에 유지하였다:

·세포를 이들이 대수 성장하였을 때 동결시켰다.

·각각 20 x 10⁶개 세포를 함유하는 10개의 앰플을 믹스 당 동결시켰다.

·동결 배지:10% DMSO를 지니는 배양 배지 (ProCHO4).

실시예 5: 생물반응기에서 조성물의 안정성

워킹 세포 뱅크의 믹스 당 하나의 동결된 앰플을 해동시키고 세포를 14일 동안 시드 트레인으로서 배양액에 유지하였으며, 이 시점에 생물반응기 배양을 개시하였다:

각 시드 트레인을 이용하여 두 생물반응기를 250 ml의 출발 배지에서 (ProCHO4 + 5mM 글루타민 + 1/100 비필수 아미노산) 0.6 x 10⁶개 세포/ml로 접종하였다.

접종한 지 2 내지 14일 후에 배양액에 공급 배지 (ProCHO4 + 6 g/L 글루코오스 + 5mM 글루타민 + 1/100 비필수 아미노산)를 공급하여 수확일인 16일에 ~585 ml의 부피가 되게 하였다.

하기 파라메터를 DASGIP 생물반응기에서 조절하였다 (단위 1-8):

표 4. 일반적인 생물반응기 공정 파라메터

부피:	2일에 시작하여 14일까지 연속하여 공급된 250 ml
온도 세트 포인트:	36.8℃, 120시간에 32.0℃로 변화
압력 세트 포인트:	6.95
pH 조절:	살균 여과된 0.25M Na2CO3 이용됨
교반:	80 rpm.
pO2 세트 포인트:	30% (가스의 O2-함량을 통해 조절됨)
가스 흐름:	0.1 sl/h
CO2-수준:	pH를 유지하기 위해 DASGIP 시스템에 의해 조정됨

매일 5 ml의 샘플을 생존력, 성장할 수 있는 세포 수, IgG 생산 및 대사산물을 분석하기 위해 취하였다. 마찬가지로 생존력 및 성장할 수 있는 세포 수를 지닐 것으로 예상되는 모든 배양을 수행하였다. 추가로 앰플을 해동한 지 20일, 24일, 28일 및 30일 후에 각 생물반응기와 (단위 1-8) 시드 트레인으로부터 (9일 및 14일에) 이온 교환 크로마토그래피 분석에 의해 IgG 조성을 분석하기 위해 10 ml를 취하였다.

IgG 조성의 분석을 상기 실시예 2에 개시된 대로 수행하였다.

모든 믹스를 상기 개시된 대로 분석하였고 4개의 믹스 중 각 샘플에서 각 항체의 함량을 계산하였다. 배양액으로부터 IgG의 총 수율은 약 150 내지 250 mg/L이었다.

각 샘플의 항체 함량을 5에 그래프로 도시한다. 놀랍게도, 모든 항체가 모든 샘플에서 뚜렷하게 동정될 수 있었다. 조성물은 강건한 것으로 보이며 어떠한 클론도 14일 시드 트레인 배양 이후에 16일 생물반응기 실행 동안 소실되거나 인계 되지 않았다. 조성은 입력 클론에 따라 상이하다.

이것은 최종 생성물에서 개개 항체의 상대적인 분포를 결정하기 위해 혼합물에 특이적인 클론을 선택함에 의해서도 가능할 것으로 생각된다.

SEQUENCE LISTING <110> Symphogen A/S Nielsen, Lars S Weilguny, Dietmar Tolstrup, Anne B Wiberg, Finn M?ler, Christian <120> Method for manufacturing a recombinant polyclonal protein <130> P108PC00 <140> PCT/DK2008/050116 <141> 2008-05-21 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 870 <212> DNA <213> Human adenovirus type 5 <400> 1 atgagacata ttatctgcca cggaggtgtt attaccgaag aaatggccgc cagtcttttg 60 gaccagctga tcgaagaggt actggctgat aatcttccac ctcctagcca ttttgaacca 120 cctacccttc acgaactgta tgatttagac gtgacggccc ccgaagatcc caacgaggag 180 gcggtttcgc agatttttcc cgactctgta atgttggcgg tgcaggaagg gattgactta 240 ctcacttttc cgccggcgcc cggttctccg gagccgcctc acctttcccg gcagcccgag 300 cagccggagc agagagcctt gggtccggtt tctatgccaa accttgtacc ggaggtgatc 360 gatcttacct gccacgaggc tggctttcca cccagtgacg acgaggatga agagggtgag 420 gagtttgtgt tagattatgt ggagcacccc gggcacggtt gcaggtcttg tcattatcac 480 cggaggaata cgggggaccc agatattatg tgttcgcttt gctatatgag gacctgtggc 540 atgtttgtct acagtcctgt gtctgaacct gagcctgagc ccgagccaga accggagcct 600 gcaagaccta cccgccgtcc taaaatggcg cctgctatcc tgagacgccc gacatcacct 660 gtgtctagag aatgcaatag tagtacggat agctgtgact ccggtccttc taacacacct 720 cctgagatac acccggtggt cccgctgtgc cccattaaac cagttgccgt gagagttggt 780 gggcgtcgcc aggctgtgga atgtatcgag gacttgctta acgagcctgg gcaacctttg 840 gacttgagct gtaaacgccc caggccataa 870 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tgactccggt ccttctaaca ca 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 tcacggcaac tggtttaatg g 21

Claims (60)

1. 2 내지 n개의 별개의 구성원을 포함하는 재조합 폴리클로날 단백질을 발현시킬 수 있는 폴리클로날 세포주를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은

   a) 한 세트의 발현 벡터를 제공하는 단계로서, 상기 벡터 각각이 상기 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 엔코딩하는 별개의 핵산의 하나 이상의 복사체를 포함하는 단계;

   b) 상기 발현 벡터의 세포의 게놈으로의 부위-특이적 통합(integration)의 부재하에, 상기 발현 벡터 각각으로 숙주 세포를 따로따로 트랜스펙션시켜 2 내지 n개의 세포 조성물을 수득하는 단계로서, 각 조성물은 폴리클로날 단백질의 하나의 별개의 구성원을 발현시키는 단계; 및

   c) 상기 2 내지 n개의 세포 조성물을 혼합시켜 폴리클로날 세포주를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
2. 제 1항에 있어서, 발현 벡터가 숙주 세포의 하나 이상의 염색체로 안정하고 무작위적으로 통합되는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 단계 b)에서 수득된 트랜스펙션된 세포가 클로닝되는 방법.
4. 제 3항에 있어서, 클론이 성장 속도, 배가 시간, 발현 수준, 생산 수준, 시간에 따른 생산 안정성, 생존력, 내구력, 강건성, 형태학, 및 복사체 수로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 표준에 대해 선택되는 방법.
5. 제 1항에 있어서, 발현 벡터가 별개의 폴리클로날 단백질의 코딩 서열을 제외하고는 동일한 방법.
6. 제 1항에 있어서, 숙주 세포가 트랜스펙션 이전에 하나의 클론으로부터 유래되는 방법.
7. 제 1항에 있어서, 폴리클로날 단백질이 다합체 단백질이고, 하나의 발현 벡터가 하나의 별개의 폴리클로날 단백질 구성원의 모든 서브유닛을 엔코딩하거나, 상기 단계 a)의 발현 벡터의 세트가 발현 벡터의 둘 이상의 서브셋으로 구성되고, 여기서 제1 서브셋은 단백질의 하나의 서브유닛을 엔코딩하는 변이성(variant) 핵산 서열을 포함하고, 제2 서브셋은 단백질의 또 다른 서브유닛을 엔코딩하는 변이성 핵산 서열을 포함함으로써, 각 트랜스펙션이 발현 벡터의 제1 서브셋의 구성원 및 제2 서브셋의 구성원으로 수행되는 방법.
8. 제 1항에 있어서, 폴리클로날 단백질이 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 단편인 방법.
9. 제 1항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포인 방법.
10. a) 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 수득된 폴리클로날 세포주를 제공하는 단계;

    b) 폴리클로날 단백질을 발현시킬 수 있는 조건하에 상기 폴리클로날 세포주를 배양하는 단계; 및

    c) 세포 또는 배지로부터 상기 폴리클로날 단백질을 회수하는 단계를 포함하여, 폴리클로날 단백질을 제조하는 방법.
11. 2 내지 n개의 세포 군집을 포함하는 폴리클로날 세포주로서, 각 군집은 재조합 폴리클로날 단백질의 별개의 구성원을 발현시키고, 상기 재조합 폴리클로날 단백질은 상이하나 상동인 단백질 분자들을 포함하며, 상기 별개의 구성원을 발현시키는 발현 구성물의 통합 부위가 폴리클로날 세포주의 구성원들 사이에서 변화되도록 하는 폴리클로날 세포주.
12. 제 11항에 있어서, 하나 이상의 발현 구성물이 하나 이상의 염색체로 통합되는 폴리클로날 세포주.
13. 제 11항에 있어서, n이 3 또는 3 초과이고, n이 30 미만인 폴리클로날 세포주.
14. 제 11항에 있어서, 폴리클로날 단백질이 다합체 단백질인 폴리클로날 세포주.
15. 제 11항에 있어서, 숙주 세포가 진핵생물 세포인 폴리클로날 세포주.
16. 제 3항에 있어서, 트랜스펙션된 세포가 FACS 클로닝을 이용하여 클로닝되는 방법.
17. 제 9항에 있어서, 진핵생물 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포, NIH 3T3 세포, 섬유 모세포, HeLa 세포, HEK293 세포 및 PER.C6 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 포유동물 세포인 방법.
18. 제 10항에 있어서, 단계 c)가 세포 또는 배지로부터 폴리클로날 단백질을 정제시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
19. 제 11항에 있어서, 폴리클로날 단백질이 폴리클로날 항체 또는 폴리클로날 항체 단편인 폴리클로날 세포주.
20. 제 15항에 있어서, 진핵생물 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, BHK 세포, 골수종 세포, NIH 3T3 세포, 섬유 모세포, HeLa 세포, HEK293 세포 및 PER.C6 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 포유동물 세포인 폴리클로날 세포주.
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