ES2350385T3

ES2350385T3 - Procedimiento de fabricación de una proteína policlonal recombinante.

Info

Publication number: ES2350385T3
Application number: ES08748815T
Authority: ES
Inventors: Lars Soegaard Nielsen; Christian Muller; Anne Bondgaard Tolstrup; Finn Wiberg; Dietmar Weilguny
Original assignee: Symphogen AS
Current assignee: Symphogen AS
Priority date: 2007-05-25
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2011-01-21
Anticipated expiration: 2028-05-21
Also published as: RU2009148332A

Abstract

Un procedimiento para la generación de una línea celular policlonal capaz de expresar una proteína policlonal que comprende de 2 a n miembros distintos, dicho procedimiento comprende: a) Proporcionar un grupo de vectores de expresión, en donde cada uno de los vectores comprende al menos una copia de un ácido nucleico distinto que codifica un miembro distinto de la proteína policlonal; b) Transfeccionar por sepatado las células huésped con cada uno de los vectores de expresión bajo condiciones que eviten la integración específica del sitio de los vectores de expresión dentro del genoma de las células, obteniendo con esto 2 a n composiciones de células, cada composición expresa un miembro distinto de la proteína policlonal; c) Mezclar las 2 a n composiciones de las células para obtener una línea celular policlonal.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la producción de proteínas policlonales recombinantes, tales como proteínas provenientes de la superfamilia de las inmunoglobulinas, por ejemplo, formas solubles o unidas a membrana de los receptores de células B o T, usando sistemas de producción que son independientes de la integración específica del sitio.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Para numerosas enfermedades, tales como enfermedades infecciosas y tipos de cáncer, se carece de terapias eficientes. En general, los anticuerpos monoclonales no han tenido éxito contra todos estos objetivos, en parte debido a la variabilidad de los objetivos complejos y a las mutaciones adaptativas de las proteínas diana que provocan escape inmunitario del reconocimiento del anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos policlonales, por otra parte, pueden dirigirse a una pluralidad de objetivos dinámicos, por ejemplo, virus, bacterias o células cancerosas. Asimismo, los anticuerpos policlonales tienen la probabilidad más elevada de conservar la actividad en el caso de mutación antigénica.

Existen diferentes terapéuticas con anticuerpos policlonales comercialmente disponibles, que incluyen: 1) lnmunoglobulina humana normal aislada de sangre de donantes humanos normales; 2) inmunoglobulina hiperinmune humana derivada de sangre de donantes humanos individuales portadores de anticuerpos contra una enfermedad objetivo concreta, por ejemplo, un virus, que habían encontrado previamente ya sea a través de infección o de vacunación; y 3) inmunoglobulina hiperinmune animal derivada de sangre de animales inmunizados.

Se ha demostrado que la inmunoglobulina purificada a partir de sangre humana es efectiva contra infecciones por el virus de la hepatitis B, el virus sincitial respiratorio, el citomegalovirus y otros virus de herpes, el virus de la rabia, la toxina botulínica, etc., así como en la profilaxis de rhesus D neonatal. La inmunoglobulina purificada a partir de sangre de conejo inmunizada con células T humanas se usa para proporcionar inmunosupresión de las células T en el tratamiento o prevención del rechazo de trasplantes (por ejemplo, timoglobulina). La inmunoglobulina humana normal se ha usado para reforzar el sistema inmunitario de pacientes inmunodeficientes, así como la terapia de diversos trastornos autoinmunitarios.

Sin embargo, el uso muy difundido de inmunoglobulinas ha estado limitado debido a la restricción del suministro de materia prima de sangre de donaantes, problemas con las variaciones entre lotes y la seguridad variable. En particular, con las inmunoglobulinas derivadas de animales existen os mismos problemas de inmunogenicidad que los observados para los anticuerpos monoclonales derivados de animales en las décadas de 1980 y 1990. Finalmente, como con otros productos hemoderivados, sigue existiendo el riesgo de transmisión de agentes infecciosos tales como el VIH, virus de herpes o de hepatitis, o priones. En consecuencia, aunque los clínicos reconocen que los anticuerpos policlonales son una terapéutica preferida en algunas situaciones, su uso ha estado muy limitado.

Con las técnicas de animales transgénicos han surgido nuevos enfoques para generar inmunoglobulinas humanas. Se han creado ratones transgénicos que poseen loci de inmunoglobulinas humanas (patente de EE.UU. No. 6.111.166). Estos ratones producen inmunoglobulinas completamente humanas y pueden producirse anticuerpos contra un objetivo específico mediante las técnicas de inmunización usuales. Sin embargo, la obtención de mayores rendimientos de anticuerpos está limitada debido al tamaño relativamente pequeño de los ratones. También se han producido animales transgénicos más grandes para los genes de las inmunoglobulinas humanas, por ejemplo vacas (Kurolwa, Y. y col. Nature Biotechnology; 2002; 20:889-893). Sin embargo, la producción de anticuerpos policlonales para terapia a partir de la sangre de tales animales no está exenta de complicaciones. En primer lugar, la inmunofisiología del animal y de los seres humanos puede mostrar diferencias considerables, lo que provoca diferencias en el repertorio inmunitario resultante, la reordenación funcional y la diversidad de la respuesta de anticuerpos. En segundo lugar, la inestabilidad mitótica de los loci de inmunoglobulina introducidos pueden influir sobre la producción de anticuerpos a largo plazo. En tercer lugar, es técnicamente un reto suprimir los loci de inmunoglobulina propios del animal, de modo que, por ejemplo, la producción de anticuerpos del animal no exceda la producción de anticuerpos humanos. En cuarto lugar, el riesgo de transmisión de agentes infecciosos, tales como virus, priones u otros patógenos, acompaña la administración de los anticuerpos humanos producidos en animales.

Recientemente se ha desarrollado un nuevo tipo de anticuerpos policlonales que es independientemente de la disponibilidad del donanate en el momento de la producción. Estos anticuerpos policlonales se generan mediante el aislamiento de secuencias de ácido nucleico que codifican el anticuerpo provenientes de donanates con una respuesta inmunitaria contra el objetivo deseado, seguido por la selección para los anticuerpos que se unen específicamente al objetivo deseado. El anticuerpo policlonal puede fabricarse mediante una tecnología adaptada de expresión en mamíferos, que se basada en la integración específica de sitio de un plásmido de expresión del anticuerpo dentro del mismo sitio genómico de cada célula, como se describe en el documento WO 2004/061104. Un ejemplo de este nuevo tipo de anticuerpos policlonales es un anticuerpo policlonal recombinante contra Rhesus D (WO 2006/007850). El uso de la integración específica de sitio da como resultado una población celular en la que cada célula contiene una única copia y en la que se espera que los niveles de expresión y las tasas de crecimiento sean relativamente uniformes.

El documento 2004/029284 da a conocer un sistema de expresión celular específico de sitio capaz de intercambiar al menos un gen diana, en el que el sistema comprende un primer casete de integración, un primer casete diana y al menos un elemento rec que codifica al menos una actividad recombinasa que reconoce los sitios de reconocimiento de la recombinasa de los casetes.

El documento 2006/007853 da a conocer procedimientos para la caracterización estructural de un anticuerpo policlonal recombinante u otra proteína policlonal recombinante o una línea celular policlonal productora de dicha proteína, con el fin de verificar la consistencia entre lotes de los productos finales, así como la estabilidad de la composición durante los ciclos de producción sencillos.

Wiberg y col. (Biotechn. Bioeng. (2006) 94(2): 396-405) describen la expresión y producción de un anticuerpo policlonal recombinante anti-rhesus D que comprende 25 anticuerpos de IgG1 humana basadas en la integración específica de sitio de genes de anticuerpos en células CHO.

Huang Y COL. (J. Immunol. Methods (Abril 2007) 322 (1-2): 28-39) describen un sistema de integración de genes en vectores celulares dirigidos para la expresión de niveles elevados de anticuerpos usando una estrategia FRT/FLP para superar los efectos de posición.

Haurum y col. (IDrugs (2005) 8(5); 404-9) revisan el desarrollo de terapéuticas con anticuerpos de inmunoglobulinas humanas de primera generación a anticuerpos monoclones recombinantes de segunda generación a anticuerpos policlonales recombinantes.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos alternativos para la producción de una proteína policlonal recombinante, que son independientes de la integración específica de sitio y, por lo tanto, proporcionan mayor flexibilidad con respecto a la elección de la línea celular de producción, al tiempo que mantienen la policlonalidad de la proteína. Además, los niveles de expresión pueden ser más altos que los que son posibles con la integración específica de sitio.

El enfoque de la presente invención está basado en la integración aleatoria de los genes individuales de interés dentro de las células huésped, seguida, preferentemente, por la clonación de células simples con las características deseadas. Los clones celulares individuales, cada uno de los cuales produce un miembro individual de la proteína policlonal, se mezclan después con el fin de generar una línea celular de fabricación policlonal para la

producción de una proteína policlonal.

Los anticuerpos policlonales son, en general, las proteínas policlonales mejor conocidas. Lo mismo sucede para los receptores de las células T (TcR), que, cuando se producen en un sistema de expresión recombinante, se pueden obtener en una forma soluble que puede tener el potencial del tratamiento como los anticuerpos policlonales. No obstante, con los sistemas de expresión recombinantes de la presente invención es posible también combinar proteínas que no son necesariamente homólogas, por ejemplo diferentes proteínas con relevancia conocida en una deficiencia o trastorno particular. La presente invención se ejemplificará mediante anticuerpos policlonales, pero se pretende que cubran TcR policlonales y otras proteínas policlonales que se puede desear fabricar conjuntamente. Tales proteínas pueden ser también proteínas de fusión, si se desea.

La presente invención permite la producción comercial de una proteína policlonal recombinante en un recipiente, por ejemplo para el uso en composiciones farmacéuticas. Una característica importante de la invención es que durante el procedimiento de fabricación, la expresión desviada de las moléculas individuales que constituyen la proteína policlonal se mantiene a niveles bajos, lo que reduce al mínimo la variación entre lotes no deseada y evita la eliminación de miembros del anticuerpo policlonal durante la fabricación.

En un aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para la generación de una línea celular policlonal capaz de expresar una proteína policlonal que comprende de 2 a n miembros distintos, en el que dicho procedimiento comprende:

a) Proporcionar un grupo de vectores de expresión, en el que cada uno de dichos vectores comprende al menos una copia de un ácido nucleico distinto que codifica un miembro distinto de dicha proteína policlonal;

b) Transfeccionar por separado las células huésped con cada uno de dichos vectores de expresión en condiciones que eviten la integración específica de sitio de los vectores de expresión dentro del genoma de las células, de modo que se obtienen de 2 a n composiciones de células, en la que cada composición expresa un miembro distinto de la proteína policlonal;

c) Mezclar dichas 2 a n composiciones de las células para obtener una línea celular policlonal.

En realizaciones preferidas, la línea celular de policlonal se usa como línea celular de fabricación policlonal y se congela y almacena y, posteriormente, usa como Banco de Células Maestras policlonales (pMCB), a partir del cual las muestras (por ejemplo, ampollas) pueden descongelarse y usarse directamente para la fabricación de la proteína policlonal recombinante

o la generación de un Banco de Células de Trabajo policlonales (pWCB).

En una realización, los vectores de expresión son vectores episomales. En otra modalidad preferida, los vectores de expresión se integran de manera estable y aleatoria dentro del genoma de las células huésped. Los vectores de expresión pueden integrarse de forma estable en posiciones aleatorias en uno o más cromosomas de una célula huésped.

Preferentemente, las células transfeccionadas obtenidas en la etapa b) se clonan. En una modalidad, la clonación se realiza usando clonación por FACS como se describe en el presente documento.

Los clones pueden ser seleccionados para al menos un criterio seleccionado del grupo constituido por: la velocidad de crecimiento, el tiempo de duplicación, el nivel de expresión, el nivel de producción, la estabilidad de producción en el tiempo, la viabilidad, la resistencia, la solidez, la morfología y el número de copias. Preferentemente, los clones se seleccionan según la uniformidad con respecto a al menos un criterio. Más preferentemente, los clones se seleccionan según la uniformidad con respecto al tiempo de duplicación y al nivel de expresión.

Se puede seleccionar un clon, o más de un clon, para cada miembro distinto de las proteínas policlonales. De este modo, se pueden seleccionar 2 clones para cada miembro distinto de las proteínas policlonales o pueden seleccionarse 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, ó 100 clones.

Las composiciones de las células que expresan diferentes miembros distintos pueden mezclarse en una proporción 1:1 o en una proporción diferente a una proporción 1:1. Preferentemente, los vectores de expresión son idénticos, excepto por las variaciones en la secuencia de codificación de la proteína policlonal. El procedimiento puede aplicarsedo a proteínas policlonales monoméricas y multiméricas.

En el caso de las proteínas multiméricas, un vector de expresión puede codificar todas las subunidades de un miembro de proteína policlonal distinta. Como alternativa, el grupo de vectores de expresión en la etapa a) está constituido por dos o más subgrupos de vectores de expresión, donde un primer subgrupo comprende secuencias de ácido nucleico variantes que codifican una subunidad de la proteína, y un segundo subgrupo comprende las secuencias variantes de ácido nucleico que codifican otra subunidad de la proteína, tal que cada transfección se realiza con un miembro proveniente del primer subgrupo y un miembro para el segundo subgrupo de vectores de expresión. Esta transfección puede ser simultánea o secuencial. Específicamente, el grupo de vectores de expresión en la etapa a) puede estar constituido por dos subgrupos de vectores de expresión, donde el primer subgrupo comprende secuencias de ácido nucleico variantes que codifica una cadena pesada de anticuerpo y el segundo subgrupo comprende secuencias de ácido nucleico variante que codifican una cadena ligera de anticuerpo, tal que cada transfección se realiza con un miembro proveniente del primer subgrupo y un miembro para el segundo subgrupo de vectores de expresión.

El vector de expresión o un vector de expresión adicional codifica, preferentemente, un marcador seleccionable. Además, las células se cultivan de forma continua en condiciones que favorecen el crecimiento de las células que expresan el marcador seleccionable. Esto se asegura de una mejor manera mediante el uso de un marcador seleccionable que comprende un producto génico, en el que la célula huésped es deficiente. El marcador seleccionable en una modalidad está codificado en un tránscrito que también codifica un miembro polipeptídico o una subunidad de dicho miembro polipeptídico, preferentemente en donde el marcador seleccionable está codificado por el tránscrito que codifica la subunidad más grande.

Un aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento para la fabricación de una proteína policlonal, en donde la proteína policlonal comprende 2-n miembros distintos, en el que dicho procedimiento comprende:

a) proporcionar una línea celular policlonal obtenida utilizando el procedimiento de la invención;

b) cultivar la línea celular policlonal en condiciones que permiten la expresión de la proteína policlonal;

c) recuperar y opcionalmente purificar la proteína policlonal a partir de las células o del medio; y opcionalmente

d) verificar la presencia de cada uno de los distintos miembros en la proteína polilonal recuperada y opcionalmente purificada.

Los presentes inventores han determinado que, sorprendentemente, la distribución de los clones individuales se mantiene durante una simulación de un ciclo de producción, que es representativo de las condiciones para la fabricación industrial de un producto farmacológico recombinante. Esto es muy sorprendente, ya que los vectores de expresión para los miembros individuales del anticuerpo policlonal se integran en diferentes posiciones y debido a que el número de copias difiere. Esto podría conducir a diferencias en el nivel de expresión y en la velocidad de crecimiento.

Al contrario de las expectativas, la fabricación no dio como resultado la pérdida parcial o completa de uno o más miembros del anticuerpo policlonal. Incluso con diferencias pequeñas en la velocidad de crecimiento entre diferentes líneas celulares, se espera que una composición policlonal con el tiempo de como resultado la pérdida parcial o completa de al menos un miembro de la composición policlonal. De este modo, en modalidades de la invención, la estabilidad de la composición se mantiene durante más de 10 divisiones celulares después del descongelación del Banco de Células de Trabajo, preferentemente más de 15 divisiones celulares, tal como más de 20 divisiones celulares, por ejemplo más de 25 divisiones celulares, tal como más de 30 divisiones celulares, por ejemplo más de 40 divisiones celulares, tal como más de 50 divisiones celulares, por ejemplo más de 75 divisiones celulares, tal como más de 100 divisiones celulares.

Los ejemplos adjuntos muestran que la estabilidad de la composición se mantiene dentro de los límites aceptables durante más de 25 divisiones celulares.

Aunque en la gran mayoría de los casos se prefiere la transfección separada, la combinación de los vectores de expresión antes de la transfección es posible en ciertas condiciones. Si la proteína policlonal es un monómero, ésto es, de hecho, una opción, ya que no es un problema que una célula exprese varios miembros diferentes de la proteína policlonal. Si la proteína policlonal es un multímero, la combinación de los vectores de expresión antes de la transfección es solo posible si se usan los medios para asegurar que únicamente se inserta una copia dentro de cada célula. De otro modo, se puede producir el entremezclado no deseado de las subunidades.

Aunque la combinación de los vectores de expresión es una posibilidad clara, ésta es menos preferible que la transfección por separado ya que se espera que de cómo resultado un sistema de fabricación menos sólido con respecto al mantenimiento de la estabilidad de la composición.

En ambos procedimientos de la invención, se entenderá que la proteína policlonal normalmente es una que no está asociada de manera natural con las células en las que se efectúa la expresión.

La presente invención describe diversos procedimientos mediante los cuales una biblioteca de secuencias variantes de ácido nucleico se puede introducir dentro de una línea celular huésped, con el fin de generar una colección de células adecuadas como línea celular de fabricación policlonal. Estos procedimientos incluyen la transfección a granel de una colección de células con la biblioteca, la transfección a semi-granel de alícuotas de células con fracciones de la biblioteca o, preferentemente, la transfección individual, en donde las células huésped son transfeccionadas con miembros individuales de la biblioteca, seguido por la combinación de los clones generados después de la selección. Preferentemente, la presente invención utiliza células de mamífero (líneas celulares o tipos celulares) como línea celular huésped.

En un aspecto de la invención, los miembros individuales de una proteína policlonal están codificados en pares de segmentos génicos independientes. Las proteínas policlonales, en las que los miembros individuales están compuestos por dos o más cadenas polipeptídicas, incluyen formas solubles o unidas a la membrana de anticuerpos y de receptores de células T.

En realizaciones adicionales de la presente invención, un par de segmentos génicos codifica la región variable de la cadena pesada y de la cadena ligera de anticuerpo, o una cadena alfa del receptor de células T y la región variable de la cadena beta o la región variable de la cadena gamma y la cadena delta del receptor de células T.

La presente invención proporciona además una línea celular policlonal que comprende de 2 a n poblaciones de células, de las que cada población expresa un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante, donde la proteína policlonal recombinante comprende moléculas proteicas diferentes pero homólogas, donde las células comprenden al menos un constructo de expresión aleatoriamente integrada dentro del genoma de modo que los sitios de integración varían entre miembros de la línea celular policlonal. En una modalidad, el al menos un constructo de expresión se integra de forma aleatoira dentro de un elemento extracromosómico. En otra modalidad, el al menos constructo de expresión se integra en posiciones aleatorias en uno o más cromosomas de una célula huésped.

La línea celular se origina, preferentemente, de una línea celular de mamífero tal como lcélulas de ovario de hámster Chino (CHO, por sus siglas en inglés), células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NS0, YB2/0), NIH 3T3, fibroblastos o células humanas inmortalizadas tales como células HeLa, células HEK 293 o PER.C6. Sin embargo,también pueden usarse células procarióticas o eucarióticas que no son de mamífero, tales como las células vegetales, células de insecto, células de levadura, bacterias, hongos, etc.

También se da a conocer en el presente documento una célula CHO negativa a DHFR que comprende un ácido nucleico establemente integrado, que codifica un transactivador E1A del adenovirus tipo 5 operablemente unido a un promotor constitutivo.

Tal línea celular CHO modificada se construyó para los experimentos descritos en el presente documento. Se ha constatado que la línea celular es excepcionalmente estable con respecto a la uniformidad de las tasas de crecimiento y los niveles de expresión y la estabilidad en el tiempo como se muestra en los ejemplos incorporados en el presente documento, y está, por lo tanto, especialmente adaptada para el uso en los procedimientos de la invención. Experimentos posteriores mostraron que el ARNm de E1A no se podía detectar en la célula dos veces subclonada. Esto significa que los resultados que muestran una estabilidad de la composición notable no pueden atribuirse únicamente a la expresión de E1A. No obstante, cabe esperar que una línea celular CHO negativa a DHFR que exprese establemente E1A de como resultado una línea celular muy estable y de alta expresión.

En una realización preferida, la línea celular deriva de una línea celular DG44, que es una homocigota defectiva en el gen de DHFR. Esta línea celular sólo puede sobrevivir en medio deficiente en timidina si las células comprenden un constructo de expresión de DHFR recombinante.

En realizaciones preferidas, la línea celular de la invención comprende además al menos una copia de un constructo de expresión establemente integrado, que codifica un polipéptido de interés. El polipéptido de interés puede ser una proteína multimérica, preferentemente la proteína multimérica es un anticuerpo.

Con el fin de permitir la selección del medio deficiente en timidina, el constructo de expresión que codifica el polipéptido de interés codifica además dhfr.

Preferentemente, dhfr y al menos una subunidad del polipéptido de interés está codificada en el mismo tránscripto, más preferentemente dhfr está codificada en el tránscrito que codifica la subunidad más grande. Esto conduce a una unión fuerte entre el producto deseado, el polipéptido de interés y el marcador de selección, dhfr, y asegura que las células supervivientes expresen el polipéptido de interés.

Para aumentar adicionalmente la expresión del polipéptido de interés, la expresión del polipéptido de interés puede controlarse mediante uno o más promotores transactivables por el activador transcripcional E1A, preferentemente en donde el promotor es un promotor de CMV o derivado de un promotor del CMV.

Definiciones

Por "proteína" o "polipéptido" se entiende cualquier cadena de aminoácidos, con independencia de la longitud o la modificación postraduccional. Las proteínas pueden existir como monómeros o multímeros, comprenden dos o más cadenas polipeptídicas ensambladas, fragmentos de proteínas, polipéptidos, oligopéptidos, o péptidos.

Como se utiliza en el presente documento, el término "proteína policlonal" o "policlonalidad" se refiere a una composición de proteína que comprende moléculas de proteína diferentes, pero homólogas, preferentemente seleccionadas de la superfamilia de las inmunoglobulinas. De este modo, cada molécula de proteína es homóloga a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia polipeptídica variable, que está caracterizada por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal. Ejemplos conocidos de tales proteínas policlonales incluyen las moléculas de anticuerpo o de inmunoglobulina o derivados de las mismas (tales como Fab Fab2; Fvs de cadena simple, etc.), receptores de células T y receptores de células B. Una proteína policlonal puede consistir en un subgrupo definido de moléculas de proteína, que se definiden mediante una característica común tal como la actividad de unión compartida hacia un objetivo deseado, por ejemplo, en el caso de un

anticuerpo policlonal, contra el antígeno objetivo deseado.

La expresión "proteína policlonal de interés" cubre un subgrupo definido de proteínas policlonales, que comparte una característica común tal como la afinidad de unión hacia un objetivo deseado, por ejemplo, en el caso de los anticuerpos policlonales descritos por la actividad de unión o especificidad contra el antígeno objetivo, siendo dicho antígeno es uno o más de, por ejemplo, proteínas distintas, microorganismos, parásitos, tipos celulares, alergenos, o moléculas de carbohidratos, o cualesquiera otras estructuras, moléculas, o sustancias, que pueden ser el objetivo de para la unión específico del anticuerpo, o mezclas de dichos antígenos.

Las expresiones "un miembro de una composición de proteína policlonal recombinante"

o "un miembro de una proteína policlonal recombinante" denotan una molécula de proteína de una composición de proteína que comprende moléculas de proteína diferentes pero homólogas, donde cada molécula de proteína es homóloga a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia polipeptídica variable, que se caracteriza(n) por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal.

Las expresiones "secuencia polipeptídica variable" y "región variable" se utilizan de forma intercambiable.

Las expresiones "un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante" denota una molécula de proteína de una composición de proteína que comprende moléculas de proteína diferentes, pero homólogas, donde cada molécula de proteína es homóloga a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia polipeptídica variable, que están caracterizados por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal.

El término "anticuerpo" describe un componente funcional de suero y a menudo se denomina colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulina) o una molécula (la molécula de anticuerpo o la molécula de inmunoglobulina). Una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a o reaccionar con un determinante antigénico específico (el antígeno o el epítopo antigénico) que a su vez puede conducir a la inducción de mecanismos efectores inmunitarios. Una molécula de anticuerpo individual normalmente se considera monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo puede ser monoclonal (es decir, constituida por moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonales (es decir, constituida por diferentes moléculas de anticuerpos que reaccionan con el mismo o diferentes epítopos sobre el mismo antígeno o incluso sobre antígenos diferentes y distintos). Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura única que hace posible que se una específicamente a su antígeno correspondiente, y todas las moléculas de anticuerpos naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas, y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos son también conocidos colectivamente como inmunoglobulinas. Los términos anticuerpo o anticuerpos, como se utilizan en el presente documento, están también destinados a incluir anticuerpos quiméricos y de cadena simple, así como fragmentos de unión de los anticuerpos, tales como los fragmentos Fab, Fv o fragmentos scFv, así como las formas multiméricas tales como las moléculas de IgA diméricas e IgM pentavalentes.

La expresión "anticuerpo policlonal" describe una composición de diferentes moléculas de anticuerpo, que es capaz de unirse a o reaccionar con varios determinantes antigénicos específicos diferentes sobre el mismo o sobre diferentes antígenos. Usualmente, se piensa que la variabilidad de un anticuerpo policlonal está localizada en las denominadas regiones variables del anticuerpo policlonal. Sin embargo, en el contexto de la presente invención, puede también entenderse que la policlonalidad describe diferencias entre las moléculas de anticuerpo individuales que residen en las denominadas regiones constantes, por ejemplo, como en el caso de las mezclas de anticuerpos que contienen dos o más isotipos de anticuerpo tales como los isotipos humanos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, e IgE, o los isotipos murinos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 e IgA.

Un "anticuerpo policlonal recombinante de interés" describe un subgrupo definido de anticuerpos policlonales recombinantes que están caracterizados por la habilidad para unirse a un objetivo deseado o a un grupo de objetivos deseado, siendo dichos objetivos, por ejemplo, una proteína distinta, un microorganismo, un parásito, una célula, un alergeno o una molécula de carbohidrato, u otra estructura, molécula o sustancia que puede ser el objetivo de la unión específica del anticuerpo o mezclas de los mismos.

Normalmente, el término "inmunoglobulina" se usa como una designación colectiva de la mezcla de anticuerpos encontrados en la sangre o en el suero, pero también se puede usarpara designar una mezcla de anticuerpos derivados de otras fuentes.

La expresión "molécula de inmunoglobulina" denota una molécula de anticuerpo individual, por ejemplo, como una parte de la inmunoglobulina, o parte de cualquier composición de anticuerpo policlonal o monoclonal.

Cuando se establece que un miembro de una proteína policlonal se une a un antígeno, se entiende en el presente documento una unión que tiene una constante de unión que está por debajo de 1 mM, preferentemente por debajo de 100 nM, aún más preferentemente por debajo de 10 nM.

La expresión "una biblioteca de moléculas de ácido nucleico variantes de interés" se usa para describir la colección de moléculas de ácido nucleico, que colectivamente codifican una "proteína policlonal recombinante de interés". Cuando se usa para transfección, la biblioteca de moléculas de ácido nucleico variantes de interés está contenida en una biblioteca de vectores de expresión. Tal biblioteca tiene típicamente al menos 2, 3, 4, 5, 6, 10, 20, 50, 1000, 104, 105 ó 106 miembros distintos.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "secuencia de ácido nucleico distinta" se debe entender como una secuencia de ácido nucleico que puede codificar diferentes cadenas polipeptídicas que conjuntamente constituyen la proteína de interés. Cuando la secuencia de ácido nucleico distinta está compuesta por más de una secuencia de codificación, estas secuencias pueden estar en la forma de una unidad de transcripción dicistrónica o pueden funcionar como dos unidades transcripcionales separadas si estám operablemente unidas a los promotores adecuados. De igual modo, el uso de unidades de transcripción tri-y tetracistrónicas es concebible si la proteína de interés consta de 3 ó 4 subunidades, o si un marcador de selección está incluido dentro de una unidad transcripcional junto con un ácido nucleico que codifica una proteína de interés o una subunidad de la misma. Preferentemente, una secuencia de ácido nucleico distinta de la presente invención es parte de una molécula de ácido nucleico tal como, por ejemplo, un vector. Algunos ejemplos, en los que se requiere más de una secuencia de codificación para dar origen a una molécula completa de una proteína de interés, incluye receptores de células B, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos tales como Fab's y dominios variables, o receptores de células T. Cuando se introducen dentro de la célula, los genes, los cuales conjuntamente codifican la proteína de interés completamente ensamblada, residen en el mismo vector, estando de este modo unidos en una secuencia de ácido nucleico.

La expresión "un gen de interés" como se utiliza en el presente documento, se refiere a una secuencia de ácido nucleico compuesta por uno o más segmentos génicos (genómico o ADNc) que codifican un miembro de una proteína de interés. La forma plural "genes de interés" se refiere a una biblioteca de secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína policlonal de interés. El término "GOI" se usa como una abreviatura de (a) uno o varios genes de interés.

Como se usa en el presente documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico dentro de la cual se puede insertar una secuencia de ácido nucleico para el transporte entre ambientes genéticos diferentes y/o para la expresión en una célula huésped. Si el vector lleva los elementos reguladores para la transcripción de la secuencia de ácido nucleico insertada en el vector (al menos un promotor adecuado), el vector se denomina en el presente documento "un vector de expresión". Si la secuencia de ácido nucleico insertada dentro de los vectores anteriormente identificados codifica una proteína de interés como se define en el presente documento, se usan los siguientes términos "vector de interés" y "vector de expresión de interés". La expresión "vector que codifica un isotipo" se refiere a un vector que posee las secuencias de ácido nucleico que codifica un isotipo de anticuerpo. En la presente especificación, "vector fagemido" y "vector fago" se utilizan de forma intercambiable. Los términos "plásmido" y "vector" se utilizan de forma intercambiable. La invención está destinada a incluir otras formas de vectores tales que sirven funciones equivalentes, por ejemplo genomas de plásmidos, fagemidos y virales o cualquiera molécula de ácido nucleico capaz de dirigir la producción de una proteína deseada en un huésped adecuado.

La expresión "cada miembro de la biblioteca de vectores de interés" se usa para describir moléculas de vector individuales con una secuencia de ácido nucleico distinta derivada de una biblioteca de vectores de interés, donde la secuencia de ácido nucleico codifica un miembro de laa proteína policlonal recombinante de interés.

La expresión "transferencia de masa" se utiliza para describir la transferencia de las secuencias de ácido nucleico de interés de una población de vectores a otra población de vectores y haciéndolo así para cada ADN simultáneamente sin recurrir al aislamiento del ADN individual de interés. Tales poblaciones de vectores pueden ser bibliotecas que contienen, por ejemplo, regiones variables, promotores, secuencias líder o elementos aumentadores de interés. Estas secuencias pueden ser transportadas sin aislamiento previo, por ejemplo desde un vector fago a un vector de expresión de mamífero. Especialmente para las secuencias de anticuerpos, esta técnica asegura que la unión entre la diversidad de VH y VL no se pierde durante el transporte de las bibliotecas desde, por ejemplo, un vector de selección (por ejemplo, un vector de expresión en fagos) a un vector de expresión de mamífero. De este modo se conserva el apareamiento original de VH y VL.

El término "transfección" se utiliza en el presente documento como un término amplio para introducir ADN extraño dentro de una célula.

Se entiende también que el término cubre otros procedimientos equivalentes funcionales para introducir ADN extraño dentro de una célula, tal como, por ejemplo, transformación, infección, transducción o fusión de una célula donante y una célula aceptora.

El término "selección" se utiliza para describir un procedimiento en el que las células han adquirido una cierta característica que hace posible el aislamiento desde las células que no han adquirido esas características. Tales características pueden ser la resistencia a un agente citotóxico o la producción de un nutriente esencial, enzima o color.

Las expresiones "gen marcador seleccionable", "gen marcador de selección", "gen de selección" y "gen marcador" se utilizan para describir un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo,, un gen que confiere resistencia contra algún fármaco citotóxico tales como ciertos antibióticos, un gen capaz de producir un nutriente esencial que puede haberse eliminado del medio de crecimiento, o un gen que codifica una enzima que produce metabolitos analizables, o un gen que codifica una proteína coloreada que puede clasificarse, por ejemplo, mediante FACS) que se co-introduce en las células junto con el o los genes de interés.

La expresión "proteína recombinante" se utiliza para describir una proteína que se expresa a partir de una línea celular transfeccionada con un vector de expresión que comprende la secuencia de codificación de la proteína.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "operablemente unido" se refiere a un segmento que se une a otro segmento cuando se coloca en una relación funcional con el otro segmento. Por ejemplo, el ADN que codifica una secuencia de señal está operablemente unido al ADN que codifica un polipéptido, si éste se expresa como líder que participa en la transferencia del polipéptido hacia el retículo endoplasmático. Asimismo, un promotor o aumentador está operablemente unido a una secuencia de codificación si éste estimula la transcripción de la secuencia.

La expresión "una mayoría de las células individuales" se refiere a un porcentaje de las células tales como más de 80%, preferentemente más de 85%, más preferentemente 90%, 95%, o incluso 99% o más.

Como se utiliza en el presente documento, el término "genoma" no debe tomarse literalmente como el complemento normal de los cromosomas presentes en una célula, sino también los elementos extra-cromosómicos que pueden introducirse dentro y mantenerse en una célula. Tales elementos extra-cromosómicos pueden incluir, entre otros, minicromosomas, YAC (cromosomas artificiales de levadura), MAC (cromosomas artificiales de ratón) o HAC (cromosomas artificiales humanos).

El término "promotor" se refiere a una región de ADN involucrada en la unión de la ARN polimerasa para iniciar la transcripción.

La expresión "promotores de cabeza a cabeza" se refiere a un par promotor que está colocado en estrecha proximidad de modo que la transcripción de los dos fragmentos génicos dirigida por los promotores se produce en direcciones opuestas. Un promotor cabeza a cabeza también puede construirse con un relleno compuesto de ácidos nucleicos irrelevantes entre los dos promotores. Tal fragmento de relleno puede contener fácilmente más de 500 nucleótidos.

Un "gen de resistencia a antibiótico" es un gen que codifica una proteína que puede superar el efecto inhibidor o tóxico que un antibiótico tiene sobre una célula, asegurando la supervivencia y la proliferación continua de las células en presencia del antibiótico.

La expresión "sitio interno de entrada al ribosoma" o "IRES" describe una estructura

diferente a la estructura del extremo 5' normal sobre un ARNm. Ambas estructuras pueden ser reconocidas por un ribosoma para iniciar la búsqueda de un codón AUG para iniciar la traducción. Mediante el uso de una secuencia promotora y dos AUG de iniciación, una primera y una segunda secuencias polipeptídicas pueden ser traducidas a partir de un ARNm simple. De este modo, para permitir la co-traducción de una primera y una segunda secuencias polinucleotídicas a partir de un ARNm bicistrónico simple, la primera y segunda secuencias polinucleotídicas pueden fusionarse transcripcionalmente a través una secuencia ligadora que incluye una secuencia IRES que hace posible la traducción de la secuencia polinucleotídica en dirección 3’ de la secuencia IRES. En este caso, una molécula de ARN bicistrónica transcrita se traducirá desde el extremo 5’ tapado y a partir de la secuencia IRES interna de la molécula de ARN bicistrónica para producir de este modo el primero y el segundo polipéptido.

La expresión "expresión inducible" se utiliza para describir la expresión que requiere la interacción de una molécula inductora o la liberación de una molécula co-represora y una proteína reguladora para que tenga lugar la expresión.

La expresión "expresión constitutiva" se refiere a la expresión que no es usualmente inducible.

El término "entremezclado" describe las situaciones en las que dos o más miembros distintos de una proteína policlonal, cada uno compuesto por dos o más cadenas polipeptídicas diferentes, por ejemplo, provenientes de la superfamilia de inmunoglobulinas, se expresan a partir de una célula individual. Esta situación puede surgir cuando la célula individual ha integrado, dentro del genoma, más de un par de segmentos génicos, donde cada par de segmentos génicos codifica un miembro distinto de la proteína policlonal. En tales situaciones pueden realizase combinaciones no pretendidas de las cadenas polipeptídicas expresadas a partir de los segmentos génicos. Estas combinaciones no pretendidas de cadenas polipeptídicas podrían no tener ningún efecto terapéutico.

La expresión "entremezclado de cadena VH-VL" es un ejemplo del entremezclado anteriormente definido. En este ejemplo, los segmentos génicos que codifican VH y VL constituyen un par de segmentos génicos. El entremezclado se produce cuando las combinaciones no pretendidas de los polipéptidos de VH y VL se producen a partir de una célula en la que dos diferentes pares de segmentos génicos que codifican VH y VL están integrados dentro de la misma célula. Tal molécula de anticuerpo entremezclada no es probable que conserve la especificidad original y, de este modo, puede no tener ningún efecto terapéutico ni incluso un efecto terapéutico no pretendido.

La expresión "línea celular de fabricación policlonal recombinante" se refiere a una población de células que expresan proteínas, que se transfeccionan con una biblioteca de secuencias de ácido nucleicos variantes de interés, tal que las células individuales, que conjuntamente constituyen la línea celular de fabricación policlonal recombinante llevan una o más copias de una secuencia de ácido nucleico distinta, de interés, que codifica un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés y que cada copia está integrada dentro del genoma de cada célula. Las células que constituyen la línea celular de fabricación policlonal recombinante se seleccionan por su habilidad para conservar la copia integrada de la secuencia de ácido nucleico distinta de interés, por ejemplo mediante selección con antibióticos. Las células que pueden constituir tal línea celular de fabricación pueden ser, por ejemplo, bacterias, hongos, células eucarióticas, tales como levaduras, células de insecto o células de mamífero, especialmente líneas celulares inmortales de mamífero, tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NS0, YB2/0), NIH 3T3 y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293

: o PER.C6.

El término "desviación" se utiliza para denotar el fenómeno durante la producción de proteína policlonal recombinante, en el que la composición de un vector policlonal, línea celular policlonal, o proteína policlonal se altera en el tiempo debido a las mutaciones genéticas aleatorias, las diferencias en la cinética de proliferación entre las células individuales, las diferencias en los niveles de expresión entre diferentes secuencias de constructo de expresión

: o las diferencias en la eficiencia de clonación de ADN.

El término "RFLP" se refiere al "polimorfismo de longitud de fragmento de restricción", un procedimiento mediante el cual el patrón migratorio en el gel de los fragmentos de la molécula de ácido nucleico se analiza después de la escisión con enzimas de restricción.

El término "5' UTR" se refiere a una región no traducida 5' del ARNm.

La expreseión "condiciones que evitan la integración específica de sitio" se refiere a un proceso de transfección que no incluye ninguna de las formas posibles de obtener la integración específica de sitio. La integración específica de sitio puede lograrse, por ejemplo, usando una combinación de una recombinasa y un sitio de reconocimiento para la recombinasa en un cromosoma de la célula huésped. La recombinasa puede también unirse covalentemente a un tramo de nucleótidos que reconoce un sitio particular en un cromosoma. También puede lograrse la integración específica de siti – aunque conuna eficiencia más baja – utilizando recombinación homóloga. Evitando la integración específica de sitio a menudo dará como resultado la integración en posiciones aleatorias a todo lo largo del genoma de la célula huésped, si se utilizan vectores de integración.

La expresión "integración aleatoria" se refiere a la integración de un vector de expresión dentro del genoma de una célula huésped en posiciones que son aleatorias. El significado de aleatorio en el diccionario es que existen las mismas probabilidades para cada elemento, en este caso, el sitio de integración. Cuando se transfeccionan células, todos los sitios de integración no representan probabilidades absolutamente iguales de integración, ya que algunas partes de los cromosomas son más propensas a los acontecimientos de integración que otras. Cuando no se realiza nada para guiar al vector de expresión hacia un sitio de integración particular, éste se integrará en posiciones que son aleatorias dentro del grupo de posibles sitios de integración. Por lo tanto, "integración aleatoria" en el contexto de la presente invención debe entenderse como un procedimiento de transfección donde no se realiza nada para guiar al constructo de expresión hacia una posición predeterminada. La ausencia de medios para guiar el vector de expresión hacia una posición predeterminada es suficiente para asegurar la "integración aleatoria". Con esto, el o los sitios de integración variarán de una célula a otra en una población transfeccionada, y el o los sitios de integración exactos pueden considerarse impredecibles.

El término "establemente integrado" se refiere a la integración de un vector de expresión dentro del genoma de una célula huésped, en donde la integración permanece estable en al menos 20, más preferentemente 30, más preferentemente 40, más preferentemente 50, tal como 75, por ejemplo 100 generaciones o más.

Abreviaturas: "CMV" = Citomegalovirus (humano). "AdMLP" = Promotor tardío principal del Adenovirus, poli A de SV40 = Secuencia señal poliA del virus de simio 40. GFP = Proteínas fluorescentes verdes. TcR = receptor de células T. ELISA = Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima. LTR = Repetición terminal larga.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Vista esquemática del procedimiento para generar un banco de células policlonales. La Figura ilustra esquemáticamente las etapas requeridas para obtener un banco de células policlonales, por ejemplo, un banco de células maestras policlonales, a) ilustra los diferentes vectores de expresión N.A.1, N.A.2, N.A.3, etc., codificando cada uno un diferente y distinto miembro distinto de la proteína policlonal, b) ilustra las células huésped que van a ser transfeccionadas con los vectores de expresión, c) ilustra la integración de los vectores de expresión en diferentes posiciones y en diferentes números de copias en células individuales, d) ilustra la selección de los clones celulares para cada uno de los miembros de la proteína policlonal. En este caso particular, para facilidad de ilustración, únicamente se muestra un clon por miembro distinto de la proteína policlonal. La etapa e) ilustra la mezcla de los clones seleccionados en el paso d) para generar un banco de células policlonales.

Figura 2a. Vector prototipo que codifica la cadena pesada y ligera. Los elementos son como sigue:

•: dos promotores del CMV humanos cabeza a cabeza, idénticos con un elemento espaciador entre ellos

•: regiones de codificación de la cadena pesada (VH + región constante gamma 1) y la cadena ligera (kappa 02-286)

•: bGH = secuencias de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento

•: SV40 pA = secuencia de poliadenilación del SV40

•: líderes genómicos para la cadena pesada y ligera

•: IRES + DHFR = sitio interno de entrada al ribosoma del ECMV, y el ADNa de la dihidrofolato reductasa de ratón

•: pUC ori = origen de replicación de pUC

•: bla, amp = gen de resistencia a la ampicilin Figura 2b. Vector de expresión pML29 de E1A.

•: Los elementos son los siguientes:

•: El vector está basado en cADN3.1+ (Invitrogen)

•: CMV = promoter de CMV humano

•: E1a = ADNc para el transactivador 13S del adenovirus tipo 5

•: bGH = región de poliadenilación de la hormona bovina del crecimiento

•: SV40EP = promotor temprano del SV40

•: Neo = gen de resistencia a la neomicina

•: SV40 poliA = región de poliadenilación del SV40

• AMP =gen dela β-lactamasa que codifica la resistencia a la ampicilina Figura 3. Contenido de IgG de las mezclas 1-9 durante el periodo de 5 semanas en que se realizó el experimento. Para detalle, véase Ejemplo 1. Figura 4. Cromatogramas de intercambio iónico que muestra la composición de la mezcla 8 al inicio (negra) y al final (azul) del periodo de cultivo de la semana 5. Figura 5. Primer muestra (gris) y última muestra (negra) proveniente de las 9 mezclas que se analizaron mediante cromatografía de intercambio iónico y el contenido de cada anticuerpo individual se calculó y mostró gráficamente. Figura 6 Muestras provenientes de las 4 mezclas (Ejemplo 5) durante el entrenamiento de siembra y la corrida en biorreactor que fueron analizadas mediante cromatografía de intercambio iónico y el contenido de cada anticuerpo individual se calculó y mostró gráficamente. La mezcla 1A-3A contenía un clon simple por anticuerpo. Los clones celulares que expresan

cada uno de los 6 anticuerpos fueron diferentes en la mezcla 1A (Figura 6a), mezcla 2A (Figura 6b) y mezcla 3A (Figura 6c). La mezcla 4A (Figura 6d) contenía 3 clones por anticuerpo.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

El sistema de expresión de proteína policlonal recombinante

La presente invención proporciona los procedimientos para la fabricación consistente de las proteínas policlonales recombinantes que son preferentemente seleccionados de la superfamilia de inmunoglobulinas, una familia de proteínas con dominio similares a la inmunoglobulina. La mayoría de los miembros están involucrados en los eventos de reconocimiento de la superficie celular. El análisis de las secuencias sugiere que los anticuerpos, los receptores de células T, las moléculas MHC, algunas moléculas de adhesión celular y los receptores de citocinas son altamente homólogos. Especialmente los miembros de esta familia que contienen regiones variables son adecuados para la generación de proteínas policlonales recombinantes de acuerdo a la presente invención. Tales miembros incluyen anticuerpos, anticuerpos unidos a la membrana (receptores de células B), fragmentos Fab, fragmentos Fv, fragmentos Fv de cadena simple (scFv), receptores de células T (TcR), TcR solubles, fragmentos de dominio variable de TcR, fragmentos de dominio variable de TcR ligados por un ligador polipeptídico u otro anticuerpo o fragmentos derivados de TcR. En particular, se contempla que la presente invención puede ser utilizada para la fabricación y producción a gran escala de anticuerpos policlonales terapéuticos recombinantes y TcR.

Una de las ventajas principales del procedimiento de fabricación de la presente invención es que todos los miembros que constituyen la proteína policlonal recombinante pueden ser producidos en uno o en unos pocos biorreactores o equivalentes de los mismos. Además, la composición de proteína policlonal recombinante puede ser purificada a partir del reactor como una preparación simple sin tener que separar los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante durante el procedimiento. En contraste, si se desea imitar una composición de anticuerpo policlonal recombinante mediante el mezclado de anticuerpos monoclonales purificados (como se propone por ejemplo en el documento WO 91/16074) se requerirá la fabricación por separado en un biorreactor de cada anticuerpo que va a ser incluido en la composición, y los anticuerpos podrían ser purificados individualmente también. Tal producción de una mezcla monoclonal sería muy costosa, y consume mucho tiempo y espacio en comparación con el procedimiento de producción del anticuerpo policlonal recombinante u otras proteínas policlonales como se describe en el presente documento. De este modo, el procedimiento como se describe en el documento WO 91/16074 podría dar como resultado naturalmente un límite práctico para el número de anticuerpos monoclonales que podrían ser incluidos en tal mezcla, mientras que la tecnología como se describe en la presente, en general puede producir un anticuerpo policlonal con muchos miembros individuales, en principio sin ningún límite superior.

La línea celular huésped utilizada es preferentemente una línea celular de mamífero que comprende aquellas típicamente utilizadas para la expresión de proteína biofarmacéutica, por ejemplo, células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NS0, YB2/0), NIH 3T3, y células humanas inmortalizadas, tales como las células HeLa, células HEK 293, o PER.C6. En la presente invención, se utilizaron células CHO, más particularmente, un clon DG44 modificado. La elección de esta línea celular particular ha sido realizada debido a que las células CHO son ampliamente utilizadas para la fabricación recombinante de anticuerpos y debido a que el clon DG44 puede usarse en combinación con el marcador de selección metabólica DHFR, lo cual adicionalmente permite la amplificación del gen codificado.

La línea celular DG44 ha sido modificada mediante transfección con un transactivador E1A que codifica el vector de expresión. Esto se ha realizado para incrementar el rendimiento general, cuando el gen de interés es operativamente unido a un promotor del CMV. El promotor del CMV es transactivado por E1A. La modificación ha proporcionado una línea celular excepcionalmente estable proporcionando clones celulares que tienen velocidades de crecimiento uniformes y niveles de expresión uniformes y altos para diferentes anticuerpos. Se cree, por lo tanto, que la modificación mejora la estabilidad de la composición en el tiempo. Los intentos para detectar la expresión de E1A en la línea celular modificada han fallado. Es por lo tanto no probable que las velocidades de crecimiento uniformes y los niveles de expresión uniformes y altos pueden ser adscritos únicamente a la expresión de E1A. Aunque en el presente caso la expresión de E1A no fue detectable, todavía se cree que la transactivación del promotor del CMV utilizando la expresión de E1A podría conducir a niveles de expresión aún más altos y estables.

Las células de BHK-21 o células CHO son preferentemente utilizadas para la expresión. Las células CHO adecuadas, incluyen, entre otras, células CHO-K1 y CHO-S. Los mutantes Dhfr-de CHO tales como CHO-DUKX-B11 o DG44, son células de mamífero preferidas para la práctica de esta invención. Estas células son bien conocidas en la técnica y están ampliamente disponibles en, por ejemplo, la Colección Americana de cultivos Tipo (American Type Culture Collection, ATCC) Rockville, Md. (BHK-21) o del Dr. Lawrence Chasin, Universidad de Columbia, Nueva York (CHO DUKX-B11 o DG44). Estas células se adaptan bien al crecimiento en cultivos en suspensión (también en condiciones sin suero) y/o pueden crecer en concentraciones de niveles bajos de suero y pueden usarse junto con el marcador de selección de DHFR.

Preferentemente, la línea celular se subclona y selecciona según los clones que muestran una expresión alta y estable del o de los miembros de la proteína policlonal.

En consecuencia, un experto en la técnica, podría ser capaz de sustituir el clon DG44 con otros clones y sustituir las células CHO con otras células de mamífero, como se describe, o incluso utilizar otro tipo de células, incluyendo las células vegetales, células de levadura, células de insecto, hongos y bacterias. De este modo, la elección del tipo celular no está destinada a limitar la presente invención.

Los rendimientos obtenibles utilizando los procedimientos de la presente invención dependen de un número de parámetros que incluyen, entre otros, las condiciones de cultivo y la especie de célula huésped utilizada. En modalidades de la presente invención, el rendimiento excede preferentemente 50 mg/litro de proteína, tal como más de 60 mg/l, por ejemplo más de 75 mg/l, tal como más de 100 mg/l, por ejemplo más de 125 mg/l, tal como más de 150 mg/l, por ejemplo más de 200 mg/l, tal como más de 250 mg/l, por ejemplo más de 300 mg/l, tal como más de 400 mg/l, por ejemplo más de 500 mg/l, tal como más de 600 mg/l, por ejemplo más de 700 mg/l, tal como más de 750 mg/l, por ejemplo más de 800 mg/l, tal como más de 900 mg/l, por ejemplo más de 1,000 mg/l, tal como más de 2 g/l, por ejemplo más de 3 g/l, tal como más de 4 g/l, por ejemplo más de 5 g/l.

La proteína policlonal recombinante de la presente invención está destinada a cubrir una composición de proteína que comprende moléculas de proteína diferentes, pero homólogas, las cuales son variables de manera natural, lo que significa que, en las modalidades preferidas, la biblioteca de ácidos nucleicos variantes comprende una diversidad de origen natural. De este modo, cada molécula de proteína es homóloga a las otras moléculas de la composición, pero también contiene uno o más tramos de la secuencia polipeptídica variable, que se caracterizan por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal. Las diferencias en la o las secuencia de aminoácidos que constituyen la secuencia polipeptídica variable puede ser tan pequeña como de un aminoácido. Preferentemente, las diferencias en la secuencia de aminoácido constituyen más de un aminoácido.

Usualmente, la variabilidad natural de un anticuerpo policlonal o TcR se considera que está localizada en las denominadas regiones variables o regiones V de las cadenas polipeptídicas.

Los miembros individuales en una proteína policlonal comprenden regiones variables que son aproximadamente de entre 80 y 120 aminoácidos de longitud. Las regiones variables pueden comprender dominios hipervariables, por ejemplo, regiones determinantes de la complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés).

En los TcR de origen natural, existen cuatro CDR en cada región variable. En los anticuerpos de origen natural, existen tres CDR en la cadena pesada y tres CDR en la cadena ligera.

De forma adicional, las regiones variables de los miembros individuales de una proteína policlonal comprenden al menos un dominio hipervariable que está entre 1 y 26 aminoácidos de longitud, preferentemente entre 4 y 16 aminoácidos de longitud. El dominio hipervariable puede corresponder a una región CDR3. Para los anticuerpos cada región variable constituye preferentemente tres dominios hipervariables. Estos pueden corresponder a CDR1, CDR2 y CDR3. Para los TcR cada región variable constituye preferentemente cuatro dominios hipervariables. Estos pueden corresponder a CDR1, CDR2, CDR3 y CDR4. Los dominios hipervariables pueden constituir solos las secuencias variables de entre una región variable de una proteína policlonal recombinante de la presente invención.

En el contexto de la presente invención, la variabilidad en la secuencia polipeptídica (la policlonalidad) puede también entenderse como que describe las diferencias entre las moléculas de anticuerpo individuales que residen en las denominadas regiones constantes o regiones C de las cadenas polipeptídicas del anticuerpo, por ejemplo, como en el caso de las mezclas de anticuerpos que contienen dos o más diferentes isotipos de anticuerpo, tales como los isotipos humanos, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM, IgD, e IgE, o los isotipos murinos IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, e IgA. De este modo, un anticuerpo policlonal recombinante puede comprender moléculas de anticuerpo que están caracterizadas por diferencias de secuencia entre las moléculas de anticuerpo individuales en la región variable (región V) o la región constante (región C) o en ambas. Preferentemente, los anticuerpos son del mismo isotipo, ya que esto facilita considerablemente la purificación posterior. Es también concebible combinar los anticuerpos de por ejemplo, los isotipos IgG1, IgG2, e IgG4, ya que éstos pueden ser todos purificados conjuntamente utilizando la cromatografía de afinidad de proteína A. En una modalidad preferida, todos los anticuerpos que constituyen el anticuerpo policlonal tienen la misma región constante para facilitar adicionalmente la purificación. Más preferentemente, los anticuerpos tienen la misma región constate de la cadena pesada. La región constante de la cadena ligera puede también ser la misma a través de distintos anticuerpos.

Con el fin de proporcionar secuencias de ácido nucleico variantes que codifican las proteínas que se unen a un antígeno particular, puede ser utilizado el número de procedimientos conocidos en la materia. Típicamente, la invención se beneficiará del uso de un procedimiento de selección que hace posible la identificación y/o el aislamiento de los ácidos nucleicos que codifican para la proteína que se une a un antígeno particular. Varios de estos procedimientos incluyen una etapa de enriquecimiento o una denominada etapa de bioexhibición panorámica, conocido por las tecnologías tales como SymplexMR (Mejier et al, 2006, J. Mol. Biol, 358:764-772; WO 2005/042774), visualización de fago (Kang, A.S. y col. 1991. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos de América 88, 4363-4366), visualización de ribosoma (Schaffitzel, C. y col. 1999. J. Immunol. Methods 231, 119-135), visualización de ADN (Cull, M. G. y col. 1992. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos de América 89, 1865-1869), visualización de ARN-péptido (Roberts, R.W., Szostak, J.W., 1997. Proc Natl Acad Sci Estados Unidos de América 94, 12297-12302), visualización covalente (WO 98/37186), expresión en la superficie bacteriana (Fuchs, P. y col. 1991. Biotechnology 9, 1369-1372), expresión en la la superficie de levadura (Boder, E.T., Wittrup, K. D., 1997. Nat Biotechnol 15, 553-557) y visualización de virus eucariótico (Grabherr, R., Ernst, W., 2001. Comb. Chem. High Throughput. Screen. 4, 185-192), procedimientos que son todos conocidos en la materia y son auxiliares interesantes en la práctica de la presente invención. La clasificación por FACS y esferas magnéticas son también aplicables para fines de enriquecimiento (toma panorámica) utilizando el antígeno marcado. Los ensayos de inmunodetección tales como ELISA (Dreher,

M. L. y col. 1991. J. Immunol. Methods 139, 197-205) y ELISPOT (Czerkinsky, CC. et.al.1983. J Immunol Methods. 65, 109-21) pueden también utilizarse ya sea después de un paso de bioexhibición panorámica o solo.

Una composición de una proteína policlonal recombinante de interés comprende un subgrupo definido de proteínas, las cuales han sido definidas por una característica común tal como la actividad de enlace compartida hacia un objetivo deseado, por ejemplo, en el caso de los anticuerpos policlonales contra el antígeno objetivo deseado. Típicamente, una composición de proteína policlonal tiene al menos 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 1000, 104, 105 ó 106 miembros variantes distintos. El número de miembros distintos necesarios en la composición de proteína policlonal dependerá de la complejidad del objetivo. En el caso de los anticuerpos, la complejidad del o de los antígenos objetivo influirá el número de miembros variantes distintos necesarios en la composición de anticuerpo policlonal. Con objetivos pequeños o no muy complejos, por ejemplo, una proteína pequeña, una composición de anticuerpo policlonal que comprende entre 2 ó 3 y 100 miembros variantes distintos puede ser suficiente, y se prefiere que el número de variantes no exceda 90, o incluso 80 ó 70. En muchos casos, el número de variantes distintas no excederá 60 ó 50, y se prefiere que el número de variantes esté en el intervalo de entre 5 y 40, tal como entre 5 y 30. Mientras que para más objetivos complejos, una composición de anticuerpo policlonal que comprende entre 20 a 500 miembros variantes distintos puede ser suficiente. Objetivos muy complejos, donde el antígeno comprende muchas moléculas diferentes, una composición de anticuerpo que comprende entre 50 a 10.000 miembros variantes distintos puede ser requerida.

En mamíferos, existen varios ejemplos conocidos de proteínas policlonales de origen natural que circulan ya sea libremente en la sangre, tales como anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina, o están presentes sobre las superficies celulares tales como los receptores de células T y receptores de células B. La diversidad de estas proteínas policlonales de origen natural es, en algunos mamíferos, lograda mediante recombinación genética de los genes que codifican para las regiones variables de estas proteínas. Se sabe además que los anticuerpos incrementan su diversidad mediante mutación somática. La presente invención puede utilizar estas diversidades naturales mediante aislamiento de las secuencias responsables para la diversidad (por ejemplo, los dominios variables o regiones CDR de las moléculas de inmunoglobulina o TcR) y generando una biblioteca a partir de ellas. Para las proteínas codificadas a partir de dos segmentos génicos independientes, por ejemplo, la cadena pesada variable del anticuerpo y la región ligera variable, la cadena TcRα y la cadena β o cadena TcRδ y la cadena γ, cada vector en la biblioteca constituirá un par de estas secuencias de codificación de la región variable. La generación de bibliotecas de pares de secuencias de codificación de la región variable es bien conocida en la técnica.

Las bibliotecas comprenden diversidades de origen natural son por ejemplo, bibliotecas combinatorias (apareamiento aleatorio de las secuencias que codifican para la región variable) así como bibliotecas de pares cognados (pares de secuencias que codifican para la región variable derivadas de la misma célula, por ejemplo, el documento WO 2005/042774). Además, las bibliotecas generadas a partir de los fragmentos génicos de CDR aislados, que son incorporadas dentro de una estructura apropiada (por ejemplo, Soderlind, E. y col., 2000. Nat. Biotechnol. 18, 852-856), tal como un anticuerpo o región variable TcR son aplicables con la presente invención. Las bibliotecas son preferentemente seleccionadas para obtener sub-bibliotecas (bibliotecas de interés) con una especificidad deseada.

Las diversidades de las proteínas pueden también ser realizadas de una manera artificial, por ejemplo sintética o mediante mutación. Las mutaciones pueden ser ya sea mutaciones aleatorias o puntuales de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína simple, con lo cual se genera una población policlonal de la proteína simple. Otro ejemplo más de la generación de bibliotecas de anticuerpos artificiales se describe en la patente Europea EP 0 859 841, un procedimiento que está basado en la generación de una biblioteca de estructuras de la región variable que pueden ser combinadas con otras bibliotecas de CDR.

En una modalidad preferida de la invención, la proteína policlonal recombinante es un

anticuerpo policlonal recombinante o un fragmento de anticuerpo. En otra modalidad preferida de la invención, la proteína policlonal recombinante es un TcR policlonal recombinante o un fragmento de TcR. Una proteína policlonal recombinante de la presente invención puede por lo tanto estar

5 también constituida de los diferentes isotipos o de manera más preferida de diferentes subclases. La policlonalidad de las inmunoglobulinas puede ocurrir en la parte constante o en el dominio variable de la molécula de inmunoglobulina o en ambas, es decir, la parte constante y el dominio variable.

La policlonalidad en la denominada región constante, particularmente la cadena pesada de los

10 anticuerpos, es de interés con respecto a la aplicación terapéutica de los anticuerpos. Los diversos isotipos de inmunoglobulina tienen diferentes funciones biológicas (resumidas en la Tabla 1), que pueden ser deseables para combinarse cuando se utilizan los anticuerpos para el tratamiento, debido a que diferentes isotipos de inmunoglobulina pueden estar implicados en diferentes aspectos de las respuestas inmunitarias naturales (Canfield y Morrison 1991. J. Exp. Med. 173, 1483-91; Kumpel ycol. 2002. Transfus. Clin. Biol. 9, 45.-53; Stirnadel

15 ycol.2000.Epidemiol.Infect.124,153-162).

Tabla 1: Funciones biológicas de los isotipos de inmunoglobulina humana

Inmunoglobulina Humana

IgG1: IgG2 IgG3 IgG4 IgA1 IgA2 IgM IgD IgE

Activación clásica del complemento: +++ ++ ++++ + - - ++++ -

Activación alternativa del complemento: + + + +++ + - - + -

Transferencia placentaria: + ++ + ++ - - - - -

Lisis bacteriana: + + + + +++ +++ + ? ?

Unión de macrófago/otros fagocitos: + - + + + + - - -

Unión de mastocitos/basoófilos: - - - - - - - - -

Reactividad de proteína A de estafilococos: + + - + - - - - -

Otro aspecto de la presente invención es una línea celular de fabricación policlonal,

recombinante, que comprende una línea celular policlonal que comprende 2-n poblaciones de células, cada población expresando un miembro distinto de una proteína policlonal recombinante, comprendiendo las células las construcciones de expresión aleatoriamente integradas en el genoma. Las construcciones de expresión son preferentemente establemente integradas dentro del genoma. Las construcciones en una modalidad están integradas en uno

o más cromosomas.

El número de poblaciones de células en la línea celular policlonales, n, puede ser 3 ó más, tal como 4 ó más, por ejemplo 5 ó más, tal como 6 ó más, por ejemplo 7 ó más, tal como 8 ó más, por ejemplo 9 ó más, tal como 10 ó más, por ejemplo 11 ó más, tal como 12 ó más, por ejemplo 13 ó más, tal como 14 ó más, por ejemplo 15 ó más, tal como 16 ó más, por ejemplo 17 ó más, tal como 18 ó más, por ejemplo 19 ó más, tal como 20 ó más, por ejemplo 21 ó más, tal como 22 ó más, por ejemplo 23 ó más, tal como 24 ó más, por ejemplo 25 ó más, tal como 26 ó más, por ejemplo 27 ó más, tal como 28 ó más, por ejemplo 29 ó más, tal como 30 ó más, por ejemplo 35 ó más, tal como 40 ó más, por ejemplo 45 ó más, tal como 50 ó más, por ejemplo 60 ó más, tal como 70 ó más, por ejemplo 80 ó más, tal como 90 ó más, por ejemplo 100 ó más.

Para la mayoría de los fines n puede ser menos de 50, tal como menor de 45, por ejemplo menor de 40, tal como menor de 35, por ejemplo menor de 30.

Una realización importante de la presente invención es el paso de clonación celular realizado antes de mezclar finalmente la línea celular policlonal. Este paso da como resultado un rendimiento o estabilidad mejorados de los bancos de células policlonales obtenidas al reducir al mínimo la aparición de desviación clonal. Las células que expresan un miembro distinto de la proteína policlonal recombinante pueden ser derivadas de una o más células clonadas, tales como de 2 ó más, por ejemplo de 3 ó más, tal como de 4 ó más, por ejemplo de 5 ó más, tal como de 6 ó más, por ejemplo de 7 ó más, tal como de 8 ó más, por ejemplo de 9 ó más, tal como de 10 ó más por ejemplo 11 ó más, tal como 12 ó más, por ejemplo 13 ó más, tal como 14 ó más, por ejemplo 15 ó más, tal como 16 ó más, por ejemplo 17 ó más, tal como 18 ó más, por ejemplo 19 ó más, tal como 20 ó más, por ejemplo 21 ó más, tal como 22 ó más, por ejemplo 23 ó más, tal como 24 ó más, por ejemplo 25 ó más, tal como 26 ó más, por ejemplo 27 ó más, tal como 28 ó más, por ejemplo 29 ó más, tal como 30 ó más, por ejemplo 35 ó más, tal como 40 ó más, por ejemplo 45 ó más, tal como 50 ó más, por ejemplo 60 ó más, tal como 70 ó más, por ejemplo 80 ó más, tal como 90 ó más, por ejemplo 100 ó más. Para la mayoría de los propósitos, el número de células clonadas es menor de 50, por ejemplo menor de 20, tal como menor de 15, por ejemplo menor de 10.

En una realización adicional de la modalidad anterior, las secuencias de ácido nucleicos

variantes que codifica la proteína policlonal (preferentemente proveniente de la superfamilia de inmunoglobulina) son todas derivadas de frecuencias de origen natural, por ejemplo aisladas de un donante.

Diversidad clonal

Una de las características de una proteína policlonal es que ésta está constituida por un número de moléculas de proteína individuales donde cada molécula de proteína es homóloga a las otras moléculas de la proteína policlonal, pero también tiene una variabilidad que se caracteriza por diferencias en la secuencia de aminoácidos entre los miembros individuales de la proteína policlonal. Preferentemente, las diferencias están confinadas a distintas áreas de la estructura completa de la proteína policlonal. Tales áreas son por ejemplo la región variable de un anticuerpo o TcR y posiblemente adicionalmente confinada a las regiones CDR en estas áreas. Esta variabilidad puede ser también descrita como una diversidad, la cual puede ser identificada a nivel de los ácidos nucleicos, así como al nivel funcional de las proteínas, por ejemplo, las diferencias de especificidad y de afinidad hacia un objetivo.

La diversidad clonal de la línea celular puede ser analizada mediante RFLP sobre clones aislados provenientes de combinados de células que expresan una proteína policlonal recombinante. La secuenciación de los productos de la (RT)-PCR representa otra posibilidad para analizar la diversidad clonal. La diversidad puede ser también analizada mediante pruebas funcionales (por ejemplo, ELISA) sobre la proteína policlonal recombinante producido por la línea celular. En el documento WO 2006/007853 se desvelan los procedimientos para la caracterización de una línea celular policlonal y una proteína policlonal. Estos procedimientos pueden ser utilizados para analizar la diversidad clonal de la línea celular y la proteína policlonal resultante.

Desviación clonal (por ejemplo, un cambio gradual en el contenido de los anticuerpos individuales que constituyen el anticuerpo policlonal), si éste existe, puede ser estimado por comparación de la diversidad clonal de la biblioteca inicial, utilizada para la transfección, con la diversidad encontrada en el combinado de células (línea celular) que expresa la proteína policlonal recombinante.

La diversidad clonal de una proteína policlonal expresada a partir de una línea celular puede ser evaluada como la cobertura objetivo por la proteína policlonal. En este caso se considera que suficiente diversidad es adquirida cuando aproximadamente 25-100% de las moléculas objetivo deseadas son enlaces por la proteína policlonal. Por ejemplo, en el caso de un anticuerpo policlonal, el enlace del anticuerpo a al menos a 25% de los epítopos no idénticos sobre la superficie de un antígeno objetivo, proporciona una diversidad suficiente en la composición. Preferentemente, la diversidad clonal por cobertura objetivo es al menos de 50%, y aún más preferentemente al menos de 75%. Para los anticuerpos, tal cobertura objetivo podría ser evaluada por ejemplo mediante mapeo de epítopos.

Como alternativa, la diversidad clonal puede ser evaluada como la distribución de los miembros individuales de la composición policlonal. Esta distribución puede ser evaluada como el número total de miembros individuales diferentes en la composición de proteína policlonal final, en comparación al número de diferentes secuencias de codificación originalmente introducidas dentro de la línea celular durante la transfección. En este caso, se considera que es adquirida suficiente diversidad cuando al menos 50% de las secuencias de codificación originalmente utilizadas en la transfección pueden ser identificadas como miembros individuales diferentes de las proteínas policlonales finales, preferentemente al menos 75%, más preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90%, tal como al menos 95%, 97%, 98% ó 99%. Expresado de otra manera, la diversidad clonal puede ser considerada suficiente si únicamente un miembro de la proteína policlonal se pierde durante la fabricación, o sí 2, 3, 4 ó 5 miembros se pierden.

La distribución de los miembros individuales de la composición policlonal puede ser también evaluada con respecto a la contribución mutua entre los miembros individuales. En este caso, se considera que es adquirida suficiente diversidad clonal si ningún miembro simple de la composición constituye más del 75% de la cantidad total de la proteína en la composición final de la proteína policlonal. Preferentemente, ningún miembro individual excede más del 50%, aún más preferentemente 25% y más preferentemente 10% del número total de los miembros individuales en la composición policlonal final. La evaluación de la diversidad clonal, basada en la distribución de los miembros individuales en la composición policlonal, puede ser realizada mediante análisis de RFLP, análisis de secuencia y análisis de proteína, tales como los procedimientos descritos posteriormente para la caracterización de una composición policlonal.

La diversidad clonal puede ser reducida como resultado de la desviación clonal que puede surgir a) como resultado de las diferencias en el nivel de expresión, b) como resultado de las variaciones en la proliferación celular. Si tales desviaciones surgen, cada una de estas fuentes de una pérdida de diversidad clonal, es fácilmente remediada por modificaciones menores a los procedimientos como se describen en el presente documento.

Es posible que las variaciones en las velocidades o proporciones de proliferación celular de las células individual en la línea celular podrían, en un periodo prolongado de tiempo, introducir una desviación dentro de la expresión de proteína policlonal recombinante, incrementando o reduciendo la presencia de algunos miembros de la proteína policlonal recombinante expresada por la línea celular. Ya que los presentes procedimientos pueden estar basados en la integración aleatoria dentro del genoma de la célula huésped, la posición y el número de copias varían entre miembros de la línea celular policlonal. Es probable que esto de origen a diferencias en la velocidad o proporción de proliferación y en el nivel de expresión entre los clones. Al seleccionar los clones celulares con velocidad o proporción de velocidad similar, este problema se reduce al mínimo. Una posibilidad adicional es utilizar más de un clon para cada miembro de la proteína policlonal. Los ejemplos ilustran que la estabilidad de la composición es incrementada si entre 3 y 5 clones que expresan un miembro simple de la proteína policlonal, se utilizan en comparación a únicamente un clon para cada miembro de la proteína policlonal.

Otra manera de abordar este problema es utilizar uno o más criterios de selección para asegurar que las células sean uniformes dentro de ciertos límites pre-establecidos con respecto a uno o más criterios seleccionados del grupo que consiste de la velocidad de crecimiento, tiempo de duplicación, nivel de expresión, nivel de producción, estabilidad de la productividad en el tiempo, viabilidad, resistencia, solidez, morfología y número de copias.

Una razón para las variaciones en las velocidades o proporciones de proliferación podría ser que la población de células que constituyen la línea celular inicial utilizada para la transfección inicial, es heterogénea. Se sabe que las células individuales en una nueva línea celular se desarrollan de manera diferente en un periodo prolongado de tiempo. Para asegurar un material inicial más homogéneo, la subclonación o subclonación repetida de la línea celular antes de la proliferación con los vectores de expresión de interés, puede ser realizado utilizando una dilución límite de la línea celular hasta el nivel de célula simple, y desarrollando cada célula simple hacia una nueva población de células (denominada subclonación celular por dilución límite).

Un procedimiento alternativo y preferido para la clonación de células simples, para asegurar una población celular bien definida, es utilizar la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés) después de la transfección. Esto puede ser realizado antes del procedimiento de selección. Los anticuerpos marcados fluorescentemente pueden ser utilizados para enriquecer las células altamente productivas derivadas de un combinado de células transfeccionadas con constructos de IgG (Brezinsky y col. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155). La ventaja de utilizar clasificación por FACS es que el procedimiento combina la clonación de células simples (mediante clasificación de células simples dentro de los pocillos), mientras que se proporciona simultáneamente la información respecto al nivel de expresión de cada célula simple. Para mejorar adicionalmente el procedimiento de clasificación, puede ser incluida una cepa de viabilidad de modo que las células muertas o moribundas son desechadas. El procedimiento de FACS somete a las células a condiciones más bien severas que incluyen tensión de corte. Esto significa que las células indirectamente sean seleccionadas para la resistencia a tales condiciones. Además, el procedimiento FACS es automatizado, permitiendo la clasificación de un alto número de células simples.

El procedimiento de FACS puede ser también utilizado para clasificar células que expresan niveles similares de inmunoglobulina, con lo cual se crea una población celular homogénea con respecto a la productividad. De igual modo, mediante el uso de la marcación con el colorante fluorescente éste de succinimidilo de diacetato de 5,6-carboxilfluoresceina (CFSE) las células que muestran velocidades de proliferación celulares pueden ser seleccionadas mediante procedimientos de FACS.

Una modalidad importante de la presente invención es la generación de una ó más líneas celulares clonadas para cada miembro del anticuerpo policlonal. La generación de clones celulares simples puede ser llevada a cabo utilizando cualquiera de un número de técnicas estándares. Sin embargo, se ha constatado que la clasificación celular por FACS donde las células son seleccionadas para la viabilidad y los niveles de IgG y son clasificados individualmente en pocillos se ha constatado consistentemente que proporciona clones estables adecuados para la preparación de un banco de células policlonales maestras y un banco de células de trabajo policlonales, subsiguientes. La presión de selección a partir de, por ejemplo, Mtx puede eliminarse antes de o durante la clasificación por FACS, mediante presión de selección continua, por ejemplo, mediante el desarrollo en un medio libre de nucleósidos es preferentemente mantenida. Los clones individuales son preferentemente seleccionados después de un cierto número de días en un cultivo bajo presión de selección después de la clasificación celular. Ya que los clones son seleccionados en el mimo día después de la clasificación, la velocidad de crecimiento de los clones será relativamente uniforme. Además de esto, las colonias son inspeccionadas visualmente para descartar los clones con cambios aparentes en la morfología y bajas velocidades de crecimiento, en comparación a la línea celular no transfeccionada original. Finalmente, el nivel de expresión del anticuerpo puede ser evaluado utilizando por ejemplo, ELISA u otras técnicas analíticas, y pueden ser seleccionados los clones con niveles de expresión alto y relativamente uniformes.

Incluso si se desarrolla una desviación inducida por la velocidad de proliferación, la pérdida o sobre-representación de los miembros individuales puede no ser necesariamente crítica, dependiendo de los requerimientos de diversidad del producto proteico policlonal, recombinante, final, y la estabilidad de la diversidad en el tiempo.

La célula huésped

Las células huésped pueden ser generadas a partir de cualquier célula que puede integrar el ADN dentro de sus cromosomas o conservar los elementos extra-cromosómicos tales como mini-cromosomas, YAC (cromosomas artificiales de levadura), MACs(cromosomas artificiales de ratón), o HAC (cromosomas artificiales humanos). Los MAC y HAC son descritos con detalle en el documento WO 97/40183. Preferentemente se usan células de mamífero, tales como células CHO, células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, YB2/0 ó NS0), fibroblastos tales como NIH 3T3, y células humanas inmortalizadas, tales como células HeLa, células HEK 293 o PER.C6. Sin embargo, también se pueden usar células procarióticas o eucarióticas que no son de mamífero, tales como células vegetales, células de insecto, células de levadura, células de hongo, E. coli, etc. .

En una realización de la presente invención, la línea celular que va a ser utilizada como material inicial, es subclonada mediante la realización de una dilución denominada limitante, de la línea celular hasta un nivel de células simples, seguido por el desarrollo de cada célula simple hasta una nueva población de células antes de la transfección con la biblioteca de vectores de interés. Tal subclonación puede ser también realizada posteriormente en el proceso de selección de la línea celular correcta, si se desea. Otros procedimientos para la clonación de células simples incluye: clonación por FACS (Brezinsky y col. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155), tecnología LEAPPM (de Cyntellect, San Diego, California, Estados Unidos de América), y ClonePix (de Genetix, Reino Unido).

El vector para integración

La siguiente descripción se centra en el uso de los sistemas de expresión en mamífero. Sin embargo, es de igual modo posible utilizar los procedimientos de la invención para la expresión en bacterias con modificaciones adecuadas.

Un vector adecuado comprende un gen de selección adecuado. Los genes de selección adecuados para el uso en la expresión de células de mamífero incluyen, pero no están limitados a, genes que hacen posible la selección nutricional, tal como el tipo de gen de la timidina cinasa (TK), el gen de la glutamina sintetasa (GS), el gen de la triptopfano sintasa (trpB) o el gen de la histidinol deshidrogenesa (hisD). Además, los marcadores de selección son genes de resistencia a antimetabolitos que confieren resistencia a fármacos, tales como el gen de la dihidrofolato-reductasa (dhfr) que puede ser seleccionado con medio deficiente a hipoxantina y timidina, y además seleccionado con metotrexato, el gen de la xantina-guanina fosforibosiltransferasa (gpt), el cual puede ser seleccionado con el ácido micofenólico, el gen de la neomicina-fosfotransferasa (neo) el cual puede ser seleccionado con G418 en células eucarióticas y neomicina o canamicina en células procarióticas, el gen de la higromicina Bfosfotransferasa (hyg, hph, hpt) el cual puede ser seleccionado con higromicina, el gen de la puromicina-N-acetil-transferasa (pac) el cual puede ser seleccionado con puromicina o el gen de la Blasticidina S-desaminasa (Bsd) el cual puede ser seleccionado con blasticidina, el gen de resistencia a la Zeocina (Sh ble) el cual es mediador de la resistencia hacia la Zeocina y la Bleomicina. Finalmente, los genes que codifican para las proteínas que hacen posible la clasificación, mediante citometria de flujo, pueden ser también utilizados como marcadores de selección tales como la proteína fluorescente verde (GFP), el receptor del factor de crecimiento nervioso (NGFR) y otras proteínas de membrana, o la beta galactosidasa (LacZ).

El marcador de selección puede estar localizado sobre un miembro de expresión separado, realizando de este modo la co-transfección con un vector de expresión que codifica el marcador de selección y uno o más vectores de expresión que codifican para la proteína de interés o las subunidades de la proteína de interés. El marcador de selección puede estar también localizado en el vector de expresión que codifica la proteína de interés. En este ultimo caso, el marcador de selección está preferentemente localizado sobre un tránscrito el cual codifica también para la proteína de interés o una de sus subunidades. Esto puede ser realizado, por ejemplo, utilizando un constructo de IRES. En el caso de una proteína multimérica, tal como un anticuerpo, el marcador de selección está preferentemente localizado sobre el tránscrito que codifica la subunidad más grande, tal como, por ejemplo, la cadena pesada del anticuerpo.

El vector para la integración del gen de interés comprende además el ADN que codifica un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés, precedido por su propio promotor de mamífero que dirige la expresión de la proteína. Si un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés comprende más de una cadena de proteína, por ejemplo, si el miembro es un anticuerpo o receptor de la célula T, el ADN que codifica las cadenas de la proteína puede ser precedido por su propio promotor de mamífero dirigiendo altos niveles de expresión (bi-direccionales o unidireccionales) de cada una de las cadenas. En una expresión bi-direccional, una configuración de promotor cabeza con cabeza en el vector de expresión, puede ser utilizada, y para una expresión unidireccional pueden ser utilizados para la expresión dos promotores o un promotor combinado con, por ejemplo, una secuencia IRES. Un vector de expresión bicistrónico con dos diferentes subunidades codificadas por el mismo tránscrito, y separadas por una secuencia IRES, es de igual modo concebible.

Las configuraciones adecuadas del promotor cabeza con cabeza son por ejemplo, pero no están limitadas a, el promotor AdMLP junto con el promotor de la metalotioneina-1 de ratón en ambas direcciones, el promotor AdMLP junto con el promotor del factor 1 de alargamiento en ambas orientaciones, o el promotor del CMV junto con el promotor MPSV de ambas orientaciones, o el promotor del CMV utilizado en ambas orientaciones.

En el caso de los anticuerpos, la experiencia ha mostrado que la cantidad de la cadena pesada expresada por una célula no debe exceder la cantidad de la cadena ligera. Por lo tanto, el promotor que dirige la expresión de la cadena ligera es preferentemente al menos tan fuerte como el promotor que dirige la expresión de la cadena pesada.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia guía funcional o una señal de translocación, puede ser incluido en el vector de expresión para dirigir el producto génico hacia el retículo endoplásmico o un sitio específico dentro de la célula, tal como un organelo. Una señal de poliadenilación fuerte puede estar situada a 3' de la secuencia de ADN que codifica la proteína. La señal de poliadenilación asegura la terminación y la poliadenilación del transcrito de ADN naciente, y está correlacionada con la estabilidad del mensaje. El ADN que codifica un miembro de la proteína policlonal recombinante de interés puede, por ejemplo, codificar para las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo, cada secuencia génica que es opcionalmente precedida por sus propios elementos promotores de mamífero y/o seguido por señales poli A fuertes que dirigen la expresión de alto nivel de cada una de las dos cadenas.

El vector de expresión para la integración puede llevar elementos reguladores de la transcripción, adicionales, tales como aumentadores, anti-represores, o UCOE (elementos de abertura de cromatina ubicuos) para la expresión incrementada y estabilidad de la expresión en el sitio de integración. Los aumentadores son secuencias de ácido nucleico que interactúan específicamente con las proteínas nucleares involucradas en la transcripción. Los UCOE abren la cromatina o mantienen la cromatina en un estado abierto y facilita la expresión reproducible de un gen operablemente unido (descrito con más detalle en el documento WO 00/05393 y Benton y col., Cytotechnology 38:43-46, 2002). Los aumentadores o elementos de aumento adicionales incluyen las Regiones de Acoplamiento a la Matriz (MAR) como se describe por ejemplo, en Girod & Mermod 2003 ("Capítulo 10: Use of scaffold/matrix-attachment regions for protein production", pp 359-379 en Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, SC Makrides (ed), 2003, Elsevier Science BV). Los elementos anti-represor incluyen, pero no están limitados a los elementos STAR (Kwaks et al Nat Biotechnol. 2003 Mayo; 21(5): 553-8). Cuando uno o más elementos reguladores descritos en lo anterior, son integrados dentro del cromosoma de una célula huésped, éstos son denominados elementos reguladores heterólogos.

Bancos de Células de Trabajo Policlonales y Bancos de Células Maestras

En realizaciones preferidas de la invención, se hace uso de los Bancos de Células de Trabajo Policlonales (pWCB) y Bancos de Células Maestras policlonales (pMCB).

Un pMCB que puede ser utilizado para el establecimiento de la línea celular de fabricación policlonal, mediante descongelación y expansión de los contenidos de una ampolla simple, puede ser generado a partir de una reserva congelada compuesta de líneas celulares individuales. Las líneas celulares individuales utilizadas para generar tal pMCB son ya sea obtenidas de i) un clon simple (como se describe en el Ejemplo 2), ii) una mezcla de clones simple (como se describe en el Ejemplo 2), o iii) un combinado de clones (un combinado de colonias simples obtenidas después de la selección). Los clones han sido obtenidos a partir de las células huésped individualmente transfeccionadas con, y seleccionadas para la expresión estable de un miembro individual de una proteína policlonal. La selección para la expresión estable es realizada mediante procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, utilizando genes marcadores de selección. En una modalidad preferida de la presente invención, las líneas celulares individuales son obtenidas a partir de células clonadas o subclonadas, por ejemplo, al someter una línea celular que se origina de i), ii) ó iii) a dilución límite o análisis de FACS de célula simple y selección, o mediante selección de los clones de alta expresión, por ejemplo, utilizando un robot como el ClonePix FL (véase más adelante). Las líneas celulares individuales utilizadas para generar el pMCB como se describe anteriormente, pueden ser prealmacenadas en una reserva de biblioteca congelada de las líneas celulares individuales, a partir de las cuales una ampolla de cada línea celular individual es descongelada y expandida antes de la generación de un pMCB. Preferentemente, las líneas celulares individuales expresan anticuerpos de longitud completa con propiedades que difieren de las propiedades de los anticuerpos producidos por los otros miembros del pMCB, por ejemplo, diferente especificidad de antígeno, diferente afinidad, diferentes regiones variables o CDR y/o diferentes regiones constantes.

Cada línea celular utilizada para generar el pMCB produce un miembro diferente de una proteína policlonal. Preferentemente, cada miembro distinto de la proteína policlonal se une a un antígeno particular. Adicionalmente, se prefiere que cada miembro distinto se produzca a partir de múltiples integrantes localizados en sitios aleatorios en el genoma de cada célula huésped. Un pMCB se genera al mezclar un número predefinido de células provenientes de cada línea celular individual. Preferentemente, las células se mezclan en números iguales (una proporción 1:1), aunque también pueden desearse otras proporciones (véase más adelante). La mezcla de células es congelada en alícuotas, ya que éstas son distribuidas en número de frascos con un número definido de células en cada frasco. Estos frascos son congelados y almacenados como pMCB para fines de fabricación posterior. Preferentemente, el número de frascos que constituyen el pMCB excede 10, 25, 50, 75, 100, 200, 500 ó 1000 frascos. Los frascos individuales en un pMCB pueden ser descongelados a puntos diferentes en el tiempo, generando diferentes lotes de la línea celular de fabricación policlonal, que son capaces de producir una proteína policlonal esencialmente con la misma composición de un lote a otro.

En un procedimiento alternativo de la presente invención, la línea celular de fabricación policlonal puede ser expandida a partir de un pWCB, el cual es derivado de un pMCB. El pWCB es generado mediante descongelación de un frasco simple a partir de un pMCB y expandiendo las células para un número de generaciones suficientes para producir un número total de células que pueden ser congeladas en una nueva serie de alícuotas (el pWCB), aproximadamente con el mismo número de células en cada alícuota de pWCB como en el frasco de pMCB originalmente utilizado para generar el pWCB. Cuando el pWCB ha sido agotado, es posible generar un nuevo pWCB a partir de una alícuota del pMCB. Este procedimiento requerirá por lo tanto una cantidad significativamente menor de trabajo que el que podría ser requerido para expandir las líneas celulares individuales provenientes de la reserva de la biblioteca congelada y mezclando un nuevo pMCB. Además, en el caso en que el pWCB se agote, la oportunidad de producir lotes adicionales de la línea celular de fabricación policlonal, sean capaces de producir una proteína policlonal esencialmente con la misma composición de lote a lote, se incremente.

Una ventaja de producir un pMCB al mezclar líneas celulares individuales que han sido obtenidas mediante transfección individual, esto es posible a realizar el análisis y las selecciones adicionales de las líneas celulares individuales transfeccionadas antes de la generación del pMCB. Esto puede asegurar una línea celular de fabricación policlonal más estable que cumpla los requerimientos de diversidad ya descritos. Además, la proteína policlonal puede ser fabricada de una manera más reproducible.

Lo que se dice a continuación respecto a pMCB también aplica a pWCB.

En una realización adicional de la presente invención, las líneas celulares individuales que han sido seleccionadas para la expresión estable de un miembro individual de una proteína policlonal como se describe anteriormente, son además caracterizadas con respecto a sus velocidades de proliferación y/o productividad antes de la generación de un pMCB. En una modalidad preferida, las líneas celulares con velocidades de proliferación y productividad similares, son seleccionadas para la generación de un pMCB. De manera más preferida, las líneas celulares con productividad similar, así como las velocidades de proliferación similares, se seleccionan para la generación del pMCB. Preferentemente, las líneas celulares que están adaptadas al cultivo en suspensión libre de suero, antes de la caracterización de las velocidades de proliferación y/o la productividad. Como alternativa, las células progenitoras utilizadas para la transfección son adaptadas al cultivo en suspensión libre de suero antes de la transfección.

Las velocidades de proliferación pueden ser evaluadas mediante procedimientos conocidos en la técnica. Las velocidades de proliferación para las líneas celulares de mamífero deben estar entre 18 y 100 horas, preferentemente entre 22 y 40 horas y lo más preferentemente entre 24 y 32 horas. La productividad debe exceder 0.5 pg de proteína por célula por día (pg/(célula*día)), preferentemente éste debe exceder 1, 1.5, 3, 5, 8, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, ó 100 pg/(célula*día). Además, la línea celular debe mostrar una población de células homogéneas con respecto a la expresión, cuando es evaluada por un procedimiento de tinción intracelular. Si se desea, una población de células más homogéneas para cada línea celular individual, puede ser obtenida mediante la clonación, por ejemplo, mediante los procedimientos de clasificación por FACS descritos en el presente documento.

En realizaciones adicionales de la presente invención, las líneas celulares individuales son clasificadas por FACS para identificar las células con un nivel de expresión homogéneo, después de los procedimientos de transfección y selección como se describen en el presente documento.

Los anticuerpos marcados fluorescentemente pueden ser utilizados para clasificar las células que expresan altos niveles de proteína deseada, por ejemplo, anticuerpo o TcR, con lo cual se crea una población celular homogénea con respecto a la productividad. Esta técnica está basada en la observación de que las proteínas secretadas pueden ser detectadas sobre la superficie de la célula que la secreta, y la cantidad de proteína superficial corresponde aparentemente con los niveles de expresión de la célula individual. Las células de alta producción pueden ser por lo tanto clasificadas por células simples, después de la tinción con un anticuerpo marcado, seguido por el análisis mediante FACS. La técnica ha sido descrita por Brezinsky (Brezinsky y col. J. 2003. Immunol Methods 277, 141-155).

Una técnica de clasificación alternativa está basada en el acoplamiento de un ligando, con especificidad a la proteína expresada a partir de las células, hacia la superficie de las células. Por ejemplo, un anticuerpo anti-Fc o un anticuerpo anti-idiotipo puede ser acoplado a la superficie de la población de células secretoras de proteína, por medio de biotina. Los anticuerpos secretados por una célula individual son luego capturados por los anticuerpos anti-Fc sobre la superficie de esa célula. Después de esto, las células de alta producción pueden ser clasificadas por FACS después de la tinción con un anticuerpo marcado. Esta técnica ha sido descrita en el documento EP 667 896.

Para obtener líneas celulares con niveles de expresión altos y homogéneos, las células simples que tienen un alto nivel de expresión son analizadas con base en el perfil de FACS obtenido de una de las técnicas descritas. Los clones celulares individuales son luego expandidos y potencialmente analizados con respecto a las velocidades de proliferación y a la productividad como se describió anteriormente. Alternativamente, un sub-ombinado de células que tienen el más alto nivel de expresión como es identificado por el perfil de FACS, es recolectado por clasificación. El subcombinado de células provenientes de la línea celular individual puede ser analizado de igual modo con respecto a las velocidades de proliferación y a la productividad, si se desea.

En una realización alternativa de esta invención, un robot tal como el robot ClonePixFL (Genetix, Reino Unido) es utilizado para seleccionar clones que muestran altos niveles de expresión y/o propiedades de crecimiento similares. Esto es realizado como sigue: las colonias obtenidas después de la transfección y la selección, son desarrolladas en un medio semi-sólido que permite la detección de las colonias de alta producción mediante captura del producto proteico secretado en la proximidad inmediata de la colonia. La producción proveniente de cada colonia es determinado por medio de marcación de inmunofluorescencia de la proteína expresada por las células, y seguido por la selección por software de imagen de los mejores clones, basado en los criterios de selección predeterminados tales como el nivel de expresión y las propiedades de crecimiento. Además, el tamaño (que refleja la velocidad de proliferación celular) de cada colonia puede ser evaluado por el robot utilizando imaginería de detección con luz. Las colonias con las propiedades deseadas de producción y/o crecimiento, son luego aisladas por el robot y transferidas a placas de 96 pocillos para la propagación posterior.

Preferentemente, las líneas celulares individuales con productividad similar son seleccionadas para la generación del pMCB. En una modalidad preferida, las líneas celulares individuales que constituyen el pMCB son generadas a partir de las células clonadas, por ejemplo, obtenidas mediante clasificación de células simples, dilución límite o recolección con robot, con un alto nivel de expresión o a partir de un combinado de células con alto nivel de expresión.

En la presente invención, ambas líneas celulares individuales obtenidas desde una colonia simple de células aisladas después de la transfección y selección, así como las líneas celulares individuales obtenidas de un clon obtenido por ejemplo, mediante clasificación por FACS de células simples, son denominadas líneas celulares clonadas. En una modalidad preferida, tales líneas celulares clonadas son utilizadas para generar el pMCB.

En realizaciones adicionales de la presente invención, las líneas celulares individuales son mezcladas a diferentes proporciones después de la generación de un pMCB. Las líneas celulares individuales pueden ser mezcladas de acuerdo a los criterios predeterminados con base en las propiedades de las líneas celulares individuales y/o el miembro de proteína individual expresado por la línea celular, por ejemplo, la productividad específica o la afinidad de enlace. Por ejemplo, las líneas celulares individuales que expresan ciertos anticuerpos que se unen a antígenos o epitopos particularmente críticos, pueden ser suministradas en exceso de las líneas celulares de los miembros remanentes del pMCB, por ejemplo, en cantidades 2 veces, 3 veces, 5 veces o 10 veces mayores. Un miembro de la línea celular puede ser por ejemplo agregado en una proporción de 2:1 sobre todos los otros miembros, por ejemplo, 4 x 106 células del miembro 1 y 2 x 106 células de cada una de las líneas celulares de los miembros remanentes.

Este enfoque de proporciones diferenciadas de las líneas celulares individuales en el pMCB, también puede adoptarse para evitar las diferencias en las velocidades de proliferación y la productividad entre las líneas celulares individuales, en particular si éstas no se han seleccionado para la similitud en estos rasgos. Por lo tanto, si una o más de las líneas celulares individuales tienen una velocidad de proliferación más lenta, por ejemplo, tiempos de duplicación más prolongados, en comparación con otros miembros del banco de células de trabajo policlonales que se caracterizan por una velocidad de proliferación más rápida, pero esta velocidad de proliferación más lenta no está asociada con la productividad alta particular, éste o estos miembros particulares pueden añadirse al pMCB en una cantidad mayor, para compensar su crecimiento lento. Por ejemplo, una línea celular con una velocidad de proliferación de 50 horas puede añadirse en una proporción 2:1 si las líneas celulares remanentes que constituyen el pMCB tienen velocidades de proliferación entre 22 y 30 horas. De igual modo, la proporción de las líneas celulares con tiempos de duplicación cortos puede reducirse para asegurar que éstas no tomarán el control durante la fabricación. Además, las proporciones de las líneas celulares individuales en un pMCB pueden ajustarse después del análisis de los productos proteicos policlonales producidos a partir de las líneas celulares de fabricación policlonales generadas a partir del pMCB. Tales ajustes pueden realizarse, por ejemplo, en base a los perfiles IEX o herramientas de caracterización equivalentes. Si tal análisis muestra que uno o más miembros proteicos particulares se ha producido en una mayor cantidad en comparación con los miembros remanentes, puede generarse un nuevo pMCB, en el que se ha reducido la proporción de las líneas celulares que producen estos miembros proteicos particulares. Y viceversa, si un miembro particular se produce en una cantidad baja, se puede generar un pMCB con una proporción incrementada de la línea celular que produce este miembro.

Sistemas de cultivo

La proteína policlonal recombinante de la invención puede fabricarse utilizando

cualquier modo de cultivo adecuado, incluidos, entre otros, los procesos por lotes, lote alimentado y de perfusión.

Establecimiento de un sistema de expresión para la expresión de proteína de alto nivel

Los procedimientos para introducir una secuencia de ácido nucleico dentro de una célula son conocidos en la materia. Estos procedimientos incluyen, típicamente, el uso de un vector de ADN para introducir la secuencia de interés dentro de la célula, el genoma o un elemento extra-cromosómico. La transfección de las células puede efectuarse mediante una serie de procedimientos conocidos por los expertos en la materia, que incluyen lipofección, transfección químicamente mediada, precipitación con fosfato cálcico, electroporación, microinyección, fusión de liposomas, fusión de glóbulos rojos (RBC, por sus siglas en inglés), fantasma, fusión de protoblastos, transducción de virus, y similares.

Para la transfección de una línea celular huésped, se usa una biblioteca de vectores de interés, en donde cada vector comprende únicamente una copia de una secuencia de ácido nucleico que codifica un miembro de una proteína policlonal recombinante de interés. Esta biblioteca de vectores de expresión de interés codifica colectivamente la proteína policlonal recombinante de interés. Los vectores adecuados para la integración se han descrito en la sección previa.

La generación de una línea celular de fabricación policlonal, recombinante, y la producción de una proteína policlonal recombinante a partir de cada línea celular, pueden obtenerse mediante diferentes estrategias de transfección y fabricación.

Una manera preferida de transfección ilustrada en la Figura 1 es un procedimiento de alto rendimiento en el cual las células huésped son transfeccionadas por separado usando los vectores individuales que constituyen la biblioteca de interés. Este procedimiento se denomina transfección individual. Las células huésped transfeccionadas individualmente se seleccionan, preferentemente, por separado. Sin embargo, éstas pueden también combinarse antes de la selección. Los clones celulares individuales generados después de la selección pueden analizarse con respecto al nivel de expresión, la velocidad de proliferación y el patrón de integración y, preferentemente, aquéllos con velocidades de crecimiento similares, número de copias similares, expresión similar y/o niveles de solidez similares pueden usarse para generar una reserva de biblioteca GOI policlonal. Los clones de células individuales pueden mezclarse para obtener la línea celular policlonal deseada antes de la generación de la reserva, inmediatamente después de que éstos han sido recuperados de la reserva, o después de un tiempo de proliferación y adaptación cortos. Este procedimiento puede mejorar adicionalmente la estabilidad de la composición.

En circunstancias de transfección que permiten la integración de más de una copia

dentro de cada célula, puede usarse la transfección a granel usandomezclas de vectores de expresión, si la proteína policlonal es un monómero. Para proteínas multiméricas, tal transfección a granel que permite la integración múltiple dentro del genoma de una célula huésped, podría dar como resultado el entremezclado de las subunidades. En muchos casos, tal como en la fabricación del anticuerpo policlonal recombinante para uso farmacéutico, debe evitarse el entremezclado. Para proteínas multiméricas, puede realizarse transfección a granel si el entremezclado es aceptable o si la transfección se lleva a cabo en condiciones que aseguren la integración de únicamente una copia dentro del genoma de cada célula huésped. Ejemplos de tales procedimientos incluyen transducción retroviral y fusión esferoblástica. Los vectores individuales que constituyen la biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos variantes de interés, pueden mezclarse entre sí en una composición única o, preferentemente, los vectores individuales que codifican cada miembro de biblioteca se pueden mantener en composiciones separadas o en mezclas de aproximadamente 5 a 50 vectores individuales de la biblioteca en una composición.

Otra manera es utilizar una biblioteca de vectores divididos en fracciones, que contienen aproximadamente 5 a 50 vectores individuales de la biblioteca en una composición, para la transfección. Preferentemente, una fracción de la biblioteca constituye 10 a 20 vectores individuales. Después, cada composición se transfecciona en una alícuota de las células huésped. Este procedimiento se denomina transfección a semi-granel. El número de alícuotas protectoras dependerá del tamaño de la biblioteca y del número de vectores individuales en cada fracción. Si la biblioteca está constituida por, por ejemplo, 100 miembros variantes distintos, divididos en fracciones que contienen 20 miembros variantes distintos en una composición, tendrían que transfeccionarse 5 alícuotas de las células huésped con una composición de la biblioteca que constituye una fracción distinta de la biblioteca original. Las alícuotas de las células huésped se seleccionn después de la transfección. Preferentemente, las alícuotas distintas se seleccionan por separado. Sin embargo, éstas pueden también combinarse antes de la selección. Las alícuotas pueden analizarse según su diversidad clonal y sólo se usarán para generar una reserva de biblioteca GOI policlonal aquéllas con diversidad suficiente.

Una reserva congelada de la línea celular policlonal puede generarse antes del inicio de la fabricación de la proteína policlonal recombinante. Para obtener la línea celular policlonal deseada para la fabricación, los clones pueden mezclarse antes de la generación de la reserva de congelación, inmediatamente después de que ésta ha sido recuperada de la reserva, o después de un tiempo corto de proliferación y adaptación.

Una característica compartida en las estrategias de fabricación descritas en lo anterior

es que todos los miembros individuales que constituyen la proteína policlonal recombinante pueden producirse en uno o un número limitado de recipientes, tales como biorreactores, con aproximadamente 10 como el máximo.

Si los niveles de expresión necesitan ser incrementados, la amplificación génica puede

5 ser realizada utilizando selección para un gen de DHFR o un gen de la glutamina-sintetasa (GS), un gen de la hprt (hipoxantina-fosforribosiltransferasa) o un gen de la triptófano sintetasa. Esto requiere el uso de vectores que comprenden tal marcador de selección. Una característica particular de la presente invención es mantener el número de copias relativamente bajo, con el fin de mantener alta la estabilidad de las células. Por lo tanto, las

10 células son preferentemente solo sometidas a una ronda de selección bajo presión de selección relativamente modesta en el medio libre de nucleósido con una baja concentración de MTX (por ejemplo, 1-10 nM) para el tipo de constructo utilizado en los ejemplos. Tal presión de selección modesta se cree que conduce a un número de copias relativamente bajo. Se cree que la presión de selección modesta conduce a un número equilibradp de copias, dando como

15 resultado una alta expresión, al tiempo que se evita la inestabilidad de las células con número de copias muy alto. Con el fin de alcanzar niveles de expresión más altos, la línea celular utilizada para la expresión incluye preferentemente un transactivador heterólogo capaz de mejorar el promotor que controla la expresión de la proteína policlonal. Los ejemplos de combinaciones adecuadas

20 de transactivador y promotor se mencionan en la siguiente tabla (Tabla 2).

Tabla 2. Ejemplos de pares transactivadores/promotor

Transactivador: Ejemplos de promotores Comentarios

Lentivirus Tat: Repetición terminal larga (LTR)

Adenovirus E1A: Potenciador/promotor de IE principal de HCMV

Virus herpes simples VP16: Promotor del gen del virus herpes simples es IE175 Documento US 6,635,478

Proteína X del virus de la hepatitis B (HBx): SV40 temprano

Proteínas sintéticas de dedo de Zn: sintético Sangamo Inc.

Antígeno largo T de SV40: Promotor tardío del SV40

Transactivadores controlados por tetraciclina (tTA): Sintético Fusiones sintéticas

IE2p86 del citomegalovirus humano: Aumentador/promotor IE mayor del HCMV

IE1p72 del citomegalovirus humano: Aumentador/promotor IE mayor del HCMV

Transactivador R del virus de Epstein-Barr (Rta): Promotor del EBV

Receptor de hormona tiroidea: Promotor de la hormona de crecimiento

Receptor de la hormona glucocorticoide: Promotor del virus tumoral mamario (MMTV)

Preferentemente, la línea celular es transfeccionada con un constructo de expresión que codifica el transactivador, y los clones son seleccionados utilizando dilución límite u otros procedimientos para la clonación de células simples. El vector de expresión puede comprender elementos tales como, promotores, el marcador de selección, etc., como se describe para los

5 vectores de expresión de la presente. Preferentemente, el promotor que controla la expresión del transactivador es un promotor constitutivo tal como el promotor del factor 1 de alargamiento, el promotor del CMV, el promotor de la metalotioneína-1 o similar. En una modalidad preferida, el promotor es el promotor del CMV.

Particularmente preferido el uso del transactivador de la E1A adenoviral, el cual parece

10 estabilizar las células por si solo además de la transactivación de un promotor de CMV que controla la expresión del gen de interés. Como se mencionó en otro sitio, la expresión de E1A no fue detectable en la primera línea celular producida, ECHO. Por lo tanto, el vínculo entre E1A y la estabilización de las células no ha sido probado por los presentes experimentos. Para la fabricación de una proteína policlonal, donde cada miembro proteico está

15 comprendido de más de dos cadenas polipeptídicas, la combinación de las cadenas puede ser importante para la afinidad, especificidad y actividad de la proteína que éstos forman. Esto es observado por ejemplo para los anticuerpos y los TcR. Por ejemplo, es la combinación de la cadena pesada variable del anticuerpo y la cadena ligera variable del anticuerpo la que se sabe afectar la afinidad y la especificidad de un anticuerpo formado a partir de las cadenas. De este modo, cuando una biblioteca de secuencias de codificación del anticuerpo ha sido seleccionada por su habilidad para producir anticuerpos con afinidad a un cierto objetivo. Es deseable asegurar que la combinación de la cadena pesada variable y la cadena ligera variable en el producto final, corresponda a ésta. Por esta razón, las cadenas polipeptídicas que constituyen un miembro individual de la proteína policlonal, son preferentemente colocadas en el mismo vector utilizado para la integración, con lo cual se asegura que éstas sean mantenidas juntas a todo lo largo del proceso. Alternativamente, las células huésped pueden ser transfeccionadas con pares de vectores de expresión que codifican para pares cognados de cadena pesada y ligera.

La siguiente descripción es un ejemplo de cómo obtener una línea celular que expresa el anticuerpo policlonal recombinante.

Un casete promotor universal para la expresión constitutiva que tiene dos promotores colocados en dirección transcripcional opuesta, tal como un constructo directo rodeado con la cadena pesada variable y la totalidad de la cadena ligera kappa o lambda, puede ser construida, permitiendo la transferencia del constructo completo dentro de un vector que comprende un marcador de selección y la región constante de cadena pesada. Se contempla que un casete promotor para la expresión inducible pueda ser también utilizado. Además, los promotores pueden ser colocados cola con cola, lo cual dará como resultado la transcripción en la dirección opuesta, o cola con cabeza para la transcripción unidireccional. Un promotor inducible puede ser también utilizado para el control de la expresión. Después de la transfección, las células son preferentemente cultivadas bajo condiciones selectivas para seleccionar transformantes estables.

Las células que sobreviven bajo estas condiciones pueden ser subsecuentemente desarrolladas en diferentes sistemas de cultivo, tales como matraces de cultivo pequeños, convencionales, fábricas de células de capas múltiples Nunc, biorreactores pequeños de alto rendimiento (MiniPerm, INTEGRA-CELLine), agitadores, y matraces giratorios de fibra hueca – y bolsas WAVE de biorreactores (Wave Biotech, Tagelswangen, Suiza) u otros recipientes/contenedores desechables. Las células pueden ser probadas para la producción de anticuerpos utilizando ELISA. Las líneas celulares policlonales son preferentemente seleccionadas para la viabilidad en crecimiento en suspensión en medio libre del suero, bajo presión selectiva por periodos prolongados.

Evaluación para la preservación de la policlonalidad en el sistema de la expresión

De acuerdo a la presente invención, es a menudo importante asegurar que la policlonalidad en el sistema de expresión no se vea alterada seriamente durante la producción, de modo que es posible detener la producción cuando la policlonalidad se altera. Esto es de acuerdo a la invención, realizado por el monitoreo de los niveles de expresión relativos de la secuencia de ácido nucleico variantes. Los niveles de expresión pueden ser por ejemplo monitorizados a nivel de ARNm, utilizando por ejemplo el análisis RFLP, el arreglo de PCR en tiempo real, o al nivel de las proteínas utilizando por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional, espectrometría de masa, o diversas técnicas cromatográficas. Con estas técnicas será posible establecer un valor de línea base para un número de todos los niveles de expresión individuales y luego recoger las muestras provenientes del cultivo durante la producción, con el fin de medir si los niveles de expresión han o no cambiado (en total y de manera relativa). En la práctica normal de la invención, puede ser establecido un intervalo de valores que rodean los valores de línea base, y si los niveles de expresión relativos son encontrados fuera de estos intervalos, entonces la producción se termina.

Cultivo de células y producción de un anticuerpo policlonal recombinante

La línea celular policlonal producida como se describió anteriormente puede ser desarrollada en medios adecuados bajo condiciones adecuadas, para la expresión de la proteína policlonal de interés codificada por las secuencias variantes de ácido nucleicos insertadas dentro del genoma de las células. El cultivo celular puede ser realizado en varios pasos. Cuando se utilizan células de mamífero, las células seleccionadas son preferentemente adaptadas al crecimiento de suspensión, así como a las condiciones libres de suero. La adaptación al crecimiento en medio libre de suero puede ser también ventajosamente realizada antes del mezclado de las líneas celulares clonadas para la línea celular policlonal. La adaptación puede ser realizada en uno o dos pasos con o sin presión de selección. Preferentemente, un sistema de selección es utilizado el cual permite la selección a todo lo largo del periodo de fabricación sin comprometer la pureza del producto farmacológico fabricado. En general, para la fabricación de las proteínas recombinantes para el uso farmacéutico se prefiere no utilizar, por ejemplo, antibióticos u otros fármacos de bajo peso molecular para proporcionar presión de selección, ya que será necesario validar si el producto final no contenga restos del antibiótico.

Cuando la línea celular policlonal está adaptada a las condiciones apropiadas puede ser iniciada la elevación de escala. En este punto, una reserva de células de trabajo policlonales (banco de células de trabajo policlonales, pWCB) y/o un banco de células maestras policlonales (pMCB) pueden ser congelados. Preferentemente, los biorreactores de entre 30 y 100 litros son utilizados, pero pueden ser empleados biorreactores más pequeños (5-10 litros)

o más grandes (hasta 1,000, 5,000, 10,000, 15,000 litros, o incluso más grandes). El tiempo de producción adecuado y la elección del tamaño del biorreactor son dependientes del rendimiento deseado de la proteína a partir del lote y los niveles de expresión a partir de la célula. Los tiempos pueden variar de un par de días hasta tres meses. La proteína policlonal recombinante expresada puede ser recuperada de las células o del sobrenadante. La proteína recombinante puede ser purificada y caracterizada de acuerdo a los procedimientos conocidos por una persona experta en la materia. Los ejemplos de procedimiento de purificación son ilustrados más adelante. Los ejemplos de procedimientos de caracterización pueden ser encontrados en, por ejemplo, el documento WO 2006/007853.

Purificación de una proteína policlonal recombinante a partir del sobrenadante de cultivo

El aislamiento de proteínas específicas a partir de sobrenadantes de cultivo, es posible utilizando diversas técnicas cromatográficas que utilizan diferencias en las propiedades fisicoquímicas de las proteínas, por ejemplo, diferencias en el peso molecular, la carga neta, la hidrofobicidad, o la afinidad hacia un ligando o proteína específica. Las proteínas pueden ser de este modo separadas de acuerdo al peso molecular utilizando cromatografía de filtración en gel o de acuerdo a la carga neta utilizando cromatografía de intercambio iónico (catiónico/aniónico) o alternativamente utilizando cromatoenfoque. Similarmente, las proteínas pueden ser separadas de acuerdo a la hidrofobicidad utilizando interacción hidrofóbica o cromatografía de inducción de carga o cromatografía de afinidad utilizando diferencias en la afinidad hacia un ligando o proteína inmovilizado específico. La separación de mezclas complejas de proteínas puede ser de este modo lograda mediante combinación secuencial de diversos principios cromatográficos. Una mezcla de proteínas puede de este modo ser inicialmente separada de acuerdo a, por ejemplo, la carga neta utilizando cromatografía de intercambio iónico y proteínas de carga neta similar pueden ser subsecuentemente separadas de acuerdo al peso molecular utilizando cromatografía de filtración en gel o después de la hidrofobicidad utilizando cromatografía de interacciones hidrofóbicas en presencia de una alta concentración de una sal seleccionada.

La cromatografía de afinidad combinada con los pasos de purificación subsiguientes tales como la cromatografía de intercambio iónico, interacciones hidrofóbicas y filtración en gel, ha sido utilizada frecuentemente para la purificación de IgG (policlonal así como monoclonal) y TcR proveniente de diferentes fuentes, por ejemplo, fluido de ascitis, sobrenadantes de cultivo celular y suero. La purificación de afinidad, donde la separación está basada en una interacción reversible entre la o las proteínas y un ligando específico acoplado a una matriz cromatográfica, es un procedimiento fácil y rápido, el cual ofrece alta selectividad, usualmente alta capacidad y alta concentración en un volumen más pequeño. La proteína A y la proteína G, dos proteínas de la superficie celular bacteriana, tienen alta afinidad por la región Fc de los anticuerpos, y en una forma inmovilizada, han sido utilizados para muchas aplicaciones rutinarias, incluyendo la purificación de IgG policlonal y sus subclases provenientes de diversas especies y absorción y purificación de complejos inmunitarios.

Después de la cromatografía de afinidad, pueden ser realizados los pasos de cromatografía con dirección 3’, por ejemplo, la cromatografía de interacción hidrofóbica y la cromatografía de intercambio iónico, para retirar las proteínas de la célula huésped, la proteína A fugada y el ADN.

La filtración en gel, como una etapa de purificación final puede ser utilizada para retirar moléculas contaminantes tales como dímeros y otros agregados, y transferir la muestra hacia el amortiguador de almacenamiento. Dependiendo de la fuente y las condiciones de expresión puede ser necesario incluir un paso de purificación adicional para lograr el nivel requerido de pureza del anticuerpo. La cromatografía de interacción hidrofóbica o la cromatografía de intercambio iónico son de este modo frecuentemente utilizadas, en combinación con la cromatografía de proteína A y de filtración en gel para purificar los anticuerpos para el uso terapéutico.

Con el fin de facilitar la purificación, es preferible que todos los miembros del anticuerpo policlonal compartan la misma región constante de la cadena pesada y/o ligera.

Con el fin de purificar otras clases de anticuerpos, tienen que ser utilizados medios de cromatografía de afinidad alternativos ya que las proteínas A y G no se unen a IgA e IgM. Una purificación de inmunoafinidad puede ser utilizada (los anticuerpos monoclonales anti-IgA o anti-IgM acoplados a la fase sólida) o, alternativamente, se pueden emplear estrategias de purificación de etapas múltiples, incluyendo el intercambio iónico y interacción hidrofóbica.

Caracterización Estructural

La caracterización estructural de las proteínas policlonales tales como anticuerpos y TcR requiere alta resolución debido a la complejidad de la mezcla (diversidad clonal y glucosilación). Los procedimientos tradicionales tales como la filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico o electroforesis puede no tener suficiente resolución para diferenciarse entre los anticuerpos individuales. La electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2DPAGE) ha sido utilizado para perfilamiento de mezclas de proteínas complejas, seguida por la espectrometría de masa (EM) o la cromatografía líquida (CL)-EM (por ejemplo, proteómicos).

2D-PAGE, que combina la separación con base en la carga y la masa de una proteína, ha probado ser útil para diferenciar entre la inmunoglobulina policlonal oligoclonal y monoclonal en muestras de suero. Sin embargo, este procedimiento tiene ciertas limitaciones. Las técnicas cromatográficas, en particular, capilar y CL acoplada a EM de ionización por electropulverización, son aplicadas cada vez más para el análisis de mezclas peptídicas complejas. CL-EM ha sido utilizada para la caracterización de los anticuerpos monoclonales. El análisis de muestras muy complejas requiere más poder de resolución del sistema cromatográfico, que puede ser obtenido por separación en dos dimensiones (o más). Tal procedimiento podría ser utilizado en el intercambio iónico en la primera dimensión y la cromatografía de fase inversa (o interacción hidrofóbica) en la segunda dimensión opcionalmente acoplada al EM.

Caracterización Funcional

Una proteína policlonal puede ser por ejemplo caracterizada funcionalmente a través de estudios de comparabilidad con proteínas policlonales con especificidad hacia el mismo objetivo o una actividad similar. Tales estudios pueden ser realizados in vitro así como in vivo.

Una caracterización funcional in vitro de un anticuerpo policlonal podría ser por ejemplo la inmunoprecipitación que es una técnica altamente específica para la separación analítica de antígenos objetivo a partir del lisado de células crudas. Al combinar la inmunoprecipitación con otras técnicas, tales como SDS-PAGE seguido por la tinción de proteína (Azul de Coomassie Blue, tinción con plata o marcación con biotina) y/o la inmunotransferencia, es posible detectar y cuantificar los antígenos, por ejemplo, y de este modo evaluar algunas propiedades funcionales de los anticuerpos. Aunque este procedimiento no da un estimado del número de moléculas del anticuerpo ni sus afinidades de enlace, éste proporciona una visualización de las proteínas objetivo y de este modo la especificidad. Este procedimiento puede ser utilizado de igual modo para monitorizar las diferencias potenciales de los anticuerpos hacia los antígenos (la integridad de la diversidad clonal) durante el proceso de expresión.

Una caracterización funcional in vivo de un anticuerpo policlonal podría ser ejemplo los estudios de infección. Un animal experimental tal como un ratón puede ser por ejemplo insertado con un virus específico, hacia el cual ha sido desarrollado un anticuerpo policlonal. El grado al cual puede ser inhibida la infección indicará la funcionalidad del anticuerpo policlonal.

Composiciones terapéuticas

Una composición farmacéutica que comprende una proteína policlonal recombinante seleccionada de la superfamilia de inmunoglobulina como su ingrediente activo está destinada

para el tratamiento o prevención de una enfermedad en un mamífero.

Preferentemente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo policlonal recombinante o un fragmento de anticuerpo como el ingrediente activo y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

También se prefiere una composición farmacéutica comprende un receptor de célula T policlonal recombinante o un fragmento del receptor de célula T como el ingrediente activo, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son preparadas de una manera conocida per se, por ejemplo, por medio de disolución convencional, liofilización, mezclado, granulación o procesos de confeccionamiento. Las composiciones farmacéuticas pueden ser formuladas de acuerdo a la práctica farmacéutica convencional (véase,por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York, NY).

Las soluciones del ingrediente activo, y también las suspensiones, y especialmente las soluciones o suspensiones acuosas isotónicas, son preferentemente utilizadas, siendo posible, por ejemplo en el caso de las composiciones liofilizadas que comprenden el ingrediente activo solo o junto con un portador, por ejemplo manitol, que tales soluciones o suspensiones sean producidas antes del uso. Las composiciones farmacéuticas pueden ser esterilizadas y/o pueden comprender excipientes, por ejemplo conservadores, estabilizadores, agentes humectantes y/o emulsionantes solubilizadores, sales para regular la presión osmótica y/o los amortiguadores, y son preparados de una manera conocida per se, por ejemplo por medio de procesos convencionales de disolución o liofilización. Las soluciones o suspensiones pueden comprender sustancias que incrementan la viscosidad, tales como carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa, dextrano, polivinilpirrolidona o gelatina.

Las composiciones para inyección son preparadas de forma habitual en condiciones estériles; lo mismo aplica también a la introducción de las composiciones dentro de ampollas o frascos y el sellado e los recipientes.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender desde aproximadamente 1% hasta aproximadamente 95%, preferentemente de aproximadamente 20% hasta aproximadamente 90% del ingrediente activo. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención puede ser, por ejemplo, en forma de dosis unitaria, tal como en la forma de ampolLas, frascos, supositorios, grageas, comprimidos o cápsulas.

Usos terapéuticos de las composiciones

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención pueden ser pueden ser utilizadas de acuerdo al tratamiento, mejoramiento o prevención de una enfermedad en un mamífero. Las enfermedades que pueden ser tratadas con las presentes composiciones farmacéuticas incluyen cáncer, afecciones infecciosas, enfermedades inflamatorias, alergia, asma y otras enfermedades respiratorias, enfermedades auto-inmunitarias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades en el sistema nervioso central, enfermedades metabólicas y endocrinas, rechazos de trasplante y embarazo no deseado.

Las composiciones se pueden usar en un procedimiento para el tratamiento, mejora o profilaxis de enfermedades en un animal, en donde se administra una cantidad efectiva del anticuerpo policlonal recombinante o el fragmento de anticuerpo o en donde que se administra en una cantidad efectiva del receptor de células T policlonal recombinante o el fragmento del receptor de células T.

Un anticuerpo policlonal recombinante o un receptor de célula T policlonal recombinante

o fragmentos de anticuerpo o receptores de células T se puede usar adicionalmente para la preparación de una composición para el tratamiento de enfermedades seleccionadas de un grupo que consiste de un cáncer, una infección, una enfermedad inflamatoria, una alergia, asma y otras enfermedades respiratorias, mal funcionamientos inmunitarios, unas enfermedades auto-inmunitarias, una enfermedad cardiovascular, una enfermedad en el sistema nervioso central, una enfermedad metabólica, una enfermedad endocrina, rechazo de transplante, y embarazo no deseado.

Uso y diagnóstico y uso de detección ambiental

Los kits de diagnóstico y los kits para uso en detección ambiental pieden comprender una proteína policlonal recombinante preparada de acuerdo a la invención, cuya proteína puede estar marcada con un marcador detectable o no marcada para la detección sin marcador. Si está marcada, la proteína policlonal recombinante presente puede ser agregada a una muestra sospechosa de contener la molécula objetivo, y la presencia o ausencia del marcador indica la presencia o ausencia de la molécula objetivo. La muestra que va a ser probada puede ser una muestra de fluido corporal tal como sangre, suero, plasma, fluido espinal, linfa u orina o una muestra no de mamífero tal como una muestra proveniente de una fuente ambiental sospechosa de albergar un contaminante. Las muestras no de mamífero pueden ser agua, aire, o tierra contaminada. La detección sin marcador comprende la medición del cambio de refracción en BIAcore después del enlace, en donde la proteína policlonal recombinante es utilizada para capturar la molécula objetivo.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 Derivación de clones de células CHO que expresan anticuerpos

Vector de expresión

El vector de expresión de IgG utilizado se muestra en la Figura 2a. El vector de expresión E1A se muestra en la Figura 2b.

Línea celular

La línea celular utilizada es un derivado de la línea celular CHO DG44 negativa para DHFR obtenida de Lawrence Chasin, Universidad de Columbia (también disponible de Gibco cat # 12613-014). Las células DG44 fueron transfeccionadas con un ADNc para la versión 13S del transactivador E1A del adenovirus tipo 5 (NCBI nº de registro. AY339865, secuencia de ADNc: atgagacatattatctgccacggaggtgttattaccgaagaaatggccgccagtcttttggaccagctgatcgaagaggtactggctg ataatcttccacctcctagccattttgaaccacctacccttcacgaactgtatgatttagacgtgacggcccccgaagatcccaacgag gaggcggtttcgcagatttttcccgactctgtaatgttggcggtgcaggaagggattgacttactcacttttccgccggcgcccggttct ccggagccgcctcacctttcccggcagcccgagcagccggagcagagagccttgggtccggtttctatgccaaaccttgtaccggag gtgatcgatcttacctgccacgaggctggctttccacccagtgacgacgaggatgaagagggtgaggagtttgtgttagattatgtg gagcaccccgggcacggttgcaggtcttgtcattatcaccggaggaatacgggggacccagatattatgtgttcgctttgctatatga ggacctgtggcatgtttgtctacagtcctgtgtctgaacctgagcctgagcccgagccagaaccggagcctgcaagacctacccgcc gtcctaaaatggcgcctgctatcctgagacgcccgacatcacctgtgtctagagaatgcaatagtagtacggatagctgtgactccgg tccttctaacacacctcctgagatacacccggtggtcccgctgtgccccattaaaccagttgccgtgagagttggtgggcgtcgccag gctgtggaatgtatcgaggacttgcttaacgagcctgggcaacctttggacttgagctgtaaacgccccaggccataa) en el vector pcDNA3.1+ (Cat # V790-20, Invitrogen). Los transfectantes fueron seleccionados con Geneticina (Invitrogen) a una concentración de 500 µg/ml. Después de la selección, las células fueron clonadas por célula simple mediante dilución límite. Los clones se sometierona ensayo para determinar la transactivación del promotor del CMV (expresión mejorada) mediante transfección transitoria con un plásmido de anticuerpo (mostrado arriba). Un clon simple mostró un nivel de expresión en el ensayo transitorio que fue mejorado por un factor de 3 en comparación a la línea celular DG44 no transfeccionada. El nivel de expresión incrementado no es evidente de transactivación efectiva y podría ser provocado por la selección de un subclon de expresión particularmente alta. En comparaciones realizadas con la transfección estable, los combinados seleccionados mostraron un nivel de expresión incrementado de 4-5 veces en comparación a la línea celular DG44 de tipo silvestre. Este clon (denominado ECHO) fue subclonado dos veces y pareció ser estable con respecto a la transactivación del promotor del CMV (expresión mejorada). La transactivación efectiva del promotor de CMV no fue medida, pero el clon mostró sin embargo alta expresión estable del anticuerpo bajo el control del promotor del CMV.

Plásmidos de expresión de anticuerpo

Los plásmidos de expresión del anticuerpo utilizado fueron construidos como se mostró anteriormente. Para este propósito, 6 anticuerpos diferentes dirigidos contra diferentes proteínas de la superficie del virus de la Vaccinia, fueron elegidos. Estos fueron elegidos debido a que cada uno de ellos tiene un perfil muy característico en la forma de intercambio iónico, haciendo posible una identificación y cuantificación en mezclas de diferentes anticuerpos. Los anticuerpos (desvelados en el documento en tramitación PCT/DK2006/000686 presentada el 4 de Diciembre del 2006, titulado "Anticuerpo policlonal recombinante anti-ortopoxvirus", publicada como WO 2007/065433) fueron:

•: Sym002-037 (clon 002-037)

•: Sym002-186 (clon 002-186)

•: Sym002-235 (clon 002-235)

•: Sym002-286 (clon 002-286)

•: Sym002-303 (clon 002-303)

•: Sym002-482 (clon 002-482)

ELISA de IgG

La IgG se midió mediante ELISA de tipo sándwich. En resumen, placas de 96 pocillos (Maxisorp, NUNC) fueron recubiertas con Fc de cabra anti-humano (Serotec, STAR106) seguido por la incubación con muestras y el estándar (anticuerpo monoclonal IgG1 kappa humano, purificado). La detección fue realizada con cadenas ligeras anti-kappa humana, de cabra, conjugadas con peroxidasa de rábano (Serotec STARlOOP).

Transfección de células ECHO

Las células ECHO fueron sembradas en matraces T80 a una densidad de 0.30*106 células/matraz en medio MEM alfa con nucleósidos (Invitrogen cat. no. 32571) con 10% de suero fetal de ternera (FCS) (Invitrogen). Dentro de una hora desde la siembra, las células fueron con Fugene6 (Roche):

•: 10 µl de Fugene6 se mezclan con 490 µl de medio Eagle Modificado de Dulbecco y se dejan incubar por 5 minutos, a temperatura ambiente

•: Se añaden 5 µg del plásmido de expresión y la mezcla se incuba por 15 minutos

adicionales, a temperatura ambiente 5 • La mezcla se añade al matraz de cultivo celular

Un día después se aspiró el medio con los reactivos de transfección, cada matraz fue lavado una vez con 5 ml de medio MEM alfa (sin nucleósidos) con 10% de FCS dializado (Invitrogen) (MEMalfa-) y 10 ml del mismo medio fueron agregados junto

10 con el metotrexato a una concentración de 2 nM. Después de esto, el medio fue cambiado dos veces a la semana. Después de 15 días, las células se sometieron a tripsinización y todas las células se transfirieron a nuevos matraces. Después de 2 días adicionales de cultivo, el medio fue cambiado y al siguiente día el medio fue aspirado, las células

15 fueron contadas y las productividades fueron medidas en ELISA de IgG ELISA. Los resultados se muestran en la Tabla 3. Las productividades son calculadas como picogramos por célula por día utilizando el número de células al tiempo de

la cosecha.

Anticuerpo

Sym002-037 Sym002-186 Sym002-235 Sym002-286 Sym002-303 Sym002-482

Concentración de IgG, µg/ml

3,65 8,15 5,71 1,39 11,4 17,0

Tabla 3.

IgG total

36,5 81,5 57,2

13.9 114 170

Número de: Productividad,

células, *106: picogramos por

célula por día

3,0: 12,2

6,0: 13,6

3,3: 17,3

0,8: 17,4

9,4: 12,1

12,5: 13,6

Las cuentas celulares, el contenido de IgG en el medio, y las productividades celulares

específicas de los combinados transfeccionados

Para la producción de los clones de células simples, las células en los combinados fueron teñidas para el anticuerpo asociado a la superficie y clasificadas por célula simple en placas de 96 pocillos que contenían 50% de medio condicionado de células ECHO (MEMalfa-) y 50% del mismo medio sin acondicionamiento. En resumen, el protocolo de tinción fue el siguiente:

1.: Las células se someten a tripsinización y se realiza su recuento

2.: Se transfieren con pipeta 1-5 x 106 células hacia un tubo FACS estéril

3.: Se centrifugan las células por 1 minuto a 250 g a 4ºC y se retiran el sobrenadante

4.: Se lavan las células en 2 ml de FACS PBS estéril (PBS + 2% FCS) (5 ml)

5.: Se tiñen las células con (fragmento F(ab)2 de cabra anti-IgG humano H + L -PE (Beckman-Coulter, IM1626) diluido 1:20 en 100 µl de Ab diluido/106 células y se incuba por 20 minutos (4ºC en la oscuridad)

6.: Se lavan las células dos veces en 2 ml de FACS PBS (5 ml)

7.: Se resuspenden a 1-5 x 106/ml en FACS PBS (2 ml)

8.: Se añade yoduro de propidio, 10 µg/ml 1:100

Se estableció una entrada adecuada y las células fueron clasificada por célula simple en placas de 96 pocillos (5 placas por anticuerpo) utilizando un FACS-Aria (Beckton-Dickinson).

Después de aproximadamente 1 semana, los pocillos fueron inspeccionados por microscopio para la presencia de los clones simples.

Después de aproximadamente 2 semanas los sobrenadantes provenientes de los pocillos con un clon simple fueron evaluados cada uno en una dilución simple mediante ELISA y basados en el valor de ELISA y la inspección visual de los pocillos, fueron seleccionados 24 clones que representan cada anticuerpo, para el cultivo continuo. Los clones fueron seleccionados utilizando inspección visual para el número de células y la morfología, combinado con una selección para el nivel de expresión del anticuerpo. Los clones seleccionados fueron adicionalmente probados en un ensayo de escape: en resumen, las células fueron sembradas en placas de 24 pocillos y se dejaron desarrollar hasta que la mayoría de las células estuvieron muertas. Los sobrenadantes fueron evaluados mediante ELISA y los 10 clones superiores para cada anticuerpo fueron seleccionados para la adaptación al cultivo en suspensión sin suero.

Adaptación al cultivo en suspensión libre de suero

Las células se sometieron a tripsinización y se realizó su recuento. 5*106 células fueron centrifugadas y resuspendidas en 10 ml de medio ProCHO4 libre de suero (Cambrex). Las células fueron transferidas a tubo de cultivo celular de 50 ml (TRP, Suiza) e incubadas en un agitador a 37°C. Las densidades celulares fueron contadas dos veces a la semana y cada vez los cultivos fueron diluidos a 0.5*106 células por ml (para las primeras 2 semanas) o a 0.3*106 células por ml (para el periodo restante). Después de 4-5 semanas el tiempo de duplicación para la mayoría de los clones fue de aproximadamente 30 horas, punto de tiempo en el cual se consideró que éstos estaban adaptados al cultivo libre de suero.

Al final del periodo de adaptación, las células fueron evaluadas mediante ELISA, congeladas en medio de cultivo con 10% de DMSO y utilizadas para experimentos de expresión (véase Ejemplo 2 más adelante).

EJEMPLO 2

Experimentos de expresión

Para probar la estabilidad de la composición de los cultivos mixtos a largo plazo, se prepararon un número de mezclas de los clones. Con base en los conteos realizados durante el periodo de adaptación, el tiempo de duplicación fue tomado en consideración al grado posible. Se tuvo cuidado en hacer concordar los clones con el tiempo de duplicación similar. Conjuntamente, se prepararon 9 mezclas:

•: Mezclas 1-5: en cada una de éstas se utilizó un clon simple para cada anticuerpo

•: Mezcla 6: se utilizaron dos clones para cada anticuerpo

•: Mezcla 7: se utilizaron cinco clones para cada anticuerpo

•: Mezcla 8: se utilizaron 3 clones para cada anticuerpo

•: Mezcla 9: todos los clones disponibles fueron utilizados, 5-7 para cada anticuerpo.

Los clones fueron mezclados de modo que el número de células que representan cada anticuerpo (para cada anticuerpo proveniente de 1-7 clones) constituyó 1/6 del número total de las células en la mezcla.

El experimento fue realizado en tubos de cultivo de 50 ml como se describe en el ejemplo 1. El medio utilizado fue ProCHO4 y los volúmenes totales de cultivo fueron de 10 ml. El experimento se inició con una concentración de 0.3*106 células por ml. Los cultivos fueron diluidos a 0.3*106 células por ml dos veces a la semana con intervalos de 3 y 4 días. Una vez a la semana las muestras fueron tomadas muestras para ELISA y el análisis de cromatografía de intercambio iónico. Las primeras muestras fueron tomadas en el día 4 y las últimas en el día

35. Los valores de ELISA para las 9 mezclas se muestran en la Figura 3. El número calculado de las divisiones celulares desde el inicio hasta el final difirió en las

mezclas desde aproximadamente 25 hasta aproximadamente 27. Esto significa que si los cultivos fueron diluidos como se describe dos veces a la semana, pero manteniendo el volumen total de cada punto, los volúmenes totales al final habrían variado entre 43,000 y 152,000 litros. Los cultivos celulares de mamífero a gran escala en la industria son típicamente hasta de 15,000 litros, lo cual significa que los experimentos de mezclado descritos aquí en cuanto a que el tiempo de cultivo y el número de generaciones sea una simulación clara del cultivo en una escala industrial.

Parece que la productividad celular es relativamente constante en el periodo de tiempo de 5 semanas con una tendencia hacia una declinación en algunas mezclas.

Análisis de la composición de IgG

5-10 ml del sobrenadante del medio filtrado a 0.22 µm, fueron cargados sobre una columna MabSelect Sure de 1 ml (GE Healthcare). La columna fue lavada con 10 ml de PBS de pH 7,4, y eluida con glicina 0,1 M, pH 2,7 como se describe por el fabricante. El material de proteína combinada fue dializada dos veces contra NaCl 40 mM, acetato de sodio 50 mM, pH

5.0 y la concentración total de IgG determinada mediante la medición de la absorbancia a 280 nm.

60 µg de la mezcla de IgG fueron cargados sobre la columna de intercambio catiónico débil PolyCat A (100 x 4, 6 mm, 3 µm, 1500 A) proveniente de PolyLC. La proteína fue eluida mediante la aplicación de un gradiente desde 150 hasta 500 mM de cloruro de sodio en un amortiguador de acetato de sodio, pH 5.0 a una velocidad de flujo de 1 ml/minutos en 72 minutos. La absorbancia a 215 nm del eluido fue monitorizada y las cantidades relativas de las IgGs individuales fueron determinadas integración de la señal.

En la Figura 3 se muestran los cromatogramas del análisis de intercambio catiónico de la composición de IgG de la primera y la última cosecha a partir de la Mezcla 8 después de la purificación MabSelect. Como se puede observar, los anticuerpos individuales están bien separados, con la separación de línea base de cuatro de ellos. Por lo tanto, la integración de la señal de UV da una determinación muy precisa de las concentraciones relativas de IgG en la muestra.

Todas las mezclas fueron analizadas como se describe anteriormente y el contenido de cada anticuerpo en cada mezcla fue calculado.

Una distribución más bien uniforme en los 6 diferentes anticuerpos se observa en las

muestras iniciales. Las diferencias observadas pueden reflejar el nivel de expresión diferente entre los clones utilizados en las mezclas. El contenido de anticuerpo de cada muestra es mostrado básicamente en la Figura 5. Sorprendentemente, todos los anticuerpos pueden ser claramente identificados en todas las muestras finales. Se observa también que en las mezclas con más de un clon simple que representa cada anticuerpo (mezcla 6-9) existe una tendencia hacia una distribución más uniforme de los anticuerpos en las últimas muestras. EJEMPLO 3, Expresión de E1A en ECHO

Para investigar la expresión de E1A en ECHO, se determinó el nivel de ARNm de E1A mediante PCR en tiempo real transcrita, inversa, cuantitativa (qRT-PCR) con verde SYBR. El procedimiento qRT-PCR está basado en la amplificación por PCR de una secuencia objetivo. La PCR es realizada en presencia del colorante de enlace al ADN, el verde SYBR que emite luz verde cuando se une al ADN de doble hebra. Esto permite la cuantificación en tiempo real del AND de doble hebra después de cada ronda de amplificación.

Cuando la cantidad del ADN de doble hebra es baja, al comienzo de la PCR, la señal proveniente del colorante verde SYBR unido puede ser distinguida del ruido de fondo. Sin embargo, durante el proceso de amplificación la señal se incrementa por arriba del ruido y la producción del ADN de doble hebra puede ser seguida. De esta manera, la cantidad relativa del objetivo inicialmente presente en las muestras puede ser determinada con base en los ciclos necesarios para la señal verde de SYBR para cruzar un umbral específico. El punto exacto en el cual el umbral es alcanzado, es el valor de Ct, el cual puede ser utilizado para las comparaciones relativas de la cantidad objetivo inicial.

Materiales y procedimientos

Se extrajo el ARN total de 3 x 106 células ECHO y Hek293 utilizando el Kit RNeasy Mini catálogo no. 74104 de Qiagen como se recomienda por el fabricante. Las concentraciones y la integridad de las muestras de ARN fueron determinadas utilizando el Bioanalizador 2100 de Agilent con el ensayo de ARN Total de Eucariote Nano Serie II. La integridad es determinada como un número de integridad de ARN (RIN) entre 1-10 con 1 que es degradado y 10 que es el ARN intacto. El ARN de ECHO tuvo un RIN de 9,5 y HEK293 tuvo un RIN de 8,9. El ADNc de cada muestra fue elaborado utilizando el Kit de Transcripción Inversa QuantiTect catálogo no. 205311 de Qiagen utilizando 800 ng de ARN como material inicial. El ADNc de Hek293 fue diluido a 25x, mientras que el ADNc de ECHO fue diluido dos veces. La qRT-PCR fue realizada sobre un Stratagene Mx3005P, utilizando la mezcla Maestra QPCR de verde Brilliante SYBR catálogo no. 600548 de Stratagene. Condiciones de ciclo térmico: 10 minutos de retención a 95ºC; 40 ciclos con 15 segundos de desnaturalización a 95ºC, 1 minuto de recocido a 60ºC y 30 segundos de extensión a 72ºC; análisis de la curva de fusión de 55-95ºC. Los cebadores utilizados fueron (E1A-696bpF: 5'-TGACTCCGGTCCTTCTAACACA-'3, E1A772bpR: 5'-TCACGGCAACTGGTTTAATGG-'3) los cuales se dirigieron a un fragmento de 77 pares de bases en el extremo 3' del gen de E1A.

Resultados

La expresión de E1A en las células ECHO fue analizada utilizando el ensayo qRT-PCR y mostró que el ARNm de E1A no puede ser amplificado y detectado en este ensayo, indicando fuertemente que la línea celular ECHO no expresa la proteína E1A. Como un posible control, se utilizó la línea celular 293 humana la cual es transformada por un fragmento del ADN adenoviral y se sabe que expresa E1A a un nivel relativamente alto.

La qRT-PCR muestra la amplificación de la muestra de Hek293, el control positivo Ct = 18,74, pero no se observó la amplificación ni el NTC (control sin plantilla) ni en la muestra de ECHO.

Muestra

Hek293: 18,74

ECHO: No Ct.

NTC: No Ct.

Ct

Ejemplo 4. Preparación de los bancos celulares para experimentos en biorreactor

Para poder realizar los experimentos en biorreactor para el estudio de la estabilidad de la composición, se prepararon células de bancos maestras y de trabajo. Para el experimento, los clones de las células ECHO que expresan 6 diferentes anticuerpos, como se describe en el Ejemplo 1, fueron utilizados. Los clones utilizados habían sido adaptados al cultivo en suspensión libre de suero en el medio de cultivo ProCHO4.

Banco de células maestras

Los clones se descongelaron y se dejaron recuperar en cultivo en suspensión por un periodo. 4 Bancos de Células Maestras fueron preparados a partir de las células en crecimiento exponencial, de acuerdo a las siguientes especificaciones:

•: Las células fueron congeladas cuando éstas estaban en el crecimiento logarítmico

•: Los 6 anticuerpos fueron representados en cada banco de células

•: Números iguales de células que representan cada anticuerpo fueron mezclados

•: Las Mezclas 1A-3A contenían un clon simple por anticuerpo

•: La Mezcla 4A contenía 3 clones por anticuerpo

• 10 ampollas cada una conteniendo 20*106 células fueron congeladas por mezcla 5 • Medio de congelación: medio de cultivo (ProCHO4) con 10% de DMSO

Banco de células de trabajo

Se descongeló una ampolla congelada por mezcla. Las mezclas se mantuvieron en cultivo durante 8-10 días antes de la preparación del banco de células de trabajo: 10 • Las células se congelaron cuando estaban en crecimiento logarítmico

•: Se congelaron 10 ampollas, por mezcla, cada una con 20*106 células

•: Medio de congelación: medio de cultivo (ProCHO4) con 10% de DMSO

Ejemplo 5: Estabilidad de composición en el biorreactor

15 Se descongeló una ampolla congelada por mezcla del banco de células de trabajo y las células se mentuvieron en cultivo com tren de siembra durante 14 días, tiempo durante el cual se inició el cultivo de biorreactor:

Cada tren de siembra se utilizó para inocular dos biorreactores con 0,6*106 células/ml en 250 ml de medio inicial (ProCHO4 + glutamina 5 mM + 1/100 de aminoácidos no 20 esenciales).

Los cultivos fueron alimentados desde el día 2 hasta el día 14 después de la inoculación con medio de alimentación (ProCHO4 + 6 g/litro de glucosa + glutamina 5 mM + 1/100 de aminoácidos no esenciales), lo que dio como resultado un volumen de ~ 585 ml en el día 16 de la cosecha.

25 En los biorreactores DASGIP se controlaron los siguientes parámetros (unidad 1-8):

Tabla 4. Parámetros de proceso generales en biorreactor.

Volumen: 250 ml alimentados continuamente, día inicial 2 hasta el día 14

Punto de ajuste de la temperatura:: 36,8ºC, cambio a 32,0ºC hasta 120 horas

Punto de ajuste del pH:: 6,95

Control de pH:: se utiliza carbonato de sodio al 0ºC a 120 horas

esterilizado por filtración

Agitación:: 80 rpm

Punto de ajuste del pO2: 30% (regulado vía el contenido de O2 del gas)

Flujo de gas:: 0,1 sl/h

Nivel CO2:: Ajustado por el sistema DASGIP con el fin de mantener el pH

Cada día se tomaron muestras de 5 ml para que el análisis de viabilidad, el número de células viables, la producción de IgG y los metabolitos. Todos los cultivos funcionaron como se

5 esperaba, con viabilidades y números de células viables similares. 10 ml adicionales se tomaron para el análisis de la composición de IgG mediante el análisis de cromatografía de intercambio iónico a partir del tren de siembra (en el día 9 y en el día 14) y a partir de cada biorreactor (unidad 1-8) en el día 20, día 24, día 28 y día 30 después del descongelación de las ampollas.

10 El análisis de la composición de IgG fue realizado como se describe bajo el ejemplo 2 anterior. Todas las mezclas se analizaron como se describe anteriormente y se calculó el contenido de cada anticuerpo en cada muestra de las 4 mezclas. El rendimiento total de IgG proveniente de los cultivos estuvo en el intervalo de aproximadamente 150 a 250 mg/litro.

15 El contenido de anticuerpo de cada muestra se muestra gráficamente en 5. Sorprendentemente, todos los anticuerpos se pueden identificar claramente en todas las muestras. La composición parece sólida, ninguno de los clones se perdió o había prevalecido durante 14 días de cultivo en el tren de siembra, seguido por un ciclo en el biorreactor de 16 días. Las composiciones son diferentes en función de los clones introducidos.

20 También parece, mediante selección de los clones específicos para una mezcla, determinar la distribución relativa de los anticuerpos individuales en el producto final.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la generación de una línea celular policlonal capaz de expresar una proteína policlonal que comprende de 2 a n miembros distintos, dicho procedimiento comprende:

a) Proporcionar un grupo de vectores de expresión, en donde cada uno de los vectores comprende al menos una copia de un ácido nucleico distinto que codifica un miembro distinto de la proteína policlonal;

b) Transfeccionar por sepatado las células huésped con cada uno de los vectores de expresión bajo condiciones que eviten la integración específica del sitio de los vectores de expresión dentro del genoma de las células, obteniendo con esto 2 a n composiciones de células, cada composición expresa un miembro distinto de la proteína policlonal;

c) Mezclar las 2 a n composiciones de las células para obtener una línea celular policlonal.
2.

El procedimiento de la reivindicación 1, caracterizado porque los vectores de expresión son estable y aleatoriamente integrados dentro de uno o más cromosomas de las células huésped.
3.

El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2, en el que las células transfeccionadas obtenidas en la etapa b) son clonadas, por ejemplo usando clonación por FACS, y, preferentemente, en el que los clones se seleccionan segùn al menos un criterio seleccionado del grupo constituido por: la velocidad de crecimiento, el tiempo de duplicación, el nivel de expresión, la nivel de producción, la estabilidad de la producción en el tiempo, la viabilidad, la resistencia, la solidez, la morfología y el número de copias.
4.

El procedimiento de la reivindicación 3, en el que los clones se seleccionan según la uniformidad con respecto al menos a un criterio, por ejemplo en el que los clones se seleccionan según la uniformidad con respecto al tiempo de duplicación y/o el nivel de expresión, opcionalmente en el que se selecciona más de un clon para cada miembro de proteína policlonal distinto.
5.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las composiciones de células que expresan diferentes miembros distintos se mezclan en una

proporción 1:1, o en el que dichas composiciones de células se mezclan en una proporción diferente de una proporción 1:1.
6.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en e que los vectores de expresión son idénticos, excepto por las variaciones en la secuencia de codificación de la proteína policlonal.
7.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células huésped derivan de un clon antes de la transfección.
8.

El procedimiento de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína policlonal es una proteína multimérica, por ejemplo en el que un vector de expresión codifica todas las subunidades de un miembro de proteína policlonal distinta o en el que el grupo de vectores de expresión en la etapa a) está constituido por dos o más subgrupos de vectores de expresión, donde un primer subgrupo comprende las secuencias variantes de ácido nucleicos que codifican una subunidad de la proteína, por ejemplo la cadena pesada de un anticuerpo, y un segundo subgrupo comprende la secuencia de variantes de ácido nucleicos que codifica otra subunidad de la proteína, por ejemplo la cadena ligera de un anticuerpo, tal que cada transfección se realiza con un miembro proveniente del primer grupo y un miembro del segundo grupo de vectores de expresión.
9.1El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, parqueen el que el vector de expresión o un vector de expresión adicional codifica un marcador seleccionable, por ejemplo en el que las células se cultivan de forma continua en condiciones que favorecen el crecimiento de las células que expresan el marcador seleccionable, por ejemplo en el que el marcador seleccionable comprende un producto génico, en el cual es deficiente la célula huésped, por ejemplo en el que el marcador seleccionable está codificado por un tránscrito que también codifica un miembro polipeptídico o una subunidad del miembro polipeptídico, preferentemente en el que el marcador seleccionable está codificado por el tránscrito que codifica la subunidad más grande.
10.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo policlonal, en el que todos los miembros del anticuerpo policlonal tienen la misma región constante de la cadena pesada y/o ligera, preferentemente de la cadena pesada.
11.

El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las células huésped son células eucarióticas, preferentemente células de mamífero, por ejemplo células de mamífero seleccionadas del grupo que consiste en células de ovario de hámster Chino (CHO) células COS, células BHK, células de mieloma (por ejemplo, células Sp2/0, NSO, YB2/0), NIH 3T3, células humanas inmortalizadas o de fibroblastos, incluyendo células HeLa, células HEK293, o PER.C6.
12.

El procedimiento de la reivindicación 11, en el que la célula huésped expresa un transactivador recombinante, capaz de transactivar el promotor que codifica la expresión de la proteína policlonal.
13.

Un procedimiento para la fabricación de una proteína policlonal, comprendiendo dicho procedimiento: a) proporcionar una línea celular policlonal obtenida utilizando el procedimiento de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12; b) cultivar la línea celular policlonal bajo condiciones que permiten la expresión de la proteína policlonal; c) recuperar y opcionalmente purificar la proteína policlonal a partir de las células o del medio; y, opcionalmente,

d) verificar la presencia de cada uno de los distintos miembros en la proteína policlonal recuperada y opcionalmente purificada.
14.

Una línea celular policlonal que comprende de 2 a n poblaciones de células, expresando cada población una población de miembros distintos de la proteína policlonal recombinante, en la que la proteína policlonal recombinante comprende moléculas de proteína diferentes pero homólogas, las células comprenden al menos un construccto de expresión aleatoriamente integrado dentro del genoma, tal que los sitios de integración varían entre los miembros de la línea de células policlonales.
15.

La línea de células policlonales de la reivindicación 14, en la que al menos un constructo de expresión está integrado en uno o más cromosomas.
16.

La línea de células policlonales de la reivindicación 14 ó 15, en la que n es menor de 50, tal como menor de 45, por ejemplo menor de 40, tal como menor de 35, por ejemplo menor de
30.
17.

La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, en la que las células que expresan un miembro distinto de la proteína policlonal recombinante derivan de 2 ó más células clonadas, y en la que el número de células clonadas es inferior a 50, por ejemplo inferior a 20, tal como inferior a 15, por ejemplo inferior a 10.
18.

La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en la que la proteína policlonal es una proteína multimérica, por ejemplo en la que cada constructo de expresión codifica las subunidades de una proteína multimérica, por ejemplo en la que la expresión de las subunidades está bajo el control de los mismos o idénticos promotores.

19, La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en la que los constructos de expresión codifica un marcador seleccionable, opcionalmente en la que el marcador seleccionable está codificado por un tránscrito que también codifica un miembro polipeptídico o una subunidad del miembro polipeptídico.
20.

La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-19, en la que la proteína policlonal es un anticuerpo policlonal o fragmento de anticuerpo policlonal, preferentemente en el que todos los miembros del anticuerpo policlonal son del mismo isotipo.
21.

La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-20, en la que las células huésped son células eucarióticas, preferentemente en la que las células huésped son células de mamífero.
22.

La línea de células policlonales de cualquiera de las reivindicaciones 14-21, en la que las células comprenden un constructo de expresión establemente integrada que codifica un transactivador capaz de transactivar el promotor que codifica los miembros de la proteína policlonal.