ES2646560T3 - Mezclas de proteínas de unión - Google Patents

Abstract

Un método para identificar, a partir de una biblioteca de células huésped, una célula huésped que exprese una mezcla de diferentes proteínas de unión de cadena polipeptídica simple con la actividad biológica óptima, en donde dichas proteínas de unión de cadena polipeptídica simple son anticuerpos de dominio único o anticalinas o aficuerpos que no se asocian y, así, pueden recuperarse como proteínas separadas, dicho método comprende: - producir una biblioteca de células, en donde cada célula codifica al menos dos anticuerpos de dominio único o anticalinas o aficuerpos separados que tienen diferentes epítopos objetivos, de manera que las células expresan los anticuerpos de dominio único o anticalinas o aficuerpos en diferentes relaciones, que comprende transfectar y permitir la integración en el genoma de todas las células de las secuencias de ácidos nucleicos que codifican dichos al menos dos anticuerpos de dominio único o anticalinas o aficuerpos y seleccionar según la integración exitosa, de manera que dichas secuencias de ácidos nucleicos comprenden una señal de secreción o una secuencia codificante para localizar y anclar la proteína de unión resultante en una membrana celular; y - evaluar las mezclas de anticuerpos de dominio único o anticalinas o aficuerpos expresados por dichas células huésped en un ensayo de actividad biológica para determinar la mezcla con la actividad biológica óptima; e - identificar la célula huésped que produce dicha mezcla.

Description

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DESCRIPCION

Mezclas de protemas de union

La presente invencion se refiere al campo de la biologfa molecular, en particular a la biologfa molecular medica. El reconocimiento espedfico juega un papel importante en la biologfa medica moderna. Todas las interacciones de receptor y ligando, respuestas inmunes, infecciones, conversiones enzimaticas se basan en el reconocimiento espedfico entre moleculas. De particular interes son las interacciones protema-protema espedficas, que brindan una enorme variedad de posibilidades para interferir en todo tipo de procesos biologicos. En toda la naturaleza se encuentran procesos biologicos que dependen de mas de una interaccion (simultanea) de protemas. En la actualidad, parece que interferir en mas de un punto en un proceso biologico sera mas efectivo que una unica interferencia. Esta interferencia puede estar mediada por dos protemas diferentes con actividad de union (tales como los anticuerpos), cada una de las cuales se une a un epttopo en un objetivo u objetivos asociados con el proceso biologico, y posteriormente inhibe el proceso biologico. Particularmente en la terapia con anticuerpos se ve que un anticuerpo (monoclonal) frecuentemente no es suficientemente efectivo para tratar un trastorno y/o enfermedad particular. Por lo tanto, la atencion de muchos investigadores medicos ahora se centra en las terapias de combinacion. Ejemplos bien conocidos de combinaciones de anticuerpos que se siguen clmicamente en la actualidad son para el tratamiento del linfoma no Hodgkin, la combinacion del anticuerpo anti-CD20 Rituxan ya aprobado con el anticuerpo anti-CD22 Epratuzumab de AmGen y para el tratamiento de la Hepatitis B, una combinacion de dos anticuerpos humanos desarrollados porXTL Pharmaceuticals (Galun E. y otros, Hepatology (2002) 35: 673-679). Sin embargo, la combinacion de multiples (dos o mas) farmacos (ya sean protemas de union, anticuerpos u otros) tiene una serie de inconvenientes tecnicos, practicos y regulatorios. En el pasado, las protemas de union, tales como los anticuerpos, no se disenaron tipicamente para funcionar y producirse en combinacion entre sf y el desarrollo como combinaciones con una eficacia clmica y compatibilidad optima puede ser un problema. Como un ejemplo, las condiciones para estabilizar una puede ser perjudicial para la estabilidad de la(s) otra(s). Ademas, multiples fuentes de produccion recombinante conducen a multiples fuentes de riesgos tales como la contaminacion viral, la contaminacion prionica y similares.

Historicamente, las protemas de union mas investigadas son los anticuerpos. Los anticuerpos normalmente muestran sitios de union compuestos por dos cadenas polipeptfdicas separadas, ensambladas como una protema tetramerica en la molecula de inmunoglobulina IgG. Mas recientemente, ha sido posible producir protemas de union de cadena polipeptfdica simple, en las cuales la union esta mediada por un dominio de protema unico. Tales protemas de union pueden basarse en la misma secuencia o andamios de protema altamente relacionados, aunque muestran especificidades de union altamente divergentes. Definimos aqu SPCBP como protema de union de cadena polipeptfdica simple, y las SPCBP como protemas de union de cadena polipeptfdica simple. Frecuentemente se obtienen proporcionando en primer lugar un cierto nivel de diversidad en un andamio o pliegue de protema monomerica elegido, que puede tener un origen natural o una base sintetica, y despues usar metodos de seleccion molecular o de seleccion para identificar entre las variantes de protemas las que muestran una especificidad de union conveniente. Alternativamente, se obtienen de la naturaleza, que ademas tiene algunas fuentes de las SPCBP, tales como los anticuerpos de 'cadena pesada solamente' de camelidos y tiburones.

La presente invencion proporciona metodos para la produccion de bibliotecas de celulas que expresan al menos dos protemas de union unicas separadas, en las que las protemas de union tienen diferentes epttopos objetivos. Estas bibliotecas se preparan mediante la integracion de las secuencias de acidos nucleicos que codifican las cadenas polipeptfdicas en el genoma de la celula huesped y seleccionando las celulas que han integrado satisfactoriamente estos acidos nucleicos. Las celulas seleccionadas se someten preferentemente a una etapa de clonacion. Esta etapa de clonacion se enlaza a una seleccion y/o etapa de tamizaje que implica seleccion y/o seleccion de celulas que producen protemas de union adecuadas, los ejemplos de tales pasos de seleccion se discuten en otra parte de esta solicitud. Se prefiere que los acidos nucleicos que codifican estas cadenas polipeptfdicas se relacionen en su secuencia de aminoacidos fuera de la region de union de manera que la mezcla de protemas de union pueda aislarse mediante el mismo procedimiento de purificacion fisicoqmmico. En este contexto, se prefiere que las cadenas polipeptfdicas sean al menos 70% homologas. Al producir multiples lmeas de celulas huesped recombinantes que expresan cada una multiples protemas de union y en las que cada lmea celular expresa las protemas en una relacion establecida, pueden hacerse facilmente muchas mezclas diferentes de protemas de union, y sin tener que expresar, purificar y caracterizar cada union protema de forma individual. Al evaluar tales mezclas en un ensayo de actividad biologica, puede determinarse la composicion de la mezcla con la actividad biologica optima, y se identifica la lmea celular huesped concurrente que produce exactamente esta mezcla. Dado que se prefiere que la protema de union incluida en la invencion comparta un cierto nivel de homologfa de secuencia de acido nucleico y naturaleza fisicoqmmica, la mezcla de protemas de union puede aislarse mediante procedimientos de purificacion fisicoqmmicos que con una eficacia similar purificaran todos los componentes de la union de la mezcla de protemas. Tal metodo proporciona un medio para producir mezclas de protemas de union para aplicaciones terapeuticas sin tener que producir individualmente los componentes de la mezcla, lo que tiene importantes inconvenientes tecnicos, financieros y de tiempo. Los presentes inventores han abierto una ruta de mejoras en el tamizaje de las propiedades de las combinaciones de protemas de union. Estas mejoras y sus ventajas se haran evidentes a partir de la siguiente descripcion.

Asf, uno de los problemas tecnicos subyacentes a la presente invencion es proporcionar metodos para producir y evaluar mezclas de protemas de union sin tener que producir individualmente cada uno de los componentes de la

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mezcla. Una solucion a este problema tecnico se logra mediante la provision de las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones. Como consecuencia, la presente invencion permite construir colecciones de protemas de union homologas que se unen a diferentes epftopos objetivo, que se expresan en la misma celula huesped y en la que la homologfa conduce a un metodo comun para la purificacion de todas las protemas de union homologas como una mezcla de protemas. El enfoque tecnico de la presente invencion, es decir derivar bibliotecas de celulas que expresan mezclas de las SPCBP y tamizar tales bibliotecas para composiciones con bioactividad optima, no se proporciona ni sugiere por la tecnica anterior.

El documento de patente WO 2004/106375 describe las combinaciones de protemas de union espedficas, tales como inmunoglobulinas, y metodos para producir composiciones que comprenden al menos dos moleculas protemicas diferentes que comprenden regiones variables apareadas.

El documento de patente WO 94/02610 describe los metodos que comprenden la expresion intracelular de un anticuerpo capaz de unirse a una molecula objetivo o a un antfgeno objetivo.

El documento de patente WO 02/096948 describe los metodos, composiciones y kits que comprenden anticuerpos dimericos para el tratamiento de trastornos neoplasicos, autoinmunes u otros. Estos anticuerpos dimericos pueden comprender homodfmeros o heterodfmeros.

El documento de patente US 2003/0194403 describe anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen espedficamente al EGFR humano, y composiciones y moleculas basadas con el anticuerpo.

El documento de patente WO 03/048306 describe sistemas de expresion para producir multiples productos genicos de interes, que contienen un vector policistronico capaz de expresar anticuerpos funcionales en celulas huesped eucariotas.

Muyldermans S., Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001) 277-302 describe metodos para aprovechar el repertorio de VHH de un dromedario o llama inmunizado y menciona el uso de intracuerpos VHH para tratar una infeccion viral.

El documento de patente WO 03/046560 describe metodos para formar complejos multimericos que tienen una afinidad mejorada para un objetivo. Dichos complejos multimericos comprenden al menos tres unidades de autoensamblaje, por ejemplo, que incluyen la subunidad B de la verotoxina (VTB) de Escherichia coli.

El documento de patente WO 03/106684 describe metodos para la produccion de manera simultanea de multiples protemas multimericas, tales como anticuerpos, en celulas huesped. Los monomeros/subunidades requeridos se producen en una relacion predeterminada que es la relacion natural (estequiometna) de las diferentes subunidades/monomeros/polipeptidos de las protemas multimericas.

El documento de patente WO 03/002609 describe ligandos dobles espedficos que comprenden un primer dominio variable de inmunoglobulina unico que tiene una primera especificidad de union y un dominio variable unico de inmunoglobulina complementario que tiene una segunda especificidad de union. Estos ligandos dobles espedficos tienen al menos un par VH/VL.

Skerra A., Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001) 257-275 describe anticalinas como una nueva clase de protemas de union a ligando modificados geneticamente con propiedades similares a los anticuerpos.

La union se define como las interacciones entre moleculas que pueden distinguirse de las interacciones de fondo. Tfpicamente, la interaccion espedfica entre las moleculas tiene mayor afinidad de union, despues de las interacciones de fondo entre las moleculas. Las protemas de union son protemas formadas por una secuencia de residuos de aminoacidos y se unen a un epttopo de un objetivo. Las protemas de union espedfica se componen de residuos de aminoacidos (moleculas proteinaceas).

Al producir las dos o mas especificidades de union deseadas en un sistema, solo existe una fuente de los productos y de ese modo menos riesgo de contaminacion con virus, priones y similares. Ademas es mas probable que las modificaciones postraduccionales impuestas a las protemas de union como se expresan dentro de la celula huesped seran similares, si no indistinguibles, entre sf. Al contrario, mientras se producen protemas de union en diferentes celulas, incluso aun cuando estas son celulas identicas, las condiciones de cultivo afectaran a algunas de las modificaciones postraduccionales. Se prefiere llevar a cabo metodos de conformidad con la invencion dentro de una celula inmortalizada, tfpicamente una lmea celular eucariotica, y preferentemente CHO, SP2/0, NSO o PER. C6. Para la produccion de bibliotecas y la seleccion de mezclas optimas, pueden usarse otras celulas tales como bacterias, celulas de insectos, levaduras y otras eucariotas que son tipicamente adecuadas para la produccion de pequenas protemas globulares (E. coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, etcetera), se prefieren.

La produccion de protemas de union separadas tiene lugar en la misma celula huesped. Una forma particularmente util de producir protemas de union es a traves de la expresion de acidos nucleicos que codifican estas protemas de union.

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Se prefiere que todas las protemas de union en una celula se produzcan mediante dicha expresion. Para la mayona de los propositos, la naturaleza del acido nucleico no es cntica, es ARN, es preferentemente ADN, es episomal o integrado, parte de un vector viral o un plasmido. Se prefiere que dichas al menos dos protemas de union se codifiquen por secuencias de acidos nucleicos separadas. En otra modalidad preferida dichas al menos dos secuencias de acidos nucleicos que codifican dichas al menos dos cadenas polipeptfdicas individuales son parte del mismo acido nucleico. De esta manera, el numero de copia de dichas al menos dos secuencias de acidos nucleicos, en relacion entre sf, puede hacerse esencialmente constante. Aun en otra modalidad, dichas al menos dos secuencias de acidos nucleicos que codifican dichas al menos dos cadenas polipeptfdicas individuales son parte de dos acidos nucleicos diferentes. De esta forma, el numero de copias de dichas al menos dos secuencias de acidos nucleicos puede variarse entre sf, de una manera controlable. Para el sistema de produccion final de la combinacion de protemas de union que tienen diferentes especificidades de union, se prefiere que el acido nucleico o los acidos que codifican las protemas de union se integren de manera estable en el genoma del huesped, preferentemente el acido nucleico comprende medios para la integracion dirigida del sitio secuencia de acido nucleico que codifica dichas protemas de union, preferentemente dichos medios son medios para la recombinacion homologa. La produccion de protemas de union a traves de la expresion de acidos nucleicos que los codifican da la posibilidad de manipular las secuencias de codificacion, permitiendo de ese modo el diseno de nuevas especificidades de union, intercambiando secuencias utiles de una secuencia de codificacion a otra y similares.

Particularmente para elaborar las preparaciones terapeuticas de protemas de union multiple, pueden hacerse fusiones de una o mas de las protemas de union a una secuencia que no influye en la especificidad de union de la protema de union en sf misma, sino que proporciona una funcion efectora o manejo de deteccion. Ejemplos de esto son beta galactosidasa, carboxipeptidasa G2 (u otras enzimas implicadas en la terapia con profarmacos enzimaticos dirigidos por anticuerpos), ARNasa humana, Onconasa (u otras enzimas que degradan el ARN) o toxinas bacterianas o de plantas (ricina A, exotoxina de Pseudomonas), o citocinas o factores de crecimiento (TNF, IL-1, IL-12, GM-CSF). Los metodos descritos en la descripcion detallada proporcionan la adaptacion de los acidos nucleicos que codifican las protemas de union al resultado final deseado.

La invencion proporciona un metodo en donde dichas protemas de union son anticalinas, aficuerpos o anticuerpos de dominio unico.

Un metodo de la invencion se usa preferentemente para la produccion de bibliotecas de celulas que expresan protemas de union multiples (es decir, dos o mas) en un sistema, y composiciones que comprenden multiples protemas de union producidas por estos metodos. Para la produccion biofarmaceutica de tales mezclas de protemas, sera necesario obtener un sistema de expresion que sea compatible con la escala de los procesos industriales que se emplean. Las celulas huesped tfpicamente recombinantes se fabrican en las que el sistema de expresion que codifica los transgenes (o los acidos nucleicos que codifican una protema de interes) se retienen por las celulas huesped en forma estable y activa durante las fases de crecimiento de escalado y produccion. Esto se logra tfpicamente mediante la integracion de los transgenes en el genoma de la celula huesped. Al seleccionar los eventos de integracion exitosos (por ejemplo, mediante marcadores de seleccion codificados geneticamente presentes en los vectores de expresion usados para la transfeccion), se afslan celulas que han integrado los acidos nucleicos que codifican las cadenas polipeptfdicas individuales y las expresan a niveles variables. La variacion en los niveles de expresion se debe a muchos factores, que incluyen los efectos de clonacion posicional y el numero de copias del transgen. Esto crea una biblioteca de combinaciones que se tamiza en bioensayos para identificar la mezcla optima. Los metodos proporcionan un medio para identificar una celula huesped que expresa las diferentes protemas de union en la relacion optima.

Otro elemento de la invencion util para el control de la produccion de diversas bibliotecas es la expresion de diferentes genes que codifican protemas de union bajo el control de diferentes elementos reguladores tales como promotores, (trans) activadores, potenciadores, terminadores, antirrepresores, elementos estabilizadores anti represion (STAR), represores, regiones de control del locus, regiones de fijacion a la matriz, sitio interno de entrada de ribosoma (IRES) y similares. Estos elementos reguladores son constitutivos, inducibles o reprimibles y dependen de su funcion, proporcionados en cis o en trans. Asf, la produccion de protemas de union puede regularse y multiplicarse, proporcionando asf un medio para lograr relaciones variables de protemas de union en cada celula, es decir, en donde dichos diferentes elementos reguladores dan lugar a diferentes niveles de expresion de diferentes protemas de union. Pueden hacerse diferentes combinaciones de protemas de union mediante separacion en el tiempo de expresion de diversas protemas de union, y las relaciones entre diferentes protemas de union se manipulan regulando los niveles de expresion. Las variaciones se describen en la descripcion detallada. Dichas secuencias de acidos nucleicos comprenden una senal de secrecion o una secuencia de codificacion para localizar y anclar la protema de union resultante en una membrana celular.

En una modalidad particularmente preferida, dichas al menos dos secuencias de acidos nucleicos que codifican dichas al menos dos protemas de union estan bajo el control de diferentes elementos reguladores.

En otra modalidad preferida, dichos elementos reguladores diferentes se eligen a partir de un promotor, preferentemente inducible, un potenciador, un terminador, un elemento estabilizante anti represor, un sitio interno de entrada al ribosoma, una region de fijacion a la matriz, un elemento de apertura de la cromatina ubicuo, un elemento de lfmite, una region de control del locus o una region de fijacion al andamio.

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En una modalidad preferida, dichos diferentes elementos reguladores dan lugar a diferentes niveles de expresion de diferentes protemas de union. En esta modalidad, se prefiere que se produzcan al menos dos celulas y que se use una seleccion o tamizaje usando un bioensayo como se menciona anteriormente para seleccionar y/o tamizar una celula que expresa una relacion favorable de dicha protema de union.

Se prefiere que cada celula codifique de 2-10 diferentes protemas de union de cadena unica de aminoacidos separadas. Al menos las dos secuencias de acidos nucleicos que codifican dichas al menos dos cadenas polipeptfdicas individuales son preferentemente parte del mismo acido nucleico, en celulas eucariotas o en parte de dos diferentes acidos nucleicos (celulas eucariotas y procariotas).

Tales metodos son particularmente utiles cuando dichos dos epftopos objetivo se asocian con una enfermedad o trastorno. Se prefiere combinar un metodo de este tipo con el sometimiento de una combinacion seleccionada de moleculas proteicas a un ensayo biologico indicativo de un efecto de la combinacion sobre la enfermedad y/o el trastorno.

Estas mezclas multiespedficas se parecen a las mezclas de anticuerpos policlonales en su eficacia para reconocer antigenos, pero sin los inconvenientes de muchas especificidades irrelevantes en la mezcla. Las mezclas de protemas de union se parecen a los anticuerpos monoclonales en su constitucion definida, facilidad de produccion y altas especificidades, pero sin la perdida de eficacia concomitante. Las mezclas contienen asf dos, tres o mas especificidades de union diferentes, y existen en varios formatos. En la forma mas simple, una mezcla de protemas de union de conformidad con la invencion contiene dos o mas protemas de union relacionadas con diferentes especificidades de union.

Como se describe en la presente descripcion, los metodos y medios de la invencion en una modalidad son la produccion de combinaciones de especificidades. Antes de la produccion de las combinaciones, deben disenarse y/o seleccionarse las combinaciones adecuadas. Estos metodos de diseno y seleccion ademas son parte de la presente invencion.

Los acidos nucleicos preferidos para usar en la produccion de combinaciones de especificidades son protemas de union creadas por la biotecnologfa combinatoria. Estos incluyen anticuerpos de dominio, o dAbs, anticuerpos de camelidos (VHH), anticalinas y aficuerpos), y sus variantes modificadas geneticamente (fusiones con otros efectores o etiquetas). Los anticuerpos de dominio pueden derivarse, por ejemplo, de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina o regiones variables de cadena ligera de inmunoglobulina, pero ademas pueden ser tubridos modificados geneticamente de regiones variables de cadena pesada y ligera (con, por ejemplo, regiones CDR intercambiadas o regiones FR). Los Dabs pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de hibridomas, mediante clonacion de donantes inmunes o no inmunes o pueden ser regiones variables construidas sinteticamente.

La invencion se describira en mas detalles en la siguiente descripcion detallada.

Leyendas de las figuras:

Figura 1. Esquema general del casete de expresion y los vectores de expresion para las celulas eucariotas. La leyenda de los elementos del vector se representa a la derecha. En (A) en el panel superior del lado izquierdo se representan tres casetes de expresion eucariota para tres protemas de union diferentes, BP1-3. Estos son esquemas de los elementos encontrados en un casete de expresion para un gen o acido nucleico de protema de union de cadena polipeptfdica simple, y tfpicamente comprende un promotor, una secuencia lfder (opcional), un marco de lectura abierto que codifica la protema de interes, una region de poliadenilacion (para expresion eucariota) y un terminador, todo en configuracion operativa. Ademas, se muestran los sitios (ademas son opcionales, indicados en la parte superior del primer casete de expresion) que se usan para la recombinacion dirigida y en algunos casos homologa. En su panel inferior se representa un esqueleto de vector ilustrativo que se usa para la insercion de casete(s) del panel superior. Este esquema muestra los elementos tfpicos de un vector de expresion eucariota, que comprende un origen de replicacion bacteriano (como Col El), un marcador de seleccion bacteriano (Seleccionar B, tal como el gen de resistencia a ampicilina), un marcador de seleccion eucariota (Seleccionar, tal como gpt, neo, zeo, etcetera, ver texto, util cuando se preve la integracion estable en el genoma de la celula huesped), y elementos opcionales adicionales tales como una region de empaquetamiento de bacteriofagos (para la produccion de ADN monocatenario, tales como fl) y un marcador de amplificacion opcional (tal como DHFR). Opcional, pero no se muestra en el esqueleto del vector, ni en los casetes de expresion otros elementos que controlan la expresion (tales como los BE, STAR, las LCR, las MAR y similares, ver mas abajo) e IRES; estos se incluyen en las figuras posteriores. En (B) se representan los elementos necesarios para la expresion procariota. Solo se indican los elementos mas relevantes para la invencion, y se omitieron algunas otras caractensticas que son bien conocidas en la tecnica que se requieren para la expresion (por ejemplo, secuencias de sitios de union a ribosomas, regiones de Shine Dalgarno, secuencias de consenso de Kozak, etcetera).

Figura 2: Esquemas que representan diferentes puntos de partida para hacer bibliotecas de protemas de union. En el panel A, multiples genes que codifican diferentes protemas de union se clonan en uno y el mismo vector de expresion que porta un marcador de seleccion. En el panel B, los genes que codifican la protema de union se clonan en tres

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vectores de expresion diferentes, cada uno diferente en su marcador de seleccion (los ejemplos de estos se ilustran en el texto).

Figura 3: Ruta a bibliotecas de 3 SPCBP diferentes con relaciones de expresion diferentes basadas en integracion aleatoria y tamizaje del sobrenadante de lmeas celulares clonales mediante union a antigeno (se indican con X en la gradilla de la placa ELISA las lmeas celulares que expresan las 3 protemas de union diferentes por encima de un determinado criterio de seleccion, por ejemplo senal superior a 3x de la senal de fondo del ensayo). Las mezclas se preparan transfectando las protemas de union que codifican los genes que codifican las protemas de union de interes (el numero aqu es 3), seguido por la clonacion de lmeas celulares, seleccionando lmeas celulares productoras de forma estable y eventualmente tamizando las mezclas de anticuerpos resultantes para una bioactividad optima.

Figura 4. Casetes de expresion para genes de SPCBP en la misma celula huesped. (A) El casete individual de base, representado por una protema de union; (B) Este casete contiene dos genes BP clonados en tandem, pero su expresion se regula individualmente, a traves de dos promotores diferentes, PI y P2. (C) Los dos genes BP se clonan en direcciones transcripcionalmente opuestas y en este ejemplo separados por un elemento que influye en la frecuencia de expresion/estabilidad/integracion (se dan mas ejemplos en el texto). (D) Igual que B, pero ahora se incluyen elementos E adicionales en el extremo 3' de cada una de las dos unidades transcripcionales. (E) El casete contiene tres genes BP clonados en tandem, cada uno con su propio promotor, lfder, senal de poliadenilacion y terminador. (F) Para los casos en que dos protemas de union deben estar presentes en la mezcla en cantidades aproximadamente similares, se inserta un IRES entre dos genes BP; en este casete, la expresion de un tercer gen BP se regula independientemente a traves de un promotor diferente. (G y H) Casetes de expresion para mediar la expresion de dos protemas de union, en las que el gen de la protema de union se une a traves de un elemento IRES a un marcador de seleccion (que despues se selecciona en lugar de usar el marcador basado en el vector del esqueleto) sin (G) o con elementos adicionales en una casete para influenciar la expresion (H).

Figura 5. Expresion dependiente de los genes de SPCBP. BP-1 es una primera SPCBP, que esta bajo el control de un promotor (P). La secuencia IRES enlaza la expresion de la cadena pesada con la de un transactivador; esto activa un promotor receptivo que induce la expresion de una segunda SPCBP, BP-2 (ver el texto para los detalles).

Figura 6. Metodo secuencial (introduccion de colecciones de 5 genes de BP en las celulas del huesped; para cada conjunto de 5, se selecciona para un marcador de seleccion diferente. Para detalles de simplicidad, solo se muestran los genes de SPCBP y la caja de marcador de seleccion en los plasmidos. Ver texto para mas detalles.

Figura 7. Plasmidos para la expresion de multiples SPCBP en celulas de mairnferos. (A) pBRV; (B), pRRV, (C) pABExpress40; se indican los sitios de clonacion para la insercion direccional de anticuerpos de dominio y anticalinas (ver el texto para mas detalles).

Figura 8. El plasmido pAn02x33x04 que dirige la expresion y la secrecion de tres fragmentos diferentes de anticuerpo de camelido.

Descripcion detallada 1. Antecedentes

1.1 Anticuerpos

En la lucha contra la infeccion, el sistema inmunologico crea una respuesta celular y humoral que puede combatir espedficamente al agente infeccioso. La respuesta inmune humoral se basa en inmunoglobulinas, o anticuerpos, que contactan a los antfgenos y median ciertas funciones efectoras para eliminar la infeccion ((Roit, I. M. y otros (1985)) y todas las referencias en la presente descripcion). En el sistema inmunitario los anticuerpos son generados por los linfocitos B. Los anticuerpos consisten en cadenas pesadas y ligeras que se ensamblan mediante apareamiento entre dominios y enlaces de disulfuro intercatenarios para formar moleculas multivalentes. Existen varios isotipos de anticuerpos naturales, que incluyen IgG (con en humanos 4 subclases, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgD, IgA e IgE. Una molecula de IgG contiene dos cadenas pesadas (H) y dos ligeras (L), ambas con unas regiones variable (V) y constante (C). Un anticuerpo IgG tfpico comprende dos regiones variables de la cadena pesada (H) (abreviado en la presente descripcion como VH), y dos regiones variables de la cadena ligera (L) (abreviado en la presente descripcion como VL). Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas "regiones determinantes de complementariedad" ("CDR"), intercaladas con regiones que mas se conservan, denominadas "regiones marco" (FR). La extension de la region marco y los CDR se definio con precision (ver, Kabat, E. A., y otros (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edicion, Departamento de Salud y Servicios Humanos de Estados Unidos, Publicacion NIH num. 91-3242, y (Chothia, C. y otros (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917), que se incorporan en la presente descripcion como referencia).

En la generacion de la respuesta inmune primaria, el apareamiento de las secuencias de la region variable pesada y ligera de los anticuerpos es un proceso aleatorio. Los genes de la region variable se ensamblan por primera vez recombinando los elementos geneticos V, (D) y J elegidos aleatoriamente, representados en el genoma como un

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conjunto de genes diversos. Las regiones variables pesadas y ligeras recombinadas se empalman despues en sus respectivos genes de region constante y las cadenas se expresan, ensamblan y secretan como inmunoglobulina. En esta biblioteca combinatoria, en principio, cada cadena pesada puede aparearse con cada cadena ligera, para crear un amplio repertorio de diferentes especificidades de antigeno, con diversidad derivada del proceso de reordenamiento (que ademas introduce una mayor diversidad en algunas de las uniones de segmento) y del conjunto combinatorio de las regiones variables de la cadena pesada y ligera. En principio, las celulas B producen solo una especificidad de anticuerpo, codificada por una secuencia de cadena pesada del anticuerpo y una ligera del anticuerpo. El sistema inmune selecciona a traves de un eficiente proceso de seleccion de antfgenos aquellos anticuerpos que pueden unirse a un antfgeno dado, en particular cuando el antfgeno es extrano y parte de un patogeno.

En las inmunoglobulinas naturales, la cadena ligera que consiste de dos dominios se aparean con la cadena pesada, que consiste de al menos 4 dominios y una region bisagra: ocurren interacciones no covalentes entre VH y VL, y entre CH1 y CL; entre este ultimo, un puente disulfuro proporciona un enlace covalente entre cadenas pesadas y ligeras. Ademas, las cadenas pesadas se encuentran apareadas entre sf, es decir en el formato IgG, y otras veces se asocian ademas con elementos adicionales tales como cadenas J (es decir, en el formato IgM). Ocurre una fuerte interaccion no covalente entre los dominios CL y CH1, una interaccion frecuentemente mas debil esta presente entre VL y VH. Las cadenas pesadas se aparean mediante interacciones en la region bisagra (frecuentemente asociadas covalentemente a traves de uno o mas puentes disulfuro) y entre los dominios CH2 y CH3.

Dentro de una celula B, tfpicamente y normalmente solo se expresa una cadena ligera y una pesada, pero en los pocos casos en que se expresan otras cadenas ligeras o pesadas (tales como en dos celulas B fusionadas), mal apareamiento entre las cadenas ocurrira y la union del antfgeno se pierde en esta fraccion de la preparacion del anticuerpo. Por ejemplo, en el pasado, la expresion de multiples dominios variables de anticuerpos, como en cuadromas o celulas transfectadas con multiples genes de cadena pesada y/o ligera, tfpicamente produce una gran fraccion de apareamiento de regiones variables que no son funcionales.

1.2 MoAb terapeuticos

La ingeniena de anticuerpos mas avanzada permite la generacion de anticuerpos 'hechos a medida' en terminos de especificidad, afinidad y mecanismos efectores mediados por la region constante. El fuerte crecimiento de las ventas del creciente numero de MoAb aprobados es testimonio de su exito. En el ano 2000, las ventas combinadas de anticuerpos humanos o humanizados superaron los $ 2 mil millones y se espera que superen los $ 6 mil millones para el 2005. Con 13 MoAb registrados para el tratamiento de una variedad de enfermedades que incluyen cancer, enfermedad autoinmune, rechazo de trasplante y profilaxis antiviral, se estimaron 200 productos de anticuerpos en varias fases de pruebas clmicas y aproximadamente 470 anticuerpos adicionales en desarrollo preclmico, los MoAb ademas fueron en 2002 la categona mas importante de nuevos medicamentos. Por ejemplo, una serie de anticuerpos monoespedficos se han aprobado como terapeuticos humanos. Estos incluyen Orthoclone OKT3, que se dirige al antfgeno cD3; ReoPro, que se dirige a GP IIb IIIa; Rituxan, que se dirige a CD20; Zenapax y Simulect, que se dirigen a los receptores de la interleucina-2; Herceptin, que se dirige al receptor HER2; Remicade, que se dirige al factor de necrosis tumoral; Synagis, que se dirige a la protema F del virus respiratorio sincitial; Mylotarg, que se dirige a CD33; y Campath, que se dirige a cD52 (ver, por ejemplo, Carter (2001) Nature Reviews 1: 118-129; Ezzell (2001) Scientific American Oct. 2001, paginas 36-41; Garber (2001) Nat. Biotechnol. 19: 184-185).

La nocion de que las generaciones actuales de los MoAb humanos recombinantes requieren mas optimizacion para lograr efectos clmicos mejorados ha estimulado el desarrollo de conjugados de anticuerpos: anticuerpos enlazados a farmacos, toxinas o radionuclidos que explotan la especificidad del anticuerpo para suministrar un compuesto altamente toxico a, por ejemplo, celulas tumorales. A pesar de su potencia mejorada, los anticuerpos conjugados son mas toxicos que los anticuerpos 'desnudos' y requieren procesos de fabricacion mas complejos, lo que restringe su aplicabilidad y aumenta sus costos. Ademas, los anticuerpos conjugados no abordan la falta de eficacia de los MoAb cuando destruyen una celula objetivo no es el mecanismo de accion deseado.

Una razon importante para la falta de eficacia de los MoAb desnudos es que solo se unen a un unico epftopo en un objetivo (virus, celula cancerosa, toxina, etcetera). En contraste, en las respuestas de anticuerpos naturales, se generan una multitud de anticuerpos (anticuerpos policlonales) que se unen a muchos epftopos en un objetivo, lo que resulta en una eliminacion o neutralizacion de objetivos mas eficiente. Aunque los anticuerpos policlonales pueden considerarse farmacos mas eficaces que los MoAb, su uso generalizado se ve obstaculizado por muchos inconvenientes.

En el campo del anticuerpo terapeutico, existe la necesidad de nuevos enfoques que combinen la tecnologfa superior existente de los MoAb humanos 'desnudos' con los niveles mas altos de eficacia clmica asociados con los anticuerpos policlonales. Para capturar la eficacia inherente a los anticuerpos policlonales, se han realizado algunos esfuerzos en el desarrollo de cocteles de los MoAb dirigidos a la misma entidad. A nivel de investigacion, se han demostrado efectos aditivos o sinergicos sobre la eficacia terapeutica los para las combinaciones de los MoAb que se produjeron por separado y posteriormente se mezclaron a nivel de protema o se administraron de manera simultanea a modelos animales.

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1.3 Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales aislados de sueros animales se han empleado en la clmica durante mas de un siglo para tratar infecciones bacterianas y virales y aun se aplican para muchas indicaciones diferentes. Los anticuerpos policlonales consisten en una mezcla mal definida de anticuerpos purificados del suero de un animal o humano. El suero policlonal se enriquece de anticuerpos espedficos mediante inmunizacion o infeccion anterior. Se prefieren los productos de origen humano sobre los de origen animal debido a la alta incidencia de reacciones adversas a los sueros de animales y a la proteccion mas duradera conferida por los anticuerpos humanos.

Los anticuerpos policlonales tienen la ventaja de consistir en una multitud de los MoAb que se dirigen a diferentes epftopos, confiriendo de ese modo frecuentemente una actividad biologica mas potente. Aunque se ha demostrado que son efectivos, su uso mas amplio se ha limitado por una variedad de razones, que incluye la inmunogenicidad de protemas derivadas de animales en pacientes humanos. Las preparaciones de anticuerpos policlonales adolecen de los siguientes inconvenientes: (1) Los anticuerpos policlonales son costosos y requieren uso intensivo de mano de obra para producirlos. (2) La cantidad de anticuerpos espedficos en una preparacion de anticuerpo policlonal usualmente representa solo una fraccion diminuta (<1%) de la protema de anticuerpo total, lo que resulta en la inyeccion de grandes cantidades de protema no relevante en los pacientes. (3) Las preparaciones policlonales generadas a partir de donantes inmunes o animales inmunizados son diffciles para el control de calidad. (4) Las preparaciones policlonales generadas a partir de sueros mezclados de donantes inmunes o animales inmunizados presentan variaciones de lote a lote. (5) La especificidad y la afinidad de los anticuerpos espedficos en la preparacion no se definen. (6) La cantidad de antisuero disponible puede limitarse para algunas aplicaciones. (7) Debido a que los anticuerpos policlonales se derivan de mezclas de sueros, existe la posibilidad de transmision de agentes infecciosos (virus, priones). Todavfa, los anticuerpos policlonales tienen la ventaja de consistir en una multitud de MoAb que se dirigen a diferentes epftopos, confiriendo de ese modo frecuentemente una actividad biologica mas potente. Aunque se ha demostrado que son efectivos, su uso mas amplio se ha limitado por una variedad de razones, que incluye la inmunogenicidad de protemas derivadas de animales en pacientes humanos. En algunos casos ha quedado claro que un anticuerpo policlonal de origen animal puede ser mas efectivo que un MoAb: un anticuerpo policlonal de origen de conejo recientemente aprobado, Thymoglobulin@, resulto mas eficaz que un MoAb humanizado, Simulent, en el tratamiento del trasplante rechazo

1.4 Mezclas de protemas

A partir de esta informacion, quedara claro que las mezclas de 3-5 MoAb, preparadas combinando anticuerpos a nivel de protema, tienen efectos terapeuticos superiores en comparacion con los MoAb. Sin embargo, la fabricacion a gran escala de multiples MoAb individuales que se mezclan para formar un producto unico plantea problemas insuperables para el desarrollo farmaceutico relacionado con cuestiones regulatorias, el costo del desarrollo paralelo de multiples MoAb y el diseno de instalaciones de fabricacion actuales para biofarmaceuticos. Similarmente, los anticuerpos policlonales terapeuticos, aunque frecuentemente son mas potentes que los MoAb, presentan importantes problemas de aislamiento, seguridad y desarrollo. Por lo tanto, los metodos para crear mezclas de protemas de union estan abordando una necesidad crucial en la terapia.

Asf, las mezclas de anticuerpos monoclonales funcionales se han hecho expresando y purificando las protemas por separado, y despues mezclandolos a nivel de protema. Generalmente, existen varios otros problemas subyacentes a la produccion de tales mezclas de protemas. Un primer problema al depender de mezclas de protemas de union que se expresaron, produjeron y purificaron por separado y despues se mezclaron, es la susceptibilidad diferencial de cada preparacion a factores externos que modificaran la protema de union. Por ejemplo, frecuentemente se proporcionan epftopos y etiquetas de deteccion/purificacion (tales como myc, etiquetas, o etiquetas ploy-HIS o fusiones a protema A, dominio de protema Z, protema de union a maltosa y GST) para la deteccion y purificacion de la protema de union expresada. Como estos usualmente se localizan en los extremos terminales N o C de la protema de union, tienden a ser propensos a la escision proteolftica. Si la etiqueta de una pero no la otra protema de union se ha degradado ampliamente, por ejemplo, debido a la extensa lisis de las celulas bacterianas durante la produccion, las dos protemas en la mezcla mostraran mas diferencias que su especificidad de union. Otros ejemplos son modificaciones de protemas independientes de secuencia o dependientes tales como glicosilacion, oxidacion, etcetera. La distribucion de glicosilacion de protemas por las celulas eucariotas es susceptible a entre otros factores que estan presentes en los medios de crecimiento de las celulas y por las condiciones de cultivo; incluso cuando se producen protemas de union tales como anticuerpos en las mismas celulas huesped, podra esto no ser una garantfa de que el patron y el contenido de glicosilacion seran identicos. Para este fin, sena conveniente tener un sistema que pudiera eliminar las diferencias indeseables entre las protemas de union que deben usarse como mezclas.

Ademas existen problemas para probar grandes cantidades de mezclas de protemas que se ensamblan in vitro mezclando muestras de los componentes individuales. Cada componente debera prepararse por separado, purificarse y determinarse su cantidad con exactitud. Frecuentemente, la purificacion de protemas es un proceso largo y no facil de usar para cientos de muestras. La determinacion de la fraccion activa de una preparacion de protemas consume mucho tiempo y no siempre es posible, y con el tiempo puede alterarse la actividad (que ademas frecuentemente depende de que tan bien se purifico el componente de la protema). Con este fin sena conveniente tener un metodo que proporcione mezclas de protemas de union que se expresen en diferentes relaciones y se expresen de tal manera que la determinacion de la purificacion y la concentracion pueda hacerse con la misma muestra.

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Existe un tercer problema al depender del tamizaje de las mezclas de protemas purificadas para encontrar la combinacion optima para la actividad biologica y despues producir una celula huesped que expresa los componentes de la protema de union de esa relacion optima. En primer lugar, habra que seleccionar muchas lmeas celulares para encontrar una que exprese la relacion de la combinacion efectiva, un problema que aumenta con el aumento del numero de diferentes protemas de union en la mezcla. Segundo, en algunos casos, la coexpresion de una protema de union simultanea con otras protemas de union puede llevar a efectos negativos inesperados en la agregacion de protemas, en la viabilidad celular y en los niveles de produccion.

2. Fabricacion de mezclas de protemas de union

2.1 Bibliotecas de protemas de union expresadas en cantidades variables

Esta invencion describe metodos para producir bibliotecas de celulas que expresan mezclas de las SPCBP. La invencion proporciona un metodo que aborda al menos algunos de estos problemas citados que ocurren cuando se mezclan protemas in vitro. El metodo minimiza las diferencias entre las protemas de union que se usan como mezcla, debido a la expresion de manera simultanea en la misma celula huesped. Simplifica la manipulacion de las protemas y evita la necesidad de purificar las protemas por separado. Si las protemas de union se modifican postraduccionalmente durante estos procesos, pueden aparecer modificaciones y alteraciones independientes de la secuencia, pero es probable que aparezcan en todas las protemas de union a una frecuencia igual o similar. Por ejemplo, la glicosilacion unida a N de dos protemas de union es mas probable que sea similar, si no indistinguible, cuando estas protemas se expresan en la misma celula huesped en comparacion con la expresion en dos celulas huesped separadas. Esto hara que la caracterizacion e interpretacion de la actividad biologica de la protema sea mas directa. Finalmente, el tamizaje directo de mezclas expresadas por una celula huesped eliminara aquellos casos en los que una protema de union es incompatible con la expresion de otras. Ademas, tiene una serie de ventajas adicionales que se detallan mas abajo.

Se ha descrito la expresion de multiples protemas dentro de la misma celula huesped, por ejemplo para producir protemas que consisten en multimeros funcionales, que sin embargo es un enfoque muy diferente de lo que se presenta aqrn. Las protemas multimericas consisten en dos o mas cadenas polipeptfdicas, posiblemente diferentes, en su forma biologica y/o biotecnologicamente activa. Los ejemplos incluyen anticuerpos (Wright y Morrison, 1997), protemas morfogeneticas oseas (Groeneveld y Burger, 2000), receptores de hormonas nucleares (Aranda y Pascual, 2001), receptores de superficie celular heterodimericos (por ejemplo, receptores de celulas T, (Chan y Mak, 1989)), integrinas (Hynes, 1999) y la familia de la hormona glicoproteica (gonadotropina corionica, hormona luteinizante hipofisaria, hormona estimulante del folmulo y hormona estimulante de la tiroides (Thotakura y Blithe, 1995)). En todos estos casos, los diferentes polipeptidos que se expresaron se ensamblaron en la celula a una protema funcional. La invencion actual es diferente en cuanto a que se expresan multiples protemas de union, y que estas no se asocian y, asf, pueden recuperarse como protemas separadas. Las protemas de union que llevan dos cadenas que forman un sitio de union se excluyen asf de esta invencion. Ademas existe una gran diferencia en el enfoque y en el resultado final. La produccion de una protema multimerica en un sistema heterologo es tecnicamente difmil debido a las dificultades para lograr la produccion de los polipeptidos monomericos en proporciones estequiometricamente equilibradas (Kaufman, 2000). La expresion desequilibrada de los monomeros es un desperdicio de los costosos recursos usados en el cultivo celular y puede tener efectos perjudiciales en la celula (que incluyen el secuestro de factores celulares necesarios para la secrecion de protemas recombinantes y la induccion de respuestas de estres que resultan en velocidades reducidas de crecimiento y la traduccion de protemas, o incluso en la apoptosis (muerte celular programada)). Tales efectos perjudiciales conducen a perdidas en productividad y rendimiento y a costos generales mas altos. Muchos sistemas de expresion descritos para tales protemas multimericas se han centrado, por lo tanto, en la obtencion de una expresion equilibrada y proporcional de dos o mas monomeros polipeptfdicos que son constituyentes de una protema multimerica. En esta invencion, se crean bibliotecas de celulas que expresan cada una las diferentes protemas de union a proposito en una relacion diferente, de manera que se produce una biblioteca de celulas que expresan un subconjunto de al menos dos protemas de union y en la que la relacion entre los niveles de expresion de las dos protemas de union es altamente variable. Eventualmente, se determina la relacion que media la bioactividad adecuada y la lmea celular que produce esta relacion se usa para producir la mezcla de dos protemas de union a esta relacion.

2.2. Ejemplos de las SPCBP y metodos para identificar estas

El desarrollo de protemas de union solubles que reconocen moleculas objetivo dadas es importante en las ciencias de la vida y la biotecnologfa. Durante el ultimo siglo, este campo se domino por los anticuerpos, que se generaron tradicionalmente a traves de la inmunizacion de animales, pero ademas se hicieron disponibles por medio de metodos de ingeniena de protemas. Las protemas de union usadas en esta invencion se basan en un polipeptido simple. Pueden generarse a partir a partir de ciertos animales (ver mas abajo) o como protemas de union artificial in vitro, mediante la aplicacion de tecnicas de biotecnologfa combinatoria con andamios o pliegues de protemas. La aplicabilidad de un andamio o pliegue radica en la capacidad de introducir diversidad permisiva, sin destruir la estructura terciaria del pliegue proteico, y la capacidad de recuperar moleculas de union de un repertorio diverso. Usualmente, los andamios existentes se reclutan para aleatorizar algunos residuos de aminoacidos expuestos despues del analisis de la estructura del cristal. La recuperacion de las variantes de union de este andamio puede lograrse mediante la presentacion de fagos y la seleccion de afinidad en el ligando elegido. Las propiedades de un andamio se determinan en gran parte por la

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naturaleza de la aplicacion y las propiedades del andamio. Muchos andamios descritos hasta la fecha son pequenas protemas globulares, y frecuentemente comprenden un dominio unico (as^ son mas faciles de producir, purificar y modificar geneticamente en reactivos multivalentes o multiespedficos).

En muchos casos, los andamios cumplen una o la totalidad de la siguiente lista de criterios, convirtiendolos en protemas de union alternativas atractivas para los anticuerpos. (1) el andamio debe expresarse como una protema soluble en huespedes compatibles con la biblioteca (E. coli y otras bacterias, celulas de levadura, celulas infectadas con Baculovirus, celulas eucariotas), y que son susceptibles a tamizaje o presentacion para venta grande y tecnologfa de seleccion (como fagos, ribosomas, ARNm, pantalla celular); (2) la estructura terciaria del andamio no debe perturbarse por la introduccion de la diversidad; (3) el andamio ademas debe ser estable; (4) el andamio debena tener bucles permisivos, parches y/o superficies para introducir diversidad en una serie de sitios elegidos, en donde la naturaleza de la superficie de union requerida depende de la aplicacion; (5) debe tener una gran superficie de union accesible que tenga el potencial de diversificarse y volverse a elegir, por ejemplo para propositos de maduracion de afinidad; (6) el andamio debe obtenerse mediante ingeniena para fabricar moleculas monoespedficas/biespedficas/triespedficas o en general multiespedficas; (7) debena permitir la fusion en el extremo N y/o C; y (8) para uso terapeutico en humanos, debe ser preferentemente no inmunogenico y humano, y (9) debe ser resistente a la proteolisis.

2.2.1 Anticuerpos de dominio unico

El primer andamio que debe considerarse es uno que se usa en las protemas naturales de union, los anticuerpos. Los dos dominios del anticuerpo, que forman el fragmento Fv, son tfpicamente la unidad mas pequena de un anticuerpo que retiene la actividad de union sin perdida significativa en la afinidad y especificidad del antfgeno. Pero un dominio en sf mismo ademas puede retener la actividad de union al antfgeno, y existir como una unica protema de union basada en el pliegue de inmunoglobulina. Se han descrito fragmentos de anticuerpos de dominio unico basados en un unico dominio VH (Ward, E. S. y otros (1989) Nature 341: 544-546), y ademas se han mostrado como moleculas naturales en camelidos (Hamers-Casterman, C. y otros (1993) Nature 363: 446- 448). Ademas, los dominios VH unicos se han seleccionado de diversas bibliotecas exhibidas de fagos de humanos modificados (Davies, J. y otros (1995) Biotechnology (N Y) 13: 475-479) o dominios VH de raton (Reiter, Y. y otros (1999) J Mol Biol 290: 685-698). Mas recientemente, los dominios unicos VH y VL humanos se han modificado geneticamente para unirse a antfgenos proteicos (van den Beucken, T. y otros (2001) J Mol Biol 310: 591-601; Holt, L. J. y otros (2003) Trends Biotechnol 21: 484-490).

2.2.2. Anticalinas

Un ejemplo de un tipo alternativo de protemas de union a ligando son las anticalinas, construidas sobre la base de lipocalinas como un andamio. El elemento central de esta arquitectura de la protema es una estructura de barril beta de ocho cadenas antiparalelas, que soporta cuatro bucles en su extremo abierto. Estos bucles forman el sitio de union natural de las lipocalinas y se han reformado in vitro mediante un amplio reemplazo de aminoacidos, creando asf nuevas especificidades de union (Skerra, A. (2001) J Biotechnol 74: 257-275.). Por ejemplo, la protema de union a bilina (BBP), una lipocalina de Pieris brassicae, se empleo como un sistema modelo para la preparacion de una biblioteca aleatoria con 16 residuos mutagenizados selectivamente. Usando tecnicas de presentacion de fagemidos bacterianos y tamizaje de colonias, se seleccionaron varias variantes de lipocalina de esta biblioteca, que exhidan actividad de union para compuestos como fluorescema o digoxigenina. Se describe que las anticalinas poseen alta afinidad y especificidad por sus ligandos prescritos, asf como por su cinetica de union rapida, de manera que sus propiedades funcionales son similares a las de los anticuerpos. Sin embargo, las anticalinas exhiben varias ventajas, que incluyen un tamano mas pequeno, la composicion de una cadena polipeptfdica simple y un conjunto simple de cuatro bucles hipervariables que pueden manipularse facilmente a nivel genetico.

2.2. 3. Aficuerpos

La ingeniena de protemas ademas se ha usado para generar protemas de union espedficas del producto hechas a medida que se usan como ligandos de afinidad en el proceso de recuperacion del producto (Jonasson, P. y otros (2002) Biotechnol Appl Biochem 35: 91-105). Particularmente utiles para este proceso son protemas de union modificadas geneticamente tales como los aficuerpos, protemas basadas en el andamio de tres helices del dominio Z derivado de la protema A estafilococica. Las bibliotecas de aficuerpo se crean por variegacion combinatoria de residuos dentro del dominio Z del conjunto de tres helices derivado de la protema A estafilococica, y los aficuerpos que se unen al objetivo de los interesados seleccionados usando la presentacion de fagos o tecnologfas similares. Se han identificado aficuerpos para una amplia gama de otras protemas y se han usado para la cromatograffa de afinidad de protemas objetivo tales como IgA humana, factor VIII, ADN polimerasa Klenow y la proteasa viral 3C (Graslund, T. y otros (2002) J Biotechnol 96: 93-102) (Nord, K. y otros (2001) Eur J Biochem 268: 4269-4277).

2.2. 4. Aislamiento de las SPCBP reactivas al antfgeno

SPCBP puede aislarse por ejemplo usando tecnologfa de biblioteca de anticuerpos basada en la presentacion, en donde las protemas de union a antfgeno se seleccionan exponiendo una biblioteca de protemas que se presentan en la superficie del fago, levadura u otra celula huesped, al antfgeno de interes y aislando esas variantes que se unen a la

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preparacion del antigeno. Una biblioteca de presentacion es una coleccion de entidades; cada entidad incluye un componente polipeptidico accesible y un componente recuperable que codifica o identifica el componente peptidico. Se han mostrado muchas protemas en la superficie de entidades que portan el material genetico que codifica la protema dentro de la entidad, tal como los bacteriofagos. Este formato se denomina "presentacion de fagos." La presentacion de fagos se describe por ejemplo, en Ladner y otros, patente de Estados Unidos num. 5,223, 409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; documento de patente WO 00/70023; documento de patente WO 92/18619; documento de patente WO 91/17271; documento de patente WO 92/20791; documento de patente WO 92/15679; documento de patente WO 93/01288; documento de patente WO 92/01047; documento de patente WO 92/09690; documento de patente WO 90/02809; documento de patente WO 00/70023; Fuchs y otros (1991) BiolTechnology 9: 1370-1372; Hay y otros (1992) Hum Antibody Hybridomas 3: 81-85; Huse y otros (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths y otros (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins y otros (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clackson y otros (1991) Nature 352: 624-628; Gram y otros (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrard y otros (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Rebar y otros (1996) Methods Enzymol. 267: 129- 49; Hoogenboom y otros (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas y otros (1991) PNAS 88: 7978-7982. Se han desarrollado sistemas de presentacion de fagos para fago filamentoso (fago fl, fd y M13) asf como para otros bacteriofagos (por ejemplo, bacteriofago T7 y fagos lambdoides; ver, por ejemplo, Santini (1998) J. Mol. Biol. 282: 125-135; Rosenberg y otros (1996) Innovations 6: 1-6; Houshmand y otros (1999) Anal Biochem 268: 363-370). Los sistemas de presentacion de fagos filamentosos tipicamente usan fusiones a una protema de recubrimiento menor, tal como protema de gen III, y protema de gen VIII, una protema de recubrimiento principal, pero ademas pueden usarse fusiones a otras protemas de recubrimiento tales como protema de gen VI, protema de gen VII, protema de gen IX, o sus dominios (ver, por ejemplo, documento de patente, WO 00/71694).

Otros formatos de presentacion utilizan fusiones de peptido con acido nucleico. El ARN y el polipeptido codificado por el ARN pueden asociarse ffsicamente estabilizando los ribosomas que estan traduciendo el ARN y tienen el polipeptido naciente unido. Las fusiones de polipeptido acido nucleico pueden generarse mediante la traduccion in vitro de ARNm que incluye un grupo de puromicina unido covalentemente, por ejemplo, como se describe en Roberts y Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 12297-12302, y la Patente de Estados Unidos num. 6,207, 446. El ARNm despues puede transcribirse de manera inversa en ADN y reticularse al polipeptido. Tfpicamente, se usan altas concentraciones de Mg2+ divalentes y baja temperatura. Ver, por ejemplo, Mattheakis y otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022 y Hanes y otros (2000) Nat Biotechnol. 18: 1287-92; Hanes y otros (2000) Methods Enzymol. 328: 404-30. y Schaffitzel y otros (1999) J Immunol Methods. 231 (1-2): 119-35.

En otro formato de presentacion, la biblioteca es una biblioteca de presentacion en las celulas. Las protemas se presentan en la superficie de una celula, por ejemplo, una celula eucariotica o procariota. Las celulas procariotas ilustrativas incluyen celulas de E. coli, celulas B. subtilis, esporas, celulas eucariotas ilustrativas incluyen levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, celulas de insecto y celulas de mairnfero. La presentacion en la superficie de levadura se describe, por ejemplo, en Boder y Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15: 553-557. La presentacion en levadura es particularmente adecuada para aislar las SPCBP. En una modalidad, las secuencias de acidos nucleicos variegadas que codifican variantes de andamios se clonan en un vector para presentacion en levaduras. La clonacion une la secuencia variegada con un dominio (o completa) protema de superficie celular de levadura, por ejemplo, preferentemente Aga2, Agal, Flol o Gasl. Un dominio de estas protemas puede anclar el polipeptido codificado por la secuencia de acido nucleico variegado por un dominio transmembrana (por ejemplo, Flol) o mediante enlace covalente a la bicapa fosfolipfdica (por ejemplo, Gasl).

Aun otro formato de presentacion es una presentacion no biologica en la que el componente polipeptfdico se une a una etiqueta de acido no nucleico que identifica el polipeptido. Por ejemplo, la etiqueta puede ser una etiqueta qmmica unida a una perla que presenta el polipeptido o una etiqueta de radiofrecuencia (ver, por ejemplo, la Patente de Estados num. 5, 874, 214).

Los metodos para la presentacion de las SPCBP y la construccion de bibliotecas en una variedad de formatos se describen bien en la literatura y son conocidos por los expertos en la tecnica. Alternativamente para presentar, a veces es factible el tamizaje directo de bibliotecas variantes de SPCBP, por ejemplo, cuando la frecuencia de los clones reactivos con antfgeno es relativamente alta (como en bibliotecas de genes VHH de camello, dromedario o llama inmune), por alto rendimiento y metodos automatizados de tamizaje.

Los anticuerpos de dominio unico se afslan preferentemente de los repertorios de presentacion in vitro hechos a partir de un repertorio de un dominio unico de ciertos fragmentos de la region variable humana, tales como los repertorios VH humano o VL humano. En otra modalidad, los anticuerpos de dominio unico se afslan de repertorios de VHH no inmunizados, inmunizados o sinteticos, basados en dominios de cadena pesada de anticuerpo naturalmente carentes de cadenas ligeras (por ejemplo, anticuerpos de camello, llama o algunos de tiburon.

Las tecnologfas de seleccion y tamizaje citadas de la SPCBP se establecen bien en el campo. Los polipeptidos espedficos al antfgeno pueden identificarse a partir de bibliotecas de presentacion mediante tamizaje directo de la biblioteca, o pueden seleccionarse primero en el antfgeno para aumentar el porcentaje de clones reactivos con antfgeno. El proceso de seleccion se lleva a cabo mediante una variedad de tecnicas bien conocidas en la tecnica, que incluyen el uso del antfgeno unido a una superficie (por ejemplo, una superficie de plastico, como en los pasos de seleccion), o mediante el uso del antfgeno unido a una partmula de fase solida que puede aislarse sobre la base de las

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propiedades de las perlas (por ejemplo, perlas de latex coloreadas o partmulas magneticas), o mediante clasificacion celular, especialmente la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS). Como sera evidente para un experto en la tecnica, el reactivo de afinidad espedfico al antigeno se une directa o indirectamente (por ejemplo, a traves de un anticuerpo secundario) al tinte, sustrato o partmula. Los procedimientos de seleccion se han descrito ampliamente en la literatura (ver, por ejemplo, Hoogenboom, (1997) Trends Biotechnol. 15: 62-70). La union de las SPCBP a sus antigenos respectivos se lleva a cabo usando tecnicas de ensayo basadas en anticuerpos, tales como tecnicas de ELISA, inmunoelectrotransferencia, inmunohistoqmmica, analisis de Resonancia de Plasmon de Superficie (SPR), cromatograffa de afinidad y similares, de conformidad con los metodos conocidos por aquellos con experiencia en la tecnica (ver, por ejemplo Sambrook y otros, 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2da Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Estas tecnicas son alternativas viables a las tecnicas tradicionales de hibridoma para el aislamiento de anticuerpos "monoclonales" (especialmente cuando se requieren anticuerpos humanos), que se abarcan por la presente invencion.

2.2. 5 Ensayos a ciegas para las SPCBP y mezclas de las SPCBP

A continuacion se describen posibles modalidades de ensayos ilustrativos para los ensayos de union:

ELISA. Los polipeptidos codificados por una biblioteca de presentacion ademas pueden examinarse para una propiedad de union usando un ensayo de ELISA. Por ejemplo, cada polipeptido se pone en contacto con una placa de microtitulacion cuya superficie inferior se ha recubierto con el objetivo, por ejemplo, una cantidad limitante del objetivo. La placa se lava con tampon para eliminar los polipeptidos que no se unen espedficamente. Despues, la cantidad de la protema unida a la placa se determina mediante el sondeo de la placa con un anticuerpo que puede reconocer el polipeptido, por ejemplo, una etiqueta o porcion constante del polipeptido. El anticuerpo se enlaza a una enzima tal como fosfatasa alcalina, que produce un producto colorimetrico cuando se proporcionan los sustratos apropiados. El polipeptido puede purificarse a partir de celulas o ensayarse en un formato de biblioteca de presentacion, por ejemplo, como una fusion a una capa de bacteriofago filamentoso. En otra version del ensayo ELISA, cada polipeptido de una biblioteca se usa para recubrir un pocillo diferente de una placa de microtitulacion. El ELISA procede despues usando una molecula objetivo constante para pesquisar cada pocillo.

Resonancia de plasmon superficial (SPR). La interaccion de union de una molecula aislada de la biblioteca de cadenas de diversidad con un objetivo puede analizarse usando SPR. Por ejemplo, despues de secuenciar un miembro de la biblioteca de presentacion presente en una muestra, y opcionalmente verificado, por ejemplo, mediante ELISA, el polipeptido presentado puede producirse en cantidad y ensayarse para unir al objetivo usando SPR. La SPR o Analisis de Interaccion Biomolecular (BIA) detectan las interacciones bioespedficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes. Los cambios de la masa en la superficie de union (indicativos de un evento de union) de la matriz de BIA dan lugar a alteraciones del mdice de refraccion de la luz cerca de la superficie (el fenomeno optico de resonancia de plasmon superficial). Los cambios en la refractividad generan una serial detectable, que se mide como una indicacion de las reacciones en tiempo real entre las moleculas biologicas. Los metodos para usar SPR se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos num. 5,641, 640; Raether (1988) Surface Plasmon Springer Verlag; Sjolander y Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63: 2338-2345; Szabo y otros (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 699- 705 y recursos en lmea proporcionados por BIAcore International AB (Uppsala, Suecia). La informacion de la SPR puede usarse para proporcionar una medida precisa y cuantitativa de la constante de disociacion de equilibrio (Kd), y parametros cineticos, que incluyen kon y kog, para la union de una biomolecula a un objetivo. Tales datos pueden usarse para comparar diferentes biomoleculas. Por ejemplo, protemas codificadas por acidos nucleicos seleccionados a partir de una biblioteca de cadenas de diversidad pueden compararse para identificar individuos que tienen alta afinidad por el objetivo o que tienen koff lenta. Esta informacion puede usarse ademas para desarrollar la relacion estructura actividad (SAR). Por ejemplo, los parametros de union cinetica y de equilibrio de las versiones maduras de una protema original pueden compararse con los parametros de la protema original. Pueden identificarse aminoacidos variantes en posiciones dadas que se correlacionan con parametros de union particulares, por ejemplo, alta afinidad y koff lenta. Esta informacion puede combinarse con el modelado estructural (por ejemplo, usando el modelado de homologfa, la minimizacion de energfa o la determinacion de la estructura por cristalograffa o NMR). Como resultado, puede formularse y usarse una comprension de la interaccion ffsica entre la protema y su objetivo para guiar otros procesos de disero.

Ensayos de union homogenea. La interaccion de union del polipeptido candidato con un objetivo puede analizarse usando un ensayo homogeneo, es decir, despues de que se anaden todos los componentes del ensayo, no se requieren manipulaciones adicionales de fluidos. Por ejemplo, la transferencia de energfa de resonancia fluorescente (FRET) puede usarse como un ensayo homogeneo (ver, por ejemplo, Lakowicz y otros, Patente de Estados Unidos num. 5,631, 169; Stavrianopoulos, y otros, Patente de Estados Unidos num. 4,868, 103). Otro ejemplo de un ensayo homogeneo es el Tamizaje Alfa (Packard Bioscience, Meriden CT). El Tamizaje Alfa usa dos perlas marcadas. Una perla genera oxfgeno singlete cuando se excita con un laser. La otra perla genera una senal de luz cuando el oxfgeno singlete se difunde desde la primera perla y choca con ella. La senal solo se genera cuando las dos perlas estan cerca. Una perla puede unirse al miembro de la biblioteca de presentacion, y la otra al objetivo. Las senales se miden para determinar el alcance de la union. Los ensayos homogeneos pueden realizarse mientras el polipeptido candidato se une al vehmulo de la biblioteca de presentacion, por ejemplo, un bacteriofago. Otros metodos para determinar las afinidades de union ademas son adecuados, tales como el uso de los sistemas basados en Kinexa y Luminex.

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Tamizaje automatizado. Los metodos y composiciones proporcionados en la presente descripcion ademas son adecuados para el tamizaje automatizado de bibliotecas de diversidad para encontrar clones con reactividad al antigeno. Por ejemplo, una biblioteca de presentacion de la SPCBP puede tamizarse para los miembros que se unen a una molecula objetivo. La biblioteca puede seleccionarse directamente o primero seleccionarse en el antigeno una o varias veces. Los atadores de una primera ronda de tamizaje pueden amplificarse y volver a tamizarse, una o mas veces. Los atadores de la segunda ronda o posteriores se afslan individualmente, por ejemplo, en una placa de multiples pocillos. Cada atador individual puede ensayarse despues para unirse a la molecula objetivo, por ejemplo, usando ELISA, un ensayo de union homogeneo o una matriz de protemas. Estos ensayos de clones individuales pueden automatizarse mediante robotica. Las secuencias de los clones seleccionados pueden determinarse usando robots y cebadores de oligonucleotidos que permiten leer las secuencias de la region variable de los clones seleccionados. Los resultados del ensayo y las secuencias pueden almacenarse en un sistema informatico y evaluarse a vista o mediante el uso de software, por ejemplo, para identificar clones que cumplen parametros particulares (por ejemplo, para la afinidad y/o especificidad de union, y para la homologfa de secuencia).

2.3 La produccion de bibliotecas de mezcla de las SPCBP

Las SPCBP son altamente adecuadas para preparar composiciones farmaceuticas de protemas de union que se unen a multiples objetivos mediante coexpresion en la misma celula huesped.

2.3.1 Sistemas de expresion basicos para la produccion de bibliotecas

El vector de expresion o vectores que comprenden los genes de SPCBP de interes contienen secuencias reguladoras, que incluyen, por ejemplo, un promotor, unido operativamente al (a los) acido (s) nucleico (s) de interes. Gran numero de vectores y promotores adecuados se conocen por aquellos con experiencia en la tecnica y estan comercialmente disponibles para generar los constructos recombinantes de la presente invencion. Se describen vectores apropiados de clonacion y expresion para su uso con huespedes procariotas y eucariotas por Sambrook, y otros, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), cuya descripcion se incorpora en la presente descripcion como referencia. Los siguientes vectores se proporcionan a modo de ejemplo.

Para la expresion de alto nivel en huespedes eucariotas, por ejemplo, los elementos reguladores ilustrativos potenciadores/promotores incluyen elementos derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador potenciador CMV/promotor AdMLP o un elemento regulador potenciador SV40/promotor AdMLP. Ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos num. 5, 385, 839. Los promotores eucariotas incluyen CMV temprano inmediato, timidina quinasa HSV, ubiquitina, factor de alargamiento-10, SV40 temprano y tardm, los LTR de retrovirus, metalotionema-I de raton, y diversos promotores espedficos de tejido conocidos en la tecnica. Los promotores adecuados para obtener expresion en celulas eucariotas son el promotor CAW, un promotor EFI-alfa de mairnfero, un promotor de ubiquitina de mamffero o un promotor SV40. Pueden usarse metodos bien conocidos por aquellos con experiencia en la tecnica para construir vectores que contienen un polinucleotido de la invencion y senales de control reguladoras transcripcionales/traduccionales y otras apropiadas. Los vectores de expresion eucariotas incluyen los siguientes ejemplos: pWLneo, pSV2cat, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG, y pSVL (Pharmacia). Las regiones promotoras pueden seleccionarse de cualquier gen deseado usando vectores CAT (cloranfenicol transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados son pKK232-8 y pCM7.

Ciertos de los vectores de expresion proporcionados en esta invencion contienen sitios internos de entrada de ribosomas (IRES). IRES permiten a los ribosomas eucariotas entrar y explorar un ARNm en una posicion que no sea la estructura de 5'm7 G-cap. Si se coloca internamente, por ejemplo, 3' de una primera region de codificacion (o cistron), un IRES permitira la traduccion de una segunda region de codificacion dentro de la misma transcripcion. La segunda region de codificacion se identifica por el primer ATG encontrado despues del IRES. Los elementos ilustrativos de IRES incluyen IRES virales tales como IRES de picornavirus y el IRES de cardiovirus (ver, por ejemplo, Patente de Estados Unidos num. 4,937, 190) y elementos de IRES no virales encontrados en los 5'UTR (por ejemplo, aquellos elementos de transcritos que codifican la protema de union a cadena pesada de inmunoglobulina (BiP) (Macejak, D. G., y otros Nature, 35390-4,1991); Drosophila Antennapedia (Oh, S. K., y otros, Genes Dev, 6: 1643-53, 1992) y Ultrabithorax (Ye, X., y otros, Mol. Cell Biol., 17: 1714- 21,1997); factor de crecimiento de fibroblastos 2 (Vagner, S., y otros, Mol. Cell Biol., 15: 35- 44,1995); factor de iniciacion eIF4G (Gan, y otros, JBiol. Chem., 273: 5006-12, 1998); proto oncogen c-myc (Nanbru, y otros, J. Biol. Chem., 272: 32061-6, 1995; Stoneley, M., Oncogene, 16: 423-8,1998); y el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Stein, I., y otros, Mol. Cell Biol., 18: 3112-9, 1998).

Otros elementos reguladores se relacionan con el control de la cromatina. Estos incluyen elementos con varios nombres y aislados en varios procedimientos que proporcionan estabilidad a largo plazo y expresion del transgen (es) espedfica o no espedfica (s) de tejido. En general, las secuencias de control de la cromatina afslan la transcripcion de genes ubicados dentro de su intervalo de accion, pero que no perturban la expresion genica, ya sea negativa o positivamente. Por ejemplo, modulan (por ejemplo, protegen) los efectos reguladores de la cromatina y las secuencias cercanas en un entorno nuclear, tfpicamente un entorno cromosomico. Asf, los aisladores pueden permitir un control regulador sostenido y/o adecuado de secuencias integradas en regiones heterologas de un cromosoma.

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Ejemplos de elementos reguladores son los siguientes. Los elementos Kmites (BE) o elementos aislantes definen los Kmites en la cromatina y tienen un papel en la definicion de los dominios transcripcionales in vivo. Carecen de actividad promotora/potenciadora intrrnseca, pero mas bien se cree que protegen los genes de la influencia transcripcional de los elementos reguladores en la cromatina circundante. Se ha demostrado que las S/MAR o las regiones de fijacion al andamio/matriz interaction con los potenciadores para aumentar la accesibilidad a la cromatina local y pueden mejorar la expresion de genes heterologos en lrneas de cultivo celular, ratones transgenicos y plantas. LCR de las regiones de control del locus son elementos reguladores cis necesarios para la activacion de la cromatina inicial de un locus y la transcripcion genica secuencial en sus ubicaciones nativas (revisado por Grossveld, 1999). LCS generalmente confiere expresion espedfica de tejido en los genes enlazados. Ademas existen otros elementos (STAR o elementos estabilizadores contra el represor, elementos de apertura de la cromatina ubicuos o los UCO, etcetera) que se han identificado y que tienen cierta capacidad para aumentar la expresion transgenica estable en celulas huesped industrialmente relevantes tales como CHO. La mayona de estos elementos funcionan en cis al transgen, pero ademas se ha reportado que las MAR funcionan cuando se cotransfectan en trans con el transgen (Zahn-Zabel y otros (2001) J. Biotechnology 87: 29-42). Los aislantes ilustrativos incluyen ademas un segmento de ADN que abarca el extremo 5' del locus de a globina de pollo y corresponde al sitio hipersensible constitutivo 5' del pollo como se describe en los elementos descritos en la publicacion PCT 94/23046, en Bell y otros (2001) Science 291: 447-50, y STAR de Chromagenics B. V. (Amsterdam, The Netherlands).

Los vectores de expresion de mamfferos comprenderan un origen de replicacion, un promotor adecuado y ademas cualquier sitios de union al ribosoma necesario, sitio de poliadenilacion, sitios donador y aceptor, secuencias transcripcional de terminacion y secuencias 5' no transcritas flanqueantes. La Figura 1A presenta una imagen esquematica del esqueleto del vector y de los casetes de expresion de las SPCBP en eucariotas y tfpicamente en celulas de mairnferos. La Figura 1B describe lo mismo para organismos procariotas como E. coli. Las secuencias reguladoras de expresion comprenden promotores, potenciadores, regiones de fijacion al andamio, elementos reguladores negativos, sitios de iniciacion transcripcional, sitios de union a proternas reguladores o combinaciones de dichas secuencias. Alternativamente, las secuencias que afectan la estructura o la estabilidad del ARN o proterna producida se reemplazan, eliminan, anaden o modifican de cualquier otra forma mediante el direccionamiento, que incluyen las senales de poliadenilacion, los elementos de estabilidad del ARNm, los sitios de corte y empalme, secuencias lfder para mejorar o modificar las propiedades de transporte o secrecion de la proterna, u otras secuencias que alteran o mejoran la funcion o la estabilidad de las moleculas de proterna o ARN, que incluyen el iARN. Ademas de la secuencia de acidos nucleicos que codifican las proternas SPCBP, los vectores de expresion recombinantes pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la replicacion del vector en las celulas huesped (por ejemplo, ongenes de replicacion) y genes de marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la seleccion de las celulas huesped en las que el vector se ha introducido (ver, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos nums. 4,399, 216,4, 634,665 y 5,179, 017). Tfpicamente es un gen y/o proterna cuya presencia puede detectarse directa o indirectamente en una celula, por ejemplo, un gen y/o una proterna que inactiva un agente de seleccion y protege la celula huesped de los efectos letales o inhibidores del crecimiento del agente (por ejemplo, un gen y/o proterna de resistencia a antibioticos). Por ejemplo, tfpicamente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a farmacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una celula huesped en la que el vector se introdujo. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en celulas huesped dhfr con seleccion/amplificacion de metotrexato), el gen neo (para la seleccion G418), la proterna marcadora seleccionable para la resistencia a la zeocina (zeo) y el marcador seleccionable de blasticidina (bsd). Para las celulas NSO, el sistema de Glutamina sintetasa se ha usado ampliamente y se ha revisado como sistema de amplificacion. (Bebbington y otros, 1991, Bio/Technology 10: 169-175; Barnes y otros, Biotechnol Bio eng 73: 261). El unico antibiotico que es particularmente ventajoso es la zeocina, porque la proterna de resistencia a la zeocina (zeocina-R) actua uniendose al farmaco y haciendolo inofensivo. Por lo tanto, es facil valorar la cantidad de farmaco que destruye a las celulas con bajos niveles de expresion de zeocina-R, mientras que permite que los expresores de alta expresion sobrevivan. Otra posibilidad es que dicho marcador de seleccion induzca fluorescencia o un deposito de color (por ejemplo, proterna fluorescente verde y derivados, luciferasa o fosfatasa alcalina).

En un sistema ilustrativo para la expresion recombinante de un anticuerpo modificado, o una porcion de union a antfgeno de este, de la invencion, se introduce un vector de expresion recombinante que codifica al menos dos genes de SPCBP en celulas CHO dhfr- mediante transfeccion mediada por fosfato de calcio. Dentro del vector de expresion recombinante, los dos genes de SPCBP se unen operativamente a elementos reguladores del potenciador/promotor (por ejemplo, derivados de SV40, CMV, adenovirus y similares, tales como un elemento regulador potenciador de CMV/promotor de AdMLP o un elemento regulador potenciador de SV40/promotor de AdMLP) para conducir altos niveles de transcripcion de los genes. El vector de expresion recombinante ademas porta un gen DHFR, que permite la seleccion de celulas CHO que se han transfectado con el vector usando seleccion/amplificacion con metotrexato. Las celulas huesped transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresion de los dos genes de SPCBP. Se usan tecnicas estandar de biologfa molecular para preparar el vector de expresion recombinante, transfectar las celulas huesped, seleccionar transformantes, cultivar las celulas huesped y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo.

Muchas de las SPCBP en virtud de su tamano compacto y estructura de dominio unico son ideales para expresarse como huespedes unicelulares tales como celulas de levadura o huespedes procariotas. Los fragmentos de las bibliotecas dAb de llama han demostrado excelentes propiedades de solucion (Tanha y otros, 2002, J. Immunol. Methods 263: 97- 969), ademas en comparacion con anticuerpos de raton y humanos y regiones VH (Ewert y otros

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2002, Biochemistry 41: 3628-36), y los fragmentos de anticuerpo VHH se han producido a altos niveles en Saccharomyces cerevisiae y Pichiapastoris (Thomassen y otros, 2002, Enzyme Microb. Technol. 30: 273-278; Frenken y otros, 2000, J. Biotechnol 78: 11-21; Holt y otros, 2003, Trends Biotechnol 11: 484-90). Se han descrito sistemas amplios para la expresion de protemas heterologas y, en particular, las SPCBP como fragmented de anticuerpos, protemas VHH, los dAb, dominios Kunitz, aficuerpos y fluorocuerpos, en procariotas y/o eucariotas inferiores. Ademas, se ha informado la expresion de protemas multimericas en estos huespedes.

Las bibliotecas de celulas que expresan las SPCBP se producen mediante la introduccion en las celulas de un vector, multiples vectores, o en cromosomas artificiales (ACE; Cytometry. 1999 Feb 1; 35 (2): 129-33), en los que se han clonado genes que codifican multiples SPCBP. Los plasmidos despues de la transfeccion se integran en el genoma de la celula huesped o existen como un elemento genetico independiente (por ejemplo, episoma, plasmidos). Los vectores de conformidad con la presente invencion son vectores de copia unica o vectores de copia multiple. Los vectores preferidos de la presente invencion incluyen vectores de expresion de levaduras, particularmente 211 vectores y vectores de centromero. Muchos de los vectores preferidos para la expresion en eucariotas son vectores lanzadera, conocidos en la tecnica como vectores que pueden replicarse en mas de una especie de organismo. Por ejemplo, un vector lanzadera que puede replicarse tanto en Escherichia coli (E. coli) como Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) puede construirse mediante secuencias de enlace de un plasmido de E. coli con secuencias del plasmido de levadura 2p.

El huesped de la presente invencion ademas es una levadura u otros hongos tales como Aspergillus. En la levadura, se usa una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Para una revision, ver, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel y otros, Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Cap. 13 (1988); Grant y otros, Expression and Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Enzymology, Ed. Wu & Grossman, Acad. Press, N. Y. 153: 516-544 (1987); Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D. C., Ch. 3 (1986); Bitter, Heterologous Gene. Expression in Yeast, en Methods in Enzymology, Eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N. Y. 152: 673-684 (1987); y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern y otros, Cold Spring Harbor Press, Vols. I y 11 (1982). El huesped de la presente invencion es ademas un organismo procariota, tal como E. coli. Como un ejemplo representativo pero no limitante, los vectores de expresion utiles para bacterias pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de replicacion bacteriano derivado de plasmidos comercialmente disponibles que comprenden elementos geneticos del conocido vector de clonacion pBR322 (ATCC 37017). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEMI (Promega, Madison, WI, Estados Unidos). Otros plasmidos de expresion procariotica se proporcionan como ejemplos: Bacterianos: pBs, phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223- 3, pKK233-3, pDR540, y pRIT5 (Pharmacia). Los promotores bacterianos particulares incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P, y trc. Se usan secuencias de control transcripcional para dirigir la expresion de transcritos que codifican el gen o genes de SPCBP. Para la expresion de levadura, los siguientes plasmidos de expresion se proporcionan como ejemplos. Los vectores de expresion para su uso en levadura incluyen YRp7 (Struhl y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 76: 1035-1039, 1979), YEpl3 (Broach y otros, Gene 8: 121-133,1979), pjDB248 y pJDB219 (Beggs, ibid.), y sus derivados. Tales vectores generalmente comprenderan un marcador seleccionable, tal como el marcador nutricional TRP1, que permite la seleccion en una cepa huesped que porta una mutacion trpl, o el marcador seleccionable pOT1, que permite la seleccion en una cepa tpi cultivada en medio rico (Kawasaki y Bell, EP 171, 142). Los promotores y los terminadores preferidos para su uso en vectores de expresion de levaduras incluyen aquellos de genes glicoltticos de levadura (Hitzeman y otros, J. Biol. Chem. 255: 12073-12080, 1980; Alber y Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet, 1: 419-434, 1982; Kawasaki, Patente de Estados Unidos num. 4,599, 311) o genes de alcohol deshidrogenasa (Young y otros, en Hollaender y otros (eds.), Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Plenum, Nueva York, 1982, pag. 335; y Ammerer, Meth. in Enzymology 101: 192- 201,1983), los promotores inducibles por galactosa, pGALI, pGALl-10, pGal4 y pGallO; promotor de fosfoglicerato quinasa, pPGK; promotor del citocromo c, pCYCI; y promotor de alcohol deshidrogenasa I, pADH1. Para la expresion de Pichia como un ejemplo, el plasmido pPICZ de Invitrogen se cita como ilustracion; en este plasmido, el casete de expresion para la protema de interes es accionado por el promotor AOX1 inducible por metanol de P. pastoris. Despues de la transformacion de las celulas de P. pastoris KM71H, las celulas que han integrado de manera estable una copia del transgen se seleccionan con zeocina.

Las secuencias lfder o senal se disenan para la translocacion de polipeptidos nacientes desde ribosomas en el citoplasma directamente a la luz del retteulo endoplasmico. Las secuencias lfderes, tipicamente hidrofobicas, incluyen una secuencia reconocida y escindida por peptidasas eucariotas. El evento de escision produce un polipeptido maduro que, sin otras senales, se secreta de la celula. Otras senales opcionales que pueden proporcionarse a los genes de SPCBP son senales dirigidas a compartimientos subcelulares tal como el nucleo, la vacuola de las celulas vegetales, la mitocondria, senales de retencion de ER (por ejemplo, KDEL en la region C terminal de la region de codificacion) y regiones transmembranales para anclar directamente las SPCBP en la membrana de la celula o anclajes GPI equivalentes. Las personas expertas en la tecnica conocen varias secuencias lfder o de senal operativas en la presente invencion; para incluir secuencias de senal operables en levaduras Mfal prepro, Mfal pre, fosfatasa acida Pho5, Invertasa SUC2; secuencias de senal operables en E. coli pill, PelB, OmpA, PhoA; lfder de gp64 operable en celulas de insectos; lfder de IgK, secuencias de senal de secrecion melitina de abejas operables en celulas de mairnferos. Las secuencias senal eucarioticas particularmente preferidas incluyen las del factor de acoplamiento a de levadura, a aglutinina de levadura, invertasa de Saccharomyces, inulina de Kluyveromyces, y con preferencia superlativa el peptido senal de la subunidad Aga2p de a aglutinina.

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La introduccion de la construccion recombinante en la celula huesped puede efectuarse, por ejemplo, mediante transfeccion de fosfato de calcio (Wigler y otros, Cell 14: 725,1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603,1981; Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), DEAE, transfeccion mediada por dextrano o electroporacion (Neumann, EMBO J. 1: 841-845, 1982 y Davis, L. y otros, Basic Methods in Molecular Biology (1986).

El ADN que codifica los anticuerpos de la invencion se afsla y secuencia facilmente usando procedimientos convencionales para clonacion, preparacion de ADN y secuenciacion como se describe por Sambrook, y otros, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edicion, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), cuya descripcion se incorpora en la presente descripcion como referencia. Para la secuenciacion, pueden usarse sondas de oligonucleotidos que son capaces de unirse espedficamente a las secuencias del vector que rodean los fragmentos del gen, y la secuencia de ADN determinada por secuenciacion basada en didesoxi (Sanger, F. y otros (1977) PNAS 74: 5463-5467). Una vez aislado, el ADN que codifica la region apropiada del gen de SPCBP se coloca en uno o mas vectores de expresion como se describe aqu y mas abajo, que despues se transfectan en celulas huesped. La celula huesped es una celula huesped eucariotica superior, tal como una celula de mairnfero, una celula huesped eucariota inferior, tal como una celula de levadura, o la celula huesped es una celula procariota, tal como una celula bacteriana.

En una modalidad preferida, se fabrican bibliotecas de protemas SPCBP en celulas de mamffero. Las celulas huesped de mamffero preferidas para expresar los anticuerpos clon o fragmentos de union a antfgeno de estos incluyen el ovario de hamster chino (celulas CHO) (que incluyen las celulas CHO dhfr-, descritas en (Urlaub, G. y otros (1980) PNAS 77: 4216-4220)), usado con un marcador seleccionable DHFR, por ejemplo, como se describe en (Kaufman, R. J. y otros (1982) J Mol Biol 159: 601-621), lmeas celulares linfodticas, por ejemplo, celulas de mieloma NSO y celulas SP2, celulas C127,3T3, celulas A431 epidermicas humanas, celulas Jurkat, U937, HL-60, celulas HEK-293, celulas C2C12, celulas L de raton, celulas de rinon de hamster bebe, celulas COS o CV-1, PER. Celulas C6 (Pau, M. G. y otros (2001) Vaccine 19: 2716-2721), otras lmeas celulares de primates transformadas, celulas diploides normales, cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, y una celula de un animal transgenico, por ejemplo, un marnffero transgenico. Por ejemplo, la celula es una celula epitelial mamaria. Otros tipos de celulas adecuadas para la expresion, en particular para la expresion transitoria, son las celulas COS de simios (Gluzman, Y. (1981) Cell 23: 175182), y las celulas de rinon embrionarias humanas de los linajes 293,295T y 911 (Hek293, 295T, 911).

En otra modalidad, se producen bibliotecas de celulas que expresan mezclas de protemas SPCBP en eucariotas inferiores tales como levaduras o en procariotas tales como bacterias (Simmons, L. C. y otros (2002) J Immunol Methods 263: 133- 147.). Las cepas de levadura potencialmente adecuadas incluyen las cepas Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar protemas heterologas. Las cepas bacterianas potencialmente adecuadas incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o cualquier cepa bacteriana capaz de expresar protemas heterologas.

Para algunas aplicaciones, se requiere modificar la mezcla de protemas producida, por ejemplo mediante fosforilacion o glicosilacion de los sitios apropiados, para obtener la protema funcional. Tales adiciones covalentes de las mezclas de protemas se llevan a cabo usando metodos qmmicos o enzimaticos conocidos. Los polipeptidos y protemas recombinantes producidos en el cultivo bacteriano usualmente se afslan, por ejemplo, por la extraccion inicial a partir de los sedimentos celulares, seguido de una o mas, precipitacion por sales, cromatograffa de intercambio de iones acuosos o de exclusion por tamano. En algunas modalidades, el acido nucleico molde ademas codifica una etiqueta de polipeptido, por ejemplo, penta o hexa-histidina. La mezcla de polipeptidos recombinantes puede purificarse despues usando cromatograffa de afinidad. Las celulas microbianas empleadas en la expresion de protemas puede romperse por cualquier metodo conveniente, que incluyen ciclo de congelacion descongelacion, sonicacion, rotura mecanica, o el uso de agentes que lisan celulas. Preferentemente, se usan metodos de purificacion independientes del reconocimiento de antfgeno

Las modalidades preferidas de andamio de las SPCBP son anticuerpos de dominio unico (dAbs) con segmentos de anticuerpo humanos, preferentemente basados en un segmento germinal de anticuerpo humano y preferentemente DP47, y ademas anticuerpos VHH de solo cadena pesada de camelido, preferentemente de animales inmunizados y preferentemente con sitios potencialmente inmunogenicos que se eliminan, cuando se usan en humanos. Preferentemente, los andamios codifican un dominio proteico globular compacto con preferentemente no mas de 250 aminoacidos, preferentemente no mas de 150 aminoacidos. Los metodos preferidos de aislamiento de las SPCBP de las bibliotecas de andamios son la presentacion en fagos y levaduras, el tamizaje de bibliotecas de expresion, la presentacion de ribosomas y las estrategias de complementacion enzimaticas.

2.3.2. Produccion de bibliotecas de mezclas de SPCBP

En una primera modalidad, se identifica una coleccion de diferentes genes que codifican SPCBP, y esto se clona en vectores de expresion apropiados (ver anteriormente y ademas mas abajo para detalles sobre formatos espedficos). La biblioteca de las SPCBP contiene multiples SPCBP, al menos dos y preferentemente no mas de 20 y preferentemente entre 2 y 10. Esta coleccion de genes de SPCBP se introduce despues en las celulas del huesped de tal manera que las celulas huesped estaran fabricando las SPCBP multiples y diferentes.

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La introduccion se realiza usando tecnicas de transfeccion convencionales, que incluyen la coprecipitacion con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfeccion mediada por DEAE dextrano, lipofeccion o electroporacion. Ademas, pueden usarse vectores biologicos, por ejemplo, vectores virales tales como retrovirales y adenovirales (para celulas eucariotas) o tales como fagos filamentosos o fagos lambda (para celulas bacterianas tales como E. coli). Los metodos adecuados para transformar o transfectar celulas huesped pueden encontrarse en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3era edicion., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001), y otros manuales de laboratorio adecuados.

En una modalidad preferida, se usan celulas eucariotas como celulas huesped, preferentemente CHO o PER. Celulas C6. En ese caso, la transfeccion puede hacerse de manera transitoria, de clones identificados que mantienen los vectores de expresion de forma estable dentro de la celula, esto es ya sea a traves de la integracion estable del transgen en el genoma de la celula o mediante vectores episomales. Si se usa la transfeccion estable, con la posibilidad de seleccionar lmeas celulares transfectadas para copias integradas de forma estable de los ADN que codifican SPCBP, los anticuerpos o anticuerpos relevantes se clonan preferentemente mediante dilucion limitante o seleccion de celulas. Ademas para tal transfeccion, frecuentemente se usan plasmidos linealizados digeridos por enzimas de restriccion para aumentar el numero de transfectantes.

En una modalidad preferida de esta invencion, representada en la Figura 2A y la Figura 3, multiples genes de SPCBP (3 se indican en la Figura 3) se clonan en un vector de expresion apropiado, y despues se presentan como una mezcla de dos ADN introducidos en la celula huesped. Las celulas huesped se transfectan y cultivan en condiciones que permiten la seleccion para la integracion del plasmido en el genoma del huesped. En una modalidad preferida, las celulas se someten a una etapa de clonacion, en la que se manipulan y cultivan celulas de tal manera que se obtienen poblaciones de celulas que son geneticamente identicas con respecto a la insercion de los acidos nucleicos que codifican SPCBP y su lugar de insercion. Asf, los clones celulares se expanden en los pocillos de cultivo de tejidos, de tal manera que los pocillos de cultivo de tejidos contendran en medio clones individuales, con algunos de los clones que expresan los genes de SPCBP.

Puede determinarse la secrecion de SPCBP espedfica de antfgeno entre estos clones y pocillos mediante varios metodos, preferentemente mediante ELISA o prueba equivalente de las mezclas de protemas de cada pocillo (ver ademas la descripcion anterior de los ensayos de union). En la Figura 3, se representa tres placas de ELISA diferentes que representan la reactividad del mismo sobrenadante en tres antfgenos diferentes: los pocillos que son reactivos con los tres antfgenos contienen celulas que secretan las tres SPCBP. Mas abajo se describen procedimientos de deteccion mas extensos.

La composicion de la mezcla de SPCBP se influencia por la manipulacion de cualquiera de los parametros que afectan el nivel de expresion alcanzado en la celula huesped y su estabilidad a lo largo del tiempo. El nivel de expresion de un componente dado es una funcion de muchos factores, que incluyen las secuencias reguladoras que impulsan la expresion del componente, la eleccion de la celula huesped, el metodo de expresion (transitorio o estable) y, para la expresion estable, el numero de copia y sitio de integracion. Los niveles de expresion ademas pueden afectarse por muchos parametros, que incluyen la eleccion de los elementos reguladores de la transcripcion (que incluyen la eleccion del promotor, potenciador, aislantes, los antirrepresores, etcetera).

Asf, la frecuencia en la biblioteca de clones celulares que expresan genes de SPCBP unicos o multiples dependera de muchos parametros, que incluyen el lugar de insercion del (los) transgen (es), la cantidad de ADN usado, la presencia de los genes de SPCBP en el mismo plasmido, la frecuencia de transfeccion, etcetera. Existe una alta probabilidad de que el transgen se vuelva inactivo debido al silenciamiento de genes (McBurney y otros, 2002), resultando, para las tecnologfas convencionales, en una fraccion de las celulas huesped recombinantes que producen uno o multiples SPCBP. Para construir una lmea celular que produzca multiples polipeptidos a niveles elevados, los diferentes transgenes generalmente se integran independientemente, pero eso conducira a una reduccion en la frecuencia de los clones celulares que expresan las SPCBP.

Si dos transgenes se transfectan de manera simultanea en dos plasmidos separados, la proporcion de celulas que produciran ambos polipeptidos en niveles elevados sera el producto de las proporciones para los transgenes unicos; si el 33% de la celula expresa una protema de union a un nivel mmimo establecido que esta por encima de un cierto criterio de seleccion (por ejemplo, 3 veces la senal de fondo en ELISA), solo aproximadamente 10% expresara dos en este nivel, 3% expresara tres en el nivel establecido, etcetera. Cuantos mas genes de SPCBP se usen para fabricar la biblioteca, mas importante sera usar un protocolo de transfeccion eficiente. Por ejemplo, los casetes de expresion con los genes de SPCBP ademas pueden ser parte de un sistema viral de manera que pueden lograrse altos niveles de eficacia de transfeccion/infeccion y multiples infecciones por celula.

Una ventaja importante de usar las SPCBP es que muchas de estas protemas tienden a ser moleculas de un dominio unico de tamano limitado (tamano promedio de 100-130 aminoacidos, y en su mayona por debajo de 200 aminoacidos). Con tales regiones de codificacion relativamente pequenas, en promedio 300-400 nucleotidos por SPCBP (sin el lfder y las etiquetas opcionales), sera mucho mas facil construir vectores de expresion que incorporen estos acidos nucleicos que, por ejemplo, los genes de anticuerpos que codifican IgG. Las regiones codificantes para este ultimo son

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aproximadamente 600 y 1400 nucleotidos para las dos cadenas respectivamente, pero muchos vectores de expresion utilizan ADN de Ig genomica que son incluso de mayor tamano. As^ las SPCBP son ideales para combinar en un plasmido de expresion, y la invencion describe modalidades con 2,3, 4 a 10 SPCBP diferentes por plasmido. Por lo tanto existe una lista de posibilidades para combinar las varias SPCBP, elementos y procedimientos regulatorios, para hacer bibliotecas de celulas que expresan multiples SPCBP y sus composiciones.

En una primera modalidad, para obtener bibliotecas con una frecuencia mas alta de multiples SPCBP expresadas, los acidos nucleicos que codifican estas protemas se clonan en un mismo plasmido que porta un marcador de seleccion para seleccionar para la integracion estable. La Figura 4A-H describe casetes de expresion de protema adecuados con multiples genes de SPCBP, con diferentes orientaciones, que se ajustan al esqueleto del vector de la Figura 1 o vectores equivalentes. Algunas de estas versiones portan en cis uno o dos elementos de control de la expresion. En una modalidad preferida, los elementos estabilizadores antirrepresores (los STAR, Kwaks y otros, 2003. Nat. Biotechnol 21: 553) se clonan en uno o ambos extremos de los genes de SPCBP (Figura 4A- D). Tales elementos confieren expresion estable y de alto nivel de un transgen dado como se muestra en esta cita y en los documentos de patentes WO03106674A2 y WO03004704A2. En esta invencion, describimos su uso para mediar expresion estable y de alto nivel para cada copia individual del transgen (ver ademas mas abajo, 2.3. 3). En una modalidad de esta invencion, los vectores que incorporan cualquiera de estos casetes de expresion pueden combinarse con vectores que incorporan las mismas casetes de expresion diferentes enumerados en la Figura 4, durante el tiempo que la mezcla de vectores cuando se usa para la transfeccion introduce multiples regiones de codificacion SPCBP en las celulas huesped.

En otra modalidad, se usan vectores diferentes que cada uno porta un marcador de seleccion diferente (Figura 2B; 3 marcadores diferentes se describen como Seleccionar 1-3), usando las celulas cotransfectadas un metodo de transfeccion/transduccion/infeccion altamente eficiente y dos o regimen de seleccion triple aplicado; esto reduce el numero total de clones de celulas supervivientes pero asegura que cada celula superviviente habra absorbido el ADN para cada una de las tres protemas de union. Los marcadores de seleccion se describen en la seccion anterior. Otra modalidad es colocar el marcador seleccionable en el mismo plasmido y bajo el control del mismo promotor que el gen de la SPCBP, la ultima disposicion que produce lo que se conoce como un mensaje dicistronico o policistronico. En una modalidad preferida, los genes marcadores seleccionables se enlazan a traves de una secuencia IRES corriente abajo de los genes de SPCBP (Figura 4G-H). Este enlace genetico directo entre la SPCBP y el marcador de seleccion proporciona una garantfa de que las lmeas celulares seleccionadas para el marcador ademas expresaran la protema SPCBP (como ademas se describe en Rees y otros, Biotechniques 20: 102-10). Alternativamente al uso de una secuencia IRES, puede usarse un corte y empalme alternativo (Lucas y otros, Nucleic Acids Res 1996: 24: 1774-9).

En otras dos modalidades, la expresion de dos SPCBP se hace dependiente entre sf de una de las siguientes maneras (Figura 4F y Figura 5). En la primera modalidad, el acido nucleico que codifica la primera SPCBP se clona en un casete de expresion, de manera que estara bajo el control de un promotor dado (tfpicamente el promotor de CMV fuerte u otro), y de manera que se sigue su secuencia de codificacion por un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES). Esto es seguido inmediatamente por una segunda region de codificacion de la SPCBP (como se representa en la Figura 4F). El promotor PI ahora impulsara la expresion de BP-1 y BP-2, lo que conduce a una relacion de expresion aproximada de 1: 1 entre estas dos protemas; frecuentemente aunque la segunda region de codificacion esta ligeramente menos bien expresada. Asf, si la relacion de expresion tiene que agitarse hacia un nivel predefinido, el uso de secuencias IRES es particularmente util. Este nivel predefinido se influencia entre otros factores por la naturaleza de la secuencia IRES, y diferentes secuencias IRES mediaran diferentes relaciones finales. Similarmente, la relacion de expresion entre tres SPCBP puede enlazarse entre sf mediante el uso de un casete de expresion tricistronico, en el que el casete descrito anteriormente va seguido de otra region codificante de IRES y SPCBP. Se describen ejemplos de sistemas de expresion tricistronicos y de secuencias y configuraciones IRES para otros sistemas en la literatura (Li y otros, J. Virol. Methods 115: 137-44; When y otros, Cancer Gene Therapy 8: 361-70; Burger y otros 1999, Appl. Microbiol. Biotechnol. 52: 34553). Asf, las bibliotecas de esta invencion ademas pueden producirse variando las secuencias de IRES.

En la segunda aproximacion para influenciar las relaciones de expresion, que se representa en la Figura 5, el casete bicistronico que contiene como primera region de codificacion la primera secuencia de SPCBP y despues la secuencia IRES se sigue por la secuencia codificante del transactivador del elemento respuesta tet (TRE) fusionado al dominio de activacion de la protema VP16 del herpes simple (tTa). El acido nucleico que codifica la segunda SPCBP se clona en un casete de expresion de manera que su expresion se regula a traves de un promotor inducible, por ejemplo el elemento respuesta tet (TRE), existente de 7 copias del sitio del operador de tetraciclina procariotico fusionado a un promotor CMV mmimo. Al introducir ambos casetes de expresion en la misma celula (en diferentes vectores o en los mismos vectores, al mismo tiempo o uno antes que el otro), existira la siguiente relacion entre la expresion de las dos regiones variables: expresion de la primera SPCBP, que esta bajo el control de, por ejemplo, un promotor constitutivo, conducira a la expresion de la protema tTa. Esta protema activa el promotor basado en TRE que impulsara la expresion de la segunda SPCBP. Asf, la produccion de la segunda SPCBP depende ahora de la produccion de la primera SPCBP. En otra modalidad, la produccion de un conjunto de las SPCBP puede hacerse dependiente de la produccion de otro conjunto de las SPCBP. En esta modalidad, la primera coleccion de genes de SPCBP se clona bajo el control del elemento TRE, mientras que se proporciona una segunda coleccion de otros genes de SPCBP con el gen IRES y tTa, como se describio anteriormente. Similarmente a la anterior, cada SPCBP individual que se expresa activara la produccion de otra SPCBP. Esta biblioteca es ahora una biblioteca de celulas que expresan dos protemas de union de manera confiable. Se han descrito otros sistemas promotor transactivadores y ademas son aplicables en este concepto.

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En el mismo campo de aplicacion, en aquellos casos en los que las relaciones de dos SPCBP particulares necesitan controlarse o corregirse, este metodo de expresion dependiente se usa para enlazar la expresion de dos SPCBP.

En otra modalidad, los genes de SPCBP se transfectan secuencialmente en la celula huesped. Si se necesita hacer una biblioteca de un numero limitado de las SPCBP de manera que se muestree una gran cantidad de variantes de un pequeno numero de protemas de union (2-4), se usa el siguiente procedimiento. Primero consideramos la modalidad para bibliotecas de celulas que producen mezclas de 2 SPCBP. Las celulas se transfectan con los dos genes de SPCBP clonados en diferentes vectores, pero la transfeccion se realiza secuencialmente en el tiempo. En esta modalidad, un segundo gen de SPCBP se transfecta en una celula huesped que ya expresa un primer gen de SPCBP en alto nivel. Esto es util para hacer una biblioteca en la que solo una de las dos protemas de union esta variegada. En otro enfoque, el primer gen de SPCBP se transfecta y no se identifica un clon celular, sino una coleccion de celulas que expresan una cantidad minima de protemas SPCBP (pero a una concentracion variable). Estas celulas despues se transfectan con el segundo gen de SPCBP como antes, y se identifican clones celulares que expresan multiples relaciones de las dos SPCBP. Para hacer la mezcla de dos SPCBP, el ADN que codifica las dos SPCB ademas puede codificarse en el mismo plasmido (ver mas abajo). Este procedimiento de llevar a cabo transfecciones secuenciales (y, si procede, selecciones de integracion entre ellas) ademas es adecuado para hacer colecciones de mezcla con hasta 10 SPCBP diferentes. En esta modalidad, las celulas se transfectan con una primera coleccion de maximo 5 genes de SPCBP y las celulas que expresan una cantidad minima de las protemas SPCBP (pero a una concentracion variable) se afslan. Para aumentar el numero de clones celulares que expresan multiples SPCBP, la coleccion de genes se basa preferentemente en el mismo plasmido, que ademas porta un primer marcador de seleccion (ver mas abajo una descripcion de dichos casetes de expresion). La poblacion celular seleccionada se transfecta posteriormente con un plasmido que contiene la segunda coleccion de maximo 5 genes de SPCBP y un segundo marcador de seleccion (Figura 6). Las celulas resultantes ahora expresan bibliotecas de hasta 10 protemas de union diferentes a proporciones muy variables y en muchas combinaciones diferentes. Como una modalidad alternativa para hacer que las celulas expresen una diversidad similar o mayor, se usa el siguiente procedimiento. Primero, como antes, se producen poblaciones de celulas que expresan hasta 5 SPCBP diferentes y son resistentes en base a un marcador de seleccion. En paralelo, se producen multiples poblaciones de celulas transfectando cada una con plasmidos que cada uno lleva 5 genes de SPCBP diferentes y un marcador de seleccion diferente (por ejemplo, neo, gpt, zeo, bdl, etcetera). En segundo lugar, estas poblaciones celulares se fusionan y se seleccionan despues para la presencia de ambos marcadores selectivos. Estas celulas fubridas tienen el potencial para expresar hasta 10 SPCBP diferentes. Similarmente, este procedimiento puede repetirse si deben realizarse colecciones de 15 o 20 SPCBP. Los metodos para la fusion celular se describen ampliamente en la literatura y son conocidos por quienes trabajan en el campo; son similares a los descritos en Norderhaug y otros, 2002 (Eur. J. Biochem 269: 3205-10), aunque aqrn no se coexpresan subunidades sino las SPCBP.

En otra modalidad, los genes de SPCBP se proporcionan mediante fusion genetica a un elemento apropiado que proporciona un anclaje en la superficie de la celula huesped. Los anclajes descritos para los procedimientos de tecnologfa de presentacion descritos anteriormente ademas son adecuados como anclajes para multiples SPCBP expresadas y ancladas por la misma celula huesped. Preferentemente, las senales de anclaje incluyen protemas basadas en membranas, protemas asociadas a membranas, protemas de recubrimiento virales y componentes de la pared celular que se usan con exito para presentar bibliotecas de protemas en celulas huesped, que incluyen fusiones Lpp-OmpA, lamb y PhoE para presentar en la superficie de E. coli y Aga-2p para presentar en Saccharomyces cerevisiae.

Esto es particularmente interesante para las aplicaciones de terapia celular, por ejemplo, en la transferencia adoptiva de linfocitos humanos que se han modificado geneticamente para expresar multiples SPCBP en su superficie celular y, como tales, se redirigieron hacia celulas tumorales o infectadas por virus. En la actualidad se aborda que una sola especificidad se injerta en tales celulas que se investigan en la clmica (Wang y otros, Nat. Med. 1998, 4: 168-72). Alternativamente al uso de una fusion genetica, puede usarse un corte y empalme alternativo para obtener una fraccion de la protema de union que se une a la superficie celular (similar a lo que se describio para genes de anticuerpos humanos; y Lucas y otros, Nucleic Acids Res 1996: 24: 1774-9). Esta configuracion ademas permite un tamizaje directo para la union de antfgenos en la superficie de la celula huesped, por ejemplo, a traves de citometna de flujo con antfgeno (s) marcado (s) con fluorescencia o epftopos objetivo o mimotopos de SPCBP (ver mas adelante), o una seleccion directa de celulas que expresan multiples antfgenos y en niveles diferentes, por ejemplo a traves de metodos de clasificacion.

En muchas aplicaciones, los genes de SPCBP se proporcionaran con una senal de localizacion. La modalidad preferida es proporcionar una senal de secrecion o lfder, que media la secrecion de las protemas en el medio (para las celulas eucariotas) o en el espacio periplasmico (para las bacterias gram negativas tales como E. coli). En otra modalidad, se usan protocolos de expresion transitoria, que son particularmente utiles para la prueba funcional inicial de combinaciones de SPCBP. Las celulas, por ejemplo, celulas HekT y COS, se transfectan con ADN plasmfdico que codifica las multiples SPCBP. La mezcla de SPCBP se recupera despues del medio en el que se cultivan las celulas. En tales casos, la modalidad preferida es usar los genes de SPCBP clonados en plasmidos separados (por ejemplo, como en la Figura 2A y Figura 3); la relacion entre los ADN del plasmido de entrada entonces ademas influyen enormemente y predetermina las relaciones entre las SPCBP expresadas. Despues se elabora una biblioteca de mezclas de protemas

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al transfectar en experimented separados diferentes cantidades de plasmidos en las celulas, y cosechar los productos. Con multiples plasmidos usados durante mastiempo cultivando numeros de copias

La expresion de mezclas de las SPCBP en algunos casos se logra sin integrar el ADN en el genoma de la celula huesped. En una modalidad, los plasmidos de expresion para dirigir la expresion en eucariotas superiores se ajustan con elementos tales como el ori/EBNA-1 del virus Epstein Barr, que permite el mantenimiento episomal a largo plazo en celulas de mairnferos (ver por ejemplo Bode y otros 2001, Int. J. Gene Ther. Mol. Biol. 6: 33-46). En una modalidad, tales plasmidos se ajustan con multiples genes de SPCBP, por ejemplo, usando los casetes de expresion representados en la Figura 4B-F. Es la modalidad preferida que en este caso las regiones codificantes de SPCBP se clonan en el mismo plasmido. En otra modalidad, se introducen multiples genes de SPCBP en cromosomas artificiales que no se integran en el genoma de la celula huesped, sino que se replican de forma independiente. Esto se logra mediante insercion dirigida a un sitio desde un vector de orientacion de ACE mediante una integrasa, y requiere que el plasmido incorpore sitios de reconocimiento (ver por ejemplo Nat Biotechnol. 2003 Jun; 21 (6): 652-9).

En los eucariotas inferiores, se han descrito plasmidos que pueden replicar de forma autonoma los plasmidos. En una modalidad, preferentemente dos o tres unidades de expresion (con cada una o multiples regiones codificadoras de SPCBP) se clonan en uno de dichos vectores de expresion de replicacion autonoma, preferentemente un plasmido de expresion basado en pUC19 o pBr322. En otra modalidad, la clonacion de las dos o tres unidades de expresion preferidas (con cada una o multiples regiones codificadoras de SPCBP) se realiza en dos plasmidos separados que pertenecen a diferentes grupos de compatibilidad y, asf, se replican en la celula huesped sin interferencia. Los plasmidos basados en E. coli preferidos son plasmidos basados en pBR322 (con el Col E1 ori), por un lado, y plasmidos compatibles, tales como los de la serie pSC101 (Manen y otros, Gene. 1997 86 (2): 197-200). Un conjunto preferido incluye los derivados pBLUESCRIPT con ori que median un numero de copias bajo y son compatibles, por ejemplo ori de pBR322 Col E1 y ori de pl5A (Mayer, Gene, 1995,163 (1): 41-6). Tales plasmidos preferentemente llevan diferentes marcadores seleccionables (kanamicina (KmR) o tetraciclina (TcR)). La variabilidad entre las SPCBP se logra aqu mediante el uso de plasmidos que se mantienen en numeros de copia diferentes, proporcionando asf una dosificacion genetica baja o alta a la celula huesped de expresion. Se prefieren las combinaciones entre tales plasmidos si es conveniente grandes diferencias relativas entre las SPCBP particulares (relaciones 10: 1 o mas).

Los sistemas de expresion transitoria de las celulas eucariotas son utiles para verificar rapidamente la actividad de una mezcla de SPCBP con proporciones particulares de las SPCBP. Las regiones codificantes de SPCBP se clonan preferentemente en plasmidos separados (como en la Figura 2A), y las bibliotecas de celulas que expresan diferentes protemas de union y en diferentes relaciones se preparan despues mezclando los ADN de plasmidos en diferentes combinaciones y cantidades. En general, la cantidad de ADN introducida afectara la cantidad de protema producida. Tales configuraciones tienen varias desventajas (ver anterior) y no son utiles para preparar grandes colecciones de las SPCBP; sin embargo, la expresion transitoria es util para la produccion rapida de ciertas combinaciones de sitios de union.

En una modalidad, la region de codificacion de SPCBP se flanquea por secuencias que median la integracion dirigida al sitio en el genoma de la celula huesped (Figura 1). Sin estos, la integracion de transgenes ocurre al azary, usualmente, varias copias del transgen se integran al mismo tiempo, a veces en forma de tandem de cabeza a cola, con el sitio de integracion y el numero de copias integradas variando de una celula transfectada a otra. El uso de los sitios de recombinacion como se representa en la Figura 1 permite que el sitio preciso de la integracion se oriente por recombinacion homologa entre el vector y el genoma de la celula huesped. Esto proporciona un medio para insertar la region de codificacion en un sitio de alta actividad transcripcional, con la opcion de proporcionar un promotor en el transgen o usar el que esta presente en el sitio de integracion. Con la insercion mediada por la recombinacion homologa o aleatoria de los acidos nucleicos que codifican SPCBP se entiende cualquier insercion en el genoma de la celula huesped, o en los acidos nucleicos en un organelo subcelular, o en un cromosoma artificial.

En algunas de las modalidades descritas, se usan casetes de expresion en formatos de vector, elementos con una secuencia identica o altamente homologa en el mismo plasmido. Preferentemente, elementos diferentes (tales como promotores diferentes, secuencias IRES diferentes), se usan ambos para crear bibliotecas con relaciones muy variables entre los compuestos de SPCBP, pero ademas para minimizar los efectos de las secuencias homologas sobre la estabilidad del constructo global una vez introducidas en la celula huesped. Si es necesario, tales elementos se proporcionan con regiones no homologas, por ejemplo, mediante el reemplazo o supresion de piezas no vitales del elemento. En una otra modalidad, se crean bibliotecas de celulas con relaciones altamente variables de un conjunto limitado de las SPCBP mediante la combinacion elementos reguladores variegados con este conjunto limitado de las SPCBP. Por ejemplo, ciertos nucleotidos dentro del(os) promotor(es) o secuencia IRES se variegan, lo que en algunos casos conducira a la expresion alterada de la region codificante de SPCBP que esta bajo el control de dicho(s) elemento(s).

En todos estos casos, pueden tamizarse grandes cantidades de lmeas celulares usando dispositivos automaticos de seleccion de celulas y procedimientos de clasificacion de celulas.

En una modalidad adicional, preferentemente al menos dos SPCBP obtenidas mediante los metodos de la invencion se combinan con un anticuerpo con dominios apareados, preferentemente un fragmento de Fv de cadena unica con

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dominios VH y VL apareados o un dominio Fab, con cadena pesada Fd y cadenas ligeras apareadas, de manera que preferentemente estas protemas de union comparten caractensticas similares que proporcionan un unico camino para la purificacion de la mezcla. En otra modalidad, una SPCBP obtenida mediante los metodos de la invencion se combina con un anticuerpo con dominios apareados, preferentemente un fragmento de Fv de cadena unica con dominios VH y VL apareados o un dominio Fab, con cadena pesada Fd y cadenas ligeras apareadas, de manera que preferentemente estas protemas de union comparten caractensticas similares que proporcionan un unico camino para la purificacion de la mezcla.

2.3.3. Regulacion de la estabilidad de la expresion genica de SPCBP en el contexto de la produccion de multiples protemas de union en la misma celula huesped

Los acidos nucleicos que codifican cadenas polipeptfdicas individuales pueden coexpresarse en la misma celula para preparar mezclas de diferentes sitios de union funcionales. Sin embargo, sera importante controlar ademas, la expresion de las regiones variables individuales y sus relaciones de expresion, ya que esto afectara la composicion de la mezcla final de protemas de union.

El nivel de expresion y la estabilidad de la expresion es, entre otras, una funcion del sitio de integracion del transgen: si el transgen se integra cerca o dentro de la cromatina inaccesible, es probable que su expresion se silenciara. En esta invencion se describe el uso para la produccion de mezclas de SPCBP en la misma celula, de elementos que, al flanquear los genes del anticuerpo, aumentaran la predictibilidad del nivel de expresion, el rendimiento y mejoraran la estabilidad. Una secuencia STAR (Anti-Represor Estabilizador) (o anti-represor, o elemento STAR, los terminos se usaran indistintamente en la presente descripcion) es un elemento de ADN de origen natural que se aislo de los genomas eucariotas sobre la base de su capacidad para bloquear la represion transgenica. Preferentemente, los elementos STAR se derivan del genoma humano. Una secuencia STAR comprende la capacidad de influir en la transcripcion de genes en cis y/o proporcionar un efecto estabilizante y/o potenciador. Se ha demostrado que cuando los elementos STAR flanquean transgenes, el nivel de expresion transgenica de las lmeas celulares recombinantes seleccionadas aleatoriamente puede aumentarse a niveles que se aproximen a la expresion potencial maxima del promotor del transgen. Ademas, el nivel de expresion del transgen es estable en muchas generaciones de celulas, y no manifiesta el silenciamiento estocastico. Por lo tanto, las secuencias STAR confieren a los transgenes un grado de expresion independiente de la posicion que no es facilmente posible con los sistemas transgenicos convencionales. La independencia de posicion significa que los transgenes que se integran en las ubicaciones genomicas que resultaran en el silenciamiento transgenico se mantienen, con la proteccion de los elementos STAR, en un estado transcripcionalmente activo. Asf, los elementos antirrepresores proporcionan un alto nivel de predictibilidad de la expresion, altos niveles de expresion y expresion estable a lo largo del tiempo (Kwaks y otros, 2003. Nat. Biotechnol 21: 553). Tales elementos confieren expresion estable y de alto nivel de un transgen, como se muestra en esta cita, y en esta invencion se describe su uso para mediar en una expresion estable y de alto nivel para cada copia individual de una mezcla de transgenes, que codifica multiples SPCBP. Una variedad de tales elementos y otros sistemas para lograr un resultado similar se han identificado en la tecnica, que incluyen las regiones de control del locus (las LCR), elementos de apertura de cromatina, cromosomas artificiales (por ejemplo, tecnologfa ACE de Chromos Molecular Systems Ltd), regiones de fijacion a la matriz (MAR), region de fijacion al andamio y los elementos de apertura de la cromatina ubicuo (UCO). Por ejemplo, las LCR son elementos reguladores de la transcripcion que poseen una remodelacion de cromatina dominante y la capacidad de activacion transcripcional que confiere niveles fisiologicos completos de expresion en un gen unido en cis, cuando se integra en el genoma de la celula huesped. En la siguiente seccion, la invencion se describe para 'elementos antirrepresores', pero otros elementos de control diferentes, como los mencionados, y considerando que proporcionan la oportunidad de regular el alto nivel de expresion de multiples genes, son igualmente adecuados para lograr una expresion controlada de los diferentes genes de SPCBP.

En la modalidad preferida, al menos uno del gen de SPCBP se flanquea por un elemento antirrepresor, o por dos elementos antirrepresores identicos o dos diferentes ubicados en cualquier extremo del gen de SPCBP (Figura 4B, C); en otra modalidad, mas de uno o posiblemente todos los genes de SPCBP que necesitan expresarse se flanquean por elementos antirrepresores. En una modalidad, todos de un maximo de 5 genes de SPCBP diferentes se basan en el mismo plasmido, en otro, se encuentran en plasmidos separados. En otra modalidad, se usan celulas CHO como huesped; en otra forma de modalidad celulas PER. Se usan las celulas C6.

La fabricacion de mezclas de las SPCBP expresadas en la misma lmea celular requerira una relacion estable de las diversas cadenas, de manera que la mezcla de SPCBP resultante despues de la fabricacion incluso en condiciones de GMP, tiene una composicion estable. Tales composiciones estables pueden traducirse despues en una actividad biologica estable y un perfil de toxicidad estable. Si la expresion de una sola SPCBP puede cambiar, puede afectarse la composicion y, por lo tanto, alterar ademas, su actividad biologica. La provision de elementos que producen un nivel de expresion mas predecible y asociado con el numero de copias es importante ademas para construir lmeas celulares que expresan niveles estables de diferentes SPCBP. Si, por ejemplo, en la biblioteca tienen que expresarse en total cinco SPCBP, los elementos antirrepresores se usan para bordear esos genes de SPCBP, cuyas relaciones relativas deben ser aproximadamente equimolar. Mediante el uso de tales elementos, puede introducirse un mayor numero de genes de SPCBP sin que se comprometa la estabilidad de la lmea celular resultante. Por lo tanto, pueden introducirse multiples genes de SPCBP, donde el numero de copias integradas para cada gen de SPCBP estara ademas a cierto nivel que refleje su nivel de expresion absoluto. Con tales elementos sera mucho mas facil y mas rapido alterar o predeterminar la

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relacion de los niveles de expresion de algunos o todos los genes de SPCBP, por ejemplo, mediante la manipulacion de la relacion de los ADN que codifican los genes de SPCBP en el momento de la transfeccion.

Esto ademas explica la incorporacion preferida de tales elementos antirrepresores en los vectores que se usan para crear las bibliotecas de celulas que expresan SPCBP; los elementos antirrepresores insertados preferentemente son los elementos STAR citados anteriormente.

Otra modalidad utiliza como elementos de control de expresion, las regiones de fijacion a la matriz o MAR. Se ha demostrado que las MAR se asocian con la remodelacion de la cromatina circundante, promoviendo asf la expresion transgenica en forma de un dominio transcripcional artificial activo. Los elementos MAR son muy activos cuando un casete transgenico se cointegra dentro del cromosoma de la celula huesped eucariota, pero ademas cuando un casete transgenico no se integra. Las MAR funcionan por el aislamiento de genes cercanos del efecto de la cromatina circundante, lo que aumenta, de ese modo, la expresion de genes dependiente del numero de copias, independiente de la posicion. Por esta razon, las MAR aumentan el numero de celulas transformadas independientemente que expresan la protema y promueven una mayor cantidad de protema recombinante producida por estas celulas. En general, las MAR aceleran el aislamiento clonal y permiten mayores velocidades de produccion. Ejemplos de las MAR pueden encontrarse en Zahn-Zabel y otros (2O0I) J. Biotechnology 87: 29-42 y en el documento de patente WO02074969A2. Se ha descrito la lisozima de pollo 5'MAR para mejorar significativamente la expresion transgenica estable en las celulas CHO.

Las MAR y STAR pueden ubicarse en cualquier lado de la secuencia de ADN a transcribir. Por ejemplo, los elementos pueden ubicarse de aproximadamente 200 pb a aproximadamente 1 kb, 5' del promotor y al menos aproximadamente 1 kb a 5 kb del promotor, en el extremo 3' del gen de interes. Ademas, mas de un elemento puede ubicarse 5' del promotor o en el extremo 3' del transgen. Por ejemplo, dos o mas elementos pueden colocarse 5' del promotor. El elemento o elementos en el extremo 3' del transgen pueden ubicarse en el extremo 3' del gen de interes, o en el extremo 3' de una secuencia reguladora 3', por ejemplo, una region 3' no traducida (UTR) o una secuencia flanqueante 3'. Los elementos de apertura de cromatina pueden estar flanqueando en ambos extremos del casete de expresion (Figura 4D), o colocados 5' del casete de expresion (Figura 4C). En particular, cuando ademas, deben introducirse multiples casetes de expresion de las SPCBP y multiples elementos reguladores tales como STAR y los UCO en los mismos plasmidos, existen limitaciones de tamano y, preferentemente, se usan elementos que tienen actividad hacia ambos extremos del elemento, de manera que pueden proporcionarse en el medio de un casete de expresion (Figura 4C). Dado que se ha informado que las MAR funcionan ademas cuando se cotransfectan con el transgen en trans (Zahn-Zabel y otros (2001) J. Biotechnology 87: 29-42), tienen la ventaja de que ninguna etapa de clonaje de ADN se requiere para unirlos ffsicamente al (a los) casete(s) de expresion de SPCBP. En ese caso, el tamano del elemento MAR o del vector de expresion que transporta los casetes de SPCBP ya no es una limitacion. Sin embargo, se han descrito elementos MAR tan pequenos como 1,3 kb, asf son posibles multiples inclusiones en cis. Se ha informado ademas que las MAR se anaden tanto en cis como en trans, y en esta configuracion aumentan 14 veces los niveles de expresion de anticuerpos en las celulas CHO. Otra funcion de estos elementos, ademas de su efecto sobre la estabilidad, es que ademas aumentaran el numero de celulas transformadas independientemente que expresan la protema y produce mayores cantidades de la protema recombinante. El aislamiento y los niveles de produccion de clones son en general mas altos, asf, en la modalidad preferida, esta invencion se practica mediante el uso de estos elementos para preparar lmeas celulares que produzcan multiples SPCBP y sus bibliotecas.

Las modalidades preferidas son emplear por vector de expresion usado en la construccion de la biblioteca no mas de 5 regiones codificadoras de protemas de union y preferentemente 3 por vector. Preferentemente, por plasmidos no contienen mas de 3 promotores y 3 secuencias IRES y no mas de 6 elementos STAR o MAR. Se prefiere limitar el tamano del vector de expresion a 20 kb y si se requieren mas de 5 protemas de union en la mezcla, y estas no pueden codificarse funcionalmente en un plasmido que es de un tamano inferior a 20 kb, usar dos plasmidos diferentes. La ruta preferida para las bibliotecas con mas de 5 protemas de union es usar dos conjuntos de vectores de expresion, y la ruta preferida se representa en la Figura 6.

Para construir la biblioteca se prefiere que la SPCBP de partida muestre valores de afinidad para la union a su objetivo de al menos 1 micromolar, preferentemente al menos 100 nanomolar, preferentemente al menos 10 nanomolar, y preferentemente entre 0,1 y 10 nanomolar. Un epftopo objetivo para una SPCBP es la region en el objetivo que se reconoce o une con la SPCBP. Dos o mas SPCBP pueden tener epftopos objetivo superpuestos pero diferentes, por ejemplo, si las protemas de union compiten por unirse entre sf pero muestran una qmmica de sitio de union diferente para el reconocimiento del objetivo debido al uso de diferentes aminoacidos en el sitio de union. Por ejemplo, dos SPCBP que reconocen a TNF y neutralizan esta citocina y compiten entre sf para unirse al TNF, se definen que reconocen diferentes epftopos objetivo en TNF si los aminoacidos que se localizan en o cerca del sitio de union de la SPCBP son diferentes entre las dos SPCBP.

Las bibliotecas contienen preferentemente menos de 10 protemas de union que estan presentes en preferentemente menos de 5 plasmidos diferentes, preferentemente entre 3 y 5 plasmidos diferentes. Las composiciones preferidas seleccionadas para la actividad optima contienen mezclas de SPCBP con preferentemente no mas de 10 protemas de union separadas. Se prefieren al menos dos y no mas de 5 protemas de union separadas, y preferentemente tres

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protemas de union separadas. Las bibliotecas preferentemente no tienen mas de 100.000 clones celulares de tamano, preferentemente entre 10 y 1.000 clones celulares de tamano.

2.3.4 Tamizaje y analisis de mezclas de protemas

La invencion es adecuada ademas para el tamizaje de mezclas de protemas que tienen una especificidad de union definida. Los genes que codifican estos compuestos se introducen como una mezcla en una celula huesped como se indico anteriormente (en la Figura 3, se proporciona un ejemplo de 3 protemas SPCBP diferentes) y clones individuales que han integrado algunas o multiples copias de los genes que codifican las diversas regiones variables expandidas. En una primera modalidad, se usa un ensayo de union para tamizar estas bibliotecas. Como se describio anteriormente, aplicado a los anticuerpos, los sobrenadantes de las lmeas celulares resultantes se tamizan para la reactividad hacia los diversos antigenos o en un bioensayo, como se describio el ELISA, el SPR, etcetera. Para este gran numero de lmeas celulares pueden tamizarse usando robots para manipular cultivos de tejidos y placas de ELISA. Ademas de la union en un ensayo in vitro, se describe ademas, que las mezclas de las SPCBP se prueban en bioensayos y actividad funcional. Los siguientes ensayos se describen a modo de ejemplos, pero muchos mas se aplicaran a esta etapa de tamizaje.

Las mezclas de las SPCBP se ensayan para la actividad funcional, ya sea in vitro o in vivo.

Ensayos inmunologicos y de eficacia. Algunos ensayos funcionales pueden monitorear una actividad que depende de un brazo del sistema inmune. La mayona de las SPCBP careceran de las funciones efectoras mediadas por Fc, pero si se proporcionan, por ejemplo, mediante ingeniena genetica del propio andamio, mediante combinacion con otras SPCBP o con una region Fc o anticuerpo anti-SPCBP, son factibles los siguientes ensayos inmunologicos. Ensayos in vitro para la actividad del dominio efector de inmunoglobulina, por ejemplo, la actividad citotoxica se usa para detectar la capacidad de las SPCBP para administrar las funciones efectoras inmunes contra un objetivo. Por ejemplo, los ensayos de cultivo celular pueden usarse para evaluar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) o la citotoxicidad mediada por celulas dependiente de anticuerpo (ADCC) mediada por una mezcla de SPCBP. Un ensayo ADCC se describe mas abajo. El ensayo de liberacion de Cr puede usarse para analizar la citotoxicidad mediada por celulas. Linfocitos de sangre periferica (PBL) se preparan como celulas efectoras, mientras que las celulas objetivo que expresan la molecula objetivo se cargan con 51Cr. Las celulas objetivo se lavan y despues se siembran en una placa de microtitulacion de fondo plano. Se agregan los PBL a las celulas objetivo en combinacion con las SPCBP. La liberacion maxima se determina mediante la adicion de Tween-20 a las celulas objetivo, mientras que la liberacion minima se determina en ausencia de los PBL. Despues de la incubacion durante la noche, el 51Cr liberado en el sobrenadante se mide en un contador de centelleo. Los ensayos in vivo incluyen inyectar una mezcla de SPCBP en un animal, por ejemplo, un modelo animal de un estado enfermo. Por ejemplo, el animal puede ser un animal transgenico, por ejemplo, que expresa un oncogen en un tejido en particular. En otro ejemplo, el animal es un raton con un xenoinjerto de celulas tumorales (por ejemplo, celulas tumorales humanas). La eficacia de la mezcla de SPCBP (u otro ligando) puede ensayarse mediante la comparacion del tiempo, tamano y numero de tumores formados en comparacion con los animales no tratados o tratados con control. En una implementacion en la que el raton xenoinjertado es un raton desnudo, el raton puede inyectarse con los PBL humanos para reconstituir el sistema inmunitario. Pueden controlarse ademas otros parametros fisiologicos de la mezcla de SPCBP, que incluyen la inmunogenicidad, el aclaramiento, y asf sucesivamente.

Ensayos de actividad celular. Otros ensayos de actividad celular incluyen las evaluaciones del pH celular y el flujo de calcio, y evaluaciones de un comportamiento celular, por ejemplo, apoptosis, migracion celular, proliferacion celular y diferenciacion celular.

En la tecnica se conocen numerosos ensayos de cultivo celular para la diferenciacion y la proliferacion. Algunos ejemplos son los siguientes:

Los ensayos para la diferenciacion de celulas madre embrionarias (que identificaran, entre otras, protemas que influyen en la hematopoyesis de la diferenciacion embrionaria) incluyen, por ejemplo, los descritos en: Johansson y otros (1995) Cellular Biology 15: 141-151; Keller y otros (1993) Molecular and Cellular Biology 13: 473-486; McClanahan y otros (1993) Blood 81: 2903-2915.

Los ensayos para la supervivencia/apoptosis de linfocitos (que identificaran, entre otras, protemas que previenen la apoptosis despues de la induccion del superantfgeno y las protemas que regulan la homeostasis de los linfocitos) incluyen, por ejemplo, los descritos en: Darzynkiewicz y otros, Cytometry 13: 795-808,1992; Gorczyca y otros,

Leukemia 7: 659-670,1993; Gorczyca y otros, Cancer Research 53: 1945-1951, 1993; Itoh y otros, Cell 66: 233 243, 1991; Zacharchuk, Journal of Immunology 145: 4037 4045, 1990; Zamai y otros, Cytometry 14: 891-897,1993; Gorezyca y otros, International Journal of Oncology 1: 639-648,1992.

Los ensayos para protemas que influyen en las primeras etapas del desarrollo y compartimentacion de las celulas T incluyen, sin limitacion, los descritos en: Antica y otros, Blood 84: 111-117,1994; Fine y otros, Cellular lnmunology 155: 111-122,1994; Galy y otros, Blood 85: 2770-2778,1995; Toki y otros, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 7548-7551,1991.

Los analisis dependientes de celulas dendnticas (que identificaran, entre otras, protemas expresadas por celulas dendnticas que activan las celulas T vfrgenes) incluyen, sin limitacion, los descritos en: Guery y otros, J. Immunol. 134:

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536-544,1995; Inaba y otros, Journal of Experimental Medicine 173: 549-559,1991; Macatonia y otros, Journal of Immunology 154: 5071-5079,1995; Porgador y otros, Journal of Experimental Medicine 182: 255-260, 1995; Nair y otros, Journal of Virology 67: 4062-4069,1993; Huang y otros, Science 264: 961-965,1994; Macatonia y otros, Journal of Experimental Medicine 169: 1255-1264, 1989; Bhardwaj y otros, Journal of Clinical Investigation 94: 797-807, 1994; y Inaba y otros, Journal of Experimental Medicine 172: 631-640,1990.

Los ensayos para la proliferacion de celulas T o timocitos incluyen, sin limitacion, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley Interscience (capftulo 3, -Tn vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3. 19; capftulo 7, Immunologic studies in Humans); Takai y otros, J. Immunol. 137: 3494 3500, 1986; Bertagnolli y otros, J. Immunol. 145: 1706 1712,1990; Bertagnolli y otros, Cellular Immunology 133: 327-341,1991; Bertagnolli, y otros, I. Immunol. 149: 37783783,1992; Bowman y otros, I. Immunol. 152: 1756-1761,1994.

Los ensayos para la produccion y/o proliferacion de citocinas de las celulas de bazo, celulas de ganglios linfaticos o timocitos incluyen, sin limitacion, los descritos en: Polyclonal T cell stimulation, Kruisbeek, A. M. y Shevach, E. M. In Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol 1, pags. 3.12. 1-3.12. 14, John Wiley y Sons, Toronto. 1994; y Measurement of mouse and human interleukin gamma, Schreiber, R. D. In Current Protocols in Immunology, Coligan eds. Vol 1 pag. 6. 8. 1-6.8. 8, John Wiley y Sons, Toronto. 1994. Los ensayos para la proliferacion y la diferenciacion de las celulas hematopoyeticas y linfopoyeticas incluyen, sin limitacion, los descritos en: Measurement of Human and Murine Interleukin 2 and Interleukin 4, Bottomly, K., Davis, L. S. y Lipsky, P. E. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol 1 pag. 6.3. 1-6.3. 12, John Wiley y Sons, Toronto. 1991; de Vries y otros, J. Exp. Med. 173: 1205 1211,1991; Moreau y otros, Nature 336: 690-692, 1988; Greenberger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 29312938, 1983; Measurement of mouse and human interleukin-6, Nordan, R. In Current Protocols in Immunology. J. E. e. a. Coligan eds. Vol 1 pag. 6.6. 1 6. 6.5, John Wiley y Sons, Toronto. 1991; Smith y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 83: 1857-1861, 1986; Measurement of human Interleukin-11, Bennett, F., Giannotti, J., Clark, S. C. y Turner, K. J. In Current Protocols in Immunology. Coligan eds. Vol 1 pag. 6.15. 1 John Wiley y Sons, Toronto. 1991.

Los ensayos para respuestas de clones de celulas T a antfgenos (que identificaran, entre otras, protemas que afectan las interacciones celulares de APC-T asf como los efectos directos de las celulas T mediante la medicion de la proliferacion y la produccion de citocinas) incluyen, sin limitacion, los descritos en: Current Protocols in Immunology, Ed por J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W Strober, Puh. Greene Publishing Associates y Wiley-Interscience (capftulo 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function; capftulo 6, Cytokines and their cellular receptors; capftulo 7, Immunologic studies in Humans); Weinberger y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6091-6095, 1980; Weinberger y otros, Eur. J. Immun. 11: 405-411,1981; Takai y otros, J. Immunol. 137: 3494-3500, 1986; Takai y otros, J. Immunol. 140: 508-512, 1988.

Otros ensayos, por ejemplo, pueden determinar la actividad biologica con respecto al comportamiento de las celulas endoteliales, crecimiento de las celulas nerviosas, migracion de las celulas nerviosas, espermatogenesis, oogenesis, apoptosis, angiogenesis, senalizacion endocrina, metabolismo de glucosa, metabolismo de aminoacidos, metabolismo del colesterol, eritropoyesis, trombopoyesis, y asf sucesivamente.

Ensayos de union celular. La funcionalidad de una mezcla de SPCBP puede usarse ademas, en un ensayo de union celular. La mezcla de SPCBP puede marcarse unida a una poblacion de celulas que incluye las celulas que presentan un objetivo reconocido por la mezcla de SPCBP. La poblacion puede incluir ademas, celulas que no presentan el objetivo, o que presentan una molecula relacionada que es discriminada por la mezcla de SPCBP.

En un primer ejemplo, la mezcla de SPCBP se prueba usando el analisis por FACS. La mezcla de SPCBP se marca con un fluoroforo, ya sea directamente o usando un anticuerpo secundario y se une a las celulas. Despues, las celulas se pasan a traves de un aparato FACS para contar el numero de celulas unidas por la mezcla de SPCBP. Las celulas pueden ponerse en contacto ademas con otro anticuerpo marcado con un fluoroforo que es detectable usando un canal diferente. La union de la mezcla puede correlacionarse sobre la base de celula por celula con la union de la mezcla de SPCBP (por ejemplo, usando un grafico de dispersion 2D).

En un segundo ejemplo, la mezcla de SPCBP se ensaya usando inmunohistoqmmica. La mezcla de SPCBP se pone en contacto con una seccion histologica. La seccion se lava y se detecta la mezcla de SPCBP unida, por ejemplo, usando metodos estandar.

En un tercer ejemplo, la mezcla de SPCBP se ensaya in vivo, por ejemplo, en un organismo de un sujeto. La mezcla de SPCBP se marca, por ejemplo, con un reactivo de contraste de NMR u otro reactivo localizable. La mezcla de SPCBP se administra al sujeto y, despues de un intervalo apropiado, se detecta su localizacion dentro del sujeto, por ejemplo, mediante imagenologfa del organismo de un sujeto.

Cualquiera de los ensayos descritos anteriormente puede usarse para determinar la mezcla con la maxima eficacia optima y, asf, el clon celular que produce esta mezcla. Las mezclas de las SPCBP tienen efectos antagonistas, agonistas (o de activacion) en ciertos ligandos, y los efectos son aditivos o sinergicos en comparacion con los componentes individuales. La mezcla puede contener una SPCBP que anula el efecto positivo ejercido por otras

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SPCBP, por lo tanto, es importante tamizar las actividades funcionales netas en lugar de anadir la actividad de los compuestos individuales de la mezcla. La presencia de efectos aditivos y sinergicos implica ademas que ciertas SPCBP que estan por debajo de un cierto criterio de seleccion, cuando se prueban como compuestos individuales y que normalmente no se buscan, en combinacion con otras SPCBP muestran un efecto biologico fuerte y significativo.

El uso preferido de las mezclas de SPCBP en enfermedades inflamatorias e infecciosas esta en aplicaciones en las que los diferentes compuestos proteicos de la mezcla ejercen un efecto antagonista, como la inhibicion de una interaccion receptor ligando debido a un impedimento esterico o efectos indirectos tales como interferencia con el sitio de union a ligando en el receptor o el sitio de union a receptor en el ligando. Otros usos preferidos incluyen el uso de mezclas de SPCBP con mas potencia o actividad por masa en comparacion con los anticuerpos con dominios apareados tales como moleculas de scFv, Fab e IgG; tal potencia aumentada se debe a los efectos sinergicos entre los componentes individuales de la mezcla. Se han descrito que los anticuerpos de dominio unico son particularmente adecuados para reconocer los sitios de los canones virales, ademas en particular, de los sitios conservados que normalmente estan ocultos en el interior de la protema del recubrimiento geneticamente variable del patogeno. Las aplicaciones preferidas, por lo tanto, incluyen la neutralizacion del virus y patogenos que son mas facilmente reconocidos por las SPCBP que por los anticuerpos con dominios apareados tales como las moleculas scFv, Fab e IgG. Similarmente, la inhibicion de las enzimas es un uso preferido para las SPCBP. Dado que las SPCBP basadas en el andamio de la inmunoglobulina (dAbs, anticuerpos de camello) se producen en eucariotas inferiores a niveles mas altos que los fragmentos de anticuerpos con dominios apareados tales como las moleculas scFv, Fab y de diacuerpo, el huesped de produccion preferido para las mezclas de SPCBP basadas en tales andamios son las eucariotas inferiores tales como Pichia pastoris, Hansenula Polymorpha y Saccharomyces cerevisiae. Para la produccion de mezcla de las SPCBP que se fusionan a dominios glicosilados, el huesped preferido es CHO.

En una modalidad, la biblioteca de celulas que expresa multiples SPCBP que se asocian ademas con la superficie celular (ver anteriormente), esta sujeta a la clasificacion por FACS. Similarmente, la clasificacion celular puede usarse para una clonacion mas rapida de clones celulares. Con respecto a FACS, las celulas se clasifican usando un clasificador de celulas activadas por fluorescencia (por ejemplo, un clasificador disponible de Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose California; ver ademas las patentes de Estados Unidos nums. 5.627. 037; 5.030. 002; y5.l37. 809). A medida que cada celula pasa a traves del clasificador, un rayo laser excita los compuestos fluorescentes que estan unidos a la celula. Un detector evalua la cantidad de luz emitida por dichos compuestos fluorescentes, si esta presente. La cantidad de marcador unido a cada celula se cuantifica y, si se detecta al menos un nivel fijo de cantidad de marcador, se genera un campo electrostatico para desviar la celula de su ruta predeterminada. Asf, las celulas desviadas se separan y se recogen. Como resultado, las celulas con baja o ninguna expresion de SPCBP pueden descartarse y las celulas que demuestran una expresion de SPCBP de alto nivel pueden recolectarse y cultivarse. La expresion de multiples SPCBP puede detectarse en la misma celula huesped usando diferentes marcadores fluorescentes y analisis multidimensionales.

Para los anticuerpos, se ha descrito una correlacion cuantitativa relativa entre los niveles de la superficie celular y la protema secretada, una caractenstica que se ha usado para seleccionar transfectantes de lmea celular con niveles de expresion de anticuerpos mejorados (Brezinsky y otros, J. Immunol. Methods 277: 141-55). En una modalidad, las bibliotecas celulares de SPCBP se someten a clasificacion FACS, despues de que se han cultivado las celulas transfectadas tales como celulas CHO en un medio de baja permeabilidad. El medio de baja permeabilidad puede ser solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene aproximadamente el 40% de gelatina con o sin suero de ternera fetal. El medio de baja permeabilidad reduce la difusion de las protemas secretadas en el cultivo, permitiendo de ese modo, que las protemas secretadas se unan a la superficie de la celula CHO de la que se expresan en lugar de difundirse y unirse a otra celula. Las celulas se eliminan despues de los medios de baja permeabilidad y se exponen a anticuerpos marcados que se unen selectivamente a una porcion de las SPCBP secretadas que no se unen a la superficie de la celula. El anticuerpo marcado (que se une a la SPCBP secretada/asociada a la superficie puede conjugarse con un fluoroforo o un marcador metalizado. Las celulas se clasifican en funcion de la deteccion del anticuerpo marcado, por ejemplo, mediante el uso de la clasificacion de celulas activadas por fluorescencia (FACS) o la clasificacion celular magnetica, respectivamente. Mediante FACS o la clasificacion de celulas magneticas, se detecta el nivel de las SPCBP secretadas y unidas a la celula CHO y se seleccionan las celulas que secretan altos niveles de las SPCBP, o las que expresan las SPCPB en una relacion relativa espedfica.

Alternativamente, las celulas de la biblioteca se encapsulan en matrices de afinidad de microgotas en gel. En el primer caso, las celulas se incuban en una matriz espedfica para el producto secretado de interes. Los productos secretados se unen a la matriz de afinidad en la superficie de la celula secretora y posteriormente se marcan con los reactivos fluorescentes espedficos para el analisis citometrico de flujo y la clasificacion celular. La propia matriz se crea mediante la union, por ejemplo, de un anticuerpo de captura espedfico avidinilado a la superficie celular previamente biotinilada. El uso de un medio de baja permeabilidad (como antes) impide la alimentacion cruzada del producto (Frykman y otros, 1998, Biotechnol Bioeng 59: 214-226 y Holmes y Al-Rubeai, 1999, J. Immunol. Methods 230: 141-147). En otro enfoque, se usan microgotas de gel (como en Gray y otros, 1995, J. Immunol. Methods 182: 155-63). En dicho sistema, las celulas de la biblioteca se encapsulan individualmente en perlas de agarosa que contienen reactivos de captura espedficos. Las celulas se cultivan durante un corto penodo de tiempo mientras producen las SPCBP y las perlas se recolectan y clasifican en un citometro de flujo.

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Una vez establecida una relacion optima, se determina la presencia de protemas de union individual en esta mezcla de la siguiente manera. La identidad de la SPCBP se revela mediante un ensayo de union, si todos los genes de SPCBP de entrada codifican protemas que se unen a diferentes objetivos y los objetivos estan disponibles para la prueba. Al carecer de algunos o todos los objetivos para el ensayo de union, la identidad se determina analizando la presencia de los genes de SPCBP en el genoma de la celula huesped, por ejemplo mediante transferencia de membrana tipo Southern o mediante PCR con sondas y oligonucleotidos espedficos de SPCBP, respectivamente. Alternativamente, el ADN que codifica los genes de SPCBP puede recuperarse mediante la amplificacion con los oligonucleotidos disenados para unirse a todos los genes de SPCBP, y el material se clona y se secuencia. En otra modalidad, se preparan reactivos espedficos de SPCBP (ver el Ejemplo 5) y las pruebas de union de 'sustitutos' empleadas para este analisis. Asf, la invencion proporciona muchos metodos para tamizar rapidamente cientos de mezclas de diferentes mezclas de protemas.

2.3.4. Purificacion mezclas de protemas

Tradicionalmente antes de su uso para la terapia humana, los farmacos proteicos se expresan y se purifican hasta la homogeneidad, que consiste en una especie molecular principal. En algunos casos, la terapia es mas eficaz con combinaciones de protemas u otros farmacos. Esta invencion describe metodos para preparar una mezcla proteica que contendra al menos dos especies moleculares principales, compuestas por al menos dos SPCBP. La fabricacion a gran escala de la mezcla protemica es un requisito previo para su uso clmico, y un procedimiento de purificacion simple es una caractenstica importante del proceso de desarrollo. Para purificar protemas biofarmaceuticas y, en particular, anticuerpos, el material de grado de investigacion se purifica frecuentemente mediante el uso de cromatograffa de afinidad de antfgeno. Dado que esto a escala industrial y para la produccion biofarmaceutica no es una opcion comercial, y en particular para las mezclas de SPCBP que reconocen objetivos multiples, puede no ser una ruta comercialmente viable para las mezclas de protemas terapeuticas, una modalidad preferida de esta invencion es usar metodos de purificacion que no se hacen dependientes del antfgeno u objetivo que se reconoce por el componente o los componentes de SPCBP. En una modalidad, los genes que codifican los componentes de los dos compuestos proteicos se coexpresan en la misma celula huesped y las diferentes especies moleculares principales que se presentan en la mezcla y tienen una especificidad de union funcional purificada usando tecnicas bioqmmicas/bioffsicas bien conocidas en la tecnica. En una modalidad, el metodo se usa para preparar una mezcla de un numero definido de protemas de union en una relacion seleccionada. En una modalidad, las principales especies moleculares que comprenden una o mas especificidades de union diferentes comparten una proporcion minima de su informacion genetica de codificacion (por ejemplo, una region Fc, una etiqueta comun u otro dominio o caractenstica compartida); dicha caractenstica compartida proporcionara un mecanismo/ensayo comun para seguir los compuestos individuales en la mezcla. En otra modalidad, las principales especies moleculares se copurifican preferentemente debido a un comportamiento bioffsico/bioqmmico similar que surge debido a una homologfa entre los acidos nucleicos que codifican las diversas SPCBP. Por ejemplo, algunas moleculas quimericas como las inmunoadhesinas muestran un dipolo de carga debido a los diferentes pi de un dominio frente al otro (Wurm y otros, in Antibody Fusion Proteins, pag. 281; Ed. Wiley, Nueva York, 1999). Tales moleculas no se comportaran de manera ideal con tecnicas de separacion basadas en la carga ionica. Las SPCBP en la mezcla se relacionan preferentemente entre sf mediante la secuencia y preferentemente se basan en el mismo andamio de la protema. Aunque su sitio de union sera diferente, la estructura general, la distribucion de carga y el tamano de dichas moleculas seran muy similares. Por lo tanto, se prefieren las regiones de codificacion de SPCBP que tienen una homologfa de secuencia de al menos 70%. Ademas, en la modalidad preferida, las SPCBP en la mezcla tienen preferentemente valores de pi que no difieren en mas de 2 unidades de pH.

La invencion se refiere ademas a las mezclas biofarmaceuticas producidas usando este metodo. Los metodos para la purificacion de protemas son bien conocidos en la tecnica e incluyen cromatograffa de afinidad basada en matrices de protema A, protema G, protema L, albumina y otras sustancias, cromatograffa de afinidad de metal inmovilizado (IMAC, para protemas de union con etiquetas de histidina) cromatograffa en gel tiofflico, filtracion en gel preparativa, FPLC y HPLC, cromatograffa de intercambio ionico, etcetera. Ademas, es aplicable la distribucion a traves de la extraccion en dos fases acuosa o recuperacion por cromatograffa en lechos expandidos. Preferentemente, los compuestos protemicos comparten caractensticas fisicoqmmicas, de manera que pueden copurificarse usando los mismos procedimientos. La razon de esto es que, dado que para las aplicaciones terapeuticas se requieren frecuentemente, multiples etapas de purificacion, una modalidad preferida de la invencion es usar protemas de union que tienen una homologfa de secuencia minima del 70% de manera que puedan usarse los mismos metodos de purificacion fisicoqmmicos para purificar todas las protemas de union en la mezcla. Ejemplos de ello son el uso de protemas de union que se unen todas a los ligandos de matrices de afinidad genericas tales como la protema A (muchos dAb humanos que contienen un segmento VH humano se unen a la protema A (Akerstrom, B. y otros (1994) J Immunol Methods 177: 151-163)), o protema L (para dominios VL humanos, (Holt, L. J. y otros (2003) Trends Biotechnol 21: 484-490.)), o la albumina (ciertas variantes de aficuerpos), o para usar un anticuerpo o anticuerpos seleccionados a la medida u otra protema o protemas de union que reconocen todas las protemas de union en la mezcla. Se han descrito metodos para proporcionar sitios genericos de ligando de union en todos los miembros de una biblioteca de protemas de union (documento de patenteWO9920749A1).

La homologfa de secuencia entre los acidos nucleicos que codifican las cadenas polipeptfdicas individuales de las protemas de union minimiza el numero de etapas de la purificacion requerida para obtener el componente activo de la mezcla de protemas y proporciona un medio para recuperar de manera simultanea las diferentes protemas de union de las protemas de union de la misma fuente de celula huesped recombinante. Por ejemplo, las unidades de union de un

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dominio unico, tales como los dominios variables derivados de camelidos, se producen facilmente y convenientemente en huespedes eucariotas inferiores como se describio anteriormente y en el documento de patente num. WO94/25591 (Unilever), en sistemas de produccion y purificacion sintonizados hacia el producto SPCBP particular. Si el andamio base para un conjunto de las SPCBP es identico, son altas ademas, las probabilidades de que seran similares muchas caractensticas de las protemas de union en la mezcla que se determinan con este andamio. Por ejemplo, muchas VHH son extremadamente estables al calor, lo que permite la pasteurizacion u otros tratamientos con calor sin perdida de la capacidad de union al antigeno de mezclas de tales VHH. Cuanto mayor sea el porcentaje de homologfa entre las SPCBP, mayor sera la probabilidad de que las protemas compartan caractensticas fisicoqmmicas similares, y que estas protemas puedan copurificarse con multiples metodos. Preferentemente, las protemas comparten una homologfa del 70%, con mayor preferencia del 80%, preferentemente del 90%. Preferentemente, las regiones dentro del andamio de la SPCBP que no se usan como sitio permisivo en la construccion de la biblioteca son 85% homologas, preferentemente 95%. El porcentaje de homologfa se determina ya sea clasificando en el acido nucleico las diferencias entre las regiones codificantes de SPCBP, o sus partes, o por metodos empmcos, por ejemplo mediante experimentos de hibridacion en los que una region codificante de SPCBP o parte de esta se usa como sonda para determinar en condiciones de rigurosidad establecidas si se hibrida con las otras regiones codificantes de SPCBP. Estos metodos se han descrito ampliamente en la tecnica.

Se prefiere, ademas, un metodo simple de purificacion antes de realizar muchos bioensayos. Asf, sera necesario algunas veces eliminar los contaminantes que interfieren con el bioensayo, y/o concentrar las protemas de union en la mezcla antes del ensayo.

El tamizaje de la biblioteca y la composicion identifica ciertas mezclas optimas de las SPCBP asociadas con un formato de expresion particular y las lmeas celulares que producen tal mezcla optima. En una modalidad, la informacion que se genera usando los metodos y composiciones de la invencion se utiliza para desarrollar una lmea celular o celula o lmea celular de produccion, por ejemplo, que producen una mezcla equivalente de las SPCBP. En otra modalidad, las celulas que expresan SPCPB con composiciones seleccionadas, ya sea como celulas completas o como acido nucleico que contienen fragmentos de estas, se usan para producir una celula de produccion que expresa las regiones codificantes de SPCBP. Por ejemplo, la fusion celular se usa para combinar las caractensticas de la celula de produccion con las de la celula que expresa SPCBP.

3. Aplicaciones de las composiciones de mezclas de SPCBP

La mayona de los experimentos hasta la fecha se han realizado con anticuerpos, y en particular, con anticuerpos monoclonales. La siguiente seccion describe las aplicaciones de la mezcla de protemas, ejemplificadas con el uso de MoAb, pero de manera similar, pueden contemplarse mezclas de las SPCBP. Para muchas aplicaciones terapeuticas se ha contemplado el uso de protemas de union que reconocen diferentes epftopos combinados en una molecula. Por ejemplo, las moleculas dirigidas a dos objetivos diferentes, tales como una celula cancerosa y un linfocito efector, que se desarrollan en el campo de la inmunoterapia del cancer (Repp, R. y otros (2003) Br J Cancer 89: 2234-2243.). Las protemas de union unicas se han combinado a traves de la tecnologfa recombinante para proporcionar reactivos biespedficos, usando fusion directa o fusion a dominios de multimerizacion. Sin embargo, particularmente, las protemas de fusion producidas de forma recombinante han mostrado limitaciones importantes en su estabilidad, por ejemplo, debido a la degradacion proteolftica y frecuentemente, muestran niveles de expresion reducidos en comparacion con los componentes individuales. En comparacion con los anticuerpos monoclonales y los interferones, por ejemplo, su desarrollo biofarmaceutico, frecuentemente, es un proceso largo, mas arriesgado y mucho mas diffcil. Ademas, no siempre es conveniente retener un enlace ffsico entre los sitios de union y obtener multiples protemas de union tales como entidades separadas no asociadas con otras protemas de union en la mezcla. Se utiliza en nuestra invencion cocteles de protemas de union separadas que se producen en la misma celula. Una aplicacion de esta invencion es construir colecciones de protemas de union dirigidas al mismo objetivo, en las que las diferentes protemas de union reconocen diferentes epftopos en el objetivo. Otra aplicacion de esta invencion es construir colecciones de protemas de union dirigidas a epftopos en diferentes objetivos. A modo de ejemplo, se describen ejemplos en los que se han usado mezclas de anticuerpos; de manera similar a las mezclas de anticuerpos, existen aplicaciones para mezclas de diferentes SPCBP en el mismo objetivo o antfgeno, para mezclas de diferentes SPCBP en diferentes objetivos o antfgenos, para mezclas de las SPCBP en diferentes objetivos o antfgenos en el mismo o diferente objetivo o antfgeno.

Virus neutralizantes

Las mezclas de MoAb antivirales aumentan la eficacia clmica del tratamiento en comparacion con la terapia MoAb. Ademas, se reduce la probabilidad de aparicion de mutantes de escape viral y la probabilidad de resistencia viral con la terapia prolongada.Se incluyen anticuerpos que se unen a multiples epftopos o subtipos diferentes del virus.Pueden usarse anticuerpos antivirales dirigidos a epftopos lineales, que son menos propensos al efecto de los mutantes de escape que los anticuerpos dependientes de la conformacion. El efecto de las multiples especificidades de union presentes en la mezcla de anticuerpos proporciona una senal mas fuerte para el aclaramiento viral que cuando se usa un MoAb.

Las mezclas de los MoAb han demostrado efectos superiores en la neutralizacion y eliminacion de una serie de virus:

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Virus de inmunodeficiencia humana (HIV). La infeccion con HIV-1 conducira al desarrollo del Smdrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) si no se trata. Durante la infeccion con HIV-1, se desarrollan anticuerpos neutralizantes que se dirigen contra diversos epftopos en las moleculas de glicoprotema de la envoltura de HIV-1 gp41 y gpl20. En los ultimos anos, se han aislado y caracterizado extensivamente diversos anticuerpos monoclonales humanos contra el HIV. Estos MoAb se han probado independientemente y en combinacion, en primates no humanos por su eficacia en el bloqueo de la transmision viral del HIV. En un ensayo clmico publicado en 1992, la administracion de plasma de seropositivo para HIV-1 que contema altos tftulos de anticuerpos neutralizantes de HIV, se asocio con una reduccion de la viremia del HIV-1 y una serie de infecciones oportunistas. Posteriormente, varios grupos publicaron que la administracion de plasma de seropositivo para HIV-1 resulta en el retraso del primer evento definitorio del SIDA y la mejora de los smtomas clmicos. Sin embargo, el entusiasmo por la inmunoterapia pasiva disminuyo cuando se descubrio que los anticuerpos no eliminaron el virus y resulto en la aparicion de variantes de escape de neutralizacion en los pacientes. Se demostro que los anticuerpos que se inducen durante la infeccion natural por el HIV-1 neutralizan de manera pobre el virus, dando como resultado una baja potencia de suero hiperinmune usado para la inmunoterapia pasiva de la infeccion por HIV-1. Ademas, se demostro que algunos anticuerpos que surgen durante la infeccion natural pueden incluso mejorar la infeccion. Se observo que para la terapia de anticuerpos del HIV-1, se necesitaban anticuerpos monoclonales neutralizantes potentes y bien caracterizados. Estos hallazgos iniciales estimularon el desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos contra las glicoprotemas de la envoltura del HIV-1. En los ultimos anos, se han aislado y caracterizado una serie de anticuerpos monoclonales humanos contra las glicoprotemas de la cubierta viral gp41 y gpl20 de HIV-1 por su actividad neutralizante del virus in vitro. Experimentos posteriores en modelos de primates no humanos de infeccion por HIV y transmision han demostrado que los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos a diferentes epftopos de la glicoprotema de la envoltura del HIV-1 exhiben una fuerte sinergia cuando se usan en combinacion. Se ha sugerido que las combinaciones de anticuerpos monoclonales anti-HIV humanos pueden explotarse clmicamente para la inmunoprofilaxis pasiva contra el HIV-1. Estos experimentos demuestran ineqmvocamente que las mezclas de 3-5 MoAb anti-HIV evitan eficientemente la transmision del HIV peri y postnatal.

Virus de la rabia. La rabia es una enfermedad neurologica aguda causada por la infeccion del sistema nervioso central con el virus de la rabia. Casi invariablemente fatal una vez que aparecen los smtomas clmicos, el virus de la rabia continua siendo una amenaza importante de infeccion humana y veterinaria debido a los extensos reservorios en diversas especies de vida silvestre. Para la inmunoterapia pasiva, se usa IgG del suero mezclado de individuos inmunes a la rabia o caballos inmunizados; la inmunoglobulina antirrabica es costosa y escasea o no existe. Por lo tanto, existe la necesidad de composiciones y metodos para producir mezclas de anticuerpos, preferentemente anticuerpos humanos, para usar en inmunoterapia pasiva de infecciones de Rabia. Se ha demostrado que una mezcla de tres MoAb humanos es tan efectiva como la Ig policlonal antirrabica humana para proteger a los ratones contra una infeccion letal de la rabia.

Virus de la Hepatitis B. Las vacunas HBV recombinantes proporcionan un medio seguro y eficaz para la prevencion del VHB que confiere inmunidad a largo plazo mediante la inmunizacion activa. A diferencia de la lenta aparicion de proteccion despues de esta vacunacion, la inmunoterapia pasiva con anticuerpos contra el HBV proporciona proteccion inmediata pero a corto plazo contra la transmision e infeccion viral. El tratamiento de la infeccion cronica por hepatitis B con los farmacos antivirales se caracteriza por la falta de aclaramiento del virus, la perdida de respuesta o la aparicion de mutantes resistentes a los farmacos. Se ha demostrado la importancia de los anticuerpos neutralizantes en el aclaramiento de la infeccion viral persistente y la combinacion de tratamientos de farmacos quimioterapeuticos y anticuerpos conduce a un efecto terapeutico adicional. Se cree que los anticuerpos inhiben la infeccion bloqueando al HBV para entrar en las celulas. Dicha inmunoterapia pasiva es recomendable para las personas que estuvieron expuestas al material positivo a HBV (lesiones por aguja o corte) y para los recien nacidos cuyas madres son portadoras de HBV, para pacientes sometidos a un trasplante de hugado. En la actualidad, este tratamiento se lleva a cabo con inmunoglobulina de hepatitis B, una preparacion de anticuerpo policlonal derivada de plasma obtenido de donantes quetuvieron anticuerpos positivos para el antfgeno de superficie de la hepatitis B. La disponibilidad de este suero es limitada y las preocupaciones adicionales por el precio y la seguridad con respecto al uso de productos sangumeos, hacen necesario el desarrollo de un tratamiento alternativo. Un anticuerpo monoclonal humano puede ser ventajoso al presentar una fuente estable y reproducible para la inmunoterapia prolongada. Sin embargo, los estudios demuestran que un anticuerpo monoclonal dirigido contra el antfgeno S y con capacidad neutralizante contra el HBV en los chimpances retraso pero no previno la infeccion con HBV. En parte, esto puede provocarse por la aparicion de variantes de escape, mutantes en el antfgeno S que ya no pueden unirse al anticuerpo monoclonal. Similarmente, los mutantes de escape surgen en los pacientes despues del trasplante de hugado en los ensayos clmicos con anticuerpos monoclonales. Por lo tanto, el tratamiento con un solo anticuerpo monoclonal puede ser ineficaz e insuficiente. Se probaron dos MoAb humanos contra el antfgeno de superficie del virus de la hepatitis B en un modelo murino y de chimpance de infeccion cronica por hepatitis B (Eren, R. y otros, (2000) Hepatology 32: 588-596). La administracion de una mezcla de estos dos anticuerpos en ambos modelos resulto en una reduccion inmediata de la carga viral. La combinacion de anticuerpos funciono mejor, tanto en la reduccion de la carga viral como en la inhibicion de la infeccion hepatica, despues de una preparacion de anticuerpos policlonales comerciales a partir de suero humano mezclado. La mezcla de dos anticuerpos se ha probado en un ensayo clmico de Fase I en pacientes con infecciones cronicas de HBV y se ha demostrado que son seguros y

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reducen la carga viral y los niveles del antigeno de superficie de la hepatitis B (Galun, E. (2000) Hepatology 35: 673-679).

• En general, para las enfermedades virales, el ensamblaje funcional de mezclas de las SPCBP antivirales puede aumentar la eficacia clrnica del tratamiento en comparacion con la terapia monoclonal, al disminuir la probabilidad de mutantes virales de escape resistentes al tratamiento y al reducir la probabilidad de la resistencia viral con la terapia prolongada. En la mezcla, pueden incluirse los anticuerpos que se unen a muchos epftopos diferentes del virus. Es factible ademas, incluir anticuerpos para los diferentes subtipos del virus, para ampliar la utilidad del farmaco en una poblacion de pacientes mas amplia. Pueden agregarse otras SPCBP antivirales dirigidos a los epftopos lineales, que son menos propensos al efecto de los mutantes de escape que las SPCBP dependientes de la conformacion. El efecto de las multiples especificidades de union presentes en la mezcla de SPCBP puede proporcionar una senal mas fuerte para el aclaramiento viral que cuando se usa un anticuerpo monoclonal. Esencialmente, hay aplicaciones ademas para mezclas de un sitio de union con diferentes especificidades finas para unir su antigeno. Por ejemplo, cuando el antigeno es propenso a la mutacion como es el caso de muchos antigenos virales, en el curso de un tratamiento, el epftopo en el antigeno puede alterarse de manera que se pierde la union de una primera protema de union. Al usar una mezcla, por ejemplo, basada en el mismo andamiaje pero con cambios mmimos con respecto a la primera y con la actividad de union similar, pero que proporciona un intervalo de alteraciones de aminoacidos en el sitio de union, existe la posibilidad de que las mutaciones afecten la union de algunas especies en la mezcla, pero no de otras con una qmmica de union diferente y resistencia aun similar. En tal caso, sera preferible usar distintas qmmicas de union para la interaccion con el antfgeno, por lo tanto, el SPCBP debe estar lo menos relacionado posible en secuencia.

Toxinas neutralizantes

La inmunizacion pasiva se ha establecido desde hace mucho tiempo como un valioso enfoque profilactico y terapeutico contra las toxinas. A pesar de disminuir la aceptacion general debido a la prevalencia de enfermedades infecciosas entre los donantes de plasma y de los requisitos de control de seguridad y eficacia exagerados impuestos a los fabricantes por las autoridades reguladoras, las preparaciones convencionales de anticuerpos policlonales derivados del plasma en muchos casos siguen siendo los unicos productos disponible para los pacientes.

• Toxina tetanica (Lang, A. B. y otros, (1993) J. Immunol. 151: 466-472). Se demostro que una mezcla de tres MoAb humanos anti-toxoide tetanico actua sinergicamente y proporciona proteccion completa contra la toxina en un modelo animal. Solo 0,7 mg de la mezcla de anticuerpo monoclonal humano dio la misma potencia que 170 mg de antisuero policlonal humano comercialmente disponible usado para la inmunizacion pasiva.

• Toxina botulmica (Nowakowski, A. y otros Proc. Natl. Acad. Sci. 2002,99, 11346-11350). Las toxinas botulmicas causan el botulismo, la enfermedad humana paralitica, y son uno de los agentes de alto riesgo para el bioterrorismo. Tres MoAb diferentes generados contra una de las toxinas no neutralizaron significativamente la toxina como agentes unicos. En contraste, las combinaciones de dos MoAb la bloquearon a las dosis de 20 veces la LD50. Una combinacion de tres MoAb neutralizo 450 000 dosis letales del 50% de la toxina en experimentos con animales: una potencia 90 veces mayor que la globulina hiperinmune humana. Es importante destacar, que se encontro que la mezcla de los anticuerpos causo un gran aumento en la avidez de union funcional. Estos estudios demuestran que la potencia de la respuesta inmune policlonal natural puede desplegarse en solo tres anticuerpos, lo que sugiere que se pueden esperar actividades igualmente potentes a partir de las mezclas de SPCBP que comprenden solo un numero limitado de anticuerpos.

Destruccion de celulas tumorales

La destruccion de las celulas tumorales mediada por anticuerpos involucra una serie de mecanismos diferentes. La union de anticuerpos a la superficie de la celula tumoral puede reclutar componentes del sistema del complemento y/o celulas efectoras inmunes que atacan a las celulas malignas. Se supone que estos procesos de destruccion se benefician de una alta densidad de moleculas de anticuerpos en la superficie celular. Puede lograrse una alta densidad de anticuerpos unidos a la superficie celular al dirigir moleculas que se regulan positivamente en la superficie de la celula tumoral. De hecho, los exitosos MoAb antitumorales Herceptin y Rituximab se unen a objetivos tumorales altamente expresados y se cree que esto es fundamental para su eficacia. Puede lograrse ademas, una alta densidad de anticuerpos unidos a la superficie celular dirigiendo multiples moleculas sobre la superficie de la celula tumoral. Los objetivos individuales no necesitan ser altamente expresados ya que multiples objetivos contribuyen a la decoracion de anticuerpos de alta densidad. Asf, los objetivos tumorales que se han considerado suboptimos para la terapia de anticuerpos son valiosos en el contexto de una mezcla de protemas de union.

La union de anticuerpos a la superficie de la celula tumoral puede ejercer ademas un efecto directo, tal como la induccion de la apoptosis (muerte celular programada). Los procesos que gobiernan la apoptosis inducida por anticuerpos no se comprenden completamente, pero se ha demostrado que el entrecruzamiento de orden superior de muchas moleculas de superficie celular diferentes induce la apoptosis. Similarmente a algunos fragmentos de anticuerpos monovalentes, algunas mezclas de SPCBP inducen de manera eficiente la apoptosis.

• Cancer de mama (Spiridon, C. I. y otros, Clin. Can. Res. 2002: 8,1720-1730). HerceptinTM es un MoAb humanizado registrado para el tratamiento de mujeres con carcinoma de mama que sobreexpresan el receptor Her-2/neu. En estudios preclrnicos, se ha demostrado que una mezcla de tres MoAb contra diferentes epftopos

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del receptor Her-2/neu demostro ser mas potente que los MoAb individuals para prevenir el crecimiento tumoral en estudios de animales.

• Linfoma de no-Hodgkin (NHL). Rituximab es un anticuerpo monoclonal quimerico que se une a la molecula CD20 sobreexpresada en los tumores de celulas B, incluyendo NHL. Recientemente, Amgen ha iniciado ensayos clmicos de Fase II combinando epratuzumab, su anticuerpo monoclonal humano anti-CD22 con rituximab. Igualmente que CD20, CD22 es una molecula de superficie celular expresada por las celulas B y tumores de celulas B. Aunque el ensayo aun esta en curso, los datos disponibles muestran que la terapia de combinacion de los dos MoAb es segura y aumenta el numero de pacientes respondedores y las remisiones completas. Estos resultados muestran que la combinacion de dos MoAb aumenta la potencia del tratamiento antitumoral como se midio con los terminos clmicos objetivos.

Citocinas neutralizantes

El factor de necrosis tumoral alfa de la citocina proinflamatoria (TNF-a) esta implicado de manera cntica en la patogenesis de varias enfermedades inflamatorias cronicas. Los MoAb contra el TNF-a se usan actualmente para el tratamiento de la artritis reumatoide (RA) y la enfermedad de Crohn y, desde el punto de vista clmico y comercial, pertenecen a los biofarmaceuticos mas exitosos generados por la industria de la biotecnologfa.

La interleucina 1 (Il-1) es otra citocina que juega un papel dominante en la mediacion de la progresion de la RA. IL-1 parece ser principalmente responsable de la destruccion del cartflago, mientras que el TNF-a es un importante mediador de la reaccion inflamatoria. Se ha demostrado en modelos animales que el bloqueo ya sea de TNF-a o IL-1 controla parcialmente la RA, mientras que la combinacion de moleculas anti-TNF-a y anti-IL-1 logra una eficacia superior (Feige, U. y otros, (2000). Cell. Mol. Life Sci. 57: 1457-1470). Asf, pueden desarrollarse mezclas de sitios de union que bloquean simultaneamente TNF-a e IL-1 u otras combinaciones de citocinas que interfieran en dos vfas patologicas aparentemente independientes en las enfermedades inflamatorias cronicas tal como RA.

Aunque los datos aun son escasos, se ha demostrado que las combinaciones de MoAb anti-TNF neutralizan sinergicamente el TNF a traves de los efectos complementarios de los mecanismos de bloqueo de TNF competitivo y alosterico. Asf, las protemas de union anti-TNF cooperativas presentes en las mezclas de SPCBP neutralizaran con mayor eficiencia, resultando en una reduccion de la dosificacion y el costo.

Asf, las mezclas de las SPCBP son adecuadas para luchar contra patogenos que incluyen virus como el HIV y la rabia, bacterias, hongos y parasitos. Otros ejemplos en los que actualmente se usa un suero policlonal o gamma-globulina que puede reemplazarse con una mezcla de SPCBP definida, incluyen enfermedades tales como la rabia, la hepatitis, el virus de la varicela-zoster, el herpes o la rubeola. Las enfermedades bacterianas que pueden tratarse con mezclas de SPCBP incluyen las meningitis, las enfermedades causadas por Staphylococcus, Streptococcus. Hemophilus, Neisseria, Pseudomonas y Actinomicetos. Los objetivos incluyen ademas los implicados en la sepsis bacteriana, como el lipopolisacarido (LPS), el lfpido A, el factor de necrosis tumoral alfa o las protemas de union a LPS. Algunos de estos patogenos poseen multiples serotipos y no uno, por lo que se requieren multiples SPCBP para neutralizar los diversos serotipos. Una mezcla de SPCBP proporcionara, mediante la eleccion de las especificidades de union, una cobertura mas amplia de los serotipos que se tratan y, por lo tanto, se pueden tratar mas pacientes con la misma mezcla de SPCBP. Por esta y otras razones, las mezclas pueden formar ademas diagnosticos adecuados y parte de estuches de diagnostico para la deteccion de una enfermedad otrastorno en los pacientes.

Las mezclas de las SPCBP pueden ser mas efectivas que los anticuerpos monoclonales ademas en el tratamiento de enfermedades oncologicas como el linfoma no Hodgkin (NHL) y tumores de celulas epiteliales como el carcinoma de mama y de colon. Ya se ha demostrado que apuntar CD20 y cD22 en el NHL con anticuerpos puede ser mas efectivo que apuntar las celulas tumorales con los anticuerpos individuales. Antfgenos objetivo adecuados para mezclas de las SPCBP en las enfermedades oncologicas son muchos, incluyendo CD19, CD20, Cd22, CD25 (receptor de IL-2), CD33, el receptor de IL-4, receptor de EGF, receptor de EGF mutante, antfgeno de carcinoma embrionario, antfgeno espedfico de prostata, ErbB2/HER2, carbohidrato LewisY, mesotelina, Mucina-1, el receptor de la transferrina, el antfgeno de membrana espedfica de la prostata, el VEGF y los receptores, EpCAM y CTLA-4. En particular para aquellos antfgenos que al apuntarse con una mezcla de SPCBP pueden modularse sin depender necesariamente de la funcion efectora mediada por la region Fc del anticuerpo, esto sera util. Los ejemplos incluyen el bloqueo eficiente de multiples interacciones entre ligandos y receptores, o de interacciones entre receptores y apareamientos tales como en la familia de receptores EGFR, o la induccion de efectos agonistas en los receptores, o la induccion de apoptosis. Pueden observarse efectos sinergicos cuando se usan mezclas de las SPCBP que se unen a diferentes objetivos y vfas en la enfermedad, tales como las SPCBP con efectos antiangiogenesis y antiproliferativos. Ademas existen aplicaciones en este campo para una mezcla de las SPCBP esencialmente muy relacionadas que se unen a un epftopo objetivo pero con qrnmicas de union ligeramente diferentes que se traducen en diferentes afinidades por la union al antfgeno. Esta mezcla es, por ejemplo, una SPCBP aislada combinada con sus variantes de mutacion puntual con afinidades alteradas (mejoradas o reducidas). La eficacia de la penetracion del tumor solido in vivo esta limitada para los anticuerpos de alta afinidad debido a la barrera del sitio de union, aunque se requiere una afinidad minima para lograr una acumulacion sustancial en el tumor. Con los metodos descritos en este documento, puede establecerse una mezcla de las SPCBP. Tales mezclas pueden usarse para aumentar la acumulacion en el tumor, y el mejor coctel equilibrado se encuentra al

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elegir los componentes y sus niveles de expresion. Tales mezclas son preferentemente mas activas que los componentes individuales, y actuan sinergicamente.

Las mezclas de las SPCBP son adecuadas ademas para neutralizar multiples objetivos diferentes, por ejemplo en el campo de las enfermedades inflamatorias, donde multiples factores se involucran de una manera u otra al mediar la enfermedad o agravar sus smtomas. Los ejemplos de estas enfermedades son la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la esclerosis multiple, la diabetes dependiente de insulina, la mellitus y la psoriasis. El tratamiento optimo de muchas de estas enfermedades implica la neutralizacion o inhibicion de agentes patologicos circulantes y/o aquellos en la superficie de las celulas dirigidas a la respuesta inflamatoria espedfica en el paciente. En las enfermedades autoinmunes e inflamatorias, los objetivos adecuados, generalmente, son los interferones, las citocinas, las interleucinas, las quimiocinas y los marcadores espedficos en las celulas del sistema inmune, y en particular, el interferon alfa, el receptor de interferon alfa, el interferon gamma, el receptor de interferon gamma, el factor de necrosis tumoral alfa, el receptor del factor de necrosis tumoral, el receptor de antigeno de HLA clase II, la interleucina-1 beta, el receptor de interleucina-1 beta, la interleucina-6, el receptor de interleucina-6, la interleucina-15, el receptor de interleucina-15, la IgE o su receptor, el CD4, el CD2 y el ICaM-1.

Las mezclas son adecuadas ademas para la neutralizacion de los efectos mediados por los agentes de la guerra biologica, incluidas toxinas tales como la neurotoxina botulmica derivada de Clostridium botulinum, el antrax, la viruela, los virus de la fiebre hemorragica y la plaga. La neutralizacion de las toxinas botulmicas se analiza en la presente como un ejemplo. Las toxinas botulmicas, las sustancias mas venenosas conocidas, causan el botulismo, la enfermedad humana paralitica, y son uno de los agentes de amenaza de alto riesgo del bioterrorismo. El anticuerpo neutralizante de la toxina puede usarse para la profilaxis previa o posterior a la exposicion o para el tratamiento. Existen pequenas cantidades tanto de la antitoxina equina como de la inmunoglobulina botulmica humana y actualmente se usan para tratar el botulismo en adultos e infantes. El anticuerpo monoclonal recombinante podna proporcionar un suministro ilimitado de antitoxina sin riesgo de enfermedad infecciosa y no requiere de donantes humanos para la plasmaferesis. Se genero un panel de anticuerpos monoclonales humanos y murinos a partir de los linfocitos B de donantes hiperinmunes y ratones inmunizados usando la tecnologfa de presentacion de anticuerpos en el fago. Se probaron anticuerpos monoclonales simples y combinaciones para determinar su capacidad de proteger a los ratones de las dosis letales de la neurotoxina (Nowakowski, A. y otros, (2002) PNAS 99: 11346-11350.). Mientras que los anticuerpos monoclonales simples no mostraron una proteccion significativa en los ratones contra dosis letales de toxinas, las combinaciones de solo tres anticuerpos monoclonales contra diferentes epftopos en la toxina ofrecieron una proteccion muy potente. La combinacion de tres anticuerpos monoclonales neutralizo dosis letales de 450.000 de la toxina botulmica, una potencia 90 veces mayor que la globulina hiperinmune humana. Es importante destacar que la potencia de la mezcla de anticuerpos monoclonales se debio principalmente a un gran aumento en la afinidad de union del anticuerpo funcional. Asf, los metodos que permiten una produccion rentable, controlada y eficiente de mezclas de las SPCBP contra la neurotoxina botulmica proporcionan una ruta para el tratamiento y la prevencion del botulismo y otros agentes patogenos y agentes de amenaza biologica. Como se muestra en este estudio, una mezcla de tres anticuerpos que unen los epftopos no superpuestos sobre la neurotoxina botulmica, tuvo un efecto sinergico en la neutralizacion de la toxina debido a una mayor avidez total.

Las mezclas de protemas de union pueden aplicarse ademas, para retrasar la aparicion de las respuestas antiidiotfpicas en pacientes, proporcionando multiples idiotipos de una familia de SPCBP, todos unidos al mismo objetivo, en los mutantes de aminoacidos del mismo SPCBP de forma mas simple con una especificidad y afinidad de union que resulta similar, a una mezcla mas compleja de multiples SPCBP dirigidos al mismo epftopo.

Pueden aplicarse ademas, mezclas de protemas de union para desarrollar derivados de las mezclas de protemas, incluyendo inmunotoxinas, inmunoliposomas, versiones marcadas con radioisotopos, inmunoconjugados, conjugados anticuerpo-enzima para terapia profarmaco (ADEPT) e inmunopoftmeros (Allen, (2002) Nat Rev Cancer 2: 750-763). Las mezclas de los anticuerpos pueden modificarse por lotes con las sustancias apropiadas o fusionarse geneticamente a una toxina o enzima o gen que codifica el efector como se describe en la tecnica para los anticuerpos monoclonales.

Ejemplos

Ejemplo 1. Vector de expresion de mamferos para dirigir la coexpresion de dos anticalinas

Un punto de partida para preparar una mezcla de dos SPCBP mediante la expresion de un unico vector de expresion de mairftfero, es el plasmido pRRV (un derivado de VHExpress y descrito en el documento de patente US20030224408A1). pRRV (Figura 7b) es un plasmido que se usa para la expresion de anticuerpos en el formato IgG, mediante la coexpresion de cadenas ligeras y pesadas bajo el control de un unico promotor de CMV y las dos regiones codificantes separadas por una secuencia IRES. El plasmido contiene una serie de sitios de restriccion unicos para la clonacion de genes de SPCBP.

Dos genes de SPCBP se clonan mediante clonacion direccional de las regiones codificantes en los sitios de restriccion ApaLI & AscI y BssHII & BclI de pRRV. Como ejemplo, se describe la clonacion de dos anticalinas, pero igualmente pueden clonarse otras SPCBP con el mismo procedimiento. Si se encuentran sitios internos para las enzimas de restriccion en el gen de SPCBP de interes, pueden eliminarse rapidamente mediante mutagenesis dirigida al sitio. Las

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dos anticalinas son las siguientes: AC-1: Lipocalina Flua modificada por ingeniena genetica, una anticalina antifluorescema, seleccionada de una biblioteca de lipocalinas modificadas por ingeniena genetica y cuya estructura en complejo con el antigeno se resolvio (pdb numero 1NOS) (Korndorfer, I. P. y otros, (2003) Proteins 53: 121-129.). AC-2: DigAl6 es una protema de union a digoxigenina artificial, que se derivo de la protema de union a la bilina, una lipocalina de Pieris brassicae, mediante la remodelacion de su bolsillo de ligando natural. Se determino a una resolucion de 1.9A, las estructuras cristalinas de DigA16 en presencia de digoxigenina o digitoxigenina y para la apoprotema (Korndorfer, I. P. y otros, (2003) J Mol Biol 330: 385-396.) Las reacciones de PCR se llevan a cabo con el molde de los genes AC-1 y AC-2, durante 25 ciclos, desnaturalizacion a 94°C durante 30 segundos, hibridacion a 50°C durante 60 segundos y elongacion a 72°C durante 90 segundos, usando Taq ADN polimerasa (Promega, Madison, WI) con iniciadores que estan disenados para hibridar con regiones codificantes de 5' y 3', y este ultima proporciona ademas, un codon de terminacion despues del ultimo codon que se traduce. Estos iniciadores incorporan ademas los sitios de enzimas de restriccion que se localizan a ambos extremos y en el extremo 5' de los genes de manera que el marco de lectura se mantiene despues de la clonacion direccional de los genes en pRRV (como se indica en la Figura 7A). El producto resultante AC-1 se purifica, se digiere con las enzimas de restriccion ApaLI y AscI, y se clona en pRRV, resultando en p2-I-AC-1. La segunda region de codificacion de AC-2 se amplifica despues a partir de su molde para la clonacion como un fragmento BssHII-XbaI. En los oligonucleotidos usados para la pCr, se proporcionan tanto las etiquetas poli-His como un codon de parada siguiendo las regiones codificantes de AC y antes de las posiciones AscI y XbaI para garantizar que la region codificante AC-1 y Ac-2 se traduzcan correctamente como productos solubles, separados y pueden detectarse con anticuerpos poliHis. Los dos genes se clonan paso a paso en el vector, para producir el primer vector p2-I-AC1 y despues el vector p2-I-AC1xAC2. La integridad de las secuencias se confirma mediante el uso del estuche de secuenciacion de ciclos AmpliTaqs (Perkin-Elmer, Foster City, EE. UU.) con iniciadores espedficos basados en el esqueleto del vector justo adyacente a las inserciones que codifican anticalina; las secuencias de ADN de la insercion se verifican para mantener las secuencias correctas de las regiones codificantes de la anticalina y las uniones con el plasmido de expresion.

Ejemplo 2. Vectores de expresion para la coexpresion de 3 protemas de VHH de camelidos

En este ejemplo, se describen los vectores de expresion para la expresion simultanea de 3 protemas de union derivadas de anticuerpos de una unica cadena pesada de dromedario/camellos y que tienen especificidad para la lisozima de diferentes especies. cAb-1. Anticuerpo cAb-Lys3 es una 'VHH' que inhibe la lisozima de clara de huevo de gallina y su estructura en complejo con el antfgeno se determino por cristalograffa (Desmyter, A. y otros, (1996) Nat Struct Biol 3: 803-811; Transue, T. R. y otros, (1998) Proteins 32: 515-522.). cAb-2. El segundo anticuerpo es cAb-TEM02 descrito en (Conrath, K. y otros (2001) J Biol Chem 276: 7346-7350). cAb-3. La tercera protema de union es un anticuerpo VHH, clon cAb-HuL6, un fragmento derivado de un anticuerpo de 'cadena pesada' de dromedario con alta especificidad para lisozima humana nativa y sus variantes amiloidogenicas (Dumoulin, M. y otros, (2002) Protein Sci 11: 500-515.). Se demostro que la protema inhibe la formacion de fibrillas amiloides con la lisozima humana (Dumoulin, M. y otros, (2003) Nature 424: 783-788.). Tiene un valor de ka para la lisozima de 8,6 x 105 M'V y una kd de 5,9 x 10-4 s'1. Su secuencia de aminoacidos se representa en la sec. con num. de ident.: 1

(QVQLQESGGGSVQAGGSLRLSCSASGYTYISGWFRQAPGKEREGVAAIRSSDGTTYYADSVKGRFTISQDNAKNTVYL QMNSLKPEDTAMYYCAATEVAGWPLDIGIYDYWGQGTEVTVSS). Ademas, se determino su estructura en complejo con la lisozima (nombre de estructura en pdb es lOP9).

El primer punto inicial para expresar estos 3 cAb en una celula de mamffero como protemas secretadas es el plasmido pBRV, un derivado de VHExpress descrito en el documento de patente num. US20030224408A1 (representado esquematicamente en la Figura 7A). Las mezclas de estos plasmidos se usan para construir bibliotecas (segun la Figura 2A). La clonacion se realiza para pBRV con regiones codificantes cAb que se amplifican mientras se anexan los sitios ApaLI y XbaI en el extremo 5' y extremo 3' del gen, respectivamente. El iniciador basado en 3' introduce ademas una etiqueta poliHis. Esto se lleva a cabo para cAb-1, produciendo el plasmido pl-cAb-1. Este plasmido dirige la expresion del fragmento cAb1 soluble que porta una etiqueta poli-His que es reconocida por varios anticuerpos monoclonales de fuente comercial, asf como ademas puede usarse para la purificacion por IMAC.

Los otros dos genes cAb se clonan en un vector que dirigira la expresion no vinculada a IRES de las dos regiones codificantes. Ademas, se introduce un elemento STAR. Los elementos STAR confieren a las celulas de mairnferos una expresion estable y de alto nivel de protemas en una forma dependiente del numero de copias (Kwaks y otros, (2003), Nat. Biotechnol 21: 553-558). El vector usado para esto, pABExpress40, se describe en la Solicitud de patente europea num. 03076671.1 y se representa en la Figura 7C. pABExpress40 contiene tanto casetes de cadena pesada como ligera con su respectiva orientacion transcripcional en direcciones opuestas, y el elemento anti-represor se posiciona en el medio de las dos unidades de transcripcion. Este plasmido, pABExpress40 se usa primero en la clonacion del primer gen de la protema de union elegida, cAb-2 (usando los sitios de clonaje de ApaLI y SpeI que se anexan a la region codificante del gen cAb-2 usando oligonucleotidos disenados para clonacion direccional y mantenimiento en el constructo resultante el marco de lectura en el gen de la protema de union seguida la secuencia lfder del vector), lo que resulta en pABExpress40-cAb-2. Este plasmido se usa para recibir el segundo gen que codifica la protema de union, cAb-3 (como el fragmento BssHII-XbaI) (todos estos 4 sitios son unicos en pABExpress40; generalmente si los sitios de reconocimiento de enzimas de restriccion son endogenos para el gen que codifica la protema de union, puede o bien eliminarse primero mediante mutagenesis in vitro dirigida al sitio, o el producto de PCR puede someterse a una digestion parcial con esta enzima (y una digestion completa con la otra enzima), despues el material de longitud

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completa se purifica en gel y este fragmento se clona; ademas, otros sitios de restriccion unicos equivalentes en su uso para este experimento de clonacion estan disponibles en el vector, ver la Tabla 5 en Persic y otros, Gene 187 (1997): 918). En la reaccion de PCR, el oligonucleotido basado en 3' se incorpora ademas a un tramo de 6 histidinas seguido de un codon de terminacion, de manera que las protemas pueden purificarse por IMAC como se describio anteriormente. Despues de la clonacion secuencial de los dos genes de protema de union, cAb-2 y cAb-3, el plasmido que contiene ambos genes VHH se designa p2-ST-cAb2/3, se identifica mediante analisis de restriccion y secuenciacion y su ADN se prepara para experimentos de transfeccion.

Para construir una biblioteca de celulas que expresan tres protemas de union diferentes, alternativamente puede construirse un vector tricistronico. Dichos vectores se describieron para otras aplicaciones y usan secuencias de IRES y sitios de clonacion diferentes. Para acelerar la clonacion de multiples genes de SPCBP, es importante proporcionar en dicho vector sitios unicos de enzimas de restriccion que limitan las regiones codificantes de SPCBP, de manera que tres genes diferentes pueden clonarse facilmente en dicho vector, secuencialmente en dos etapas o mas rapido a traves de ligacion de 3 vfas. Se describieron vectores tricistronicos retrovirales y de adenovirus que coexpresan IL-12 (IL-12p40 mas IL-12p35) y CD80 utilizando dos secuencias internas de sitio de entrada de ribosoma (IRES) para unir los tres ADNc. Un vector retroviral a base de virus de celulas madre murinas (MSCV) (MSCV-hIL12. B7) utilizo distintas secuencias IRES del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) y el virus de la fiebre aftosa (FMCV), mientras que los vectores de adenovirus basados en Ad5 conteman unidades transcripcionales con dos secuencias EMCV IRES bajo el control de promotores de citomegalovirus murinos (AdMhl2. B7) o humanos (AdHhl2. B7). Al combinar diferentes secuencias de promotor e IRES, tales como las que se enumeran en la presente y anteriormente en el texto, pueden construirse plasmidos que median la expresion de las 3 SPCBP.

Ejemplo 3. Produccion de una biblioteca de expresion de dos y tres celulas de diferentes cAb en diferentes relaciones.

Los plasmidos pl-cAbl y p2-ST-cAb2/3 se usan para hacer multiples transfectantes estables. El plasmido p2-ST-cAb2/3 se transfecta solo o en combinacion con el plasmido pl-cAbl. Mediante la seleccion con el gen de resistencia neo y los metodos de cultivo y tamizaje conocidos por aquellos expertos en la tecnica, se obtienen las lmeas celulares estables derivadas de PER.C6™ que expresan los 2 o 3 cAb y en diferentes relaciones. Esencialmente 5 x 106 PER.C6™ celulas se transfectan usando Lipofectamina de conformidad con las instrucciones del fabricante, y 3 microgramos de ADN del plasmido (o 2+1 microgramos si los dos se usan juntos). Despues de 5 horas, las celulas se lavan y el medio se intercambia con medio no selectivo. Al dfa siguiente, el medio se reemplaza con medio fresco que contiene 500 microgramos/ml de G418 (Sigma-Aldrich) y ademas, cada 2-3 dfas el medio de cultivo se recambia hasta que aparecen los clones (15-20 dfas despues de la siembra). Los clones se recogen y se clonan para limitar las condiciones de dilucion, de manera que 2-3 semanas mas tarde comienzan a aparecer lmeas celulares clonales. Estas se expanden en los pocillos y frascos mas grandes, y eventualmente se omite el medio selectivo. El primer analisis de las lmeas celulares es analizar la presencia de los dos o tres genes cAb diferentes en las lmeas celulares creadas, mediante la amplificacion del ADN genomico de estas lmeas celulares con oligonucleotidos espedficos (vector y basados en la region codificante) para cAb-1 y cAb-2 y cAb-3, y la confirmacion de la presencia mediante la secuenciacion del material amplificado. El numero de copia de los casetes de expresion (supuestamente el mismo para ambos cAb-1 y cAb-2) se determina mediante transferencia de membrana de tipo Southern o hibridacion fluorescente in situ (FISH). El sobrenadante de estas lmeas celulares se recolecta para el analisis de las mezclas de cAb secretadas. Las protemas cAb se purifican del sobrenadante por IMAC de conformidad con las instrucciones del fabricante. Las mezclas de cAb se afslan, purifican y prueban en una serie de ensayos. En segundo lugar, la mezcla se caracteriza bioqmmicamente usando SDS-PAGE y transferencia Western (para sobrenadante no purificado) y usando SDS-PAGE y enfoque isoelectrico con protemas purificadas con IMAC. En tercer lugar, los ensayos de union a la lisozima y de neutralizacion de lisozima se llevan a cabo mediante el ensayo ELISA como se describio anteriormente y el ensayo catalftico para la lisozima. Dado que los cAb se unen a diferentes especies de lisozima, la presencia de las protemas de union multiple en la mezcla se detecta ademas usando lisozima de diferentes especies, incluidas la clara de huevo de gallina y de humanos. Las intensidades relativas de las senales, en los geles o en el ELISA, revelan relaciones relativas diferenciales de los cAb en las diferentes lmeas celulares.

Ejemplo 4. Produccion de bibliotecas de celulas CHO que producen diversas mezclas de protemas.

Los plasmidos p2-I-AClxAC2 (Ejemplo 1) y pl-cAb-1 (Ejemplo 2) se usan en una relacion 2: 1 en el experimento de cotransfeccion de las celulas CHO. K1 esencialmente como se describe para las celulas PER.C6 (Ejemplo 3). Las lmeas celulares transfectadas de forma estable se generan mediante la seleccion de celulas en G418 y el sobrenadante de clones obtenidos en la dilucion limitante probada por la presencia de anticalinas o el cAb mediante ELISA en fase solida utilizando los 3 antfgenos diferentes, digoxigenina, fluorescema y lisozima como antfgenos de recubrimiento. Las intensidades relativas en el ELISA revelan relaciones relativas diferenciales de las AC y CAb en diferentes lmeas celulares.

Ejemplo 5. Analisis detallado de mezclas de protemas de union usando ELISA y el uso de reactivos espedficos del sitio de union.

Los tres cAb del ejemplo 3 y la mezcla de anticalinas y un cAb se analizan con mas detalle de la siguiente manera. Se expande el cultivo de los clones de celulas individuales que expresan una mezcla y se afslan los fragmentos de protema

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de union a traves de sus etiquetas de histidina usando IMAC. Las mezclas de protemas resultantes se analizan como sigue.

En primera instancia, se considera el caso de una mezcla compuesta de multiples protemas de union, cada una dirigida a diferentes epftopos, pero todas presentes en el mismo antigeno objetivo (la mezcla de cAbl, 2 y 3). Los siguientes metodos estan disponibles para analizar la mezcla. La region del sitio de union en cada protema de union producira diferentes composiciones de aminoacidos y permite el siguiente analisis, independiente del antigeno: (1) Electroforesis en gel basada en tamano, tal como SDS-PAGE: para protemas de union de pequeno tamano relativo como las citadas en el Ejemplo 1, las diferencias en el peso molecular causadas por la composicion de aminoacidos unica en o cerca del sitio de union pueden revelarse mediante electroforesis en gel. Al usar los metodos de alta resolucion (por ejemplo, geles con gradientes), pequenas diferencias en el peso molecular resultan en un cambio en la movilidad y, por lo tanto, se revela la presencia de protemas de union individuales en la mezcla. (2) Analisis de gel por enfoque isoelectrico: este analisis se basa en un valor de pi diferente para las diferentes protemas de union. Cada molecula mostrara un unico punto isoelectrico. Las protemas con un pi diferente se separan mediante electroforesis en un gradiente de pH. El metodo es semicuantitativo. Si dos protemas de union en la mezcla solo tienen una diferencia minima en su valor pi, sera diffcil separarlas usando esta prueba, y se usan las otras pruebas citadas. (3) Analisis de espectrometria de masas: este analisis se basa en la composicion diferencial de aminoacidos (u otros cambios que alteran el peso molecular y/o la composicion) de las protemas de union, que, despues de la digestion con enzimas proteolfticas, produce un espectro unico de peptidos en el analisis MassSpec. Este metodo es predominantemente cualitativo, pero se puede combinarse con otros metodos analfticos. (4) Analisis de union basado en anticuerpos 'antiidiotipo': este analisis requiere la disponibilidad de reactivos que reconozcan espedficamente un sitio de union de protema de union en presencia de los otros sitios de union en la mezcla. Adecuados para este analisis son los anticuerpos 'antiidiotipo', anticuerpos que unicamente reconocen el area en la protema de union que es equivalente al idiotipo de un anticuerpo. Dado que las protemas de union son diferentes en la secuencia de aminoacidos, ademas habra otros 'idiotipos' y, por lo tanto, pueden obtenerse los reactivos que los reconozcan. En el ejemplo con las anticalinas, las protemas de union comparten un alto nivel de homologfa de secuencia y, por lo tanto, las caractensticas unicas del idiotipo se forman principalmente por regiones que originalmente se diversificaron. Se seleccionan los anticuerpos antiidiotipos usando la protema de union individual como antfgeno en una seleccion de una gran biblioteca de protemas de union presentada en un fago usando metodos conocidos por aquellos expertos en la tecnica. Tfpicamente, se usa una biblioteca de anticuerpos no inmunes (de Haard, H. J. y otros, (1999) J Biol Chem 274: 18218-18230), que produce fragmentos Fab, y una biblioteca de anticuerpos scFv semisinteticos en fagos (de Kruif y otros, (1995) J. Mol. Biol. 248: 97). Se seleccionan los anticuerpos antiidiotipo en protemas de union AC-1 y AC-2 inmovilizadas o biotiniladas de la biblioteca de protemas de union no inmune citada, usando el tamizaje por ELlSA de los anticuerpos del fago seleccionados en estas dos protemas usadas para la seleccion, se identifican los anticuerpos antiidiotipo que reconocen unicamente el 'idiotipo' de una de las dos protemas de union. Los respectivos reactivos Fab y scFv seleccionados de esta biblioteca, se expresan como fragmentos del anticuerpo y se purifican usando metodos estandar, por ejemplo descritos en estas citas y en 'Antibody Engineering (2001), Eds. Konterman y Dubel, Springer Lab Manual). Los fragmentos se usan en el ELISA para determinar que idiotipo esta presente en la mezcla de las protemas de union, que se lleva a cabo en un ensayo cuantitativo. Los anticuerpos antiidiotipo espedficos para los sitios de union de AC-1 y AC-2 se usan ademas en experimentos de competencia con antfgenos con la preparacion hecha en el Ejemplo 4, para delimitar la contribucion de un sitio de union individual a la actividad biologica de la mezcla de protemas de union.(5) Analisis de union basado en los peptidos de union de protemas de union: Alternativamente, las protemas de union individuales se usan para derivar peptidos asociados al idiotipo, peptidos lineales o conformacionales derivadas de la secuencia del antfgeno y aun reactivos con la protema de union, por ejemplo a traves del analisis de PepScan, como se demostro para el anticuerpo neutralizante del virus de la rabia MAb 6-15C4 (van der Heijden y otros, (1993), J. Gen. Virol. 74: 1539-45). Una alternativa es aislar mimotopos de peptidos, con secuencias no relacionadas con el antfgeno original pero que se unen espedficamente a las secuencias asociadas con el sitio de union de la protema de union. Siempre que la reaccion proporcionada sea espedfica para una protema de union dada en el contexto de la otra u otras en la mezcla, ademas dichos peptidos son adecuados para un analisis espedfico de la mezcla de protemas de union. Se seleccionan peptidos con una reactividad unica para una protema de union dada de bibliotecas de peptidos de presentacion de fagos utilizando metodos esencialmente similares a los de las bibliotecas de protemas de union a fago. La prueba de union con los anticuerpos antiidiotipo y los peptidos mimotopos es cualitativa o cuantitativa, y una serie grande de pruebas de union son factibles, incluyendo ELISA, RiA, analisis por citometna de flujo, BIAcore, etcetera.

Se describe ademas el analisis de una mezcla que comprende multiples protemas de union en las que cada una de las protemas de union originales se une a un antfgeno diferente (como en la generacion de mezclas en el Ejemplo 4). Esto se asemeja a la situacion en la que las protemas de union reconocen el mismo antfgeno u objetivo, y se disponen de reactivos antiidiotipo o mimeticos de peptidos. El analisis de multiples especificidades en una mezcla se lleva a cabo de la siguiente manera (teniendo en cuenta que el antfgeno es sinonimo de antiidiotipo). La reactividad a antfgenos individuales se prueba en ELISA en todos los antfgenos por separado, con ensayos estandarizados que usan los anticuerpos monoclonales y la prueba cuantitativa de ELISA IgG. El antfgeno se recubre directa o indirectamente, las placas se incuban con la mezcla de protemas de union y la protema de union se detecta con un reactivo que reconoce todas las protemas de union. Por ejemplo, los anticuerpos antietiqueta son particularmente utiles para esto, o reactivos que reconocen la region dentro de las protemas de union que se comparten entre ellos debido al nivel de identificacion entre las protemas. Esto conduce a una actividad 'espedfica' de la preparacion, es decir, una reactividad en unidades relativas de actividad por cantidad de protema de union.

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Ejemplo 6. Una mezcla detres dominios VHH expresados en una celula huesped de E. coli

Los tres genes cAb, cAb-1,2 y 3 se clonan en un vector de expresion procariotico, usando los metodos de clonacion anteriores. En primer lugar, los genes de la region codificante se amplifican con los oligonucleotidos que hibridan con los extremos 5' y 3' de las secuencias de nucleotidos y proporcionan sitios de enzimas de restriccion apropiados para la clonacion. Las tecnicas estandar de clonacion se describen en Sambrook y otros, 'Molecular cloning', segunda edicion, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1987). Los genes CAb se amplifican mediante la reaccion en cadena de la polimerasa usando los metodos bien conocidos en la tecnica. El plasmido receptor es pSCFV-3 que se describio en la solicitud de patente europea num. 03076671.1, y contiene 3 sitios para la insercion de las regiones de codificacion cAb (Figura 9). pSCFV-3 porta sitios de restriccion unicos para el clonaje de los genes de cAb, dos detras del mismo promotor lacZ y separados mediante un nuevo sitio de union a ribosomas (rbs) y la secuencia senal (L), y uno detras de un promotor inducible por arabinosa, rbs y L. Ademas porta diferentes etiquetas, una para cada uno de los casetes cAb, etiqueta c-myc (secuencia EQKLISEeDl), etiqueta VSV (secuencia YTDIEMNRLGK) y la etiqueta (HA) de la hemaglutinina de influenza (secuencia YPYDVPDYA), y todo seguido de una extension de 3 alaninas y 5 histidinas. Esta configuracion proporciona un metodo para la deteccion de anticuerpos individuales en la mezcla, y un metodo generico para la purificacion, basado en cromatograffa de afinidad de metal inmovilizado (IMAC) usando los metodos bien conocidos en la tecnica. Las tres regiones codificantes de cAb se clonan secuencialmente en este plasmido, corriente abajo de una secuencia lfder bacteriana, y en marco con la secuencia de etiqueta.

La expresion de la mezcla de los cAb se realiza de la siguiente manera. Los fragmentos de cAb solubles se expresan despues de la induccion con isopropil-p-D-tiogalactopiranosido (IPTG) del promotor lacZ que impulsa la expresion del cAb en los plasmidos basados en pSCFv y con y sin el inductor del promotor arabinosa, y las mezclas de protemas cAb recolectadas a partir del espacio periplasmico de las celulas E. coli TG1. Para confirmar la union de los cAb individuales, se realiza un ELISA usando las placas de Polysorb (Nunc) recubiertas con lisozima de clara de huevo de gallina y humana. Por induccion con IPTG, se logra la expresion de una mezcla de dos fragmentos funcionales de cAb. Mediante induccion adicional con arabinosa, se coexpreso un fragmento de cAb adicional. La contribucion a la union en la mezcla de cada uno de los fragmentos de cAb se confirma usando uno de los tres anticuerpos antietiqueta (el anticuerpo monoclonal de raton 9E10 se une a la etiqueta del epttopo c-Myc humano (codigo de producto de abcam,
www.abcam.com: ab32), y anticuerpos policlonales para la etiqueta HA (ab3413) o etiqueta VSV (ab3556). Para verificar si la produccion se lleva a cabo por una bacteria y su progenie y no por tres clones que cada uno produce uno de los fragmentos de anticuerpo, el cultivo se purifica en colonias despues de 4 horas en la fase de induccion y se prueba para la produccion de los tres clones independientes, lo que confirma que la expresion es clonal.

Para un analisis detallado, la mezcla de cAb se purifica y concentra. Para determinar correctamente el porcentaje de la mezcla de cAb, se purifica primero del extracto periplasmico de E. coli usando IMAC. Brevemente, un cultivo de 500 ml inducido por IPTG y arabinosa (mantenido durante 4 horas a 30°C), se centrifuga a 4600 x g durante 20 min a 4°C y el sedimento bacteriano se resuspende en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene inhibidores de proteasa (fluoruro de fenil-metilsulfonilo y benzamidina). La solucion se sonica a 24°C usando un desintegrador ultrasonico (MSE Scientific Instruments), y la suspension se centrifuga a 50.000 x g durante 30 min a 4°C. La fraccion del sobrenadante se incuba con la resina TALONTM de conformidad con las instrucciones del fabricante (Clontech). Despues de un lavado prolongado, las protemas se eluyen usando imidazol 100 mM. Siguiendo este procedimiento, los fragmentos cAb se purifican adicionalmente mediante filtracion en gel usando una columna Superdex 75 (Amersham Pharmacia Biotech) conectada a un instrumento Biologic (Biorad). Se cuantifican las concentraciones de CAb usando el estuche de acido bicinconmico (Pierce).

Alternativamente al uso de un plasmido, los tres casetes de expresion de cAb pueden clonarse ademas en plasmidos separados, por ejemplo, en plasmidos compatibles tales como pBR322 y pACYC y se mantienen en la misma celula huesped antes de la induccion.

Ejemplo 7. Aislamiento de anticuerpos de un dominio unico contra una glicoprotema de la Rabia a partir de una biblioteca de fase VL, produccion de una biblioteca de celulas que expresan multiples VL y tamizaje de las mezclas para la mezcla de neutralizacion optima.

Los fragmentos de anticuerpo VL de dominio unico espedficos de la Rabia se seleccionan de un repertorio de presentacion de fagos aislado de los PBL humanos y se diversifican mediante aleatorizacion de ADN, como se describe en van den Beucken y otros, (2001), J. Mol. Biol. 591-601 (bibliotecas B y C). Las partmulas de fagos se elaboran de los cultivos de estas dos bibliotecas. El rescate de las partmulas fagemidas con el fago auxiliar M13-KO7 se realiza de conformidad con (Marks y otros, (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597) en una escala de 1 L, usando numeros representativos de bacterias de la biblioteca para la inoculacion, para garantizar la presencia de al menos 10 bacterias de cada clon en el inoculo inicial. Para la seleccion de los VL, se usa la protema G de la rabia. La purificacion del virus y la purificacion de glicoprotemas se han descrito en otra parte (Dietzschold y otros, (1996) Laboratory Techniques in Rabies, Eds Meslin, Kaplan y Korpowski. World Health Organization, Ginebra, pag. 175). Para las selecciones, se usan 1013cfu ((unidades formadoras de colonias) con 10 microgramos/ml de glicoprotema de la Rabia recubierta en inmunotubos (tubos Maxisorp, Nunc) o con 250 nM de la protema G biotinilada soluble. El antfgeno se biotinila en una proporcion de una a cinco moleculas de NHS-Biotina (Pierce) por antfgeno de molecula de conformidad con las

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recomendaciones de los proveedores. Se llevan a cabo tres rondas de seleccion con estas bibliotecas. Los protocolos detallados para cultivar y seleccionar las bibliotecas de presentacion de fagos se han descrito en otra parte (como en Marks y otros, (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597) y se conocen bien por los que trabajan en la tecnica. En resumen, la seleccion con el antigeno biotinilado se lleva a cabo de la siguiente manera. Las partmulas de fagos se incuban en una rueda rotatoria durante 1 hora en M-PBST al 2% (PBS suministrado con leche desnatada en polvo al 2% y Tween- 20 al 0,1%). Mientras tanto, 100 microlitros de perlas paramagneticas conjugadas con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) se incuban en una rueda rotatoria durante 2 h en M-PBST al 2%. El antigeno biotinilado se agrega al fago preincubado y se incuba en una rueda rotatoria durante 30 min. A continuacion, se agregan las perlas y la mezcla se deja en la rueda rotatoria durante 15 minutos. Despues de 14 lavados con M-PBST al 2% y un lavado con PBS, las partmulas de fagos se eluyen con 950 pl de trietilamina 0,1 M durante 5 minutos. El eluato se neutraliza inmediatamente con la adicion de 0,5 ml de Tris-HCl (pH 7,5) y se usa para la infeccion de celulas de E. coli TG1 en fase logantmica. Las celulas TG1 se infectan durante 30 minutos a 37°C y se colocan en placas de agar 2xTY (16 g de Bacto-tripton, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl por litro), que contienen glucosa al 2% y 100 pg/ml de ampicilina. Despues de la incubacion durante la noche a 30°C, las colonias se raspan de las placas y se usan para el rescate del fago como se describe en (Marks y otros, (1991), J. Mol. Biol. 222: 581-597). Los sobrenadantes de cultivo de los clones seleccionados individualmente que albergan los fagos rescatados o fragmentos de VL solubles se ensayan en el ELISA con el antfgeno recubierto directamente o el antfgeno biotinilado capturado indirectamente mediante BSA biotinilado- estreptavidina inmovilizada. En la presente se describe el procedimiento con el antfgeno biotinilado para la deteccion de fragmentos solubles de VL. Para la captura de la glicoprotema de la Rabia biotinilada, primero, el BSA biotinilado se recubre a 2 pg/ml en PBS durante 1 hora a 37°C. Despues de 3 lavados con PBS-0,1% (v/v) Tween 20 (PBST), las placas se incuban durante 1 hora con estreptavidina (10 pg/ml en PBS/0,5% de gelatina) (24). Despues del lavado como anteriormente, se anade el antfgeno biotinilado para una incubacion durante la noche a 4°C a una concentracion de 3 pg/ml. Las placas se bloquean durante 30 minutos a temperatura ambiente con leche en polvo semidesnatada al 2% (p/v) (Marvel) en PBS. El sobrenadante del cultivo se transfiere a estos pocillos y se diluye 1 o 5 veces en Marvel/PBS al 2% (p/v) y se incuba durante 2 h; el VL unido se detecta con el anticuerpo anti-myc 9E10 (5 pg/ml) que reconoce la etiqueta del myc-peptido en el carboxiterminal de la cadena VL1 y el conjugado anti-HRP de raton en conejo (DAKO). Despues de la ultima incubacion, la tincion se realiza con tetrametilbenzidina (TMB) y H2O2 como sustrato y se detiene mediante la adicion de medio volumen de H2SO42N; la densidad optica se mide a 450 nm. Los clones que dan una senal positiva en ELISA (mas de 2 veces el fondo), se analizan adicionalmente mediante secuenciacion. Puede ser un gran trabajo purificar cada reactivo individual del clon VL y probarlos individualmente para neutralizar el virus. En cambio, 5 VL reactivas a antfgeno que ademas son reactivas con la protema L ((Holt, L. J. y otros, (2003) Trends Biotechnol 21: 484-490.) se identifican y se seleccionan para la elaboracion directa de mezclas usando los metodos de los ejemplos anteriores, y el comportamiento de la neutralizacion de las mezclas probadas. La purificacion de protema L hace que la provision de etiquetas sea obsoleta y proporciona un esquema de purificacion generico para todas las VL seleccionadas.

Ejemplo 8: Una biblioteca de celulas CHO que expresan una mezcla de las SPCBP neutralizantes de parasitos

Las protemas de union de cadena polipeptfdica unica usadas en este experimento son 5 fragmentos de anticuerpos de camelido descritos para unirse al dfmero de la glicoprotema de superficie espedfica de variante (VSG) de los tripanosomas africanos (Stijlemans, B. y otros, (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261). Los cinco fragmentos de anticuerpo se seleccionaron de una biblioteca de presentacion de fagos de 5x107 linfocitos diferentes de dromedario inmunizado mediante los pasos de seleccion en un VSG purificado. De las cinco protemas, hay una, cAb-An33, que se une a un epttopo conservado en la superficie expuesta a carbohidratos unidos por Asn presentes en VSG (Stijlemans, B. y otros, (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261). Este pequeno fragmento de anticuerpo, a diferencia de lectinas mas grandes o fragmentos de anticuerpos convencionales, es capaz de penetrar las glicoprotemas de superficie variantes (VSG) que son comunes a multiples clases de VSG.

Los clones con los nombres originales cAb-An02, cAb-An33, cAb-An04, cAb-An05 y cAb-An06 se toman para crear una mezcla de celulas que expresan niveles diferentes de estas SPCBP. Las secuencias de estas SPCBP se describen en los numeros de acceso GenBank™ AY263486, AY263490, AY263487, AY263488 y AY263489, respectivamente.

Las regiones codificantes de cAb se amplifican a partir de su molde mediante los oligonucleotidos que se unen a las regiones equivalentes en el ADN que codifica las regiones terminales N y C para estas SPCBP. Para cAb-AN33, el plasmido que contiene el gen cAb-An33 obtenido despues de las adsorciones (Stijlemans, B. y otros, (2004) J Biol Chem 279: 1256-1261) se usa como molde en una reaccion de PCR con los iniciadores de Sec. con num. de ident. 1: 5'-AGTGTACAGG CGCGCACTCC GATGTGCAGC TGGTGGAGTC-3' y la Sec. con num. de ident. 2: 5'- TGAGGAGACG GTGACCTGGG TCCC-3'. Esto amplifica la region codificante de VHH y en un iniciador se anexa un sitio de restriccion (en este caso BssHII) para la clonacion, en este caso fuera de su propia region codificante, y se basa en el sitio de restriccion unico natural en el otro (BstEII). El diseno de los iniciadores para estos y los otros iniciadores para la clonacion se realiza de manera que el marco de lectura se mantiene con la secuencia lfder eucariota anterior y la secuencia que codifica la etiqueta siguiente.

Tres clones, cAb-An02/33 y 04 se clonan en varias etapas en un plasmido que mediara en la expresion de las 3 SPCBP. El iniciador cAb-An33 se amplifica y se clona en pAbExpress como fragmento BssHII-BstEII en pABExpress40 (Figura 7C), para producir pAn33. En segundo lugar, se prepara un fragmento de PCR a partir de pRRV para amplificar la

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para identificar, a partir de una biblioteca de celulas huesped, una celula huesped que exprese una mezcla de diferentes protemas de union de cadena polipeptfdica simple con la actividad biologica optima, en donde dichas protemas de union de cadena polipeptfdica simple son anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos que no se asocian y, asf, pueden recuperarse como protemas separadas, dicho metodo comprende:

   - producir una biblioteca de celulas, en donde cada celula codifica al menos dos anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos separados que tienen diferentes epftopos objetivos, de manera que las celulas expresan los anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos en diferentes relaciones, que comprende transfectar y permitir la integracion en el genoma de todas las celulas de las secuencias de acidos nucleicos que codifican dichos al menos dos anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos y seleccionar segun la integracion exitosa, de manera que dichas secuencias de acidos nucleicos comprenden una senal de secrecion o una secuencia codificante para localizar y anclar la protema de union resultante en una membrana celular; y

   - evaluar las mezclas de anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos expresados por dichas celulas huesped en un ensayo de actividad biologica para determinar la mezcla con la actividad biologica optima; e

   - identificar la celula huesped que produce dicha mezcla.
2. 2. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 1, en donde las celulas transfectadas se someten a una etapa de clonacion.
3. 3. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 1 o 2, en donde dichos al menos dos anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos se codifican por secuencias de acidos nucleicos separadas.
4. 4. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde al menos dos secuencias de acidos nucleicos que codifican dichos al menos dos anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos estan bajo el control de diferentes elementos reguladores.
5. 5. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 4, en donde dichos elementos reguladores diferentes se seleccionan de un promotor, preferentemente inducible, un potenciador, un terminador, un elemento estabilizador antirrepresor, un sitio interno de entrada al ribosoma, una region de fijacion a la matriz, un elemento de apertura de la cromatina ubicuo, un elemento de lfmite, una region de control del locus o una region de fijacion al andamio.
6. 6. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 4 o 5, en donde dichos elementos reguladores diferentes dan lugar a diferentes niveles de expresion de diferentes anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos.
7. 7. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde cada celula codifica 2-10 anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos diferentes y separados.
8. 8. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde al menos dos secuencias de acidos nucleicos que codifican dichos al menos dos anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos son parte del mismo acido nucleico.
9. 9. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde dichas al menos dos secuencias de acidos nucleicos que codifican dichos al menos dos anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos son parte de dos acidos nucleicos diferentes.
10. 10. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde cada celula es una celula inmortalizada.
11. 11. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dichas secuencias de acidos nucleicos comprenden al menos un marcador seleccionable.
12. 12. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde se proporcionan medios para la integracion dirigida a un sitio de dichas secuencias de acidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos de dominio unico o anticalinas o aficuerpos.
13. 13. Un metodo de conformidad con la reivindicacion 12, en donde dichos medios son medios para la recombinacion homologa.
14. 14. Un metodo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde dichas celulas son celulas eucariotas.