CN111201239A

CN111201239A - 用于开发特异于表位翻译后修饰状态的抗体的方法和组合物

Info

Publication number: CN111201239A
Application number: CN201880064760.5A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·维纳; 玛格丽特·基斯
Original assignee: Abcam PLC
Current assignee: Abcam PLC
Priority date: 2017-08-04
Filing date: 2018-08-03
Publication date: 2020-05-26
Also published as: WO2019025866A3; EP3661958A2; AU2018310860A1; WO2019025866A9; US20210032368A1; CA3071894A1; WO2019025866A2; JP2020534796A

Abstract

本公开尤其提供了一种产生识别感兴趣的蛋白质的抗体的方法。在一些方面中，所述感兴趣的蛋白质包含翻译后修饰(PTM)位点。在一些方面中提供了一种产生特异性结合无翻译后修饰的位点的非PTM结合抗体的方法。在一些方面中提供了一种泛PTM结合抗体文库，所述泛PTM结合抗体文库包含衍生自特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的预先存在的抗体的多种抗体。在另一些方面中提供了一种非PTM结合抗体文库，所述非PTM结合抗体文库包含衍生自特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的预先存在的抗体的多种抗体。

Description

用于开发特异于表位翻译后修饰状态的抗体的方法和组合物

相关申请

本申请要求于2017年8月4日提交的美国临时申请序列号62/541,530的优先权，该美国临时申请的全部内容由此以引用方式并入。

背景技术

许多细胞活性受翻译后修饰(诸如磷酸化)的控制。然而，特定试剂的缺乏阻碍了对这些修饰在细胞生长、功能、发育和分化中的作用的研究。最常用的产生抗体(“Ab”)的方法是通过动物免疫。然而，该方法通常是低通量、昂贵、费时的，并且产生的Ab并非总是可再生的。特异于翻译后修饰的Ab克隆的稀有性增加了该挑战。

用于产生针对翻译后修饰抗原的抗体的传统方法目前无效。此外，目前没有开发这样的Ab对的方法，其中该对的一个成员结合至经修饰的表位，并且该对的第二成员结合至未经修饰的相同序列。

因此，仍然需要用于开发识别、结合和/或调控具有特异性翻译后修饰状态的表位的抗体的改进方法和组合物。

发明内容

本文提供了允许开发识别、结合或调控具有特异性翻译后修饰的表位的抗体的方法。当前的公开内容首次描述了用于产生特异于翻译后修饰的抗体的基于结构的定向进化方法。在本文描述的一些实施方式中是基于抗体框架产生聚焦抗体文库的方法，该抗体框架具有结合特定翻译后修饰的表位和结合邻近序列(context sequence)的一般模式的预先存在倾向。

本公开尤其提供了一种产生不依赖于翻译后修饰(PTM)状态来识别PTM位点的抗体的方法，该方法包括：提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；通过使PTM结合袋内或外的一个或多个与邻近该PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库，从而鉴定出泛PTM结合抗体。

本公开尤其提供了一种产生不论修饰状态如何或依赖于修饰状态来识别翻译后修饰(PTM)位点的抗体的方法，该方法包括：提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；在该抗体的PTM结合袋中的一个或多个被确定与PTM相互作用的位点处引入不带电荷的氨基酸；通过使PTM结合袋内或外的一个或多个与邻近该PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库，从而鉴定出泛PTM结合抗体。

在一些实施方式中，PTM位点是天然存在的PTM位点。在一些实施方式中，PTM位点是经工程化的PTM位点。在一些实施方式中，通过位点特异性诱变将工程化的PTM位点引入感兴趣的肽或蛋白质中。可以使用本领域中已知的各种方式来产生工程化的PTM位点。在一些实施方式中，位点特异性诱变包括某一点突变、一系列点突变、缺失或插入。在一些实施方式中，通过在感兴趣的肽或蛋白质中进行一个或多个氨基酸替换来引入工程化的PTM位点。在一些实施方式中，通过将一个或多个氨基酸插入感兴趣的肽或蛋白质中来引入工程化的PTM位点。在一些实施方式中，插入感兴趣的肽或蛋白质中的一个或多个氨基酸包括约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸替换可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸替换。

在一些实施方式中，产生的抗体识别PTM位点，而不论修饰状态如何。在一些实施方式中，产生的抗体依赖于修饰状态来识别PTM位点。例如，在一些实施方式中，修饰状态可以无PTM。

在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是在结构上预测的。在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是通过实验确定的。在一些实施方式中，不带电荷的氨基酸是丙氨酸或甘氨酸，但是可以使用任何不带电荷的氨基酸。可以使用本领域中的各种方式来引入不带电荷的氨基酸。可以使用任何合适的方法来引入不带电荷的氨基酸。在一些实施方式中，通过位点诱变来引入不带电荷的氨基酸。

本文的方法可以应用于任何PTM。例如，PTM可以是任何类型的乙酰化、酰胺化、脱酰胺、异戊烯化(诸如法呢酰化或香叶酰化)、甲酰化、糖基化、羟基化、甲基化、豆蔻酰化、亚硝基化、磷酸化、唾液酸化、硫酸化、聚唾液酸化(polysialylation)、泛素化、SUMO蛋白質修飾化(SUMOylation)、类泛素化修饰(NEDDylation)、核糖基化、硫酸化，或它们的任何组合。在一些实施方式中，PTM是带负电的、带正电的、亲水和/或疏水的。在一些实施方式中，PTM是磷酸化。在一些实施方式中，PTM是糖基化。在一些实施方式中，糖基化是唾液酸化、乙酰化或甲基化。

在一个方面中，本公开尤其提供了一种产生在不存在翻译后修饰的情况下特异性结合PTM位点的非PTM结合抗体的方法，该方法包括：提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；通过使PTM结合袋内或外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选非PTM结合抗体的文库；针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库，从而鉴定出非PTM结合抗体。

在一个方面中，本公开尤其提供了一种产生非PTM结合抗体的方法，该非PTM结合抗体特异性结合可能变成被翻译后修饰的位点，但是仅当此类位点尚未通过翻译后修饰(PTM)被修饰时才进行该特异性结合，该方法包括：提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；在该抗体的PTM结合袋中的一个或多个被确定为与PTM相互作用的位点处引入排斥PTM的氨基酸；通过使PTM结合袋内或外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选非PTM结合抗体的文库；以及针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质筛选文库，从而鉴定出非PTM结合抗体。

在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是在结构上预测的。在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是通过实验确定的。在一些实施例中，PTM是带负电的。PTM可以是任何带负电的PTM。在一些实施方式中，PTM是磷酸化。在一些实施方式中，PTM是糖基化。在一些实施方式中，糖基化是唾液酸化。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带负电的氨基酸。天然存在或不存在的任何种类的带负电的氨基酸均可用于本文提供的方法中。在一些实施方式中，带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

在一些实施方式中，PTM是带正电的。PTM可以是任何带正电的PTM。在一些实施方式中，PTM是视黄基席夫碱形成或精氨酰化。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带正电的氨基酸。天然存在或不存在的任何种类的带正荷的氨基酸均可用于本文的方法中。在一些实施方式中，带正电的氨基酸是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是非经典氨基酸。天然存在的或非天然存在的任何种类的非经典氨基酸均可用于本文的方法中。在一些实施方式中，非经典氨基酸是磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对叠氮基-苯丙氨酸、苯甲酰基-苯丙氨酸，或乙酰基赖氨酸。

在一些实施方式中，通过抑制性tRNA引入排斥PTM的氨基酸。以这种方式引入的天然存在的或非天然存在的任何种类的氨基酸均可以用于本文的方法中。在一些实施方式中，此类氨基酸是硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸。

在一些实施方式中，PTM是疏水的。任何种类的疏水性PTM均可适用于本文的方法。在一些实施方式中，当PTM是疏水的时，排斥PTM的氨基酸是亲水的。因此，在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是亲水的。天然存在的或非天然存在的任何种类的亲水性氨基酸均可用于本文的方法中。在一些实施方式中，亲水性氨基酸是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方式中，PTM是亲水的。在一些实施方式中，当PTM是亲水的时，排斥PTM的氨基酸是疏水的。因此，在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是疏水的。天然存在的或非天然存在的任何种类的疏水性氨基酸均可用于本文的方法中。在一些实施方式中，疏水性氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸。

可以使用本领域已知的任何方法来引入排斥PTM的氨基酸。在一些实施方式中，通过位点诱变引入排斥PTM的氨基酸。

在一些实施方式中，将与PTM结合袋位点相邻的邻近序列随机化以产生非PTM结合抗体文库。在一些实施方式中，邻近序列在PTM位点上游或下游包含3-15个残基。本领域中已知的任何定点诱变方法都可以用于使PTM结合袋之外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化。例如，易错PCR、通过引物延伸进行定点诱变、反向PCR、基于kunkel的诱变，盒式诱变、全质粒诱变、AXM诱变、易错滚环扩增(RCA)或体内定点诱变可用于将随机化引入邻近序列以产生抗体文库。在一些实施方式中，通过易错滚环扩增(RCA)将PTM结合袋之外的一个或多个与邻近序列结合的区域随机化。

在一些实施方式中，在不改变PTM结合袋的情况下，使PTM结合袋之外的一个或多个与邻近序列结合的区域随机化。

任何种类的文库均可用于展示候选泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。例如，可以使用噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示和/或mRNA展示。在一些实施方式中，包含候选泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的文库是噬菌体展示文库。

在一些实施方式中，包含候选泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的文库具有至少10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²的多样性。

可以使用本领域中已知的任何方法来筛选抗体文库。例如，可以使用噬菌体展示或微乳液筛选方法。在一些实施方式中，筛选文库的步骤包括全细胞淘选。在一些实施方式中，全细胞淘选是基于乳液的。

在一些实施方式中，该方法还包括确认所鉴定的泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的步骤。可以使用本领域中已知的任何方法来确认泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。例如，ELISA和/或功能测定可用于抗体确认。在一些实施方式中，确认步骤是高通量的。

如上所述，并且在下面更详细地讨论，本文方法的PTM可以是任何种类的PTM，并且抗体的确认可以通过各种方法来进行，例如通过高通量确认或使用功能测定。在一些实施方式中，PTM是磷酸化，并且高通量确认步骤涉及使用细胞系将磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸掺入到可抑制的amber(UAG)终止密码子中，从而产生磷酸蛋白质以用于确认泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。

在本文描述的方法中，可以使用任何种类的细胞。例如，细胞可以是古细菌细胞、原核细胞、细菌细胞、真菌细胞或真核细胞。在一些实施方式中，细胞系是大肠杆菌(E.coli)。在一些实施方式中，细胞系是昆虫细胞系。

在一些实施方式中，通过功能测定确认鉴定出的泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。在一些实施方式中，确认泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的步骤包括将scFv转化为IgG以执行确认。可以使用本领域中的任何方法将scFv转化为IgG。例如，一种将scFv转化为IgG的方法包括将可变重链和轻链基因克隆到pMINERVA载体中，以及通过CHO细胞的瞬时转染来表达所述载体。

在其他实施方式中，确认步骤包括确定鉴定出的泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体是否是针对PTM的空间抑制性抗体。

在一些实施方式中，提供了一种产生针对酶的空间抑制性抗体的方法，该方法包括提供特异性识别感兴趣的酶上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；通过使PTM结合袋内或外的一个或多个与酶上的PTM位点结合的区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；针对感兴趣的酶筛选文库，以及选择在不没有PTM修饰的情况下识别PTM位点的抗体；以及通过执行酶活性测定来选择空间抑制性抗体。

在一些实施方式中，提供了一种产生针对酶的空间抑制性抗体的方法，该方法包括工程化感兴趣的酶上的PTM位点；提供特异性识别感兴趣的酶上的经工程化的PTM位点的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；通过使PTM结合袋内或外的一个或多个与该酶上的该经工程化的PTM位点结合的区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；针对不具有经工程化的PTM位点的感兴趣的酶筛选文库，以及选择在没有经工程化的PTM位点的情况下识别该抗体的抗体；以及通过执行酶活性测定来选择空间抑制性抗体。

在一些实施方式中，PTM位点是天然存在的PTM位点。在一些实施方式中，PTM位点是经工程化的PTM位点。在一些实施方式中，通过位点特异性诱变将经工程化的PTM位点引入感兴趣的酶中。可以使用本领域中已知的各种方式来产生工程化的PTM位点。在一些实施方式中，位点特异性诱变包括某一点突变、一系列点突变、缺失或插入。在一些实施方式中，通过在感兴趣的酶中的一个或多个氨基酸替换来引入经工程化的PTM位点。在一些实施方式中，通过将一个或多个氨基酸插入感兴趣的酶来引入经工程化的PTM位点。在一些实施方式中，插入感兴趣的酶中的一个或多个氨基酸包括约约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。在一些实施方式中，一个或多个氨基酸替换可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸替换。

在一些实施方式中，根据前述公开内容中任一项的方法产生泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。

在一个方面中，本公开尤其提供了一种泛PTM结合抗体文库，该泛PTM结合抗体文库包括衍生自特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的预先存在的抗体的多个抗体，其中该多个抗体包含PTM结合袋和一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的随机化区域。在一些实施方式中，PTM结合袋包含在一个或多个被确定与PTM相互作用的位点处的不带电的氨基酸。

天然存在的或非天然存在的任何不带电的氨基酸均可用于本文的方法中。在一些实施方式中，不带电的氨基酸是丙氨酸或甘氨酸。

本文提供的方法中的PTM可以是任何PTM。例如，PTM可以是任何类型的乙酰化、酰胺化、脱酰胺、异戊烯化(诸如法呢酰化或香叶酰化)、甲酰化、糖基化、羟基化、甲基化、豆蔻酰化、亚硝基化、磷酸化、唾液酸化、硫酸化、聚唾液酸化(polysialylation)、泛素化、SUMO蛋白質修飾化(SUMOylation)、类泛素化修饰(NEDDylation)、核糖基化、硫酸化，或它们的任何组合。在一些实施方式中，PTM是磷酸化。在一些实施方式中，PTM是糖基化。任何种类的糖基化都与本文所述的方法一致。在一些实施方式中，糖基化是唾液酸化。

在一个方面中，本公开尤其提供了一种非PTM结合抗体文库，该非PTM结合抗体文库包括衍生自特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的预先存在的抗体的多个抗体，其中该多个抗体包含PTM结合袋和一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的随机化区域，其中该PTM结合袋包含在一个或多个被确定与PTM相互作用的位点处的排斥PTM的氨基酸。

在一些实施例中，PTM是带负电的。任何带负电的PTM均与本文所述的方法一致。在一些实施方式中，非PTM结合抗体文库包含衍生自特异性识别PTM的预先存在的抗体的多个抗体。在一些实施方式中，PTM是磷酸化。在一些实施方式中，PTM是糖基化。在一些实施方式中，糖基化是唾液酸化。

在一些实施方式中，产生非PTM结合抗体的方法包括在抗体的PTM结合袋中的一个或多个位点处引入排斥PTM的氨基酸。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带负电的氨基酸。天然存在或不存在的任何带负电的氨基酸均可用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

在一些实施方式中，PTM是带正电的。任何带正电的PTM均与本文所述的方法一致。在一些实施方式中，PTM是视黄基席夫碱形成或精氨酰化。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带正电的氨基酸。天然存在的或非天然存在的任何带正电的氨基酸均可用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，带正电的氨基酸是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

在一些实施方式中，PTM是疏水的。任何疏水性PTM都与本文所述的方法一致。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是亲水的。天然存在的或非天然存在的任何亲水性氨基酸均可用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，亲水性氨基酸是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方式中，PTM是亲水的。任何亲水性PTM均与本文所述的方法一致。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是疏水的。天然存在的或非天然存在的任何疏水性氨基酸均可用于本文所述的方法中。在一些实施方式中，疏水性氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸。

如上所述，并且在下面进一步详细描述，PTM可以是任何PTM。在一些实施方式中，PTM是磷酸化。在本文所述的方法中，预先存在的抗体可以结合任何磷酸化的残基。在一些实施方式中，磷酸化的残基是Ser、Tyr和/或Thr。因此，在一些实施方式中，PTM是磷酸化，并且预先存在的抗体结合磷酸化的Ser(pSer)、磷酸化的Tyr(pTyr)和/或磷酸化的苏氨酸(pThr)。在一些实施方式中，PTM位点是pSer。在一些实施方式中，PTM位点是pTyr。在一些实施方式中，PTM位点是pThr。在一些实施方式中，PTM位点是pHis(磷酸化的组氨酸)。在一些实施方式中，PTM位点是pArg(磷酸化的精氨酸)。在一些实施方式中，PTM位点是pLys(磷酸化的赖氨酸)。在一些实施方式中，PTM位点是pSer、pTyr、pThr、pHis、pArg和/或pLys的组合。在一些实施方式中，PTM位点是pSer和pTyr的组合。在一些实施方式中，PTM位点是pSer和pThr的组合。在一些实施方式中，PTM位点是pTyr和pThr的组合。

在一些实施方式中，PTM结合袋包含CDR H2区和/或CDR L2区。在一些实施方式中，一个或多个随机化区域结合至邻近序列，该邻近序列包含在PTM位点上游或下游的3-15个残基。

在一些实施方式中，泛PTM结合或非PTM结合抗体文库的一个或多个随机化区域包含随机化的CDR H3或CDR L3。在一些实施方式中，一个或多个随机化区包含随机化的CDRH1、CDR L1、CDR H3和/或CDR L3。在一些实施方式中，一个或多个随机化区域包括随机化的框架区域。

在一些实施方式中，泛PTM结合或非PTM结合抗体文库的PTM结合袋包含CDR H2区，并且一个或多个随机化区包含随机化的CDR H3、CDR L3和/或CDR L2。

在一些实施方式中，通过定点诱变产生泛PTM结合或非PTM结合抗体文库的一个或多个随机化区域。

在一些实施方式中，通过易错RCA产生泛PTM结合或非PTM结合抗体文库的一个或多个随机化区域。

在一些实施方式中，通过丙氨酸和/或组氨酸扫描产生泛PTM结合或非PTM结合抗体文库的一个或多个随机化区域。

在一些实施方式中，该文库选自由以下项组成的组：噬菌体展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、核糖体展示文库和mRNA展示文库。

在一些实施方式中，文库包含选自抗体片段的多种抗体。在一些实施方式中，文库包含选自scFv、Fab、Fab’s、Fv或IgG的多种抗体。在一些实施方式中，该文库是scFv文库。在一些实施方式中，scFv文库是M13scFv文库。在一些实施方式中，该文库具有大于10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²的多样性。

本公开尤其提供了一种产生针对感兴趣的肽的抗体的方法，该方法包括：提供经修饰的感兴趣的肽，该经修饰的感兴趣的肽经修饰以包括带负电的氨基酸；针对偏向带负电的氨基酸的抗体文库筛选经修饰的肽；分离一种或多种与经修饰的感兴趣的肽结合的抗体；以及测定该一种或多种抗体与未经修饰的感兴趣的肽的结合，从而鉴定出与感兴趣的肽结合的抗体。

本公开尤其提供了一种产生针对感兴趣的肽的抗体的方法，该方法包括：提供经修饰的感兴趣的肽，该经修饰的感兴趣的肽经修饰以包括带负电的氨基酸；针对偏向带负电的氨基酸的抗体文库筛选经修饰的肽；分离一种或多种与经修饰的感兴趣的肽结合的抗体；通过亲和成熟产生该一种或多种抗体的克隆型文库；针对未经修饰的感兴趣的肽筛选该克隆型文库，从而鉴定出与感兴趣的肽结合的抗体。

在实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸化的氨基酸。在实施方式中，磷酸化的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)或磷酸酪氨酸。在实施方式中，磷酸化的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)。在实施方式中，磷酸化的氨基酸是磷酸酪氨酸。在实施方式中，带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。在实施方式中，带负电的氨基酸替换感兴趣的肽内的天然存在的氨基酸。在实施方式中，抗体文库是偏向磷酸化的抗体文库(phospho-biased antibody library)。在实施方式中，偏向磷酸化的抗体文库选自噬菌体展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、核糖体展示文库或mRNA展示文库。在实施方式中，抗体文库是噬菌体展示文库。在实施方式中，抗体文库包括选自抗体片段的多种抗体。在实施方式中，抗体文库包含选自scFv、Fab、Fab’s、Fv或IgG的多种抗体。在实施方式中，抗体文库是scFv文库。在实施方式中，scFv文库是M13 scFv文库。在实施方式中，该抗体文库具有约或大于10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²的多样性。在实施方式中，该抗体文库具有约或小于10¹³、10¹²、10¹¹或10¹⁰的多样性。在实施方式中，该方法还包括与感兴趣的肽结合的抗体的亲和成熟。在实施方式中，通过定向进化来执行亲和成熟。在实施方式中，亲和成熟包括将与经修饰的肽结合的一种或多种抗体的CDR-H2和/或CDR-L2区域之外的序列随机化的步骤。在实施方式中，亲和成熟包括易错PCR诱变。在实施方式中，对全细胞、细胞片段或分离的蛋白质执行每个筛选步骤。在实施方式中，每个筛选步骤包括全细胞淘选。在实施方式中，全细胞淘选是基于乳液的。在实施方式中，基于乳液的筛选是延迟乳液感染(Delayed Emulsion Infectivity,DEI)。在实施方式中，感兴趣的肽基于感兴趣的蛋白质的表位。在实施方式中，表位在感兴趣的蛋白质的胞外域中。在实施方式中，表位是线性表位。在实施方式中，表位是构象表位或不连续的表位。在实施方式中，感兴趣的肽包含约介于5个与30个之间的氨基酸。在实施方式中，感兴趣的肽包含约介于10个与20个之间的氨基酸。在实施方式中，感兴趣的肽包含在感兴趣的蛋白质的外部结构域中每第3个、第4个、第5个、第6个、第7个、第8个、第9个或第10个氨基酸周围的序列。在实施方式中，感兴趣的肽包含在感兴趣的蛋白质的外部结构域中每第5个氨基酸周围的序列。在实施方式中，感兴趣的肽不包含糖基化位点。在实施方式中，感兴趣的蛋白质是细胞表面受体。在实施方式中，细胞受体是G蛋白偶联受体(GPCR)、酶偶联受体或配体门控离子通道受体。在实施方式中，细胞受体是瘦素受体、胰高血糖素受体、胰岛素受体、CXCR4、NTSR1、NTSR2或受体酪氨酸激酶。在实施方式中，该方法还包括测试抗体是否结合至感兴趣的蛋白质的步骤。在实施方式中，该方法还包括测试该抗体是否抑制感兴趣的蛋白质的功能的步骤。在实施方式中，抗体通过竞争性抑制来抑制感兴趣的蛋白质的功能。在实施方式中，抗体通过非竞争性抑制来抑制感兴趣的蛋白质的功能。在实施方式中，非竞争性抑制是变构抑制。在实施方式中，其中该方法还包括测试抗体是否增强感兴趣的蛋白质的功能的步骤。

本公开尤其提供了一种产生抑制感兴趣的蛋白质的抗体的方法，该方法包括：基于来自感兴趣的蛋白质的序列合成肽，其中该序列经修饰以包含带负电的氨基酸；根据前述权利要求中任一项所述的方法鉴定与该肽结合的抗体；以及测试该抗体是否抑制感兴趣的蛋白质的功能。在实施方式中，该方法还包括确定抗体是否在空间上抑制感兴趣的蛋白质的步骤。

如在本申请中使用的，术语“约”和“近似”用作等同词。本文中对出版物、专利或专利申请的任何引用均全文以引用方式并入。在本申请中使用的具有或不具有大约/近似的任何数字旨在涵盖相关领域的普通技术人员所理解的任何正常波动。

在下面的详细描述中，本发明的其他特征、目的和优点是显而易见的。然而，应当理解的是，详细描述虽然指示了本发明的实施方式，但是仅以说明而非限制的方式给出。根据详细描述，本发明范围内的各种改变和修改对于本领域技术人员将变得显而易见。

附图说明

图1是一系列示意图，该一系列示意图示出了衍生出磷酸状态特异性抗体(磷酸状态特异性抗体克隆型)的方法的一个实施方式。示意图示出了一种开发抗体克隆型的方法，所述抗体克隆型仅在检测特定邻近序列的PTM状态(例如，磷酸状态；磷酸状态特异性抗体克隆型)的能力方面有所不同。通过首先产生磷酸化衍生物以引导结合，然后使该衍生物亲和成熟以增加对邻近序列的亲和力，该方法还可用于衍生针对任何给定肽的抗体。

图2是描述开发作为细胞表面蛋白抑制剂的抗体的流程图。图2，小图A描绘了由感兴趣的受体的胞外域的重叠部分构成的10至20聚体肽的合成(描绘为GPCR)。在该流程图中，使用替换天然存在的氨基酸的中央磷酸丝氨酸(SEP)合成10至20聚体肽。图2，小图B描绘了在开发针对感兴趣的细胞表面蛋白的抗体变构抑制剂的过程中的噬菌体展示阶段。在该流程图中，使用噬菌体展示来鉴定磷酸化特异性scFv命中。图2，流程图的小图C示出鉴定出的命中经诱变，并经历针对天然序列肽的成熟(例如发现成熟(“DisMAT”)和/或亲和成熟(“AffMAT”))。图2，流程图的小图D指示IgG将被纯化，然后在基于细胞的测定中测试纯化的IgG。

图3示出了人凝血酶蛋白质的示意图和一系列图表(图3，小图(a)-(d))，该一系列图表描绘了根据本文所述方法开发的针对人凝血酶蛋白质的抗体变构抑制剂的活性。

图4，小图A-F是一系列示意图(小图A-D和F)，该一系列示意图基于计算方法和来自丙氨酸扫描的实验数据(小图E)描绘了与磷酸肽复合的ScFv模型。图4，小图A示出了使用Rosetta蛋白质建模软件的Rosetta Ab方案的前200/2000个计算出的结构诱饵的覆盖图。图4，小图B示出两个得分最高的结构显示出相似的CDR构象。图4，小图C示出结构模型的静电轮廓显示出与H2连接的带负电的深沟。图4，小图E示出了丙氨酸扫描诱变结果。如图4，小图E中所示的对于亲和力而言重要的残基形成了如图4，小图D中所示的该沟的一部分。将磷酸抗原(MARRPRHSIYS(磷酸)SDEDDEDFE)的带正电的一半手动建模到沟中并使用RosettaFlexiPepDock改善(图4，小图F)。结果表明，最左侧的精氨酸未与蛋白质接触。

图5，小图A-D是一系列示意图(小图A-B)、条形图(小图C)和表格(小图D)，这些图示出了磷酸盐特异性文库的设计和分析。数据表明单残基替换可以将pSer结合切换为pTyr结合。在图5，小图A和B中示出了结构差异。突变的残基是经标记的。H3和H2 CDR环是经标记的，并且接触残基被示出为棒。图5，小图C是条形图，所述条形图示出了针对具有抗Myb磷酸化丝氨酸(pSer)特异性scFv(AXM1293)及其突变体的一组肽的ELISA结果。图5，小图D示出了这样的文库，在所述文库中L2、H3和L3被同时随机化，并针对不同的磷酸靶标进行筛选。使用文库执行针对不同磷酸靶标的筛选，并将唯一命中数与传统文库方法进行比较，在所述文库中CDR-H2识别pSer和pTyr两者。

图6是示出针对IgG系统的经修饰的pMINERVA scFv的一系列示意图。scFv Ab编码在pMINERVA噬菌粒pDonor载体上作为gp3融合体，并以噬菌体展示生物淘选程序进行筛选。筛选之后，鉴定出编码具有期望的生物物理学特性的scFv的噬菌粒。将该噬菌粒转导到表达phiC31整合酶并具有例如IgG受体载体(pAcceptor)的大肠杆菌菌株中。重组事件的产物在VH基因的3'末端附近引入了CH基因和多腺苷酸化信号位点。此外，重组事件将哺乳动物启动子和功能性蛋白质起始位点5'两者引入VL基因中。scFv的VH结构域与VL结构域之间的接头由phiC31 36-bp attP位点组成，该phiC31 36-bp attP位点能够用作以下两者：i)重链可变结构域与轻链可变结构域之间的肽接头，以及ii)用于phiC31整合酶的36bp功能性底物。[图例：Pmam是哺乳动物启动子；P酵母是酵母启动子；Pcmv是CMV启动子；5'ss和3'ss是剪接信号；VL是轻链可变区；VH是重链可变区；gp3是噬菌体M13基因3产物；P大肠杆菌是大肠杆菌启动子；CH或Fc是重链恒定区；attB、attP是整合酶基因的底物；attR和attL是整合酶基因的产物；polyA是多腺苷酸化序列；CamS、CamR是没有启动子和具有启动子的氯霉素抗性基因；TCRζ是T细胞受体ζ；CAR-T是嵌合抗原受体；Pro剪接、Procat是双重功能启动子类型；IRES是内部核糖体进入位点；RBS是核糖体结合位点]。

图7是示出用于亲和成熟文库构建方法的AXM诱变的一系列示意图。使用在其5'末端上含有多个硫代磷酸酯键的反向引物，在易错PCR条件下扩增寡核苷酸库。用T7核酸外切酶处理所得的双链DNA，以选择性降解dsDNA分子的未修饰链。然后将所得的单链DNA或“mega引物”退火成尿嘧啶化的环状单链噬菌粒DNA，并用来通过DNA聚合酶引发体外合成。然后将连接的异源双链体产物转化到大肠杆菌AXE688细胞中，其中尿嘧啶化的链在体内被尿嘧啶N-糖基化酶切割，从而有利于新合成的含有mega引物的重组链的存活。同样，使用Eco29kI来消除任何未完全重组的克隆。

图8是示出噬菌体显示的一系列示意图。使用噬菌体展示来进行蛋白质相互作用的高通量筛选。在M13丝状噬菌体展示的情况下，编码感兴趣的蛋白质或肽的DNA被连接到编码次要外壳蛋白的pIII基因中。然后将噬菌体基因和插入DNA杂交体转导到大肠杆菌TG1中。通过将相关的蛋白质靶标固定在微量滴定板孔或珠粒的表面上，展示出与这些靶标中的一个结合的Ab的噬菌体将保留，而其余则通过洗涤去除。可以将剩余的那些洗脱，用来产生更多的噬菌体(通过使用辅助噬菌体进行细菌感染)，由此产生富含相关(即结合)噬菌体的噬菌体混合物。可以结合低pH洗脱缓冲液来进行洗脱。这些步骤的重复循环称为“淘选”，是指通过去除不期望的物质来富集金样本。在最后一步中洗脱的噬菌体可用于感染合适的细菌宿主，从该细菌宿主中可以收集噬菌粒，并切下相关的DNA序列进行测序，以鉴定相关的相互作用蛋白质或蛋白质片段。

图9是示出噬菌体微乳液筛选方法的一系列示意图。在这种筛选方法中，将用编码scFv变体的噬菌体M13文库感染的大肠杆菌在油包水乳液中用抗原包被的珠粒隔室化，以产生平均每个隔室约1个珠粒和1-10个被感染的细菌细胞。因此，在每个隔室中，产生了重组噬菌体的多个拷贝，所述多个拷贝中一些可以与抗原包被的珠粒结合。将乳液破乳，并分离出微珠以及任何结合的噬菌体。然后将珠粒与偶联至FITC的抗M13 IgG Ab一起孵育。因此，具有结合的噬菌体的抗原包被的珠粒变成被多个荧光素分子标记。然后可以通过流式细胞术分选来富集这些珠粒(连同附接到它们的噬菌体)。

图10，小图a-b是一系列示意图，该一系列示意图示出使用体内限制和饱和质粒DNA转化来产生高滴度的全重组抗体文库。图8，小图a示出了在产生重组文库中使用AXE688菌株进行体内限制。通过在AXE688[＝TG1(eco29KIR,eco29kIM)]细胞中表达的Eco29kI酶来切割在互补决定区(CDR)内携带Eco29kI位点的亲本质粒。图10，小图b描绘了使用饱和DNA进行的体内细胞选择。可以通过使用过饱和浓度的质粒DNA来利用细胞的选择性，以产生大型的全重组克隆文库。电感受态细胞等分试样内的感受态细胞可以在DNA相对于混合物中的感受态细胞数饱和的条件下吸收多个质粒。使用AXE688，细胞可吸收多个质粒并限制体内保留Eco29kI位点的亲本DNA，从而导致转化细胞具有更高比例的全重组克隆。

图11，小图A-C描绘了一系列示意图(图11，小图A)和图表(图11，小图B和C)，这些图证明了特异于所选抗体的CDRH3的抗独特型抗体的分离。图11，小图D描绘了一系列示意图和图表，这些图示出了抑制以下酶的分离抗体的代表性示例：凝血酶、淀粉酶和分选酶。示意图指示了分离的抗体与酶靶标结合的区域。图表示出了在各种条件下通过抗体进行的抑制。

图12，小图A-D描绘了一系列显微照片和图表，这些显微照片和图表是已经使用如本文所述的噬菌体衍生的IgG抗体制备的抗体的代表性示例。图12，小图A描绘了特异于SK-N-SH(人成神经细胞瘤细胞系细胞)中的髓磷脂碱性蛋白质的抗体的免疫细胞化学染色的结果。图12，小图B描绘了在HeLa细胞上使用特异于组蛋白H2B的抗体执行的蛋白质印迹法。图12，小图C描绘了流式细胞仪图，其中流式细胞仪实验使用与过表达NTSR1 GPCR的细胞系一起孵育的sc-Fv E1抗体。图12，小图D是示出使用特异于组蛋白H2B的抗体进行的染色质免疫沉淀测定(ChIP)的结果的图表。

图13，小图(a)-(c)示出了一系列示意图，所述一系列示意图代表Western分析中修饰特异性克隆型(“MSC”)抗体对的鉴定和确认。图13，小图(a)是示意图，所述示意图示出了定向磷酸Ab克隆型(“DPAC”)的图。DPAC是用于分离和确认新的磷酸化特异性抗体和匹配识别不含修饰的相同序列的抗体对的平台。图13，小图(b)是示出通过使用发现成熟(“DisMat”)而进行的磷酸化特异性噬菌体抗体命中的分子进化的示意图。图13，小图(c)是示出大肠杆菌中分离的转化IgG的确认的示意图。

图14是示出动物来源的磷酸化特异性抗体的使用的示意图。从使用动物来源的磷酸化特异性抗体进行的研究获得的数据表明，在寻找非磷酸依赖性或丝氨酸特异性抗体中，针对6个测试RAbMab克隆的成功率为66％。定向磷酸Ab克隆型3(“DPAC3”)是指用于将现有的抗磷酸化修饰的重组单克隆抗体转化为未经修饰且不依赖于磷酸化的克隆衍生物的平台。

图15，小图A和小图B是示出抗akt473的发现和发现成熟(“DisMat”)的一系列图表。

图16A是示出延迟的乳液感染(“DEI”)：重组生物淘选的示意图。DEI是基于乳液的筛选测定。

图16B是条形图，所述条形图示出了DEI测定中生长温度对M13感染的影响。使大肠杆菌TG1细胞在20℃、24℃或37℃下生长至OD600＝0.4。然后将细胞与噬菌体一起孵育，洗涤(以去除未结合的噬菌体)，并在37℃下接种以进行氨苄青霉素转导。对每种条件下抗氨苄青霉素的菌落的数量进行计数并绘制成曲线图。

图17，小图A和B是示出在DEI的实施方式中使用的细菌展示系统的示意图。图17，小图(A)示出了Lpp-OmpA细菌展示系统的示意图。图17，小图(B)示出了用于抗原展示的表达构建体的示意图，所述表达构建体含有大肠杆菌启动子(lac)、Lpp-OmpA融合蛋白质、Tev蛋白酶切割位点和抗原片段。启动子、展示蛋白质(Lpp-OmpA)和抗原序列均侧接有限制性位点以促进交替序列的克隆。(右)通过phiC31整合酶进行整合。在大肠杆菌宿主中，phiC31整合酶蛋白重组两个载体的attP序列和attB序列，从而产生单一的嵌合分子，该单一的嵌合分子以预定取向由归巢载体序列和供体载体序列两者组成。重组事件的产物将VH与CH基因融合。此外，重组事件将哺乳动物启动子和功能性蛋白质起始位点5'两者引入VL基因中。特别值得注意的是，scFv的VH结构域和VL结构域之间的接头由phiC3136-bp attP位点组成，该phiC31 36-bp attP位点能够用作以下两者：i)重链可变结构域与轻链可变结构域之间的肽接头，以及ii)用于phiC31整合酶的36bp功能性底物。[图例：PCMV是CMV启动子；mSigP是哺乳动物信号肽；bSigP是细菌信号肽；ss是剪接信号；VL是轻链可变区；VH是重链可变区；gp3是噬菌体M13基因3产物；PSacR是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)SacR启动子；Ptac是嵌合的trp和lac启动子；Fc是重链恒定区；attB、attP是phiC31整合酶基因的底物；attR和attL是phiC31整合酶基因的产物；loxP是cre蛋白质的底物；polyA是多腺苷酸化序列]。

图18，小图A和B是一系列图表，所述一系列图表示出了来自在大肠杆菌表面上的18种独立展示的肽的多重性的结果。示出了对前10个肽中超过一百万个抗体下一代测序(“NGS”)读段的存在的分析。图18，小图A示出了噬菌体命中的NGS分析。绘制为针对靶标N对比整个NGS组(减去靶标N)的特异性抗体序列的出现的函数图。图18，小图B示出了NGS读段的三个“类别”或分组的说明。如图18，小图B中所示，这三个类别或分组是(i)富集的靶标1特异性scFv；(ii)非特异性scFv；以及(iii)富集的所有其他scFv。

图19是示出在蛋白质印迹分析中使用直系同源抗体确认针对蛋白质的修饰特异性克隆型(“MSC”)抗体的示意图。

定义

为了使本发明更容易理解，下面首先定义了某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。

亲和试剂：如本文所用，术语“亲和试剂”是与靶分子特异性结合，例如以鉴定、追踪、捕获或影响靶分子的活性的任何分子。通过本文所述的方法鉴定或回收的亲和试剂是“遗传编码的”，例如抗体、肽或核酸，并且因此能够被测序。术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用以指代连接在一起的两个或更多个氨基酸。

动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方式中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方式中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人动物。在某些实施方式中，非人动物是哺乳动物(例如，啮齿动物、小鼠、大鼠、兔子、猴子、狗、猫、绵羊、牛、灵长类和/或猪)。在一些实施方式中，动物包括但不限于哺乳动物、禽类、爬行动物、两栖动物、鱼类、昆虫和/或蠕虫。在一些实施方式中，动物可以是转基因动物、基因工程化的动物和/或克隆体。

抗体：如本文所用，术语“抗体”或“Ab”或“Abs”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。“与tt特异性结合”或“与tt免疫反应”是指抗体与所需抗原的一种或多种抗原决定簇反应。抗体包括抗体片段。抗体还包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合dAb(结构域抗体)、单链、F_ab、F_ab’、F_(ab’)2片段、scFv和F_ab表达文库。抗体可以是完整抗体、或免疫球蛋白、或抗体片段。

公认的免疫球蛋白多肽包括其他物种中的κ和λ轻链和α、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ重链或等同物。全长免疫球蛋白“轻链”(约25kDa或约214个氨基酸)包含在NH2末端处的约110个氨基酸的可变区，以及在COOH末端处的κ或λ恒定区。全长免疫球蛋白“重链”(约50kDa或约446个氨基酸)类似地包含可变区(约116个氨基酸)，以及上述重链恒定区中的一个，例如γ重链恒定区(约330个氨基酸)。

抗原结合位点：如本文所用，术语“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。在重链和轻链的V区域内的三个高度散开的段被称为“高变区”，插置在被称为“框架区域”或“FR”的更为保守的侧翼段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间和附近的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中相对于彼此设置，以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一者的三个高变区被称为“互补决定区”或“CDR”。

抗独特型的抗体：如本文所用，“抗独特型抗体”是指特异性结合另一抗体的抗原结合位点并因此被该另一抗体特异性结合的抗体。抗独特型的抗体可以模拟通常被另一抗体识别的表位。独特型是免疫球蛋白可变区中的结构的在遗传学上确定的变体。仅部分地解释了独特型变异性的精确遗传基础。然而，独特型变体涉及氨基酸序列和蛋白质结构(所谓的决定簇)，特别是在抗原结合位点(也称为独特位)的区域中。术语“独特型”表示抗体分子的可变区的决定簇的完整集合。

近似或约：如本文所用，术语“近似”或“约”，如应用于一个或多个感兴趣的值，是指与所陈述的参考值类似的值。在某些实施方式中，除非另有说明或以其他方式从上下文中可以明显看出，否则术语“近似”或“约”是指落入所叙述的参考值的任一方向(大于或小于)上的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少的值的范围(除非此类数字超过可能值的100％)。

有生物活性的：如本文所用，短语“有生物活性的”是指任何试剂的在生物系统中，特别是在生物体中具有活性的特征。例如，当施用于生物体时对该生物体具有生物效应的试剂被认为是有生物活性的。在特定的实施方式中，在肽有生物活性的情况下，该肽的共享该肽的至少一种生物活性的一部分通常被称为“生物活性”部分。

克隆型：如本文所用，术语“克隆型”是指通过体细胞亲和成熟而来源于相同祖先B细胞的一组抗体。

定向磷酸状态特异性抗体克隆型1(“DPAC1”)：如本文所用，“定向磷酸状态特异性抗体克隆型1”或“DPAC1”是指用于分离和确认新的磷酸状态特异性抗体和匹配识别不含修饰的相同序列的抗体对的平台(图1和图13)。

定向磷酸状态特异性抗体克隆型2(“DPAC2”)：如本文所用，“定向磷酸状态特异性抗体克隆型2”或“DPAC2”是指用于分离针对感兴趣的肽或蛋白质的抗体抑制剂的平台。在实施方式中，感兴趣的肽或蛋白质可以是酶。在实施方式中，抑制是通过空间抑制进行的。DPAC2还指用于产生抗独特型的抗体的平台(图2)。

定向磷酸状态特异性抗体克隆型3(“DPAC3”)：如本文所用，“定向磷酸状态特异性抗体克隆型3”或“DPAC3”是指用于将现有的抗磷酸化修饰的重组单克隆抗体转化为未经修饰且不依赖于磷酸化的克隆衍生物的平台(图14)。

发现成熟(“DisMat”)：如本文所用，“发现成熟”或“DisMat”是指进行AXM易错PCR诱变(图7)，以产生发现命中克隆的随机突变文库，然后在发现生物淘选条件下对这些新制备的文库进行生物淘选，其中抗原浓度高并通过3-4轮重复淘选保持恒定。这些特异性改变的克隆在本文中称为“克隆型”。结合也可以通过使用亲和成熟(“AffMat”)定向进化来进一步改善。例如，在AffMat中，每三到四轮淘选使免疫原浓度降低4-10倍。以这种方式采用的AffMat允许采用解离速率选择方案来增大克隆型的亲和力。

表位：如本文所用，术语“表位”包括能够与免疫球蛋白或片段特异性结合的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(诸如氨基酸或糖侧链)组成，并且通常具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。例如，可以产生针对多肽的N末端或C末端肽的抗体。

功能性表位：如本文所用，术语“功能性表位”是指该表位内的残基对结合相互作用作出积极贡献。

功能等同物或功能衍生物：如本文所用，术语“功能等同物”或“功能衍生物”在氨基酸序列的功能衍生物的情境中是指保留与原始序列基本上相似的生物活性(功能或结构)的分子。功能性衍生物或等同物可以是天然衍生物或合成制备的。示例性功能衍生物包括具有一个或多个氨基酸的替换、缺失或添加的氨基酸序列，前提条件是蛋白质的生物活性是保守的。替换氨基酸合意地具有与被替换氨基酸相似的化学物理特性。合意的相似的化学物理特性包括电荷、大小、疏水性、亲水性等方面的相似性。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中、在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在诸如人类和非人动物等多细胞生物体内发生的事件。在基于细胞的系统的情境中，该术语可用于指代在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指(1)在最初产生时(无论是在自然中和/或在实验环境中)已与其所缔合的组分中的至少一些分离的物质和/或实体；和/或(2)由人手产生、准备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与它们最初所缔合的其他组分的至少约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约95％、约98％、约99％、基本上100％或100％分离。在一些实施方式中，分离的试剂是大于约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、基本上100％或100％纯的。如本文所用，如果物质基本上不含其他组分，则所述物质是“纯的”。如本文所用，术语“分离的细胞”是指多细胞生物中不包含的细胞。

免疫结合：术语“免疫结合”是指在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白所特异于的抗原之间发生的类型的非共价相互作用。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以根据相互作用的解离常数(K_d)表示，其中较小的K_d表示较大的亲和力。可以使用本领域中众所周知的方法来定量所选多肽的免疫结合特性。

分子展示系统：如本文所用，术语“分子展示系统”或“抗体文库”是能够呈现潜在亲和试剂文库以筛选靶分子或配体的潜在结合剂的任何系统。分子展示系统的示例包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示和mRNA展示。在一些实施方式中，使用噬菌体展示。

特异于修饰的克隆型：如本文所用，术语“修饰特异性克隆型”或“MSC”是有几个氨基酸不同并且与相同表位的翻译后状态差异结合的抗体。“几个氨基酸”是指约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个氨基酸。

多肽：如本文所用的术语“多肽”是指经由肽键连接在一起的氨基酸的顺序链。该术语用于指任何长度的氨基酸链，但是本领域的普通技术人员应理解，该术语不限于长链并且可以指包含经由肽键连接在一起的两个氨基酸的最小链。如本领域技术人员已知的，多肽可以经加工和/或修饰。

翻译后修饰：如本文所用的术语“翻译后修饰”通常是指在蛋白质生物合成期间或之后发生的肽或蛋白质的任何修饰。例如，翻译后修饰包括将官能团或蛋白质共价加成到蛋白质或肽中，诸如调控亚基的蛋白水解切割或整个蛋白质的降解。

翻译后修饰位点：如本文所用的术语“翻译后修饰位点”通常是指肽、蛋白质或酶内充当任何修饰的受体的一个或多个氨基酸残基。翻译后修饰位点可以是天然存在的，或者其可以被工程化为感兴趣的肽、蛋白质或酶。

蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指用作分立单元的一个或多个多肽。如果单个多肽是分立的功能单元并且不需要与其他多肽进行永久或暂时的物理缔合以形成分立的功能单元，则术语“多肽”和“蛋白质”可以互换使用。如果分立的功能单元由多于一个彼此物理缔合的多肽组成，则术语“蛋白质”是指物理偶联并一起充当分立单元的多个多肽。

scFv：单链Fv(“scFv”)多肽分子是共价连接的VH::VL异二聚体，其可以从包括通过肽编码接头连接的VH编码基因和VL编码基因的基因融合体表达。(参见Huston等人，(1988)Proc Nat Acad Sci USA85(16):5879-5883)。已经描述了许多方法来辨别这样的化学结构，所述化学结构用于将来自抗体V区的天然聚集但化学分离的轻多肽链和重多肽链转化为scFv分子，所述scFv分子将折叠成与抗原结合位点的结构基本上相似的三维结构。参见例如美国专利号5,091,513；5,132,405；和4,946,778。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出感兴趣的特征或特性的全部或接近全部范围或程度的定性条件。生物学领域中的普通技术人员应理解，生物学和化学现象很少(如果有的话)进行完全和/或行进至完全或实现或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来涵盖许多生物学和化学现象中固有的潜在完全性不足。

某些实施方式的详细描述

在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。这些部分的使用并不意味着限制本发明。每个部分可以应用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用表示“和/或”。

本公开尤其提供了用于产生识别、结合或调控具有特异性翻译后修饰的表位的抗体的方法和组合物。在一些实施方式中，本公开描述了一种用于产生翻译后修饰特异性抗体的基于结构的定向进化方法。在一些实施方式中，本公开描述了泛翻译后修饰抗体的产生，其中抗体在存在或不存在翻译后修饰的情况下结合至表位。在一些实施方式中，本公开提供了产生抑制感兴趣的肽或蛋白质的抗体的方法。在实施方式中，抗体是抗酶空间抑制剂。

靶向表位的特异性翻译后修饰的抗体的产生允许在研究的许多方面中使用所述抗体，并且允许所述抗体的潜在治疗用途。例如，可以产生结合至并修饰治疗性蛋白质靶标或其他生物靶标的抗体。“生物蛋白质靶标”是指活生物体内一些其他实体所针对和/或结合的任何事物(例如细胞、蛋白质、小分子、RNA、DNA等)，其中该结合改变了细胞和/或活生物的生理。

如单链可变片段(scFv)等重组抗体具有许多吸引人的属性。它们可以通过在适当的异源宿主中过度表达而再生，它们可以容易地作为DNA贮存和转移，并且可以基因工程化为与多种酶、荧光蛋白和表位标签的融合体。同样有用的是，scFv也可以容易地转换为IgG。然而，在本公开之前，迄今为止体外选择方法(诸如噬菌体展示、酵母展示和核糖体展示)在满足定制翻译后修饰特异性抗体的需要方面一直无效。

先前已使用几种方法在体外产生了Ab多样性。这些方法包括克隆免疫或非免疫脊椎动物细胞的免疫区的cDNA(天然方法)(以创建初原文库)，利用混合核苷酸合成来全合成Ab CDR基因片段，以及合成框架基因的半合成方法，并且多样性是通过克隆大量的CDR产生的。具有恒定框架的典型噬菌体展示文库使5个CDRS中的12个位置随机化，这些位置被发现为：(i)在天然存在的Ab中变化最大，或者(ii)预计与给定抗原(“Ag”)相互作用最多。使用这些文库的总潜在多样性仍比可取样的多样性(使用噬菌体文库时通常为10¹⁰-10¹¹)高得多(>3.8×10²¹)，并且并非在给定CDR位置处的所有氨基酸都将产生功能性Ab。良好的噬菌体展示文库通常>10¹¹，具有>10％的重组。使用本文提供的方法进行文库产生(图10)，可以制备>10¹²并且>85％重组的文库。在一些实施方式中，如本文公开的，使用3个恒定位置结合磷酸化靶标的聚焦文库将有效地比随机化文库更有效、有价值和实用20³(＝8,000)倍。

在一些实施方式中，代替CDR残基的随机诱变，可以将翻译后修饰抗体结合的先验知识并入文库随机化方法中，以产生具有更高频率的相关结合剂的文库。

翻译后修饰

本文描述的方法可以应用于具有任何类型的翻译后修饰的任何表位。翻译后修饰可以是任何翻译后修饰。翻译后修饰可以是带负电的、带正电的、亲水的，和/或疏水的。

作为翻译后修饰的非限制性示例，翻译后修饰可以是任何类型的乙酰化、酰胺化、脱酰胺、异戊烯化(诸如法呢酰化或香叶酰化)、甲酰化、糖基化、羟基化、甲基化、豆蔻酰化、磷酸化、唾液酸化、聚唾液酸化、泛素化、SUMO蛋白質修飾化、类泛素化修饰、核糖基化、硫酸化，或它们的任何组合。

在一些实施方式中，翻译后修饰可以是酰化，包括例如豆蔻酰化、脂酰化(lipoylation)和/或棕榈酰化。翻译后修饰可以是例如异戊二烯化、异戊烯化、法呢基化、香叶酰香叶酰化、糖基磷脂酰肌醇化(glypiation)、黄素部分的添加、血红素c、磷酸泛酰巯基乙胺基化(phophopatetheinylation)、视黄基席夫碱形成、酰化、甲酰化、烷基化、甲基化，酰胺化、精氨酰化、聚谷氨酰化、多糖化、丁酰化、γ-羧化、糖基化、丙二酰化、亚硝基化、羟基化、碘化、腺苷酰化、丙酰化、焦谷氨酸盐形成、S-谷氨酰化、S-亚硝基化、S-亚磺酰化(S-sulfenylation)、S-亚硫酰化(S-sulfinylation)、S-磺酰化(S-sulfonylation)、琥珀酰化、硫酸酯化(sulfation)、糖化、氨基甲酰化、羰基化、生物素化、氨基甲酰化、氧化、聚乙二醇化、ISG化、SUMO蛋白质修饰化、泛素化、类泛素化修饰、原核类泛素化(Pupylation)、瓜氨酸化、脱酰胺化、消去化(eliminylation)，或它们的任何组合。

在一些实施方式中，翻译后修饰可包括二硫键、蛋白水解切割、异天冬氨酸形成、外消旋、蛋白质剪接，或它们的任何组合。

翻译后修饰位点

在本文描述的实施方式中，PTM位点可以是任何PTM位点。PTM位点可以是天然存在的，也可以是经工程化的。可以通过替换感兴趣的肽、蛋白质或酶中的一个或多个氨基酸而将经工程化的PTM位点引入感兴趣的肽、蛋白质或酶中。替代地或另外，可以通过将一个或多个氨基酸残基插入到感兴趣的肽、蛋白质或酶中而将经工程化的PTM位点引入到感兴趣的肽、蛋白质或酶中。引入的经工程化的PTM位点可以具有任何长度。作为非限制性示例，引入的PTM可包括约1-25个、1-50个、1-100个或1-150个氨基酸。在一些实施方式中，引入的PTM包括约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。在一些实施方式中，引入的PTM包括约1-10个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)或1-15个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)氨基酸。

可以通过本领域已知的任何方法将引入的PTM插入感兴趣的肽、蛋白质或酶中。例如，可以使用众所周知的分子克隆方法将编码引入的PTM位点的核苷酸插入感兴趣的肽、蛋白质或酶中。或者，可以使用本领域已知的方法将对应于所需PTM位点的氨基酸序列直接引入感兴趣的肽、蛋白质或酶中。

在一些实施方式中，可以通过替换感兴趣的肽、蛋白质或酶中存在的一个或多个氨基酸来引入经工程化的PTM。例如，可以通过位点诱变或随机诱变来引入经工程化的PTM位点。位点诱变可以是例如某一点突变、一系列点突变(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个或这些之间的任何量)、缺失或插入。

生成PTM和泛PTM结合抗体文库

本文提供了开发基于结构的定向进化方法以产生识别翻译后修饰(PTM)的抗体的方法。在一些实施方式中，提供了一种产生识别PTM位点的抗体的方法，该方法包括：提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；在该抗体的PTM结合袋内的一个或多个被确定与PTM相互作用的位点处引入带负电或不带电的氨基酸；通过使该PTM结合袋之外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库，从而鉴定出泛PTM结合抗体。

在一个方面中，本公开提供了使用可通过掺入磷酸化特异性结合高变区而富集的磷酸化氨基酸识别文库的方法。抗磷酸化特异性可以用作生物物理标记，以“定位”磷酸化特异性抗体与肽上特定位点的结合，以及由此也与蛋白质的结合。一旦鉴定出特异性位点，就可以使重组抗体进化以识别天然序列。在实施方式中，本公开提供用于发现和确认识别高度相似序列的抗磷蛋白抗体和进化抗体。

在一些实施方式中，产生抗体的方法包括提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体。PTM可以是任何PTM。上面描述了示例性的PTM修饰。具有识别特定翻译后修饰的起始抗体允许分析和鉴定与翻译后修饰直接相互作用的残基。在一些实施方式中，使用起始抗体来进行抗体PTM结合袋的结构分析和确定。

在一些实施方式中，鉴定起始抗体的PTM结合袋。本领域中有几种方法允许鉴定PTM结合袋。可以使用任何合适的方法来鉴定抗体PTM结合袋。在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是在结构上预测的。在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是通过实验确定的。

在一些实施方式中，在抗体的PTM结合袋内的一个或多个被确定为与PTM相互作用的位点处引入不带电的氨基酸。“引入的”是指以下中的任何一种：i)用另一种选定的氨基酸替换其天然位置上的现有氨基酸；ii)将附加的选定氨基酸添加到选定位置处的序列中；或iii)从序列中去除选定的氨基酸，以及将另一个氨基酸添加到该序列中与原始去除的氨基酸的位置分离的不同位置处。可以将不带电的氨基酸引入到例如PTM结合袋内的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个位点。在实施方式中，将不带电的氨基酸引入PTM结合袋内的1个位点。在实施方式中，邻近PTM结合袋引入不带电的氨基酸。“相邻”是指从PTM结合袋中去除的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。在一些实施方式中，不带电的氨基酸是丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸或甘氨酸。在一些实施方式中，不带电的氨基酸是丙氨酸或甘氨酸。氨基酸的等电点(pI)可用作选择不带电的氨基酸的指导(表1)。可以使用各种方法将不带电的氨基酸引入抗体的PTM结合袋内。可以使用本领域中已知的任何方法。在一些实施方式中，通过位点诱变引入不带电的氨基酸。

在一些实施方式中，在抗体的PTM结合袋内的一个或多个被确定为与PTM相互作用的位点处引入带负电的氨基酸。可以将带负电的氨基酸引入例如PTM结合袋内的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个位点。在实施方式中，将带负电的氨基酸引入PTM结合袋内的1个位点处。在实施方式中，邻近PTM结合袋引入不带电的氨基酸。在一些实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸化的氨基酸。在一些实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)、磷酸酪氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)。在实施方式中，引入SEP以替换以下氨基酸中的任何一个或多个：丝氨酸(S)、甘氨酸(G)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)。氨基酸的等电点(pI)可作为选择带负电的氨基酸的指导(表1)。

表1：氨基酸等电点pI

在一些实施方式中，PTM可以是任何PTM。在一些实施方式中，PTM可以是带电的或不带电的。不带电的PTM的示例可以包括甲基化。在一些实施方式中，PTM可以带负电或带正电。示例性的带负电的PTM包括但不限于磷酸化、糖基化和唾液酸化。在一些实施方式中，PTM可以是亲水的和/或疏水的。

在一些实施方式中，通过使PTM结合袋之外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库。邻近PTM位点的邻近序列可以具有不同的长度。在一些实施方式中，邻近序列可以是PTM位点上游和/或下游的约1-15个(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)氨基酸残基。在一些实施方式中，邻近序列可以是PTM位点上游和/或下游的约15-30个(即15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)氨基酸残基。在一些实施方式中，邻近序列可以在PTM位点的上游和下游两者处。在一些实施方式中，邻近序列位于PTM位点的上游。在一些实施方式中，邻近序列位于PTM位点的下游。

本领域中已知的任何定点诱变方法都可以用于使PTM结合袋之外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化。例如，易错PCR、通过引物延伸进行定点诱变、反向PCR、基于kunkel的诱变，盒式诱变、全质粒诱变、AXM诱变、易错滚环扩增(RCA)或体内定点诱变可用于引入随机化以产生文库。在一些实施方式中，使用基于kunkel的定点诱变。在一些实施方式中，使用AXM诱变。在一些实施方式中，使用易错滚环扩增(RCA)。

在一些实施方式中，针对具有PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库。在一些实施方式中，针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库。在一些实施方式中，该筛选允许鉴定特异性识别PTM的抗体。或者，该筛选允许鉴定不识别PTM的抗体。可替代地，该筛选允许鉴定与具有和不具有PTM的表位结合的抗体。这些后面的抗体是“泛PTM”抗体，因为它们与特定表位结合，而与该表位的PTM状态无关。

生成非PTM结合抗体文库

在一些实施方式中，提供了一种用于产生特异性结合不具有翻译后修饰(PTM)的位点的非PTM结合抗体的方法，该方法包括：提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；在该抗体的PTM结合袋中的一个或多个被确定为与PTM相互作用的位点处引入排斥PTM的氨基酸；通过使PTM结合袋之外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选非PTM结合抗体的文库；以及针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库，从而鉴定出非PTM结合抗体。

在一些实施方式中，产生抗体的方法包括提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体。PTM可以是任何PTM。上面描述了示例性的PTM修饰。具有识别特定翻译后修饰的起始抗体允许分析和鉴定与翻译后修饰直接相互作用的残基。在一些实施方式中，使用起始抗体来进行抗体PTM结合袋的结构分析和确定。在一些实施方式中，鉴定起始抗体的PTM结合袋。本领域中有几种方法允许鉴定PTM结合袋。可以使用任何合适的方法来鉴定抗体PTM结合袋。在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是在结构上预测的。在一些实施方式中，PTM结合袋内的一个或多个位点是通过实验确定的。

在一些实施方式中，在抗体的PTM结合袋中的一个或多个被确定为与PTM相互作用的位点处引入排斥PTM的氨基酸。在实施方式中，排斥PTM的氨基酸可以是任何氨基酸。在实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带正电的或带负电的。在实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带负电的。在实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带正电的。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带正电的还是带负电的取决于带电的氨基是否能够排斥PTM。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带负电的。例如，在一些实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)、磷酸酪氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)。在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是带正电的。例如，带正电的氨基酸可以是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

排斥PTM的氨基酸可以是非经典氨基酸。作为非限制性示例，非经典氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)、磷酸酪氨酸、对叠氮基-苯丙氨酸、苯甲酰基-苯丙氨酸，或乙酰基赖氨酸。作为非限制性示例，氨基酸可以是硒代半胱氨酸或吡咯赖氨酸。在实施方式中，通过抑制性tRNA引入排斥PTM的氨基酸。

在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是亲水的。在实施方式中，可以使用任何亲水性氨基酸。例如，亲水性氨基酸可以是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

在一些实施方式中，排斥PTM的氨基酸是疏水的。在实施方式中，可以使用任何疏水性氨基酸。例如，疏水性氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸。

在一些实施方式中，通过使PTM结合袋之外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化来产生包含候选非PTM结合抗体的文库。邻近PTM位点的邻近序列可以具有不同的长度。在一些实施方式中，邻近序列可以是PTM位点上游和/或下游的约1-15个(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个)氨基酸残基。在一些实施方式中，邻近序列可以是PTM位点上游和/或下游的约15-30个(即15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)氨基酸残基。在实施方式中，邻近序列位于PTM位点的上游。在实施方式中，邻近序列位于PTM位点的下游。在一些实施方式中，邻近序列可以在PTM位点的上游和下游两者处。

本领域中已知的任何定点诱变方法都可以用于使PTM结合袋之外的一个或多个与邻近PTM位点的邻近序列结合的区域随机化。例如，易错PCR、通过引物延伸进行定点诱变、反向PCR、基于kunkel的诱变，盒式诱变、全质粒诱变、AXM诱变、易错滚环扩增(RCA)或体内定点诱变可用于引入随机化以产生文库。在一些实施方式中，使用基于kunkel的定点诱变。在一些实施方式中，使用AXM诱变。在US9,617,537和US9,422,549中描述了AXM诱变，这些专利的全部内容以引用方式并入本文。在一些实施方式中，使用易错滚环扩增(RCA)。

在一些实施方式中，针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库。在一些实施方式中，该筛选允许鉴定不识别PTM的抗体。

产生抑制性抗体

在实施方式中，提供了用于产生抑制性抗体的方法。抑制性抗体可以通过本领域已知的任何方法抑制感兴趣的肽或蛋白质。例如，通过本文的方法产生的抑制性抗体可以通过空间抑制、变构抑制和/或通过竞争抑制来进行抑制。在实施方式中，抗体是空间抑制剂。在实施方式中，抗体是变构抑制剂。在实施方式中，抗体是竞争性抑制剂。在实施方式中，感兴趣的肽或蛋白质是酶。在实施方式中，感兴趣的肽或蛋白质是跨膜蛋白质。在实施方式中，感兴趣的肽或蛋白质是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。在实施方式中，感兴趣的肽或蛋白质是细胞受体。细胞受体可以是任何种类的细胞受体，例如在实施方式中，细胞受体是G蛋白偶联受体(GPCR)、酶偶联受体或配体门控离子通道受体。产生靶向感兴趣的肽或蛋白质的抑制性抗体的方法可以应用于任何种类的GPCR。多种G蛋白偶联受体是本领域中已知的。例如，发现GPCR是腺苷受体、粘附GPCR、肾上腺素能受体、趋化因子受体、胆囊收缩素受体、多巴胺受体、组胺受体、代谢型谷氨酸受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、嗅觉受体、阿片受体和羟色胺受体等。在实施方式中，感兴趣的肽或蛋白质选自瘦素受体、胰高血糖素受体、胰岛素受体、CXCR4、NTSR1、NTSR2和受体酪氨酸激酶。

在实施方式中，抑制性抗体是抗独特型的抗体。抑制性抗体可经构建以靶向任何种类的独特型。在实施方式中，抑制性抗体抑制赫赛汀(Herceptin)和/或抗CD19。在实施方式中，抑制性抗体抑制双特异性抗体。在实施方式中，抑制性抗体结合经变性的IgG和天然IgG。在实施方式中，抑制性抗体结合经变性的或天然的IgG。

在实施方式中，产生针对感兴趣的肽或蛋白质的抑制性抗体的方法包括提供经修饰的感兴趣的肽，所述经修饰的感兴趣的肽经修饰以包括带负电的氨基酸；针对偏向带负电的氨基酸的抗体文库筛选经修饰的肽；分离一种或多种与经修饰的感兴趣的肽结合的抗体；以及测定该一种或多种抗体与未经修饰的感兴趣的肽的结合，从而鉴定出与感兴趣的肽结合的抗体。

在实施方式中，产生针对感兴趣的肽的抗体的方法包括：提供经修饰的感兴趣的肽，该经修饰的感兴趣的肽经修饰以包括带负电的氨基酸；针对偏向带负电的氨基酸的抗体文库筛选经修饰的肽；分离一种或多种与经修饰的感兴趣的肽结合的抗体；通过亲和成熟产生该一种或多种抗体的克隆型文库；针对未经修饰的感兴趣的肽筛选该克隆型文库，从而鉴定出与感兴趣的肽结合的抗体。

在实施方式中，形成经修饰的肽的碱基序列的肽与感兴趣的肽或蛋白质的胞外域和/或胞外域的周围区域对应。在实施方式中，形成经修饰的肽的碱基序列的肽是感兴趣的肽或蛋白质的胞外域。在实施方式中，形成经修饰的肽的碱基序列的肽是从感兴趣的蛋白质获得的活性位点和/或活性位点的周围区域。在实施方式中，感兴趣的肽或蛋白质是酶。“周围区域”是指在胞外域和/或活性位点上游和/或下游的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。在实施方式中，通过将一个或多个氨基酸(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个)引入从如上所述的感兴趣的肽或蛋白质获得的碱基序列中来产生经修饰的肽。在实施方式中，通过将一个氨基酸引入从感兴趣的肽或蛋白质获得的碱基序列中来产生经修饰的肽。“引入”是指以下中的任何一种：i)用另一种选定的氨基酸替换其天然位置上的现有氨基酸；ii)将附加的选定氨基酸添加到选定位置处的序列中；或iii)从序列中去除选定的氨基酸，以及将另一个氨基酸添加到该序列中与原始去除的氨基酸的位置分离的不同位置处。在实施方式中，经修饰的肽被合成为包括带负电的氨基酸。在实施方式中，通过使用来自CDR H3和/或CDR L3的碱基序列产生经修饰的肽来构建抗独特型的抗体。在实施方式中，将CDR H3序列用作碱基序列来合成经修饰的肽。在实施方式中，将CDR L3用作碱基序列来合成经修饰的肽。在实施方式中，将CDR H3和CDR L3均用作碱基序列来合成经修饰的肽。

在一些实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸化的氨基酸。在一些实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)、磷酸酪氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在实施方式中，带负电的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)。氨基酸的等电点(pI)可作为选择带负电的氨基酸的指导(以上表1)。将带负电的氨基酸引入基础肽，从而形成经修饰的肽。可以在基础肽内引入约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。在实施方式中，将带负电的氨基酸引入基础肽内的1个位点以产生经修饰的肽。在实施方式中，在胞外域或活性位点附近引入带负电的氨基酸。“邻近”是指在胞外域和/或活性位点上游或下游的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸。

可以使用本领域中的任何方法来筛选候选抗体。在一些实施方式中，使用基于乳液全细胞的文库筛选方法。在实施方式中，基于乳液全细胞的文库筛选方法是延迟乳液感染(“DEI”)。全细胞筛选方法(例如全细胞淘选)描述于US 2015-0322150和WO/2015/085079中，这些专利中的每一个的全部内容以引用方式并入本文。

可以使用本领域已知的任何方法来纯化抑制性抗体。许多抗体纯化技术是本领域中可用的。例如，可以使用蛋白A或蛋白G通过亲和层析来纯化抗体，所述蛋白A或蛋白G主要提供免疫血清的IgG级分。随后或可替代地，可以将为所寻求的免疫球蛋白的靶标的特异性抗原或其表位固定在柱上，以通过免疫亲和层析来纯化免疫特异性抗体。

在实施方式中，使用测定来测试纯化的抑制性抗体结合和/或抑制感兴趣的肽或蛋白质的能力。在实施方式中，使用基于细胞的测定来测试纯化的抑制性抗体的结合和/或抑制能力。可使用其他测定(例如ELISA、FACS和/或免疫细胞化学)来测试纯化的抑制性抗体。

任何抗体文库均可与本文公开的方法一起使用。在实施方式中，抗体文库是带负电的抗体文库。在实施方式中，该抗体文库是一种偏向磷酸化的抗体文库。

在实施方式中，通过本领域已知的方法使一种或多种抗体的克隆型文库突变和成熟。在实施方式中，通过亲和成熟来使一种或多种抗体的克隆型文库突变和成熟。在实施方式中，通过AXM诱变来使一种或多种抗体的克隆型文库成熟(图7)。

在实施方式中，针对经修饰的肽筛选出的抗体文库具有结合磷酸化的氨基酸(例如，磷酸丝氨酸(SEP)或磷酸酪氨酸)的预定倾向。在实施方式中，针对经修饰的肽筛选出的抗体文库具有在经修饰的序列(即邻近序列)的情况下结合特定序列的一般模式。在实施方式中，构建噬菌体文库并用来鉴定抗磷酸化肽抗体。在实施方式中，被引入被筛选的肽中的磷酸化的氨基酸替换了该序列处的天然氨基酸。在实施方式中，执行分离的抗体的定向进化方法。在定向进化后，针对能够识别天然序列的克隆型筛选抗体(例如，其中被筛选的肽中的天然存在的氨基酸替换该序列处的磷酸化的氨基酸)。

在实施方式中，经修饰的表位的碱基序列是通过在感兴趣的肽或蛋白质的外部结构域或活性位点中或附近系统地向下“行走”约每第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12个氨基酸而选择的。在实施方式中，经修饰的表位的碱基序列是通过在感兴趣的肽或蛋白质的外部结构域或活性位点中系统地向下“行走”约每第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12个氨基酸而选择的。在实施方式中，经修饰的表位的碱基序列是通过在感兴趣的肽或蛋白质的外部结构域中系统地向下“行走”约每第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12个氨基酸而选择的。在实施方式中，经修饰的表位的碱基序列是通过在感兴趣的肽或蛋白质的活性位点中系统地向下“行走”约每第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12个氨基酸而选择的。在实施方式中，经修饰的表位的碱基序列是通过在感兴趣的肽或蛋白质的外部结构域中或附近或活性位点中或附近系统地向下“行走”约每第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第10、第11或第12个氨基酸而选择的。

文库构建、扩增和筛选

抗体文库可以是任何种类的抗体文库。抗体文库的示例包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、核糖体展示和mRNA展示。在一些实施方式中，抗体文库是噬菌体展示。

本领域已知的任何种类的文库扩增方法可以用于第二文库的扩增。在一些实施方式中，可以使用一对寡核苷酸来扩增感兴趣的序列，该一对寡核苷酸中一个寡核苷酸是受保护的寡核苷酸，另一个是非保护的寡核苷酸。可以使用此类寡核苷酸对通过诸如PCR、易错PCR、等温扩增或滚环扩增等扩增反应来扩增感兴趣的序列。在一些实施方式中，文库扩增方法是滚环扩增(RCA)。在一些实施方式中，文库扩增方法是易错滚环扩增。RCA可以将文库扩增大致介于50倍与150倍之间(例如50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、105倍、110倍、115倍、120倍、125倍、130倍、135倍、140倍、145倍、150倍，以及这些之间的任何值)。在一些实施方式中，RCA可以将文库扩增约100倍。在一些实施方式中，RCA扩增的文库被线性化和重新环化。

可以将抗体文库引入本领域已知的任何合适的细胞中。在实施方式中，细胞是古细菌细胞、原核细胞、细菌细胞、真菌细胞或真核细胞。在实施方式中，细胞是酵母细胞、植物细胞或动物细胞。在实施方式中，细胞是大肠杆菌细胞或酿酒酵母细胞。在一些实施方式中，细胞是昆虫细胞。在实施方式中，细胞株是任何电感受态细胞或化学感受态细胞。在一些实施方式中，将文库转化到DH5α、JM109、C600、HB101或TG1内。在一些实施方式中，将文库转化到TG1细胞内。

在一些实施方式中，抗体文库具有大致介于10⁷个与10¹⁴个(即10⁷个、10⁸个、10⁹个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个和10¹⁴个)独特抗体之间的多样性。在一些实施方式中，文库具有至少10⁸和10¹²(即10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹和10¹²)的多样性。

可以使用本领域中的任何方法来筛选候选抗体。在一些实施方式中，使用基于乳液全细胞的文库筛选方法。全细胞筛选方法(例如全细胞淘选)描述于US 2015-0322150和WO/2015/085079中，这些专利中的每一个的全部内容以引用方式并入本文。全细胞筛选方法包括例如形成乳液，在所述乳液中已将用抗体噬菌体文库转导的大肠杆菌与展示感兴趣的抗原的细胞或珠粒一起孵育。在过夜孵育过程中，抗体展示噬菌体从大肠杆菌中分泌出并附着到抗原呈递细胞或珠粒上。后续加工包括添加附接至噬菌体的标记抗体，并随后进行FACS分选以分离已经与在整个细胞或珠粒上展示的抗原结合的抗体展示噬菌体。在一些实施方式中，文库经加工以用于进行多轮全细胞筛选。在一些实施方式中，执行介于约3次与8次之间(即3次、4次、5次、6次、7次、8次)的全细胞筛选。在一些实施方式中，执行全细胞筛选约3次。在一些实施方式中，多轮全细胞筛选导致分离出更具特异性的表位结合抗体。

延迟乳液感染(DEI)：重组生物淘洗

在实施方式中，全细胞淘选方法包括以下步骤：i)提供具有可诱导的噬菌体附着位点并且在表面上展示肽、蛋白质、磷酸肽或磷酸蛋白质的细菌细胞(例如大肠杆菌)；ii)将所述细菌细胞与包含条形码序列标识物的噬菌体抗体文库以一定比例混合、乳化，使得每一个细菌细胞有一个噬菌体；iii)诱导所述可诱导的噬菌体附着位点的表达，从而允许所述细菌细胞的噬菌体感染；iv)使噬菌体感染的细菌细胞生长，以及v)对条形码序列标识物进行测序以鉴定由噬菌体编码的抗体。在实施方式中，细菌细胞是大肠杆菌细胞。

作为背景，F菌毛是用于大肠杆菌M13感染的附着位点。F菌毛在<22℃下生长的F⁺大肠杆菌中不表达。在DEI中，噬菌粒编码的抗体与细胞的“缔合”依赖于展示M13的抗体与已在16℃下过夜生长的基因型为F⁺的大肠杆菌宿主的细菌细胞表面展示抗原的相互作用。将这些表型为F^-的宿主以10:1(细胞:噬菌体)的比率与M13噬菌体Ab文库混合。期望的比率是每个细菌细胞缔合有1个噬菌体。通过具有包含比噬菌体更多的细菌的比率，克服了由于泊松分布导致的限制。将抗体文库和细胞文库的混合物洗涤以去除未附着和弱附着的噬菌体，然后在生长培养基中重悬。将单次洗涤的细胞与任何附着的噬菌体一起在油包生长培养基乳液中乳化。通过产生比细菌更多且更小的微滴，克服了泊松分布。由于CDR H2中的三个氨基酸，文库的磷酸化聚焦使其有效大小增大了约8,000倍(＝20³)，并对使用较小的文库进行了DEI补偿。将乳液温度升至37℃以：(1)诱导F菌毛表达，(2)允许噬菌体从细胞表面分离，以及(3)通过F菌毛附着实现分离的噬菌体感染。在细胞内，通过phiC31整合酶的介导，将进入的抗体编码的供体噬菌粒与抗原编码的受体质粒重组。由于供体噬菌粒和受体质粒成功重组形成质粒共整合体，因此发动了氯霉素(CAM)基因。几个小时后，将乳液破乳，并且使细胞在CAM存在下生长过夜。从库中分离重组质粒，所述重组质粒现在具有与Ag序列物理连接的Ab基因。使用个别质粒的抗原和抗体序列的配对末端下一代DNA测序(NGS)和多重条形码方案来鉴定和连接所有抗CAM抗体:抗原对。

在实施方式中，大肠杆菌细胞是F⁺大肠杆菌细胞。在实施方式中，F⁺大肠杆菌细胞包含含有氯霉素(CAM)基因的受体质粒。在实施方式中，使F⁺大肠杆菌细胞在小于约22℃(例如约10.0℃、10.5℃、11.0℃、11.5℃、12.5℃、13.0℃、13.5℃、14.0℃、14.5℃、15.0℃、15.5℃、16.0℃、16.5℃、17.0℃、17.5℃、18.0℃、18.5℃、19.0℃、19.5℃、20.0℃、20.5℃、21.0℃、20.5℃)的温度下生长。在实施方式中，将F⁺大肠杆菌与噬菌体文库混合，从而乳化F⁺大肠杆菌细胞。在实施方式中，使乳化的F⁺大肠杆菌细胞在约37℃的温度下生长，然后将氯霉素引入培养物中。在实施方式中，对感染的、生长的、暴露于氯霉素的F⁺大肠杆菌中包含的质粒进行测序，以鉴定由噬菌体编码的抗体。

在一些实施方式中，该方法还包括确认步骤。可以在确认步骤中使用本领域已知的任何方法来确认感兴趣的抗体。例如，ELISA和/或功能测定可用于抗体确认。在一些实施方式中，确认步骤是高通量的。

在一些实施方式中，确认包括确定所鉴定出的PTM、泛PTM、非PTM结合抗体是否是针对PTM的空间抑制剂。例如，本文提供的方法可用于产生靶向感兴趣的肽或蛋白质的空间抑制性抗体。在实施方式中，本文所述的方法产生抑制感兴趣的酶的空间抑制性抗体。产生空间抑制性抗体的方法包括例如提供特异性识别感兴趣的酶上的PTM的抗体；鉴定该抗体的PTM结合袋；通过使PTM结合袋内或外的一个或多个与酶上的PTM位点结合的区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；针对感兴趣的酶筛选文库，以及选择在不没有PTM修饰的情况下识别PTM位点的抗体；以及通过执行酶活性测定来选择空间抑制性抗体。对于这些方法，任何酶都可以是空间抗体抑制剂的靶标。用于检测或定量酶活的测定是本领域已知的。在选择过程中可以使用任何此类酶活测定。

磷酸化状态特异性抗体文库设计

在一些实施方式中，提供了用于产生磷酸化特异性抗体文库的方法。在一些实施方式中，提供了用于产生泛磷酸化抗体文库的方法。在一些实施方式中，提供了用于产生非磷酸化抗体文库的方法。

以下是用于创建特异于磷酸化翻译后修饰的抗体文库的示例性策略。

在一些实施方式中，磷酸化翻译后修饰(PTM)可以在任何残基处。在一些实施方式中，磷酸化发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸和/或组氨酸残基上。在一些实施方式中，磷酸化发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、组氨酸、精氨酸和/或赖氨酸残基上。在一些实施方式中，PTM位点是pSer。在一些实施方式中，PTM位点是pTyr。在一些实施方式中，PTM位点是pThr。在一些实施方式中，PTM位点是pHis。在一些实施方式中，PTM位点是pArg。在一些实施方式中，PTM位点是pLys。

在一些实施方式中，产生抗体的方法包括提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体。在一些实施方式中，PTM是磷酸化。在一些实施方式中，鉴定磷酸化结合袋。

先前的研究已表明，抗体结合磷酸化的氨基酸的能力依赖于重链/轻链互补决定区2(CDR H2或CDR L2)，该重链/轻链互补决定区2与磷酸化的氨基酸直接接触。进一步的研究已表明，可以使用CDR H2中的天然磷酸结合基序来产生具有与磷酸肽结合的倾向的磷酸化聚焦文库。

通过随机化、非依赖性筛选，抗Myb pSer特异性scFv的CDR H2中的氨基酸显示为对于结合磷酸化的Myb_1-20肽至关重要。L2或H2的选择似乎与邻近序列的方向相关。基于这些观察，可以将磷酸盐结合位点设计为局部模块。

磷酸化抗体结合相互作用的结构分析表明关于磷酸化的表位，磷酸化的区域通常裸露具有环或圈结构的线性基序。不希望受到理论的束缚，这据推测是由于需要适合激酶的狭窄底物结合袋。因此，不同磷酸化的区域之间的序列变化实际上并不影响相对均匀的二级结构。

进一步的分析表明，磷酸化表位特异性可能需要邻近序列的最佳长度。磷酸化特异性Ab可识别磷酸化的氨基酸和周围的邻近序列。成功的磷酸肽Ab通常识别在磷酸化残基的上游和/或下游的约4-5个额外残基，表明与邻近序列的过度结合可能会稀释磷酸化的氨基酸的贡献，从而削弱相对于天然肽的磷酸化肽特异性。

在一些实施方式中，邻近序列的最佳长度是磷酸化残基的上游或下游的约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个残基。在一些实施方式中，邻近序列的最佳长度是磷酸化残基的上游或下游的约3个、4个、5个或6个额外残基。在一些实施方式中，邻近序列的最佳长度是磷酸化残基的上游或下游的约4个或5个额外残基。在一些实施方式中，邻近序列可以在翻译后修饰的上游或下游。在一些实施方式中，邻近序列在翻译后修饰的上游。在一些实施方式中，邻近序列在翻译后修饰的下游。

总体而言，数据表明，如果可以发现邻近序列的常用结合模式，则统一的结构、可能限定的邻近长度以及经确认的磷酸结合位点设计共同使高度聚焦的基于知识的磷酸化状态结合库成为可设计的。

在一些实施方式中，用于磷酸化翻译后修饰的结合袋是CDR H2区和/或CDR L2区。在一些实施方式中，CDR H2区域和/或CDR L2区域之外的区域是随机化的。CDR H2区域和/或CDR L2区域之外的任何区域均可为随机化的。例如，CDR H1、CDR H3、CDR L1、CDR L3或框架区域可以是随机化的。在一些实施方式中，一个或多个随机化区包含随机化的CDR H3或L3。在一些实施方式中，PTM结合袋包含CDR H2区，并且一个或多个随机化区包含随机化的CDR H3、CDR L3和/或CDR L2。

本领域中已知的任何定点诱变方法都可以用于使磷酸化结合袋之外的一个或多个与邻近磷酸化位点的邻近序列结合的区域随机化。例如，易错PCR、通过引物延伸进行定点诱变、反向PCR、基于kunkel的诱变，盒式诱变、全质粒诱变、AXM诱变、易错滚环扩增(RCA)或体内定点诱变可用于引入随机化以产生文库。在一些实施方式中，使用基于kunkel的定点诱变。在一些实施方式中，使用AXM诱变。在一些实施方式中，使用易错滚环扩增(RCA)。

在一些实施方式中，在不改变磷酸化结合袋的情况下，使磷酸化结合袋之外的一个或多个与邻近序列结合的区域随机化。

在一些实施方式中，针对具有磷酸化的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库。在一些实施方式中，针对不含PTM的感兴趣的肽或蛋白质来筛选文库。在一些实施方式中，该筛选允许鉴定特异性识别磷酸化的抗体。可替代地，该筛选允许鉴定不识别磷酸化的抗体。可替代地，该筛选允许鉴定与具有和不具有磷酸化的表位结合的抗体。这些后面的抗体是“泛磷酸化”抗体，因为它们与特定表位结合，而与表位的磷酸化状态无关。

使用这种将功能诱变和结构建模相组合的方法，并与特定翻译后修饰抗体复合物的现有结构进行比较，可以确定候选肽结合沟。对于磷酸化肽抗体复合物，肽结合沟被鉴定为由CDR L3和CDR H3的几个限制性区域所包裹，所述几个限制性区域可以用作聚焦磷酸化肽文库设计的候选对象。

抗体

本公开的抗体可以是多特异性的，例如双特异性的。抗体可以是哺乳动物的(例如，人或小鼠)、人源化的、嵌合的、重组的、合成产生的，或天然分离的。本公开的示例性抗体包括但不限于IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1、IgA2和IgAsec)、IgD、IgE、Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv、scFv-Fc和SMIP结合部分。在某些实施方式中，抗体是scFv。scFv可包括例如柔性接头，从而允许scFv沿不同方向定向以实现抗原结合。在各种实施方式中，抗体可以是在细胞内的还原环境中保持其结构和功能的胞质稳定scFv或胞内抗体(参见例如Fisher和DeLisa,J.Mol.Biol.385(1):299-311,2009；以引用方式并入本文)。在特定的实施方式中，根据本文所述的方法将scFv转化为IgG或嵌合抗原受体。在实施方式中，抗体与经变性的和天然的蛋白质靶标结合。在实施方式中，抗体结合经变性的或天然的蛋白质。

在包括人类在内的大多数哺乳动物中，完整抗体具有通过二硫键连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由三个结构域(CH1、CH2和CH3)以及在CH1和CH2之间的铰链区组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分为被称为互补决定区(CDR)的高变区和被称为架构区(FR)的更保守区域，所述CDR与所述FR交替散布。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，所述三个CDR和四个FR从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

抗体包括所有已知形式的抗体和其他具有抗体样特性的蛋白质支架。例如，抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人抗体、人源化抗体、双特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、或具有抗体样特性的蛋白质支架，诸如纤连蛋白或锚蛋白重复序列。抗体可以具有以下同种型中的任何一种：IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgM、IgA(例如，IgA1、IgA2和IgAsec)、IgD，或IgE。

抗体片段可以包括一个或多个源自抗体的区段。来源于抗体的区段可以保留特异性结合特定抗原的能力。抗体区段可以是例如Fab、Fab'、Fab'2、F(ab')2、Fd、Fv、Feb、scFv、或SMIP。抗体片段可以是例如双抗体、三链抗体、亲和抗体、纳米抗体、适体、结构域抗体、线性抗体、单链抗体，或可由抗体片段形成的多种多特异性抗体中的任何一种。

抗体区段的示例包括：(i)Fab片段：由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段：包含两个通过铰链区处的二硫键连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段：由VH结构域和CH1结构域组成的片段；(iv)Fv片段：由抗体单臂的VL结构域和VH结构域组成的片段；(v)dAb片段：包括VH结构域和VL结构域的片段；(vi)dAb片段：作为VH结构域的片段；(vii)dAb片段：作为VL结构域的片段；(viii)分离的互补决定区(CDR)；以及(ix)两个或更多个分离的CDR的组合，所述两个或更多个分离的CDR可以任选地通过一个或多个合成接头接合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法连接在一起，例如通过合成接头，所述合成接头使所述两个结构域表达为单个蛋白质，所述单个蛋白质的VL区和VH区配对形成单价结合部分(称为单链Fv(scFv))。抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且在一些情况下可以与完整抗体相同的方式使用。抗原结合片段可以通过重组DNA技术或通过完整免疫球蛋白的酶或化学切割来产生。抗体片段还可以包括上述抗体片段中的任何一者，并且添加有额外的C末端氨基酸、N末端氨基酸、或分离个别片段的氨基酸。

如果抗体包含一个或多个来源于第一物种的抗原决定区或恒定区和一个或多个来源于第二物种的抗原决定区或恒定区，则该抗体可称为嵌合的。嵌合抗体可以例如通过基因工程化来构建。嵌合抗体可以包括属于不同物种(例如，来自小鼠和人)的免疫球蛋白基因区段。

抗体可以是人抗体。人抗体是指具有可变区的结合部分，在所述可变区中框架区和CDR区均来源于人免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则该恒定区也来源于人免疫球蛋白序列。人抗体可以包括人免疫球蛋白序列中未鉴定出的氨基酸残基，诸如一个或多个序列变体，例如突变。可以例如通过人为操纵来引入变体或附加的氨基酸。本公开的人抗体不是嵌合的。

抗体可以是人源化的，意味着将包括一个或多个基本上来源于非人免疫球蛋白或抗体的抗原决定区(例如，至少一个CDR)的抗体操纵为包括至少一个基本上来源于人免疫球蛋白或抗体的免疫球蛋白结构域。可以使用本文所述的转化方法将抗体人源化，例如通过将来自由第一载体编码的非人抗体的抗原识别序列插入到由第二载体编码的人框架中。例如，第一载体可以包括编码非人抗体(或其片段)的多核苷酸和位点特异性重组基序，而第二载体可以包括编码人框架的多核苷酸和与第一载体上的位点特异性重组基序互补的位点特异性重组。可以将位点特异性重组基序定位在每种载体上，使得重组事件导致将非人抗体的一个或多个抗原决定区插入到人框架中，从而形成编码人源化抗体的多核苷酸。

在某些实施方式中，将抗体从scFv转化为IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)。本领域中有多种将scFv片段转化为IgG的方法。在美国专利申请公开号20160362476中公开了一种将scFv片段转化为IgG的此类方法，该美国专利申请内容以引用方式并入本文。

结合亲和力

抗体和抗体片段的结合亲和力可以通过本领域已知的各种方法来确定。例如，结合亲和力可以通过Scatchard analysis of Munson and Pollard,Anal.Biochem.,107:220(1980)来确定。另一种方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力，以及在两个方向上相等地影响速率的几何参数。因此，“缔合速率常数”(K_缔合)和“解离速率常数”(K_解离)都可以通过计算浓度和实际的缔合速率和解离速率来确定。(参见Nature 361:186-87(1993))。K_解离/K_缔合的比率使得能够取消与亲和力无关的所有参数，并且等于解离常数K_d。(通常参见Davies等人，(1990)Annual Rev Biochem59:439-473)。

在一些实施方式中，翻译后特异性抗体的结合亲和力为约1nM的K_d。在一些实施方式中，翻译后特异性抗体的结合亲和力为大于约1nM的K_d。在一些实施方式中，抗体结合亲和力为大约介于1nM与50nM之间的K_d(即1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM，或介于这些之间的任何值)。在一些实施方式中，抗体结合亲和力为大约介于为1nM与15nM之间的K_d(即1nM、2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM，或介于这些之间的任何值)。

实施例

实施例1-鉴定用于特定翻译后修饰的抗体肽结合沟

该实施例描述了结合特定翻译后修饰的抗体肽结合沟的鉴定。在该实施例中评定的特定翻译后修饰是磷酸化。图1示出了一个实施方式的方法的示意图，该示意图说明了翻译后修饰特异性抗体克隆型的衍生。

使用功能诱变和结构建模的组合，并与磷酸化肽Ab复合物的现有结构进行比较，鉴定出了共享的肽结合沟，该共享的肽结合沟被CDR L3和CDR H3的几个限制性区域包裹。CDR L3和CDR H3中的这些限制性区域可以用作聚焦磷酸-肽文库设计的候选物。

从抗Myb磷酸化丝氨酸(pSer)特异性scFv(AXM1293)的CDR区的随机丙氨酸扫描诱变获得的数据表明，CDR H2中的氨基酸残基对于磷酸化的Myb_1-20肽的结合至关重要(图4)。基于丙氨酸扫描结果(图4)和H2是磷酸结合中心的发现，使用RosettaAb3软件对抗MybpSer特异性scFv(AXM1293)的Ab结构及其与其同源的磷酸化肽的复合物进行建模。根据对结构建模和丙氨酸扫描诱变获得的结果的分析(图4)，得出的结论是L2和H2可以分别用于靶向具有C末端邻近序列或N末端邻近序列的磷酸化肽(图4)。还确定了两种其他磷酸化肽-Ab结构，尽管该两种其他磷酸化肽-Ab结构具有不同的磷酸结合位点(H2或L2)，但共享共同的邻近序列结合模式，即该肽被H3和L3包裹，这在复合模型中类似地观察到(图4)。将使用诱变和晶体学方法来执行进一步的确认。

实施例2—设计和产生翻译后修饰特异性抗体文库

该实施例描述了聚焦的磷酸化丝氨酸(pSer)、磷酸化酪氨酸(pTyr)和pSer/pTyr抗体文库的设计和产生。根据对先前阐明的结构和本文产生的数据的分析，确定了磷酸肽的核心结合区可以定位到包括L3、H3和H2或L2的三角形区域。这种相互作用的主要多样性是由L3和H3贡献的，而H2或L2的选择决定了磷酸结合以及可能的肽方向。

将抗体选择为pSer特异性的，诸如AXM1293，并将附加的抗体克隆选择为抗pTyr特异，或抗pSer特异/抗p-Tyr特异两者的(参见图5)。L3和H3的部分将被随机化，也就是说，那些预期介导与特定肽/蛋白质相互作用的CDR环将被随机化，而将已经对pSer、pTyr或pSer/pTyr具有亲和力的CDR H2保留。因此，这将提供简单的开关来将pSer抗体库转化为用于pTyr识别，并且更重要地支持H2区确实与肽接触的计算模型。为此，已经获得了针对pTyr肽的文库，其中L3、H3和L2上的残基是随机化的。从该文库获得的数据表明，与传统文库相比，针对pTyr肽的成功率是有前途的(图5)。

为了进一步证实邻近序列的侧链主要在L3和H3之间结合，将通过丙氨酸扫描来研究CDR L3和H3中的其他相互作用的氨基酸。将进行计算模型的进一步确认并查明与肽相互作用的残基，包括例如使磷酸肽和Ab复合物结晶。变体文库还将通过以下方式来制备：改变邻近沟周围的带电氨基酸以产生变体文库。这将允许扩展我们可以成功筛选的肽。

抗体文库设计

对于AXM1293(抗Myb pSer11)文库，12个残基将基于潜在的相互作用(在该肽的

内)残基及其在Kabat数据库中经测序的人Ab中的多样性而在CDR L3(按照Chothia编号的L93、L94、L95和L95A)和CDR H3(按照Chothia编号的H95、H96、H97、H98、H99、H100、H100A和H100B)中随机化。应注意的是，H95(AXM1293中的Asp)在很大程度上促进了结合袋的负电荷，该负电荷与结合表位的正电荷互补。将残基集合选择为确保针对未来靶标的电荷互补性。将平行构建至少三个到至多六个具有靶向pSer或pTyr肽的限定H2区的文库。

文库是在经修饰的pMINERVA噬菌粒系统中构建的(参见图6)。为了构建文库，使用AXM诱变修饰(图5)。AXM诱变修饰使用在Kabat数据库中选定的CDR位置处的残基的基于Kunkel的位点定向诱变。scFvs文库将作为与gpIII外壳蛋白的遗传融合体展示在噬菌体M13的表面上(图8)。由于初步文库是在没有结构模型指导的情况下设计的，因此将仅潜在的磷酸化肽接触残基随机化的更聚焦的文库可能会增强筛选效率。来自噬菌体文库的数据证明了当使用化磷酸聚焦抗体文库时增强的生物淘选结果(参见下面的表2和表3)。

表2.增强的生物淘选中的磷酸化聚焦抗体文库结果—

磷酸丝氨酸靶标

表3.增强的生物淘选中的磷酸化聚焦抗体文库结果—

磷酸酪氨酸靶标

可以使用产生重组抗体文库的附加方法。例如，也可以使用用于产生重组抗体的体内方法(图10和图14)。动物来源的磷酸化特异性抗体的数据表明，在寻找非磷酸化依赖性或丝氨酸特异性抗体时，针对6种测试RAbMab克隆的成功率为约66％。

可以在单个Ab框架中通过大量突变成功构建出高度多样化且紧凑的与自然相似的Ab文库。据估计，潜在的人Ab的所有组成成分为至少10¹¹；然而，任何一个时刻存在的Ab特异性数目都受到个体中的B细胞总数以及每个个体与抗原的相遇的限制，这在任何一个时刻中有约10⁸种不同的特异性。这是本文一个实施方式中描述的文库的多样性的百分之一。因此，通过对该文库执行一轮生物淘选，可以更好地模拟自然选择并获得结合Ab的多样性模式。即使文库的大小对于成功分离高亲和力Ab至关重要，高亲和力也不一定是成功应用Ab的先决条件。这是因为其他特性(诸如特异性、表达水平和稳定性)也很重要。

可以通过改进的亲和成熟方法进一步增强Ab的亲和力(图5)。该方法涉及通过易错PCR将多样性引入Ab基因，并通过减少抗原量来进行变体的亲和力选择。亲和成熟过程可用于改善选自中等大小的初原噬菌体文库的具有较低结合亲和力的Ab的亲和力，或用于产生“超级”Ab以用于某些应用，诸如诊断或免疫疗法。据报道，已经通过体外亲和成熟制备了亲和力(10^-11M)比可通过B细胞体内选择获得的最高亲和力(10^-10M)高大致十倍的噬菌体Ab。

实施例3—筛选文库

作为筛选实验的阳性对照，将使用为抗pSer Ab的AXM1293，其对含pSer的肽的亲和力为约1×10^-7M。初步丙氨酸扫描数据已经支持H2残基与磷酸化残基结合并与肽的主链相互作用的计算模型(图2)。数据表明(图5)甚至在较大的10¹⁰非聚焦文库中针对磷酸化结合剂富集了10⁸大小的文库。

噬菌体展示筛选

为了选择识别在翻译后修饰周围具有特定邻近序列的pSer或pTyr的scFv，将针对pSer肽和pTyr肽的集合来筛选文库。例如，Akt1 pSer473、Rb pSer780和CREB pSer133将用于pSer文库筛选，而Her2 pTyr1222、Myb pTyr11和Esr1 pTyr537将用于pTyr文库筛选。还可以筛选其他肽作为进一步的对照。

缺少磷酸基团的相同肽将作为竞争剂添加到溶液中，以选择对磷酸肽具有选择性的scFv。将通过标准噬菌体展示(图8)和使用微乳液筛选方法(图9)两者来筛选文库。使用乳液方法，可以回收更多样的结合剂集合，因为在油包水乳液中克隆是针对单独隔室内的抗原单独查询的。

将创建并筛选附加文库，其中将更改邻近序列特异性沟(context-specificgroove)附近的静电荷。

初步分析发现的抗体和抗体表征

数据分析表明，通常针对肽的Ab是肽特异性的，因为所述抗体在肽末端与羧酸根结合。其中羧酸根通常位于全长(FL)蛋白的远端。通过针对比起始结合剂长5-6个氨基酸的肽进行第二轮筛选，可以避免仅含肽的抗磷酸化氨基酸结合剂。

通常，将通过针对含pSer或pTyr的肽、它们的非磷酸化配对物以及对照肽和蛋白质的噬菌体ELISA来分析从筛选中分离的440个或更多个单独克隆。将ELISA信号比背景高>5倍且在与其非磷酸肽衍生物的竞争ELISA中至少20％的克隆在大肠杆菌中表达，并通过本领域中的方法(例如金属亲和层析)纯化。

将通过多种方法来确认可溶性scFv和IgG。例如，将使用(在可用时)可从Abcam或Cell Signaling商购获得的现有蛋白质特异性抗pSer或抗pTyr Ab确认裂解物中蛋白质的磷酸化状态。将经确认的scFv转化成IgG，并通过在CHO细胞中转染而表达(图6)。

实施例4—产生修饰特异性克隆型(MSC)

该实施例尤其描述了产生修饰特异性克隆型(MSC)的方法。如本文所用，MSC是有几个氨基酸不同并且与相同表位的翻译后修饰状态差异结合的抗体。在该实施例中，所描述的MSC是与相同表位的磷酸化状态差异结合的那些MSC。

为了找到泛磷酸结合Ab(即结合磷酸位点的两种磷酸化状态)，将使用定点诱变将不带电的氨基酸(丙氨酸或甘氨酸到结合袋内)放置在Ab磷酸位点结合袋中被确定为与磷酸根相互作用的在结构上预测的位点和通过实验确定的位点。为了发现非磷酸结合(即仅与磷酸位点处的未修饰的丝氨酸或酪氨酸结合)，将使用定点诱变以将带负电的氨基酸(天冬氨酸或谷氨酸，它们据推测会排斥结合袋处的磷酸根)放置在磷酸位点结合袋中的在结构上预测的和通过实验确定的位点处。将使用这些突变的Ab的定向进化，并将针对肽筛选这些突变的Ab，其中所述肽中的磷酸化的氨基酸现在是未修饰的。

噬菌体展示筛选、抗体表征和确认

如上文“噬菌体展示筛选”部分中所述，将使用类似的方法，不同之处在于Ab中的磷酸结合氨基酸将被特异地改变(即，变为ala、gly、asp或glu)。如果在实验条件下没有鉴定出命中，我们将改变筛选的严格度。

为了进行抗体表征，将通过针对含pSer或pTyr的肽及其非磷酸化配对物的噬菌体ELISA来分析从筛选中分离的单独克隆。为了进行抗体确认，将首先通过对蛋白质印迹针对可过表达不具有(以及具有)丝氨酸或酪氨酸磷酸化的靶蛋白的细胞裂解物进行蛋白质印迹来确认可溶性MSC scFv(参见例如图13和图19)。将使用可从Abcam和Cell Signaling商购获得的现有蛋白质特异性抗pSer或抗pTyr Ab来确认裂解物中蛋白质的磷酸化状态。例如，图19示出在敲除细胞系可用的情况下，可以产生四种不同的细胞裂解物：1)野生型(wt)人细胞裂解物，(2)敲除(KO)细胞系裂解物，(3)在SEP抑制性大肠杆菌(SEP)中表达的蛋白质X，以及(4)wt大肠杆菌菌株(SER)。如果直系同源的磷酸丝氨酸MSC抗体和丝氨酸特异性MSC抗体给出在图19中看到的模式，则这支持MSC抗体被确认的发现。在图19中，假定蛋白质X在野生型中是非磷酸化的。通过将可变重链基因和可变轻链基因克隆到我们的pMINERVA载体中并通过CHO细胞的瞬时转染表达它们，可以将经确认的scFv转化为IgG(图6)。

实施例5—定向磷酸化Ab克隆型(DPAC)

抗体的磷酸结合位点可以设计成局部模块，并用作衍生化磷酸化特异性抗体的有效手段。本文提出的策略是产生磷酸聚焦的富集噬菌体展示抗体文库，其中抗体的CDR-H2对于磷酸化偏好和磷酸化特异性结合活性保持恒定。在噬菌体生物淘选中使用该文库以使M13 gpIII蛋白质上展示的抗体针对包含预先指定的磷酸化氨基酸的合成肽。

初步DPAC研究的结果

合成了一组20对(即，由含Sep的序列和天然序列组成的对)的肽。使用AXM40文库和AXM41文库筛选出了20个Sep肽。结果显示在下表4中。

表4：来自噬菌体文库筛选的结果

随后针对非磷酸化的天然序列测试来自发现筛选的“命中”。观察到了三类命中：(i)非磷酸化依赖性的，其中Ab与磷酸肽和非磷酸肽等同地结合，(ii)磷酸化特异性的，所述命中与磷酸化肽的结合比天然肽的结合好>10倍，以及(iii)偏好磷酸化的，所述命中与磷酸肽和非磷酸肽均结合，具有对磷酸肽的>5倍的偏好性。偏好磷酸化的候选对象首先被追捕到，因为它们已经：(1)结合到天然序列，并且(2)因为它们受磷酸根的影响，所以被推测为最有可能位于Sep附近。现在将偏好磷酸化的候选对象转化为IgG，纯化，并针对全长蛋白质进行确认。如果需要的话，可以通过AXM诱变使这些发现命中亲和成熟，以衍生出对天然序列具有增大的结合亲和力的抗体。转化为IgG的scFv或Fab将得到进一步确认。

初步DPAC研究的总结.

可以使用CDR H2中的天然磷酸结合基序来有效地产生具有固有的结合磷酸化肽倾向的磷酸化聚焦文库。抗Myb Sep(Sep11)特异性scFv(AXM1293)的CDR H2中的氨基酸对于结合磷酸化的Myb_1-20肽至关重要(图13)。已经制造了几个试验文库，其中H2保持恒定，并且L3、H3和L2上的残基是随机化的。与我们的传统文库(针对相似大小的肽通常产生<50％的成功率，参见表4)相比，这些试验文库对20-25聚体磷酸化肽的成功率是有希望的(在测试的10个中有10个成功)。

图15，小图A和B示出了DPAC产生抗akt473抗体的另一个示例。图15(小图A和小图B)示出了抗akt473的发现和发现成熟(“DisMat”)。对于这项研究，针对磷酸化聚焦文库筛选与akt473位点相对应的磷酸化肽，并分离出磷酸化特异性克隆。然后将该克隆诱变，并针对未修饰的肽重新筛选。

实施例5—设计抗酶抗体立体抑制剂

该实施例描述了空间酶抑制剂的产生。在一些实施方式中，空间酶抑制剂可用于基于细胞和酶的筛选测定中。

通常难以产生针对蛋白质或肽上的特定氨基酸(或至少与该特定氨基酸相邻)的重组抗体。本文和以上实施例中描述了允许产生针对蛋白质或肽上的特定氨基酸的重组抗体的方法。如以上实施例中所述，使用基于功能的结构模型和丙氨酸扫描，已鉴定出了用于通过IgG Ab和scFv Ab进行磷酸化氨基酸和邻近序列结合的一般模式。

针对蛋白质或肽上的磷酸位点的抗体通常来源于特定的CDR-H2种系，该特定的CDR-H2种系使这些Ab倾向于与磷酸化的氨基酸结合。这些Ab经由Ab上的两个区域结合：(1)可以被视为“磷酸化特异性”结合位点区域的特定CDR-H2序列，以及(2)由其余五个CDR中的一个或多个构成的第二区域，该第二区域与“邻近”序列结合。邻近序列导致所得的Ab特异于磷酸化蛋白或磷酸化肽抗原。可以制备Ab文库，从而将负责特异性磷酸化结合活性的CDR-H2保持到恒定的氨基酸序列。CDR-H2中至少有三个特定氨基酸负责与磷酸根的相互作用，这些文库在抗磷酸化氨基酸结合方面是相对于普通筛选文库几乎一万倍(20³)富集的。

本文的一种方法是产生磷酸化聚焦的富集文库，其中CDR-H2对于磷酸化特异性结合活性保持恒定。该文库将用于噬菌体生物淘选，以使M13gpIII蛋白上展示的Ab针对含有预先指定的磷酸化氨基酸的肽。在一种补充方法中，将使用蛋白质结构分析来定义一个或多个在表面上暴露的氨基酸环，该一个或多个在表面上暴露的氨基酸环与酶活性位点相邻或(可以想象地)在酶活性位点内。由这些环序列组成的合成肽将成对合成，所述对由以下组成：(1)天然序列，以及(2)天然序列的中心氨基酸被磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸替代的肽。在一个实施方式中，环选择将偏向于其中中央氨基酸实际上是丝氨酸或酪氨酸的环。已经注意到这些氨基酸通常在蛋白质表面上存在。抗磷酸化富集的文库将首先针对含磷酸的肽进行生物淘选，以得到初始发现克隆。然后，使用定向进化，将针对天然序列来使进化抗磷酸化的Ab。最后，将测试能够结合天然非磷酸化邻近序列的这些进化的Ab抑制酶活的能力，并且(如果需要的话)进行亲和成熟以获得更高的亲和力。

在一些实施方式中，该方法还包括选择环，其中无论天然序列中存在什么氨基酸，都用磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸替代中心氨基酸。如果使用该方法的任何一个氨基酸均无法产生适当的结合剂，则这将允许针对任何给定的蛋白质序列来筛选几种肽。通过移动在肽内给定位置的上游或下游的磷酸化的氨基酸，将允许增大产生环特异性Ab的机会。

本文描述了制备抗酶抗体空间抑制剂的方法。为此，将使用基于Ab框架的磷酸化聚焦的特异性文库，该Ab框架具有结合磷酸化氨基酸的预先存在的倾向和结合邻近序列的一般模式。该磷酸化特异性文库将用于将Ab结合引导至经磷酸化修饰的肽，所述经磷酸化修饰的肽由围绕酶的活性位点的在表面上暴露环的环的氨基酸序列组成。这将允许迅速产生可用于生物化学和药理学中的可逆抑制剂。

已成功产生了针对人凝血酶蛋白的空间抑制性抗体(图3)。为此，合成了与围绕凝血酶活性位点的选定凝血酶序列的重叠部分相对应的肽。将合成的肽工程化以掺入磷酸丝氨酸(GGGSGGSWGEGCDR(pSer)GKYG)。然后使scFv命中针对天然序列(带下划线的)成熟：qmgivswgegcdrdgkygfythvfr。在所示的四种scFv结合剂中，三种(图3，小图a、b和c)抑制凝血酶活性，而选定的肽结合剂中的一个(图3，小图d)则不抑制凝血酶活性。

文库设计、文库构建、磷酸化免疫原设计、以及文库筛选

将如在上述实施例中描述地设计和构建pSer、pTyr和pSer/pTyr文库。然后使pSer、pTyr和pSer/pTyr文库与磷酸化免疫原接触。

在一些实施方式中，酶靶标将聚焦于具有以下所需特性的那些酶靶标：(i)可商购获得或相对易生产的纯化蛋白，(ii)执行相对简单的酶促测定(例如基于凝胶的测定、基于荧光的测定或比色测定，(iii)公开数据库中可得的结构信息，(iv)已知并且可用的基准抑制剂(例如，空间抑制剂)，以及(v)与活性位点几乎邻近的在表面上暴露的环，所述在表面上暴露的环含有丝氨酸或酪氨酸。在一些实施方式中，具有所有或几乎所有这些特性的蛋白质的类别包括：聚合酶、限制酶、磷酸酶、激酶、ATP酶、荧光素酶等。将使用所述酶的结构来鉴定和选择表面环。

如以上实施例中所述，可以通过亲和成熟来增强抗体的亲和力(图7)。对于筛选过程，将使用标准噬菌体展示(图8)和微乳液筛选方法(图7)两者来筛选文库。

可以根据需要将候选scFv转化为IgG(图6)。候选scFvs到IgG的这种转化使结合亲和力提高了4到10倍，这是由于IgG中scFv可变区二聚化而产生的“亲和力效应”。

在图12中呈现了使用如本文所述的噬菌体衍生的IgG抗体产生的示例性抗体。例如，如图12所示，根据本文所述方法从噬菌体衍生的IgG抗体获得的抗体已在免疫组织化学应用(图12，小图A)、蛋白质印迹应用(图12，小图B)、流式细胞术应用(图12，小图C)，以及染色质免疫沉淀测定(ChiP)(图12，小图C)中得到了确认。

图12，小图A示出了针对SK-N-SH(人成神经细胞瘤细胞系)细胞中的髓磷脂碱性蛋白构建的抗体的代表性免疫组织化学应用。将细胞用4％甲醛固定(10min)，用0.1％TritonX-100透化5分钟，然后用0.1％PBS-Tween中的1％BSA/10％正常驴血清/0.3甘氨酸封闭1小时。然后将细胞与浓度为5μg/ml的ab209328一起在+4℃下孵育过夜，然后用1/2000稀释度的驴抗人(Alexa Fluor 488)二级Ab检测(以绿色示出)。将核DNA用DA(以蓝色示出)R和1/250稀释度的α微管蛋白小鼠单克隆抗体ab195889(Alexa Fluor 594)(以红色示出)标记。

图12，小图B示出了使用抗组蛋白H2B抗体的代表性蛋白质印迹。所有泳道：0.25μg/ml的抗组蛋白H2B Ab[IGX4228R-1](ab213225)。泳道1：0.5μg的CTH(小牛胸腺组蛋白)。泳道2：20μg的HeLa(人上皮癌细胞系)全细胞裂解液物。泳道3：10μg的HeLa(人上皮癌细胞系)核裂解物。泳道4：20μg的NIH 3T3(小鼠胚胎成纤维细胞系)全细胞裂解物。泳道5：10μg的NIH 3T3(小鼠胚胎成纤维细胞系)核裂解物。泳道6：0.1μg的组蛋白H2B重组蛋白。泳道7：0.1μg的组蛋白H3重组蛋白。1/50000稀释度的二次过氧化物酶亲和纯化山羊抗兔IgG(H+L)。使用ECL技术开发。在还原条件下执行。预测条带大小：14kDa，观察到的条带大小：17kDa。曝光时间：1分钟。该印迹法是在MES缓冲液体系下使用4-12％的Bis-tris凝胶产生的。使凝胶在200V下运行35分钟，然后转移到30V下的硝酸纤维素膜上70分钟。然后将膜用3％牛奶封闭一个小时，然后在4℃下与ab213225一起孵育过夜。使用ECL开发溶液ab133406将Ab结合可视化。

图12，小图C示出了使用抗NTSR抗体的代表性流式细胞术曲线。简而言之，将过表达GPCR NTSR1的细胞系(黑色)和阴性对照裸细胞系(上部为蓝色，以及底部为紫色)与荧光素化的NTSR1配体(顶部)或scFv E1(底部)混合，并进行流式细胞分析。

图12，小图D示出了使用噬菌体衍生的IgG抗体的代表性染色质免疫沉淀结果(ChIP)。简言之，根据Abcam X-ChIP方案从HeLa细胞制备染色质。用甲醛将细胞固定10分钟。用25μg染色质、2μg ab213288(蓝色)和20μl的蛋白质A/G琼脂糖珠粒来执行ChIP。珠粒对照物中不添加Ab(黄色)。通过实时PCR(Taqman方法)定量免疫沉淀的DNA。引物和探针位于转录区的第一kb中。

实施例7：设计抗独特型的抗体和酶抑制性抗体

该实施例描述并证明了抗独特型的抗体的产生。该实施例还描述并证明了抑制分选酶、凝血酶和淀粉酶的酶抑制性抗体的产生(图11，小图D)。作为概念的证明而选择了这些酶，然而，如本领域的普通技术人员应理解的，本文提出的方法也可以应用于靶向本领域已知的其他酶或其他抗体(例如抗独特型的抗体)。

构建针对选定抗体的抗独特型的抗体(图11，小图AC)。抗独特型的抗体和酶抑制性抗体均是使用与图2所示流程图相同的工作流程构建的。简言之，为了产生抗独特型的抗体，选择来自CDR H3和CDR L3的碱基序列以产生分离的经修饰的肽。将经修饰的肽合成为在其序列内包含磷酸丝氨酸。针对经修饰的肽来筛选噬菌体文库，从而分离出特异于所选抗体的CDRH3的抗体，由此产生抗独特型的抗体。结合测定显示了抗独特型的抗体的结合(图11，小图A-C)。

使用本文所述和图2中描绘的方法，还产生了针对以下酶靶标的抗体：分选酶、凝血酶和淀粉酶。从分离的抗体获得结合测定，并在与所产生的分离的抗体(即分选酶、凝血酶和淀粉酶)接触时确认结合和酶抑制(图11D)。

实施例8：延迟乳液感染(DEI)：重组生物淘选策略

图16，小图A示出了说明延迟乳液感染的示意图。

重组生物淘选策略.简言之，DEI生物淘选策略总结如下。使在大肠杆菌表面展示的具有约104种不同Ag的Lpp'ompA融合体文库在16℃下生长以抑制F菌毛(细胞表面上的M13受体)表达和克隆扩增。将复杂度>1010的噬菌体展示Ab文库与散装溶液中的细菌文库混合达足以使Ag-Ab相互作用发生的时间段，然后洗涤以去除任何未附着的噬菌体。加入胰蛋白酶(以从gpIII蛋白中特异性切割Ab以实现增加的特异性和增大的分离效率)，并通过涡旋混合物以将细胞(和任何附着的噬菌体)封装在油包水乳液的单独液滴中来使所述细胞快速隔室化。将乳液变化至37℃以诱导F菌毛的表达和噬菌体颗粒的分离。分离的噬菌体经由诱导的F菌毛来感染细菌。将乳液破乳，并且使细胞在LB+Cam平板上生长以防止克隆扩增。从库中分离出质粒DNA。使用PCR扩增介于scFv基因的5'侧与表位的3'侧之间的DNA区域。然后通过下一代测序分析PCR产物。在重叠群装配后，使用编码到Ab和表位恒定区两者中的条形码来鉴定特异性克隆。可以使用表位特异性引物来扩增针对特定表位的抗体。可以使用独特的条形码互补引物对来扩增特异性抗体。也可以将特异性抗体亚克隆到合适的表达系统中。将一个条形码放置在scFv基因的5'末端，并将第二个条形码放置在表位基因的3'。

DEI研究总结

使用一组18种肽对DEI进行建模。使用下一代测序(“NGS”)和条形码方案来处理数百万个HiSeq测序读段。在大肠杆菌中产生聚焦磷酸化的文库时，非特异性结合到大肠杆菌细胞表面的噬菌体被剔除并大大减少。还执行了生物信息学分析，所述生物信息学分析包括将来自单个靶标Ag的命中与所有其余Ag的组合进行比较，以减少实验中的噪音。在单个多重筛选中使用针对所有Ag的相同文库允许在计算机上可视化结合至靶标N和两种类型的非靶标N类序列(非特异性且富含其他所有序列)的克隆。

在图17中示出了与DEI相关的细菌展示系统的实施方式。如图17中所示，与DEI相关的细菌展示系统的一个实施方式是Lpp-OmpA细菌展示系统。

对DEI系统的初步观察表明，生长温度对M13的感染能力具有直接影响(图16，小图B)。

在图17中示出了与DEI相关的细菌展示系统的实施方式。

已经从大肠杆菌表面上的18种单独展示的肽的多重性获得了结果。如图18(小图A和小图B)所示，结果显示了前10个肽的超过100万个抗体下一代序列读段。从这项研究中获得的数据显示，来自该分析的三个“类别”的分组是：1)富集的靶标1特异性scFv；2)非特异性scFv；3)富集的所有其他scFv。

等同物和范围

本领域的技术人员将认识到，或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的特定实施方式的许多等同方案。本发明的范围不旨在限于以上描述，而是如以下权利要求书中所述：

Claims

1.一种产生抗体的方法，所述抗体不依赖于翻译后修饰(PTM)状态地识别PTM位点，所述方法包括：

提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；

鉴定所述抗体的PTM结合袋；

通过使所述PTM结合袋内或外的与PTM位点附近的邻近序列结合的一个或多个区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；

针对无PTM的感兴趣的肽或蛋白质筛选所述文库，从而鉴定泛PTM结合抗体。

2.一种产生识别翻译后修饰(PTM)位点的抗体的方法，所述方法包括：

提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；

鉴定所述抗体的PTM结合袋；

在所述抗体的PTM结合袋内的被确定为与所述PTM相互作用的一个或多个位点处引入不带电的氨基酸；

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PTM位点是天然存在的PTM位点。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述PTM位点是经工程化的PTM位点。

5.根据权利要求4所述的方法，其中通过位点特异性诱变将所述经工程化的PTM位点引入感兴趣的肽或蛋白质中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述位点特异性诱变包括一个点突变、一系列点突变、缺失或插入。

7.根据权利要求6所述的方法，其中通过所述感兴趣的肽或蛋白质中的一个或多个氨基酸替换来引入所述经工程化的PTM位点。

8.根据权利要求6所述的方法，其中通过将一个或多个氨基酸插入所述感兴趣的肽或蛋白质中来引入所述经工程化的PTM位点。

9.根据权利要求8所述的方法，其中插入所述感兴趣的肽或蛋白质中的一个或多个氨基酸包括约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体识别PTM位点而不论修饰状态如何。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗体依赖于修饰状态识别PTM位点。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述修饰状态是没有PTM。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PTM结合袋内的所述一个或多个位点是通过结构预测的。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PTM结合袋内的所述一个或多个位点是通过实验确定的。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不带电的氨基酸是丙氨酸或甘氨酸。

16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不带电的氨基酸是通过诱变引入的。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述诱变是位点诱变或随机诱变。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PTM是带负电的、带正电的、亲水的和/或疏水的。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PTM是磷酸化。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述PTM是糖基化。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述糖基化是唾液酸化、乙酰化或甲基化。

22.一种产生在不存在翻译后修饰的情况下特异性结合PTM位点的非PTM结合抗体的方法，所述方法包括：

提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；

鉴定所述抗体的PTM结合袋；

通过使所述PTM结合袋内或外的与所述PTM位点附近的邻近序列结合的一个或多个区域随机化来产生包含候选非PTM结合抗体的文库；

针对无PTM的感兴趣的肽或蛋白质筛选所述文库，从而鉴定非PTM结合抗体。

23.一种产生在不存在翻译后修饰的情况下特异性结合PTM位点的非PTM结合抗体的方法，所述方法包括：

提供特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的抗体；

鉴定所述抗体的PTM结合袋；

在所述抗体的PTM结合袋内的被确定为与所述PTM相互作用的一个或多个位点处引入排斥所述PTM的氨基酸；

通过使所述PTM结合袋外的与所述PTM位点附近的邻近序列结合的一个或多个区域随机化来产生包含候选非PTM结合抗体的文库；以及

24.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述PTM位点是天然存在的PTM位点。

25.根据权利要求22或23所述的方法，其中所述PTM位点是经工程化的PTM位点。

26.根据权利要求25所述的方法，其中通过位点特异性诱变将所述经工程化的PTM位点引入感兴趣的肽或蛋白质中。

27.根据权利要求25所述的方法，其中所述位点特异性诱变包括一个点突变、一系列点突变、缺失或插入。

28.根据权利要求27所述的方法，其中通过所述感兴趣的肽或蛋白质中的一个或多个氨基酸替换来引入所述经工程化的PTM位点。

29.根据权利要求27所述的方法，其中通过将一个或多个氨基酸插入所述感兴趣的肽或蛋白质中来引入所述经工程化的PTM位点。

30.根据权利要求31所述的方法，其中插入所述感兴趣的肽或蛋白质中的所述一个或多个氨基酸包括约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。

31.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述PTM结合袋内的一个或多个位点是通过结构预测的。

32.根据权利要求22-30中任一项所述的方法，其中所述PTM结合袋内的一个或多个位点是通过实验确定的。

33.根据权利要求22-32中任一项所述的方法，其中所述PTM是带负电的。

34.根据权利要求22-33中任一项所述的方法，其中所述PTM是磷酸化。

35.根据权利要求22-33中任一项所述的方法，其中所述PTM是糖基化。

36.根据权利要求35所述的方法，其中所述糖基化是唾液酸化。

37.根据权利要求23-36中任一项所述的方法，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是带负电的氨基酸。

38.根据权利要求37所述的方法，其中所述带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

39.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述PTM是带正电的。

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述PTM是视黄基席夫碱形成或精氨酰化。

41.根据权利要求39或40所述的方法，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是带正电的氨基酸。

42.根据权利要求41所述的方法，其中所述带正电的氨基酸是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

43.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是非经典氨基酸。

44.根据权利要求43所述的方法，其中所述非经典氨基酸是磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对叠氮基-苯丙氨酸、苯甲酰基-苯丙氨酸，或乙酰基赖氨酸。

45.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是通过抑制性tRNA引入的。

46.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述PTM是疏水的。

47.根据权利要求46所述的方法，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是亲水的。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述亲水的氨基酸是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

49.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述PTM是亲水的。

50.根据权利要求49所述的方法，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是疏水的。

51.根据权利要求50所述的方法，其中所述疏水的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸。

52.根据权利要求23-51中任一项所述的方法，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是通过诱变引入的。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述诱变是位点诱变或随机诱变。

54.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述邻近序列包含所述PTM位点的上游或下游的3-15个残基。

55.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中通过易错滚环扩增(RCA)将所述PTM结合袋外的与邻近序列结合的所述一个或多个区域随机化。

56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在不改变所述PTM结合袋的情况下，使所述PTM结合袋外的与邻近序列结合的所述一个或多个区域随机化。

57.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含候选泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的所述文库是噬菌体展示文库。

58.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含候选泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的所述文库具有至少10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²的多样性。

59.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中筛选所述文库的步骤包括全细胞淘选。

60.根据权利要求59所述的方法，其中所述全细胞淘选是基于乳液的。

61.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括确认鉴定的所述泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的步骤。

62.根据权利要求61所述的方法，其中所述确认步骤是高通量的。

63.根据权利要求62所述的方法，其中所述PTM是磷酸化，并且所述高通量确认步骤涉及使用将磷酸丝氨酸或磷酸酪氨酸掺入到可抑制的琥珀(UAG)终止密码子中的细胞系，从而产生磷酸化蛋白质以用于确认泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。

64.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞系是大肠杆菌(E.coli)。

65.根据权利要求63所述的方法，其中所述细胞系是昆虫细胞系。

66.根据权利要求61所述的方法，其中通过功能测定确认所鉴定的所述泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。

67.根据权利要求61-66中任一项所述的方法，其中所述确认泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体的步骤包括将scFv转化为IgG。

68.根据权利要求61-66中任一项所述的方法，其中所述确认步骤包括确定所鉴定的所述泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体是否是针对PTM的空间抑制性抗体。

69.一种产生针对酶的空间抑制性抗体的方法，所述方法包括：

提供特异性识别感兴趣的酶上的PTM的抗体；

鉴定所述抗体的PTM结合袋；

通过使所述PTM结合袋内或外的与所述酶上的PTM位点结合的一个或多个区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；

针对所述感兴趣的酶筛选所述文库，以及选择在无PTM修饰的情况下识别所述PTM位点的抗体；

以及通过执行酶活测定来选择空间抑制性抗体。

70.一种产生针对酶的空间抑制性抗体的方法，所述方法包括：

工程化感兴趣的酶上的PTM位点；

提供特异性识别所述感兴趣的酶上的经工程化的所述PTM位点的抗体；

鉴定所述抗体的PTM结合袋；

通过使所述PTM结合袋内或外的与所述酶上的经工程化的所述PTM位点结合的一个或多个区域随机化来产生包含候选泛PTM结合抗体的文库；

针对不具有经工程化的所述PTM位点的所述感兴趣的酶来筛选所述文库，以及选择在无经工程化的所述PTM位点的情况下识别所述抗体的抗体；

以及通过执行酶活测定选择空间抑制性抗体。

71.根据权利要求69所述的方法，其中所述PTM是天然存在的PTM位点。

72.根据权利要求69所述的方法，其中所述PTM位点是经工程化的PTM位点。

73.根据权利要求70或72所述的方法，其中通过位点特异性诱变将所述经工程化的PTM位点引入所述感兴趣的酶中。

74.根据权利要求73所述的方法，其中所述位点特异性诱变包括一个点突变、一系列点突变、缺失或插入。

75.根据权利要求73所述的方法，其中通过所述感兴趣的酶中的一个或多个氨基酸替换来引入所述经工程化的PTM位点。

76.根据权利要求75所述的方法，其中通过将一个或多个氨基酸插入所述感兴趣的酶中来引入所述经工程化的PTM位点。

77.根据权利要求76所述的方法，其中插入所述感兴趣的酶中的所述一个或多个氨基酸包括约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸。

78.一种抗体，所述抗体是根据权利要求69-77中任一项所述的方法产生的感兴趣的酶的空间抑制剂。

79.一种使用权利要求69-78中任一项所述的抗体抑制感兴趣的酶的方法。

80.一种根据前述权利要求中任一项的方法产生的泛PTM结合抗体或非PTM结合抗体。

81.一种泛PTM结合抗体文库，所述泛PTM结合抗体文库包括衍生自特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的预先存在的抗体的多种抗体，其中所述多种抗体包含PTM结合袋和与PTM位点附近的邻近序列结合的一个或多个随机化区域。

82.根据权利要求80-81中任一项所述的泛PTM结合抗体文库，其中所述PTM结合袋包含在被确定为与所述PTM相互作用的一个或多个位点处的不带电的氨基酸。

83.根据权利要求82所述的泛PTM结合抗体文库，其中所述不带电的氨基酸是丙氨酸或甘氨酸。

84.根据权利要求80-83中任一项所述的泛PTM结合抗体文库，其中所述PTM是磷酸化。

85.根据权利要求80-83中任一项所述的泛PTM结合抗体文库，其中所述PTM是糖基化。

86.根据权利要求85所述的泛PTM结合抗体文库，其中所述糖基化是唾液酸化。

87.一种非PTM结合抗体文库，所述非PTM结合抗体文库包括衍生自特异性识别感兴趣的肽或蛋白质上的PTM的预先存在的抗体的多种抗体，其中所述多种抗体包含PTM结合袋和与PTM位点附近的邻近序列结合的一个或多个随机化区域，其中所述PTM结合袋包含在被确定为与所述PTM相互作用的一个或多个位点处的排斥所述PTM的氨基酸。

88.根据权利要求87所述的非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是带负电的。

89.根据权利要求88所述的非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是磷酸化。

90.根据权利要求88所述的非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是糖基化。

91.根据权利要求90所述的非PTM结合抗体文库，其中所述糖基化是唾液酸化。

92.根据权利要求87-91中任一项所述的非PTM结合抗体文库，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是带负电的氨基酸。

93.根据权利要求92所述的非PTM结合抗体文库，其中所述带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

94.根据权利要求87所述的非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是带正电的。

95.根据权利要求94所述的非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是视黄基席夫碱形成或精氨酰化。

96.根据权利要求94或95所述的非PTM结合抗体文库，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是带正电的氨基酸。

97.根据权利要求96所述的非PTM结合抗体文库，其中所述带正电的氨基酸是赖氨酸、精氨酸或组氨酸。

98.根据权利要求87所述的非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是疏水的。

99.根据权利要求98所述的非PTM结合抗体文库，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是亲水的。

100.根据权利要求99所述的非PTM结合抗体文库，其中所述亲水的氨基酸是精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸。

101.根据权利要求87所述的非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是亲水的。

102.根据权利要求101所述的非PTM结合抗体文库，其中排斥所述PTM的所述氨基酸是疏水的。

103.根据权利要求102所述的非PTM结合抗体文库，其中所述疏水的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸或色氨酸。

104.根据权利要求80-103中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述PTM是磷酸化，并且所述预先存在的抗体结合磷酸化的Ser(pSer)和/或磷酸化的Tyr(pTyr)。

105.根据权利要求80-104中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述PTM结合袋包含CDR H2区和/或CDR L2区。

106.根据权利要求80-105中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述一个或多个随机化区域结合邻近序列，所述邻近序列包含在所述PTM位点上游或下游的3-15个残基。

107.根据权利要求80-106中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述一个或多个随机化区域包含随机化的CDR H3或CDR L3。

108.根据权利要求80-107中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述PTM结合袋包含CDR H2区，并且所述一个或多个随机化区域包含随机化的CDR H3、CDR L3和/或CDR L2。

109.根据权利要求80-108中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述一个或多个随机化区域是通过定点诱变产生的。

110.根据权利要求80-108中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述一个或多个随机化区域是通过易错RCA产生的。

111.根据权利要求80-108中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述一个或多个随机化区域是通过丙氨酸和/或组氨酸扫描产生的。

112.根据权利要求80-111中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述文库选自由以下项组成的组：噬菌体展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、核糖体展示文库和mRNA展示文库。

113.根据权利要求80-112中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述文库包含选自抗体片段的多种抗体。

114.根据权利要求80-113中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述文库包含选自scFv、Fab、Fab’s、Fv或IgG的多种抗体。

115.根据权利要求114所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述文库是scFv文库。

116.根据权利要求115所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述scFv文库是M13 scFv文库。

117.根据权利要求80-116中任一项所述的泛PTM结合抗体文库或非PTM结合抗体文库，其中所述文库具有大于10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²的多样性。

118.一种产生针对感兴趣的肽的抗体的方法，所述方法包括：

提供经修饰的感兴趣的肽，所述经修饰的感兴趣的肽经修饰以包含带负电的氨基酸，

针对偏向所述带负电的氨基酸的抗体文库筛选所述经修饰的肽，

分离与所述经修饰的感兴趣的肽结合的一种或多种抗体；以及

测定所述一种或多种抗体与无所述修饰的所述感兴趣的肽的结合，从而鉴定与所述感兴趣的肽结合的抗体。

119.一种产生针对感兴趣的肽的抗体的方法，所述方法包括：

分离与所述经修饰的感兴趣的肽结合的一种或多种抗体；

通过亲和成熟产生所述一种或多种抗体的克隆型的文库；

针对无所述修饰的感兴趣的肽筛选所述克隆型的文库，从而鉴定与所述感兴趣的肽结合的抗体。

120.根据权利要求118或119所述的方法，其中所述带负电的氨基酸是磷酸化的氨基酸。

121.根据权利要求120所述的方法，其中所述磷酸化的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)或磷酸酪氨酸。

122.根据权利要求120或121所述的方法，其中所述磷酸化的氨基酸是磷酸丝氨酸(SEP)。

123.根据权利要求120或121所述的方法，其中所述磷酸化的氨基酸是磷酸酪氨酸。

124.根据权利要求118或119所述的方法，其中所述带负电的氨基酸是天冬氨酸或谷氨酸。

125.根据权利要求118-124中任一项所述的方法，其中所述带负电的氨基酸替换所述感兴趣的肽内的天然存在的氨基酸。

126.根据权利要求118-125中任一项所述的方法，其中所述抗体文库是偏向磷酸的抗体文库。

127.根据权利要求126所述的方法，其中所述偏向磷酸的抗体文库选自噬菌体展示文库、细菌展示文库、酵母展示文库、核糖体展示文库或mRNA展示文库。

128.根据权利要求127所述的方法，其中所述抗体文库是噬菌体展示文库。

129.根据权利要求118-128中任一项所述的方法，其中所述抗体文库包含选自抗体片段的多种抗体。

130.根据权利要求118-129中任一项所述的方法，其中所述抗体文库包含选自scFv、Fab、Fab’s、Fv或IgG的多种抗体。

131.根据权利要求118-130中任一项所述的方法，其中所述抗体文库是scFv文库。

132.根据权利要求131所述的方法，其中所述scFv文库是M13 scFv文库。

133.根据权利要求118-132中任一项所述的方法，其中所述抗体文库具有约或大于10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹或10¹²的多样性。

134.根据权利要求118-133中任一项所述的方法，其中所述抗体文库具有约或小于10¹³、10¹²、10¹¹或10¹⁰的多样性。

135.根据权利要求118-134中任一项所述的方法，其中所述方法还包括与所述感兴趣的肽结合的所述抗体的亲和成熟。

136.根据权利要求119-135中任一项所述的方法，其中所述亲和成熟是通过定向进化执行的。

137.根据权利要求119-136中任一项所述的方法，其中所述亲和成熟包括将与所述经修饰的肽结合的所述一种或多种抗体的CDR-H2区域和/或CDR-L2区域之外的序列随机化的步骤。

138.根据权利要求119-137中任一项所述的方法，其中所述亲和成熟包括易错PCR诱变。

139.根据权利要求118-138中任一项所述的方法，其中对全细胞、细胞片段或分离的蛋白质执行每个所述筛选步骤。

140.根据权利要求118-139中任一项所述的方法，其中每个所述筛选步骤包括全细胞淘选。

141.根据权利要求140所述的方法，其中所述全细胞淘选是基于乳液的。

142.根据权利要求141所述的方法，其中所述基于乳液的筛选是延迟乳液感染(DEI)。

143.根据权利要求118-142中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的肽基于感兴趣的蛋白质的表位。

144.根据权利要求143所述的方法，其中所述表位在所述感兴趣的蛋白质的胞外域中。

145.根据权利要求143或144所述的方法，其中所述表位是线性表位。

146.根据权利要求143或144所述的方法，其中所述表位是构象表位或不连续表位。

147.根据权利要求118-146中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的肽包含约介于5个与30个之间的氨基酸。

148.根据权利要求118-147中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的肽包含约介于10个与20个之间的氨基酸。

149.根据权利要求118-148中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的肽包含在所述感兴趣的蛋白质的外部结构域中每第3个、第4个、第5个、第6个、第7个、第8个、第9个或第10个氨基酸周围的序列。

150.根据权利要求118-149中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的肽包含在所述感兴趣的蛋白质的外部结构域中每第5个氨基酸周围的序列。

151.根据权利要求118-150中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的肽不包含糖基化位点。

152.根据权利要求143-151中任一项所述的方法，其中所述感兴趣的蛋白质是细胞表面受体。

153.根据权利要求152所述的方法，其中所述细胞受体是G蛋白偶联受体(GPCR)、酶偶联受体或配体门控离子通道受体。

154.根据权利要求152所述的方法，其中所述细胞受体是瘦素受体、胰高血糖素受体、胰岛素受体、CXCR4、NTSR1、NTSR2或受体酪氨酸激酶。

155.根据权利要求143-154中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测试所述抗体是否结合至所述感兴趣的蛋白质的步骤。

156.根据权利要求143-155中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测试所述抗体是否抑制所述感兴趣的蛋白质的功能的步骤。

157.根据权利要求156所述的方法，其中所述抗体通过竞争性抑制来抑制所述感兴趣的蛋白质的所述功能。

158.根据权利要求157所述的方法，其中所述抗体通过非竞争性抑制来抑制所述感兴趣的蛋白质的所述功能。

159.根据权利要求158所述的方法，其中所述非竞争性抑制是变构抑制。

160.根据权利要求143-155中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测试所述抗体是否增强所述感兴趣的蛋白质的功能的步骤。

161.一种产生抑制感兴趣的蛋白质的抗体的方法，所述方法包括：

基于来自感兴趣的蛋白质的序列合成肽，其中所述序列经修饰以包含带负电的氨基酸，

根据前述权利要求中任一项所述的方法鉴定与所述肽结合的抗体；以及

测试所述抗体是否抑制所述感兴趣的蛋白质的功能。

162.根据权利要求161所述的方法，其中所述方法还包括确定所述抗体是否在空间上抑制所述感兴趣的蛋白质的步骤。