KR102216032B1 - 합성 항체 라이브러리의 생성 방법, 상기 라이브러리 및 그 적용(들) - Google Patents

합성 항체 라이브러리의 생성 방법, 상기 라이브러리 및 그 적용(들) Download PDF

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안쿠리나 샤르마
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Abstract

본 발명은 코돈 치환 기술을 사용하여 컨센서스 핵산 서열의 풀상에 구축된 합성 항체 유전자 발현 라이브러리에 한정되지 않는, 항체 라이브러리의 생성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 생성된 합성 항체 라이브러리 및 상기 항체 라이브러리의 적용(들)에 관한 것이다.

Description

합성 항체 라이브러리의 생성 방법, 상기 라이브러리 및 그 적용(들)
본 발명은 일반적으로 생명 공학, 유전 공학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 코돈 치환 기술을 사용하여 컨센서스 핵산 서열의 풀 상에 구축된 합성 항체 유전자 발현 라이브러리에 한정되지 않는, 항체 라이브러리의 생성 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용함으로써 생성되는 합성 항체 라이브러리 및 상기 항체 라이브러리의 적용(들)에 관한 것이다.
가장 빈번하게 발견되는 재배열된 항체를 갖는 인간 면역 글로불린 (Ig) 유전자의 집합체인 인간 항체 레퍼토리는, 잘 발현되고 모든 경쇄 (Vk 및 Vλ와 상황 의존적 방식으로 쌍을 이루는 인간 가변-중쇄 (VH) 세그먼트를 포함한다. 자연 면역계에서, 유전자의 재배열을 통한 이러한 다양성 (diversity)은 B 림프구 성숙 과정에서 규칙적인 방식으로 일어난다. 항원 독립적 프로세스로 인해 발생하는 나이브 다양성은 B 림프구를 함유하는 표면 항체가 중간 정도의 친화성을 갖는 항원을 만났을 때 더 발달한다. 따라서 T 세포와 협력하여, 처녀 B 세포의 성숙 B 세포로의 활성화, 성숙 및 분화 과정은 B 세포의 증식, 항체의 분비, IgG의 생성, 체세포 초돌연변이 및 기억 B 세포의 생성을 초래한다.
인간 단일클론 항체 (mAb) 및 이들의 유도체는 생물 의약 산업에서 가장 빠르게 성장하는 분야 중 하나이다. 항체의 생성 및 발현을 위한 재조합 DNA 기술의 최근 적용은 산업계 및 학계의 과학자들 사이에서 상당한 관심을 모았다.
키메라, 인간화 및 인간 mAb, 즉 일반적인 포맷의 치료용 mAb는 인간의 불변 도메인을 공유하고 있지만 이들의 가변 도메인의 기원에 의해 식별된다. 인간 mAb는 전적으로 인간 항체 레퍼토리로부터 유래된 일련의 가변 도메인을 가진다. 키메라 항체는 항-항체 반응을 초래할 수 있는 인간 코돈 용법을 사용하여 인위적으로 개발된다. 이는 초기 단일클론 항체 요법의 가장 중요한 치료적 한계 중 하나이다. 또한, 면역 반응의 이러한 개발은 예컨대, 감소된 표적 결합, 변경된 클리어런스 및 약동학 등 그 효능 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다. 뿐만 아니라, 상기 항체의 인간화 프로세스 또는 CDR 서열의 접목으로부터 생산된 인간화 항체는 모체 항체와 다르게 항원에 결합한다. 따라서, 인간 단일클론 항체는 일반적으로 비인간 항체 레퍼토리의 단일클론 항체에 비하여 보다 우수한 약동학 (pharmacokinetic) 및 약역학 (pharmacodynamic) 특성을 가지는 것으로 여겨진다. 인간화 mAb의 면역원성은 비인간 및 키메라 단일클론 항체에 비하여 실질적으로 작다.
면역화 기술 및 뮤린 (murine) 하이브리도마 기술 등의 접근법은 전통적으로 항체 생성을 위해 발전해왔다. 그러나, 면역화의 한계는 약물 분자 개발의 유용성과 효능에 직접적으로 영향을 미치는 안전성 및 약동학적 성질에 있었다. 하이브리도마 기술의 한계는 마우스에서의 항원 독성 또는 비면역원성에 있었다. 인간 및 개별 뮤린 항원 사이의 높은 서열 상동성을 고려하면, 자가 항원에 대한 항체의 생성은 어려울 수 있다.
더 상세하게, 하이브리도마 기술과 관련된 한계는 다원적이다. 항체가 형성되는 에피토프에 대한 어떠한 제어 장치도 존재하지 않는다. 항체는 연구자가 원하는 특성을 가지도록 생성되기를 희망하며 생성된 후, 광범위하게 스크리닝되어야 한다. 또한, 민감성 항원 (예컨대, 막 단백질 및 핵산)은 동물 내에서 파괴될 수 있는 반면, 독성 항원은 동물을 죽일 수 있다. 인간과 마우스 사이의 높은 서열 상동성을 고려하면, 개별 뮤린 항원은 자가 항원에 대한 항체의 생성이 어려울 수 있는 마우스 내에서 비면역원성을 일으킬 수 있다. 보다 높은 친화도를 나타내는 특성들을 이론적으로 도입하는 면에서, 항체의 추가적인 개발 범위는 극히 제한되어 있으며 어렵다.
합성 다양성은 면역화 및 클론 선택 후 면역 글로불린에서 보이는 돌연변이의 패턴을 모방한다. 따라서, 합성 라이브러리는 기본적으로 라이브러리를 구축 및 개발하는 데 사용되는 서열의 기원에 있어 면역 또는 나이브 라이브러리와 차이가 있다. 합성 라이브러리에서 항체 다양성은 인실리코 (in silico)로 설계되고 통제된 방식으로 합성되는 한편, 나이브 라이브러리는 천연 공급원으로부터 증폭되며 다양성은 무작위적이다. 자연적으로 유래된 및 합성적으로 설계된 세그먼트의 비율은, 반-합성에서 완전 합성에까지 이르는 라이브러리를 나타내는 각각의 라이브러리에 따라 다르다.
많은 다양한 합성 항체 라이브러리를 개발하기 위하여, 아미노산의 위치 및 조성 편차에 대한 이해를 길이 변화에 대한 관련 정보와 함께 연구할 수 있다. 또한, 합성 항체 레퍼토리의 다양성은 항체-항원 상호 작용의 구조-기능 연구에 의해 인도되는 이론적 설계에 전적으로 의존한다. 1992 년에, 49 개의 VH 서열 및 단일 Vλ경쇄 서열을 포함하는 반-합성 scFv-항체 파지 디스플레이 라이브러리가 Hoogenboom 및 Winter에 의해 개발되었으며, 여기서 CDR-H3 영역의 5 내지 8 개의 잔기가 PCR-기반 접근법을 통해 무작위화되어 1 × 107 크기의 라이브러리가 생성되었다. 후속 라이브러리는 26 개의 카파 및 21 개의 람다 서열의 첨가로 구축되었다. 길이 가변성으로 매개된 다양성이 CDR-H3의 4-12 개 잔기, 카파 CDR-L3의 1-3 개 잔기 및 람다 CDR-L3의 0-5 개 잔기의 무작위화를 통해 라이브러리에 도입되어, 라이브러리 크기를 6.5 × 1010까지 확장시켰다. 연구자들은 인풋 라이브러리의 예상을 뛰어 넘는, 선택 후 특정 프레임워크 (주로 VH1 및 VH3)가 파지 디스플레이 플랫폼에서 과하게 나타난 것을 관찰하였다. 이러한 관찰은 사용 빈도와 안정성 및/또는 발현 수준에 기초하여 중쇄 및 경쇄 서열을 동정/선택하는 단일 컨센서스 수용체 서열의 개발을 촉진하였다.
나이브 라이브러리와 달리, 선택적 결합은 라이브러리의 항체 능력을 저해하는 단일 프레임워크 영역에서의 변경을 통해 도입되어 모든 유형의 항원을 결합시킬 수 있다. 다양한 포맷 중에서, 단일 사슬 항체 (scFv) 또는 Fab를 코딩하는 유전자는 PCR을 사용한 중쇄 및 경쇄 V-유전자의 무작위적인 조합에 의해 생성되었고, 조합 라이브러리는 파지의 표면에 디스플레이하기 위하여 파지미드 또는 효모에 클로닝될 수 있었다. 또는, 라이브러리는 중쇄 또는 경쇄 도메인의 상보성 결정 영역 (CDR)으로 돌연변이를 인공적으로 도입함으로써 얻을 수 있다. 중쇄 CDR3은 항원 결합에 있어 중요한 기여자이며, 천연 항체의 CDR 중에서 가장 가변성이다. 가변성 중쇄 유전자의 CDR3은 크기 및 서열이 다양하며 V-D-J 세그먼트의 재배열은 항체 다양성에서 지배적인 역할을 한다. 나이브 라이브러리는 축퇴 프라이머를 사용하여 구축된 한편, 합성 라이브러리는 CDR3 아미노산 조성의 무작위화를 통해 만들어졌다. 여러 연구들은, 중쇄 CDR3에 변이가 있는 중간 크기의 라이브러리 (5X107의 구성원들)가 신규한 항체 특이성의 성공적인 동정을 제공하였음을 보여주었다. 50 개 VH의 4 내지 21 개 잔기 및 49 개의 상이한 VH 유전자의 6 내지 15 개 잔기의 중쇄 CDR3 서열 길이를 갖는 108 개 이상 분자의 큰 라이브러리는 상이한 특이성을 갖는 항체 단편을 선택할 수 있도록 하였다. De Kruif와 공동연구자들이 수행한 작업은 6 내지 15 개 잔기의 범위의 CDR-H3 길이 가변성을 갖는 7 개의 상이한 경쇄 유전자 (가변성 카파에서 4 개, 가변성 람다에서 3 개) 및 49 개의 모든 인간 생식 계열 VH 유전자를 성공적으로 사용하여 3.6 × 108의 라이브러리를 구축하였다. 이 접근법은 6 개 아미노산 길이의 더 짧은 CDR-H3의 완전한 무작위화를 포함하며, 더 긴 CDR-H3의 경우, 상기 설계는 인간 천연 항체 서열을 닮은 더 낮은 다양성의 영역에 인접한 완전히 무작위화된 아미노산 잔기의 연장을 포함한다. CDRH3는 항체의 전반적인 특이성에 크게 기여한다. 반면, 다른 5 개의 CDR은 항체의 특이성 및 친화성에 또한 기여할 수 있다.
모든 CDR을 조합하는 또 다른 접근법은 CDR-주입 기술 (Implantation Technology) 또는 CDR 이식 기술 (grafting technology)을 사용한다. 이해할 수 있는 바와 같이, 6 개 CDR의 동시적이고 무작위적인 조합에 의해 발생하는 기능적 변이의 정도는 막대하다. 합텐 (haptens) 및 단백질 항원 모두에 대한 항체 단편의 특정 세트를 찾는 관점에서, 라이브러리의 유용성은 가장 작은 라이브러리들 중에서 선택될 수 있지만; 친화성은 다소 낮을 것으로 예상된다. 이들 측면에서 수행된 많은 작업으로 인해, VH3 프레임워크에 대한 강한 편향이 존재한다는 것을 관찰하게 되었다. 10 배 더 큰 라이브러리의 사용에 의해 예시되는 바와 같이, 18 개의 상이한 항원에 대한 scFv 단편의 선택이 이루어졌다. 또 다른 관찰은 VH2를 제외한 모든 VH 패밀리가 발견되었음을 나타냈으며, 여기서 VH3 패밀리는 매우 과하게 나타났다.
초기 라이브러리로 수행된 선택의 결과를 모으면, 더 큰 라이브러리는 더 높은 친화성을 갖는 더 특이적인 항체를 생성한다는 것을 확인할 수 있다. 또 다른 관찰에서는, 특정 프레임워크 (주로 VH1 및 VH3)가 일반적으로 파지 디스플레이 선택 후 과하게 나타났으며, 여기서 그 비율은 주로 인풋 라이브러리보다 상이하다. 이는 단일 수용체 프레임워크 라이브러리의 개발을 초래하였으며, 여기서 VH 및 VL 프레임워크에 대한 서열은 사용 빈도 및 이들의 유리한 안정성에 기초하여 선택된다. 이러한 예시 중 하나로서 단일 프레임워크 조합으로 생성된 라이브러리는, 종종 인간 항체에서 빈번하게 발견되는 프레임워크인 중쇄 프레임워크 VH3_23을 사용한다. 이러한 독점적인 중쇄는 대부분의 경쇄와 쌍을 이루어 박테리아에서 우수하게 발현되며 파지상에서 잘 디스플레이된다.
Pini 등은 VH3_23 중쇄 및 그 발현 수준 및 안정성 특성에 대해 Vκ3_20 생식 계열에 상응하는 경쇄를 사용하였으며, 여기서 지정된 위치는 CDR-L3 및 CDR-H3에서 무작위화되어, >3 × 108 크기의 라이브러리를 생성하였다. 클론의 88%는 기능성 항체를 발현하는 것으로 나타났고, scFv는 나노 몰 수준에서 1가 친화성을 갖는 것으로 선택되었다. 동일한 프레임워크가 Bioinvent에 의해 V_lambda (DPL3)와 조합 사용되어, n-CoDeR®scFv 라이브러리를 생성하였다. 천연 다양성은 이 라이브러리에 대하여 다양성을 도입하기 위해 사용되었다. 이 특정 라이브러리는 CDR 서열의 PCR 증폭에 의해 하나의 단일 마스터 프레임워크로 조합된, 상이한 생식 계열 공급원의 재배열된 면역 글로불린 유전자로부터 유래된 생체 내 (in vivo) 형성된 CDR을 코딩하는 서열로 구성된다. 고정된 프레임워크가 단 하나 존재하기 때문에, 다른 생식 계열의 CDR 서열은 그 고정된 프레임워크와 조합되었다. CDR 서열은, 이들 CDR 영역이 인실리코 설계에 비하여 더 적은 T 세포 에피토프를 함유할 수 있다는 가정하에, 다양한 공급원으로부터 증폭되었다. 이 가정은 생체 내 교정 (proofreading) 매커니즘의 존재에 기반하였다. 초기 라이브러리 크기는 2 x 109 였지만, 10 년 규모로 증가하였으며 친화성의 서브-나노 몰 범위에서 선택적 분자인 것으로 밝혀졌다.
또 다른 경우에서, Lee와 동료들은 단일 스캐폴드에 기초하여 합성 CDR 서열을 갖는 라이브러리를 구축하기 위한 유사한 프레임워크 서열을 사용하였다. 라이브러리는 VH3_23 및 V_kappa로부터 유래된 프레임워크인 인간화 4D5 항체 (Herceptin®의 프레임워크 서열을 사용하여 구축되었다. 또한, 인간 레퍼토리의 천연 다양성은 맞춤 제작한 코돈 선택의 사용에 의해 모방되었다. 이들 라이브러리는 낮은 나노 몰 범위에서 친화성을 나타냈다. 반면, ScFv 및 Fab 포맷과 병행하여, 단일 도메인 합성 항체 라이브러리는 Tanha 등에 의해 확립되었다. 인간 VH 라이브러리는 낙타화 (camelized) VH 서열에 기초하여 23 개의 CDR3 잔기 중 19 개를 완전히 무작위화함으로써 구축되었다.
CDR-H1 및 -H2의 합성 다양성과 천연 CDR-H3의 길이 및 서열 다양성을 조합한 또 다른 예시는, Dyax에서 Hoet과 동료들이 생식 계열 서열에 핫스팟 돌연변이를 도입하고 CDRH1 및 H2 영역에 전략적으로 배치한 문헌에서 볼 수 있다. 이는 3.5 × 1010 크기의 라이브러리 및 서브-나노 몰 수준 범위의 친화성을 갖는 1.0 × 1010 크기의 파지 라이브러리를 초래하였다. 유사한 원리에 기초하여, Schoonbroodt과 동료들은 항-탄수화물 항체에 대한 라이브러리를 생성하였으며, 여기서 상기 라이브러리는 한정된 위치에 염기성 잔기를 도입함으로써 음으로 하전된 탄수화물을 인식하는 항체의 생성을 위해 맞춤화되었다. 여러 탄수화물 결합 항체에 대해 수행된 서열 정렬 연구는 돌연변이에 대한 지정된 위치를 유도하였다. 상기 라이브러리는 두 가지 인간 하전된 탄수화물 표적, 즉 헤페란 설페이트 (heperan sulfate) 및 6-술포시알릴 루이스 X 코어 (6-sulfosialyl Lewis X core)상에서 성공적으로 테스트되었다. 또 다른 경우에서, HUCAL®로 명명된 설계된 라이브러리는 단일 생식 계열 서열을 사용하기 보다는 다중 생식 계열 패밀리를 나타내는 컨센서스 서열을 기반으로 한다. 이 개념은 인간 항체의 구조적 다양성에 기여하는 다양한 프레임워크 서열을 통합한다.
이를 종합하면, 상기 접근법은 면역 반응 동안 빈번하게 사용되는 인간 VH 및 VL 서브패밀리 각각에 대한 하나의 컨센서스 프레임워크의 개념을 설명하며, VH의 경우 7 개의 마스터 유전자 및 VL의 경우 7 개의 마스터 유전자를 초래하여 Fab 포맷에서 49 개의 가능한 조합을 얻는다. 선택되지 않은 라이브러리의 257 개 구성원의 시퀀싱은 정확하고 잠재적 기능성인 서열의 빈도가 61%를 넘지 않았음을 보여주었다. 그러나, 이들 새로 도입된 CDR 및 고정된 프레임워크 사이의 구조적 비 호환성이 기능성 항체의 형성을 방해할 수 있다. 라이브러리 스크리닝으로부터 선택되는 항체의 최적화는 구조적 정보에 기반한 위치 특이적 돌연변이 유발 (mutagenesis) 또는 CDR/s의 조합 돌연변이 유발을 비롯한 다양한 시험관 내 (in vitro) 전략들을 포함한다.
모든 고-친화성 항체는 생체 내에서 다양성 (체세포 초돌연변이) 및 후속적인 선택 (클론 확장)을 도입하는 단계의 조합을 통해 면역계에 의해 생성된다. 항원 자극된 B 세포의 증식 동안, 면역 글로불린 좌위는 매우 높은 비율로 체세포 돌연변이를 겪는다. 조합 합성 라이브러리로부터 얻은 항체의 친화성을 향상시키기 위하여 시험관 내에서 이들 이벤트를 모방하는 몇몇 다른 접근법들이 존재한다. 시험관 내 친화성 발달을 위하여, 선택된 분자를 무작위화하여 다양성을 도입한 후 선택압으로 선별하여 개량된 변이체를 동정하여, 표적화 및 비표적화 다양화 전략을 구별할 수 있다.
다양한 비표적화 다양화 접근법 중에서, 오류가 발생하기 쉬운 PCR 및 돌연변이 유발 유전자 (mutator) E. coli 균주의 사용은 다양성을 초래하는 돌연변이를 도입하는 데 사용된다. 그러나, 서열 다양성이 전체 항체 서열에 무작위로 도입됨에 따라서, 이는 보존된 프레임워크 영역에서의 해로운 돌연변이의 도입으로 이어지고, 잠재적 후보자를 동정하기 위한 큰 레퍼토리의 스크리닝을 요한다. 파지 디스플레이와 조합하여 오류가 발생하기 쉬운 PCR이 Hawkins와 동료들에 의해 사용되었으며, 여기서 합텐 특이적 항체 단편의 4.5 배 다소 상승한 친화성이 관찰되었다. 또 다른 그룹은 후속 파지 디스플레이와 조합하여 E. coli 돌연변이 유발 유전자 균주 mutD5를 사용하였다. 이는 100 배의 인자로 phOx 항체 단편의 친화성을 증가시켰다. 비록 대중적으로 사용되지는 않지만, 사슬 셔플링 (chain shuffling)은 비표적화 다양화를 위한 또 다른 방법이다. 이 접근법은 다른 사슬 상수를 유지하는 레퍼토리에 의해 2 개의 항체 사슬 중 하나의 치환을 수반한다. Marks와 동료들의 연구에 의해 예시된 바와 같이, 합텐 phOx에 특이적인 ScFv로의 사슬 셔플링 방법이 후속 스크리닝 실험에 사용되었다. 다양한 연구자들 그룹이 erbB2 특이적 항체 단편의 5 내지 6 배 친화성 향상과 같은 중요한 친화성 향상을 초래하는 친화성 발달을 위하여 성공적으로 항체 사슬 셔플링을 사용하였지만 VEGF 특이적 항체 단편에 대해서 30 배의 친화성 향상이 나타났다.
합성 라이브러리를 개발하기 위하여 설계된 전략은 주로 CDR 영역에서 항원 결합에 기여할 것으로 예측되는 한정된 위치에 다양성을 도입하기 위한 표적화 방식으로 구성된다. CDR-표적화 돌연변이 유발은 이들 영역의 최적화가 단백질 안정성 또는 기능성에 문제를 일으키지 않으면서 친화성을 향상시킬 가능성이 있기 때문에 유리하다. 여러 채택된 방법론 중에서, CDR 워킹은 한정된 다양성의 범위와 함께 사용되었으며, 여기서 단일 CDR의 4 내지 6 개 아미노산의 짧은 연장이 표적화된다. 축퇴 올리고뉴클레오티드의 사용으로 도입될 수 있는 병행 및 순차 CDR 워킹이 존재한다. 그러한 하나의 예시로는 gp120 (HIV 항원) 특이적 항체의 향상된 친화성이 있다.
일련의 라이브러리가 다양화를 위하여 아미노산의 서브 세트를 이용하여 구축되었다. 이는 자연 발생 항체 서열 스페이스의 프레임워크 서열 내 다양성을 최대화하는 접근법과 대조적이다. 결정학적 분석 및 관련된 발견으로부터, 자연 발생 티로신 및 세린 잔기가 이들의 항원 결합 부위에서 유리하다는 것이 관찰되었다. Genentech의 연구원들은 CDR 위치에 접근 가능한 선택된 용매를 무작위화하여 작은 합성 라이브러리를 만들었으며, 이는 나중에 VEGF에 대해 성공적으로 스크리닝되어 낮은 나노 몰 친화성을 갖는 잠재적 분자를 생성하였다.
다양한 합성 조합 항체 라이브러리는 이들의 디자인, 서열 다양성의 기원 및 생성 방법에 있어 상이하다. 이들 모든 측면은 도서관의 본질적인 특성, 즉 i) 크기 및 ii) 기능적 다양성에 대해 다원적인 영향을 미친다. 이들은 결과적으로 허용 가능하고 개선된 생물물리학적 특성을 갖는 고친화성 항체를 스크리닝 및 전달하는 능력에 반영될 것이다.
초기 라이브러리로 수행된 선택 및 스크리닝 연구는 더 큰 라이브러리가 더 높은 친화성을 갖는 더 특이적인 항체를 생산할 것이라는 예상을 확인시켜주었다. 몇몇 디스플레이 및 단백질 상호 작용 시스템은 항체-항원 상호 작용을 위한 선별 방법으로서 확립되어, 시험관 내 전사 후의 파지, 효모 또는 리보솜의 표면상에 항체가 디스플레이되는 것이 가장 바람직하다. 대조적으로, 효모-2-하이브리드 시스템 또는 단백질 보완 분석과 같은 세포 내 선택 방법은 표적 단백질의 세포 내 발현에 직접적으로 의존한다.
리보솜 디스플레이 방법은 RNA 및 리보솜 복합체의 상대적 불안정성으로 인해 기술적으로 더 어려움이 있다. 파지 디스플레이는 클로닝의 용이함으로 인해 가장 많이 수용되는 방법이며, 큰 라이브러리 크기, 1가 디스플레이 및 다양한 안정성 파라미터의 용이한 결정을 가능하게 한다. 그러나, 파지 디스플레이의 경우, 원핵성 발현 시스템 및 디스플레이된 항체 단편의 번역 후 변형의 결여로 인하여, 적절한 단백질 폴딩에 대한 한계점들이 존재한다. 이들 한계점을 극복하기 위하여, 효모 디스플레이 플랫폼, 즉 진핵성 디스플레이 시스템이 선택되는데, 이는 항체 발현 수준, 결합된 항원의 수, 또는 교차 반응성 등의 파라미터와 병행하여 용액 내에서 자연 조건에 가까운 항체 선택을 가능하게 하는, 형광 활성화 세포 분류기 (FACS)-분류 기법과 호환되기 때문이다. 그러나, 효모 디스플레이의 경우 주요 문제는 상대적으로 더 작은 라이브러리의 크기이다.
본 발명의 내용은, 선행 기술의 이러한 한계점을 해결하기 위한 것으로, 이에 따라 큰 라이브러리 크기를 수용할 수 있는 매우 다양한 항체 합성 유전자 라이브러리를 설계 및 제조하여, 이로써 다양한 친화성 및 특이성을 지닌 다수의 항원에 대한 고유 분자들을 동정 및 생성하는 능력을 향상시키는 것을 목표로 한다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 특징은 첨부된 도면들과 함께 다음의 설명으로 완전히 명료해질 것이다. 도면들은 본 발명에 따른 일부 구현예만을 도시하고 있으며 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안 된다는 것을 이해하면서, 첨부된 도면들을 사용하여 본 발명을 추가적으로 설명하겠다:
도 1은 CDRH3 길이 분포의 분석을 나타낸다.
도 2는 중쇄 CDRH3에 대한 상대적인 아미노산 빈도 분포를 나타낸다. 데이터는 14 개 아미노산 길이의 CDRH3를 나타낸다. Kabat 명명법을 따랐다.
도 3은 파지미드 컨센서스 컨스트럭트를 생성하기 위한 전략을 나타낸다
A. 컨센서스 서열을 함유하는 카파 경쇄 (K1 내지 K4)의 생성
B. 컨센서스 서열을 함유하는 람다 경쇄 (L1 내지 L3)의 생성
C. 프레임워크 3 (FR3) 및 프레임워크 4 (FR4) 사이의 중쇄 가변 영역 내로의 합성 CDRH3 라이브러리의 개략도.
도 4는 H1A 컨센서스 컨스트럭트로부터의 독립 클론의 NcoI -HF & XbaI 효소를 사용한 분석을 나타낸다.
도 5는 카파 경쇄 가변 영역을 갖는 H1A 컨센서스 컨스트럭트로부터의 대표 클론의 HindIII -HF & AscI 효소를 사용한 분석을 나타낸다
A. K1 패밀리; B. K2 패밀리; C. K3 패밀리 및 D. K4 패밀리.
도 6은 람다 경쇄 가변 영역을 갖는 H1A 컨센서스 컨스트럭트로부터의 대표 클론의 HindIII -HF & AscI 효소를 사용한 분석을 나타낸다
A. L1 패밀리; B. L2 패밀리 및 C. L3 패밀리.
도 7은 합성된 CDRH3 라이브러리의 실시간 PCR을 통한 정량화를 나타낸다.
도 8은 CDRH3 합성 라이브러리의 NGS 서열 분석을 나타낸다
A. 합성 라이브러리의 서열 정확성
B. 합성 라이브러리의 CDRH3 길이 분포.
도 9는 합성된 CDRH3 라이브러리의 상대적인 아미노산 빈도 분포를 나타낸다
A. CDRH3 길이 - 4 개 아미노산
B. CDRH3 길이 - 5 개 아미노산
C. CDRH3 길이 - 6 개 아미노산
D. CDRH3 길이 - 7 개 아미노산.
도 10은 합성된 CDRH3 라이브러리의 상대적인 아미노산 빈도 분포를 나타낸다
A. CDRH3 길이 - 8 개 아미노산
B. CDRH3 길이 - 9 개 아미노산
C. CDRH3 길이 - 10 개 아미노산
D. CDRH3 길이 - 11 개 아미노산.
도 11은 합성된 CDRH3 라이브러리의 상대적인 아미노산 빈도 분포를 나타낸다
A. CDRH3 길이 - 12 개 아미노산
B. CDRH3 길이 - 13 개 아미노산
C. CDRH3 길이 - 14 개 아미노산
D. CDRH3 길이 - 15 개 아미노산.
도 12는 합성된 CDRH3 라이브러리의 상대적인 아미노산 빈도 분포를 나타낸다
A. CDRH3 길이 - 16 개 아미노산
B. CDRH3 길이 - 17 개 아미노산
C. CDRH3 길이 - 18 개 아미노산
D. CDRH3 길이 - 19 개 아미노산.
도 13은 합성된 CDRH3 라이브러리의 상대적인 아미노산 빈도 분포를 나타낸다
A. CDRH3 길이 - 20 개 아미노산
B. CDRH3 길이 - 21 개 아미노산
C. CDRH3 길이 - 22 개 아미노산
D. CDRH3 길이 - 23 개 아미노산.
도 14는 중쇄 풀의 BstEII / BstBI 및 XbaI에 의한 제한 효소 분해를 나타낸다
A. 컨센서스 컨스트럭트 H1A 내지 H3 패밀리의 풀
B. 컨센서스 컨스트럭트 H4 내지 H6 패밀리의 풀.
도 15는 합성된 CDRH3 라이브러리를 함유하는 H1A 패밀리 풀의 제한 효소 분해를 나타낸다.
도 16은 CDRH3 길이 변화를 보여주는 H1A 합성 라이브러리로부터의 독립 클론의 서열 분석을 나타낸다.
도 17은 합성 항체 유전자 라이브러리의 플라크 분석을 나타낸다.
도 18은 자성 비드 접합 효율의 유동 세포 분석에 의한 평가를 나타낸다.
도 19는 한 라운드의 파지 패닝 후 합성 항체 유전자 라이브러리의 플라크 분석을 나타낸다.
도 20은 패닝된 파지 라이브러리로부터의 항체 중쇄, 항체 카파 사슬 및 항체 람다 경쇄의 PCR 증폭을 나타낸다.
도 21은 효모 발현 벡터 내 독립 클론의 제한 효소 분해를 나타낸다.
A. 중쇄 클론
B. 카파 경쇄 클론
C. 람다 경쇄 클론.
도 22는 CDRH3 길이 변화를 보여주는 효모 벡터 내 독립 클론의 서열 분석을 나타낸다.
도 23은 Her2 항원에 대한 카파 경쇄를 갖는 효모 합성 CDRH3 라이브러리의 유동 세포 분석을 나타낸다
A. 항 His 항체를 사용한 유동 세포 분석
B. 항 c-myc 항체를 사용한 유동 세포 분석
C. 표지된 Her2 항원을 사용한 유동 세포 분석.
도 24는 Her2 항원에 대한 람다 경쇄를 갖는 효모 합성 CDRH3 라이브러리의 유동 세포 분석을 나타낸다.
A. 항 His 항체를 사용한 유동 세포 분석
B. 항 c-myc 항체를 사용한 유동 세포 분석
C. 표지된 Her2 항원을 사용한 유동 세포 분석.
도 25는 Her2 항원에 대한 카파 경쇄 (A 및 B) 및 람다 경쇄 (C 및 D)를 갖는 효모 합성 CDRH3 라이브러리의 유동 세포 분석 분류를 나타낸다. 효모 라이브러리는 항체의 표면 디스플레이를 위해 갈락토오스로 24 시간 동안 유도되었다
A. 비착색된 효모 세포
B. 표지된 Her2 항원으로 분류된 효모 세포
C. 비착색된 효모 세포
D. 표지된 Her2 항원으로 분류된 효모 세포
따라서, 본 발명은 길이가 약 4 개 아미노산 내지 약 23 개 아미노산인, 항체 분자(들)의 중쇄의 변형된 CDR을 포함하는 항체 분자(들)의 합성 라이브러리로, 여기서 상기 CDR의 길이가 4 개 아미노산일 때, 위치 2의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 약 20%이고, 상기 CDR의 길이가 5 내지 17 개 아미노산의 범위일 때, 마지막 위치의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 약 40% 내지 약 80%에 이르거나 마지막에서 두 번째 위치의 아미노산 티로신의 빈도는 약 40% 내지 약 65%에 이르고, 또는 상기 CDR의 길이가 18 내지 23 개 아미노산의 범위일 때, 마지막 위치의 아미노산 발린의 빈도는 약 20% 내지 약 67%에 이르거나 마지막 위치의 아미노산 이소류신의 빈도는 약 17% 내지 약 24%에 이르는 것인 합성 라이브러리; 전술한 합성 라이브러리의 수득 방법으로, 하나 이상의 소정의 특성(들)을 갖는 항체 분자를 스크리닝 및 동정하는 단계, CDR3 중쇄 (CDRH3)의 길이 분포 분석 및 상기 CDRH3 내의 아미노산 발생 빈도에 기초하여 상기 동정된 분자를 분석하여 최적의 사슬 길이 및 아미노산 빈도를 결정하는 단계, 변형된 항체 분자(들)을 설계한 후 상기 정의된 최적의 사슬 길이 및 아미노산 빈도에 기초하여 상기 분자(들)에 코돈 치환 기술을 적용하여 변형된 CDRH3를 갖는 항체 분자(들)을 수득하는 단계, 및 상기 분자(들)을 클로닝하여 라이브러리를 형성하는 단계를 포함하는 것인 합성 라이브러리의 수득 방법; 전술한 합성 라이브러리로부터 단리된 항체 분자 또는 상기 방법에 의해 수득된 항체 분자; SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14 중에서 선택되는 중쇄 컨센서스 아미노산 서열, SEQ ID 15, 17, 19 또는 21 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 16, 18, 20 또는 22 중에서 선택되는 경쇄 컨센서스 아미노산 서열 또는 SEQ ID 23, 25 또는 29 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 24, 26 또는 28 중에서 선택되는 컨센서스 아미노산 서열, SEQ ID 30-49, 64-79 또는 92-103 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 프레임워크 영역 및 SEQ ID 50-63, 80-91 또는 104-112 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 CDR을 포함하는 항체 분자로, 여기서 상기 CDR의 길이가 4일 때, 위치 2, 3 및 4의 아미노산 아르기닌의 빈도는 약 18%에서 약 20%까지 다양하고, 상기 CDR의 길이가 5일 때, 위치 3의 아미노산 프롤린의 빈도는 약 20%이고, 상기 CDR의 길이가 6일 때, 위치 4의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 25%이고, 상기 CDR의 길이가 7일 때, 위치 5의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 43.63%이고, 상기 CDR의 길이가 8일 때, 위치 6의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 35.24%이고, 상기 CDR의 길이가 9일 때, 위치 7의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 44.15%이고, 상기 CDR의 길이가 10일 때, 위치 8의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 55.93%이고, 상기 CDR의 길이가 11일 때, 위치 9의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.27%이고, 상기 CDR의 길이가 12일 때, 위치 10의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 52.70%이고, 상기 CDR의 길이가 13일 때, 위치 11의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.39%이고, 상기 CDR의 길이가 14일 때, 위치 12의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.77%이고, 상기 CDR의 길이가 15일 때, 위치 13의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.81%이고, 상기 CDR의 길이가 16일 때, 위치 14의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 50.47%이고, 상기 CDR의 길이가 17일 때, 위치 15의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 37.93%이고, 상기 CDR의 길이가 18일 때, 위치 16의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 37.96%이고, 상기 CDR의 길이가 19일 때, 위치 17의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 40.09%이고, 상기 CDR의 길이가 20일 때, 위치 1의 아미노산 글루탐산의 빈도는 약 15.56%이고, 상기 CDR의 길이가 21일 때, 위치 19의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 35.45%이고, 상기 CDR의 길이가 22일 때, 위치 20의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 36.27%이고, 상기 CDR의 길이가 23일 때, 위치 21의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 43.24%인 것인 항체 분자; 및 암, 류마티스성 관절염, 신경 장애, 감염성 질환 및 대사 장애 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 치료를 위한 치료법으로; 진단으로; 예후로; 연구 목적으로; 표적 발견; 기능 유전체학에서의 검증 또는 항체나 항체의 유도체가 사용되는 임의의 적용에 사용하기 위한, 전술한 합성 항체 라이브러리 또는 상기 방법에 의하여 수득되는 것인 합성 항체 라이브러리에 관한 것이다.
본 명세서에 달리 정의되지 않은 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학적 및 기술적 용어들은 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 의미를 가진다. 또한, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수의 용어들은 복수를 포함하고 복수의 용어들은 문맥 및/또는 적용에 적절하다고 생각되는 단수를 포함한다. 다양한 단수/복수의 치환은 명료성을 위하여 본원에서 명확하게 제시될 수 있다. 일반적으로, 본원에 기재된 생명 공학, 면역학, 분자 및 세포 생물학, 재조합 DNA 기술과 관련하여 사용되는 명명법은 본 기술 분야에 잘 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본원에 인용된 특정 참고 문헌들과 기타 문헌들은 본원에 참조로서 명확하게 포함되었다. 충돌이 있는 경우, 정의를 비롯하여 본 명세서가 우선한다. 재료, 방법, 도면 및 실시예는 단지 예시일 뿐이고 한정하고자 하는 것은 아니다.
또한, 개시된 항체 합성 라이브러리의 방법, 제조 및 사용은, 달리 지시하지 않은 한 분자 생물학, 생화학, 컴퓨터 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 기술, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 및 관련 분야의 통상적인 기술들을 사용한다. 이들 기술들, 그 원리 및 요구사항은 문헌에 설명되어 있으며 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
상기 항체 합성 라이브러리 및 항체 합성 라이브러리를 구성하는 핵산의 생성 방법 및 본 발명의 기타 구현예들이 개시되고 기술되기 전에, 본원에서 사용되는 용어들은 특정 구현예들을 설명하기 위한 것을 뿐 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아님을 이해하여야 한다. 발명의 상세한 설명 및 청구 범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 달리 지시하지 않는 한 복수의 대상을 포함한다는 것을 주의하여야 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "라이브러리" 및 "라이브러리들"은 본 발명의 생성물과 관련된 본 개시 내에서 상호 교환적으로 사용된다. 또한, 이는 핵산 서열의 집합체 또는 풀을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 문맥상 용어 "풀링", "풀링된", "풀", "풀들"은 본 발명의 방법을 사용하여 수득한 샘플/핵산 서열/핵산 단편/유전자 클론/증폭된 생성물/항체를 결합시키는 것을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 체내 면역 반응을 유도하는 임의의 이물질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 천연 공급원으로부터 유래되거나, 전체 또는 일부가 합성적으로 생산될 수 있는 면역 글로불린을 지칭한다. 용어 "항체" 및 "면역 글로불린"은 달리 지시되지 않는 한 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 동의어로 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 다클론 및 단일클론 항체 제조물을 모두 포함하고, 또한 키메라 항체 분자, F(ab')2 및 F(ab) 단편, Fv 분자, 단일 사슬 Fv 분자 (ScFv), 다이머 및 트라이머 항체 단편, 미니바디, 인간화 단일클론 항체 분자, 인간 항체, 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질 및 이들 분자로부터 유래된 임의의 기능성 단편을 포함하며, 여기서 유도체 분자들은 모체 항체 분자의 면역학적 기능성을 유지한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 본 발명의 용어 "단일클론 항체"는 동종 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 지칭한다. 항체는 항체의 종 또는 공급원 또는 제조 방식에 한정되지 않는다. 상기 용어는 모체 단일클론 항체 분자의 면역학적 결합 성질을 나타내는 키메라 및 인간화 동종 항체 집단뿐만 아니라, 전체 면역 글로불린 및 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv 및 기타 단편을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 단편"은 항원 결합 활성을 나타내는 능력을 보유하고 있는 전체 항체의 일부이다. 용어 Fab 또는 ScFv는 항체 단편으로서 구체적으로 언급된다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 디스플레이 라이브러리"는 표적 항원에 대한 스크리닝 방법에 적합한 세포 또는 무세포 표면상의 항체를 발현하는 플랫폼(들)을 지칭한다. 본원에서, 파지 디스플레이 라이브러리 및 효모 디스플레이 라이브러리는 달리 지시되지 않는 한 정확한 설명서와 함께 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "합성 라이브러리"는 합성적으로 설계된 VH 레퍼토리를 코딩하는 핵산 서열의 집합체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VH"는 경쇄가 자연적으로 결여된 포유류에서 발견될 수 있는 유형의 항체의 단일 중쇄 가변 도메인 또는 그 일부를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "VL"은 항체의 단일 경쇄 가변 도메인을 지칭하며; 이들은 불변 도메인 서열에 기초한 2 가지 유형으로 발견된다. Vk (카파 불변 영역) 및 Vl (람다 불변 영역)은 이에 따라 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CDR"은 항체 구조의 상보적 결정 영역을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "레퍼토리"는 유전적 다양성을 나타내는 집합체를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프레임워크 영역 (framework region)"은 본원에서 분자의 구조적 요소를 코딩하는 항체 분자의 핵산 서열 영역을 지칭하기 위하여 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플레이킹 영역 (flaking region)"은 상기의 영역에 인접한 뉴클레오티드 및/또는 아미노산 서열을 지칭하기 위하여 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "무작위화"는 특정 설계에 기반한 아미노산 및/또는 뉴클레오티드 서열 다양성의 생성을 지칭하기 위하여 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "Aga2p"는 효모 표면상에 관심 대상 항체를 디스플레이하는 앵커 단백질로서 사용되는 효모 단백질을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "면역 글로불린"은 특정 항원을 특이적으로 인식하고 결합함으로써 면역 반응의 중요한 부분으로 작용하는 당단백질 분자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "PCR"은 적절한 프라이머를 사용하여 DNA 세그먼트를 증폭시키는 데 사용되는 분자 생물학 기술인 폴리머라제 연쇄 반응을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "프라이머"는 DNA 합성을 개시하기 위한 DNA 또는 RNA의 짧은 단편을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "벡터"는 특이적으로 지정된 제한 부위에서 항체 유전자를 수용하기 위한 클로닝 또는 발현 시스템과 관련된 DNA를 지칭한다. 파지미드 벡터 (파지 디스플레이 시스템에 적용 가능) 또는 효모 벡터 (효모 디스플레이 시스템에 적용 가능)는 이에 따라 이해된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "파지미드"는 플라스미드로서 복제될 수 있는 DNA 발현 시스템을 지칭하며, 또한 바이러스 입자 내에 단일 가닥 DNA로서 포장될 수 있다. 파지미드는 항체 유전자의 전체 레퍼토리를 수용하는 데 사용되며, 여기서 파지미드는 박테리아에 감염된 후 재조합 단백질을 디스플레이하는 파지 입자를 생성하기 위해 헬퍼 파지에 의해 제공된 추가적인 단백질을 필요로 한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "파지"는 박테리아를 감염시키고 증폭시키는 바이러스 입자를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "헬퍼 파지"는 기능성 파지 입자를 생성하기 위해 필요한 모든 단백질/재료를 공급하는 특정 파지 입자를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "플라크"는 세포 파괴로 인해 박테리아의 론 (lawn)에 형성된 가시적인 구조를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "파지 증폭"은 파지 입자의 성장을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "패닝 (panning)"은 특정 표적/항원에 대한 결합제를 선택하는 친화성 선택 기술을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "연어 정자 DNA"는 연어 정자 보조 파지 DNA 침전으로부터 단리된 저분자량 데옥시리보핵산을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "ssDNA"는 단일 가닥 DNA를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "위치 상관 지수 (positional correlation index)"는 특정 길이의 CDR에 존재하는 특정 빈도의 아미노산이 다른 위치와 어떻게 관련되는지를 정의하는 확률론적 값을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "피어 (Peer) 그룹 시퀀싱"은 큰 라이브러리의 진정한 표현으로서 몇몇 개별 클론으로부터 유래된 뉴클레오티드 서열로 구성된 일련의 프로세스를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "코돈 치환 기술"은 선조립된 트리-뉴클레오티드 구축 블록을 사용하여 제어된 다양화를 유도하는 특정 관심 부위에서의 아미노산 조성의 맞춤 제작을 완성하는 것을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "컨센서스 서열"은 합성 DNA에 대한 아미노산 서열, 인코딩 핵산 서열을 지칭하며, 인실리코 설계된 면역 글로불린의 인간 가변 중쇄 및 경쇄 영역에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, "샤논 엔트로피 (Shannon Entropy)"는 진정한 다양성을 추론하기 위한 파라미터를 지칭한다.
본 발명은 길이가 약 4 개 아미노산 내지 약 23 개 아미노산인, 항체 분자(들)의 중쇄의 변형된 CDR을 포함하는 항체 분자(들)의 합성 라이브러리에 관한 것으로, 여기서:
ㆍ 상기 CDR의 길이가 4 개 아미노산일 때, 위치 2의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 약 20%이고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 5 내지 17 개 아미노산의 범위일 때, 마지막 위치의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 약 40% 내지 약 80%에 이르거나 마지막에서 두 번째 위치의 아미노산 티로신의 빈도는 약 40% 내지 약 65%에 이르고; 또는
ㆍ 상기 CDR의 길이가 18 내지 23 개 아미노산의 범위일 때, 마지막 위치의 아미노산 발린의 빈도는 약 20% 내지 약 67%에 이르거나 마지막 위치의 아미노산 이소류신의 빈도는 약 17% 내지 약 24%에 이른다.
한 구현예에서, 상기 합성 라이브러리는 아미노산 빈도의 특정 조합을 갖는, 길이가 약 4 개 아미노산 내지 약 23 개 아미노산인, 항체 분자(들)의 중쇄의 변형된 CDR을 포함하는 항체 분자(들)을 포함하며, 여기서:
ㆍ 상기 CDR의 길이가 4 개 아미노산일 때, 위치 1 및 3의 아미노산 글리신의 빈도는 약 16 내지 36%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 5 개 아미노산일 때, 처음 3 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 20 내지 38%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 6 개 아미노산일 때, 처음 4 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 11 내지 35%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 7 개 아미노산일 때, 처음 4 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 12 내지 38%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 8 개 아미노산일 때, 처음 5 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 14 내지 34%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 9 개 아미노산일 때, 처음 6 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 12 내지 43%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 10 개 아미노산일 때, 처음 7 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 14 내지 30%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 11 개 아미노산일 때, 처음 8 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 14 내지 28%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 12 개 아미노산일 때, 처음 9 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 15 내지 28%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 13 개 아미노산일 때, 처음 10 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 13 내지 26%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 14 개 아미노산일 때, 처음 11 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 8 내지 26%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 15 개 아미노산일 때, 처음 12 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 8 내지 30%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 16 개 아미노산일 때, 처음 13 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 7 내지 35%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 17 개 아미노산일 때, 처음 14 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 7 내지 36%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 18 개 아미노산일 때, 처음 15 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 7 내지 30%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 19 개 아미노산일 때, 처음 16 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 7 내지 45%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 20 개 아미노산일 때, 처음 17 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 3 내지 44%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 21 개 아미노산일 때, 처음 18 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 2 내지 44%에 이르고;
ㆍ 상기 CDR의 길이가 22 개 아미노산일 때, 처음 19 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 3 내지 58%에 이르고; 또는
ㆍ 상기 CDR의 길이가 23 개 아미노산일 때, 처음 20 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 약 0.5 내지 58%에 이른다.
또 다른 구현예에서, 상기 합성 라이브러리는 각 위치에서 아미노산 빈도의 특정 조합을 갖는, 길이가 약 4 개 아미노산 내지 약 23 개 아미노산인, 항체 분자(들)의 중쇄의 변형된 CDR을 포함하는 항체 분자(들)을 포함하며, 여기서:
상기 CDR의 길이가 4일 때 -
a. 위치 1 및 2의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 각각 약 10% 및 약 20%이고;
b. 위치 1 내지 3의 아미노산 프롤린의 빈도는 약 0.05%에서 약 0.15%까지 다양하고, 위치 4에서는 약 15%이고; 및
c. 위치 1의 아미노산 아르기닌의 빈도는 약 5%이고, 위치 2, 3 및 4에서는 약 18%에서 약 20%까지 다양하고,
상기 CDR의 길이가 5일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4 및 5의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 3%, 0.05%, 20%, 0.1% 및 6%이고; 및
b. 위치 1, 2, 3, 4 및 5의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 6%, 18%, 0.2%, 0.1% 및 0.05%이고,
상기 CDR의 길이가 6일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 3.00%, 0.15%, 2%, 25%, 0.05% 및 3.5%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 3.43%, 5.61%, 0.09%, 0.06%, 7.79% 및 0.08%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 0.05%, 7.78%, 7.48%, 4.37%, 4.53% 및 1.77%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 세린의 빈도는 각각 약 1.76%, 9.44%, 8.13%, 8.93%, 0.26% 및 1.43%이고,
상기 CDR의 길이가 7일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 3.65%, 0.18%, 0.08%, 3.09%, 43.63%, 0.15% 및 3.01%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 3.33%, 7.19%, 12.74%, 1.11%, 0.21%, 0.09% 및 3.34%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 0.09%, 4.68%, 0.23%, 2.74%, 3.95%, 0.06% 및 3.53%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 6.98%, 15.99%, 3.98%, 4.13%, 1.00%, 1.16% 및 0.67%이고,
상기 CDR의 길이가 8일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 4.56%, 6.02%, 2.69%, 4.00%, 1.82%, 35.24%, 0.98% 및 2.61%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 3.17%, 3.28%, 3.30%, 5.44%, 2.19%, 2.99%, 0.93% 및 4.74%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 0.05%, 6.05%, 3.76%, 1.04%, 3.79%, 1.47%, 0.68% 및 4.64%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 6.24%, 5.58%, 8.88%, 8.36%, 5.24%, 0.10%, 0.88% 및 3.18%이고,
상기 CDR의 길이가 9일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.96%, 1.92%, 2.31%, 2.13%, 2.36%, 2.05%, 44.15%, 0.86% 및 2.59%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.68%, 2.83%, 3.24%, 3.36%, 3.13%, 3.94%, 1.12%, 0.93% 및 4.74%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 0.98%, 3.49%, 3.57%, 3.96%, 3.79%, 9.19%, 3.71%, 1.06% 및 5.26%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 4.93%, 9.19%, 9.45%, 9.10%, 9.50%, 3.21%, 0.07%, 0.83% 및 3.97%이고,
상기 CDR의 길이가 10일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.12%, 2.44%, 2.27%, 2.49%, 2.18%, 2.78%, 2.64%, 55.93%, 0.56% 및 2.32%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.66%, 2.95%, 3.25%, 3.15%, 3.22%, 3.10%, 1.22%, 1.35%, 0.91% 및 4.76%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 1.42%, 3.12%, 3.57%, 2.78%, 3.00%, 2.81%, 4.00%, 1.22%, 0.78% 및 4.08%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.28%, 9.13%, 9.97%, 9.70%, 10.04%, 9.91%, 4.20%, 0.07%, 1.12% 및 3.81%이고,
상기 CDR의 길이가 11일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.10%, 2.30%, 2.51%, 2.24%, 2.47%, 2.43%, 2.24%, 2.10%, 54.27%, 0.58% 및 2.76%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.68%, 2.74%, 2.98%, 3.40%, 2.98%, 3.33%, 3.54%, 4.20%, 0.97%, 1.26% 및 4.40%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 1.61%, 3.72%, 2.90%, 3.27%, 3.07%, 2.90%, 2.98%, 5.78%, 3.05%, 0.99% 및 4.22%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.62%, 9.57%, 10.06%, 10.35%, 9.61%, 9.14%, 10.00%, 2.18%, 0.00%, 1.11% 및 4.14%이고,
상기 CDR의 길이가 12일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.06%, 2.42%, 2.08%, 2.44%, 1.88%, 2.46%, 2.59%, 2.34%, 2.17%, 52.70%, 0.65% 및 2.49%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.59%, 3.31%, 3.58%, 3.12%, 3.24%, 3.27%, 3.62%, 6.42%, 1.28%, 0.89%, 1.14%, 및 4.65%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 1.62%, 3.52%, 3.50%, 3.43%, 3.64%, 2.72%, 3.35%, 4.82%, 6.23%, 3.16%, 0.82%, 및 3.96%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.18%, 10.28%, 10.15%, 10.64%, 10.28%, 10.11%, 10.11%, 5.52%, 2.88%, 0.00%, 및 0.80% 및 3.50%이고,
상기 CDR의 길이가 13일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.02%, 2.09%, 2.13%, 2.28%, 2.44%, 2.32%, 2.49%, 2.40%, 4.51%, 4.85%, 54.39%, 0.86% 및 2.65%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.61%, 3.28%, 3.34%, 3.07%, 3.47%, 3.22%, 3.32%, 3.34%, 9.54%, 2.13%, 0.94%, 1.11% 및 4.16%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 1.86%, 3.70%, 3.49%, 3.53%, 3.07%, 3.07%, 3.24%, 3.24%, 1.98%, 4.26%, 27.61%, 0.75% 및 3.38%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.85%, 9.77%, 9.46%, 9.38%, 9.86%, 9.94%, 9.90%, 9.54%, 5.14%, 1.34%, 0.00%, 0.81% 및 3.13%이고,
상기 CDR의 길이가 14일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.00%, 2.48%, 2.33%, 2.42%, 2.37%, 3.01%, 2.42%, 2.22%, 2.79%, 4.02%, 4.09%, 54.77%, 0.70% 및 1.96%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.46%, 3.49%, 3.56%, 3.41%, 3.23%, 3.58%, 3.27%, 3.25%, 3.19%, 2.04%, 2.37%, 0.92%, 1.54% 및 2.94%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 1.82%, 3.58%, 3.41%, 3.10%, 2.86%, 3.45%, 2.50%, 3.05%, 2.53%, 7.32%, 5.36%, 3.05%, 0.81% 및 0.26%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.78%, 9.69%, 8.94%, 9.53%, 10.04%, 9.89%, 9.82%, 10.26%, 10.22%, 10.26%, 1.82%, 0.00%, 0.90% 및 1.14%이고,
상기 CDR의 길이가 15일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.07%, 2.02%, 2.25%, 2.29%, 2.82%, 2.43%, 2.38%, 2.32%, 3.74%, 3.23%, 4.03%, 4.38%, 54.81%, 0.80% 및 2.29%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.80%, 3.32%, 2.91%, 2.98%, 3.42%, 3.46%, 2.89%, 3.44%, 1.93%, 2.34%, 2.73%, 2.77%, 0.78%, 1.33% 및 2.54%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 1.65%, 3.44%, 3.62%, 3.58%, 3.09%, 3.12%, 2.66%, 2.61%, 7.66%, 6.92%, 7.40%, 3.12%, 2.43%, 0.69% 및 0.23%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.96%, 10.13%, 9.26%, 9.58%, 10.32%, 10.09%, 9.01%, 9.67%, 11.10%, 10.45%, 9.67%, 3.42%, 0.00%, 0.83% 및 0.85%이고,
상기 CDR의 길이가 16일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.12%, 1.57%, 1.75%, 2.62%, 2.85%, 2.50%, 2.85%, 2.21%, 2.97%, 2.74%, 3.38%, 3.38%, 2.39%, 50.47%, 1.22% 및 2.91%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.87%, 2.33%, 3.03%, 2.85%, 3.67%, 2.56%, 3.32%, 2.74%, 2.68%, 1.98%, 2.39%, 2.27%, 0.17%, 0.64%, 0.81% 및 2.79%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 2.44%, 16.94%, 3.61%, 6.00%, 3.61%, 3.61%, 3.73%, 3.38%, 7.51%, 10.30%, 11.76%, 8.21%, 4.95%, 2.56%, 0.81% 및 1.34%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 6.40%, 9.72%, 8.91%, 9.84%, 10.01%, 9.14%, 9.66%, 9.49%, 8.21%, 9.60%, 8.15%, 8.96%, 0.58%, 0.00%, 1.34% 및 0.99%이고,
상기 CDR의 길이가 17일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.06%, 1.37%, 2.47%, 2.96%, 2.91%, 2.01%, 2.85%, 2.44%, 3.05%, 2.59%, 3.31%, 3.37%, 2.59%, 0.64%, 37.93%, 0.70% 및 3.31%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.64%, 4.56%, 3.14%, 2.47%, 3.69%, 3.25%, 3.11%, 3.84%, 3.55%, 2.27%, 1.95%, 1.74%, 2.35%, 1.71%, 0.00%, 1.28% 및 1.39%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 2.79%, 7.29%, 3.31%, 10.52%, 2.44%, 4.50%, 3.89%, 4.53%, 3.95%, 9.79%, 9.82%, 10.20%, 10.32%, 2.32%, 1.63%, 1.25% 및 7.90%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.81%, 14.44%, 9.97%, 8.95%, 8.78%, 9.47%, 8.37%, 9.47%, 9.33%, 9.82%, 10.29%, 9.76%, 9.85%, 1.31%, 0.00%, 1.16% 및 1.02%이고,
상기 CDR의 길이가 18일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.05%, 1.37%, 2.07%, 2.43%, 3.39%, 2.28%, 2.73%, 3.39%, 2.83%,2.53%, 3.59%, 3.19%, 3.14%, 3.14%, 0.56%, 37.96%, 1.11% 및 3.39%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.66%, 2.78%, 2.83%, 1.52%, 2.33%, 3.64%, 3.90%, 2.73%, 3.64%, 4.25%, 2.02%, 2.53%, 2.63%, 2.94%, 0.51%, 0.05%, 1.32% 및 1.42%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 2.02%, 4.35%, 3.64%, 11.69%, 11.03%, 3.29%, 4.61%, 3.54%, 5.31%, 4.55%, 11.39%, 8.76%, 10.17%, 8.76%, 5.11%, 2.13%, 0.91% 및 9.67%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.97%, 9.77%, 9.01%, 9.56%, 8.50%, 8.96%, 9.36%, 9.11%, 10.98%, 9.46%, 10.58%, 8.96%, 9.36%, 8.25%, 2.23%, 0.05%, 0.76% 및 0.86%이고,
상기 CDR의 길이가 19일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.17%, 0.81%, 2.20%, 3.08%, 2.84%, 3.28%, 6.30%, 8.97%, 2.40%, 3.08%, 3.39%, 3.73%, 3.45%, 1.19%, 4.20%, 0.44%, 40.09%, 1.02% 및 3.49%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.98%, 1.69%, 2.88%, 2.84%, 2.64%, 1.76%, 4.03%, 2.57%, 4.30%, 3.12%, 2.47%, 2.10%, 2.64%, 11.45%, 7.31%, 0.03%, 0.00%, 1.46% 및 1.19%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 2.54%, 10.26%, 3.66%, 11.62%, 9.82%, 9.92%, 0.44%, 4.03%, 4.27%, 5.25%, 9.85%, 9.99%, 8.84%, 2.44%, 3.05%, 2.78%, 1.42%, 0.81% 및 9.72%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.38%, 12.09%, 7.92%, 9.04%, 9.21%, 8.53%, 0.61%, 1.76%, 9.18%, 8.91%, 10.19%, 8.77%, 9.11%, 3.93%, 0.54%, 1.08%, 0.00%, 0.95% 및 1.05%이고,
상기 CDR의 길이가 20일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 글루탐산의 빈도는 각각 약 15.56%, 4.65%, 3.96%, 7.86%, 4.75%, 2.14%, 0.82%, 3.96%, 4.59%, 3.99%, 5.19%, 4.71%, 5.03%, 0.31%, 3.99%, 0.06%, 0.06%, 0.00%, 2.39% 및 0.00%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.66%, 2.67%, 3.17%, 1.13%, 2.01%, 0.31%, 3.52%, 3.49%, 3.36%, 3.21%, 2.36%, 2.64%, 2.42%, 4.34%, 4.09%, 3.96%, 1.16%, 0.09%, 1.45% 및 1.07%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 2.39%, 3.49%, 3.61%, 3.11%, 11.44%, 1.76%, 1.38%, 4.37%, 3.71%, 5.00%, 10.09%, 9.90%, 9.90%, 6.38%, 4.87%, 6.44%, 0.31%, 1.19%, 0.91% 및 9.55%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.41%, 8.67%, 9.71%, 4.87%, 9.37%, 1.98%, 3.49%, 8.74%, 9.21%, 8.89%, 8.96%, 9.87%, 10.47%, 4.43%, 1.67%, 4.09%, 2.83%, 0.00%, 0.97% 및 1.26%이고,
상기 CDR의 길이가 21일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.00%, 2.07%, 0.28%, 2.93%, 2.31%, 5.82%, 6.92%, 7.44%, 7.10%, 7.13%, 7.20%, 11.47%, 0.59%, 0.65%, 4.34%, 6.17%, 2.20%, 0.17%, 35.45%, 2.17% 및 2.58%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.65%, 0.14%, 4.17%, 2.79%, 3.44%, 1.52%, 1.31%, 0.93%, 1.17%, 1.38%, 1.76%, 2.89%, 6.48%, 0.41%, 4.20%, 0.24%, 4.51%, 0.34%, 0.00%, 1.03% 및 2.17%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 2.20%, 9.06%, 4.48%, 4.24%, 4.13%, 2.86%, 2.55%, 2.24%, 3.10%, 3.38%, 3.31%, 18.05%, 6.44%, 8.54%, 2.79%, 2.89%, 8.27%, 1.10%, 1.83%, 1.55% 및 8.23%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.99%, 3.82%, 8.96%, 9.20%, 9.20%, 4.27%, 4.13%, 4.68%, 4.99%, 4.62%, 4.00%, 10.27%, 6.30%, 9.68%, 5.99%, 1.79%, 3.41%, 1.72%, 0.24%, 1.00% 및 0.03%이고,
상기 CDR의 길이가 22일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.04%, 5.37%, 3.13%, 6.33%, 3.67%, 0.27%, 6.95%, 6.49%, 7.34%, 3.79%, 3.28%, 3.79%, 5.99%, 7.34%, 0.19%, 0.27%, 0.19%, 0.31%, 3.24%, 36.27%, 0.85% 및 9.35%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.50%, 0.00%, 4.21%, 0.19%, 4.17%, 4.21%, 1.04%, 1.43%, 1.51%, 1.85%, 2.90%, 2.01%, 1.27%, 1.08%, 0.39%, 0.27%, 0.12%, 7.61%, 0.12%, 0.08%, 1.47% 및 0.00%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 2.74%, 7.96%, 4.75%, 18.23%, 8.50%, 3.59%, 2.47%, 2.94%, 2.74%, 10.31%, 10.35%, 9.62%, 3.13%, 3.05%, 13.90%, 0.27%, 5.37%, 0.23%, 0.31%, 1.78%, 1.39% 및 2.47%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 5.83%, 17.50%, 8.42%, 5.06%, 4.52%, 4.79%, 4.91%, 4.48%, 4.60%, 9.39%, 8.42%, 8.57%, 4.36%, 4.44%, 0.58%, 3.59%, 6.06%, 0.23%, 6.30%, 0.04%, 0.77% 및 0.00%이고,
상기 CDR의 길이가 23일 때 -
a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 약 0.00%, 0.29%, 0.15%, 0.49%, 8.00%, 3.07%, 3.76%, 0.59%, 9.03%, 3.90%, 4.25%, 9.42%, 0.44%, 3.90%, 0.34%, 3.32%, 3.51%, 0.10%, 3.90%, 0.39%, 43.24%, 0.83% 및 4.73%이고;
b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 약 0.24%, 0.05%, 0.15%, 0.15%, 4.69%, 5.32%, 0.10%, 0.15%, 14.84%, 0.20%, 4.49%, 4.64%, 4.25%, 5.42%, 0.10%, 8.30%, 0.05%, 0.10%, 4.69%, 0.00%, 0.00%, 1.12% 및 0.00%이고,
c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 약 0.24%, 9.91%, 3.71%, 3.61%, 5.32%, 2.73%, 3.61%, 3.81%, 7.42%, 2.10%, 6.69%, 4.34%, 2.93%, 8.39%, 11.27%, 3.17%, 0.20%, 0.24%, 0.34%, 4.05%, 0.88%, 1.22% 및 9.22%이고; 및
d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 약 0.44%, 4.39%, 8.69%, 22.40%, 7.76%, 4.49%, 4.05%, 3.42%, 0.78%, 9.13%, 10.35%, 3.66%, 11.52%, 3.95%, 0.29%, 8.25%, 0.20%, 6.69%, 0.20%, 0.44%, 0.00%, 1.95% 및 0.05%이다.
또 다른 구현예에서, 상기 CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3로 이루어진 군으로부터 선택되고; 여기서 바람직하게는 CDR은 CDR3이다.
또 다른 구현예에서,
ㆍ 상기 항체 분자(들)의 중쇄는 SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14 중에서 선택되는 컨센서스 아미노산 서열을 포함하고;
ㆍ 상기 항체 분자(들)의 경쇄 (카파)는 SEQ ID 15, 17, 19 또는 21 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 16, 18, 20 또는 22 중에서 선택되는 컨센서스 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 항체 분자(들)의 경쇄 (람다)는 SEQ ID 23, 25 또는 29 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 24, 26 또는 28 중에서 선택되는 컨센서스 아미노산 서열을 포함하고;
ㆍ 상기 중쇄의 프레임워크 영역 1, 2 및 3은 SEQ ID 30-49 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고;
ㆍ 상기 중쇄의 CDR 1 및 2는 SEQ ID 50-63 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고;
ㆍ 상기 경쇄 (카파)의 프레임워크 영역 1, 2, 3 및 4는 SEQ ID 64-79 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고;
ㆍ 상기 경쇄 (카파)의 CDR 1, 2 및 3은 SEQ ID 80-91 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고;
ㆍ 상기 경쇄 (람다)의 프레임워크 영역 1, 2, 3 및 4는 SEQ ID 92-103 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하고;
ㆍ 상기 경쇄 (람다)의 CDR1, 2 및 3은 SEQ ID 104-112 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 라이브러리는 약 1010 내지 약 1011 개의 클론을 포함하고; 여기서 상기 합성 항체 라이브러리는 파지 또는 효모의 표면에 발현된 항체 분자(들)의 집합체이거나, 파지 또는 효모 또는 이들의 조합으로부터 단리된 항체 분자(들)의 집합체이다.
본 발명은 또한 전술한 합성 라이브러리를 수득하는 방법에 관한 것으로, 다음의 단계들을 포함한다:
a) 하나 이상의 소정의 특성(들)을 갖는 항체 분자를 스크리닝 및 동정하는 단계,
b) CDR3 중쇄 (CDRH3)의 길이 분포 분석 및 상기 CDRH3 내의 아미노산 발생 빈도에 기초하여 상기 동정된 분자를 분석하여 최적의 사슬 길이 및 아미노산 빈도를 결정하는 단계,
c) 변형된 항체 분자(들)을 설계한 후 상기 정의된 최적의 사슬 길이 및 아미노산 빈도에 기초하여 상기 분자(들)에 코돈 치환 기술을 적용하여 변형된 CDRH3를 갖는 항체 분자(들)을 수득하는 단계; 및
d) 상기 분자(들)을 클로닝하여 라이브러리를 형성하는 단계.
한 구현예에서, 상기 스크리닝은 중복 제거를 위해 이용 가능한 온라인 데이터베이스 (IMGT 데이터베이스)로부터 항체 유전자 서열을 분석하는 단계를 포함하고; 여기서 상기 소정의 특성(들)은 주석 레벨, 종, 구성 유형, 재배열된 유전자 유형 및 기능성, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서, 상기 설계는 SEQ ID 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14 중에서 선택되는 중쇄 아미노산 서열 및 SEQ ID 16, 18, 20, 22, 24, 26 또는 28 중에서 선택되는 경쇄 아미노산 서열; SEQ ID 30-112 중에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 하나 이상의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역 및 CDR을 포함하는 항체 분자(들)을 합성하는 단계를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 변형된 CDRH3를 갖는 항체 분자(들)은 파지 벡터에 의해 개별적으로 또는 파지 벡터에 이어서 효모 벡터에 의해 순차적으로 디스플레이된다.
또 다른 구현예에서, 상기 파지 또는 효모 벡터에 의한 항체 분자(들)의 디스플레이는 다음의 단계들을 포함한다:
상응하는 항체 유전자를 파지 내로 클로닝하여 파지 항체 라이브러리를 수득한 후, 항원(들)에 대해 디스플레이된 분자(들)을 스크리닝하여 패닝된 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계,
효모의 표면에 상기 항체 분자(들)을 디스플레이하기 위하여 패닝된 파지 항체 라이브러리를 효모 내로 전달한 후, 항원(들)에 대해 효모 디스플레이된 항체 분자(들)을 스크리닝하여 효모 스크리닝된 항체 라이브러리를 수득하는 단계, 및
목적하는 기능적 특성을 갖는 파지 또는 효모 디스플레이된 항체 분자(들)을 선택하여 합성 항체 라이브러리를 형성하는 단계 또는 파지 항체 라이브러리 또는 효모 항체 라이브러리로부터 목적하는 기능적 특성을 갖는 선택된 항체 분자(들)을 단리하여 스크리닝된 항체 합성 라이브러리를 생성하는 단계.
또 다른 구현예에서, 상기 항체 분자(들)은 파지 또는 효모 벡터 내로 클로닝하기 위하여 Fab 또는 Scfv 포맷으로 존재하고; 여기서 파지 벡터 내로의 형질 전환 효율은 약 109 내지 약 1010의 범위이며; 효모 벡터 내로의 형질 전환 효율은 약 106 내지 약 108의 범위이다.
또 다른 구현예에서, 파지 라이브러리를 수득하기 위한 스크리닝은 관심 대상 항체를 단리하기 위해 자성 비드상에 코팅된 항원을 이용하는 패닝을 포함하고; 여기서 상기 파지 디스플레이 스크리닝/패닝은 항체 비결합자 (non-binders)를 제거하기 위하여 사용된다.
또 다른 구현예에서, 표면 디스플레이에 의한 효모 라이브러리를 수득하기 위한 스크리닝은, 담배 식각 바이러스 (Tobacco Etch Virus; TEV), 엔테로키나제, 트롬빈, Xa 인자, HRV 3C 프로테아제 및 유사 프로테아제 절단 단백질 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위를 사용하여 Fab 또는 ScFv 분자를 단리하기 위해 경쟁적 항원 에피토프, 항체 파라토프 (paratope) 형태, 서열 및 서열 모티프 또는 이들의 임의의 조합을 사용함으로써 수행된다.
또 다른 구현예에서, 상기 합성 항체 라이브러리는 파지 또는 효모의 표면에 발현된 항체 분자(들)의 집합체이거나, 또는 파지 또는 효모 또는 이들의 조합으로부터 단리된 항체 분자(들)의 집합체이다.
본 발명은 또한 전술한 합성 라이브러리로부터 단리된 항체 분자 또는 상기 방법에 의해 수득된 항체 분자에 관한 것이다.
본 발명은 또한 다음을 포함하는 항체 분자에 관한 것이다:
ㆍ SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 2, 4, 6, 8, 10, 12 또는 14 중에서 선택되는 중쇄 컨센서스 아미노산 서열;
ㆍ SEQ ID 15, 17, 19 또는 21 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 16, 18, 20 또는 22 중에서 선택되는 경쇄 컨센서스 아미노산 서열; 또는 SEQ ID 23, 25 또는 29 중에서 선택되는 상응하는 핵산 서열에 의해 코딩되는 SEQ ID 24, 26 또는 28 중에서 선택되는 컨센서스 아미노산 서열;
ㆍ SEQ ID 30-49, 64-79 또는 92-103 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 프레임워크 영역; 및
ㆍ SEQ ID 50-63, 80-91 또는 104-112 중에서 선택되는 컨센서스 핵산 서열에 의해 코딩되는 CDR.
여기서,
상기 CDR의 길이가 4일 때, 위치 2, 3 및 4의 아미노산 아르기닌의 빈도는 약 18%에서 약 20%까지 다양하고;
상기 CDR의 길이가 5일 때, 위치 3의 아미노산 프롤린의 빈도는 약 20%이고;
상기 CDR의 길이가 6일 때, 위치 4의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 25%이고;
상기 CDR의 길이가 7일 때, 위치 5의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 43.63%이고;
상기 CDR의 길이가 8일 때, 위치 6의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 35.24%이고;
상기 CDR의 길이가 9일 때, 위치 7의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 44.15%이고;
상기 CDR의 길이가 10일 때, 위치 8의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 55.93%이고;
상기 CDR의 길이가 11일 때, 위치 9의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.27%이고;
상기 CDR의 길이가 12일 때, 위치 10의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 52.70%이고;
상기 CDR의 길이가 13일 때, 위치 11의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.39%이고;
상기 CDR의 길이가 14일 때, 위치 12의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.77%이고;
상기 CDR의 길이가 15일 때, 위치 13의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 54.81%이고;
상기 CDR의 길이가 16일 때, 위치 14의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 50.47%이고;
상기 CDR의 길이가 17일 때, 위치 15의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 37.93%이고;
상기 CDR의 길이가 18일 때, 위치 16의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 37.96%이고;
상기 CDR의 길이가 19일 때, 위치 17의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 40.09%이고;
상기 CDR의 길이가 20일 때, 위치 1의 아미노산 글루탐산의 빈도는 약 15.56%이고;
상기 CDR의 길이가 21일 때, 위치 19의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 35.45%이고;
상기 CDR의 길이가 22일 때, 위치 20의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 36.27%이고; 및
상기 CDR의 길이가 23일 때, 위치 21의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 약 43.24%이다.
본 발명은 또한 암, 류마티스성 관절염, 신경 장애, 감염성 질환 및 대사 장애 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 치료를 위한 치료법으로; 진단으로; 예후로; 연구 목적으로; 표적 발견; 기능 유전체학에서의 검증 또는 항체나 항체의 유도체가 사용되는 임의의 적용에 사용하기 위한, 전술한 합성 항체 라이브러리 또는 상기 방법에 의하여 수득되는 것인 합성 항체 라이브러리에 관한 것이다.
본 발명은 합성 항체 유전자 발현 라이브러리에 한정되지 않는 항체 라이브러리를 생성하는 설계 또는 방법에 관한 것이다. 상기 합성 항체 라이브러리는 상보적 결정 영역 (CDR)에 한정되지 않는 다양성을 갖는 컨센서스 아미노산 서열의 풀상에 구축된다.
본 발명의 비제한적인 구현예에서, CDR은 CDR1, CDR2 및 CDR3로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 비제한적인 구현예에서, 상기 합성 라이브러리는 치환-코돈 기술/코돈 치환 기술을 통해 정확하게 설계된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 구축된다.
상기 기술은 항체 CDR의 특정 위치에서 특정 아미노산 잔기를 치환시키는 것에 기초한다. 아미노산 서열의 극단적인 가변성 및 CDR 영역의 길이로 인하여, 각 위치는 소정 빈도로 다중 아미노산으로 치환된다. 이러한 치환은 다양한 항원 인식을 위한 선행 조건인 항체 레퍼토리를 나타내는 다수의 독립적 분자를 유도한다. 합성되는 올리고뉴클레오티드는 가변 코돈으로 설계되어 각 위치에서 아미노산 다양성을 나타낸다.
본 발명의 또 다른 비제한적인 구현예에서, 코돈 치환 기술은 인실리코 분석 데이터로부터 얻은 인풋을 사용하여 아미노산 조성 편차를 도입한다. 상기 분석을 위하여, 공중이 입수 가능한 항체 데이터베이스로부터의 몇몇 항체의 아미노산 서열이 사용된다. 특정 위치에서의 특정 아미노산 분자의 존재 빈도는 인실리코 결정된다. 얻어지는 데이터는 아미노산 빈도의 다양성을 나타내는 올리고뉴클레오티드 서열의 합성에 사용된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 핵산 서열을 코딩하는 컨센서스 아미노산은 합성 DNA를 포함하며, 인실리코 설계된 면역 글로불린의 인간 가변 중쇄 및 경쇄 영역에 한정되지 않는다.
본 발명의 비제한적인 구현예에서, 합성 항체 라이브러리의 생성 방법은 조합 툴을 사용함으로써 특정 항원의 스크리닝 절차를 포함한다.
예시적인 구현예에서, 조합 툴은 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 합성 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하기 위해 파지 디스플레이 기술 및/또는 효모 디스플레이 기술을 사용함으로써 스크리닝을 이용한다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 합성 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하기 위해 파지 디스플레이 기술에 이어서 효모 디스플레이 기술을 순차적으로 사용함으로써 스크리닝을 이용한다.
본 발명의 비제한적인 구현예에서, 상기 합성 항체 유전자 발현 라이브러리는 특정 치료 표적, 즉 향상된 친화성 및 특이성을 갖는 항원에 대해 목적하는 기능적 특성을 갖는 고유 항체 분자의 단리를 허용한다.
본 발명의 또 다른 비제한적인 구현예에서, 상기 항체의 목적하는 기능적 특성들은, 이에 한정되는 것은 아니지만 친화성, 특이성, 제조 가능성, 새로운 에피토프의 생성, 내열성, 항원성, 가용성, 응집성 및 촉매 활성, 또는 이들의 임의의 조합 및 성공적인 제품 상용화와 관련된 임의의 다른 특성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 비제한적인 구현예에서, 상기 합성 항체 유전자 발현 라이브러리의 생성 방법은 2 가지 별개의 스캐닝 툴, 1) 파지 디스플레이 기술 및 2) 효모 디스플레이 기술을 사용함으로써 컨센서스 아미노산 서열의 풀의 발현을 순차적으로 탐구하는 단계를 포함한다. 이들 기술의 순차적인 사용은 파지 기반 라이브러리의 특성인 항체 유전자 다양성의 더 큰 집합을 활용할 수 있도록 한다. 그 후에 항체 클론을 효모 디스플레이 시스템을 통해 스크리닝한다. 항체 유전자 발현을 위한 효모 시스템의 사용은 세포 표면의 항체 생성물의 진핵 생물 단백질 번역, 가공 및 적절한 폴딩 때문에 유리하다. 또한, 효모 발현은 높은 특이성을 갖는 항원성 표적과의 적절한 상호 작용을 가능하게 한다. 이들 2 가지 상보적인 시스템을 사용하여 얻은 정보는 상용화 가능성의 관점에서 보다 높은 성공률로 "선도 분자 (lead molecules)" (즉, 항원에 특이적인 항체)를 생성한다.
본 발명에서 채택된 발현 프로파일링 및 스크리닝 전략은 파지를 효모 디스플레이 플랫폼으로 원활하게 전달할 수 있도록 한다. 파지 디스플레이는 스크리닝된 분자가 효모 플랫폼을 통해 디스플레이를 위한 조합 또는 비조합 프로세스를 다시 거치는 동안, 고-처리량 포맷에서 항체-항원 상호 작용의 엄격성과 특이성에 중점을 둔 1차 스크리닝을 위한 라이브러리 크기 (~1011)를 수용한다. 따라서, 각 플랫폼은 기능적으로 특이적인데도 구조적으로 다양한 항체 모이어티를 개발하는 파이프라인에 조합적으로 기여한다. 2 가지 상이한 디스플레이 시스템을 통한 항원 또는 항원-발현 세포 또는 항원 코팅된 입자상 선택의 다중 라운드 프로세스는 목적하는 항체 성질들, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만 친화성, 특이성, 제조 가능성, 새로운 에피토프, 내열성, 항원성, 가용성, 항체의 응집성, 촉매 활성 등의 범위를 양성 또는 음성 선택하는 데 매우 중요하다. 본 방법은 다양한 항원성 표적에 대한 고유 분자의 확인을 용이하게 하는 라이브러리의 다양성을 보존할 수 있도록 한다. 매우 다양한 인간 항체 합성 라이브러리의 생성은 새로운 항체 동정 및 추가적인 상업적 개발을 위한 엄청난 자원의 역할을 한다.
본 발명의 비제한적인 구현예에서, 상기 방법론은 또한 다양성이 2 가지 플랫폼들 사이에서 변환되고 다양한 조작된 항체 포맷들, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만 키메라 항체 분자, Fab, 단편, F(ab')2 단편, Fv 분자, ScFv, ScFab, 다이머 및 트라이머 항체 단편, 미니바디, 인간화 단일클론 항체 분자, 인간 항체, 항체의 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질, 이들 분자로부터 유래된 임의의 기능성 단편 (여기서 유도체 분자들은 모체 항체 분자의 면역학적 기능성을 유지함) 및 모든 기타 항체 포맷으로서 탐구되는 전략을 포함한다.
또 다른 비제한적인 구현예에서, 본 발명의 방법은 또한 2 개의 개별 효모 벡터로부터의 효모 내 더 큰 라이브러리들 (ScFv 또는 Fab 또는 전체 항체)을 생성할 수 있도록 허용하고 친화도 향상을 위한 사슬 무작위화에도 순응적인, 효모의 반수체/이배체 생활 주기의 특징인, 효모 접합 유형에 기반한 전략들을 통합하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 비제한적인 구현예에서, 합성 라이브러리 크기 및 다양성과 같은 특성들은 향상된 항체 특이성 및 친화성을 달성하는 데에 직접적으로 관련이 있다고 의심된다.
본 발명의 합성 항체 라이브러리, 바람직하게는 합성 인간 항체 라이브러리의 생성 또는 개발 방법은 다음 흐름도에 기재되어 있다.
Figure 112018084191332-pct00001
a) 더 상세하게, 항원(들)에 대한 스크리닝 단계를 포함하는 합성 항체 라이브러리, 바람직하게는 합성 인간 항체 유전자 발현 라이브러리를 생성하는 본 방법은 다음 작용/단계를 포함한다: 항체 아미노산 서열의 인실리코 분석 단계;
b) 인실리코 접근법을 통한 중쇄 CDR3 다양성 설계 및 생성 단계; 코돈-치환 기술을 통한 완전한 다양성의 합성 단계.
c) 컨센서스 항체 핵산 서열을 파지미드 벡터 내로 클로닝하는 단계; 합성 핵산 레퍼토리를 파지미드 벡터 내로 혼입하여 합성 파지 라이브러리를 생성하는 단계;
d) 특정 항원 또는 항원 생성 세포에 대한, 파지 디스플레이 라이브러리의 스크리닝 단계.
e) 단계 d)의 스크리닝된 생성물을 효모 벡터 내로 전달/클로닝한 후 상기 생성물을 항원(들)에 대해 스크리닝하는 단계; 및
f) 파지 라이브러리로부터 목적하는 기능적 특성을 갖는 항체 분자를 선택하는 단계.
바람직한 구현예에서, 상기 라이브러리는 항체 구조적 정보가 목적하는 항체 성질들, 예컨대 이에 한정되는 것은 아니지만 친화성, 특이성, 제조 가능성, 새로운 에피토프, 내열성, 항원성, 가용성, 항체의 응집성, 촉매 활성 등의 범위를 양성 또는 음성 선택하는 데 사용되는 이론적 설계 접근법을 채택함으로써 더 개량된다.
바람직한 구현예에서, 인간 합성 항체 라이브러리를 생성하는 본 방법은 다음의 단계들, 즉 다수의 인간 항원-항체 구조를 인실리코 분석하여 이로부터 얻은 정보에 기초해 합성 DNA를 생성하고, 코돈-치환 기술을 사용하여 합성 DNA의 핵산 서열을 코딩하는 아미노산 서열에서 유전자 변형을 수행하는 단계를 포함한다. 그 후, 항체를 코딩하는 변형된 핵산 서열을 파지 및/또는 효모 벡터 내로 클로닝 한 후 특정 항원 표적에 대해 약 2 내지 약 5 라운드의 라이브러리 스크리닝을 수행한다. 그 후, 스크리닝된 분자 풀을 효모 벡터 내로 클로닝하고 특정 항원 표적에 대해 약 1 내지 약 3 라운드의 스크리닝을 수행한다. 표적 항원에 대해 더 높은 친화성 또는 다른 목적하는 항체 특성(들)을 보이는 특정 집단을 단리하고, 개별 클론을 분리하고, 이로부터 수득된 클론 집단을 특정 분자를 선택하는 데 사용하여 추가적인 항체를 개발한다.
본 발명의 예시적인 구현예에서, 상기 인간 합성 항체 라이브러리의 생성 방법은 다음 단계들을 포함한다.
1 단계: 다양한 데이터베이스로부터 다운로드한 몇몇 항체 서열에 대해 수행한 인실리코 분석에 기반하여 변형된 핵산 서열 또는 합성 DNA를 생성하는 단계. 상기 단계는 특정 파지 발현 벡터에서 인간 면역 글로불린 가변 중쇄 (VH) & 가변 경쇄 (VL)의 고도로 최적화된 컨센서스 서열의 사용을 가능하게 하는 정확하게 제어된 설계를 제작하는 단계를 포함한다. 상기 컨센서스 영역에는 고도의 가변 CDR 영역이 산재되어있다. CDR 영역은 각 CDR의 길이뿐만 아니라 아미노산 서열에 대해 가변적이다. CDR 길이 및 CDR 아미노산 조성에 대한 정보를 분석하여 각 위치에서의 아미노산 가변성의 빈도를 유도하고; 이와 유사하게 길이 분포 또한 결정된다. 이 특정 CDR에서의 아미노산 치환 및 상응하는 CDR 길이를 종합하면 다양한 항원 인식에 기여할 것이다. 바람직하게는, 합성 항체 라이브러리의 설계, 구축 및 적용을 위한 완전한 방법은 상보성-결정 영역에 한정되지 않는 다양성을 갖는 컨센서스 중쇄 및 경쇄 서열상에 구축된다. 합성 분자의 다양성은 아미노산 빈도의 위치적 다양성 및 가변 중쇄 서열의 CDR3의 다양한 길이 분포의 인실리코 분석과 이해를 통해 유도되는 아미노산 분포 매트릭스의 전략적 설계를 통해 달성된다. 이에 따라 얻어지는 아미노산 조성의 다양성은 코돈 치환 기술을 사용하여 DNA 분자를 생성하는 데 사용된다. 2 단계: 합성적으로 제조된 DNA 단편을 함께 수집/풀링하고 특정 파지미드 벡터 집합 내로 클로닝한다. 파지미드 벡터 내로의 상기 클로닝은 라이브러리 분자의 광대한 크기 및 다양성을 확보한다는 개념으로 수행된다. 단계 3: 상기 벡터를 항체 유전자를 발현하는 데 사용한 후 특정 항원 표적에 대해 스크리닝을 실시한다. 바람직하게는, 분자 라이브러리의 스크리닝은 특정 항원에 대한 1 라운드의 선택을 통해 바이오-패닝함으로써 수행될 것이다. 비결합자를 씻어내고, 결합된 클론을 선택적으로 용리하고, 선택된 클론을 E. coli에 한정되지 않는 숙주 내로 재증폭함으로써 특정 결합제를 라이브러리로부터 선택한다. 4 단계: 파지 디스플레이 플랫폼으로부터 선택된 분자 풀을 효모 디스플레이 플랫폼으로 전달한다. 바람직하게는, 파지 디스플레이 플랫폼에서 스크리닝된 선택된 분자 풀을 진핵성 시스템 내로 선택된 다양성의 무작위화 또는 비무작위화, 즉 중쇄 및 경쇄의 조합으로 전달함으로써, 중쇄 및 경쇄의 특정 조합을 포함하거나 포함하지 않는 선택된 분자 풀을 보존한다. 이 전달은 파지 디스플레이 플랫폼 내 중쇄 및 경쇄의 폴딩 및 페어링과 관련된 문제들을 극복하기 위하여 특별히 수행될 것이다. 효모 디스플레이 플랫폼은 상이한 포맷의 다양한 항체 모이어티를 발현하는 다양한 설정으로 구성된다. 5 단계: 효모 플랫폼을 사용하여 디스플레이되는 분자/항체 단편을 특정 항원 표적에 대해 스크리닝한다. 표적 항원에 대해 더 높은 친화성을 보이는 특정 항체 집단을 분리한다. 필요한 경우, 이들 선택된 풀을 항원 특이성에 대해 추가로 테스트한다. 6 단계: 스크리닝된 항체 풀로부터의 개별 클론을 분리하고 클론 집단을 "선도 분자"를 코딩하는 핵산 서열을 단리하는 데 사용한다. 몇몇 생물정보학 툴을 사용하여 항체-항원 상호 작용 연구를 신중하게 분석 및 이해하면, 선도 분자의 핵산 서열에 더 많은 변화를 통합시킬 수 있다.
조합 접근법을 통해, 즉 무작위로 조합된 중쇄 및 경쇄의 개념을 사용함으로써 개발된 인간 합성 항체 레퍼토리를 발현하는 파지 및 효모 디스플레이 플랫폼의 순차적 사용은, 광범위한 치료 표적을 스크리닝하고 향상된 친화성 및 특이성을 갖는 고유 항체 분자의 동정을 가능하게 한다. 또한, 사용되는 또 다른 접근법은, 파지 디스플레이 라이브러리 스크리닝으로부터 수득된 중쇄 및 경쇄의 특정 조합을 보존한 후, 파지로부터 효모 내로 전달하여 다양한 항체 포맷의 특정 조합을 변화시키지 않도록 유지하는 유연성을 이용한다. 순차적 또는 조합 효모 디스플레이 시스템/플랫폼 및 파지 디스플레이 시스템을 사용하는 유연성은 Fab, ScFV, ScFab 분자 또는 임의의 항체 포맷과 같은 다양한 아웃풋 포맷뿐만 아니라, 반수체 세포 발현 및 이배체 세포 발현에 대한 편리한 선택이다. 다양한 옵션 유용성을 통해 이 조합 효모 디스플레이 및 파지 디스플레이 포맷이 면역 글로불린 구조를 모방한 리간드를 선택하는 독특하고, 유연하며 필수적인 플랫폼으로 성공할 수 있다.
항원 및 항체 구조-기능 분석의 상세한 이해는 아미노산 서열 모티프의 추가적인 변형을 가능하게 하고, 이에 따라 증가된 친화성, 안정성, 발현, 효능 등을 갖는 선도 분자를 생성하는 범위를 증강시킨다. 따라서, 본 발명은 다양한 질환의 표적에 대한 고유 단일클론 항체 동정을 보관할 뿐만 아니라 기능성 유전체학 분야에서의 표적 발견 및 검증에 중요한 역할을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법을 사용하여 제조된 합성 핵산 서열의 레퍼토리를 비롯한 항체 유전자 발현 라이브러리에 관한 것이다.
합성 라이브러리 등의 항체 라이브러리는 특정 치료 표적, 즉 항원에 대해 목적하는 기능적 특성을 갖는 신규 항체 단편 또는 분자의 단리를 가능하게 한다.
라이브러리의 상기 카테고리의 고유성은, 면역계로부터의 천연 항체의 범위를 벗어난 친화성 및 특이성을 갖는 제어된 방식으로 설계되고; 더 높은 친화성 및 특이성을 갖는 항원(들)을 표적화할 능력을 가질 수 있는 다양한 항체를 가지는 것이다. 그러나, 나이브 항체 라이브러리와 관련하여, 그 안의 정보는 예컨대, 관심 대상이 될 수 있는 체세포 초돌연변이 또는 다른 생리학적 현상으로부터 발생하는 아미노산 가변성을 포함하지 않을 것이다. 또한, 나이브 라이브러리 내의 항체 레퍼토리는 항원 접촉에 의해 형성되지 않기 때문에, 나이브 라이브러리 친화성은 본 발명과 같은 합성 라이브러리 친화성과 비교할 때 온건할 것으로 예상되지만, 적어도 유의하지 않다. 비교에서, 면역화 및 클론 선택 후 면역 글로불린에서 보이는 돌연변이 패턴을 모방하기 위해 인실리코 연구가 사용되었기 때문에, 항원에 대한 합성 라이브러리의 친화성이 높고 특이적일 것으로 기대된다.
본 발명은 또한 항원 표적에 대해 스크리닝하기 위한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 합성 핵산 서열의 레퍼토리를 비롯한 항체 유전자 발현 라이브러리의 사용에 관한 것이다.
비제한적인 구현예에서, 본 발명의 항체 유전자 발현 라이브러리는, 이에 한정되는 것은 아니지만 치료, 진단, 예후, 연구 목적 및 항체 또는 항체 유도체가 사용되는 사실상 모든 적용을 비롯한 여러 분야에서 응용된다.
요약하자면, 전술한 측면에서, 본 발명은 특히 다양한 친화성 및 특이성을 갖는 다수의 항원에 대한 항체 또는 항체 단편을 스크리닝 및 생성하는 데 사용될 수 있는, 고도로 다양하고 기능적인 합성 항체 레퍼토리의 생성에 관한 것이다. 본 발명의 독점적 설계 및 합성 항체 라이브러리의 생성은, 기존의 기술 분야에 대한 이해와 기존의 합성 항체 라이브러리 및 천연 항체 레퍼토리에 대한 연구로부터 얻은 가치 있는 통찰, 뿐만 아니라 항체 서열 다양성의 분석과 얻어진 지식 및 본 발명에 의해 수행된 항체-항원 상호 작용의 구조-기능 연구에 크게 의존한다.
본 발명은 코돈-치환 기술을 사용하여, 상보성-결정 영역 (CDR3)에 한정되지 않은 다양성을 갖는 컨센서스 아미노산 서열의 풀상에 구축된 적절히 설계된 항체 디스플레이 방법론의 설계 및 생성을 위한 전략을 설명한다. 또한, 본 발명은 상대적으로 보존된 프레임워크 영역상에 존재하는 특정 변형 역시 야기한다. 서열 다양성과 별개로, 길이의 변화는 또한 Fab 항체 분자의 균등한 동등 표현을 위한 전략이 통합된, 데이터베이스 내 CDR의 다양한 길이의 분포에 중점을 두어 고려되었다.
본 발명은 2 가지 별개의 스캐닝 툴, 즉 파지 디스플레이 기술 및 효모 디스플레이 기술을 이용하여 클론 풀의 발현 프로파일을 순차적으로 탐구할 것이다. 이들 기술의 순차적 사용은 파지 기반 라이브러리의 특성인 항체 유전자 다양성의 더 큰 집합을 활용할 수 있도록 하며 항체 클론은 효모 디스플레이 시스템을 통해 스크리닝될 수 있다. 항체 유전자 발현을 위한 효모 디스플레이 시스템의 사용은 세포 표면의 항체 생성물의 진핵 세포 단백질 번역, 가공 및 적절한 폴딩 때문에 유리하다. 효모 발현이 높은 특이성을 갖는 항원 표적과의 적절한 상호 작용을 가능하게 할 것이라는 가설이 존재한다. 이들 2 가지 보완 시스템을 사용하여 얻은 정보는 상용화 능력 면에서 더 높은 성공률을 갖는 "선도 분자"를 생성할 것이다. 상기 제안된 방법은 또한 본 발명의 상기 섹션에서 설명된 바와 같이, 두 플랫폼 간에 다양성이 변환될 수 있고 Fab, ScFv, ScFab 및 다른 항체 포맷에 의해 예시된 다양한 조작된 항체 포맷으로서 상기 다양성이 탐구될 수 있는 전략을 포함한다. 후보 항체 분자는 항체-항원 상호 작용의 구조-기능 연구에 의해 유도된 이론적 설계를 통해 더 최적화 될 것이다.
비제한적인 구현예에서, 본 방법에 의해 수득된 후보 항체 분자는 항체-항원 상호 작용의 구조-기능 연구에 의해 유도된 이론적 설계를 통해 더욱 최적화된다. 약물, 특히 항체 기반 약물의 개발 프로세스는 까다롭고, 시간이 오래 소요되며, 비용이 많이 든다. 이론적 약물 설계의 토대를 집합적으로 형성하는 이들 과제를 해결하기 위해서는 여러 학문 분야에 걸친 접근이 필요하다. 단일클론 항체 약물의 제조 가능성의 성공을 위한 전제 조건은 가용성, 응집성, 항원성, 안정성 등과 같은 다양한 생물학적 및/또는 상호 관련 성질에 좌우된다. 이들 성질의 다수는 항체의 상이한 구조 모티프에 의존하고; 이는 인실리코 접근을 통해 예측할 수 있다. 예시적으로, 이론적이고, 증거에 기초한, 보다 신속한 구조-기반 약물 설계는 암 화학 요법, 내약성 감염, 신경 질환 등의 분야에서 엄청난 기여를 하였다. 이들 방법으로부터 초래된 결과물은 선택된 분자들의 항체 라이브러리 구축 및 제조 가능성을 증강시키기 위하여 본 발명에서 사용된다.
본 발명은 일반적으로 생명 공학, 유전 공학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다양한 친화성 및 특이성을 갖는 다수의 항원에 대한 항체 또는 항체 단편을 스크리닝 및 생성하는데 사용될 수 있는 고도로 다양하고 기능적인 합성 항체 레퍼토리의 생성에 관한 것이다. 이를 종합하면, 본 발명의 관심은 합성 항체 레퍼토리의 보다 효율적인 이용을 목표로 하여, 조합 접근법과 함께 순차적 또는 조합 라이브러리 기술에 집중되어 있다. 항체의 합성 라이브러리는 강한 특이성 및 더 큰 친화성을 갖는 인간 mAb의 시험관 내 선택을 가능하게 한다. 그의 설계로 인해, 이 기술은 선택된 mAb의 유전적 (핵산 수준) 및 기능적 분석 (단백질 수준)을 모두 허용함으로써 인간 면역계의 메커니즘에 대한 연구를 용이하게 한다. 그러한 라이브러리를 포함하는 번역 연구 접근법은 새로운 미래 요법에 집중될 수 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참조하여 추가적으로 설명되며, 실시예는 본질적으로 단지 예시일 뿐이고 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예
사용된 실험 재료
DPBS (GIBCO, USA); FBS (Moregate Biotech, Australia); dNTPs (Ambion, USA); 1 Kb Ladder (Invitrogen, USA); Phusion 효소 (NEB, USA); 아가로오스 (SIGMA, USA); PCR 정제 키트 (Qiagen, USA); 아가로오스 (SIGMA, USA); 겔 용출 키트 (Qiagen, USA); 미니 프렙 키트 (Qiagen, USA); dATP (NEB, USA); T4 DNA 리가아제 (NEB, USA); LB-한천 (Himedia, India), Neb5알파 (NEB, USA); 암피실린 (MP Biomedicals, USA); NcoI-HF, (NEB, USA); XbaI, (NEB, USA); HindIII-HF, (NEB, USA); AscI (NEB, USA); BstEII (NEB, USA); BstBI (NEB, USA); AscI (NEB, USA); NotI (NEB, USA), TG1 세포 (Lucigen, USA); PCR 정제 키트 (Qiagen, USA); LB-한천 (Himedia, India); 미니 프렙 키트 (Qiagen, USA); LB-브로스 (Himedia, India); 암피실린 (MP Biomedicals, USA); dam - / dcm - Competent E. coli (NEB, USA); 카나마이신 (MP biomedicals, USA); M13KO7 헬퍼 파지 (Thermo Scientific, USA); 글리세롤 (Fischer Scientific, USA); PEG 8000, (SIGMA, USA); 염화 나트륨, (SIGMA, USA); PBS (SIGMA, USA); BSA (Biovision, USA); 항-FLAG, (Sigma, USA); HRP 염소 항-마우스 (Biolegend, USA); TMB 기질 (Sunmodics, USA); Herclon®(Roche, USA); 염소-항 인간_IgGFc-HRP Conjugated (Bethyl, USA); Tween 20 (Fisher Scientific, USA); Her2 (Acrobiosystems, China).
실시예 1:
합성 항체 라이브러리 생성을 위한 일반적인 절차.
합성 라이브러리의 성공은 다양해야 하는 고유한 설계 및 충분히 커야 하는 최종 라이브러리 크기에 전적으로 좌우된다. 합성 항체 라이브러리의 크기 & 다양성 및 항체 특이성 & 친화성은 직접적으로 연관되어 있다. 다양성 및 고유성을 커버하는 합리적인 수의 클론을 가지기 위하여, 다수의 항체 서열을 인실리코 분석하였다. 코돈 치환 기술을 확실성 및 다양성을 갖는 변형된 항체 서열을 합성하는 데 사용하였고, 수탁 번호 MTCC 25125의 사내 파지미드 벡터 내로 클로닝하였다. 합성 라이브러리 풀을 나타내는 특정 벡터 내 클로닝된 유전자를 특정 항원에 대하여 전적으로 엄격성에 기초하여 패닝하였다. 선택된 분자 풀을 조합 또는 비조합 접근법을 통해 특정 효모 디스플레이 벡터 (수탁 번호 MTCC 25126, MTCC 25127 및 MTCC 25128) 내로 전달하였다. 그러나, 중쇄 및 경쇄의 무작위화는 2 가지 디스플레이 시스템 간의 차이를 보완할 수 있다. 상기 디스플레이된 단편들을 특정 항원성 표적에 대해 스크리닝하고, 표적 항원에 대해 보다 높은 친화도를 나타내는 집단을 분리하였다. 선택된 풀을 항원 특이성에 대하여 선택적으로 테스트하고, 상기 풀로부터 개별 클론을 분리하고, 상기 선도 분자를 코딩하는 핵산 서열을 단리하는 데 클론 집단을 사용하였다.
실시예 2:
항체 서열은 NCBI, V-base, Genbank 등으로 예시된 다양한 웹사이트로부터 다운로드한다. 기능성 생식 계열 및 재배열된 항체 서열은 IMGT 데이터베이스에서 다운로드한다. 대략 4300 개의 고유 서열을 분석하여, 후에 중복 서열을 제거하였다. 동일한 항원 또는 표적에 대한 항체 서열의 다중 엔트리 또한 분석에서 고려하지 않았다. 중쇄의 CDR3 영역 (CDRH3)이 항원 결합에 주로 관여하므로, 오직 CDRH3 다양성만이 합성 라이브러리에 통합되도록 계획하였다.
모든 CDRH3 서열을 추출하고 추가적인 분석을 위해 정렬하였다. CDRH3 서열의 길이 분포 분석은 4 내지 36 개 아미노산 범위 내의 길이 변화를 나타낸다. 24 개 아미노산 이상 길이의 CDRH3에서 관찰된 아미노산의 낮은 다양성 및 빈도 분포 때문에, 다양성을 도입하기 위해 23 개까지의 아미노산 길이로 진행하기로 결정하였다. 아미노산 조성 분포는 각 위치에 대해 평가된다. 정해진 출현/발생 빈도 퍼센트를 갖는 아미노산의 특정 혼합물에 대해 계산된 확률 지수에 기초하여, 합성 매트릭스를 설계한 후 코돈-치환 기술을 사용하여 합성하였다. 합성된 CDRH3 레퍼토리에 대해 차세대 시퀀싱을 수행하고 이론적 설계와 비교하였다. 이들 다양성에 대하여 인접한 영역은 7 가지 중쇄 서브-패밀리, 즉 H1A, H1B, H2, H3, H4, H5 및 H6과 모두 호환 가능하다. 이들 인접한 영역은 또한 컨센서스 서열 컨스트럭트로의 엔트리 지점 모드로서 사용될 특정 제한 효소로 부착된다. 모든 7 가지 중쇄, 4 가지 카파 경쇄 및 3 가지 람다 사슬 서브-패밀리에 대한 컨센서스 서열은, 인간 코돈 최적화되고, 합성되며, 사내 파지미드 벡터 내로 (Sequence Listing에 열거된 서열을 통해) 모든 49 가지 조합으로 통합된다. 이는 Fab 포맷을 유지하기 위하여 수행된다. 그러나, 파지미드 벡터 내 모든 49 가지 컨센서스 서열 컨스트럭트는 중쇄 서브-패밀리의 존재에 기초하여 7 개의 풀로 분류되며, 여기서 모든 컨스트럭트는 하나의 중쇄 하에서 등몰비로 풀링된다. 특정 중쇄 패밀리와 인접한 CDRH3 다양성을 특정 제한 효소 부위 BstEII / BstBI 및 XbaI 사이에 혼입하였다. CDRH3 레퍼토리의 클로닝을 형질 전환 효율이 >109인 Fab 포맷으로 수행하였고, 여기서 삽입물 존재의 확인은 제한 효소 분해 분석에 의해 수행되었으며 90-95% 이상이다. 선택적으로, 피어 그룹 시퀀싱을 추가로 수행하여 >80%로 예상되는 기능적 다양성을 평가하였다. 모든 7 가지 박테리아 라이브러리를 2 내지 5 x 1010의 균등한 세포수로 풀링하였다. 파지 라이브러리 생성을 계산된 수의 파지 입자 6 x 1010-1011 개로 신중하게 수행하였다. 항원에 대한 패닝 실험의 경우, 결합제를 보다 잘 제어하기 위하여 자기 기반의 접근법을 채택하였다. 자성 dyna비드 상에 코팅된 항원의 제조를 위하여, 비드 접합 효율을 >90% 로 설정하였다. 또한, 패닝을 한 라운드에 고정하여 107 개 이하의 파지 입자를 갖는 비결합자만을 제거하였다. 이 단계는 다음의 효모 디스플레이 라이브러리 스크리닝 단계와 잘 배열되어 있다. 임의의 편향된 증폭을 피하거나 관련되지 않은 집단 농축을 표적화하기 위하여, 고정된 90 분의 파지 증폭 기간을 사용하였다. 패닝된 나이브 라이브러리를 전달하기 위하여, 연어 정자 DNA의 존재하에서 ssDNA를 단리한 후 삽입물, 즉 중쇄 및 경쇄 레퍼토리를 증폭시켰다. 정제된 레퍼토리를 분해시키고 2 가지 포맷, 즉 Fab 포맷 및 ScFv 포맷으로 효모 발현 벡터 내로 결찰시켰다. 다수의 효모 벡터를, 동일한 프로모터 또는 2 개의 별개 프로모터로부터의 동일한 벡터와 2 개의 별개 벡터의 항체 중쇄 및 경쇄를 발현하도록 효모 접합 유형을 사용하여 설계하였다. 모든 경우에서, 효모 내 형질 전환 효율은 >107이었다. 형질 전환된 효모 세포를 중쇄, 경쇄 및 전체 집단의 15-50% 이상인 Fab 분자의 발현에 대하여 검사하였다. 접합 유형의 경우, 접합 효율은 30-50%의 범위에 이른다. 상기 발현 분석을 FLAG, c-Myc 및 중쇄과 경쇄 각각에 대한 (His)6-태그 및 V5-태그와 같은 다양한 태그들로 수행하였다. 항원 결합에 대한 유동 기반의 분류를 항원 및 중쇄 또는 경쇄 모두에 대하여 이중 양성으로 분석하였다. 분류된 효모 클론을 결합 연구를 위하여 개별적으로 성장 및 테스트하기 전, 특정 항원에 대해 2 내지 3 라운드 이상 수집, 성장 및 스크리닝하였다.
다음 흐름도는 본 발명의 중요한 가공 단계를 나타낸다.
스테이지 1: 합성 다양성 설계부터 파지 내 합성 항체 라이브러리 생성까지의 가공 단계.
Figure 112018084191332-pct00002
스테이지 2: 독립적인 결합제의 유동 분류를 사용하여, 효모 클론 개발에 대한 파지 라이브러리 스크리닝 단계를 포함하는 가공 단계
Figure 112018084191332-pct00003
서열 분석
항체 서열을 IMGT 데이터베이스 (http://www.imgt.org/IMGT_jcta/jcta?livret=0)에서 다운로드하였고, 여기서 재배열된 서열을 다음 파라미터들; 주석 레벨 (ANNOTATION_LEVEL)=완전히 주석화된 종 (SPECIES)=호모 사피엔스 (인간); 구성 유형 (CONFIGURATION_TYPE)=생식 계열, 재배열된 유전자 유형 (GENE_TYPE)=가변적, 다양성, 접합; 기능성 (FUNCTIONALITY)=기능적, 생산적 군 (GROUP)=IGHV을 사용하여 동정하였다. 이 서열들을 중복 검사 (redundancy check)를 통해 필터링하였고 이에 따라 총 ~4300 개의 서열이 ~ 2830 개의 서열로 줄어들었다. 초기 서열들을 또한 동일한 항원에 대한 항체 서열의 임의의 다중 엔트리가 있는지 여부에 대해 검사하였다. 후속 분석을 위하여 오직 고유 서열만을 유지하였다.
항원-항체 상호 작용에 대하여 수행된 다수의 구조-기능 연구들은 중쇄의 CDR3 (CDRH3)가 표적과의 최대 접촉 수를 만들고 항원 결합에 대부분 기여함을 암시한다. 따라서, 설계를 통해 다양성을 도입하는 데 바람직한 CDR은 CDRH3이다. 그러나, 합성 라이브러리의 효율성 및 생산성은 다양성을 제공하는 특유의 설계 및 크기를 수용하는 지원 기술에 전적으로 의존하는, 라이브러리의 다양성 및 크기에 좌우된다. CDRH3 서열을 프레임워크 3 및 프레임워크 4 서열의 상대적으로 보존된 경계에 기초하여 추출하였다.
모든 CDRH3 서열을 각 서열 위치에서의 길이 및 조성에 기초하여 분류하였다. 수득된 CDRH3 서열은 4 내지 36에 이르는 상이한 길이를 가진다 (도 1). 길이 변화에 대해 보인 가우시안 (Gaussian) 빈도 분포는 사실상 분명히 CDRH3 길이의 확실한 편향을 나타낸다. 현저하게, >24 개 아미노산 길이의 CDRH3를 갖는 항체 집단의 빈도는 극히 낮았다. 따라서, 4 내지 23 개의 아미노산에 이르는 길이의 CDRH3에 중점을 두어 작업하기로 결정하였다. 길이의 분류 이후, 각 CDRH3 서열은 조성 편향에 대해 분석되었고, 여기서 특정 위치에 대한 20 개의 천연 아미노산 각각에 대한 발생 빈도가 결정되었다. 아미노산에 대한 위치적 선호가 결정되었고 (도 2), 그의 자연적인 존재와 유사하다는 것이 밝혀졌다. 자연에서 보이는 아미노산 다양성의 편향은 상기 설계에서도 마찬가지로 보존될 것이다. 그러나, 모든 20 개의 아미노산 치환에 따른 모든 CDRH3 길이의 완전한 무작위화는 >1023의 천문학적 숫자를 유도할 것이다. 본 발명에서, 다양성을 손상시키지 않으면서 그 수를 감소시키는 개선된 방법을 개발하였다.
따라서, 합성 라이브러리 설계에서 위치 상관 관계 (positional correlation)라는 독특한 개념이 도입되었다. 그러나, CDRH3의 길이가 증가함에 따라 아미노산의 수가 감소하면서 길이가 4 내지 10 인 CDRH3 영역에서 모든 20 개의 아미노산이 발생할 확률과 같은, 서열 분석에서 나온 몇몇 결과가 존재한다. 심지어 상관 관계 분석 없이도 주목할 만한 몇 가지 두드러지는 특징들이 있다. 예를 들어, 각 길이마다, 거의 모든 위치에서 높은 발생 확률을 갖는 글리신에 의해 예시되는 바와 같이, 우세한 아미노산에 의해 항상 점유되는 특정 위치가 존재한다. 또 다른 결과는 40% 내지 58% 범위로 발생하는 티로신 (Y)으로 끝나는 CDRH3 영역에 대한 강한 선호에 관한 것이며, 마지막에서 두 번째 잔기는 54% 내지 85% 범위로 발생하는 아스파르트산 (D)으로 되는 강한 경향이 있는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 15 개 아미노산 길이의 CDRH3가 티로신 억제와 발린으로의 시프트를 선호하는 한편, 마지막 잔기로서의 티로신에 대한 선호는 14 길이의 CDRH3까지 보여진다. 서열 위치 상관 관계 또한 고려된다. 예를 들어, 설계된 서열은 마지막 위치에서의 티로신 및 마지막에서 두 번째 위치에서의 아스파르트산/발린과 동일한 비율을 가져야한다. 초기 서열 분석은 라이브러리를 합성하기 위하여 무작위화되어야 하는 총 270 개의 위치를 야기한다. 추가적인 분석을 수행하기 위하여, 상이한 길이의 CDRH3에서의 서로 다른 위치 사이의 확률을 계산하였다. 다음으로, 20 개 개별 아미노산에 대한 확률 차이를 더하여 두 위치 당 하나의 숫자를 생성하였고 다른 한 쌍의 위치와 비교하였다. 차이가 작을수록 위치가 더 유사하다는 것을 의미한다. 예시된 바와 같이, 21 길이의 위치 19와 8 길이의 위치 7의 확률 차이 값은 1.98이며, 12 길이의 위치 10과 11 길이의 위치 9의 확률 차이 값은 0.15이므로, 이는 후자 쌍에서의 아미노산 조성 빈도가 전자 쌍에 비하여 유사성이 더 높다는 것을 의미한다. 따라서 원칙적으로, 동일한 혼합물을 한도 내에서 존재하는 합성에 사용할 수 있고, 이로써 다양성에 대한 타협은 없다. 확률 차이 수를 0.5로 진행하기로 결정하였다; 아웃풋 값 및 상응하는 아미노산 분포를 수동으로 검사하였고 상기 값과 일치하는 것으로 밝혀졌다. 몇몇 연구자들 그룹에서 앞서 성공한 것에 기반하여, 코돈 치환 기술을 레퍼토리를 합성하는 데 채택하였다. 코돈 치환 기술은 특정 위치를 다양화하는 구성 요소로서 선택된 트리-뉴클레오티드의 사용을 포함한다. 이는 원치 않는 종결 코돈 또는 아미노산의 발생을 회피하는 아미노산 조성의 완전한 맞춤 제작을 가능하게 하여, 축퇴 코돈을 사용하는 무작위화와 같은 종래의 기술을 사용하는 것보다 상당히 높은 품질의 라이브러리를 달성할 수 있도록 한다. 이를 종합하면, 코돈 치환 기술은 적은 수의 프레임 유실 (out-of-frame), 종결 코돈 및 원치 않는 아미노산 함유 서열로, 목적하는 아미노산의 통합을 완전히 제어할 수 있다. 따라서, 이 기술은 가장 큰 영향을 미칠 것으로 예상되는 위치에 이론적 다양성을 창출한다. 그러나, 위치 상관 지수 없이 완전한 다양성을 이용하는 데 필요한 270 개의 고유 혼합물이 존재한다. 합성 라이브러리를 설계하기 위한 위치 상관 관계 개념의 도입은 아미노산 혼합물을 270 개에서 101 개 고유 혼합물로 감소시켰다. 이 개념은 전체 프로세스가 매우 효율적이고, 합성 및 후속 단계와 관련된 몇몇 기술적 한계점과 호환 가능하도록 한다. 이 개념의 결과는 대표적 혼합물이 선택되어야 하는 아미노산 혼합물의 12 가지 고유 그룹이다. 이는 대표적 혼합물이 어떠한 조합도 놓치지 않아야 하기 때문에 중요하다. 이 문제를 해결하기 위하여, 진정한 다양성의 개념, 즉 샤논 엔트로피를 사용하였으며, 여기서 정보 컨텐츠의 예측불가능성을 측정하였다. 샤논 엔트로피 측정은 두 가지 파라미터, 예컨대 시스템 내 풍부도 (richness) 및 존재도 (abundance)을 포함한다. 상기 풍부도는 아미노산의 다양성 (variety)을 나타내는 한편 상기 존재도는 발생 확률을 포함한다. 계산은 다음 식을 사용하여 수행되며, 여기서 Pi는 아미노산 발생 확률에 관한 것이다.
Figure 112018084191332-pct00004
상기 프로그램을 벤치마킹하기 위하여, 한 아미노산의 확률이 1이고 다른 19 개 아미노산의 확률이 0인 두 가지 알려진 상황이 제공된다. 두 번째 조건의 경우, 모든 20 개 아미노산이 동등한 발생 확률을 가지며 이는 가장 높은 다양성을 나타낸다. 다양성이 0인 경우 상기 값은 1이고, 다양성이 최대인 경우 상기 값은 0.05이다. 전술한 바와 같이, 라이브러리 합성은 코돈 치환 기술을 통해 수행되어 생성물을 보다 잘 제어할 수 있도록 한다. 코돈의 선택은 인간 코돈 사용에 한정된다.
컨센서스 컨스트럭트의 생성
재배열된 서열이 아미노산 잔기를 향해 특정 위치에 편향되고 항원에 대한 스크리닝 후 우세한 서열의 선택이 관찰되는 것을 생식 계열 패밀리에서 볼 수 있다. 따라서, 나중에 가장 빈번하게 사용되는 서열의 선택과 관련하여 완전한 비편향성 (un-biasness)을 가지기 위하여, 컨센서스 서열을 CDRH3 다양성이 합성 라이브러리의 생성을 위해 도입되는 일정한 배경으로 (Sequence Listing에 따라) 합성 및 사용하였다. 중쇄 및 경쇄 CDR1 및 CDR2 영역 모두에 대하여, 재배열된 서열의 컨센서스를 상응하는 패밀리의 생식 계열 서열 중 하나의 아미노산 서열로 치환하였다. 따라서 이 절차는 임의의 편향을 제거하는데, 이는 재배열 및 돌연변이된 서열의 CDR이 이들의 특정 항원에 대한 선택으로 인해 돌연변이된 것으로 알려져 있기 때문이다.
7 개의 중쇄 및 7 개의 경쇄 (4 개의 카파 경쇄 & 3 개의 람다 경쇄) 컨센서스 서열을 인간에 대해 코돈 최적화하고 Geneart (Thermo Fischer, Germany)로부터 합성하였다. 합성된 유전자는 사내 파지미드 벡터 (수탁 # MTCC 25125) 내로의 개별 엔트리에 대한 호환 가능한 제한 효소 부위가 인접해있다. 따라서 컨스트럭트를 함유하는 총 49 개의 개별 컨센서스 서열이 생성된다 (도 3A & B). CDRH3의 합성 다양성을 통합하기 위하여, H1A, H1B, H4 및 H5 패밀리에 대하여는 FR3 영역에 5' BstEII 부위를 선택하는 한편, H2, H3 및 H6 중쇄 패밀리에 대하여는 5' BstBI 제한 효소 부위를 고정하였다. XbaI를 모든 중쇄 패밀리에 대하여 3' 제한 효소 부위로 결정하였다 (도 3C). 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역을 함유하는 상응하는 파지미드 벡터와 함께, 11 μg의 중쇄 (H1A, H1B, H2, H3, H4, H5 및 H6)를 37 ℃에서 3 시간 동안 총 부피 100 μL에서 NcoI -HF & XbaI로 분해시켰다 (표 1). 분해된 샘플을 겔 용출하였으며, 여기서 절단된 겔을 3 부피의 완충액 QX1 용액을 혼합함으로써 용해시켰다. 30 μL의 QIAEX II 비드를 30 초 동안 볼텍싱한 후 50 ℃에서 10 분 동안 배양하였다. 비드에 일련의 세척을 제공하였으며; 먼저 500 μL의 QX1 이어서 500 μL PE 완충액으로 2 회 세척하였다. DNA를 뉴클레아제가 없는 물 30 μL로 용출하였다. 용출된 DNA를 표 2에 설명한 바와 같이 설정하여 4 ℃에서 밤새 결찰하는 데 사용하였다.
DNA (벡터/H1A) 10 μg
NcoI -HF (20U/μL) 4 μL
XbaI (20U/ μL) 4 μL
Cut smart 완충액 10 μL
물 milli-Q 물의 개별 부피
총 부피 100 μL
DNA (벡터) 50 ng
DNA (삽입) 125 ng
T4 DNA 리가아제 1 μL
T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) 1 μL
물 2.5 μL
총 부피 10 μL
5 μL의 결찰된 샘플을 열충격 방법으로 dam-/ dcm - Competent E. coli로 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 세포를 LB-한천-암피실린 배지상에 도말하여 밤새 배양하였다. 클론을 NcoI -HF & XbaI로 제한 효소 분해함으로써 확인하였다 (도 4; 표 3). 유사하게, H1B, H2, H3, H4, H5 및 H6에 대한 중쇄 컨센서스 컨스트럭트를 생성하였다.
반응 혼합물
DNA 2 μg
완충액 2 μl
NcoI -HF (20U/μL) 1 μl
XbaI (20U/μL) 1 μl
물 Mili-Q 물의 개별 부피
총 부피 20 μl
파지미드 컨스트럭트 (경쇄 카파 또는 경쇄 람다 불변 영역)를 함유하는 추가적인 H1A 컨센서스 서열을 미디 프렙 키트를 사용하여 단리하고 경쇄 카파 (K1, K2, K3 및 K4) 및 경쇄 람다 (L1, L2 및 L3) 컨센서스 서열과 함께 HindIII -HF 및 AscI 제한 효소로 대량으로 분해하였다 (표 4).
H1A 컨센서스
파지미드 		K1 내지 K4 삽입
공급원 		L1 내지 L3 삽입
공급원
DNA (H1A) 10.0 μg 10.0 μg 10.0 μg
HindIII-HF (20U/μL) 4 μL 4 μL 4 μL
AscI (10U/ μL) 4 μL 4 μL 4 μL
Cut smart 완충액 10 μL 10 μL 10 μL
물 Mili-Q 물의 개별 부피 Mili-Q 물의 개별 부피 Mili-Q 물의 개별 부피
총 부피 100 μL 100 μL 100 μL
분해된 샘플을 전술한 바와 같이 겔 용출하였다. 용출된 DNA를 표 5에 설명한 바와 같이 K1 내지 K4 및 L1 내지 L3에 대해 개별적으로 설정하여 결찰하는 데 사용하고 4 ℃에서 밤새 배양하였다.
DNA (벡터) 50 ng
DNA (삽입, K1 내지 K4 또는 L1 내지 L3) 125 ng
T4 DNA 리가아제 1 μL
T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) 1 μL
물 2.5 μL
총 부피 10 μL
5 μL의 결찰된 샘플를 열충격 방법으로 dam-/ dcm - Competent E. coli로 형질 전환시킨 후, 형질 전환된 세포를 LB-한천-암피실린 배지상에 도말하여 밤새 배양하였다. 각각의 경쇄에 대한 클론을 HindIII -HF & AscI로 제한 효소 분해함으로써 확인하였다 (도 5 및 6). 이어서 파지미드 컨센서스 컨스트럭트를 함유하는 H1B, H2, H3, H4, H5 및 H6에 대하여 동일한 방법론을 사용하여 총 49 개의 컨스트럭트를 생성하였다.
다양성의 합성 및 검증
설계된 CDRH3 다양성의 합성을 코돈 치환 기술을 사용하여 완성하였다. 합성된 라이브러리를 실시간 PCR로 정량화하였다 (도 7). 라이브러리를 Ion Torrent PGM, Hi-Q-View 화학을 사용하여 차세대 시퀀싱으로 분석하였다. 서열 당 평균 해독 수 (Average Number of Reads per Sequence)는 24.4이다. 상기 분석은 105174 중 10947의 서열이 리딩 프레임 내에 결실 (3409), 삽입 (6558) 또는 치환 (1525)을 갖는 오류 서열을 함유함을 나타낸다 (도 8A). 라이브러리의 생존율은 91.2%이며 라이브러리의 정확도는 89.6%임이 밝혀졌다. 각 CDRH3 길이에 대하여 합성된 분자의 수는 근사값과 동등하게 많다는 (abundant) 것이 밝혀졌다 (도 8B). 천연 CDRH3 길이 분포와 달리, 합성된 CDRH3 길이 분포는 가우시안 분포를 따르지 않는다 (도 8C). 이는 아마도 4 내지 23 범위의 상이한 길이를 갖는 비편향된 분자가 존재하는, 설계된 라이브러리의 강도를 내포할 것이다. 또한, 다른 CDRH3 길이와 비교할 때 천연 레퍼토리에서 불충분하게 나타나는 4 내지 10 개 아미노산 길이의 CDRH3의 발생 퍼센트가 증가하였고; 이에 따라 합성 풀 내 다양한 분자의 잠재적 수를 증가시켰다. 또한, 다수의 10 내지 19 개 아미노산 길이의 CDRH3는 발생 빈도의 유사한 퍼센트로 유지되고; 이에 따라 이들 세그먼트의 최대 다양성이 유지된다. 천연 레퍼토리 및 합성된 레퍼토리 사이의, 20 내지 23 개 아미노산 범위 길이의 CDRH3에서 현저한 변화는 존재하지 않는다. 아미노산 빈도 분포 분석을 합성된 모든 길이의 CDRH3에 대하여 수행하였다 (도 9 내지 13). 합성 라이브러리를 또한 Sanger 시퀀싱을 통한 피어 그룹 시퀀싱에 의해 분석하였다. 총 96 개의 개별 콜로니를 선정하고 시퀀싱하였다. 95 개 중 5 개의 서열이 리딩 프레임 내에 결실 (1), 삽입 (0) 또는 치환 (4)을 갖는 오류 서열을 함유하였다. 이를 종합하면, 피어 그룹 시퀀싱으로부터 얻은 라이브러리의 정확도는 95%인 것으로 밝혀졌다.
다양성의 컨센서스 컨스트럭트를 함유하는 중쇄 및 경쇄 내로의 통합
합성 라이브러리를 생성하기 위하여, (카파 또는 람다 경쇄를 갖는) 개별 컨스트럭트를 함유하는 고정된 중쇄를 풀링하였다. H1A 중쇄 패밀리에 대해 예시된 바와 같이, 다음의 조합을 갖는 7 가지 컨스트럭트가 존재한다; H1A-K1, H1A-K2, H1A-K3, H1A-K4, H1A-L1, H1A-L2 및 H1A-L3. 이들 모든 컨스트럭트를 각각 2.9 μg의 동일한 양으로 풀링하고 H1A 컨스트럭트의 마스터 풀 (master pool)을 제조하였다.
CDRH3 다양성을 전술한 설계에 따라 합성하였다. 다양성은 각 중쇄 패밀리, 즉 H1A, H1B, H2, H3, H5 및 H6과 관련된다. 모든 라이브러리는 라이브러리의 방출에 적절하게 사용되어 컨센서스 컨스트럭트의 각 중쇄 풀 내로 통합되는 각 BstEII/BstBI 및 XbaI 제한 효소와 관련된다.
컨센서스 컨스트럭트의 H1A 풀의 경우, BstEII 및 XbaI 제한 효소 부위를 갖는 H1A 인접 영역과 호환 가능한 CDRH3 다양성을 H1A-합성 라이브러리를 생성하는 데 사용하였다. 10 μg의 H1A 풀 컨센서스 컨스트럭트와 15 μg의 H1A-CDRH3 다양성 풀을 총 부피 100 μL에서, 65 ℃에서 8 시간 동안 BstEII로 이어서 37 ℃에서 밤새 XbaI로 순차적으로 분해하였다 (도 14 & 15; 표 6). 이어서 H1B, H2, H3, H4, H5 및 H6 컨스트럭트에 대하여도 동일한 방법론을 사용하였다 (도 14). 분해된 샘플을 겔 용출하였으며, 여기서 절단된 겔을 3 부피의 완충액 QX1 용액을 혼합함으로써 용해시켰다. 30 μL의 QIAEX II 비드를 30 초 동안 볼텍싱한 후 50 ℃에서 10 분 동안 배양하였다. 비드에 일련의 세척을 제공하였으며; 먼저 500 μL의 QX1 이어서 500 μL PE 완충액으로 2 회 세척하였다. DNA를 뉴클레아제가 없는 물 30 μL로 용출하였다. 용출된 DNA를 표 7에 설명한 바와 같이 설정하여 4 ℃에서 밤새 결찰하는 데 사용하였다.
벡터 삽입
H1A 풀 10 μg 15 μg
Cut smart 완충액 (10X) 10 μl 10 μl
BstEII (20U/ μl) 4 μl 4 μl
XbaI (20U/ μl) 4 μl 4 μl
물 39 μl 72 μl
총 부피 100 μl 100 μl
결찰
벡터 400 ng
삽입 80 ng
리가아제 완충액 (10X) 3 μl
T4 DNA 리가아제 0.6 μl
물 13.8 μl
총 부피 30 μl
25-50 ng의 결찰 혼합물을 일렉트로포레이션을 통해 25 μL의 TG1 세포로 형질 전환시키고, 여기서 1.0 mm 큐벳을 1800 볼트, 600 옴 및 10 μF의 최적의 설정으로 사용하였다. 회수 배지에서 회수한 후, 200 μL의 형질 전환된 세포를 144 mm 플레이트에 도포하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 총 6-8 플레이트가 존재하며, 여기서 다음날 콜로니를 스크랩핑하고 20% 글리세롤로 스톡을 제조하였다. 형질 전환 효율은 희석 플레이팅에 의해 계산되며, 109 내지 약 1010 범위 내, 바람직하게는 ~109인 것으로 밝혀졌다.
희석 플레이팅을 통해 글리세롤 스톡의 바이알 당 총 세포 수를 측정하였으며 1012 개인 것으로 밝혀졌다. 콜로니들을 5 mL LB-Amp에 접종하고 플라스미드를 단리하였다. 상기 단리된 플라스미드를 제한 효소 분해 분석을 위해 검사하고 풀 내의 CDRH3 라이브러리의 존재를 확인하였다.
~109의 형질 전환 효율은 풀에 존재하는 다수의 독립 클론을 나타내고 이에 따라 최대 다양성을 이용한다. 콜로니를 스크랩핑하고 나중에 사용하기 위하여 글리세롤 스톡으로 저장하였다. 바이알 당 추정 세포의 수는 1012 개이며, 이는 완전한 다양성을 나타낸다. 대표적인 클론의 일부를 플라스미드 단리에 사용하여 선택적으로 피어 그룹 시퀀싱을 위하여 보냈다. 시퀀싱 결과는 클로닝된 분자의 대부분이 기능성이고, 4 내지 22 개의 아미노산으로 구성된 상이한 CDRH3 서열 및 길이를 가지고 있음을 나타낸다. 이는 합성에서 박테리아 라이브러리까지 상당한 양의 다양성이 전달되었음을 나타낸다 (도 16). 이어서 다른 중쇄 패밀리에 대하여 유사한 전략을 사용하고 박테리아 스톡을 생성하였다.
박테리아 합성 라이브러리의 제조
파지 라이브러리의 생성을 진행하기 전, CDRH3 다양성을 함유하는 모든 중쇄 패밀리의 마스터 스톡을 생성하는 것이 필수적이며, 여기서 세포수의 면에서의 기여도는 동일하게 유지되었다. 이는 우리에게 표적 분자에 대한 스크리닝 후 선택된 중쇄 패밀리의 선호에 대한 정보를 제공할, 비편향된 시나리오를 사용할 목적으로 수행되었다. 따라서, 모든 중쇄 합성 라이브러리를 패밀리 당 세포수 1010으로 풀링하였다. 풀링된 라이브러리를 파지 라이브러리 제조를 위한 후속 단계에서 사용하였다.
파지 라이브러리 생성
박테리아 마스터 글리세롤 스톡을 함유하는 풀링된 합성 라이브러리 1 ml를 OD 600nm이 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 200 ml LB-AMP 배지로 성장시켰다. 또한, 박테리아에 10의 감염다중도 (multiplicity of infection; MOI)의 M13KO7 헬퍼 파지를 첨가하고 37℃에서 30 분 동안 다시 배양하였다. 감염 후, 감염된 박테리아를 원심 분리하고 펠릿을 100 μg/ml 암피실린 및 25 μg/ml 카나마이신을 함유하는 200 ml의 LB에 재현탁한 후 250 rpm으로 30℃에서 밤새 성장시켰다. 현탁액을 8000 rpm으로 4℃에서 15 분 동안 스핀다운시킨 후 상기 펠릿을 버렸다. 분리된 상층액을 ¼부피의 상층액 내 PEG/NaCl 용액과 혼합하고, 상기 혼합물을 얼음상에서 1 시간 동안 배양하였다. 혼합물을 10000g에서 15 분 동안 원심 분리하고, 파지 펠릿을 20 ml의 PBS에 재현탁하였다. 글리세롤을 전체 파지 현탁액에 50%의 최종 농도로 첨가하고, -80℃에서 1 ml 분취액으로 파지 라이브러리 스톡으로 동결시켰다.
헬퍼 파지를 첨가함으로써, 다양성을 나타내는 파지 입자들은 침전 및 정제되고, 나중에 사용하기 위하여 글리세롤 스톡으로 저장되었다. 플라크 형성 분석 (plaque forming assay)으로부터 유래된 파지 라이브러리의 추산*?*된 수는 약 1010 내지 약 1011, 바람직하게는 ~1011 pfu/mL인 것으로 밝혀졌다 (도 17).
라이브러리의 스크리닝/ 패닝을 위한 전략
합성 라이브러리의 스크리닝은 특정 표적 항원에 대한 잠재적 결합제의 흐름을 생성하기 때문에 가장 중요한 단계이다. 결합제를 생성 및 개발하는 전체 프로세스를 생각하면, 패닝의 목적은 비특이적 결합제를 나이브 레퍼토리 풀로부터 제거하는 것이다. 따라서, 결합, 증폭 및 제한 효소 분해 및 서열 확인 단계로 구성되는 파지 스크리닝 전략을 주의하여 결정하여야 한다. 효율적인 결합을 가지는 것 외에도, 결합하는 동안 어떠한 종류의 편향도 피하도록 항원 및 파지 분자의 비율이 결정되어야 한다.
파지-디스플레이된 항체의 라이브러리는 다른 클론보다 표적에 더 잘 결합하는 클론 및 다른 클론보다 더 빠르게 증폭하는 클론을 함유한다. 이들 특성은 대부분 독립적이다. 이는 또한 증폭 기간이 길어질수록 결합제의 다양성이 상실될 수 있음을 나타낸다. 또한, 표적과 관련이 없는 항체가 풍부해질 수 있다.
상기 언급된 기준을 실제로 유지하면서, 파지 입자에 대한 항원 분자의 비율은 적어도 10-100 배 더 높게 유지된다. 비특이적 결합제의 농축을 피하기 위하여, 증폭은 90 분 이상 지속되지 않는다.
파지 수의 추산
TG1 박테리아 플레이트로부터의 단일 콜로니를 3 ml의 LB 배지 내 박테리아에 접종하고 OD600
Figure 112018084191332-pct00005
0.9가 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. 0.7%의 아가로스를 Milli-Q 물에서 제조하고 15 ml의 팔콘 튜브에 각각 3ml의 분취액씩 50℃에서 저장하였다. 파지 상층액 및 펠릿을 각각의 단계에서 10-1 내지 10-4로 희석하였다. 100 μl의 희석된 파지와 100 μl의 TG1 세포를 각 아가로스 분취액에 첨가 및 혼합한 후 즉시 LB 한천 플레이트에 도포하였다. 플레이트들을 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 플라크 형성을 다음날 관찰 및 계수하였다. 패닝된 분자의 수는 관찰된 플라크의 수에 기초하여 계산된다.
비드 접합
Dyna 비드를 ~108개의 비드에 상응하는 0.5 mg의 양으로 칭량하고 pH 7.4의 0.1 M 인산나트륨 완충액에 용해시켰다. 이 현탁액을 30 초 동안 볼텍싱한 후 연속 회전시키면서 실온에서 10 분 동안 배양하였다. 상기 현탁액을 0.1 M 인산나트륨 완충액으로 2 회 세척하고 100 μL의 0.1M 인산나트륨 완충액에 다시 재현탁하였다. Her2, 리간드 용액, (~100 μL)을 10 μg의 상기 비드 현탁액에 첨가하였다. 또한, 100 μL의 황산암모늄 용액 (3 M 황산암모늄)을 첨가하기 전 현탁액을 잘 혼합하였다. 상기 혼합물을 37℃에서 20 시간 동안 천천히 기울이지만 연속 회전시키면서 배양하였다. 배양 후 상기 튜브는 자기 분리 (magnetic separation)를 위하여 1 분 동안 자석 홀더에 놓았다. 자석 홀더 (튜브는 제자리에 있음)는 조심스럽게 거꾸로 2회 뒤집어 캡 내에 비드가 남아 있지 않도록 하였다. 상층액을 제거하고 비드를 BSA (0.05%)를 함유하는 1mL의 1X PBS로 4 회 세척하였다. 마지막으로, 비드를 BSA (0.05%)를 함유하는 100 μL의 1X PBS에 재현탁한 후 패닝에 사용하였다.
FACS에 의한 비드 접합 효율
패닝에 대하여 자기 분리 기반의 접근법을 수행하기 위해, 항원 코팅된 자성 비드를 생성하였다. 접합 효율은 유동 세포 분석기를 사용하여 측정된다 (도 18). 정제된 Her2가 항원으로서 사용된다. 실험은 항체의 다양한 조합과 함께 ~105개 비드의 배양으로 시작된다. 여기서, 리간드와 결합하는 항체를 비오틴으로 표지하였다. N-히드록시석신이미드 (NHS) 에스테르 -활성화 비오틴은 가장 널리 사용되는 유형의 비오틴화 시약이다. NHS 에스테르는 pH 7-9의 완충액에서 1차 아미노기 (-NH)와 효율적으로 반응하여 안정한 아미드 결합을 형성하였다. 항체 및 기타 단백질은 일반적으로 각 폴리펩티드의 N-말단 이외에도 다수의 리신 (K) 잔기를 함유하기 때문에, NHS-활성화 시약으로 표지하기 위한 표적으로 사용할 수 있는 다수의 1차 아민을 가지고 있다. 비오틴 표지의 정도는 단백질상의 아미노기의 크기 및 분포와 사용된 시약의 양에 좌우된다. 10 mM 비오틴 용액을 2.2 mg의 술포-NHS-비오틴과 500 μL의 물을 혼합하여 만들었다. 1XPBS 내의 항-Her2 항체인 트라스투즈맵 (Trastuzumab) 용액을 2 mg/mL의 농도로 만들었다. 27 μL의 비오틴 용액을 1 mL의 트라스투즈맵에 첨가하고 얼음상에서 2 시간 동안 배양하였다. Thermo Scientific ZebaSpin 탈염 칼럼을 상기 용액으로부터 과량의 결합되지 않은 비오틴 분자를 탈염하는 데 사용하였다. 단백질 농도를 분광 광도계를 사용하여 측정하였고, 농도는 사소한 변화를 나타낸 것으로 밝혀졌다. 비특이적 항체인 리툭시맵 (Rituximab)은 또한 비오틴화되어 있으며, 비오틴화 후의 농도는 2 mg/mL이다. Alexa 633 형광단이 있는 스트렙타비딘 (streptavidin)은 비오틴화의 정도를 활용하기 위한 2차 항체로서 사용하였다. 1 μL의 비드 단독 및 Her2 리간드로 코팅된 비드를 항체, 비오틴화된 트라스투즈맵, 비오틴화된 리툭시맵 없이 0.05 mg/mL의 농도에서 혼합한 후, 0.5% BSA를 함유하는 1X PBS로 100 μL 부피를 제조하였다. 혼합물을 얼음상에서 2 시간 동안 배양한 후, 0.5% BSA를 함유하는 1XPBS로 세척하였다. 마지막으로, 비드를 0.5% BSA를 함유하는 1XPBS 내의 스트렙타비딘-alexa633 용액 25 μL에 재현탁하고 부피는 판독 전에 500 μL로 증가시켰다. Accuri C6 유동 세포 분석기를 사용하여 모든 유동 실험을 수행하며, 상기 분석은 BD Accuri C6 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 우선 전방 및 측방 산란 데이터는 게이트를 고정시키는 것으로 보여지며, 이어서 FLH4 필터를 통한 형광 판독을 수행하였다. 각 샘플에 대하여 적어도 10000개의 데이터 포인트를 수집하였다.
패닝
갓 줄무늬가 생긴 TG1 박테리아 플레이트로부터의 단일 콜로니를 3 ml LB 배지에 접종한 후 37℃에서 OD600
Figure 112018084191332-pct00006
0.9가 될 때까지 배양하고 이를 나중에 파지 감염에 사용하였다. 100 μl의 0.5% MPBS를 항원 접합된 자기 비드의 100 μl 현탁액에 첨가하고 실온에서 2 시간 동안 배양하였다. 파지 라이브러리 분취액을 해동하고, 파지 입자를 250 μl (파지 현탁액 부피의 1/4)의 PEG/NaCl 용액 (20% PEG 8000과 2.5 M NaCl)으로 침전시키고, 얼음상에서 30 분 동안 배양한 후, 10,000 g으로 10 분 동안 침전된 파지를 원심 분리하였다. 상층액을 버리고 파지 펠릿을 200 μl PBS 용액에 재현탁하였다. 파지 현탁액 (200 μl)을 항원과 접합된 비드에 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 회전기에서 배양하였다. 비드를 0.05% PBST (PBS 내의 0.05% Tween-20) 1ml로 적어도 2 회 세척하였다. 마지막으로, 파지 입자 결합제와 결합된 자성 비드를 100 μl PBS에 재현탁하였다. 10 μL의 비드 현탁액은 나중에 플라크 분석을 위해 따로 보관하였다. 남아 있는 90 μl의 현탁액을 앞서 준비한 2 ml의 성장한 TG1 세포에 첨가하고 상기 혼합물을 37℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 배양 후 이를 암피실린을 함유하는 10 ml LB 배지에서 최종 농도 25 μg/ml로 희석하였다. 250 rpm으로 흔들어 주면서 37℃에서 2 시간 더 배양한 후, 암피실린의 농도를 100 μg/ml의 최종 농도까지 증가시켰다. 헬퍼 파지인 M13KO7을 증폭된 TG1 세포에 MOI 10으로 혼합하고 37℃에서 30 분 더 배양하였다. 헬퍼 파지에 감염된 박테리아를 스핀다운시키고 펠릿을 100 μg/ml의 암피실린 및 25 μg/ml의 카나마이신이 보충된 10 ml의 LB 배지에 재현탁한 후 파지 증폭을 위해 30℃에서 90 분 동안 배양하였다. 상기 박테리아 배양물을 10,000 g에서 10 분 동안 원심 분리하여 펠릿다운시켰다. 상기 펠릿을 버리고, 상층액 (상층액 부피의 1/4)에 PEG/NaCl 용액을 첨가함으로써, 증폭된 파지 분자를 침전시키는 데 상층액을 사용하였다. 상기 혼합물을 얼음상에서 30 분 동안 배양한 후, 침전된 파지를 10,000 g에서 10 분 동안 회전시켰다. 상층액을 버리고 펠릿을 1 ml의 PBS에 재현탁하였다. 플라크 분석을 증폭된 파지 수를 측정하기 위하여 10 μL의 증폭된 파지 현탁액에서 수행하였으며, 남아 있는 침전된 파지는 장기 저장을 위하여 -80℃냉동기에서 50% 글리세롤과 저장하였다.
플라크 분석은 파지 입자의 수를 보장하기 위하여 모든 단계에서 수행된다. TG1 박테리아 플레이트로부터의 단일 콜로니를 3ml LB 배지 내 박테리아에 접종하고 OD600
Figure 112018084191332-pct00007
0.9가 될 때까지 37℃에서 성장시켰다. 0.7%의 아가로스를 Milli-Q 물에서 제조하고 15 ml의 팔콘 튜브에 각각 3ml의 분취액씩 50℃에서 저장하였다. 파지 상층액 및 펠릿을 각각의 단계에서 10-1 내지 10-4로 희석하였다. 100 μl의 희석된 파지 및 100 μl의 TG1 세포를 각 아가로스 분취액에 첨가 및 혼합한 후 즉시 LB 한천 플레이트에 도포하였다. 플레이트들을 37℃ 인큐베이터에서 밤새 배양하였다. 플라크 형성을 다음날 관찰 및 계수하였다. 패닝된 분자의 수는 관찰된 플라크의 수에 기초하여 계산된다 (도 19).
파지 ssDNA의 단리 및 PCR을 통한 중쇄 및 경쇄 다양성의 증폭
한 바이알의 증폭된 파지를 해동하고, 혼합물을 여러 번 뒤집음으로써 5 μg의 연어 정자 DNA와 함께 200 μl의 20% PEG/2.5M NaCl를 여기에 첨가한 후, 4℃에서 2 시간 동안 그대로 두었다. (추가적인 선택 및 분류를 위해 패닝된 풀을 효모 디스플레이 시스템으로 전달시키기 위하여, 결합제의 ssDNA가 충분한 양으로 단리되어 있음으로써 패닝된 다양성을 나타낸다. 전단 및 끓인 연어 정자 DNA의 사용은 특히 패닝된 ssDNA의 수율을 개선시킨다.) 연어 정자 DNA를 사용하기 전 전단시키고 끓였다. 연어 DNA를 칭량하고 뉴클레아제가 없는 물과 5 mL/mL의 농도로 혼합하였다. DNA를 22 게이지 바늘로 3 회 부드럽게 혼합하여 전단한 후 5 분간 끓였다. 또한, 절단된 DNA는 추후 사용을 위하여 -20℃에서 분취액으로 저장하였다. 파지, PEG/NaCl 및 연어 정자 DNA를 함유하는 혼합물을 14,000x rpm으로 4℃에서 10 분 동안 원심 분리하고 상층액을 버렸다. 여기서 주목해야 할 점은 파지 펠릿이 보이지 않을 경우, 혼합물을 동일한 속도로 간단히 다시 회전시킨다는 것이다. 상층액을 조심스럽게 피펫팅하여 오직 펠릿만 남긴다. 펠릿을 튜브를 볼텍싱함으로써 100 μl의 요오드화물 완충액 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M 요오드화나트륨 (NaI))에 완전히 재현탁하였다. 250 μl의 100% 에탄올을 첨가하고 -80℃에서 밤새 배양하였다. 상기 제조물을 14,000 rpm으로 4℃에서 30 분 동안 원심 분리하고, 상층액을 버렸다. 펠릿을 0.5 ml의 70% 에탄올로 2 회 세척한 후 공기 중에서 건조시켰다. ssDNA를 함유하는 펠릿을 20 μl의 뉴클레아제가 없는 물에 재현탁하였다.
PCR 증폭을 Vh, Vl 및 Vk 프라이머의 특정 집합으로 수행하였고, Vh의 경우 ~500 bp, Vk 및 Vl의 경우 ~600 bp인 크기를 정정하도록 증폭하였다. PCR 주기의 사용은 제한된 수로 유지되어 PCR 매개 돌연변이의 발생을 피한다. 앰플리콘을 겔 용출되고 Vh의 경우 NcoI -HF 및 NotI -HF, Vk 또는 피의 경우 HindIII -HF 및 AscI를 사용하여 분해하였다 (도 20). PCT 설정 세부 사항은 표 8에 제공하였다.
PCR 설정 　
　 1X (
Figure 112018084191332-pct00008
L)		 3X (
Figure 112018084191332-pct00009
L)
SSDNA 1 3
dNTPs 1 3
5X GC 완충액 10 30
물 23 69
역방향 프라이머 (H/K/L) 2 6
정방향 프라이머 (H/K/L) 2 6
Phusion 효소 (2U/
Figure 112018084191332-pct00010
l)		 1 3
효모 셔틀 벡터 내로의 중쇄 및 경쇄 라이브러리 구축
프로토콜은 효모 시스템에서 스크리닝 및 분류를 수행하기 위하여 파지로부터 효모 발현 벡터로 모든 결합제를 전달시키는 것을 포함한다. 친화성 기반의 방법을 호환 가능한 방법, 즉 FACS를 사용하여 수행하고 최상의 결합제를 추가적으로 선택 및 평가하였다.
항체 포맷의 선택으로서, Fab은 미가공 항체 제조를 위한 초고속 친화성-스크리닝 분석법의 개발을 유도할 것이기 때문에 선호된다. Fab 라이브러리는 접합 시스템을 이용하여 개발되며, 여기서 경쇄 라이브러리 및 중쇄 라이브러리는 상이한 효모 발현 벡터에 클로닝된다 (수탁 # MTCC 25126, MTCC 25127 및 MTCC 25128). 그러나, 경쇄에 대하여 배타적으로 설계 및 생성된, 사내 효모 발현 백터와 함께 패닝된 분자의 카파 및 람다 경쇄 PCR 풀은 HindIII -HF 및 AscI로 절단된 후, TG1, 즉 고도의 수용성 세포로 개별적으로 결찰 및 형질 전환된다.
마찬가지로, HC 사슬 풀 및 상기 개별 벡터를 NcoI -HF 및 NotI -HF로 분해한 후, TG1, 즉 고도의 수용성 세포로 결찰 및 형질 전환시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 모두에 대하여 수득된 형질 전환 효율은 >107 cfu이었다. 이러한 벡터 이외에도, 모든 벡터에 공통적인 독점적 특성으로 생성된 몇 가지 발현 벡터가 존재하고; 반면, 효모 표면상에 디스플레이된 항체 단편의 포맷은 다양하지만 전달된 가변 풀은 전체적으로 일정하게 유지되었다.
중쇄 및 경쇄 라이브러리 모두에 대해 수득된 형질 전환된 콜로니를, 글리세롤 스톡 제조를 위해 스크랩핑하기 전 중쇄의 경우 NcoI -HF/ NotI -HF (도 21a) 및 경쇄 카파 (도 21b)와 람다 (도 21c)의 경우 HindIII -HF/ AscI를 사용하여 삽입물 방출을 검사하였다. 두 사슬에 모두에 대해 삽입물 방출은 패닝된 분자의 존재를 확인하였다. 글리세롤 스톡을 추후 사용을 위하여 -80℃에서 저장하였다. 표 9, 10 및 11는 효모 벡터에서 라이브러리를 구축하는 데 적용 가능한 구성 요소들을 제공한다.
몇몇 대표 클론을 플라스미드 단리에 사용하고 피어 그룹 시퀀싱을 위해 보냈다. 시퀀싱 결과는 거의 모든 클로닝된 분자가 4 내지 22 개 아미노산 길이의 CDRH3로 생산적이고 다양하다는 것을 나타냈다 (도 22).
1X
DNA 10 μg
NcoI-HF (20U/μL) 1 μL
NotI-HF (20U/ μL) 1 μL
Cut smart 완충액 10 μL
물 Mili-Q 물의 개별 부피
총 부피 100 μL
1X
DNA 10 μg
HindIII-HF (20U/ μL) 1 μL
AscI (10U/ μL) 2 μL
Cut smart 완충액 10 μL
물 Mili-Q 물의 개별 부피
총 부피 100 μL
DNA (벡터) 200 ng
DNA (삽입) 60 ng
T4 DNA 리가아제 0.6 μL
T4 DNA 리가아제 완충액 (10X) 2 μL
물 Mili-Q 물의 개별 부피
총 부피 20 μL
효모 내 중쇄 및 경쇄 라이브러리의 형질 전환
다량의 플라스미드 DNA 단리를 두 라이브러리 모두에 대하여 수행한 후, 확인을 위하여 개별 효소로 제한 효소 분해하였다. 검증시, 각 DNA의 1 μg을 채취하여 Frozen-EZ Yeast transformation II KitTM으로 OD600 1.2-1.5에서 효모 세포 내로 형질 전환시켰다. EBY100-ura3-4 및 YVH10을 각각 중쇄 라이브러리 및 경쇄 라이브러리 (카파 및 람다)의 세포 표면 디스플레이를 위한 숙주로서 사용하였다.
더 상세하게는, 5 ml YPD 브로스 내의 효모 세포를 흔들어 주면서 30℃에서 밤새 배양하였다. 밤새 배양한 배양물을 OD600~0.2-0.3이 될 때까지 50 ml로 희석하고 ~1.2 내지 1.5의 OD600까지 성장시킨 후 15 ml의 세포를 500 g에서 4 분 동안 펠릿화시키고 상층액을 버렸다. 1 ml의 EZ 1 용액을 첨가하여 펠릿을 세척하였다. 세포를 다시 펠릿화시키고 상층액을 버렸다. 200 μl의 EZ 2 용액을 첨가하여 펠릿을 재현탁하였다. 200 μl의 수용성 세포를 1 μg의 DNA와 혼합하고 (5 μl 미만의 부피로) 500 μl의 EZ 3 용액을 첨가하고 완전히 혼합한 후 30℃에서 1.30-2.00 시간 동안 배양하였다. 이 배양 도중에, 손가락으로 톡톡 치거나 15-20 분 마다 볼텍싱하여 활발히 혼합하였다. 100 μl의 상기 형질 전환 혼합물을 적절한 드롭 아웃 합성 글루코스 플레이트상에 놓았다. 플레이트들을 30℃에서 2~4 일 동안 배양하여 형질 전환체를 성장시켰다. 중쇄 및 경쇄 패닝된 라이브러리 모두 ~106의 효율로 효모 균주 (EBY100-ura3Δ 및 YVH10) 내로 성공적으로 형질 전환되었다.
효모 접합을 통한 효모 이배체 라이브러리의 구축
표면상에 Fab 포맷의 라이브러리을 디스플레이하기 위하여, 중쇄와 카파 또는 람다인 경쇄 라이브러리를 나타내는 2 개의 성장한 반수체 세포 사이의 접합은 동일한 수의 반수체 세포를 혼합함으로써 이루어진다. 접합 효율은 이중-선택 플레이트에서의 이배체 콜로니의 수를 단일 선택 플레이트에서의 총 콜로니의 수로 나눈 값으로서 계산되며, 여기서 계산된 접합 퍼센트는 ~25%이다. 또한, 이배체 세포를 임의의 성장 및 발현 분석 이전에 이중 드롭 아웃 배지 (Ura-, Trp-)에서 농축시켰다.
더 상세하게, p414GAL1에 HC 패닝된 라이브러리를 함유하는 EBY100-ura3Δ-4 (MATa) 형질 전환체 및 p416GAL1에 LC 패닝된 라이브러리 (카파 및 람다)를 함유하는 YVH10 (MATα) 형질 전환체를 각각 5 ml의 Trp- 드롭 아웃 글루코스 및 Ura- 드롭 아웃 글루코스 배지에서 220 rpm으로 30℃에서 밤새 성장시켰다. 그 후, 반수체 세포를 초기 세포 OD600
Figure 112018084191332-pct00011
0.3에서 재접종하여 선택적 배지 위에 새로 제조하고 광학 밀도가 ~1.2-1.8에 도달할 때까지 성장시켰다. 2 개의 성장한 반수체 세포의 접합은 동일한 수의 세포 (1.0 OD)를 볼텍싱하여 혼합하고, 이들을 YPD 한천 플레이트에 도포시키며, 30℃에서 밤새 배양함으로써 수행하였다. 세포를 이중-선택적 Ura- Trp- 이중 드롭 아웃 글루코스 배지 1 ml로 부드럽게 스크랩핑하여 수집하고 원심 분리함으로써 (2,500 g으로 3 분 동안) 펠릿화하였다. 세포를 1 ml의 멸균된 차가운 탈염수로 재현탁함으로써 세척하고 남아 있는 배지 성분을 제거하기 위하여 원심 분리하였다. 접합 효율을 평가하기 위하여, 세척된 세포를 Ura- Trp- 이중 드롭 아웃 글루코스 배지 1 ml의 총 부피에서 재현탁하고, 연속적으로 희석하며, 이중-선택적 Ura- Trp- 이중 드롭 아웃 글루코스 한천, 즉 Trp 드롭 아웃 글루코스 한천 및 Ura- 드롭 아웃 글루코스 한천 플레이트상에 도포하였다. 플레이트들을 30℃에서 2-3 일 동안 배양하고 콜로니의 수를 계수하였다. 접합 효율 퍼센트는 이중-선택 플레이트에서의 이배체 콜로니의 수를 단일 선택 플레이트에서의 총 콜로니의 수로 나눈 값으로서 계산된다. 이배체를 풍부하게 하기 위하여, 세포를 OD600 = 0.1의 매우 낮은 세포 밀도에서 Ura- Trp- 이중 드롭 아웃 글루코스 배지에 접종하고 필요할 때마다 30℃에서 24 시간 동안 성장시켰다.
항체 유전자 발현 및 효모 세포의 유동 분류 분석
중쇄 풀 및 경쇄 풀을 발현하는 플라스미드를 갖는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 2N 라이브러리를 20 ml의 SDCAA 배지에 접종하고 30℃에서 밤새 성장시켰다. 밤새 성장한 배양물의 OD600을 측정하고 최종 OD600nm이 0.4가 되도록 20 ml의 SDCAA Ura- Trp- 이중 드롭 아웃 글루코스 배지 (유도되지 않은 배양물) 및 20 ml의 2X SGCAA 배지 (유도된 배양물)에 적절하게 접종하였다. 유도되지 않은 세포와 유도된 세포는 20℃에서 24-48 시간 범위 내 상이한 시간 동안 성장한다.
모든 유동 분석을 위하여, 표지된 완충액, 즉 0.5% BSA를 함유하는 1XPBS를 제조한 후 ~106개의 세포 (유도/비유도)를 100 μl LB로 이동시켰다. 세포를 10000 rpm으로 4℃에서 2 분 동안 스핀다운시켰다. 세포들을 건드리지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하였다. 25 μl의 1차 항체 (경쇄의 경우 항-His, 또는 중쇄의 경우 항-c-Myc 항체, 또는 비오틴화된 Her2의 경우 STREP-Alexa 633)를 샘플에 적절한 농도로 첨가하고 4℃에서 30 분 동안 배양하였다 (모든 제조물의 항체 희석은 표지된 완충액에서 수행됨). 또 다른 100 μl의 표지된 완충액을 샘플 튜브에 첨가한 후 세포를 표지된 완충액으로 2 회 세척하였다. 형광단과 접합된 25 μl의 2차 항체를 샘플 튜브에 혼합하였다. 샘플을 다시 4℃에서 20 분 동안 배양하였다. 세포를 100 μl의 표지된 완충액으로 상기 언급한 바와 같이 2 회 세척하고 세포를 350 μl의 1xPBS에서 재현탁한 후 유동 세포 분석기에서 샘플을 분석하였다.
분류 연구를 위하여, 항원 결합을 비오틴화된 항원 (Her2)을 사용하여 모니터링하고 비오틴화된 항원에 대한 양성 이벤트에 기초하여 선택 및 분류하였다. 10 mM 비오틴 용액을 2.2 mg의 술포-NHS-비오틴과 500 μL의 물을 혼합하여 제조하였다. 1xPBS 내의 항원, 즉 Her2 용액을 1 mg/mL의 농도로 제조하였다. 0.28 mM로 측정된 20 배의 몰 과량의 비오틴 용액을 1 mL의 Her2 용액에 첨가하여 반응을 개시한 후, 얼음상에서 2 시간 동안 배양하였다. Thermo Scientific Zeba spin 탈염 칼럼을 상기 용액으로부터 과량의 결합되지 않은 비오틴 분자를 탈염하는 데 사용하였다. 비오틴화된 Her2의 농도는 0.56 mg/mL로 밝혀졌다. 결합 실험을 수행하기 위하여 500 nM 농도의 비오틴화된 항원을 사용하였다.
경쇄 및 중쇄의 발현을 상당한 퍼센트로 관찰하였다. 경쇄 발현은 항-His 항체에 의해 조사되고 ~0.2-0.4%임이 밝혀진 한편 (도 23A 및 24A), 항-c-Myc 항체로 탐침된 중쇄는 ~19-22%임이 밝혀졌다 (도 23B 및 24B). 또한, 비오틴화된 Her2 항원을 이용한 발현 분석은 1.5-1.8%임이 밝혀졌다 (도 23C 및 24C). 이 결과는 효모 표면에서의 성공적인 Fab 형성을 나타낸다. 또한, 비오틴화된 Her2를 이용한 분류가 탐구되었고, ~ 1.3-2%로 착색된 Her2 항원에 대하여 양성인 것으로 밝혀졌다 (도 25). 이는 다른 연구자들이 발견 및 공유한 결과들과 일치하였다. 이 결과는 또한 이중 영양요구성 (auxotrophic) 마커로 선택된 이배체가 중쇄와 관련된 경쇄를 발현함을 나타낸다.
본 발명에서 사용된 접근법의 장점
1. 본 발명의 방법에 의해 수득된 합성 라이브러리는 분자의 다양성을 최대화하고 합성 및 후속 스크리닝 단계와 관련된 기술적 한계를 극복하기 위하여, CDRH3의 효율적인 설계를 고려하여 더 높은 항체 다양성을 보유할 것이다. 이들은 항체 서열의 더 큰 데이터세트로부터 전적으로 유래된 일련의 특정 인실리코 분석을 사용하여 실행되었다.
a. 생식 계열 서열의 동정, 비-중복 서열의 제거를 통해 거른 항체 데이터베이스.
b. 중쇄 CDR3 서열의 동정 후 아미노산 발생 빈도 및 길이 분석의 평가.
c. 위치 상관 인자의 도입 후 다양한 위치에서 아미노산 확률 지수를 결정함으로써 설계 분포 매트릭스의 생성.
d. 진정한 다양성의 개념, 즉 샤논 엔트로피에 기초한 고유 아미노산 빈도 분포의 동정 및 선택의 도입.
우리가 아는 한, 이 접근법은 항체 라이브러리 스페이스에서 최초로 언급되었다.
2. 합성 라이브러리의 설계에 기초하여, 매우 유사한 중쇄 CDR3의 아미노산 조성 다양성이 합성 후 달성되었다.
3. 차세대 시퀀싱 및 피어 그룹 시퀀싱 연구에 의해 판단된 합성 라이브러리의 생산성은 80% 내지 95%에 이른다.
4. CDRH3 길이 (4 내지 23 개의 아미노산) 분포 연구는 모든 CDRH3 길이의 균일한 존재를 나타내고, 천연 레퍼토리에서 부족하게 나타난 CDRH3 길이, 특히 9 개 아미노산까지의 CDRH3 길이에 대하여 상당한 양의 다양성이 존재함을 확인한다. 따라서, 4 내지 23 개의 아미노산 범위의 CDRH3 길이에 대하여 비편향 및 균등한 존재가 달성된다.
5. 본 발명은 파지 및 효모 항체 표면 디스플레이의 독특한 조합을 사용하며, 이는 큰 라이브러리 크기 (1011 개 이상의 클론)의 스크리닝을 허용하며 효모의 번역 후 변형으로 인한 항체 구조의 더 우수한 폴딩을 가능하게 한다.
6. 라이브러리는 상기 항체의 개선된 결합 특징을 위한 항체 CDR 최적화 또는 모티프 이식 접근법을 통합할 것이다.
7. 상기 라이브러리는 높은 항체 안정성, 낮은 항체 응집성, 낮은 면역원성, 우수한 가용성 및 상기 항체의 제조 가능성을 향상시키는 기타 항체 특성들을 위한 항체 이론적 설계를 수립할 것이다.
8. 본 발명은 또한 각 디스플레이 플랫폼에서 Fab 서열의 다중 변화를 수용하는 유연성 및 조합과 비-조합 접근법을 통해 Fab 포맷의 패닝된 분자를 효모 발현 시스템으로 전달하는 유연성을 제공한다.
9. 파지 및 효모 표면 발현에 사용되는 벡터들은 고유하다.
10. 파지 라이브러리에서 선택된 클론은 중쇄 및 경쇄의 특정 조합을 갖거나 갖지 않는 ScFv 또는 Fab를 포함하는 다양한 항체 포맷으로 효모 라이브러리에 전달되어, 개선된 스크리닝 프로세스로 본래의 다양성을 유지할 것이다.
11. 본 발명은 또한 디스플레이 플랫폼에서 Fab 및/또는 ScFv 서열의 다중 변이체를 수용하는 유연성 및 조합과 비-조합 접근법을 통해 Fab 포맷 및/또는 ScFv 포맷의 패닝된 분자를 효모 발현 시스템으로 전달하는 유연성을 제공한다.
발명 및 예시가 명확성 및 이해의 목적으로 도해 및 실시예로서 제공되었지만, 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 변경 및 변형이 실시될 수 있음은 통상의 기술자에게 명백하다. 따라서, 전술한 설명 및 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
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Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 1 5 10 15 Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro 50 55 60 Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Arg 115 120 <210> 13 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(381) <223> ZB_H6 <400> 13 ccatggcagg tgcaattgca acagtctggc cctggcctgg tgaaacccag ccagaccctg 60 agcctgacct gcgccatctc cggagacagc gtgtccagca acagcgccgc ctggaactgg 120 atcagacagt cccccggcag aggcctcgag tggctgggcc ggacctacta ccggtccaag 180 tggtacaacg actacgccgt gtccgtgaag tcccggatca ccatcaaccc cgacacttcg 240 aaaaaccagt tctccctgca actgaacagc gtgacccccg 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ZB_H5_FR2 <400> 45 tgggtgcgcc agatgcccgg caagggcctc gagtggatgg gc 42 <210> 46 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(96) <223> ZB_H5_FR3 <400> 46 caggtgacca tcagcgccga caagagcatc agcaccgcct acctgcagtg gtccagcctg 60 aaggccagcg acaccgccat gtactactgt gcgcgc 96 <210> 47 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(75) <223> ZB_H6_FR1 <400> 47 caggtgcaat tgcaacagtc tggccctggc ctggtgaaac ccagccagac cctgagcctg 60 acctgcgcca tctcc 75 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(42) <223> ZB_H6_FR2 <400> 48 tggatcagac agtcccccgg cagaggcctc gagtggctgg gc 42 <210> 49 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(96) <223> ZB_H6_FR3 <400> 49 cggatcacca tcaaccccga cacttcgaaa aaccagttct ccctgcaact gaacagcgtg 60 acccccgagg acaccgccgt gtactactgt gcgcgc 96 <210> 50 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_H1A_CDR1 <400> 50 ggaggcacct tcagcagcta cgccatcagc 30 <210> 51 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(51) <223> ZB_H1A_CDR2 <400> 51 ggcatcatcc ccatcttcgg caccgccaac tacgcccaga aattccaggg c 51 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_H1B_CDR1 <400> 52 ggatacacct tcaccagcta ctacatgcac 30 <210> 53 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(51) <223> ZB_H1B_CDR2 <400> 53 tggatcaacc ccaacagcgg cggcaccaac tacgcccaga aattccaggg c 51 <210> 54 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(24) <223> ZB_H2_CDR1 <400> 54 tactacgccg acagcgtgaa gggc 24 <210> 55 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(48) <223> ZB_H2_CDR2 <400> 55 ctgatcgact gggacgacga caagtactac agcaccagcc tgaaaacc 48 <210> 56 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_H3_CDR1 <400> 56 ggattcacct tcagcagcta cgccatgagc 30 <210> 57 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(51) <223> ZB_H3_CDR2 <400> 57 gccatcagcg gcagcggcgg cagcacctac tacgccgaca gcgtgaaggg c 51 <210> 58 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_H4_CDR1 <400> 58 ggaggcagca tcagcagcta ctactggtcc 30 <210> 59 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(48) <223> ZB_H4_CDR2 <400> 59 tacatctact acagcggcag caccaactac aaccccagcc tgaagtcc 48 <210> 60 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_H5_CDR1 <400> 60 ggatacagct tcaccagcta ctggatcggc 30 <210> 61 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(51) <223> ZB_H5_CDR2 <400> 61 atcatctacc ccggcgacag cgacacccgg tacagcccca gcttccaggg c 51 <210> 62 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(36) <223> ZB_H6_CDR1 <400> 62 ggagacagcg tgtccagcaa cagcgccgcc tggaac 36 <210> 63 <211> 54 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(54) <223> ZB_H6_CDR2 <400> 63 cggacctact accggtccaa gtggtacaac gactacgccg tgtccgtgaa gtcc 54 <210> 64 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(72) <223> ZB_K1_FR1 <400> 64 gatatccaga tgacccagtc ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 60 atcacctgca ga 72 <210> 65 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(45) <223> ZB_K1_FR2 <400> 65 taccagcaga agcccggcaa ggcccccaag ctattaatct acgcc 45 <210> 66 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(96) <223> ZB_K1_FR3 <400> 66 gtgccaagca gattcagcgg atccggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc 60 ctgcaacccg aggacttcgc cacctactac tgccag 96 <210> 67 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> ZB_K1_FR4 <400> 67 ggccagggaa caaaggtgga aatcaagcgt acg 33 <210> 68 <211> 78 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(78) <223> ZB_K2_FR1 <400> 68 gatatcgtga tgacccagtc ccccctgagc ctgagcctgc ccgtgacacc tggcgagcct 60 gccagcatca gctgcaga 78 <210> 69 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(45) <223> ZB_K2_FR2 <400> 69 tacctgcaaa agcccggcca gtcccctcag ctattaatct acctg 45 <210> 70 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(96) <223> ZB_K2_FR3 <400> 70 gtgccagata gattcagcgg atccggctcc ggcaccgact tcaccctgaa gatcagccgg 60 gtggaagccg aggacgtggg cgtgtactac tgcatg 96 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> ZB_K2_FR4 <400> 71 ggccagggaa caaaggtgga aatcaagcgt acg 33 <210> 72 <211> 75 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(75) <223> ZB_K3_FR1 <400> 72 gatatcgtgc tgacccagtc ccccctggct accctgagcc tgtctcctgg cgagagagcc 60 accctgagct gcaga 75 <210> 73 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(45) <223> ZB_K3_FR2 <400> 73 taccagcaga agcccggcca ggcccccaga ctattaatct acggc 45 <210> 74 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(96) <223> ZB_K3_FR3 <400> 74 gtgccagcca gattttctgg cagcggatcc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc 60 ctggaacccg aggacttcgc cgtgtactac tgccag 96 <210> 75 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> ZB_K3_FR4 <400> 75 ggccagggaa caaaggtgga aatcaagcgt acg 33 <210> 76 <211> 72 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(72) <223> ZB_K4_FR1 <400> 76 gatatcgtga tgacccagtc ccccgacagc ctggccgtgt ctctgggcga gcgggccacc 60 atcaactgca ga 72 <210> 77 <211> 44 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(44) <223> ZB_K4_FR2 <400> 77 taccagcaga agcccggcca gccccccaag ctattaatct actg 44 <210> 78 <211> 96 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(96) <223> ZB_K4_FR3 <400> 78 gtgccagata gattcagcgg atccggctcc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc 60 ctgcaagccg aggacgtggc cgtgtactac tgccag 96 <210> 79 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> ZB_K4_FR4 <400> 79 ggccagggaa caaaggtgga aatcaagcgt acg 33 <210> 80 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> ZB_K1_CDR1 <400> 80 gccagccagg gcatcagcag ctacctggcc tgg 33 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> ZB_K1_CDR2 <400> 81 gccagctctc tgcaaagcgg c 21 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(24) <223> ZB_K1_CDR3 <400> 82 cagcactaca ccaccccccc attt 24 <210> 83 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(48) <223> ZB_K2_CDR1 <400> 83 tccagccaga gcctgctgca cagcaacggc tacaactacc tggactgg 48 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> ZB_K2_CDR2 <400> 84 ggcagcaacc gggccagcgg c 21 <210> 85 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(27) <223> ZB_K2_CDR3 <400> 85 cagcagcact acaccacccc cccattt 27 <210> 86 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(36) <223> ZB_K3_CDR1 <400> 86 gccagccaga gcgtgtccag cagctacctg gcctgg 36 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> ZB_K3_CDR2 <400> 87 gcttccagca gagccaccgg c 21 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(24) <223> ZB_K3_CDR3 <400> 88 cagcactaca ccaccccccc attt 24 <210> 89 <211> 51 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(51) <223> ZB_K4_CDR1 <400> 89 tccagccaga gcgtgctgta cagctccaac aacaagaact acctggcctg g 51 <210> 90 <211> 22 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(22) <223> ZB_K4_CDR2 <400> 90 ggccagcacc cgcgagagcg gc 22 <210> 91 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(24) <223> ZB_K4_CDR3 <400> 91 cagcactaca ccaccccccc attt 24 <210> 92 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(66) <223> ZB_L1_FR1 <400> 92 gatatcgtgc tgacccagcc tcccagcgtg tccggcgcac caggtcagag agtgaccatc 60 agctgc 66 <210> 93 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(45) <223> ZB_L1_FR2 <400> 93 taccagcagc tgcccgggac cgcccccaag ctgctgatct acgac 45 <210> 94 <211> 93 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(93) <223> ZB_L1_FR3 <400> 94 gtgccagacc ggtttagcgg atccaagagc ggcaccagcg ccagcctggc tatcaccggc 60 ctgcagagcg aggacgaggc cgactactac tgc 93 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_L1_FR4 <400> 95 ggcggaggca ccaagttaac cgtgctgggc 30 <210> 96 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(66) <223> ZB_L2_FR1 <400> 96 gatatcgccc tgacccagcc tgccagcgtg tccggctcac caggtcagag catcaccatc 60 agctgc 66 <210> 97 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(45) <223> ZB_L2_FR2 <400> 97 taccagcagc accccgggaa ggcccccaag ctgatgatct acgac 45 <210> 98 <211> 93 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(93) <223> ZB_L2_FR3 <400> 98 gtgtccaaca gattcagcgg atccaagagc ggcaacaccg ccagcctgac catcagcgga 60 ctgcaggccg aggacgaggc cgactactac tgc 93 <210> 99 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_L2_FR4 <400> 99 ggcggaggca ccaagttaac cgtgctgggc 30 <210> 100 <211> 66 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(66) <223> ZB_L3_FR1 <400> 100 gatatcgagc tgacccagcc cccctccgtg tctgtggcac caggtcagac cgccagaatc 60 agctgc 66 <210> 101 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(45) <223> ZB_L3_FR2 <400> 101 taccagcaga agcccgggca ggcccccgtg ctggtgatct acgac 45 <210> 102 <211> 93 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(93) <223> ZB_L3_FR3 <400> 102 atccccgagc ggttcagcgg atccaacagc ggcaataccg ccaccctgac catcagcggc 60 acccaggccg aggacgaggc cgactactac tgc 93 <210> 103 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(30) <223> ZB_L3_FR4 <400> 103 ggcggaggca ccaagttaac cgtgctgggc 30 <210> 104 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(42) <223> ZB_L1_CDR1 <400> 104 tccggcagca gcagcaacat cggcagcaac tacgtgtcct gg 42 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> ZB_L1_CDR2 <400> 105 aacaaccagc ggcccagcgg c 21 <210> 106 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(27) <223> ZB_L1_CDR3 <400> 106 cagcagcact acaccacccc cccattc 27 <210> 107 <211> 45 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(45) <223> ZB_L2_CDR1 <400> 107 accggcacca gcagcgacgt gggcggctac aactacgtgt cctgg 45 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> ZB_L2_CDR2 <400> 108 gtgtccaacc ggcccagcgg c 21 <210> 109 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(27) <223> ZB_L2_CDR3 <400> 109 cagcagcact acaccacccc cccattc 27 <210> 110 <211> 33 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(33) <223> ZB_L3_CDR1 <400> 110 ggcgacgccc tgggcgataa gtacgccagc tgg 33 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> ZB_L3_CDR2 <400> 111 gacagcgaca gacccagcgg c 21 <210> 112 <211> 27 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(27) <223> ZB_L3_CDR3 <400> 112 cagcagcact acaccacccc cccattc 27

Claims (18)

  1. 길이가 4 개 아미노산 내지 23 개 아미노산인, 항체 분자(들)의 중쇄의 변형된 CDR3 (CDRH3)를 포함하는 항체 분자(들)을 코딩하는 합성 핵산 서열의 레퍼토리를 포함하는 인간 합성 항체 유전자 발현 라이브러리로서,
    여기서 상기 라이브러리는 다음의 단계들, 즉:
    a) 공개된 생식 계열 및 재배열된 항체 서열을 스크리닝하고, 하나 이상의 소정의 특성(들)을 갖는 항체 분자를 동정하는 단계로서, 여기서 상기 소정의 특성(들)은 주석 레벨, 종, 구성 유형, 재배열된 유전자 유형 및 기능성, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계,
    b) CDR3 중쇄 (CDRH3)의 길이 분포 분석 및 상기 CDRH3 내의 아미노산 발생 빈도에 기초하여 상기 동정된 분자를 분석하여 아미노산 사슬 길이 및 아미노산 빈도를 결정하는 단계,
    c) 위치 상관 분석을 사용하여, 결정된 아미노산 사슬 길이 및 아미노산 빈도를 갖는 아미노산의 확률 지수를 평가하는 단계,
    d) 상이한 CDRH3 길이에서의 상이한 위치 사이의 확률을 계산한 후, 20 개의 개별 아미노산에 대한 확률 차이를 더하여 두 위치 당 하나의 수를 생성하고, 4 개 아미노산 내지 23 개 아미노산의 모든 CDRH3 길이를 커버하는 또 다른 위치 쌍과 비교하는 단계,
    e) 샤논 엔트로피 (shannon entropy)에 의한 아미노산의 풍부도 (richness) 및 존재도 (abundance) 파라미터에 기초한 진정한 다양성 (diversity)을 도입하는 단계로서, 여기서 상기 풍부도 파라미터는 아미노산의 다양성 (varieties)을 정의하고, 상기 존재도 파라미터는 각 아미노산의 발생 확률을 정의하는 것인 단계,
    f) CDRH3 영역을 제외한 인간 면역 글로불린 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 서열을 포함하는 항체 분자(들)을 설계한 후, 하기 정의되는 바와 같은 CDRH3의 아미노산 사슬 길이 및 아미노산 빈도에 기초하여 상기 분자(들)에 코돈 치환 기술을 적용함으로써, 변형된 CDRH3를 갖는 항체 분자(들)을 수득하는 단계; 및
    g) 상기 분자(들)을 클로닝하여 라이브러리를 형성하는 단계
    를 포함하는 방법에 의하여 얻어지는 것이고,
    여기서 상기 라이브러리는 상기 변형된 CDRH3에 기초하는 1010 내지 1011 개의 클론을 포함하고, 및 여기서 상기 라이브러리는 발현될 때 파지 또는 효모의 표면에 발현된 항체 분자(들)의 집합체이거나 파지 또는 효모 또는 이들의 조합으로부터 단리되는 항체 분자(들)의 집합체이고,
    및 여기서:
    ㆍ 상기 CDRH3의 길이가 4 개 아미노산일 때, 위치 2의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 20%이고; 및
    ㆍ 상기 CDRH3의 길이가 5 내지 17 개 아미노산의 범위일 때, 마지막 위치의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 40% 내지 80%에 이르거나 마지막에서 두 번째 위치의 아미노산 티로신의 빈도는 40% 내지 65%에 이르고; 및
    ㆍ 상기 CDRH3의 길이가 18 내지 23 개 아미노산의 범위일 때, 마지막 위치의 아미노산 발린의 빈도는 20% 내지 67%에 이르거나 마지막 위치의 아미노산 이소류신의 빈도는 17% 내지 24%에 이르고,
    및 여기서 길이가 4 개 아미노산 내지 23 개 아미노산인 상기 변형된 CDRH3는 각 위치에서 아미노산 빈도의 특정 조합을 포함하며, 여기서:
    상기 CDRH3의 길이가 4일 때 -
    a. 위치 1 및 2의 아미노산 아스파르트산의 빈도는 각각 10% 및 20%이고;
    b. 위치 1 내지 3의 아미노산 프롤린의 빈도는 0.05%에서 0.15%까지 다양하고, 위치 4에서는 15%이고; 및
    c. 위치 1의 아미노산 아르기닌의 빈도는 5%이고, 위치 2, 3 및 4에서는 18%에서 20%까지 다양하고,
    상기 CDRH3의 길이가 5일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4 및 5의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 3%, 0.05%, 20%, 0.1% 및 6%이고; 및
    b. 위치 1, 2, 3, 4 및 5의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 6%, 18%, 0.2%, 0.1% 및 0.05%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 6일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 3.00%, 0.15%, 2%, 25%, 0.05% 및 3.5%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 3.43%, 5.61%, 0.09%, 0.06%, 7.79% 및 0.08%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 0.05%, 7.78%, 7.48%, 4.37%, 4.53% 및 1.77%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5 및 6의 아미노산 세린의 빈도는 각각 1.76%, 9.44%, 8.13%, 8.93%, 0.26% 및 1.43%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 7일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 3.65%, 0.18%, 0.08%, 3.09%, 43.63%, 0.15% 및 3.01%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 3.33%, 7.19%, 12.74%, 1.11%, 0.21%, 0.09% 및 3.34%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 0.09%, 4.68%, 0.23%, 2.74%, 3.95%, 0.06% 및 3.53%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 6.98%, 15.99%, 3.98%, 4.13%, 1.00%, 1.16% 및 0.67%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 8일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 4.56%, 6.02%, 2.69%, 4.00%, 1.82%, 35.24%, 0.98% 및 2.61%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 3.17%, 3.28%, 3.30%, 5.44%, 2.19%, 2.99%, 0.93% 및 4.74%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 0.05%, 6.05%, 3.76%, 1.04%, 3.79%, 1.47%, 0.68% 및 4.64%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 및 8의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 6.24%, 5.58%, 8.88%, 8.36%, 5.24%, 0.10%, 0.88% 및 3.18%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 9일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.96%, 1.92%, 2.31%, 2.13%, 2.36%, 2.05%, 44.15%, 0.86% 및 2.59%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.68%, 2.83%, 3.24%, 3.36%, 3.13%, 3.94%, 1.12%, 0.93% 및 4.74%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 0.98%, 3.49%, 3.57%, 3.96%, 3.79%, 9.19%, 3.71%, 1.06% 및 5.26%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 4.93%, 9.19%, 9.45%, 9.10%, 9.50%, 3.21%, 0.07%, 0.83% 및 3.97%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 10일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.12%, 2.44%, 2.27%, 2.49%, 2.18%, 2.78%, 2.64%, 55.93%, 0.56% 및 2.32%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.66%, 2.95%, 3.25%, 3.15%, 3.22%, 3.10%, 1.22%, 1.35%, 0.91% 및 4.76%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 1.42%, 3.12%, 3.57%, 2.78%, 3.00%, 2.81%, 4.00%, 1.22%, 0.78% 및 4.08%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.28%, 9.13%, 9.97%, 9.70%, 10.04%, 9.91%, 4.20%, 0.07%, 1.12% 및 3.81%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 11일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.10%, 2.30%, 2.51%, 2.24%, 2.47%, 2.43%, 2.24%, 2.10%, 54.27%, 0.58% 및 2.76%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.68%, 2.74%, 2.98%, 3.40%, 2.98%, 3.33%, 3.54%, 4.20%, 0.97%, 1.26% 및 4.40%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 1.61%, 3.72%, 2.90%, 3.27%, 3.07%, 2.90%, 2.98%, 5.78%, 3.05%, 0.99% 및 4.22%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.62%, 9.57%, 10.06%, 10.35%, 9.61%, 9.14%, 10.00%, 2.18%, 0.00%, 1.11% 및 4.14%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 12일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.06%, 2.42%, 2.08%, 2.44%, 1.88%, 2.46%, 2.59%, 2.34%, 2.17%, 52.70%, 0.65% 및 2.49%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.59%, 3.31%, 3.58%, 3.12%, 3.24%, 3.27%, 3.62%, 6.42%, 1.28%, 0.89%, 1.14%, 및 4.65%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 1.62%, 3.52%, 3.50%, 3.43%, 3.64%, 2.72%, 3.35%, 4.82%, 6.23%, 3.16%, 0.82%, 및 3.96%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 및 12의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.18%, 10.28%, 10.15%, 10.64%, 10.28%, 10.11%, 10.11%, 5.52%, 2.88%, 0.00%, 및 0.80% 및 3.50%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 13일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.02%, 2.09%, 2.13%, 2.28%, 2.44%, 2.32%, 2.49%, 2.40%, 4.51%, 4.85%, 54.39%, 0.86% 및 2.65%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.61%, 3.28%, 3.34%, 3.07%, 3.47%, 3.22%, 3.32%, 3.34%, 9.54%, 2.13%, 0.94%, 1.11% 및 4.16%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 1.86%, 3.70%, 3.49%, 3.53%, 3.07%, 3.07%, 3.24%, 3.24%, 1.98%, 4.26%, 27.61%, 0.75% 및 3.38%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12 및 13의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.85%, 9.77%, 9.46%, 9.38%, 9.86%, 9.94%, 9.90%, 9.54%, 5.14%, 1.34%, 0.00%, 0.81% 및 3.13%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 14일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.00%, 2.48%, 2.33%, 2.42%, 2.37%, 3.01%, 2.42%, 2.22%, 2.79%, 4.02%, 4.09%, 54.77%, 0.70% 및 1.96%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.46%, 3.49%, 3.56%, 3.41%, 3.23%, 3.58%, 3.27%, 3.25%, 3.19%, 2.04%, 2.37%, 0.92%, 1.54% 및 2.94%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 1.82%, 3.58%, 3.41%, 3.10%, 2.86%, 3.45%, 2.50%, 3.05%, 2.53%, 7.32%, 5.36%, 3.05%, 0.81% 및 0.26%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13 및 14의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.78%, 9.69%, 8.94%, 9.53%, 10.04%, 9.89%, 9.82%, 10.26%, 10.22%, 10.26%, 1.82%, 0.00%, 0.90% 및 1.14%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 15일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.07%, 2.02%, 2.25%, 2.29%, 2.82%, 2.43%, 2.38%, 2.32%, 3.74%, 3.23%, 4.03%, 4.38%, 54.81%, 0.80% 및 2.29%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.80%, 3.32%, 2.91%, 2.98%, 3.42%, 3.46%, 2.89%, 3.44%, 1.93%, 2.34%, 2.73%, 2.77%, 0.78%, 1.33% 및 2.54%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 1.65%, 3.44%, 3.62%, 3.58%, 3.09%, 3.12%, 2.66%, 2.61%, 7.66%, 6.92%, 7.40%, 3.12%, 2.43%, 0.69% 및 0.23%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 및 15의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.96%, 10.13%, 9.26%, 9.58%, 10.32%, 10.09%, 9.01%, 9.67%, 11.10%, 10.45%, 9.67%, 3.42%, 0.00%, 0.83% 및 0.85%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 16일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.12%, 1.57%, 1.75%, 2.62%, 2.85%, 2.50%, 2.85%, 2.21%, 2.97%, 2.74%, 3.38%, 3.38%, 2.39%, 50.47%, 1.22% 및 2.91%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.87%, 2.33%, 3.03%, 2.85%, 3.67%, 2.56%, 3.32%, 2.74%, 2.68%, 1.98%, 2.39%, 2.27%, 0.17%, 0.64%, 0.81% 및 2.79%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 2.44%, 16.94%, 3.61%, 6.00%, 3.61%, 3.61%, 3.73%, 3.38%, 7.51%, 10.30%, 11.76%, 8.21%, 4.95%, 2.56%, 0.81% 및 1.34%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 및 16의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 6.40%, 9.72%, 8.91%, 9.84%, 10.01%, 9.14%, 9.66%, 9.49%, 8.21%, 9.60%, 8.15%, 8.96%, 0.58%, 0.00%, 1.34% 및 0.99%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 17일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.06%, 1.37%, 2.47%, 2.96%, 2.91%, 2.01%, 2.85%, 2.44%, 3.05%, 2.59%, 3.31%, 3.37%, 2.59%, 0.64%, 37.93%, 0.70% 및 3.31%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.64%, 4.56%, 3.14%, 2.47%, 3.69%, 3.25%, 3.11%, 3.84%, 3.55%, 2.27%, 1.95%, 1.74%, 2.35%, 1.71%, 0.00%, 1.28% 및 1.39%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 2.79%, 7.29%, 3.31%, 10.52%, 2.44%, 4.50%, 3.89%, 4.53%, 3.95%, 9.79%, 9.82%, 10.20%, 10.32%, 2.32%, 1.63%, 1.25% 및 7.90%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16 및 17의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.81%, 14.44%, 9.97%, 8.95%, 8.78%, 9.47%, 8.37%, 9.47%, 9.33%, 9.82%, 10.29%, 9.76%, 9.85%, 1.31%, 0.00%, 1.16% 및 1.02%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 18일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.05%, 1.37%, 2.07%, 2.43%, 3.39%, 2.28%, 2.73%, 3.39%, 2.83%,2.53%, 3.59%, 3.19%, 3.14%, 3.14%, 0.56%, 37.96%, 1.11% 및 3.39%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.66%, 2.78%, 2.83%, 1.52%, 2.33%, 3.64%, 3.90%, 2.73%, 3.64%, 4.25%, 2.02%, 2.53%, 2.63%, 2.94%, 0.51%, 0.05%, 1.32% 및 1.42%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 2.02%, 4.35%, 3.64%, 11.69%, 11.03%, 3.29%, 4.61%, 3.54%, 5.31%, 4.55%, 11.39%, 8.76%, 10.17%, 8.76%, 5.11%, 2.13%, 0.91% 및 9.67%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 및 18의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.97%, 9.77%, 9.01%, 9.56%, 8.50%, 8.96%, 9.36%, 9.11%, 10.98%, 9.46%, 10.58%, 8.96%, 9.36%, 8.25%, 2.23%, 0.05%, 0.76% 및 0.86%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 19일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.17%, 0.81%, 2.20%, 3.08%, 2.84%, 3.28%, 6.30%, 8.97%, 2.40%, 3.08%, 3.39%, 3.73%, 3.45%, 1.19%, 4.20%, 0.44%, 40.09%, 1.02% 및 3.49%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.98%, 1.69%, 2.88%, 2.84%, 2.64%, 1.76%, 4.03%, 2.57%, 4.30%, 3.12%, 2.47%, 2.10%, 2.64%, 11.45%, 7.31%, 0.03%, 0.00%, 1.46% 및 1.19%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 2.54%, 10.26%, 3.66%, 11.62%, 9.82%, 9.92%, 0.44%, 4.03%, 4.27%, 5.25%, 9.85%, 9.99%, 8.84%, 2.44%, 3.05%, 2.78%, 1.42%, 0.81% 및 9.72%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 및 19의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.38%, 12.09%, 7.92%, 9.04%, 9.21%, 8.53%, 0.61%, 1.76%, 9.18%, 8.91%, 10.19%, 8.77%, 9.11%, 3.93%, 0.54%, 1.08%, 0.00%, 0.95% 및 1.05%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 20일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 글루탐산의 빈도는 각각 15.56%, 4.65%, 3.96%, 7.86%, 4.75%, 2.14%, 0.82%, 3.96%, 4.59%, 3.99%, 5.19%, 4.71%, 5.03%, 0.31%, 3.99%, 0.06%, 0.06%, 0.00%, 2.39% 및 0.00%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.66%, 2.67%, 3.17%, 1.13%, 2.01%, 0.31%, 3.52%, 3.49%, 3.36%, 3.21%, 2.36%, 2.64%, 2.42%, 4.34%, 4.09%, 3.96%, 1.16%, 0.09%, 1.45% 및 1.07%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 2.39%, 3.49%, 3.61%, 3.11%, 11.44%, 1.76%, 1.38%, 4.37%, 3.71%, 5.00%, 10.09%, 9.90%, 9.90%, 6.38%, 4.87%, 6.44%, 0.31%, 1.19%, 0.91% 및 9.55%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 및 20의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.41%, 8.67%, 9.71%, 4.87%, 9.37%, 1.98%, 3.49%, 8.74%, 9.21%, 8.89%, 8.96%, 9.87%, 10.47%, 4.43%, 1.67%, 4.09%, 2.83%, 0.00%, 0.97% 및 1.26%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 21일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.00%, 2.07%, 0.28%, 2.93%, 2.31%, 5.82%, 6.92%, 7.44%, 7.10%, 7.13%, 7.20%, 11.47%, 0.59%, 0.65%, 4.34%, 6.17%, 2.20%, 0.17%, 35.45%, 2.17% 및 2.58%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.65%, 0.14%, 4.17%, 2.79%, 3.44%, 1.52%, 1.31%, 0.93%, 1.17%, 1.38%, 1.76%, 2.89%, 6.48%, 0.41%, 4.20%, 0.24%, 4.51%, 0.34%, 0.00%, 1.03% 및 2.17%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 2.20%, 9.06%, 4.48%, 4.24%, 4.13%, 2.86%, 2.55%, 2.24%, 3.10%, 3.38%, 3.31%, 18.05%, 6.44%, 8.54%, 2.79%, 2.89%, 8.27%, 1.10%, 1.83%, 1.55% 및 8.23%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 및 21의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.99%, 3.82%, 8.96%, 9.20%, 9.20%, 4.27%, 4.13%, 4.68%, 4.99%, 4.62%, 4.00%, 10.27%, 6.30%, 9.68%, 5.99%, 1.79%, 3.41%, 1.72%, 0.24%, 1.00% 및 0.03%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 22일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.04%, 5.37%, 3.13%, 6.33%, 3.67%, 0.27%, 6.95%, 6.49%, 7.34%, 3.79%, 3.28%, 3.79%, 5.99%, 7.34%, 0.19%, 0.27%, 0.19%, 0.31%, 3.24%, 36.27%, 0.85% 및 9.35%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.50%, 0.00%, 4.21%, 0.19%, 4.17%, 4.21%, 1.04%, 1.43%, 1.51%, 1.85%, 2.90%, 2.01%, 1.27%, 1.08%, 0.39%, 0.27%, 0.12%, 7.61%, 0.12%, 0.08%, 1.47% 및 0.00%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 2.74%, 7.96%, 4.75%, 18.23%, 8.50%, 3.59%, 2.47%, 2.94%, 2.74%, 10.31%, 10.35%, 9.62%, 3.13%, 3.05%, 13.90%, 0.27%, 5.37%, 0.23%, 0.31%, 1.78%, 1.39% 및 2.47%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 22의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 5.83%, 17.50%, 8.42%, 5.06%, 4.52%, 4.79%, 4.91%, 4.48%, 4.60%, 9.39%, 8.42%, 8.57%, 4.36%, 4.44%, 0.58%, 3.59%, 6.06%, 0.23%, 6.30%, 0.04%, 0.77% 및 0.00%이고,
    상기 CDRH3의 길이가 23일 때 -
    a. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 페닐알라닌의 빈도는 각각 0.00%, 0.29%, 0.15%, 0.49%, 8.00%, 3.07%, 3.76%, 0.59%, 9.03%, 3.90%, 4.25%, 9.42%, 0.44%, 3.90%, 0.34%, 3.32%, 3.51%, 0.10%, 3.90%, 0.39%, 43.24%, 0.83% 및 4.73%이고;
    b. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 아스파라긴의 빈도는 각각 0.24%, 0.05%, 0.15%, 0.15%, 4.69%, 5.32%, 0.10%, 0.15%, 14.84%, 0.20%, 4.49%, 4.64%, 4.25%, 5.42%, 0.10%, 8.30%, 0.05%, 0.10%, 4.69%, 0.00%, 0.00%, 1.12% 및 0.00%이고,
    c. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 프롤린의 빈도는 각각 0.24%, 9.91%, 3.71%, 3.61%, 5.32%, 2.73%, 3.61%, 3.81%, 7.42%, 2.10%, 6.69%, 4.34%, 2.93%, 8.39%, 11.27%, 3.17%, 0.20%, 0.24%, 0.34%, 4.05%, 0.88%, 1.22% 및 9.22%이고; 및
    d. 위치 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 및 23의 아미노산 아르기닌의 빈도는 각각 0.44%, 4.39%, 8.69%, 22.40%, 7.76%, 4.49%, 4.05%, 3.42%, 0.78%, 9.13%, 10.35%, 3.66%, 11.52%, 3.95%, 0.29%, 8.25%, 0.20%, 6.69%, 0.20%, 0.44%, 0.00%, 1.95% 및 0.05%이고,
    여기서,
    ㆍ 상기 항체 분자(들)의 중쇄의 가변 영역의 CDR1, CDR2, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 각각의 해당 아미노산 서열을 포함하고, 및
    ㆍ 상기 항체 분자(들)의 경쇄 (카파)의 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 SEQ ID 15, 17, 19 또는 21 중에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 각각의 해당 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 항체 분자(들)의 경쇄 (람다)의 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 SEQ ID 23, 25 또는 27 중에서 선택되는 각각의 해당 아미노산 서열을 포함하는 것인, 인간 합성 항체 유전자 발현 라이브러리.
  2. 제1항에 있어서, 아미노산 빈도의 특정 조합을 갖는 길이가 4 개 아미노산 내지 23 개 아미노산인, 항체 분자(들)의 중쇄의 변형된 CDR3 (CDRH3)를 포함하는 항체 분자(들)을 포함하는 라이브러리로서, 여기서:
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 4 개 아미노산일 때, 위치 1 및 3의 아미노산 글리신의 빈도는 16 내지 36%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 5 개 아미노산일 때, 처음 3 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 20 내지 38%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 6 개 아미노산일 때, 처음 4 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 11 내지 35%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 7 개 아미노산일 때, 처음 4 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 12 내지 38%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 8 개 아미노산일 때, 처음 5 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 14 내지 34%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 9 개 아미노산일 때, 처음 6 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 12 내지 43%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 10 개 아미노산일 때, 처음 7 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 14 내지 30%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 11 개 아미노산일 때, 처음 8 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 14 내지 28%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 12 개 아미노산일 때, 처음 9 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 15 내지 28%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 13 개 아미노산일 때, 처음 10 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 13 내지 26%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 14 개 아미노산일 때, 처음 11 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 8 내지 26%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 15 개 아미노산일 때, 처음 12 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 8 내지 30%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 16 개 아미노산일 때, 처음 13 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 7 내지 35%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 17 개 아미노산일 때, 처음 14 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 7 내지 36%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 18 개 아미노산일 때, 처음 15 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 7 내지 30%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 19 개 아미노산일 때, 처음 16 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 7 내지 45%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 20 개 아미노산일 때, 처음 17 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 3 내지 44%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 21 개 아미노산일 때, 처음 18 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 2 내지 44%에 이르고;
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 22 개 아미노산일 때, 처음 19 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 3 내지 58%에 이르고; 또는
    ㆍ 상기 CDR의 길이가 23 개 아미노산일 때, 처음 20 개 위치의 아미노산 글리신의 빈도는 0.5 내지 58%에 이르는 것인 라이브러리.
  3. 제1항에 기재된 라이브러리의 수득 방법으로서, 다음의 단계들, 즉:
    a) 공개된 생식 계열 및 재배열된 항체 서열을 스크리닝하고, 하나 이상의 소정의 특성(들)을 갖는 항체 분자를 동정하는 단계로서, 여기서 상기 소정의 특성(들)은 주석 레벨, 종, 구성 유형, 재배열된 유전자 유형 및 기능성, 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단계,
    b) CDR3 중쇄 (CDRH3)의 길이 분포 분석 및 상기 CDRH3 내의 아미노산 발생 빈도에 기초하여 상기 동정된 분자를 분석하여 아미노산 사슬 길이 및 아미노산 빈도를 결정하는 단계,
    c) 위치 상관 분석을 사용하여, 결정된 아미노산 사슬 길이 및 아미노산 빈도를 갖는 아미노산의 확률 지수를 평가하는 단계,
    d) 상이한 CDRH3 길이에서의 상이한 위치 사이의 확률을 계산한 후, 20 개의 개별 아미노산에 대한 확률 차이를 더하여 두 위치 당 하나의 수를 생성하고, 4 개 아미노산 내지 23 개 아미노산의 모든 CDRH3 길이를 커버하는 또 다른 위치 쌍과 비교하는 단계,
    e) 샤논 엔트로피 (shannon entropy)에 의한 아미노산의 풍부도 (richness) 및 존재도 (abundance) 파라미터에 기초한 진정한 다양성 (diversity)을 도입하는 단계로서, 여기서 상기 풍부도 파라미터는 아미노산의 다양성 (varieties)을 정의하고, 상기 존재도 파라미터는 각 아미노산의 발생 확률을 정의하는 것인 단계,
    f) CDRH3 영역을 제외한 인간 면역 글로불린 가변 중쇄 영역 및 가변 경쇄 영역의 서열을 포함하는 항체 분자(들)을 설계한 후, 제1항에서 정의된 바와 같은 변형된 CDRH3의 아미노산 사슬 길이 및 아미노산 빈도에 기초하여 상기 분자(들)에 코돈 치환 기술을 적용함으로써, 변형된 CDRH3를 갖는 항체 분자(들)을 수득하는 단계; 및
    g) 상기 분자(들)을 클로닝하여 라이브러리를 형성하는 단계
    를 포함하는 것인 라이브러리의 수득 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 스크리닝은 중복 제거를 위해, IMGT 데이터베이스로부터 항체 유전자 서열을 분석하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 설계는,
    ㆍ 상기 항체 분자(들)의 중쇄의 가변 영역의 CDR1, CDR2, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 SEQ ID 1, 3, 5, 7, 9, 11 또는 13 중에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 각각의 해당 아미노산 서열을 포함하고, 및
    ㆍ 상기 항체 분자(들)의 경쇄 (카파)의 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 SEQ ID 15, 17, 19 또는 21 중에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 각각의 해당 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 상기 항체 분자(들)의 경쇄 (람다)의 가변 영역의 CDR1, CDR2, CDR3, FR1, FR2, FR3 및 FR4는 SEQ ID 23, 25 또는 27 중에서 선택되는 핵산 서열에 의해 코딩되는 각각의 해당 아미노산 서열을 포함하는, 항체 분자(들)을 합성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 변형된 CDRH3를 갖는 항체 분자(들)은 파지 벡터에 의해 개별적으로 또는 파지 벡터에 이어서 효모 벡터에 의해 순차적으로 디스플레이되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 파지 또는 효모 벡터에 의한 항체 분자(들)의 디스플레이는 다음의 단계들, 즉:
    상응하는 항체 유전자를 파지 내로 클로닝하여 파지 항체 라이브러리를 수득한 후, 항원(들)에 대해 디스플레이된 분자(들)을 스크리닝하여 패닝된 파지 항체 라이브러리를 수득하는 단계,
    효모의 표면에 상기 항체 분자(들)을 디스플레이하기 위하여 패닝된 파지 항체 라이브러리를 효모 내로 전달한 후, 항원(들)에 대해 효모 디스플레이된 항체 분자(들)을 스크리닝하여 효모 스크리닝된 항체 라이브러리를 수득하는 단계, 및
    목적하는 기능적 특성을 갖는 파지 또는 효모 디스플레이된 항체 분자(들)을 선택하여 합성 항체 라이브러리를 형성하는 단계 또는 파지 항체 라이브러리 또는 효모 항체 라이브러리로부터 목적하는 기능적 특성을 갖는 선택된 항체 분자(들)을 단리하여 스크리닝된 항체 라이브러리를 생성하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 항체 분자(들)은 파지 또는 효모 벡터 내로 클로닝하기 위하여 Fab 또는 Scfv 포맷으로 존재하고; 여기서 파지 벡터 내로의 형질 전환 효율은 109 내지 1010의 범위이며; 효모 벡터 내로의 형질 전환 효율은 106 내지 108의 범위인 것인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 파지 라이브러리를 수득하기 위한 스크리닝은 관심 대상 항체를 단리하기 위해 자성 비드상에 코팅된 항원을 이용하는 패닝을 포함하고; 여기서 파지 디스플레이 스크리닝/패닝은 항체 비결합자 (non-binders)를 제거하기 위하여 사용되는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 표면 디스플레이에 의한 효모 라이브러리를 수득하기 위한 스크리닝은, 담배 식각 바이러스 (Tobacco Etch Virus; TEV), 엔테로키나제, 트롬빈, Xa 인자, HRV 3C 프로테아제 및 유사 프로테아제 절단 단백질 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로테아제 절단 부위를 사용하여 Fab 또는 ScFv 분자를 단리하기 위해 경쟁적 항원 에피토프, 항체 파라토프 (paratope) 형태, 서열 및 서열 모티프 또는 이들의 임의의 조합을 사용함으로써 수행되는 것인 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 항체 라이브러리는 파지 또는 효모의 표면에 발현된 항체 분자(들)의 집합체이거나, 또는 파지 또는 효모 또는 이들의 조합으로부터 단리된 항체 분자(들)의 집합체인 것인 방법.
  12. 제1항에 기재된 라이브러리의 하나 이상의 항체 분자를 발현하는 하나 이상의 파지 또는 효모 세포의 단리 방법으로서, 상기 방법은 항체 분자의 라이브러리를 파지에 이어서 효모 세포 내로 순차적으로 발현 및 스크리닝하여 하나 이상의 파지 또는 효모 세포를 단리하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 발현 및 스크리닝은 다음 단계들, 즉:
    (i) 합성적으로 제조된 항체 유전자 발현 라이브러리의 항체 분자를 파지미드 벡터 내로 클로닝하는 단계;
    (ii) 항체 유전자를 발현한 후 특정 항원 표적(들)에 대해 파지 클론을 스크리닝하고, 파지 클론을 선택 또는 단리하는 단계,
    (iii) 상기 선택 또는 단리된 파지 클론의 항체 분자를 효모 세포 내로 전달 또는 발현하고 상기 효모 세포를 특정 항원 표적(들)에 대해 접촉시킴으로써 스크리닝하는 단계; 및
    (iv) 상기 특정 항원 표적(들)에 결합하는 항체를 디스플레이하는 하나 이상의 효모 세포를 분리 또는 단리하는 단계
    를 포함하는 것인 하나 이상의 파지 또는 효모 세포의 단리 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 파지 또는 효모 세포로부터 하나 이상의 항체를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 단리하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 암, 류마티스성 관절염, 신경 장애, 감염성 질환 및 대사 장애 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환 치료를 위한 치료법으로; 진단으로; 예후로; 연구 목적으로; 표적 발견; 기능 유전체학에서의 검증 또는 항체나 항체의 유도체가 사용되는 임의의 적용에 사용하기 위한 하나 이상의 항체를 단리하기 위한 것인 라이브러리.
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