JP2023552397A - 可変重鎖のみのライブラリ、その調製方法、及びその使用 - Google Patents
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Abstract
本開示は、可変重鎖のみ(VHO)ドメイン領域の設計と適用に関する。本開示は、VHOドメインをコードするポリヌクレオチドのVHOライブラリ(ここで、該VHOドメインは、ヒトVhファミリーのVhドメインに基づいて設計される)、並びにVHOライブラリを作製する方法を提供する。本開示はまた、pIXやpVIIなどのM13バクテリオファージのマイナーコートタンパク質の使用による、VHOライブラリによってコードされたVHOドメインを提示するファージライブラリ、並びに該ファージライブラリを作製する方法も提供する。本開示はまた、目的の標的を結合することができるVHO候補を同定するためのファージライブラリをスクリーニングする方法も提供する。
Description
関連出願の相互参照
本願は、2020年12月3日に出願された米国特許仮出願第63/120,842号の優先権を主張するものであり、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
本願は、2020年12月3日に出願された米国特許仮出願第63/120,842号の優先権を主張するものであり、その内容全体を参照により本明細書に援用する。
配列表
本願はASCII書式で電子的に提出されている配列表であって、その全体を参照により本明細書に援用する。前記ASCIIコピーは、2021年12月2日に作製され、15271_0007-00304_SLと名付けられ、サイズは19,819バイトである。
本開示の分野
本願はASCII書式で電子的に提出されている配列表であって、その全体を参照により本明細書に援用する。前記ASCIIコピーは、2021年12月2日に作製され、15271_0007-00304_SLと名付けられ、サイズは19,819バイトである。
本開示の分野
本開示は、(選択的結合部分として役割を果たし、治療用分子及び/又は診断試薬として使用できる)可変重鎖のみの(VHO)ドメイン領域の設計と適用に関する。本開示はまた、多様なVHO縮重ライブラリを作製する方法、及びバクテリオファージのコートタンパク質を使用した縮重VHOライブラリを提示する方法にも関する。
本開示の背景
VHH(可変重ホモダイマー)又は単一領域抗体は、しばらく研究され、そして薬品に使用されている(Muyldermans 2013)；(Belanger, Iqbal et al. 2019)。ラクダ科動物重鎖抗体(HcAb)は、ラクダ科動物ファミリー(ラマ、ラクダ、アルパカなど)で見られ、そして類似の可変新規抗原受容体(VNAR)分子は、サメやヤツメウナギを含めた軟骨魚綱及び円口網に見られる。これまでに最も研究された、及び遺伝子組み換えにより使用されたVHHは、ラマやラクダ由来のものである(Arbabi-Ghahroudi 2017)。ラクダ/ラマファミリーに対して本明細書中でなされた言及は、ラクダ科動物ファミリーのメンバーを指す。ラクダ科動物ファミリーの抗体は、サイズが150～160kDaにて重鎖と軽鎖の両方を含有するヒト抗体(IgG)と比較して、70～90kDaのサイズの重鎖のみの分子である(図1Aを参照のこと)。ラクダ及びラマ抗体は、それぞれ3つのドメイン：可変ドメイン、定常ドメイン2、及び定常ドメイン3、から成る。ほとんどの抗体のように、可変ドメインは、3つの超可変ループ、それらの超可変ループの間の4つのフレームワーク領域を有する。ラクダ又はラマ抗体の可変領域は、液性応答中に外来タンパク質に結合するための部位である。ヒト抗体のように、パラトープの多様性は、超可変領域又は相補性決定領域(CDR)によって規定される(Mitchell and Colwell 2018)。
VHH(可変重ホモダイマー)又は単一領域抗体は、しばらく研究され、そして薬品に使用されている(Muyldermans 2013)；(Belanger, Iqbal et al. 2019)。ラクダ科動物重鎖抗体(HcAb)は、ラクダ科動物ファミリー(ラマ、ラクダ、アルパカなど)で見られ、そして類似の可変新規抗原受容体(VNAR)分子は、サメやヤツメウナギを含めた軟骨魚綱及び円口網に見られる。これまでに最も研究された、及び遺伝子組み換えにより使用されたVHHは、ラマやラクダ由来のものである(Arbabi-Ghahroudi 2017)。ラクダ/ラマファミリーに対して本明細書中でなされた言及は、ラクダ科動物ファミリーのメンバーを指す。ラクダ科動物ファミリーの抗体は、サイズが150～160kDaにて重鎖と軽鎖の両方を含有するヒト抗体(IgG)と比較して、70～90kDaのサイズの重鎖のみの分子である(図1Aを参照のこと)。ラクダ及びラマ抗体は、それぞれ3つのドメイン：可変ドメイン、定常ドメイン2、及び定常ドメイン3、から成る。ほとんどの抗体のように、可変ドメインは、3つの超可変ループ、それらの超可変ループの間の4つのフレームワーク領域を有する。ラクダ又はラマ抗体の可変領域は、液性応答中に外来タンパク質に結合するための部位である。ヒト抗体のように、パラトープの多様性は、超可変領域又は相補性決定領域(CDR)によって規定される(Mitchell and Colwell 2018)。
ラクダ及びラマ抗体のVhドメインは、単一領域やナノボディ分子の遺伝子操作するために使用された(Arbabi-Ghahroudi 2017)。これらの分子は、サイズが～15kDaであり、かつ、IgGと比較してより高い熱安定性を有する(McConnell, Spasojevich et al. 2013)。これらの生物物理学的特質のため、単一領域分子は、製造及び開発のための利点を提供する(Tonikian and Sidhu 2012) (Ewert, Cambillau et al. 2002) (Harmsen and De Haard 2007)。これらの特質はまた、より独特な診断及び治療適用のための利点も提供する。それらは、細胞膜をとおり抜け、血液脳関門を越え、そして代替の生物学的送達系として役立つように遺伝子操作され得る(Herce, Schumacher et al. 2017) (Bruce, Lopez-Islas et al. 2016)。単一領域を使用する代替の薬物送達の例としては、誘導全身送達(Yang, Moynihan et al. 2018) (Slastnikova, Ulasov et al. 2018)及び効果的な鼻腔内投与(Gomes, Cabrito et al. 2018)のためにナノ粒子とそれらを適合させることが挙げられる。これらの分子はまた、画像診断として役立つような蛍光タンパク質融合体として設計されることもできる(Li, Bourgeois et al. 2012)。一部の疾患標的、例えばウイルス、には、IgGのサイズ制限があり、そのため、単一領域などのより小さいタンパク質治療薬が必要である(Wrapp, De VLieger et al. 2020) (Wilken and McPherson 2018)。
ラクダ及びラマ抗体可変領域は、ヒトVhドメインに対してタンパク質配列相同性を有する(Mitchell and Colwell 2018)、(Herold, John et al. 2017)、(Muyldermans 2013)、(Strohl et al., (2012), Woodhead Publishing)。図1Aは、ヒトIgGとラクダ科動物抗体の構造を示す。ヒト、ラマ、及びラクダのV遺伝子断片のコンセンサス翻訳は、それらのアミノ酸配列相同性を示す図1(B)でアラインされる(配列番号1～4)。CDR3は図1(B)において未掲載であるが、なぜなら、抗体の大部分の多様性が存在する場所だからである。図2は、IMGT(国際免疫遺伝学情報システム) (http://www.imgt.org/IMGTrepertoire/ Proteins/taballeles/human/IGH/IGHV/Hu_IGHVall.html)から得られたラクダ及びラマ両方のVhファミリーに対するヒトVhファミリーの系統樹ベースのアラインメントを示す。その組分けは、ヒトファミリーVh3は、配列相同性においてラクダ及びラマ両方のVHに最も類似しているが、他のヒトVhファミリーにとはそれほど類似していないことを示す。図3は、ヒトVh3サブファミリー内でのさらなる配列相同性を示す。
ヒトVh3(Vh3とも呼ばれる)ファミリーは、免疫時にヒト液性応答中に見られる、並びに発生における抗体の分布を反映する、最も一般的なものである(Joyce, Burton et al. 2020) (Longo, Rogosch et al. 2017)。このファミリーはまた、ヒトレパートリーで最も典型的であることもわかっている(Tiller, Schuster et al. 2013)。ラクダ/ラマの単一Vhドメインは抗体のヒトVhドメインに類似しているが、それらもまた全く異なっている。これらの違いは、ラクダ/ラマ単一Vhドメインを使用した診断及び治療処置の有効性を制限する免疫原性効果を引き起こし得る。
ある程度の研究者らは、ラクダ、ラマ、又はアルパカ抗体足場由来のそれらのファージライブラリをベースとした。最近、Twist Bioscience社は、ヒト、他の種(ラクダ、ラマ、及びアルパカ)のうちの1つの配列の混合物に基づいた足場を使用した。Rossotti et al. (2021)によるsdAb(単一領域抗体)の総説では、sdAbsに対する免疫原性と抗薬物抗体応答(ADA)が、凝集特性をもたらす固有の非ヒト配列から起こったと結論づけた。
本開示は、単一ドメインベースの診断又は治療用化合物を作製するための、ラクダ科動物由来のVHHベースの分子に代わってヒトVh領域を使用することを記載する。例えば、本開示は、単一ドメインベースの治療用化合物を作製するのにヒト抗体Vh3ファミリーのVh領域を使用することを記載する。斯かる単一ドメインベースの治療用化合物は、他のヒト抗体Vhファミリー由来の単一ドメインベースの治療用化合物に比べて、改善された安定性及び/又は改善された治療係数を有し得る。
本開示の概要
本開示は、単一ドメインベースの治療用化合物、例えば、sdAb、ナノボディ(Nb)、及びVHHタイプの抗体を作製するためのVHO(可変重鎖のみ)プラットフォームを提供する。一実施形態において、本開示は、遺伝子ファミリーVh3などのヒトVhファミリーのヒト可変ドメインベースのVHOライブラリ(本明細書中ではTavoSelectライブラリとも呼ばれる)を提供する。例えば、ヒト抗体Vh3ファミリーのVh領域は、VHOライブラリを作り出すための足場として使用できる。
本開示は、単一ドメインベースの治療用化合物、例えば、sdAb、ナノボディ(Nb)、及びVHHタイプの抗体を作製するためのVHO(可変重鎖のみ)プラットフォームを提供する。一実施形態において、本開示は、遺伝子ファミリーVh3などのヒトVhファミリーのヒト可変ドメインベースのVHOライブラリ(本明細書中ではTavoSelectライブラリとも呼ばれる)を提供する。例えば、ヒト抗体Vh3ファミリーのVh領域は、VHOライブラリを作り出すための足場として使用できる。
一実施形態において、本開示は、アミノ酸配列によって相同である、及び/又はヒトVhファミリーのVhドメインに対してカノニカル構造が類似している、ヒト可変ドメイン生殖細胞系列ベースのVHOライブラリを提供する。一実施形態において、本開示は、多様なVHOドメインをコードするポリヌクレオチドのVHOライブラリを提供し、ここで、該VHOドメインは、遺伝子ファミリーVh3などのヒトVhファミリーのVhドメインと配列相同性を有する、及び/又はカノニカル相同性を有する。例えば、カノニカル構造としては、IMGT(国際免疫遺伝学情報システム)又はKabatデータベース若しくはV Baseデータベースなどのその他の情報源で入手されるヒト抗体配列の3Dモデリングを挙げることができる。
一実施形態において、本開示は、多様なVHOドメインを提示できる又は多様なVHOドメインを提示するファージライブラリ(本明細書では「VHOファージライブラリ」とも呼ばれる)を提供する。一実施形態において、VHOライブラリは、M13ファージなどの細菌のファージのコートタンパク質により組み立てられる。一実施形態において、VHOライブラリは、M13ファージのpIX及び/又はpVIIコートタンパク質への遺伝子融合によって組み立てられる。
一実施形態において、本開示は、多様性選択又はパンニングスクリーニングを受けるのに十分にロバストであるVHOファージライブラリを提供する。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載したVHOドメインのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載のVHOドメインをコードするポリヌクレオチド配列を準備し、そして該ポリヌクレオチド配列をファージミド及び/又はプラスミドなどのベクター内に挿入すること、を含む、VHOライブラリを調製する方法を提供する。
一実施形態において、本開示は、細菌細胞培養物を本明細書に記載のVHOファージライブラリで形質転換し、該細菌細胞培養物を対数期まで増殖させ、該細菌細胞培養物にヘルパーファージを感染させて、そして該細菌細胞培養物を増幅させること、を含む、VHOライブラリを調製する方法を提供する。
一実施形態において、本開示は、目的のVHO候補を同定するための、例えば、ファージパンニングによって、VHOファージライブラリをスクリーニングする方法を提供する。一実施形態において、本開示は、標的に結合できる目的のVHOドメインを同定する方法であって、以下：本明細書に記載したように、VHOファージライブラリなどのVHOライブラリを作製し、該VHOファージライブラリを、標的に対するバイオパニングを使用してスクリーニングして、目的のVHOを同定すること、を含む方法を提供する。一実施形態において、その方法はさらに、NGS(次世代シークエンシング)によって目的のVHOを配列決定することを含む。一実施形態において、その方法はさらに、例えば、ELISA、BLI、及び/又はSPRによって、標的に対する目的のVHOの結合親和性を評価することを含む。
一実施形態において、目的のVHO候補物質は、ファージ上に提示され、スタンドアロンタンパク質として発現され、IgG若しくは別の可溶性ドメインとの融合体として、又はT若しくはB細胞受容体ドメインなどの細胞表面タンパク質へのタンパク質融合体として、発現され得る。
一実施形態において、本明細書に記載のVHOは、融合体としてヒトIgG Fcドメインに接続され得る。Fcドメインへの斯かる融合体は、ヒンジ部を有していても若しくは有していなくてもよく、又は定常重鎖ドメインに融合されていても若しくはされていなくてもよく、又はκ若しくはλファミリーのいずれかの定常軽鎖に融合されていても若しくはされていなくてもよい。
一実施形態において、本開示は、標的を結合できる目的の VHOを提供する。一実施形態において、本開示は、目的のVHOに対して50%超の同一性を有するタンパク質を提供する。一実施形態において、本開示は、目的のVHOに対して50%超の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。
一実施形態において、目的のVHOは、タグに融合される。そのタグは、任意の免疫グロブリンファミリーのFcドメイン、ポリヒスチジン、及びFLAGからも選択され得る。例えば、目的のVHOは、免疫グロブリン、受容体、及び細胞表面タンパク質、並びに免疫グロブリン、受容体、及び細胞表面タンパク質の断片から選択されるタンパク質に融合される。例えば、目的のVHOは、可溶性タンパク質として、別のタンパク質(例えば、免疫グロブリン)に融合された可溶性タンパク質として、或いは任意の細菌細胞(例えば、E.コリ(E.coli))、任意の哺乳動物細胞、酵母、又は植物細胞において任意の細胞表面タンパク質(例えば、受容体)への融合体として、発現され得る。
一実施形態において、本開示は、目的のVHO又は目的のVHOを含むポリペプチドを含む組成物、例えば、別のタンパク質と目的のVHOの融合体、を提供する。
一実施形態において、本開示は、本明細書に記載したベクターを含む、細胞、例えば細菌細胞、を提供する。
詳細な説明
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含むがこれらに限定されないあらゆる刊行物は、あたかも完全に表記されているかのように参照により本明細書に援用される。本明細書に引用された文献の特定の内容が本開示と矛盾するか、又は反する場合、本開示が統制する。
本明細書に引用されている特許及び特許出願を含むがこれらに限定されないあらゆる刊行物は、あたかも完全に表記されているかのように参照により本明細書に援用される。本明細書に引用された文献の特定の内容が本開示と矛盾するか、又は反する場合、本開示が統制する。
本明細書に使用されている用語法は、単に特定の実施形態を記載することを目的としており、限定を意図するものではないことを理解されたい。他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。
本開示の実施又は検査において、本明細書に記載されているものと同様の又は均等ないかなる方法及び材料を使用することもできるが、例示的な材料及び方法が本明細書に記載されている。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「a」、「an」及び「the」は、内容がそれ以外のことを明らかに指示しない限り、複数形の指示対象を含む。よって、例えば、「1つの細胞(a cell)」の参照は、2つ又はそれよりも多い細胞の組み合わせ、その他を含む。
「抗体」は、広義で企図され、マウス、ヒト、ヒト化及びキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体断片、二特異性又は多特異性抗体、二量体、四量体又は多量体抗体、単鎖抗体、ドメイン抗体、ならびに要求される特異性の抗原結合部位を含む他のいずれかの改変された構成の免疫グロブリン分子を含む免疫グロブリン分子を含む。
「完全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互接続された2本の重鎖(HC)及び2本の軽鎖(LC)、ならびにその多量体(例えば、IgM)で構成される。各重鎖は、重鎖可変領域(VH)及び重鎖定常領域(ドメインCH1、ヒンジ、CH2及びCH3で構成される)で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域(VL)及び軽鎖定常領域(CL)で構成される。VH及びVL領域は、フレームワーク領域(FR)を散在させた、相補性決定領域(CDR)と命名された高頻度可変性の領域へとさらに細分することができる。各VH及びVLは、3個のCDR及び4個のFRセグメントで構成されており、これらは、アミノ末端からカルボキシル末端へ、次の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4で配置されている。
「相補性決定領域(CDR)」は、抗体における「抗原結合部位」である。CDRは、様々な用語を使用して定義することができる：(i) 3個はVHにあり(HCDR1、HCDR2、HCDR3)、3個はVLにある(LCDR1、LCDR2、LCDR3)、相補性決定領域(CDR)は、配列可変性に基づく(Wu et al. (1970) J Exp Med 132: 211-50 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991)。(ii) 3個はVHにあり(H1、H2、H3)、3個はVLにある(L1、L2、L3)、「高頻度可変領域」、「HVR」又は「HV」は、Chothia及びLesk(Chothia et al. (1987) J Mol Biol 196: 901-17)によって定義されるとおり、構造が高頻度可変である抗体可変ドメインの領域を指す。国際免疫遺伝学(IMGT)データベース(http://www_imgt_org)は、抗原結合部位の標準化されたナンバリング及び定義を提供する。CDR、HV及びIMGT描写の間の一致は、Lefranc et al. (2003) Dev Comp Immunol 27: 55-77に記載されている。用語「CDR」、「HCDR1」、「HCDR2」、「HCDR3」、「LCDR1」、「LCDR2」及び「LCDR3」は、本明細書で使用される場合、本明細書にそれ以外のことが明確に記述されていない限り、上記の方法、Kabat、Chothia又はIMGTのいずれかによって定義されるCDRを含む。
従来の一文字及び三文字アミノ酸コードが、本明細書に使用されている。アミノ酸、三文字コード、一文字コード：
本明細書に提供されるポリペプチド、核酸、融合タンパク質及び他の組成物は、本明細書に提供されるアミノ酸配列又はDNA配列に対して列挙されているパーセント同一性を有するポリペプチド、核酸、融合タンパク質その他を包含することができる。用語「同一性」は、配列の整列及び比較によって決定される、2種若しくはそれよりも多いポリペプチド分子又は2種若しくはそれよりも多い核酸分子の配列の間の関係性を指す。「パーセント同一性」、「パーセント相同性」、「配列同一性」又は「配列相同性」その他は、比較される分子におけるアミノ酸又はヌクレオチドの間の同一残基のパーセントを意味し、これは、比較されている分子の最小のサイズに基づき計算される。このような計算のため、整列におけるギャップ(あるとすれば)が、好ましくは、特定の数理モデル又はコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって取り組まれる。整列された核酸又はポリペプチドの同一性の計算に使用することができる方法は、Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M., ed.), 1988, New York: Oxford University Press; Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed.), 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.), 1994, New Jersey: Humana Press; von Heinje, G., 1987, Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.), 1991, New York: M. Stockton Press;及びCarillo et al., 1988, SIAM J. Applied Math. 48:1073に記載されている方法を含む。パーセント同一性の計算において、比較されている配列は、典型的に、配列の間で最大のマッチが得られる仕方で整列される。
「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的又は生化学的に改変又は誘導体化されたアミノ酸、ならびに改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる、いずれかの長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。これらの用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、タンパク質分解性切断その他など、ポリペプチドの同時翻訳(例えば、シグナルペプチド切断)及び翻訳後改変を有するポリペプチドも含む。
さらに、本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、ネイティブ配列に対して欠失、付加及び置換(当業者にとって公知のとおり、一般に保存的な性質の)などの改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるなど、計画的であってもよい、あるいはタンパク質を産生する宿主の変異又はPCR増幅若しくは他の組み換えDNA法が原因のエラーによるなど、偶発的であってもよい。
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」及び「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドのポリマー形態を含むように本明細書で互換的に使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。
「ベクター」は、生物システム内で重複され得る、又はこのようなシステム間で移動され得るポリヌクレオチドを指す。ベクターポリヌクレオチドは典型的に、ベクターを重複することができる生物学的構成成分を利用して、細胞、ウイルス、動物、植物及び再構成された生物システムなどの生物システムにおけるこのようなポリヌクレオチドの重複又は維持を容易にするように機能する、複製起点、ポリアデニル化シグナル又は選択マーカーなどのエレメントを含有する。ベクターポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖の、DNA若しくはRNA分子、cDNA、又はこれらのハイブリッドであってもよい。ベクターは、細菌のファージミド及び/又はプラスミドであってもよい。ベクターは、発現ベクターであっても、又はファージが目的のタンパク質を提示することができるベクターであってもよい。例えば、本明細書に開示されるpTavoファージミド/プラスミドは、細菌ファージ（bacterial phage）のコートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、又は斯かるコートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含まないベクターであり得る。例えば、図5(B)を参照のこと。ベクターは、例えば、ELISA、BLI、及び/又はSPRによる、例えば、精製及び/又は検出のための、1若しくは複数のタグを含んでもよい。その1若しくは複数のタグは、ポリ‐ヒスチジン(HIS)及びヘマグルチニン(HA)タグから選択され得る。そのタグは、VHO、及び/又はコートタンパク質に融合され得る。例えば、図5(A)を参照のこと。
「発現ベクター」は、発現ベクター中に存在するポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの翻訳を方向付けるために、生物システム又は再構成された生物システムにおいて利用され得るベクターを指す。
「宿主細胞」は、本明細書で使用される場合、インビボ若しくはインビトロにおいて真核細胞、又は単細胞の実体として培養された多細胞生物由来の細胞(例えば、細胞系)を表示し、このような真核細胞は、核酸(例えば、本開示の多量体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター)のレシピエントとして使用することができる又は使用されており、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫が、天然、偶発的又は計画的変異が原因で、必ずしも、元の親と形態又はゲノム若しくは総DNA含量において完全に同一でなくてよいことが理解される。「組み換え宿主細胞」(「遺伝子改変された宿主細胞」とも称される)は、異種核酸、例えば、発現ベクターが導入された宿主細胞である。例えば、遺伝子改変された真核宿主細胞は、適した真核宿主細胞への、異種核酸、例えば、真核宿主細胞にとって外来である外因性核酸、又は真核宿主細胞に正常であれば見出されない組み換え核酸の導入によって遺伝子改変されている。
「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「結合する」は、他の抗原に対するよりも優れた親和性での特異的抗原への抗体結合を指す。典型的には、結合に関する平衡解離定数(KD)が、約1×10－8M又はそれ未満、例えば、約1×10－9M若しくはそれ未満、約1×10－10M若しくはそれ未満、約1×10－11M若しくはそれ未満又は約1×10－12M若しくはそれ未満であり、典型的には、非特異的抗原(例えば、BSA、カゼイン)への結合に関するそのKDの多くとも百分の1のKDによる場合、抗体は、「特異的に結合する」。KDは、標準手順を使用して測定することができる。
「ファージディスプレイライブラリ」は、本明細書に使用される場合、ファージコートタンパク質との融合体としてクローン化タンパク質配列の収集物を発現できるか又は発現するバクテリオファージ、例えば、M13由来、ベクターで構成された、タンパク質発現ライブラリを指す。抗体ファージディスプレイライブラリ、及び斯かるライブラリを作製する方法は、当該技術分野で既知である(例えば、Famm et al., J. Mol. Biol. 376:926- 931, 2008; Carmen and Jermutus, Brief Funct Genomic Proteomic 1(2):189-203, 2002; and U.S. Pat. Nos. 6,828,422 and 7,195,866を参照のこと)。例えば、本明細書に開示されるVHOファージディスプレイライブラリは、ファージ、例えばM13ファージ、にVHOドメインのライブラリを提示できるか又は提示する。
「VHO」、「VHO領域」、「VHOドメイン」、又は「VHOタンパク質」は、本明細書に使用される場合、ヒト、ラクダ、及びラマ抗体VhファミリーのVh領域、例えば、ヒト抗体Vh3ファミリーのヒトVh領域、例えば、少なくとも55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の配列同一性を有する、保存配列(タンパク質又はDNA)を共有するポリペプチドを意味する。文脈により、「VHO」、「VHO領域」、又は「VHOドメイン」は、VHOポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を指すのに使用されてもよい。
リーダーペプチド
特定の実施形態において、リーダーペプチド又はリーダー配列は、分泌タンパク質として細胞培養上清中に、この開示に記載のVHOタンパク質の分泌を駆動するように選択される。任意の既知の分泌タンパク質/ペプチドのための任意のリーダーペプチドも使用できる。
特定の実施形態において、リーダーペプチド又はリーダー配列は、分泌タンパク質として細胞培養上清中に、この開示に記載のVHOタンパク質の分泌を駆動するように選択される。任意の既知の分泌タンパク質/ペプチドのための任意のリーダーペプチドも使用できる。
本明細書に使用される場合、「リーダーペプチド」又は「シグナルペプチド」としては、通例、長さが16～30アミノ酸の短ペプチドが挙げられ、そしてそれは、分泌経路に向かう予定になっている新規合成タンパク質のN末端に存在する。リーダーペプチドは配列が極度に異種であり、かつ、多くの原核及び真核リーダーペプチドが別種の間でさえ機能上交換可能であるが、タンパク質分泌の効率は、リーダー/シグナルペプチドの配列によって強く決定され得る。
リンカーペプチド
いくつかの実施形態において、VHO、コートタンパク質、及び1若しくは複数のタグの間に1若しくは複数のリンカーペプチドが存在してもよい。例えば、図5(A)を参照のこと。例えば、VHOと1若しくは複数のタグ(例えば、Fc、HISタグ及び/又はHAはタグ)の間にリンカーペプチドが存在してもよい。また、VHOとコートタンパク質の間にリンカーペプチドが存在してもよい。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは、ファージによる提示又は精製若しくはアッセイ検出を目標とするタグの使用のための活性に役立つ任意の他のペプチドによって置換され得る。
いくつかの実施形態において、VHO、コートタンパク質、及び1若しくは複数のタグの間に1若しくは複数のリンカーペプチドが存在してもよい。例えば、図5(A)を参照のこと。例えば、VHOと1若しくは複数のタグ(例えば、Fc、HISタグ及び/又はHAはタグ)の間にリンカーペプチドが存在してもよい。また、VHOとコートタンパク質の間にリンカーペプチドが存在してもよい。いくつかの実施形態において、リンカーペプチドは、ファージによる提示又は精製若しくはアッセイ検出を目標とするタグの使用のための活性に役立つ任意の他のペプチドによって置換され得る。
好適なリンカーペプチド(「スペーサー」とも呼ばれる)は、容易に選択され、かつ、1個のアミノ酸～30個のアミノ酸(例えば、1～30の任意の特定の整数)、又は1個のアミノ酸(例えば、Gly)～約20個のアミノ酸(例えば、2～15、3～12、4～10、5～9、6～8、又は7～8個のアミノ酸)などの好適な長さの任意の数のものであり得る。
例示的なリンカーペプチドとしては、グリシンポリマー(G)n、グリシン‐セリンポリマー(例えば、(GS)n、(GSGGS)n(配列番号13)、及び(GGGS)n(配列番号14を含む)｛ここで、nは、少なくとも1つの整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20である｝、グリシン‐アラニンポリマー、アラニン‐セリンポリマー、アラニン‐プロリン、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgMを含めた免疫グロブリンアイソタイプ及びサブタイプヒンジ、並びに当該技術分野で知られている他のフレキシブルリンカーペプチド、が挙げられる。Gly及びSerの両方が、比較的構造化されておらず、そのため、成分間の中性テザーとして役立ち得る。
特定の実施形態において、リンカーペプチドは、グリシンポリマーである。グリシンは、アラニンより有意に多くのphi-psiスペースに接近し、かつ、より長い側鎖を有する残基に比べてほとんど制限されない(Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)を参照のこと)。例示的なリンカーペプチドは、これだけに限定されるものではないが、GGS、GGSG(配列番号15)、GGSGG(配列番号16)、GGGGS(配列番号17)、GSGSG(配列番号18)、GSGGG(配列番号19)、GGGSG(配列番号20)、GSSSG(配列番号21)などを含有するアミノ酸配列を含み得る。
特定の実施形態において、リンカーペプチドは、リジッドリンカーである(Chen, Zaro et al. 2013)。例示的なリジッドリンカーペプチドは、任意のアミノ酸、好ましくはAla、Lys、又はGlu、を指定するXを有しする、高プロリン配列、(XP)n｛ここで、nは、少なくとも1つの整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20である｝を、これだけに限定されるものではないが含む、アミノ酸配列を含む。例示的なリジッドリンカーペプチドは、(EAAAK)n(配列番号22)｛ここで、nは少なくとも1つの整数、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20である｝の配列を有するαヘリックス形成リンカーを、これだけに限定されるものではないが含むアミノ酸配列も含み得る。
VHOライブラリの設計、合成、及び構築
本開示は、単一ドメインベースの治療用化合物を作製するためのVHOプラットフォームを提供する。一実施形態において、本開示は、遺伝子ファミリーVh3などのヒトVhファミリーのヒト可変ドメインベースのVHOライブラリ(本明細書ではTavoSelectライブラリとも呼ばれる)を提供する。ヒト抗体Vh3ファミリーのVh領域は、VHOライブラリを作り出すための足場として使用できる。例えば、IGVh3ファミリーのメンバーであるヒト配列IGHV3.23は、VHOライブラリを構築するための足場として使用される。他のヒト生殖細胞系列ファミリーより安定したVhを有するので、IGHV3が選択される(Ewert et al 2003)。IGHV3はまた、ラクダ、ラマ、及びアルパカIgGに対して高レベルの配列同一性を有する(例えば、図2及び3を参照のこと)。
本開示は、単一ドメインベースの治療用化合物を作製するためのVHOプラットフォームを提供する。一実施形態において、本開示は、遺伝子ファミリーVh3などのヒトVhファミリーのヒト可変ドメインベースのVHOライブラリ(本明細書ではTavoSelectライブラリとも呼ばれる)を提供する。ヒト抗体Vh3ファミリーのVh領域は、VHOライブラリを作り出すための足場として使用できる。例えば、IGVh3ファミリーのメンバーであるヒト配列IGHV3.23は、VHOライブラリを構築するための足場として使用される。他のヒト生殖細胞系列ファミリーより安定したVhを有するので、IGHV3が選択される(Ewert et al 2003)。IGHV3はまた、ラクダ、ラマ、及びアルパカIgGに対して高レベルの配列同一性を有する(例えば、図2及び3を参照のこと)。
本明細書に記載したVHOは、そのVHOがヒトアミノ酸配列を含むという点で、他の単一領域抗体(sdAb)及び/又はナノボディ(Nb)と異なっている。よって、
ラクダ、ラマ、及びアルパカsdAbライブラリには必要があるVHOパンニングのための
あらゆるヒト化方法を必要としなくともよい。
ラクダ、ラマ、及びアルパカsdAbライブラリには必要があるVHOパンニングのための
あらゆるヒト化方法を必要としなくともよい。
一実施形態において、VHOライブラリは、最も高い精度の有力候補を得るような方法で作製される。「精度」は、システイン、メチオニン、及び/又は縮重のCDR領域内に設計された終止コドンの不存在、並びに開始メチオニンコドンから設計された終止コドンまでのオープンリーディングフレーム(ORF)の維持、と定義される。
一実施形態において、本開示は、バリエーションを有する(例えば、無作為化コドンを有する)VHOポリヌクレオチド配列のライブラリを構成するVHO変異ライブラリを提供し、ここで、そのVHOフレームワーク又は足場は、ヒトVh3ファミリーのVh領域などのヒトVhファミリーのVh領域に基づいて設計されている。IMGT命名法に基づくVh3ファミリーとしては、サブファミリーVh3メンバーIGHV3-7、IVGH3-9、IVGH3-11、IVGH3-13、IVGH3-15、IVGH3-16、IVGH3-19、IVGH3-20、IVGH3-21、IVGH3-23、IVGH3-23D、IVGH3-25、IVGH3-30、IVGH3-30-3、IVGH3-30-5、IVGH3-33、IVGH3-35、IVGH3-38、IVGH3-43、IVGH3-47、IVGH3-48、IVGH3-49、IVGH3-52、IVGH3-53、IVGH3-64、IVGH3-66、IVGH3-69-1、IVGH3-72、IVGH3-73、及びIVGH3-74を挙げることができる。
一実施形態において、本開示は、バリエーションを有する(例えば、無作為化コドンを有する)VHOポリヌクレオチド配列のライブラリを構成するVHO変異ライブラリを提供し、ここで、そのVHOフレームワーク又は足場は、IGHV3-23のVh領域に基づいて設計されている。
一実施形態において、本開示は、アミノ酸配列による相同である、及び/又はカノニカル構造でヒトVhファミリーのVhドメインに類似であるヒト可変ドメイン生殖細胞系列ベースのVHOライブラリを提供する。カノニカル構造とは、CDRループのアラインメントと、そのCDRループ間の配列の位置決定を指す。IMGT及び/又は他の抗体供給元によって定義されたすべてのVDJ遺伝子組み合わせを含めたヒト生殖細胞系列ファミリーVh3は、IMGT及び/又は他の抗体供給元に基づくDNA及び/又はタンパク質配列BLAST検索アラインメントによるそれらのVDJ遺伝子組み合わせを包含するラマ及びラクダVHHに対して類似性が最も高い。図3は、ヒトVhドメインと比較したラクダ又はラマVHHドメインの配列が、それぞれ81%及び79%相同性の平均ペアワイズ同一性を有することを示す。Vh3生殖細胞系列ファミリーは、未感作及び免疫されたヒトにおいて最も豊富である(Herce, Schumacher et al. 2017)。Vh3生殖細胞系列ファミリーは、他のヒト重鎖可変生殖細胞系列ファミリーより安定している(Ewert, Huber et al. 2003)。
一実施形態において、VHOライブラリは、例えば、IMGT及び/又は他の抗体供給元によって定義されるすべてのVDJ遺伝子組み合わせをアラインすることによって、Geneious又は他の関連ソフトウェアにより作り出される、完全ヒト生殖細胞系列Vh3ファミリーのコンセンサス配列に基づいて作製される。Vh3ファミリー配列のアラインメントは、ヌクレオチド、核酸配列(DNAアラインメント)又はアミノ酸配列(タンパク質アラインメント)に基づくことができる。DNA配列はまた、アラインされたアミノ酸又は残基タイプに従って作り出されることもできる。タンパク質アラインメントは、IMGTなどの供給元によって提供されたカノニカル構造の規則を適用しながら実施され得る。
一実施形態において、本開示は、様々なVHO(可変重鎖のみ)ドメインをコードするポリヌクレオチドのVHO縮重遺伝子ライブラリを提供し、ここで、該VHOドメインは、Vh3ファミリーなどのヒトVhファミリーのVhドメイン、例えば、IGHV3-23との、IMGTによって定義された配列相同性及び/又はカノニカルループ領域相同性を有する。例えば、その配列相同性(アミノ酸又はヌクレオチド)は、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、又は99%である。そのVHOドメインは、VHOドメインの全領域における残基の多様性を有し得る。例えば、そのVHOドメインは、1若しくは複数のCDR領域における、例えば、CDR1、CDR2、及び/又はCDR3領域における、残基の多様性を有する。例えば、VHOドメインは、1若しくは複数のフレームワーク領域における、例えば、FR1、FR2、FR3、及び/又はFR4領域における、残基の多様性を有する。一実施形態において、1若しくは複数のフレームワーク領域は、タンパク質発現、タンパク質折り畳み、タンパク質精製、結合親和性、下流標的のシグナル伝達、及び/又はシグナル伝達の阻害のレベルの改善を提供する1若しくは複数の突然変異を有し得る。一実施形態において、そのVHOドメインは、1若しくは複数のCDR領域と、1若しくは複数のフレームワーク領域における残基の多様性を有する。一実施形態において、そのVHOドメインは、すべてのCDR領域と、すべてのフレームワーク領域における残基の多様性を有する。一実施形態において、そのVHOは、IMGT又は類似の基準供給元による典型的な可変重鎖ドメインである領域、例えばCDR1～3及びFR1～4、を含む。
一実施形態において、VHOライブラリは、一方の部分としてCDR1及びCDR2を有し、並びに他方の部分としてCDR3を有する遺伝子モジュールを含むように設計される。CDRはまた、scFv、Fab、及びIgG分子に見られるVh及びVL関連性に関わる残基を破壊することによって凝集を最小にするように設計されることもできる。Vl領域と相互作用するようにVh領域を通常提供するCDR並びにフレームワーク内の特定の位置にて異なる残基を使用することは、VHO分子が凝集することを少なくする。よって、VHOライブラリは、凝集が分子間sdAb相互作用から生じるラクダ、ラマ、及びアルパカVHH抗体ライブラリと異なる。
一実施形態において、本明細書に開示されたVHOライブラリから得られたsdAbsの小パラトープは、所定の標的抗原に関する多くの形式のバイオパニングのスクリーニングを可能にする。VHOのより小さいパラトープを伴うこの多様なバイオパニングアプローチは、多くのエピトープを標的表面上で発見することを可能にする。より多くのエピトープを有することは、優れた治療用又は診断用生物製剤の分子を発見する機会を改善し得る。
一実施形態において、IMGT、Kabat、CLOTHIA、又はMartinの定義のいずれか、並びにそれらの組み合わせによって定義されたCDR3の長さは、例えば、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29～30個のアミノ酸(対応するポリヌクレオチド配列の6～30個のコドン)などの1～30個のアミノ酸の範囲に及び得る。
一実施形態において、VHOライブラリは、1若しくは複数のサブライブラリを包含し得る。例えば、VHO上のCDR3の長さは変更でき、これにより、VHOライブラリ内の複数のサブライブラリが作製できる。
一実施形態において、VHOフレームワーク又は足場は、ヒトVhファミリーのすべてのVJ領域の、Geneious又は(IMGTからアミノ酸と共にアップロードされた)他の関連ソフトウェアによって作り出された、以下のコンセンサス配列に基づいて設計される：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS(配列番号5)。
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS(配列番号5)。
一実施形態において、VHOフレームワーク又は足場は、ヒトVh3サブファミリーのすべてのVJ領域の、Geneious又は(IMGTからアミノ酸と共にアップロードされた)他の関連ソフトウェアによって作り出された、以下のコンセンサス配列に基づいて設計される：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X)DSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS(配列番号6)。
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X)DSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS(配列番号6)。
ヒト可変重鎖ドメインのCDR領域の特定の非保存部位は、配列番号5及び6において「X」によって示される。その「X」は、適切なアミノ酸に翻訳されるコドンに適用される任意の種類の縮重突然変異誘発のシンボルである。その「X」の置換はまた、IMGT、Kabat、Clothia、又はMartinの定義、並びにヒト可変領域に関する斯かる定義の組み合わせによる任意の定義されたCDR位置にて設定され得る。「X」は、配列番号5及び6などの可変重鎖ドメイン内の任意の位置に配置されることができ、そして、アミノ酸分布又は相対コドン分布の任意の組み合わせが、Xを置換するのに使用できる。
一実施形態において、「X」で規定される位置は、CDR1のためのC、CDR2のためのC及びM、並びにCDR3のためのC、M、及びN以外の全20種類の天然に存在するアミノ酸の一様の分布により置換される。例えば、CDR1の「X」はC(Cys)残基によって置換されず、CDR2の「X」はC又はM残基によって置換されず、CDR3の「X」はC、M、又はN残基によって置換されない。アミノ酸のその他の組み合わせとそれぞれのアミノ酸の分布は等しいと考えられる。斯かる分布は、NNK又はTRIMなどのDNA縮重合成法/技術によって作製され得る(Ferreira Amaral, Frigotto et al. 2017) (Li A, Sun Z, Reetz MT. 2018) (Suchsland R, Appel B, Muller S. 2018)。
可変領域内の縮重の設計は、本明細書に開示されるように決定される。可変領域における変異を設計する複数の標準的方法もまた、より多様なライブラリを作製するためにも使用できる。縮重のVHOコンセンサス足場及び/又はライブラリの設計はまた、細菌(例えば、エシェリキア・コリ(Escherichia coli))、酵母、又は哺乳動物(例えば、ヒト又はチャイニーズハムスター卵巣細胞)における縮重のVHO足場及び/又はライブラリの翻訳などの要因も考慮できる。例えば、縮重のVHO足場及び/又はライブラリの設計は、当業者によって典型的に設計されるコドン利用又はコドン最適化の組み合わせを考慮し得る。
一実施形態において、本明細書に開示されるVHOライブラリのポリヌクレオチド配列は、細菌のファージミド及び/又はプラスミドなどのベクター内に配置される。一実施形態において、そのベクターは、当業者によって典型的に使用される、抗生物質抵抗性を介した制御された増殖のための機能に関する1若しくは複数の要素、DNA複製のためのOri部位、ファージ複製のためのOri部位、タンパク質発現を駆動するためのプロモーター、分泌シグナル(例えば、翻訳タンパク質の分泌を駆動するためのリーダー配列)、及びタンパク質発現のレベルを制御するためのリプレッサー、を包含する。使用される宿主系に依存して、コドン使用とファージミド/プラスミドの特定の組み合わせが、タンパク質への遺伝子のより効果的な発現を得るために使用できる。
一実施形態において、本明細書に開示されたVHOライブラリは、ファージミド/プラスミド内の発現カセット、例えば、図5(B)に見られるpTAVO、に配置される。
一実施形態において、本開示は、ファージライブラリを提供し、ここで、本明細書に記載したVHOドメインは、原核又は真核細胞によって産生されたウイルス粒子上、原核及び/又は真核宿主細胞に感染したウイルス上、或いは原核又は真核細胞上に提示され得るか、又は提示される。
一実施形態において、本開示は、M13糸状バクテリオファージなどのバクテリオファージによるVHOライブラリを提供する。バクテリオファージの任意のコートタンパク質、例えばM13は、VHOドメインのアミノ又はカルボキシル末端のいずれかにインフレーム遺伝子融合によって接続され得る。例えば、VHOは、任意のコートタンパク質、例えば、M13糸状バクテリオファージのPVII、PIX、PIII、及び/又はPVI、例えば、pVII及び/又はpIXと融合され得る(Hoydahl, Nilssen et al. 2016を参照のこと)。VHOとコートタンパク質を含む融合体はさらに、当業者に理解される他のタグ又はタグ組み合わせと融合され得る。図5(A)は、バクテリオファージコートタンパク質に融合されたVHO(例えば、HISタグとHAタグを有するコートタンパク質pIXに融合されたVHO)を示す略図を例示する。図5(C)は、M13ファージに融合された(M13ファージ上に提示された)VHOの略図を示す。
VHO変異ライブラリの合成及び構築は、当業者によって理解された方法によって実施され得る。本明細書に開示されるVHO変異ライブラリは、当業者によって理解されたクローニング法によってファージミド/プラスミド構築物中に配置される。例えば、NcoI及びNotI制限部位は、VHOファージライブラリなどの連結VHOライブラリ構築物を得るためにVHO変異ライブラリのDNAが挿入される場所としてpTAVO上の領域を示す。さらに、遺伝子組み換えと制限酵素クローニング法との組み合わせが、各カセット内のVHO変異ライブラリを構成するのに使用できる。
VHOファージライブラリによる形質転換
連結VHOファージライブラリ構築物は、、以下の例示的な実施形態によって例示されるとおり、MC1061Fの細胞、又はM13糸状性バクテリオファージによって感染できる同等な菌株(JM105、JM107、JM110、DH1、GM48、SL10、TD1、MC4100、SK1592など)などの細胞に形質転換される。1×10６～1×10１１の形質転換効率(連結DNAの量あたりのコロニー)は、典型的な研究室環境で得ることができる。形質転換効率は、1マイクログラムのDNAの反応から得ることができるものが何コロニー形成単位(形質転換体)かを測定することによって計算される。
連結VHOファージライブラリ構築物は、、以下の例示的な実施形態によって例示されるとおり、MC1061Fの細胞、又はM13糸状性バクテリオファージによって感染できる同等な菌株(JM105、JM107、JM110、DH1、GM48、SL10、TD1、MC4100、SK1592など)などの細胞に形質転換される。1×10６～1×10１１の形質転換効率(連結DNAの量あたりのコロニー)は、典型的な研究室環境で得ることができる。形質転換効率は、1マイクログラムのDNAの反応から得ることができるものが何コロニー形成単位(形質転換体)かを測定することによって計算される。
細菌培養物は、VHOファージライブラリ、例えば、固定されたCDR3長を有するVHOライブラリ、を用いて形質転換できる。VHOファージライブラリが異なるCDR3長を有する複数のサブライブラリを含む場合、複数の細菌培養物は、それぞれのCDR3長のVHOサブライブラリを用いてそれぞれ形質転換できる。
VHOファージライブラリ、例えば、固定されたCDR3長のVHOサブライブラリ、で形質転換された細菌培養物は、対数期まで培養される。培養物は、VCSM13ヘルパーファージなどのヘルパーファージで感染させ、そして、誘導条件下で一晩培養される。一晩のファージライブラリ増幅培養物は、ファージ採集法を受ける。少なくとも1×10１２のコロニー形成単位又はプラーク形成単位の力価が得られる。ローリングサークル及びサンガーシークエンシング法は、単独感染コロニーで実施される。例えば、単独感染コロニーのシークエンシングから得られた配列は、翻訳のために加工され、次に、互いに、並びにVHO DNA配列鋳型に対してアラインされる(例えば、IMGTから得られた生殖細胞系列Vh配列のマッチング)。この配列分析では、分泌シグナルから予想される最後の終止コドンまでのインフレーム翻訳を期待する。一実施形態において、Cysteine、Methionine、又は1若しくは複数のCDR内に配置された終止コドンを含有する任意の配列は、正確なVHOとして認められない。これらのVHOライブラリの典型的な正確さは、30～60%の範囲に及ぶ。図5(C)は、VHOが少ないコートタンパク質pIXとの遺伝子融合によってM13ファージ表面にどのように提示されるかに関する例を描く。類似の多様性、形質転換効率、及び機能的な精度を有するFabファージライブラリは、多くの成功したバイオパニングプロジェクトをもたらした(Shi et al, 2007)。
VHOファージライブラリのスクリーニング
本明細書に開示されるVHOファージライブラリは、以下の例示的な実施形態で例示されるように、標的に対するパンニング(又はバイオパニング)方法を使用してスクリーニングできる。標的は、タンパク質、細胞、組織、又はその組み合わせであり得る。例えば、VHO pIXファージディスプレイライブラリは、スクリーニングのための標的に追加される。これは、ファージライブラリのVHO部分と標的との間に結合が起こることを可能にする。標的に特異的なVHOの捕獲のために、非特異的に結合したVHO pIXファージは洗い流される。洗浄後にまだ標的に結合しているVHO-ファージは、酸を使用するか、又は直接感染のための細菌細胞を単に適用するかのいずれかによって捕獲される。例えば、VHO候補を担持する感染細菌は、通常4時間以内の培養により拡大される。拡大した培養物が最適な細胞密度(例えば、OD600nm=0.6～0.8)になった時点で、プラーク形成単位(pfu)の量が細胞数の少なくとも10×大きい状態に達するように、ヘルパーファージがその培養物に添加される。ヘルパーファージが感染した細菌細胞は、そのファージに融合された、選択されたVHO候補の発現のために誘導され、そして、その培養物は一晩インキュベートされる。このステージはファージ増幅と呼ばれ、そしてそれは、当業者によって知られているバイオパニングの各ラウンド後に実施され得る。例えば、VHO候補を担持する細菌細胞培養物は、8～16時間インキュベートされ得る。
本明細書に開示されるVHOファージライブラリは、以下の例示的な実施形態で例示されるように、標的に対するパンニング(又はバイオパニング)方法を使用してスクリーニングできる。標的は、タンパク質、細胞、組織、又はその組み合わせであり得る。例えば、VHO pIXファージディスプレイライブラリは、スクリーニングのための標的に追加される。これは、ファージライブラリのVHO部分と標的との間に結合が起こることを可能にする。標的に特異的なVHOの捕獲のために、非特異的に結合したVHO pIXファージは洗い流される。洗浄後にまだ標的に結合しているVHO-ファージは、酸を使用するか、又は直接感染のための細菌細胞を単に適用するかのいずれかによって捕獲される。例えば、VHO候補を担持する感染細菌は、通常4時間以内の培養により拡大される。拡大した培養物が最適な細胞密度(例えば、OD600nm=0.6～0.8)になった時点で、プラーク形成単位(pfu)の量が細胞数の少なくとも10×大きい状態に達するように、ヘルパーファージがその培養物に添加される。ヘルパーファージが感染した細菌細胞は、そのファージに融合された、選択されたVHO候補の発現のために誘導され、そして、その培養物は一晩インキュベートされる。このステージはファージ増幅と呼ばれ、そしてそれは、当業者によって知られているバイオパニングの各ラウンド後に実施され得る。例えば、VHO候補を担持する細菌細胞培養物は、8～16時間インキュベートされ得る。
バイオパニングのステップは、少なくとも3回、4回、又は5回などの複数回にわたり反復される。バイオパニングが機能しているかどうかに関する有効性は、培養物が抗生物質の淘汰圧下にあるので、バイオパニングの各ラウンド間にその培養物がどの程度増殖したか測定される。バイオパニングの最終ラウンドからの培養物は、そのバイオパニングプロセスからの選択されたVHO候補をコードするファージミドDNA配列、例えば、バイオパニングプロセス後に標的に結合することができるそれらのVHO候補、を捕獲するのに使用される。捕獲されたファージミドDNA配列は、それぞれのVHO候補を配列決定するために(Dias-Neto, Nunes et al. 2009)、NGSライブラリを作り出すのに使用される(Suckling, McFarlane et al. 2019) (Head, Komori et al. 2014)。それぞれのパンニング群、例えば、所定の標的をスクリーニングするパンニング群(例えば、ヒトTNFに特化するパンニング群、カニクイザルTNFに特化するパンニング群、又はマウスTNFに特化するパンニング群)は、それ自体のNGS増幅産物ライブラリを作り上げる。
例えば、プライマーベースのインデックスNextera-XT(www.illumina.com)は、各配列が選択されるパンニング群からの、斯かる方法によるその後識別に適用される。これらのインデックス付き増幅産物ライブラリを作製するのに必要とされるPCR及びビーズベースの精製ステップは、30ngのパンニング出力DNAと遺伝子特異的配列プライミング部位で0.1μMに希釈した16Sプライマーとを使用した(16S Metagenomic Sequencing Library Preparation, Illumina part # 15044223 Rev B. https:// support.illumina.com/ documents/ documentation/ chemistry_ documentation/ 16s/16s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf)に基づいて作製される。具体的には、フォワードプライマーは62.6℃のTMを有し、及びリバースプライマーは61.3℃のTMを有する。両プライマーは、バイオパニングプロセスからの選択されたVHOのCDR多様性を捕獲するための隣接領域にアニーリングするように設計される。最終的なNGS増幅産物ライブラリ生成物は、重鎖CDR1から重鎖CDR3に至るまでを構成する250～300bp長の概算範囲の領域を含有する。これらの増幅産物ライブラリは、2×300の対をなすMiSeq実行に適用される。20～25百万の配列が、斯かるMiSeq実行から得られる。これらの配列は、特質スコア(Fastq)によって整理され、及びBaseSpaceソフトウェア(Illumina)を利用したバイオパニングインデックスによって分離される。そのデータは、それぞれのバイオパニング群を定義するインデックスに従って分離された、対を成さないFastq形式で送達される。プロセッシングアプリケーションは、本明細書に開示されるように、MiSeq実行毎に、インデックス/バイオパニング群に基づいてさらに推定され得る最大25百万の配列～最小1000～100,000の独特なタンパク質配列を整理する。
選択されたVHO候補の特異性の測定
例示的な実施形態のように、NGSからもたらされる配列の結果は、バイオパニングに使用される標的又はバイオパニングに使用される環境に従って分類される。例えば、使用される標的タンパク質は、3種類の別々の種：ヒト、カニクイザル(cyno)、及びマウス、からのものであり得る。ヒトTNFのECD(細胞外ドメイン)は、それぞれ、cyno及びマウスTNFのECDと97%及び79%の同一性を示す。例えば、それぞれ、ヒト、cyno、及びマウスTNFに対して、それぞれのバイオパニング群から単離されたDNAは、VHO候補配列の特定の回復における助けとなるように、各群に「インデックスが付された」(Head, Komori et al. 2014) (Li, Zhao et al. 2019)NGSライブラリを作製するのに使用される。最初に、数百万の配列が、それぞれのインデックス付きバイオパニング群に加工される。それぞれのバイオパニング群内に、すべての選択されたVHO候補の配列分布が存在する。選択されたVHO候補のDNA配列がペプチド配列に加工された後に、VHO候補の特定のパンニングのための固有の配列が決定される。例えば、バイオパニング群内でしか見られない配列や2以上のバイオパニング群で見られる配列などの特異性が、更なる評価のために選ばれる。更なる評価のための、3つのバイオパニング群、すなわち、ヒト、cyno、及びマウスTNF、からの候補配列のリストは、それぞれ、図6に示されている。
例示的な実施形態のように、NGSからもたらされる配列の結果は、バイオパニングに使用される標的又はバイオパニングに使用される環境に従って分類される。例えば、使用される標的タンパク質は、3種類の別々の種：ヒト、カニクイザル(cyno)、及びマウス、からのものであり得る。ヒトTNFのECD(細胞外ドメイン)は、それぞれ、cyno及びマウスTNFのECDと97%及び79%の同一性を示す。例えば、それぞれ、ヒト、cyno、及びマウスTNFに対して、それぞれのバイオパニング群から単離されたDNAは、VHO候補配列の特定の回復における助けとなるように、各群に「インデックスが付された」(Head, Komori et al. 2014) (Li, Zhao et al. 2019)NGSライブラリを作製するのに使用される。最初に、数百万の配列が、それぞれのインデックス付きバイオパニング群に加工される。それぞれのバイオパニング群内に、すべての選択されたVHO候補の配列分布が存在する。選択されたVHO候補のDNA配列がペプチド配列に加工された後に、VHO候補の特定のパンニングのための固有の配列が決定される。例えば、バイオパニング群内でしか見られない配列や2以上のバイオパニング群で見られる配列などの特異性が、更なる評価のために選ばれる。更なる評価のための、3つのバイオパニング群、すなわち、ヒト、cyno、及びマウスTNF、からの候補配列のリストは、それぞれ、図6に示されている。
NGS処理から決定されたVHO候補は、クローンの可溶性VHO発現、又はファージ上に提示される、のいずれかのために選ばれて、バイオパニングプロセスで使用される同じそれぞれの標的に対する結合特異性について評価される。例えば、(例えば、HIS又はFcなどのタグを有する)特定の発現VHO候補は、バイオレイヤー干渉(BLI)動態アッセイにおける検体として適用される。図7は、2つの別個の種(ヒト及びマウスFCRNタンパク質)と2つの異なるpH選択性(pH6及びpH7)に対するBLI実験(GatorBio)における、1セットのVHO-Fc融合体(それぞれ、配列番号7、8、及び9に規定されるVHO配列を含むVHO3-Fc、VHO4-Fc及びVHO5-Fc)の結合活性を示す。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVSVISGDGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWKGAGRGPGALGGLDVWGQGTLVTVSS (配列番号7)。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMSWVRQAPGKGLEWVSAIWSDGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARRTWGHQFDYWGQGTLVTVSS (配列番号8)。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMHWVRQAPGKGLEWVSVINYSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAMGTPGELPLDYWGQGTLVTVSS (配列番号9)。
バイオパニング、NGS、及び結合アッセイの結果は、VHO(例えば、完全なヒトVHO)が標的に結合するか否かを示す。VHOは、多様なライブラリ設定及びクローンファージステージの両方においてpIXファージ上に提示され得る。図7に関連する実施例では、VHOファージディスプレイが、標的に対する交差反応性VHO候補を作製するのに使用できることを実証する。パンニング及びNGS分析法は、多くのVHO候補配列を同定できる。2つ以上のVHO候補が、バイオパニングとNGS分析との間の相関関係を示し、さらに、BLIにおける結合結果の特異性を有する。図7のデータはさらに、VHOの多様な結合活性を示す。例えば、BLI実行のステップ3及び4における異なるカーブは、標的の2種類のオルソログの使用と使用した2種類のpH値による多様な結合活性を示唆する。
図8は、IgGなどの他のタンパク質と比較して、VHOがどれほど良好に動作できるか(例えば、軽度の凝集)を示す。例えば、VHO-Fc融合タンパク質の217個の一過性発現された候補が完成した後、VHO-Fc融合体を伴った凝集は観察されなかった。217個の候補について、VHO-Fc二量体として発現された88%は、非還元SDS-PAGEによる配列決定に基づいて予測されたMWに対応したバンドを有した(図8Bに例示された実施例を参照のこと)。図8Aは、ヒトIgG1分子と比較した、2つの異なるVHO-Fc分子(「VHO1-Fc」及び「VHO2-Fc」と規定される)のサイズ排除クロマトグラフィーの結果に関する例を示す。図8Aのサイズ排除クロマトグラフィークロマトグラムは、本明細書に開示したVHO-Fcタンパク質の典型である。図8Aのクロマトグラムにおける単一ピークプロファイルは、最小限の凝集又はクリッピングしかない正しい分子量を有するVHOタンパク質の存在を示唆する。
図8Aで特徴づけされる「VHO1-Fc」及び「VHO2-Fc」は、それぞれ、以下のVHO配列を含む。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVSGISYSGSSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPRWAVPGRGHPRFDYWGQGTLVTVSS (配列番号10)。
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSFDYWGQGTLVTVSS (配列番号11)。
実施例1
ライブラリ構築
VHO遺伝子なしでpIX、HIS、及びHAタグを含有する初期カセットを、NcoI及びNotI制限酵素部位を使用することによってpTAVOにクローン化した。図5(B)は、NcoI及びNotI制限酵素部位を有するpTAVOを例示する。CROによって合成したDNA断片としてのCDR1及びCDR2の多様性を、pTAVOにクローン化し、そしてそれは、既に、適切な消化パラメータに従ってPstI及びNcoIなどの制限酵素を使用することによって、pIX、HIS、及びHAタグを含有する。CDR1及びCDR2の多様性、並びにpIX、HIS、及びHAタグを既に含有しているpTAVOを、増幅し、次に、部分的なライブラリ含有ベクターとして使用して、PstIやXhoIなどの制限酵素を使用してより多様なCDR3領域ライブラリを挿入した。T4リガーゼを、供給業者からの推奨法に従った、ベクター及びDNA断片のゲル抽出後のすべてのクローニングステップで使用した。消化CDR1及びCDR2又はCDR3断片、並びに消化pTAVO又は部分的ライブラリpTAVOベクターの量は、それぞれ、少なくとも2：1のモル比であるが、この比だけに限定されるものではない、T4リガーゼ反応セットに配置される。連結ライブラリ、例えば、CDR1、CDR2、及びCDR3の多様性、並びにpIX、HIS、及びHAタグを含有するpTAVOを、例えば、グリコーゲン及びブタノール沈殿によって、DNA損失を回避する方法で洗浄した。500～1000ngのDNAの連結ライブラリを、アリコート毎に10８細胞にてそれぞれ設定された、5～10のアリコートのコンピテントMC1061F’E.コリに混合した。DNA/細胞混合物は、最も高い形質転換効率のために最適化したパラメータに従ったエレクトロポレーションを受けた。形質転換細胞を、抗生物質抵抗性から回復させ、対数期まで増殖させ、次に、M13ヘルパーファージを感染させた。連結ライブラリによる感染細胞を、最適なファージ及びVHOタンパク質発現条件下で16～18時間にわたり培養した。VHOライブラリファージを、沈殿させ、10倍濃縮し、その後のバイオパニングにおける使用のために－80℃にて保存した。すべての細菌/ファージライブラリ条件に使用される培養培地は、2xYTであった。グルコースを、Lacレプレッサを使用したファージ増幅前のVHO発現を抑制するために使用した。VHO及びファージ発現を、グルコースなしにLacプロモーターを用いて1mMのIPTGによって誘導した。
ライブラリ構築
VHO遺伝子なしでpIX、HIS、及びHAタグを含有する初期カセットを、NcoI及びNotI制限酵素部位を使用することによってpTAVOにクローン化した。図5(B)は、NcoI及びNotI制限酵素部位を有するpTAVOを例示する。CROによって合成したDNA断片としてのCDR1及びCDR2の多様性を、pTAVOにクローン化し、そしてそれは、既に、適切な消化パラメータに従ってPstI及びNcoIなどの制限酵素を使用することによって、pIX、HIS、及びHAタグを含有する。CDR1及びCDR2の多様性、並びにpIX、HIS、及びHAタグを既に含有しているpTAVOを、増幅し、次に、部分的なライブラリ含有ベクターとして使用して、PstIやXhoIなどの制限酵素を使用してより多様なCDR3領域ライブラリを挿入した。T4リガーゼを、供給業者からの推奨法に従った、ベクター及びDNA断片のゲル抽出後のすべてのクローニングステップで使用した。消化CDR1及びCDR2又はCDR3断片、並びに消化pTAVO又は部分的ライブラリpTAVOベクターの量は、それぞれ、少なくとも2：1のモル比であるが、この比だけに限定されるものではない、T4リガーゼ反応セットに配置される。連結ライブラリ、例えば、CDR1、CDR2、及びCDR3の多様性、並びにpIX、HIS、及びHAタグを含有するpTAVOを、例えば、グリコーゲン及びブタノール沈殿によって、DNA損失を回避する方法で洗浄した。500～1000ngのDNAの連結ライブラリを、アリコート毎に10８細胞にてそれぞれ設定された、5～10のアリコートのコンピテントMC1061F’E.コリに混合した。DNA/細胞混合物は、最も高い形質転換効率のために最適化したパラメータに従ったエレクトロポレーションを受けた。形質転換細胞を、抗生物質抵抗性から回復させ、対数期まで増殖させ、次に、M13ヘルパーファージを感染させた。連結ライブラリによる感染細胞を、最適なファージ及びVHOタンパク質発現条件下で16～18時間にわたり培養した。VHOライブラリファージを、沈殿させ、10倍濃縮し、その後のバイオパニングにおける使用のために－80℃にて保存した。すべての細菌/ファージライブラリ条件に使用される培養培地は、2xYTであった。グルコースを、Lacレプレッサを使用したファージ増幅前のVHO発現を抑制するために使用した。VHO及びファージ発現を、グルコースなしにLacプロモーターを用いて1mMのIPTGによって誘導した。
実施例2
ファージバイオパニング
ファージライブラリ及びストレプトアビジン(SA)結合磁性ビーズ(Life Technologies、M280ストレプトアビジン二価鉄ベースビーズ)を、ビオチン化標的抗原、例えば、ヒト、マウス、又はカニクイザルTNFオルソログ、を事前添加した。磁気分離機を、バイオパニング実験の特定のステップ中に溶液とビーズを効果的に分離するのに使用した、例えば、ビーズ上の特異的結合ファージから非特異的結合ファージを取り除くために、洗浄ステップ中にチューブを磁気分離機内に置いた。標的結合SAビーズを、ミルク又はChemiblockerなどの剤を用いてブロッキングして、VHOファージライブラリによる非特異的結合を削減した。非特異的(例えば、標的添加ビーズに結合していない)VHOファージを、PBSなどのバッファーで洗浄することによって取り除いた。対数期のMC1061F’E.コリ細胞を、バイオパニングの最終ラウンド中に標的添加ビーズに結合することができる、好ましいバイオパニング特徴を保有するファージを捕獲する(感染させる)のに使用した。捕獲したVHOファージの増幅とその後のバイオパニングのラウンド後に、感染により対数期MC1061F’によって捕獲された最終ラウンドの標的特異的VHOファージを、発現の抑制条件下で一晩培養した。バイオパニング出力のこの最終培養物におけるDNA調製を、供給業者のプロトコールに従って実施した。
ファージバイオパニング
ファージライブラリ及びストレプトアビジン(SA)結合磁性ビーズ(Life Technologies、M280ストレプトアビジン二価鉄ベースビーズ)を、ビオチン化標的抗原、例えば、ヒト、マウス、又はカニクイザルTNFオルソログ、を事前添加した。磁気分離機を、バイオパニング実験の特定のステップ中に溶液とビーズを効果的に分離するのに使用した、例えば、ビーズ上の特異的結合ファージから非特異的結合ファージを取り除くために、洗浄ステップ中にチューブを磁気分離機内に置いた。標的結合SAビーズを、ミルク又はChemiblockerなどの剤を用いてブロッキングして、VHOファージライブラリによる非特異的結合を削減した。非特異的(例えば、標的添加ビーズに結合していない)VHOファージを、PBSなどのバッファーで洗浄することによって取り除いた。対数期のMC1061F’E.コリ細胞を、バイオパニングの最終ラウンド中に標的添加ビーズに結合することができる、好ましいバイオパニング特徴を保有するファージを捕獲する(感染させる)のに使用した。捕獲したVHOファージの増幅とその後のバイオパニングのラウンド後に、感染により対数期MC1061F’によって捕獲された最終ラウンドの標的特異的VHOファージを、発現の抑制条件下で一晩培養した。バイオパニング出力のこの最終培養物におけるDNA調製を、供給業者のプロトコールに従って実施した。
実施例3
バイオパニングしたVHO候補のNGS分析
16S Metagenomic Sequencing Library Preparation、Illumina部分#15044223Rev B.参照文献(https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_ documentation/16s/16 s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf)に概説されたプロトコールに基づいて、以下の方法を、特異的NGS増幅産物ライブラリの遺伝子を作製するのに使用した。最終ラウンドのバイオパニング出力DNAを、Illuminaオーバーハングアダプター配列を包含する遺伝子特異的フォワード及びリバースプライマーを使用して増幅した。PCRを使用して、KAPA HiFi Hot Startポリメラーゼを使用した25サイクルの増幅を実施し、そして、AMPure XPビーズベースのPCRクリーンアップを、先に参照したプロトコールに従ってPCR反応で実施した。精製PCR反応物からのDNAを、KAPA HiFi Hot StartポリメラーゼとAMPure XPビーズベースPCRクリーンアップを使用する8サイクルの増幅を伴う第二のPCR(インデックスPCR)に使用した。次に、サンプルを、正規化し、変性させ、変性PhiX対照と混合し、そして、単回MiSeq実行(Ravi RK, Walton K, Khosroheidari M. 2018)に添加して、VHO候補の配列を決定した。
バイオパニングしたVHO候補のNGS分析
16S Metagenomic Sequencing Library Preparation、Illumina部分#15044223Rev B.参照文献(https://support.illumina.com/documents/documentation/chemistry_ documentation/16s/16 s-metagenomic-library-prep-guide-15044223-b.pdf)に概説されたプロトコールに基づいて、以下の方法を、特異的NGS増幅産物ライブラリの遺伝子を作製するのに使用した。最終ラウンドのバイオパニング出力DNAを、Illuminaオーバーハングアダプター配列を包含する遺伝子特異的フォワード及びリバースプライマーを使用して増幅した。PCRを使用して、KAPA HiFi Hot Startポリメラーゼを使用した25サイクルの増幅を実施し、そして、AMPure XPビーズベースのPCRクリーンアップを、先に参照したプロトコールに従ってPCR反応で実施した。精製PCR反応物からのDNAを、KAPA HiFi Hot StartポリメラーゼとAMPure XPビーズベースPCRクリーンアップを使用する8サイクルの増幅を伴う第二のPCR(インデックスPCR)に使用した。次に、サンプルを、正規化し、変性させ、変性PhiX対照と混合し、そして、単回MiSeq実行(Ravi RK, Walton K, Khosroheidari M. 2018)に添加して、VHO候補の配列を決定した。
実施例4
VHOタンパク質の製造
バイオパニング及びNGSから確立したVHO配列を、合成し、そして、Fc融合体として哺乳動物発現ベクター内にクローン化した(Lo et al, 1998)。それぞれのVHO-Fc構築物を、HEK293 Expi細胞(Invitrogen)で一過性に発現させた。5日間の培養からの使用済み培地を、プロテインA又はプロテインG方法論を使用して加工して、VHO-Fcタンパク質を精製した(Fishman and Berg, 2019)。
VHOタンパク質の製造
バイオパニング及びNGSから確立したVHO配列を、合成し、そして、Fc融合体として哺乳動物発現ベクター内にクローン化した(Lo et al, 1998)。それぞれのVHO-Fc構築物を、HEK293 Expi細胞(Invitrogen)で一過性に発現させた。5日間の培養からの使用済み培地を、プロテインA又はプロテインG方法論を使用して加工して、VHO-Fcタンパク質を精製した(Fishman and Berg, 2019)。
実施例5
VHOタンパク質の分析
VHO-Fcタンパク質を、収率、純度、及び生物学的活性について評価した。収率を、分光光度計を使用した280nmの吸収度によって測定した。純度をSDS-PAGEによって評価し、及び単分散性を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して確認した。生物学的活性を、標的タンパク質への、又はその表面に斯かる標的を有する細胞への結合によって計測した。タンパク質標的への結合を、ELISA、バイオレイヤー干渉法、又はタンパク質‐タンパク質相互作用に関する任意の同等な技術のいずれかによっておこなった。結合活性はまた、フローサイトメトリーを介して細胞においても計測した。
VHOタンパク質の分析
VHO-Fcタンパク質を、収率、純度、及び生物学的活性について評価した。収率を、分光光度計を使用した280nmの吸収度によって測定した。純度をSDS-PAGEによって評価し、及び単分散性を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して確認した。生物学的活性を、標的タンパク質への、又はその表面に斯かる標的を有する細胞への結合によって計測した。タンパク質標的への結合を、ELISA、バイオレイヤー干渉法、又はタンパク質‐タンパク質相互作用に関する任意の同等な技術のいずれかによっておこなった。結合活性はまた、フローサイトメトリーを介して細胞においても計測した。
実施例6
エピトープのスクリーニング
抗体のごく一部、可変重鎖領域、を使用したライブラリを設計した。このごく一部は、より多くのエピトープが所定の標的において網羅されることを可能にする。より多くのパラトープを捕獲する能力を増強するためのCDRの多様性に関するさまざまな設計を取り込むために、VHOをモジュール化する。バイオパニングの多様な方法はまた、より多くのエピトープとパラトープの作出も改善する。下流活性評価のための可溶性タンパク質として発現するためにVHOを選択したNGS及び配列分析は、優先順位を決めるのに役立つ。
エピトープのスクリーニング
抗体のごく一部、可変重鎖領域、を使用したライブラリを設計した。このごく一部は、より多くのエピトープが所定の標的において網羅されることを可能にする。より多くのパラトープを捕獲する能力を増強するためのCDRの多様性に関するさまざまな設計を取り込むために、VHOをモジュール化する。バイオパニングの多様な方法はまた、より多くのエピトープとパラトープの作出も改善する。下流活性評価のための可溶性タンパク質として発現するためにVHOを選択したNGS及び配列分析は、優先順位を決めるのに役立つ。
図9は、スクリーニングした又は特徴づけした候補あたりのエピトープのパーセンテージが、sdAb、Nb、及びVHHについての従来のパンニングと比較して、本開示によるVHOに関してより高いことを示す。Ablynx N.V.の研究者は、単一標的に対してファージディスプレイの取り組みをおこない、96の候補から3～4つのエピトープを得ることができた(doi:10.3389/fimmu.2017.00420)。よって、Ablynx試験は、0.04又は4%(4つのエピトープ/96の候補)の成功標的化効率をもたらした(doi:10.3389/fimmu.2017.00420)。別の群は、5種類の標的に対してファージディスプレイを免疫し、そして、160～182の候補の範囲から3～6つのエピトープの範囲を得た。それらの成功標的化効率は、0.03又は3%(867の候補から30個のエピトープ)(DOI:10.7554/eLife.48750.009)であった。
VHO(完全合成及び完全ヒト)ファージディスプレイライブラリを、5つの異なる標的をパンニングするのに使用した。190のVHO候補に対して合計31個のエピトープを得、そして、図9に示すように、0.16又は16%(190の候補から31個のエピトープ)の成功標的化効率を得た。よって、本開示によるVHOライブラリは、5%未満の成功標的化効率を達成する当該技術分野のものより高い成功標的化効率を有した。
VHO分子を、VHO単独タンパク質として及びFc融合タンパク質として哺乳動物細胞で発現させた。いずれの形式でも、成功標的化VHOヒット分子はまた、より良好な発現性質、図8に示した単分散プロファイル、及び図7に示した結合活性も有した。
更なる典型的な実施形態を、以下に例示する。
1.
VHO(可変重鎖のみ)ドメインをコードするポリヌクレオチドのVHOライブラリであって、ここで、該VHOドメインが、ヒトVhファミリーのVhドメインと配列相同性及び/又はカノニカル相同性を有するVHOライブラリ。
1.
VHO(可変重鎖のみ)ドメインをコードするポリヌクレオチドのVHOライブラリであって、ここで、該VHOドメインが、ヒトVhファミリーのVhドメインと配列相同性及び/又はカノニカル相同性を有するVHOライブラリ。
2.
前記ヒトVhファミリーが、ヒトVh3ファミリーである、実施形態1に記載のVHOライブラリ。
前記ヒトVhファミリーが、ヒトVh3ファミリーである、実施形態1に記載のVHOライブラリ。
3.
前記配列相同性が、少なくとも75%である、実施形態1～2のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記配列相同性が、少なくとも75%である、実施形態1～2のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
4.
前記VHOドメインが、VHOドメイン全領域を通じて残基多様性を有する、実施形態1～3のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインが、VHOドメイン全領域を通じて残基多様性を有する、実施形態1～3のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
5.
前記VHOドメインが、1若しくは複数のCDR領域内において残基多様性を有する、実施形態1～4のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインが、1若しくは複数のCDR領域内において残基多様性を有する、実施形態1～4のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
6.
前記VHOドメインが、以下の配列番号5：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (配列番号5)
｛ここで、位置Xは、20種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちのいずれか1つを表す｝を含む、実施形態1～5のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインが、以下の配列番号5：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (配列番号5)
｛ここで、位置Xは、20種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちのいずれか1つを表す｝を含む、実施形態1～5のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
7.
前記VHOドメインが、以下の配列番号6：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (配列番号6)
｛ここで、位置Xは、20種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちのいずれか1つを表す｝を含む、実施形態1～5のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインが、以下の配列番号6：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (配列番号6)
｛ここで、位置Xは、20種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちのいずれか1つを表す｝を含む、実施形態1～5のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
8.
位置Xが、CDR1でのC、CDR2でのC及びM、並びにCDR3でのC、M、及びNを除き、20種類の天然に存在するアミノ酸すべての同等な分布で置換されている、実施形態6及び7のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
位置Xが、CDR1でのC、CDR2でのC及びM、並びにCDR3でのC、M、及びNを除き、20種類の天然に存在するアミノ酸すべての同等な分布で置換されている、実施形態6及び7のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
9.
前記VHOドメインが、1若しくは複数のフレームワーク領域において残基多様性を有する、実施形態1～8のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインが、1若しくは複数のフレームワーク領域において残基多様性を有する、実施形態1～8のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
10.
1若しくは複数のフレームワーク領域が、1若しくは複数の突然変異を有し、前記1若しくは複数の突然変異が、タンパク質発現、タンパク質折り畳み、タンパク質精製、結合親和性、下流標的シグナル伝達、及び/又はシグナル伝達の阻害のレベルにおける改善を提供する、実施形態1～9のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
1若しくは複数のフレームワーク領域が、1若しくは複数の突然変異を有し、前記1若しくは複数の突然変異が、タンパク質発現、タンパク質折り畳み、タンパク質精製、結合親和性、下流標的シグナル伝達、及び/又はシグナル伝達の阻害のレベルにおける改善を提供する、実施形態1～9のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
11.
前記VHOドメインが、1若しくは複数のフレームワーク領域と1若しくは複数のCDR領域において残基多様性を有する、実施形態1～10のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインが、1若しくは複数のフレームワーク領域と1若しくは複数のCDR領域において残基多様性を有する、実施形態1～10のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
12.
前記VHOドメインが、CDR3領域において長さ多様性を有する、実施形態1～11のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインが、CDR3領域において長さ多様性を有する、実施形態1～11のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
13.
前記CDR3領域の長さ多様性が、6～30コドンの範囲に及ぶ、実施形態1～11のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記CDR3領域の長さ多様性が、6～30コドンの範囲に及ぶ、実施形態1～11のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
14.
前記VHOドメインをコードするポリヌクレオチドが、ベクター内に挿入されている、実施形態1～13のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記VHOドメインをコードするポリヌクレオチドが、ベクター内に挿入されている、実施形態1～13のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
15.
前記ベクターが、ファージミドである、実施形態14のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、ファージミドである、実施形態14のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
16.
前記ベクターが、プラスミドである、実施形態14のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、プラスミドである、実施形態14のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
17.
前記ベクターが、細菌ファージのコートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態14～15のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、細菌ファージのコートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態14～15のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
18.
前記細菌ファージが、M13バクテリオファージである、実施形態17に記載のVHOライブラリ。
前記細菌ファージが、M13バクテリオファージである、実施形態17に記載のVHOライブラリ。
19.
前記コートタンパク質が、pVII又はpIXコートタンパク質である、実施形態17～18のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記コートタンパク質が、pVII又はpIXコートタンパク質である、実施形態17～18のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
20.
前記ベクターが、1若しくは複数のタグを含む、実施形態14～19のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、1若しくは複数のタグを含む、実施形態14～19のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
21.
前記1若しくは複数のタグが、ポリヒスチジン(HIS)及びヘマグルチニン(HA)タグから選択される、実施形態20に記載のVHOライブラリ。
前記1若しくは複数のタグが、ポリヒスチジン(HIS)及びヘマグルチニン(HA)タグから選択される、実施形態20に記載のVHOライブラリ。
22.
前記ベクターが、VHOと1若しくは複数のタグとの間のリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態21に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、VHOと1若しくは複数のタグとの間のリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態21に記載のVHOライブラリ。
23.
前記ベクターが、VHOとコートタンパク質との間のリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態21に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、VHOとコートタンパク質との間のリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、実施形態21に記載のVHOライブラリ。
24.
前記リンカーペプチドが、GGGGS(配列番号17)である、実施形態22～23のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記リンカーペプチドが、GGGGS(配列番号17)である、実施形態22～23のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
25.
前記ベクターが、VHOドメインがバクテリオファージ上に提示される様式で配置されている要素を含む、実施形態14～15及び17～24のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、VHOドメインがバクテリオファージ上に提示される様式で配置されている要素を含む、実施形態14～15及び17～24のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
26.
前記ベクターが、VHOドメインが発現される様式で配置されている要素を含む、実施形態14～25のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、VHOドメインが発現される様式で配置されている要素を含む、実施形態14～25のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
27.
前記ベクターが、VHOドメインが細菌ファージなしで発現される様式で配置されている要素を含む、実施形態14、16、20～22、24、及び26のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、VHOドメインが細菌ファージなしで発現される様式で配置されている要素を含む、実施形態14、16、20～22、24、及び26のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
28.
前記ベクターが、DNA複製のためのOri部位、ファージ複製のためのOri部位、翻訳されたタンパク質の分泌を駆動するためのリーダー配列、タンパク質発現を駆動するためのプロモーター、及びタンパク質発現のレベルを制御するためのリプレッサーを有する、実施形態14～27のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
前記ベクターが、DNA複製のためのOri部位、ファージ複製のためのOri部位、翻訳されたタンパク質の分泌を駆動するためのリーダー配列、タンパク質発現を駆動するためのプロモーター、及びタンパク質発現のレベルを制御するためのリプレッサーを有する、実施形態14～27のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
29.
前記ベクターが、VHOドメインのうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態14～28のいずれか一項に記載のベクター。
前記ベクターが、VHOドメインのうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドを含む、実施形態14～28のいずれか一項に記載のベクター。
30.
実施形態1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリによってコードされるVHOドメインを提示するファージライブラリ。
実施形態1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリによってコードされるVHOドメインを提示するファージライブラリ。
31.
前記VHOドメインが、原核又は真核細胞によって産生されたウイルス粒子上に提示されるか、原核及び/又は真核宿主細胞に感染するウイルス上に提示されるか、或いは原核又は真核細胞上に提示される、実施形態30に記載のファージライブラリ。
前記VHOドメインが、原核又は真核細胞によって産生されたウイルス粒子上に提示されるか、原核及び/又は真核宿主細胞に感染するウイルス上に提示されるか、或いは原核又は真核細胞上に提示される、実施形態30に記載のファージライブラリ。
32.
実施形態1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリを調製する方法であって、以下：
実施形態1～13のいずれか一項に記載のVHOドメインをコードするポリヌクレオチド配列を準備し；そして、
実施形態14～29のいずれか一項に記載のベクター内に該ポリヌクレオチド配列を挿入すること、
を含む、方法。
実施形態1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリを調製する方法であって、以下：
実施形態1～13のいずれか一項に記載のVHOドメインをコードするポリヌクレオチド配列を準備し；そして、
実施形態14～29のいずれか一項に記載のベクター内に該ポリヌクレオチド配列を挿入すること、
を含む、方法。
33.
実施形態30～31のいずれか一項に記載のファージライブラリを調製する方法であって、以下：
実施形態1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリを用いて細菌細胞培養物を形質転換し、
該細菌細胞培養物を対数期まで増殖させ、該細菌細胞培養物にヘルパーファージを感染させ、そして
該細菌細胞培養物を増幅させること、
を含む、方法。
実施形態30～31のいずれか一項に記載のファージライブラリを調製する方法であって、以下：
実施形態1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリを用いて細菌細胞培養物を形質転換し、
該細菌細胞培養物を対数期まで増殖させ、該細菌細胞培養物にヘルパーファージを感染させ、そして
該細菌細胞培養物を増幅させること、
を含む、方法。
34.
標的を結合することができる目的のVHOドメインを同定する方法であって、以下：
実施形態32に従ってVHOライブラリを作製し、実施形態33に従ってファージライブラリを作製し、そして標的に対するバイオパニングを使用して該ファージライブラリをスクリーニングして、目的のVHOを同定すること、を含む方法。
標的を結合することができる目的のVHOドメインを同定する方法であって、以下：
実施形態32に従ってVHOライブラリを作製し、実施形態33に従ってファージライブラリを作製し、そして標的に対するバイオパニングを使用して該ファージライブラリをスクリーニングして、目的のVHOを同定すること、を含む方法。
35.
前記バイオパニングステップが、複数回実施される、実施形態34に記載の方法。
前記バイオパニングステップが、複数回実施される、実施形態34に記載の方法。
36.
NGSによって目的のVHOの配列決定することをさらに含む、実施形態34～35のいずれか一項に記載の方法。
NGSによって目的のVHOの配列決定することをさらに含む、実施形態34～35のいずれか一項に記載の方法。
37.
標的に対する目的のVHOの結合親和性を評価することをさらに含む、実施形態34～36のいずれか一項に記載の方法。
標的に対する目的のVHOの結合親和性を評価することをさらに含む、実施形態34～36のいずれか一項に記載の方法。
38.
前記結合親和性が、ELISAを使用して評価される、実施形態37に記載の方法。
前記結合親和性が、ELISAを使用して評価される、実施形態37に記載の方法。
39.
実施形態34～38のいずれか一項に記載の方法によって同定される目的のVHO。
実施形態34～38のいずれか一項に記載の方法によって同定される目的のVHO。
40.
前記VHOが、免疫グロブリン、受容体、細胞表面タンパク質、及びその断片から選択されるタンパク質に融合される、実施形態39に記載のVHOを含むポリペプチド。
前記VHOが、免疫グロブリン、受容体、細胞表面タンパク質、及びその断片から選択されるタンパク質に融合される、実施形態39に記載のVHOを含むポリペプチド。
41.
実施形態39に記載のVHO又は実施形態40に記載のポリペプチドを含む組成物。
実施形態39に記載のVHO又は実施形態40に記載のポリペプチドを含む組成物。
42.
実施形態39に記載の目的のVHO又は実施形態40に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
実施形態39に記載の目的のVHO又は実施形態40に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
43.
実施形態39に記載の目的のVHOに対して50%超の同一性を有するポリペプチド。
実施形態39に記載の目的のVHOに対して50%超の同一性を有するポリペプチド。
44.
実施形態39に記載の目的のVHOに対して50%超の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
実施形態39に記載の目的のVHOに対して50%超の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
45.
実施形態42又は44のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
実施形態42又は44のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
46.
実施形態29に記載のベクターを含む細胞。
実施形態29に記載のベクターを含む細胞。
47.
実施形態45に記載のベクターを含む細胞。
実施形態45に記載のベクターを含む細胞。
48.
前記VHOが、任意のタグ、例えば、任意の種の免疫グロブリンファミリーのFcドメイン、ポリヒスチジンタグ、及びFLAGタグ、に遺伝的に融合される、実施形態39に記載のVHOを含むポリペプチド。
前記VHOが、任意のタグ、例えば、任意の種の免疫グロブリンファミリーのFcドメイン、ポリヒスチジンタグ、及びFLAGタグ、に遺伝的に融合される、実施形態39に記載のVHOを含むポリペプチド。
49.
前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞において発現される、実施形態39に記載のVHOを含むポリペプチド。
前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞において発現される、実施形態39に記載のVHOを含むポリペプチド。
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1. US 8,105,592 B2 HEAVY CHAIN AND SINGLE DOMAIN ANTIBODIES
2. CA 2380443 C 2013/03/12 SINGLE DOMAIN ANTIGEN BINDING ANTIBODY FRAGMENTS DERIVED FROM LLAMA ANTIBODIES
3. US 2020/0031952 A1 HIGH AFFINITY AND AGGREGATIVELY STABLE ANTIBODIES ON THE BASIS OF VARIABLE DOMAINS VL AND A DERIVATIVE VHH
4. WO2016072938A1 STABILIZED AND AUTONOMOUS ANTIBODY Vh DOMAIN
5. US 9,062,305 B2 GENERATION OF HUMAN DE NOVO PIX DISPLAY LIBRARIES
6. US20050226863A1
7. EP2139918A2
8. EP2139918B1
9. AU2011200930A1
10. AU2011200930B2
5. US 9,062,305 B2 GENERATION OF HUMAN DE NOVO PIX DISPLAY LIBRARIES
6. US20050226863A1
7. EP2139918A2
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9. AU2011200930A1
10. AU2011200930B2
Claims (45)
- VHO(variable heavy only（可変重鎖のみ）)ドメインをコードするポリヌクレオチドのVHOライブラリであって、ここで、該VHOドメインが、ヒトVhファミリーのVhドメインと配列相同性及び/又はカノニカル相同性（canonical homology）を有するVHOライブラリ。
- 前記ヒトVhファミリーが、ヒトVh3ファミリーである、請求項1に記載のVHOライブラリ。
- 前記配列相同性が、少なくとも75%である、請求項1～2のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記VHOドメインが、VHOドメイン全領域を通じて残基多様性を有する、請求項1～3のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記VHOドメインが、1若しくは複数のCDR領域内において残基多様性を有する、請求項1～4のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記VHOドメインが、以下の配列番号5：
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFS(X)WVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (配列番号5)
｛ここで、位置Xは、20種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちのいずれか1つを表す｝を含む、請求項1～5のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。 - 前記VHOドメインが、以下の配列番号6：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(X)NWVRQAPGKGLEWV(X)DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(X)WGQGTLVTVSS (配列番号6)
｛ここで、位置Xは、20種類の天然に存在するアミノ酸残基のうちのいずれか1つを表す｝を含む、請求項1～5のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。 - 位置Xが、CDR1でのC、CDR2でのC及びM、並びにCDR3でのC、M、及びNを除き、20種類の天然に存在するアミノ酸すべての同等な分布で置換されている、請求項6及び7のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記VHOドメインが、1若しくは複数のフレームワーク領域において残基多様性を有する、請求項1～8のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 1若しくは複数のフレームワーク領域が、1若しくは複数の突然変異を有し、前記1若しくは複数の突然変異が、タンパク質発現、タンパク質折り畳み、タンパク質精製、結合親和性、下流標的シグナル伝達、及び/又はシグナル伝達の阻害のレベルにおける改善を提供する、請求項1～9のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記VHOドメインが、1若しくは複数のフレームワーク領域と1若しくは複数のCDR領域において残基多様性を有する、請求項1～10のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記VHOドメインが、CDR3領域において長さ多様性を有する、請求項1～11のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記CDR3領域の長さ多様性が、6～30コドンの範囲に及ぶ、請求項1～11のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記VHOドメインをコードするポリヌクレオチドが、ベクター内に挿入されている、請求項1～13のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、ファージミドである、請求項14のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、プラスミドである、請求項14のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、細菌ファージ（bacterial phage）のコートタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項14～15のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記細菌ファージが、M13バクテリオファージである、請求項17に記載のVHOライブラリ。
- 前記コートタンパク質が、pVII又はpIXコートタンパク質である、請求項17～18のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、1若しくは複数のタグを含む、請求項14～19のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記1若しくは複数のタグが、ポリヒスチジン(HIS)及びヘマグルチニン(HA)タグから選択される、請求項20に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、VHOと1若しくは複数のタグとの間のリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、VHOとコートタンパク質との間のリンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、請求項21に記載のVHOライブラリ。
- 前記リンカーペプチドが、GGGGS(配列番号17)である、請求項22～23のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、VHOドメインがバクテリオファージ上に提示される様式で配置されている要素を含む、請求項14～15及び17～24のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、VHOドメインが発現される様式で配置されている要素を含む、請求項14～25のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、VHOドメインが細菌ファージなしで発現される様式で配置されている要素を含む、請求項14、16、20～22、24、及び26のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、DNA複製のためのOri部位、ファージ複製のためのOri部位、翻訳されたタンパク質の分泌を駆動するためのリーダー配列、タンパク質発現を駆動するためのプロモーター、及びタンパク質発現のレベルを制御するためのリプレッサーを有する、請求項14～27のいずれか一項に記載のVHOライブラリ。
- 前記ベクターが、VHOドメインのうちのいずれか1つをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項14～28のいずれか一項に記載のベクター。
- 請求項1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリによってコードされるVHOドメインを提示するファージライブラリ。
- 前記VHOドメインが、原核又は真核細胞によって産生されたウイルス粒子上に提示されるか、原核及び/又は真核宿主細胞に感染するウイルス上に提示されるか、或いは原核又は真核細胞上に提示される、請求項30に記載のファージライブラリ。
- 請求項1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリを調製する方法であって、以下：
請求項1～13のいずれか一項に記載のVHOドメインをコードするポリヌクレオチド配列を準備し；そして、
請求項14～29のいずれか一項に記載のベクター内に該ポリヌクレオチド配列を挿入すること、
を含む、方法。 - 請求項30～31のいずれか一項に記載のファージライブラリを調製する方法であって、以下：
請求項1～28のいずれか一項に記載のVHOライブラリを用いて細菌細胞培養物を形質転換し、
該細菌細胞培養物を対数期まで増殖させ、該細菌細胞培養物にヘルパーファージを感染させ、そして
該細菌細胞培養物を増幅させること、
を含む、方法。 - 標的を結合することができる目的のVHOドメインを同定する方法であって、以下：請求項32に従ってVHOライブラリを作製し、請求項33に従ってファージライブラリを作製し、そして標的に対するバイオパニングを使用して該ファージライブラリをスクリーニングして、目的のVHOを同定すること、を含む方法。
- 前記バイオパニングステップが、複数回実施される、請求項34に記載の方法。
- NGSによって目的のVHOの配列決定することをさらに含む、請求項34～35のいずれか一項に記載の方法。
- 標的に対する目的のVHOの結合親和性を評価することをさらに含む、請求項34～36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記結合親和性が、ELISAを使用して評価される、請求項37に記載の方法。
- 請求項34～38のいずれか一項に記載の方法によって同定される目的のVHO。
- 請求項39に記載のVHOを含むポリペプチドであって、前記VHOが、免疫グロブリン、受容体、細胞表面タンパク質、及びその断片から選択されるタンパク質に融合されている、ポリペプチド。
- 請求項39に記載のVHO又は請求項40に記載のポリペプチドを含む組成物。
- 請求項39に記載の目的のVHO又は請求項40に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項29に記載のベクターを含む細胞。
- 請求項39に記載のVHOを含むポリペプチドであって、前記VHOが、任意の種の免疫グロブリンファミリーのFcドメイン、ポリヒスチジンタグ、及びFLAGタグから選択されるタグ、に遺伝的に融合されている、ポリペプチド。
- 請求項39に記載のVHOを含むポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、哺乳動物細胞において発現される、ポリペプチド。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US202063120842P | 2020-12-03 | 2020-12-03 | |
| US63/120,842 | 2020-12-03 | ||
| PCT/US2021/061574 WO2022120024A1 (en) | 2020-12-03 | 2021-12-02 | Variable heavy chain only libraries, methods of preparation thereof, and uses thereof |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2023552397A true JP2023552397A (ja) | 2023-12-15 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2023533978A Pending JP2023552397A (ja) | 2020-12-03 | 2021-12-02 | 可変重鎖のみのライブラリ、その調製方法、及びその使用 |
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