JP5797642B2 - 合成ポリペプチドライブラリーおよび天然で多様化されたポリペプチドバリアントを作製するための方法 - Google Patents
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Description
本願は、2009年5月20日に出願された米国仮特許出願61/179,850号、2009年12月17日に出願された米国仮特許出願61/287,336号、2010年3月17日に出願された米国仮特許出願61/314,794号の利益を主張し、これらの米国仮特許出願の各々の内容は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
本発明は、相同ポリペプチドをコードするDNA配列のライブラリーの作製と、そのようなライブラリーの使用とに関する。本発明は、特に、1またはいくつかの相補性決定領域(CDR)が、天然供給源から捕捉された対応するCDRのコレクションにより置き換えられた合成抗体断片のコレクションの作製に関する。本発明は、さらに、免疫した動物に由来するCDRを含有する抗体断片のコレクションの作製と、高い親和性の抗体断片を導くためのよりよい供給源としてのそれらの使用とに関する。本発明は、さらに、元のポリペプチドコード配列を改変する必要なく、合成または天然の起源の多様化された配列を挿入することによる、ポリペプチドの部分の多様化に関する。
抗体は、4つのポリペプチド:2つの重鎖と2つの軽鎖で構成される。抗体の抗原結合部分は、軽鎖可変ドメイン(VL)と重鎖可変ドメイン(VH)とにより形成される。これらのドメインの一方の端部にて、6つのループが抗原結合部位を形成し、相補性決定領域(CDR)ともよばれる。3つのCDRがVHドメイン上に位置し(H1、H2およびH3)、他の3つがVLドメイン上にある(L1、L2およびL3)。B細胞の発生中に、V(D)J組換えとして公知の体細胞組み換えにより、ユニーク免疫グロブリン領域が形成される。免疫グロブリン重鎖または軽鎖の可変領域は、異なる遺伝子セグメントによりコードされる。重鎖は、可変(V)、多様性(D)および連結(J)セグメントとよばれる3つのセグメントによりコードされ、軽鎖の可変は、2つのセグメントVおよびJだけの組換えにより形成される。多数の抗体パラトープを、ゲノム中に存在するV、DおよびJセグメントの複数のコピーの1つ同士の組換えにより作製できる。VセグメントはCDR1およびCDR2をコードし、CDR3は、組換え事象により作製される。免疫応答の経過中に、さらなる多様性が、体細胞超変異(SHM)とよばれるプロセスにより抗原結合部位に導入される。このプロセス中に、点突然変異が、重鎖および軽鎖の可変遺伝子、特にCDRをコードする領域に導入される。このさらなる多様性が、それらの同族抗原への親和性が改良された抗体バリアントを発現するB細胞の選択および拡張を可能にする。
本発明は、安定なフレームワーク選択と、天然にコードされる相補性決定領域(CDR)または抗体のような機能的ポリペプチドの天然の状況において選択されたCDRの役割を充足できるアミノ酸配列の挿入との利点を組み合わせた核酸配列のライブラリーを作製する方法を提供する。この方法は、合成アプローチを用いてはコードするのが非常に困難である長いCDRまたはCDRの役割を充足できるアミノ酸配列の回復を可能にする。本発明は、安定なフレームワークと、正確に折り畳まれたCDRまたはCDRの役割を充足できるアミノ酸配列とを組み合わせることにより、ライブラリー中の機能的抗体の割合を最大限にし、よって、選択プロセスの性能および選択されるクローンの質を最大限にする。本発明は、異なる種からの天然に発現されるCDRを捕捉し、それらをヒト抗体フレームワークに挿入する方法を提供する。このことにより、ヒトレパートリーと比較した場合に、長さおよび組成が著しく異なるCDR H3レパートリーの使用が可能になる。本発明は、その他の種に由来する構造レパートリーと、よって異なる構造空間を標本抽出する能力を特徴とするヒト抗体断片の作製を可能にする。本方法は、合成起源のCDRまたはCDRの役割を充足できるアミノ酸配列を、代替法よりも高い成功頻度で、コード配列中にフレームシフトを引き起こす誤りの導入をより少なくして導入するためにも用いられる。本方法を用いて作製されるライブラリーは、機能的バリアントの頻度が高い。この方法に従って作製されるバリアントのライブラリーは、いずれの記載されたディスプレイ、選択およびスクリーニング技術を用いる選択ならびにスクリーニングのためにも用いられる。
本願は特定の実施形態において、例えば以下を提供する:
(項目1)
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域3(CDR3)配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
(項目2)
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、非ヒト哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域3(CDR3)配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
(項目3)
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、ヒトからの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された複数の相補性決定領域3(CDR3)配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
(項目4)
(a)別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第1フレームワーク領域(FR1)、第2フレームワーク領域(FR2)、第3フレームワーク領域(FR3)および第4フレームワーク領域(FR4)を含み、前記FR1の領域およびFR2の領域は、相補性決定領域1(CDR1)を間に有し、前記FR2の領域およびFR3の領域は、相補性決定領域2(CDR2)を間に有し、前記FR3の領域およびFR4の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも2つのIIs型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
(b)前記哺乳動物種の免疫グロブリンレパートリーから単離された相補性決定領域3(CDR3)配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてIIs型制限酵素認識部位を含むステップと、
(c)前記CDR3の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ(a)の前記スタッファー核酸配列を、ステップ(a)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化するステップと、
(d)前記FR3の領域およびFR4の領域が、前記CDR3の領域またはCDR3の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ(a)および(b)の前記IIs型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ(c)の前記CDR3の領域またはCDR3のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ(c)の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
を含む、項目1、2または3に記載の方法。
(項目5)
ステップ(b)が、哺乳動物種からの前記CDR3配列を、IIs型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、項目6に記載の方法。
(項目8)
ステップ(b)が、非ヒト種からの前記CDR3配列を、FokI IIs制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、項目5に記載の方法。
(項目9)
前記非ヒト種が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、Camelidae科のメンバー、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、項目2に記載の方法。
(項目10)
ステップ(a)およびステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位が、異なるIIs型制限酵素により認識される、項目4に記載の方法。
(項目11)
前記IIs型制限酵素認識部位が、BsmBI認識部位、BsaI認識部位、FokI認識部位またはそれらの組み合わせである、項目10に記載の方法。
(項目12)
CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖CDR3(CDR H3)配列をコードする、項目4に記載の方法。
(項目13)
CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖CDR3(CDR L3)配列をコードする、項目4に記載の方法。
(項目14)
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、VH1−2、VH1−69、VH1−18、VH3−30、VH3−48、VH3−23およびVH5−51から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、項目4に記載の方法。
(項目15)
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、項目4に記載の方法。
(項目16)
前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、VK1−33、VK1−39、VK3−11、VK3−15およびVK3−20から選択される、項目15に記載の方法。
(項目17)
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、項目4に記載の方法。
(項目18)
前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、VL1−44およびVL1−51から選択される、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも1つの可変重鎖(VH)アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも1つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、項目4に記載の方法。
(項目20)
ステップ(d)の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ(e)と、ステップ(e)の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ(f)とをさらに含む、項目4に記載の方法。
(項目21)
前記宿主細胞が、E.coliである、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、項目20に記載の方法。
(項目23)
核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、免疫した非ヒト哺乳動物からの免疫グロブリン可変ドメインから別々に単離された複数の相補性決定領域3(CDR3)配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする、方法。
(項目24)
(a)別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第1フレームワーク領域(FR1)、第2フレームワーク領域(FR2)、第3フレームワーク領域(FR3)および第4フレームワーク領域(FR4)を含み、前記FR1の領域およびFR2の領域は、相補性決定領域1(CDR1)を間に有し、前記FR2の領域およびFR3の領域は、相補性決定領域2(CDR2)を間に有し、前記FR3の領域およびFR4の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも2つのIIs型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
(b)前記免疫した非ヒト哺乳動物から単離された相補性決定領域3(CDR3)配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてIIs型制限酵素認識部位を含むステップと、
(c)前記CDR3の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ(a)の前記スタッファー核酸配列を、ステップ(a)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化するステップと、
(d)前記FR3の領域およびFR4の領域が、前記CDR3の領域またはCDR3の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ(a)および(b)の前記IIs型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ(c)の前記CDR3の領域またはCDR3のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ(c)の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
を含む、項目23に記載の方法。
(項目25)
ステップ(b)が、前記免疫した非ヒト哺乳動物からの前記CDR3配列を、IIs型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、項目24に記載の方法。
(項目26)
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、項目25に記載の方法。
(項目27)
前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、項目26に記載の方法。
(項目28)
ステップ(b)が、前記非ヒト哺乳動物からのCDR H3配列を、FokI IIs制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、項目25に記載の方法。
(項目29)
前記非ヒト哺乳動物が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、項目24に記載の方法。
(項目30)
ステップ(a)およびステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位が、異なるIIs型制限酵素により認識される、項目24に記載の方法。
(項目31)
前記IIs型制限酵素認識部位が、BsmBI認識部位、BsaI認識部位、FokI認識部位またはそれらの組み合わせである、項目30に記載の方法。
(項目32)
CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖CDR3(CDR H3)配列をコードする、項目24に記載の方法。
(項目33)
CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖CDR3(CDR L3)配列をコードする、項目24に記載の方法。
(項目34)
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、VH1−2、VH1−69、VH1−18、VH3−30、VH3−48、VH3−23およびVH5−51から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、項目24に記載の方法。
(項目35)
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、項目24に記載の方法。
(項目36)
前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、VK1−33、VK1−39、VK3−11、VK3−15およびVK3−20から選択される、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、項目24に記載の方法。
(項目38)
前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、VL1−44およびVL1−51から選択される、項目37に記載の方法。
(項目39)
前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも1つの可変重鎖(VH)アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも1つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、項目24に記載の方法。
(項目40)
ステップ(d)の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸の前記ライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ(e)と、ステップ(e)の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ(f)とをさらに含む、項目24に記載の方法。
(項目41)
前記宿主細胞が、E.coliである、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、項目40に記載の方法。
免疫グロブリン可変生殖系列遺伝子のクローニング
7つのヒト重鎖可変生殖系列遺伝子(VH1−2、VH1−69、VH1−18、VH3−30、VH3−48、VH3−23、VH5−51)、5つのヒトカッパ軽鎖可変生殖系列遺伝子(VK1−33、VK1−39、VK3−11、VK3−15、VK3−20)および2つのヒトラムダ軽鎖可変生殖系列遺伝子(VL1−44、VL1−51)を、ライブラリーを構築するために選択した(Lefranc, M.−P.ら、1999年、Nucleic Acids Research、27巻、209〜212頁)。これらの遺伝子は、これらがヒトで発現される抗体レパートリーにしばしば用いられ、これらがコードするフレームワークが個別のドメインとしてまたはVH/VL対の状況において好ましい安定性および発現プロファイルを示すので、選択した(Ewert Sら、J Mol Biol.2003年1月17日;325巻(3号):531〜53頁)。2組の特異的プライマーを用いて、ネステッドPCRによりヒトゲノムDNAからこれらの遺伝子を増幅した。同じファミリーの生殖系列遺伝子の5’配列は同一または非常に類似しているので、このアプローチは必要であった。各遺伝子について、ゲノム探知体とよばれるプライマーの第1対を、生殖系列遺伝子を挟む5’および3’の非翻訳領域に特異的になるように設計した。第2対は、フレームワーク1領域(FR1)の始めおよびFR2の終わりに特異的になるように設計した。14の独立したPCR生成物を、pGEMT−easy(Promega、Madison WI)にクローニングし、それらの身元および完全性を、配列決定により確認した。選択された生殖系列遺伝子のアミノ酸配列を、図5に示す。
ゲノム探知体
アクセプターフレームワークの作製
選択された生殖系列遺伝子の配列を、IIs型制限部位の存在について分析した。BsmBI部位は、選択された抗体可変生殖系列遺伝子中に存在しなかった。2つのBsmBI部位が、アクセプターフレームワークをクローニングし得るファージミドベクターであるpNDS1の主鎖で見出された。アクセプターフレームワークのスタッファーDNA配列内にユニークBsmBI部位を導入できるように、これらの2つの部位を、部位特異的突然変異誘発により除去した。各生殖系列遺伝子を、多重ネステッドPCRにより増幅して、スタッファーDNA配列を、それぞれの対応する可変セグメント(VH、Vk、Vλ)に特異的なFR4をコードする配列が後に続くFR3配列の3’末端に付加した。VH FR4のアミノ酸配列は、生殖系列J遺伝子であるJH1、JH3、JH4およびJH5によりコードされるFR4の領域に相当する。VK FR4のアミノ酸配列は、生殖系列J遺伝子であるJK1によりコードされるFR4の領域に相当する。Vλ FR4のアミノ酸配列は、生殖系列J遺伝子であるJL2およびJL3によりコードされるFR4の領域に相当する。106位(アルギニンまたはグリシン)に単独アミノ酸置換を有するVk FR4配列の2つのバリアントを作製した。生殖系列遺伝子VH3−23に基づくアクセプターフレームワークについて、FR3の最後の残基である94位の単独アミノ酸が異なる(リシンからアルギニン)2つのバリアントも構築した。最終増幅ステップ中に、SfiI/NcoIおよびXhoI部位を、VHの5’および3’末端にそれぞれ導入した。
インバリアント可変ドメインを含有するファージミドアクセプターベクターの作製
scFvの発現のために用いたファージミドベクターpNDS1を、まず改変して、2つのBsmBI部位を除去した。規定されたCDR3配列を含有するVH3−23ドメインを、改変されたpNDS1に、SfiIおよびXhoI制限部位を用いてクローニングして、ファージミドベクターpNDS_VHdummyを得た。このドメインはFR4の領域内にBsmBI部位を含有したが、これは、サイレント部位特異的突然変異誘発により修正した。これと並行して、規定されたCDR3配列を含有するVK1−39ドメインを、次いで、改変されたpNDS1に、SalIおよびNotI制限部位を用いてクローニングして、ファージミドベクターpNDS_VKdummyを得た(図9)。8つのVHアクセプターフレームワークを、pNDS_VKdummyに、SalIおよびNotI制限部位を用いてクローニングした。12のVLアクセプターフレームワークを、pNDS_VHdummyに、SfiIおよびXhoI制限部位を用いてクローニングした。以下に列挙する、得られた20のpNDSファージミドベクターは、この段階で、スタッファーDNA断片内に存在するBsmBI部位を用いて、多様化されたCDR3をクローニングするために用いることができた。
VHアクセプター: pNDS_VH1−2_VKd; pNDS_VH1−18_VKd; pNDS_VH1−69_VKd; pNDS_VH3−23R_VKd; pNDS_VH3−23K_VKd; pNDS_VH3−30_VKd; pNDS_VH5−51_VKd; pNDS_VH3−48_VKd。
VLアクセプター: pNDS_VHd_VK1−33G; pNDS_VHd_VK1−33R; pNDS_VHd_VK1−39G; pNDS_VHd_VK1−39R; pNDS_VHd_VK3−11G; pNDS_VHd_VK3−11R; pNDS_VHd_VK3−15G; pNDS_VHd_VK3−15R; pNDS_VHd_VK3−20G; pNDS_VHd_VK3−20R; pNDS_VHd_VL1−44; pNDS_VHd_VK1−51。
ヒトレパートリーからの天然CDR H3多様性の捕捉
ヒトcDNAの複数の供給源を、CDR H3配列の増幅のための鋳型として用いた。これらの供給源は、ヒト胎児脾臓ならびに雄性および雌性の正常成体末梢血精製細胞のプールを含んだ。増幅のためのいくつかの方策を、特定の生殖系列遺伝子によりコードされる再構成されたVH cDNAを起源とするCDR H3配列、または任意のVH cDNAを起源とするCDR H3配列を回復するために用いた。
天然ヒトCDR H3をアクセプターフレームワーク内にクローニングすることによる1次ライブラリーの作製
増幅したCDR H3をFokIで消化し、切断した端部および未消化DNAを、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズを用いて除去した。これと並行して、pNDS VHアクセプターベクターを、BsmBIを用いて消化した。これらの消化により作製される突出は適合性であるので、天然CDR H3のコレクションは、適当なリーディングフレームを復元してVHアクセプターフレームワークにライゲーションすることができた。ライゲーションしたDNAを、コンピテントE.coli XL1 Blue細胞の形質転換のために精製して濃縮し、CDR H3配列が再構築され、CDRとフレームワーク領域との間の接合部が正しいことを確認するために、ランダムクローンを配列決定により分析した(図10)。結果は、全てのクローンがCDR H3配列を含有し、リーディングフレームが復元され、よって免疫グロブリン可変重鎖をコードすることを示した。さらに、全てのCDRは異なっており、このことは、天然に存在する配列の大きい多様性がこのアプローチにより捕捉されたことを示した。CDR H3の長さも変動性であり、10〜15残基の比較的長いCDRが見出され、よって、合成多様性を用いてカバーすることが困難な長いCDR配列を標本抽出するためのこのアプローチの利点が強調された。
合成CDR3をアクセプターフレームワーク内にクローニングすることによる1次ライブラリーの作製
本方法は、天然多様性を取得することを特に対象とするが、これは、合成多様性をアクセプターフレームワークに組み込むために用いることもできる。合成CDR3配列を、VHおよびVLの両方について設計した。設計は、所与の長さを有するCDRの頻度と、ライブラリー内の形質転換体の妥当な数(約5×109形質転換体)のうちの理論的多様性の完全なカバーを可能にする多様性方策(NNS、DVK、NVTまたはDVTコドン)とを考慮した(図11)。CDRの正準構造を維持するための重要な残基は、VKおよびVλ鎖についてCDR3の設計中で一定に保った。重鎖について、10までの多様化された位置を有するCDR3だけを作製した。なぜなら、より長いCDRによりコードされる多様性をカバーするために必要なクローンの数は、形質転換効率の実際上の限界を超えるからである。
2次ライブラリーの作製
重鎖および軽鎖の両方に多様性を持つscFvのライブラリーを作製するために、1次合成軽鎖ライブラリーを、1次合成重鎖ライブラリーまたは1次天然重鎖ライブラリーのいずれかと組み合わせた(図13)。ファージミドDNAを各1次ライブラリーから調製し、XhoI/NotI制限酵素で切断した。リンカーおよび1次合成ライブラリーからの軽鎖に相当するDNA断片を、ライゲーションにより、消化した1次天然または合成重鎖ベクターに挿入した。代わりに、リンカー−VL配列も特異的プライマーを用いて増幅した後に、XhoI/NotIでの消化およびライゲーションを行った。ライゲーション生成物をフェノール/クロロホルム抽出および沈殿により精製した後に、エレクトロコンピテントE.coli TG1細胞を形質転換し、2×TYAG Bioassayプレート(100μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを含有する2×TY培地)に播種した。30℃にて1晩のインキュベーションの後に、10mlの2×TYAG液体培地をプレートに加え、細胞を表面からはがし、50mlポリプロピレンチューブに移した。50%グリセロールを含有する2×TYAGを細胞懸濁物に加えて、17%グリセロールの最終濃度を得た。ライブラリーの分割量を−80℃にて貯蔵した。組み換わるライブラリーの数を制限するために、これらを鎖のサブクラスによりプールし(すなわちVH1、VH3、VH5、VK1、VK3、Vλ1)、よって9つのライブラリーの組み合わせを(すなわちVH1×VK1、VH1×VK3、VH1×Vλ1、VH3×VK1、VH3×VK3、VH3×Vλ1、VH5×VK1、VH5×VK3、VH5×Vλ1)について行った。2次合成ライブラリーの合計サイズ(VHおよびVLの両方に合成多様性を持つ)は、7.3×109形質転換体であった。2次天然ライブラリーの合計サイズ(VHに天然多様性、VLに合成多様性を持つ)は、1.5×1010形質転換体であった。
非ヒト種に由来するCDRH3レパートリーを表示するヒト抗体ライブラリーの作製
抗体組み合わせ部位内で異なる3次元空間を探索することを可能にする多様性の代替供給源を利用するために、マウスのCDRH3を捕捉し、それらをヒト抗体フレームワークのコレクション中に導入することによりライブラリーを創出した。このアプローチのために、合成CDR L3多様性を有するVL遺伝子のコレクションを含有するアクセプターライブラリーを構築し、実施例2に記載されるようにIIS型制限クローニングのためにすぐに適するスタッファーDNA配列を含有するアクセプター配列のコレクションと組み合わせた。このライブラリーは、天然(ヒトおよび非ヒト)または合成CDR H3の複数の供給源を用いる2次ライブラリーの迅速な作製のための開始点を表す。この実施例において、天然CDR H3多様性を、ナイーブBalb/cマウスおよびhIFNγまたはhCCL5(hRANTES)で免疫化したマウスから捕捉した。
マウスからのCDRH3増幅のために用いたプライマー
1回目のPCR
ライブラリーのファージレスキュー
1次および2次ライブラリーのそれぞれを、以下に簡単にまとめる標準的なファージディスプレイ手順に従って独立してレスキューした。ライブラリーの理論的多様性の少なくとも10倍をカバーするのに十分な凍結ライブラリー分割量からの細胞の容量を、500mlの2×TYAGに加え、37℃にて撹拌(240rpm)しながら0.3〜0.5のOD600に到達するまで成長させた。培養物に、次いで、MK13K07ヘルパーファージを重感染させ、37℃にて1時間(150rpm)インキュベートした。培地を、次いで、細胞を2000rpmにて10分間遠心分離し、培地を除去し、ペレットを500mlの2×TY−AK(100μg/mlアンピシリン;50μg/mlカナマイシン)に再懸濁することにより交換した。培養物を、次いで、30℃にて1晩(240rpm)成長させた。培養物を4000rpmにて20分間遠心分離して、細胞をペレットにした。上清を回収し、30%(vol/vol)のPEG8000(20%)/2.5M NaClを加えて、混合物を1時間氷上でインキュベートすることによりファージ粒子を沈殿させた。ファージ粒子を、10,000rpmにて30分間遠心分離することにより回収し、10mlのTE緩衝液(10mM tris−HCl pH8.0;1mM EDTA)に再懸濁した。再懸濁した溶液を10,000rpmにて遠心分離して細菌破片を除去し、沈殿手順を繰り返した。最後の再懸濁の後に、ファージを、E.coliの感染および280nmでの吸収により滴定した。ファージ表面でのscFvのディスプレイレベルも、抗c−mycモノクローナル抗体を用いるウェスタンブロット分析により評価した。異なるライブラリーからの精製ファージを、15%(w/v)の最終濃度までグリセロールを加えた後に−80℃にて凍結貯蔵した。
抗体ライブラリーのハイスループット配列決定
ライブラリーの質および多様性は、ランダムライブラリーメンバーのDNA配列決定により評価できる。ほとんどの場合、ライブラリーの非常に小さい画分だけを表す(10,000,000ライブラリーメンバーのうちの1未満)数百クローンを配列決定する。本明細書で提供される方法の性能を分析するために、次世代の配列決定技術を用いて、より典型的な数のライブラリーメンバーを分析した。ライブラリーAE1から単離したDNAを、illuminaゲノムアナライザ装置を用いるハイスループット配列決定のための鋳型として用いた。この次世代のDNA配列決定システムは、数日間で数十億塩基を読み取ることを可能にする。配列決定読み取りは比較的短い(約70塩基)が、我々のライブラリー設計に完全に適合性である。多様性はCDR3の領域に限られるので、70塩基の読み取りは、VHファミリー同定のためにCDRH3およびフレームワーク3領域の部分をカバーするために十分である。この技術は、AE1ライブラリーから数百万のCDRH3領域を配列決定するために用いられている。5,078,705の配列が、合計で365,666,760塩基について得られた。データの分析により、5,007,022の配列(全体の98.6%)がユニークであったことが示された。合計で4,680,882の配列を、VHファミリー(VH1、VH3およびVH5)に明確に帰着させることができ、AE1ライブラリーにおけるVHファミリーの代表が決定された(41%VH1;30%VH3;29%VH5)。重要な知見は、インフレーム挿入断片の割合が、88と91%の間の範囲であったことであった。このデータは、実施例6に記載される24の1次VH合成ライブラリーの配列決定の結果よりもはるかに統計学的な様式で確認された。この組み合わせた組の配列決定データは、この方法において用いたIIs型制限クローニングプロセスが非常に堅固であり、AE1ライブラリーのVH多様性を作製するために行った24の独立したライブラリー構築における効率的で生産的な挿入を導くことを証明する。
2次ライブラリーを用いるファージディスプレイ選択
ヒトインターフェロンガンマ(hIFNγ)に対する液相選択:
AD1およびAE1ファージライブラリーの分割量(1011〜1012Pfu)を、3%(w/v)脱脂乳を含有するPBSで室温にて1時間、ロータリーミキサー上でブロックした。ブロックしたファージを、次いで、ストレプトアビジン磁性ビーズ(Dynal M−280)上で室温にて1時間、ロータリーミキサー上で選択解除した。選択解除したファージを、次いで、in vivoビオチン化hIFNγ(100nM)と室温にて2時間、ロータリーミキサー上でインキュベートした。ビーズを、磁気スタンドを用いて捕捉した後に、PBS/0.1% Tween20で4回、およびPBSで3回洗浄した。ビーズを、次いで、10mlの指数関数成長しているTG1細胞に直接加え、37℃にて1時間、緩慢な振とう(100rpm)でインキュベートした。感染させたTG1の分割量を系列希釈して、選択の産出量を滴定した。残りの感染させたTG1を3000rpmにて15分間スピンし、0.5mlの2×TYAG(100μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを含有する2×TY培地)に再懸濁し、2×TYAG寒天Bioassayプレートに広げた。30℃にて1晩のインキュベーションの後に、10mlの2×TYAGをプレートに加え、細胞を表面からはがし、50mlポリプロピレンチューブに移した。50%グリセロールを含有する2×TYAGを細胞懸濁物に加えて、17%グリセロールの最終濃度を得た。選択回の分割量を−80℃にて保存した。ファージ産出量を各回の後に滴定し、産出量の累進的な増加は、標的に特異的なクローンの富化が生じていることを示した(図16)。
ラットモノクローナル抗体5E3に対するパニングによる選択:
免疫チューブを、PBS中に10μg/mlにて5E3で4℃にて1晩被覆し、ファージ選択解除のための免疫チューブを、無関係のラット抗体で同じ条件下にて被覆した。洗浄の後に、免疫チューブを、3%(w/v)脱脂乳を含有するPBSで室温にて1時間ブロックした。AD1およびAE1ファージライブラリーの分割量(1011〜1012Pfu)を、3%(w/v)脱脂乳を含有するPBSで室温にて1時間、ロータリーミキサー上でブロックした。ブロックしたファージを、次いで、無関係のラット抗体で被覆した免疫チューブ中で室温にて1時間、ロータリーミキサー上で選択解除した。選択解除したファージを、次いで、5E3で被覆した免疫チューブに移し、室温にて2時間、ロータリーミキサー上でインキュベートした。チューブをPBS/0.1% Tween20で5回およびPBSで3回洗浄した。ファージを、TEA 100mMで10分間溶出し、1M Tris HCl pH7.5で中和した。ファージを、10mlの指数関数成長しているTG1細胞に加え、37℃にて1時間、緩慢な振とう(100rpm)でインキュベートした。感染させたTG1の分割量を系列希釈して、選択の産出量を滴定した。残りの感染させたTG1を3000rpmにて15分間スピンし、0.5mlの2×TYAG(100μg/mlアンピシリンおよび2%グルコースを含有する2×TY培地)に再懸濁し、2×TYAG寒天Bioassayプレートに広げた。30℃にて1晩のインキュベーションの後に、10mlの2×TYAGをプレートに加え、細胞を表面からはがし、50mlポリプロピレンチューブに移した。50%グリセロールを含有する2×TYAGを細胞懸濁物に加えて、17%グリセロールの最終濃度を得た。選択回の分割量を−80℃にて保存した。ラット5E3と、可変領域をマウスの定常ドメインに融合した5E3のキメラバージョンとを交互にすることにより選択の回を行った。これらの交互の回を行って、5E3の可変領域に特異的なクローンを富化し、抗イディオタイプ抗体を作製した。ファージ産出量を各回の後に滴定し、産出量の累進的な増加は、標的に特異的なクローンの富化が生じていることを示した(図17)。
ハイスループット配列決定を用いる選択の後に得られるCDR3プロファイルの分析
実施例10に記載される次世代の配列決定技術を用いて、AE1およびAD1ライブラリーならびに3回目の選択の後に得られた産出物中の各VHファミリー内のCDR H3の長さの分布を分析した。AE1およびAD1ライブラリーのプロファイルは、明らかに異なる(図18)。AE1ライブラリー中のCDR H3の長さの分布は、意図するライブラリー設計に相当し、長さは9〜15の間のアミノ酸の範囲である。これとは対照的に、22アミノ酸までのより長いCDR H3がAD1ライブラリーで見出され、プロファイルは、ヒト天然レパートリーで観察される長さの分布に相当する。これらの結果により、ヒト天然CDR H3レパートリーが、AD1ライブラリーの構築中に捕捉されたことが確認される。5E3に対する3回の選択の後に行われた同様の分析により、完全に異なるCDR H3の長さのプロファイルが選択されたことが明らかになった。特に、8および21アミノ酸の長さのCDR H3が劇的に富化されたことが、AD1ライブラリーを用いて行った選択において観察できた。この組のデータは、異なるCDR H3プロファイルが、同じ標的に対する選択の後に2つのライブラリーから富化されたことを証明した。さらに、この分析は、本発明を用いて、合成多様性を用いてカバーすることが非常に困難な長いCDR H3を、選択したヒトフレームワーク内に捕捉して選択できたことを証明する。
同定されたscFvの結合アッセイにおける評価
5E3の可変領域に対して陽性であると同定された、異なる配列を有するクローンの精製されたscFv調製物を、キメラ5E3に対する結合について、用量応答ELISAにおいて試験した。これらの調製物は、無関係のマウス抗体(1A6)に対しても試験した。ELISAプレート(Maxisorb、NUNC)を、PBS中の2μg/mlマウス5E3で1晩被覆した。対照プレートを、2μg/ml 1A6モノクローナル抗体で被覆した。プレートを、次いで、3%脱脂乳/PBSで室温にて1時間ブロックした。プレートを、PBS 0.05% Tween20で3回洗浄した後に、異なる濃度の精製されたscFvを加え、室温にて1時間インキュベーションした。プレートを、次いで、PBS 0.05% Tween20で3回洗浄した。(HRP)コンジュゲート抗myc抗体を含有する50μlの3%脱脂乳/PBSを各ウェルに。室温にて1時間のインキュベーションの後に、プレートをPBS 0.05% Tween20で5回洗浄した。ELISAを、次いで、50μlのAmplex Red蛍光基質を加えることにより明らかにし、シグナルを蛍光分光光度計で読み取った。データは、ほとんどのクローンが、1A6を認識しないので5E3について高度に特異的であり、これらが5E3の可変領域を指向することを示す(図19)。
インターフェロンガンマにより誘導されるレポーター遺伝子発現のScFv阻害
hIFNγに特異的な、選択されたscFvのパネルを上記のようにして生成して精製し、hIFNγの生物活性を遮断する能力について試験した。IFNγ誘導性GBP1プロモーターにより駆動されるレポーター遺伝子(ホタルルシフェラーゼ)を、ヒトメラノーマ株化細胞Me67.8にトランスフェクトした。種々の濃度のscFvを2ng/mlのhIFNγとインキュベートし、次いで、細胞培養物に加えた。6時間のインキュベーション時間の後に、ルシフェラーゼレポーターアッセイを行い、発光の強度を測定した。活性を、ヒトドナーからのVH/VLレパートリー(クローンG9)の伝統的な捕捉により構築された別のヒトscFv抗体ライブラリーから単離したscFvと比較した。データは、合成または天然のいずれかのヒト多様性ライブラリー(AE1およびAD1)から単離したscFvが、hIFNγの生物活性を用量依存的な様式で阻害可能であったことを示す(図21)。これらのscFvの中和効力は、ベンチマークscFvクローンG9より優れていた。
インターフェロンガンマにより誘導されるMHCクラスII発現のscFv阻害
フローサイトメトリーアッセイを行って、IFNγにより誘導されるMHCクラスII分子の発現を遮断できる完全にヒトのIgG抗体またはその断片を同定した。Me67.8細胞の播種の後に、5ng/ml組換えヒトIFNγを、種々の濃度の完全にヒトの抗IFNγモノクローナル抗体の候補の存在下で培養に加えた。48時間の培養の後に、細胞を、蛍光標識抗ヒトMHCクラスII抗体(HLA−DR)で染色し、FACSCalibur(登録商標)を用いて分析した。よって、各候補抗体についてのIC50(IFNγにより誘導されるMHCクラスII発現の50%が阻害される場合、すなわち50%阻害濃度)が測定される。
IgGフォーマットへのscFvの再フォーマッティング
選択されたscFvのVHおよびVL配列を、5’末端にリーダー配列とHindIII制限部位とを導入する特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅した。ApaI部位は重鎖の3’末端に導入し、一方、AvrIIおよびBsiWI部位は、それぞれラムダまたはカッパ軽鎖配列の3’末端に導入した。増幅されたVH配列をHindIII/ApaIで消化し、pCon_gamma1発現ベクター(LONZA、Basel、Switzerland)にクローニングした。増幅されたVLラムダ配列をHindIII/AvrIIで消化し、pCon_lambda2発現ベクターにクローニングし、増幅されたVLカッパ配列をHindIII/BsiWIで消化し、pCon_kappa発現ベクター(LONZA、Basel、Switzerland)にクローニングした。構築物を配列決定により確認した後に、哺乳動物細胞をトランスフェクトした。
インターフェロンガンマ生物活性のIgG阻害
機能的アッセイにおいてhIFNγに対する阻害活性が確認された2つのscFvであるAE1−4−R3−P2E4(2E4)およびA2−AD1−R4P1A9(1A9)を、実施例16に記載されるようにしてIgGに再フォーマットし、実施例14に記載されるインターフェロンガンマにより誘導されるレポーター遺伝子アッセイにおいて試験した。図23に示す結果は、IgGフォーマットにおいて、1A9および2E4はともにhIFNγの活性を、それぞれ42nMおよび10nMのIC50で中和できたが、陰性対照IgG(NI−0701)はこのアッセイにおいて効果を有さなかったことを示す。よって、合成および天然の多様性ライブラリーの両方から単離されたこれらの2つの候補は、完全IgGに再フォーマットでき、選択された標的に対する中和活性を特徴とする。
マウス血清における5E3の検出のための薬物動態アッセイの開発。
ナイーブおよび免疫化マウスから捕捉したCDRH3多様性を含有するライブラリーを用いるファージ選択。
その他の実施形態
本発明を、その詳細な説明に関連して説明したが、上記の記載は、説明することを意図し、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定しない。その他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (38)
- 核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された、非ヒト哺乳動物種からの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された、または、ヒトからの免疫グロブリン可変ドメインレパートリーから別々に単離された、複数の相補性決定領域3(CDR3)配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードし、前記方法は、以下:
(a)別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第1フレームワーク領域(FR1)、第2フレームワーク領域(FR2)、第3フレームワーク領域(FR3)および第4フレームワーク領域(FR4)を含み、前記FR1の領域およびFR2の領域は、相補性決定領域1(CDR1)を間に有し、前記FR2の領域およびFR3の領域は、相補性決定領域2(CDR2)を間に有し、前記FR3の領域およびFR4の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも2つのIIs型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
(b)前記哺乳動物種の免疫グロブリンレパートリーから単離された相補性決定領域3(CDR3)配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてIIs型制限酵素認識部位を含むステップと、
(c)前記CDR3の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ(a)の前記スタッファー核酸配列を、ステップ(a)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化するステップと、
(d)前記FR3の領域およびFR4の領域が、前記CDR3の領域またはCDR3の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ(a)および(b)の前記IIs型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ(c)の前記CDR3の領域またはCDR3のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ(c)の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
を含む、方法。 - ステップ(b)が、哺乳動物種からの前記CDR3配列を、IIs型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、請求項2に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、請求項3に記載の方法。
- ステップ(b)が、非ヒト種からの前記CDR3配列を、FokI IIs制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項2に記載の方法。
- 前記非ヒト種が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、Camelidae科のメンバー、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、請求項1に記載の方法。
- ステップ(a)およびステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位が、異なるIIs型制限酵素により認識される、請求項1に記載の方法。
- 前記IIs型制限酵素認識部位が、BsmBI認識部位、BsaI認識部位、またはFokI認識部位を含む、請求項7に記載の方法。
- CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖CDR3(CDR H3)配列をコードする、請求項1に記載の方法。
- CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖CDR3(CDR L3)配列をコードする、請求項1に記載の方法。
- 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、VH1−2、VH1−69、VH1−18、VH3−30、VH3−48、VH3−23およびVH5−51から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、VK1−33、VK1−39、VK3−11、VK3−15およびVK3−20から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、VL1−44およびVL1−51から選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも1つの可変重鎖(VH)アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも1つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、請求項1に記載の方法。
- ステップ(d)の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸のライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ(e)と、ステップ(e)の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ(f)とをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、E.coliである、請求項17に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、請求項17に記載の方法。
- 核酸のコレクションを生成する方法であって、各核酸が、免疫した非ヒト哺乳動物からの免疫グロブリン可変ドメインから別々に単離された複数の相補性決定領域3(CDR3)配列を含むヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードし、前記方法は、以下:
(a)別個のヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする複数のアクセプターフレームワーク核酸配列を提供するステップであって、各アクセプターフレームワーク核酸配列が第1フレームワーク領域(FR1)、第2フレームワーク領域(FR2)、第3フレームワーク領域(FR3)および第4フレームワーク領域(FR4)を含み、前記FR1の領域およびFR2の領域は、相補性決定領域1(CDR1)を間に有し、前記FR2の領域およびFR3の領域は、相補性決定領域2(CDR2)を間に有し、前記FR3の領域およびFR4の領域は、ランダム核酸配列を間に有する少なくとも2つのIIs型制限酵素認識部位を含むスタッファー核酸配列を間に有するステップと、
(b)前記免疫した非ヒト哺乳動物から単離された相補性決定領域3(CDR3)配列をコードする複数の多様化された核酸配列を提供するステップであって、前記複数の多様化された核酸配列のそれぞれが、それぞれの端部にてIIs型制限酵素認識部位を含むステップと、
(c)前記CDR3の領域をコードする前記複数の核酸配列のそれぞれを、ステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化し、前記アクセプターフレームワークからのステップ(a)の前記スタッファー核酸配列を、ステップ(a)の前記IIs型制限酵素認識部位と結合するIIs型制限酵素を用いて消化するステップと、
(d)前記FR3の領域およびFR4の領域が、前記CDR3の領域またはCDR3の領域の役割を充足できるアミノ酸配列をコードする核酸配列を間に有し、かつステップ(a)および(b)の前記IIs型制限酵素認識部位を含有しない完全免疫グロブリン可変ドメインコード配列が復元するように、ステップ(c)の前記CDR3の領域またはCDR3のアミノ酸配列をコードする消化された核酸配列を、ステップ(c)の消化されたアクセプターフレームワークにライゲーションするステップと
を含む、方法。 - ステップ(b)が、前記免疫した非ヒト哺乳動物からの前記CDR3配列を、IIs型制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項20に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列と、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワークとの間の適合性を増進するように設計される、請求項21に記載の方法。
- 前記オリゴヌクレオチドプライマーが、前記哺乳動物のCDR3配列の境界における核酸配列を改変して、ヒト免疫グロブリン可変ドメインをコードする前記アクセプターフレームワーク内の適合性の付着ヌクレオチド配列を生成するように設計される、請求項22に記載の方法。
- ステップ(b)が、前記非ヒト哺乳動物からのCDR H3配列を、FokI IIs制限部位を含有するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて増幅することにより行われる、請求項21に記載の方法。
- 前記非ヒト哺乳動物が、非ヒト霊長類、げっ歯類、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダまたはブタである、請求項20に記載の方法。
- ステップ(a)およびステップ(b)の前記IIs型制限酵素認識部位が、異なるIIs型制限酵素により認識される、請求項20に記載の方法。
- 前記IIs型制限酵素認識部位が、BsmBI認識部位、BsaI認識部位、またはFokI認識部位を含む、請求項26に記載の方法。
- CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、重鎖CDR3(CDR H3)配列をコードする、請求項20に記載の方法。
- CDR3配列をコードする前記多様化された核酸配列が、軽鎖CDR3(CDR L3)配列をコードする、請求項20に記載の方法。
- 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、VH1−2、VH1−69、VH1−18、VH3−30、VH3−48、VH3−23およびVH5−51から選択されるヒト重鎖可変遺伝子配列を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記ヒトカッパ軽鎖可変遺伝子配列が、VK1−33、VK1−39、VK3−11、VK3−15およびVK3−20から選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記アクセプターフレームワーク核酸配列が、ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記ヒトラムダ軽鎖可変遺伝子配列が、VL1−44およびVL1−51から選択される、請求項33に記載の方法。
- 前記複数のアクセプターフレームワーク核酸配列が、少なくとも1つの可変重鎖(VH)アクセプターフレームワーク核酸配列と、少なくとも1つの可変軽鎖アクセプターフレームワーク核酸配列との混合物を含む、請求項20に記載の方法。
- ステップ(d)の免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸の前記ライブラリーを、発現ベクターにクローニングするステップ(e)と、ステップ(e)の前記発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、前記宿主細胞を、前記ライブラリーによりコードされる複数の免疫グロブリン可変ドメインを発現させるために十分な条件下で培養するステップ(f)とをさらに含む、請求項20に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、E.coliである、請求項36に記載の方法。
- 前記発現ベクターが、ファージミドまたはファージベクターである、請求項36に記載の方法。
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