BRPI1011195B1 - métodos para produzir uma coleção de ácidos nucleicos - Google Patents

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Nicolas Fischer
Marie Kosco-Vilbois
Ulla Ravn
Franck Gueneau
Sophie Venet-Bonnot
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Novimmune S.A
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Abstract

método para produzir uma biblioteca de ácidos nucléicos a invenção provê métodos para geração de bibliotecas de sequências de dna codificando polipeptídeos homólogos e a utilização das bibliotecas para identificar variantes de polipeptídeo naturalmente diversificadas. a invenção também provê composições e métodos para geração de bibliotecas de fragmentos de anticorpo sintético, nos quais uma ou várias regiões determinantes de complementaridade (cor) são substituídas por uma biblioteca de cdrs correspondentes capturadas de uma fonte natural. a invenção provê, adicionalmente, composições e métodos para diversificar uma porção de um polipeptídeo por inserção de uma sequência diversificada de origem natural ou sintética sem a necessidade de modificação da sequência de codificação de polipeptídeo original.

Description

PEDIDOS CORRELATOS
[001]Este pedido reivindica o benefício dos Pedidos US Provisórios números 61/179.850, depositado em 20 de maio de 2009, 61/287.336, depositado em 17 de dezembro de 2009 e 61/314.794, depositado em 17 de marco de 2010, o conteúdo de cada um sendo incorporado ao presente documento como referência em sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002]A invenção se refere à geração de bibliotecas de sequências de DNA codificando polipeptídeos homólogos e ao uso de tais bibliotecas. Esta invenção se refere, especificamente, à geração de coleções de fragmentos de anticorpos sintéticos em que uma ou várias regiões determinantes de complementaridade (CDR) são substituídas por uma coletânea de CDR correspondente capturada de uma fonte natural. A invenção se refere também à geração de coleções de fragmentos de anticorpos contendo CDR derivado de um animal imunizado e seu uso como uma fonte melhor para derivar os fragmentos de anticorpos de alta afinidade. A invenção se refere, adicionalmente, à diversificação de uma porção de um polipeptídeo através da inserção de uma sequência diversificada de origem sintética ou natural, sem a necessidade de modificação da sequência de codificação de polipeptídeo original.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003]Um anticorpo é composto por quatro polipeptídeos; duas cadeias pesadas e duas cadeias leves. A porção de ligação do antígeno de um anticorpo é formada pelo domínio variável de cadeia leve (VL) e o domínio variável de cadeia pesada (VH). Em uma extremidade destes domínios seis regiões de alças formam o sítio de ligação de antígeno e também são referidos como regiões determinantes de complementaridade (CDR). Três CDRs estão localizadas no domínio VH (H1, H2 e H3) e as outras três estão no domínio VL (L1, L2 e L3). Durante o desenvolvimento das células B uma região de imunoglobulina única é formada por recombinação so- mática conhecida como recombinação V(D)J. A região de cadeia pesada variável da imunoglobulina ou cadeia leve é codificada pelos diferentes segmentos gênicos. A cadeia pesada é codificada por três segmentos denominados segmentos variáveis (V), diversidade (D) e ligação (J) enquanto a cadeia leve variável é formada por recombinação de apenas dois segmentos V e J. Um grande número de paratopos de anticorpos pode ser gerado por recombinação entre uma das várias cópias dos segmentos V, D e J que estão presentes no genoma. O segmento V codifica a CDR1 e CDR2 enquanto a CDR3 é gerada pelos eventos de recombinação.
[004]Durante o curso da resposta imune diversidade adicional é introduzida no sítio de ligação de antígeno por um processo chamado hipermutação somática (SHM). Durante este processo mutações pontuais são introduzidas nos genes variáveis das cadeias leves e pesadas e, especificamente nas regiões de codificação das CDRs. Esta variabilidade adicional permite a seleção e expansão de células B expressando variantes de anticorpos com afinidade melhor para seu antígeno cognato.
[005]Nos últimos anos várias tecnologias de exibição surgiram permitindo o rastreamento de grandes coleções de proteínas ou peptídeos. Estas incluem exibição de fago, exibição de bactérias, exibição de leveduras e exibição de ribossomo (Smith GP. Science. 14 de junho de 1985; 228 (4705): 1315-7; Hanes J e Plünckthun A. Proc Natl Acad Sci EUA A. 13 de maio de 1997; 94 (10) :4937-42; PS Daugherty e outros, Protein Eng., setembro de 1998; 11 (9): 825-32.; Boder ET e Wittrup KD. Nat Biotechnol., junho de 1997; 15 (6):553-7). Especificamente, estes métodos têm sido aplicados extensivamente aos anticorpos e fragmentos dos mesmos. Vários métodos têm sido descritos para gerar bibliotecas de polipeptídeos e para classificar os elementos com propriedades de ligação desejadas.
[006] A primeira abordagem é capturar por ampliação gênica os genes de imunoglobulina rearranjados dos repertórios naturais usando tecidos ou células de seres humanos ou outros mamíferos, como fonte de diversidade genética. Estas coleções de cadeias pesadas e leves (VH e VL) rearranjadas são então combinadas para gerar bibliotecas de pares de ligação que podem ser exibidas no bacteriófago ou em outros tipos de exibição, tais como bactérias, fungos ou células de mamíferos. Neste caso, uma grande fração do repertório de imunoglobulinas encontradas no doador é capturada. Assim, todos os frameworkscodificados pelos genes germ inativos do doador podem ser encontrados no repertório, bem como a diversidade gerada tanto por recombinação de V (D) J e por hipermutação somática (Marks JD e outros., J Mol Biol. 5 de dezembro de 1991; 222 (3) : 581-97; McCaffety, Patente US no. 5.969.108).
[007]Uma limitação dos repertórios naturais é que os anticorpos ocorrendo naturalmente podem se basear em frameworkscom estabilidade intrínseca baixa que limitam os seus níveis de expressão, sua validade e utilidade como reagentes ou moléculas terapêuticas. Para superar essas limitações vários métodos foram desenvolvidos para gerar bibliotecas de anticorpos sintéticos.
[008]Nessas abordagens, um único ou um número limitado de frameworks de anticorpos codificados por seus genes germ inativos correspondentes são selecionadas. A seleção dessas frameworksde modo geral tem como base sua estabilidade bioquímica e/ou sua frequência de expressão nos repertórios de anticorpos naturais. A fim de gerar um conjunto de proteínas de ligação, a diversidade sintética é então introduzida em todos ou um subconjunto de CDRs. Tipicamente tanto o total quanto parte da CDR é diversificada usando estratégias diferentes. Em alguns casos, a diversidade foi introduzida em posições selecionadas dentro das CDRs (Knappik A e outros, J Mol Biol. 11 de fevereiro 2000; 296 (l):57-86). Resíduos alvo podem ser aqueles frequentemente envolvidos no contato com o antígeno, aqueles revelando diversidade máxima nos repertórios de anticorpo natural ou mesmo resíduos que seriam preferivelmente alvejados pela maquinaria celular envolvida na geração de hipermutações somáticas durante o processo de maturação por afinidade (Balint RF, Larrick JW. Gene. 27 de dezembro de 1993; 137 (1): 109-18).
[009]Vários métodos vêm sendo utilizados para diversificar as CDRs de anti- corpos. A sobreposição de PCR usando oligonucleotídeos degenerados vem sendo amplamente utilizada para montar o frameworke elementos de CDR para reconstituir os genes de anticorpo. Em outra abordagem, os sítios de enzima de restrição únicos foram construídos nas regiões framework (“framework regions”) nos limites de cada CDR permitindo a introdução das CDRs diversificadas por clonagem mediada por enzima de restrição. Em qualquer caso, como todos os elementos da biblioteca se baseiam em frameworkscom características selecionadas e preferidas é antecipado que os anticorpos derivados destes repertórios são mais estáveis e fornecem uma fonte melhor de reagentes úteis. (Knappik, US 6.696.248; Sidhu SS, e outros, Métodos EnzymoL 2000; 328:333-63; CV Lee e outros, J. Mol. Biol.. 23 de julho de 2004; 340 (5): 1073-1093).
[0010]No entanto, uma limitação importante dessas bibliotecas sintéticas é que uma proporção significativa dos elementos da biblioteca não é expressa, porque as sequências aleatoriamente diversificadas não permitem a expressão adequada e/ou dobramento da proteína. Este problema é particularmente significativo para a CDR3 da cadeia pesada. Na verdade, esta CDR muitas vezes contribui para a maior parte da energia de ligação ao antígeno e é altamente diversa em comprimento e sequência. Enquanto o outro CDR (H1, H2, L1, L2 e L3) só pode adotar um número limitado de três conformações dimensionais, conhecido como dobras canônicas, o número de conformações que podem ser adotadas pela cadeia pesada CDR3 continua a ser demasiado diversificado para ser previsto (Al-Lazikani B e outros, J. Mol. Biol. 7 de novembro de 1997; 273 (4) :927-48). Além disso, o emprego de oligonucleotídeos degenerados muito usados para cobrir CDR H3 longa muitas vezes introduz um único par de bases exclusões. Esses fatores reduzem significativamente o tamanho funcional dos repertórios sintéticos.
[0011]Ambos os repertórios naturais e sintéticos apresentam vantagens e limitações. Por um lado, as estratégias de contar com a captura de genes variáveis de anticorpos naturalmente rearranjados não são ótimas porque incluem frameworks potencialmente menos favoráveis dentro da biblioteca. Um aspecto positivo é que esses genes variáveis rearranjados incluem CDRs que são compatíveis com dobra- dura de domínio próprio, pois foram expressos no contexto de um anticorpo natural. Por outro lado, as estratégias com base na seleção dos frameworkse inserção de benefício de diversidade sintética a partir da estabilidade aperfeiçoada dos frameworks,porém são limitadas pelo grande número de sequências de CDR que não são compatíveis com dobradura e ou expressão e podem desestabilizar o domínio total (figura 1A). Portanto, existe a necessidade de novas abordagens que possam combinar os benefícios do uso de frameworksselecionadas com características de-sejáveis e combiná-los com CDRs corretamente dobradas, por exemplo, derivados de repertórios naturais.
[0012]Todas as abordagens descritas para gerar bibliotecas de anticorpos, quer por captura de sequências de anticorpos naturalmente reorganizadas ou através da geração de diversidade por meios sintéticos são limitadas pela ocorrência de mutações conduzindo a mutações do quadro para sequências não funcionais de anticorpos. Estas mutações podem surgir em várias etapas do tratamento molecular do DNA que codifica os anticorpos, tais como a ampliação da PCR e conjunto de fragmento e DNA bem como clonagem molecular. A frequência de elementos não funcionais nas bibliotecas de anticorpo varia tipicamente de 15% a 45% dependendo das estratégias empregadas para capturar ou gerar a diversidade de anticorpos (Persson MA e outros, Proc Natl Acad Sci USA. 1991 15 março; 88 ( 6):2432-6; Schoonbroodt S, e outros, Nucleic Acids Res. 19 de maio de 2005; 33 (9): e81; Sõderling E e outros, Nat Biotechnol. agosto de 2000; 18 (8):852-6;. Rothe e outros, J Mol Biol. 29 de fev. de 2008; 376 (4): 1182-200). A frequência das sequências de codificação de anticorpos não funcionais tem um grande impacto sobre o processo de identificação de anticorpos. Primeiro, o tamanho funcional da biblioteca é reduzido e, em razão dos clones não funcionais frequentemente apresentarem uma vantagem de desenvolvimento durante a propagação das bibliotecas os quais se expandem rapidamente e podem comprometer o processo de identificação dos candidatos de anticorpos (De Bruin R e outros. Nat Biotechnol, 17 de abril de 1999: 397-399). Estas questões são reconhecidas como sérias limitações para explorar plenamente o potencial das bibliotecas de anticorpos. A geração de bibliotecas altamente funcionais permanece um desafio no campo e promoveu muitos esforços para melhorar o processo. Por exemplo, estratégias de múltipla diversificação visando imitar o emprego dos aminoácidos encontrados nas sequências naturais de CDR vêm sendo utilizados, a fim de amostrar de forma mais eficaz a enorme diversidade de combinação de sequência possível codificada por CDRs sintéticas (de Kruif J e outros, J. Mol. Biol., 21 de abril de 1995; 248 (1):97-105; Sidhu SS e outros, J. Mol. Biol., 23 de abril de 2004; 338 (2) :299-310). Outra abordagem se refere à limpeza da biblioteca inicial, a fim de remover clones não funcionais em detrimento potencial de perda de diversidade. Isto vem sendo aplicado à pré-seleção de repertórios sintéticos, por ligação da biblioteca de anticorpos a um ligante genérico. Esta etapa permitiu o enriquecimento dos elementos da biblioteca que são capazes de expressar e dobrar corretamente e podem ser usados para recriar uma biblioteca mais funcional (Winter e Tomlinson, EUA 6.696.245 B2). Independentemente da abordagem a qualidade de qualquer biblioteca depende da eficiência dos métodos de biologia molecular aplicados para gerar a biblioteca e, geralmente, levam de 15% a 45% elementos não funcionais da biblioteca. Existe, portanto, a necessidade de abordagens novas e altamente eficientes que minimizem a frequência de genes não funcionais, devido às mudanças do quadro introduzidos durante as etapas de clonagem molecular e que maximizam a funcionalidade das bibliotecas por captura das regiões de CDR apresentando uma alta propensão de serem corretamente dobradas nos frameworksde anticorpo com propriedades desejáveis. Além disso, existe uma necessidade de abordagens que permitam a captura das sequências da CDR a partir de um repertório imune de animais em um contexto terapeuticamente útil, tais como, frameworksde anticorpo humano, a fim de aperfeiçoar o processo de geração de anticorpos de alta afinidade.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0013]A presente invenção fornece métodos de geração de bibliotecas de sequências de ácidos nucléicos que combinam as vantagens da seleção de frameworkestável e a inserção de regiões determinantes de complementaridade naturalmente codificadas (CDRs) ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR, as quais foram selecionadas em um contexto natural de um polipeptídeo funcional, tal como, um anticorpo. O método permite a recuperação de CDRs longas ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR, as quais são muito difíceis de serem codificadas usando abordagens sintéticas. Esta invenção, combinando frameworksestáveis e CDRs corretamente dobradas, ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR, maximiza a proporção de anticorpos funcionais na biblioteca e, portanto, o desempenho do processo de seleção e a qualidade dos clones selecionados. A invenção fornece um método para capturar CDRs naturalmente expressas de diferentes espécies e inserção das mesmas em frameworkde anticorpos humanos. Isto permite o uso de repertórios de CDR H3 que diferem significativamente em comprimento e composição em relação ao repertório humano. A invenção permite a geração de fragmentos de anticorpos humanos apresentando repertórios estruturais derivadas de outras espécies e, portanto, a capacidade de amostrar diferentes espaços estruturais. Os presentes métodos são também usados para introduzir CDRs de origem sintética ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR com uma fre- qüência maior sucesso que métodos alternativos introduzindo alguns erros que causam mudanças do quadro na sequência de codificação. As bibliotecas geradas usando os presentes métodos contêm uma alta freqüência de variantes funcionais. As bibliotecas de variantes geradas de acordo com este método são usadas para a seleção e classificação com qualquer tecnologia de exibição, seleção e classificação descrita.
[0014]A análise dos repertórios imunológicos de diferentes espécies, ou, dentro de uma espécie, em diferentes estágios de desenvolvimento revelou algumas diferenças marcantes nas características de composição de CDR H3 e comprimento. Por exemplo, o comprimento médio de CDRH3 em humanos é maior em adultos quando comparada à vida do feto ou do recém-nascido (Schroeder Jr, HW e outros, 2001 Sangue 98; 2745-2751). Curiosamente, apesar da grande semelhança entre os genes germinativos de anticorpos humanos e primatas, a evolução do comprimento de CDRH3 durante o desenvolvimento difere (Link JM e outros. Molecular Immunol. 2005 42; 943-955). A comparação das sequências CDR H3 encontradas em camundongos e humanos mostra claramente que o comprimento médio é significativamente menor em camundongos (Rock EP e outros, J Exp Med 1994 179;. 323-328). Durante o desenvolvimento inicial de células B na medula óssea, o comprimento médio de CDRH3 aumenta nos camundongos, considerando-se que, tende a diminuir em seres humanos e, além disso, a composição de aminoácidos dos repertórios de CHRH3 de humanos e murinos difere (Zemlin M e outros., 2003 J Mol Biol 334, 733- 749; Ivanov I e outros, 2005 J Immunol 174;. 7773-7780). Estes exemplos indicam que diferentes espécies expressam diferentes faixas de repertórios de CDR H3 apesar do fato de que eles são globalmente expostos às classes de antígenos semelhantes e o significado biológico destas observações ainda precisa ser mais bem estudado. Tem sido demonstrado que a forma do sítio de combinação de anticorpos dirigidos contra antígenos pequenos, tais como, haptenos ou peptídeos difere daqueles direcionados contra proteínas grandes e a forma do sítio de combinação é ditada pelo comprimento e composição das CDRs (Collis A e outros, J Mol Biol 2003 325;. 337-354). A partir dessas verificações pode ser antecipado que o repertório de CDRH3 expresso por diferentes espécies apresenta diferentes propensões para reagir eficazmente contra as diferentes classes alvo.
[0015]Os métodos e bibliotecas de anticorpos contidos no presente documento são projetados para explorar os vários repertórios expressos por diferentes espécies para a geração de anticorpos terapêuticos. Esses repertórios que exploram diferentes espaços tridimensionais poderiam permitir a geração de anticorpos contra uma ampla variedade de classes alvo e epitopos. Métodos para gerar bibliotecas que formam animais imunizados ou não desafiados anteriormente são bem descritos e estes métodos permitem a captura dos repertórios correspondentes e a geração de anticorpos. No entanto, anticorpos derivados dessas bibliotecas não são de origem humana e, portanto, não são adequados para terapia humana sem a realização de trabalho de construção, tal como, humanização. Portanto, existe a necessidade de novos métodos para aproveitar a diversidade expressa no repertório de diferentes espécies e explorar essa diversidade no contexto terapêutico útil de um anticorpo humano.
[0016]Os métodos e bibliotecas de anticorpos fornecidos no presente documento abrangem várias das limitações descritas acima e representam um aperfeiçoamento em relação à técnica atual. Primeiro, os métodos fornecidos no presente documento combinam os benefícios da seleção de frameworkestável e a inserção de CDRs naturalmente codificadas que foram selecionadas em um contexto natural de um anticorpo funcional. Em segundo lugar, os métodos permitem uma inserção al-tamente eficiente de sequências de CDRs sintéticas ou naturais em um framework de anticorpos que minimiza significativamente o número de mudanças na biblioteca e, portanto, melhora a sua qualidade. Finalmente, a invenção permite uma nova maneira de usar a diversidade estrutural dos anticorpos que ocorre naturalmente por captura de repertórios de CDR H3 expressos naturalmente de diferentes espécies e inserção dos mesmos nos frameworksde anticorpos humanos. Assim, é possível explorar esses repertórios estruturalmente diferentes de forma produtiva de modo a gerar anticorpos para terapia humana.
[0017]Os métodos providos no presente documento geram anticorpos que contêm um frameworkestável e CDRs dobradas corretamente ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de um CDR. Os métodos capturam a diversidade natural de sequências em frameworksestáveis.
[0018]Nos métodos fornecidos no presente documento, as sequências ger- minativas para regiões framework1, 2 e 3 (FR1, FR2 e FR 3) são selecionadas a partir do organismo desejado, por exemplo, a partir do genoma humano (vide, por exemplo, figuras 2 e 6). Em uma modalidade deste método, os domínios variáveis de anticorpo selecionados são modificados através da introdução de uma sequência de fragmento principal (“stuffer sequence”) que servirá como um sítio de integração para sequências diversificadas. A diversidade é introduzida na sequência fora da região de codificação da imunoglobulina através da introdução de sítios de reconhecimento da enzima de restrição, por exemplo, tipo de sítios de restrição do Tipo lis, em um local desejado, tal como uma região determinante de complementaridade 3 de cadeia pesada variável (CDR H3), região determinante de complementaridade 3 de cadeia leve variável (CDR L3), a região determinante de complementaridade 1 da cadeia pesada variável (CDR H1), a região determinante de complementaridade 1 da cadeia leve variável (CDR L1), a região determinante de complementaridade 2 da cadeia pesada variável (CDR H2), a região determinante de complementaridade 2 da cadeia leve variável (CDR L2). Enquanto os exemplos fornecidos no presente documento demonstram a diversidade na região CDR3 (na região da cadeia pesada variável e/ou região da cadeia leve variável), entende-se que a diversidade pode ser alcançada em qualquer local desejado, tais como, porém não limitado à região CDR1 (na região de cadeia pesada variável e/ou região de cadeia leve variável) ou à região CDR2 (na região de cadeia pesada variável e/ou região de cadeia leve variável). Sequências de DNA diversificadas são geradas com sequências de flanquea- mento que incluem sítios de restrição do Tipo lis. Nos métodos fornecidos no presente documento, as extremidades coesas geradas pelas enzimas de restrição são compatíveis e o quadro de leitura é mantido, permitindo assim que os fragmentos de DNA diversificados sejam ligados em um aceptor de framework (“Acceptor Framework’).
[0019]Os métodos fornecidos no presente documento também são úteis para a geração de sequências de aminoácidos apresentando regiões diversificadas codificadas nas mesmas. Por exemplo, nos métodos providos no presente documento, as sequências para as porções não diversificadas do aminoácido codificado são selecionadas a partir do organismo desejado, por exemplo, a partir da sequência humana. Uma porção da sequência de aminoácido codificado é modificada através da introdução de uma sequência de filamento principal que servirá como um sitio de integração para sequências diversificadas. A diversidade é introduzida na sequência no(s) local(s) desejado (s) através da introdução de sítios de reconhecimento da enzima de restrição, por exemplo, sítios de restrição lis, em um local desejado dentro da sequência de aminoácido codificada. Sequências de DNA diversificadas são geradas com sequências de flanqueamento que incluem sítios de reconhecimento do Tipo lis. Nos métodos providos no presente documento, as extremidades coesas geradas pelas enzimas de restrição são compatíveis e o quadro de leitura é mantido, permitindo assim que os fragmentos de DNA diversificados sejam ligados em um aceptor de framework.
[0020]Nos métodos fornecidos no presente documento, um “Aceptor de Framework'é gerado através do emprego de um "fragmento principal" do DNA que contém e, de preferência, delimitado por dois sítios de enzima de restrição do Tipo Ils. (Vide, por exemplo, a figura 6). De preferência, estes dois sítios de enzima de restrição do Tipo lis digerem sequências no limite do sítio no qual a diversidade é desejada, tais como, região CDR H3, região CDR L3, região CDRH1, região CDR L1, região CDR H2 ou região CD L2. Conforme empregado no presente documento, o termo “Aceptor de Framework’se refere a uma sequência de ácidos nucléicos que inclui as sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões FR1, FR2, FR 3 e FR4, as sequências de ácidos nucléicos codificando duas CDRs ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel dessas CDRs, e um "fragmento principal" que serve como sítio de integração para a sequência de ácidos nucléicos diversificada. Por exemplo, nas modalidades onde a diversidade na região CDR3 (na região da cadeia pesada variável e/ou da região da cadeia leve variável) é desejada, o Aceptor de Frameworkinclui a sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões FR1, FR2, FR 3 e FR4, as sequências de ácidos nucléicos que codificam as regiões CDR1 e CDR2 e um "fragmento principal" que serve como sítio de integração para a sequência de ácidos nucléicos diversificada. Por exemplo, nas modalidades onde a diversidade na região CDR2 (na região da cadeia pesada variável e/ou da região da cadeia leve variável) é desejada, o Aceptor de Frameworkinclui as sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões FR1, FR2, FR 3 e FR4, as sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR1 e CDR3, e um "fragmento principal" que serve como sítio de integração para a sequência de ácidos nucléicos diversificada. Por exemplo, nas modalidades onde a diversidade na região CDR1 (nas regiões de cadeia pesada variável e/ou regiões de cadeia leve variável) for desejada, o Aceptor de Frameworkinclui as sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões FR1, FR2, FR 3 e FR4, as sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR2 e CDR3, e um "fragmento principal" que serve como o sítio de integração para a sequência de ácidos nucléicos diversificada.
[0021]Os termos "fragmento principal", "fragmento principal de DNA" e "sequência de fragmento principal" ou qualquer variação gramatical dos mesmos são empregados como sinônimos no presente documento para se referir a uma sequência de ácidos nucléicos, que inclui pelo menos dois sítios de reconhecimento do Tipo IIs e uma sequência diversificada. O Aceptor de Frameworkpode ser um Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH), ou um Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável (VL). O uso de Aceptor de Frameworke dos fragmentos principais nele contidos permite a integração de uma sequência de CDR (natural ou sintética) ou uma sequência de aminoácidos que pode cumprir o papel da CDR no aceptor de frameworksem nucleotídeos de frameworkdoadores ou resíduos contidos ou necessários a esta integração. Por exemplo, o uso de Aceptores de Frameworkse de fragmentos principais neles contidos permite a integração de uma sequência de CDR (natural ou sintética) selecionada de CDR H3, CDR L3, CDR H2, CDR L2, CDR H1 e CDR L1, ou uma sequência de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR selecionada de CDR H3, CDR L3, CDR H2, CDR L2, CDR H1 e CDR L1 no aceptor de frameworksem nucleotídeos de frameworkdoadores ou resíduos nele contido ou necessários para a integração. Assim, na integração, o fragmento principal é removido na íntegra, e a região de codificação da proteína receptora e os fragmentos de proteínas inseridos (isto é, CDRs) estão intactos.
[0022]Os métodos fornecidos no presente documento empregam iniciadores que são projetados para conter sítios de clivagem para enzimas de restrição do Tipo Ils no limite do sítio no qual a diversidade é desejada, por exemplo, a região CDR H3, a região CDR L3, a região CDR H2, a CDR L2, a região CDR H1 ou a região CDR L1. Clones de CDR aleatórios, ocorrendo naturalmente (vide, por exemplo, a figura 10) ou sequências de CDR sintéticas (vide, por exemplo, Exemplo 6) ou se-quências de aminoácidos que podem cumprir o papel da CDR são capturados nos Aceptores de Frameworksempregados no presente documento. Por exemplo, nas modalidades em que a diversidade na região CDR3 (na região de cadeia pesada variável e/ou na região de cadeia leve variável) for desejada, clones de CDR3 aleatórios, que ocorrem naturalmente (vide, por exemplo, a figura 10) ou sequências sintéticas de CDR3 (vide, por exemplo, Exemplo 6) ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR3 são capturados no Aceptor de Frameworks usados no presente documento. Por exemplo, nas modalidades em que a diversidade na região CDR2 (na região de cadeia pesada variável e/ou na região de cadeia leve variável) for desejada, clones de CDR2 aleatórios, que ocorrem naturalmente (vide, por exemplo, métodos mostrados na figura 10) ou sequências sintéticas de CDR2 (vide, por exemplo, métodos mostrados no Exemplo 6) ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR2 são capturados nos Aceptores de Frameworksempregados no presente documento. Por exemplo, nas modalidades em que a diversidade na região CDR1 (na região de cadeia pesada variável e/ou na região de cadeia leve variável) for desejada, clones de CDR1 aleatórios, que ocorrem naturalmente (vide, por exemplo, métodos mostrados na Figura 10) ou sequências sintéticas de CDR1 (vide, por exemplo, métodos mostrados no Exemplo 6) ou sequências de aminoácidos que podem cumprir o papel de uma CDR1 são capturados nos Aceptores de Frameworksusados no presente documento. Como exemplo foram projetados oligonucleotídeo iniciadoress específicos para regiões de flan- queamento da sequência de DNA que codificam a CDR H3 das imunoglobulinas, ou seja, específicos para o FR 3 e FR4 da região variável. Oligonucleotídeo iniciadoress específicos para regiões de flanqueamento das sequências de DNA codificando outras regiões, tais como, por exemplo, a CDR L3, CDR H1, CDR L1, CDR H2, ou CDR L2, também podem ser projetados. Estes oligonucleotídeos contêm em sua extremidade 5' um sítio para uma enzima de restrição do Tipo lis considerando-se que sua porção 3' emparelha a sequência de DNA alvejada.
[0023]Em algumas modalidades, o iniciador é um ácido nucléico selecionado do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 120-254.
[0024]Qs métodos providos no presente documento empregam enzimas de restrição do Tipo lis, tais como, por exemplo, Fokl, para inserir sequências de CDR naturais, como, por exemplo, sequências naturais de CDR H3, CDR L3, CDR H1, CDR L1, CDR H2 ou de CDR L2 nos Aceptores Frameworksdescritos no presente documento. Os métodos providos no presente documento empregam enzimas de restrição do Tipo IIs, tais como, por exemplo, Fokl, para inserir sequências sintéticas de CDR, como, por exemplo, sequências sintéticas de CDR H3, CDR L3, CDR H1, CDR L1, CDR H2 ou CDR L2 nos Aceptores Frameworksdescritos no presente documento. Os métodos providos no presente documento empregam enzimas de restrição do Tipo lis, tais como, por exemplo, Fokl, para inserir sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR desejada, como, por exemplo, uma sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região natural ou sintética CDR H3, CDR L3, CDR H1, CDR L1, CDR H2 ou CDR L2 nos Aceptores Frameworksdescritos no presente documento. As enzimas de restrição do tipo Ils são enzima que clivam fora de sua sequência de reconhecimento para um lado. Essas enzimas apresentam tamanhos intermediários, tipicamente 400- 650 aminoácidos de comprimento e reconhecem sequências que são contínuas e assimétricas. Enzimas de restrição do Tipo lis adequadas, também conhecidas como endonucleases de restrição do Tipo Ils, e as sequências que as mesmas identificam são descritas, por exemplo, em Szybalski e outros,. "Class-IIS Restriction Enzymes - a Review”. Gene, vol. 100: 13-26 (1991), o conteúdo do mesmo sendo incorporado em sua totalidade como referência.
[0025]Bibliotecas primárias incluem um Aceptor de Frameworkde VH e uma sequência VL fixa (também referida como uma sequência “fictícia VL”) ou um Aceptor de Frameworkde VL e uma sequência VH fixa (também referida como uma sequência “fictícia VH”). Assim, Bibliotecas Primárias apresentam diversidade em apenas uma das cadeias leve ou pesada. As bibliotecas secundárias são geradas por ligação de um Aceptor de Frameworkde VH e um Aceptor de Frameworkde VL em conjunto (vide, por exemplo, Exemplo 7). Bibliotecas secundárias têm a diversidade em ambas as cadeias pesada e leve.
[0026]A invenção fornece métodos para a produção de uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de cadeia pesada da muno globulina humana contendo várias regiões 3 determinantes de complementaridade de cadeia pesada (CDR H3) isoladas do repertório de domínio variável de uma imunoglobulina a partir de espécie não-humana. Em algumas modalidades, o método inclui as etapas de: (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina humana distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcompreendendo uma primeira região framework(FR1), uma segunda região framework(FR2), uma terceira região framework(FR 3), uma quarta região framework(FR4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma re- gião determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamen-to principal compreendendo pelo menos dois sítios de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR H3) de cadeia pesada isoladas do repertório de imunoglobulina de espécie não-humana, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados compreende um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR H3 utilizando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de filamento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkusando uma enzima de restrição do Tipo IIs que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR H3 ou as sequências de aminoácidos da etapa (c) no Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c), tal que, as regiões FR 3 e FR4 são intercaladas por sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR H3 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR3 e as sequências codificando um domínio variável de imunoglobulina completo que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b) são restauradas.
[0027]Em algumas modalidades, a etapa (b) como definida acima é realizada através da ampliação da sequência da CDR H3 de uma espécie não-humana utilizando iniciadores contendo um sítio de restrição do tipo lis. Em algumas modalidades, a etapa (b) como definida acima é realizada através da ampliação da sequência da CDR H3 de uma espécie não-humana utilizando iniciadores contendo um sítio de restrição Fokl Ils. Em algumas modalidades, a espécie não-humana se constitui em primatas não-humanos, roedores, caninos, ovinos, felinos, caprinos, bovino, equinos ou suínos.
[0028]A invenção fornece métodos para produzir uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável da imunoglobulina por (a) fornecimento de uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulinas distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework,incluindo uma primeira região framework(FR1), uma segunda região framework(FR2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR4), onde as regiões FR 1 e FR 2 estão intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR2 e FR 3 estão intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2), e a regiões FR 3 e FR4 estão intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal contendo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; (b) fornecer uma pluralidade de regiões de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando a região determinante de complementaridade 3, regiões (CDR3) ou codificação das sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3, onde cada uma das várias das sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis, em cada extremidade; (c) digestão de cada uma das várias sequências de ácidos nucléicos que codificam as regiões CDR3 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 usando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos do fragmento principal da etapa (a) do Aceptor de Framework usando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis da (a) e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridas codificando as regiões CDR3 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 da etapa (c) no Aceptor de Framework Acceptor digerido da etapa (c) tal que as regiões FR 3 e FR4 estão intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR3 ou a se-quência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR3 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando as sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b) são restaurados .
[0029]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, o sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento BSAI, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[0030]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada a partir de VH 1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5-51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada a partir de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é um sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada a partir VL1 -44 e VL1 -51.
[0031]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos codifica regiões de CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências ocorrendo naturalmente ou sequências derivadas de animais imunizados.
[0032]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências CDR3 ocorrendo naturalmente, sequências de lg dos seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências lg ocorrendo naturalmente de um mamífero, sequências ocorrendo naturalmente de região de alça de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificadas.
[0033]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR3, e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que tenham sido expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0034]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificada codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3, e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0035]Em outra modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3, e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0036]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de pelo menos uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e pelo menos uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
[0037]Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem desde a etapa adicional de (e) transformação do vetor de expressão da etapa (d) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira em condições suficientes para expressar a pluralidade de sequências do Aceptor de Framework.Por exemplo, a célula hospedeira é E.colí. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemídeo. Por exemplo, o vetor é fagemídeo pNDS1.
[0038]A invenção também fornece métodos para produção de uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável da imunoglobulina, por (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Acceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR1), uma segunda região framework(FR2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR4), onde as regiões FR 1 e FR 2 estão intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal incluindo, pelo menos, dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória, as regiões FR2 e FR 3 estão intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2), e as regiões FR 3 e FR4 estão intercaladas por uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando regiões 1 determinantes de complementaridade, regiões (CDR1) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima e restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR1 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 empre- gando uma enzima de restrição do Tipo Ils, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkempregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimen-to da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR1 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR1 ou a se-quência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR1 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapas (a) e (b) são restaurados.
[0039]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo IIs são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[0040]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[0041]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências ocorrendo naturalmente ou sequências derivadas de animais imunizados.
[0042]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR1 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificados.
[0043]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0044]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0045]Em outra modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéti- cas.
[0046]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) pelo menos uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
[0047]Em algumas modalidades, os métodos providos incluem as etapas adicionais de (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca. Por exemplo, a célula hospedeira é E. colí. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fage- mídeo. Por exemplo, o vetor fagemideo é pNDS1.
[0048]A invenção também fornece métodos para produção de uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina, por (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 2, regiões (CDR2) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR2 ou sequências de ami-noácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkempregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR2 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 da etapa (c) ao Aceptor de Framework digerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR2 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR2 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo IIs da etapas (a) e (b) são restaurados.
[0049]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[0050]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[0051]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências ocorrendo naturalmente ou sequências derivadas de animais imunizados.
[0052]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR2 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificadas.
[0053]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0054]Em outra modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0055]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
[0056]Em algumas modalidades, os métodos providos incluem as etapas adicionais de (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca. Por exemplo, a célula hospedeira é E. coli. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fage- mídeo. Por exemplo, o vetor fagemideo é pNDS1.
[0057]A invenção também fornece métodos para fabricação de um anticorpo específico para alvo, região variável de anticorpo ou uma porção do mesmo, por (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região fra-mework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de áci-dos nucléicos aleatória; (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nu- cléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 3, regiões (CDR3) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR3 ou sequências de ami-noácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal da etapa (a) empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); (d) clonagem das sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR3 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 em um vetor de expressão e ligando as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR3 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 da etapa (c) no Aceptor de Framework,tal que, as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR3 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR3 e uma sequência de codificação gênica variável de imunoglobulina completa são restauradas; (e) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar a pluralidade de sequências de Aceptor de Framework,(f) contato da célula hospedeira com um antígeno alvo; e (g) determinação de quais sequências expressas de Aceptor de Frameworkse ligam ao antígeno alvo.
[0058]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo Ils da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reco-nhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[0059]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[0060]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências ocorrendo naturalmente ou sequências derivadas de animais imunizados.
[0061]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR3 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificados.
[0062]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0063]Em outra modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0064]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
[0065]Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemí- deo. Por exemplo, o vetor fagemídeo é pNDS1. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli.
[0066]Em algumas modalidades, o método inclui a etapa adicional de (i) se- quenciamento do domínio variável de imunoglobulina codificando sequências que se ligam ao antígeno alvo.
[0067]A invenção também fornece métodos para fabricação de um anticorpo específico para alvo, região variável de anticorpo ou uma porção do mesmo, por (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região fra-mework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória, as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma região determinante de comple-mentaridade 3 (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 1, regiões (CDR1) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima de restri-ção do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR1 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal da etapa (a) empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); (d) clonagem das sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR1 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 em um vetor de expressão e ligando as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR1 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 da etapa (c) no Aceptor de Framework,tal que, as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR1 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR1 e uma sequência de codificação gênica variável de imunoglobulina completa é restaurada; (e) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar a pluralidade de sequências de Aceptor de Framework,(f) contato da célula hospedeira com um antígeno alvo; e (g) determinação de quais sequências expressas de Aceptor de Frameworkse ligam ao antígeno alvo.
[0068]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[0069]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[0070]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências ocorrendo naturalmente ou sequências derivadas de animais imunizados.
[0071]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR1 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificados.
[0072]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0073]Em outra modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0074]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
[0075]Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemí- deo. Por exemplo, o vetor fagemídeo é pNDS1. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. colí.
[0076]Em algumas modalidades, o método inclui a etapa adicional de (i) se- quenciamento do domínio variável de imunoglobulina codificando sequências que se ligam ao antígeno alvo.
[0077]A invenção provê métodos para fabricação de um anticorpo específico para alvo, região variável de anticorpo ou uma porção do mesmo, por (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodifi- cando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 2, regiões (CDR2) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR2 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 empregando uma enzima de restrição do Tipo IIs, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo IIs da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkempregando uma enzima de restrição do Tipo IIs, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo IIs da etapa (a); (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR2 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR2 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR2 e domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restri- ção do Tipo Ils da etapas (a) e (b) são restaurados; (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão; (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca; (g) contato da pluralidade de domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (f) com um antígeno alvo; e (h) determinação de quais sequências de codificação de domínio variável de imunoglobulina expressas se ligam ao antígeno alvo.
[0078]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[0079]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[0080]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências ocorrendo naturalmente ou sequências derivadas de animais imunizados.
[0081]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR2 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificados.
[0082]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0083]Em uma modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0084]Em outra modalidade, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[0085]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde ca- deia leve variável.
[0086]Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemídeo. Por exemplo, o vetor fa- gemídeo é pNDS1.
[0087]Em algumas modalidades, o método inclui a etapa adicional de (i) se- quenciamento do domínio variável de imunoglobulina codificando sequências que se ligam ao antígeno alvo.
[0088]A invenção também fornece métodos para produção de uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina. Esses métodos incluem as etapas de (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg dentro das quais uma fonte de diversidade é introduzida em uma região determinante de complementaridade simples (CDR) selecionada do grupo consistindo na região determinante de complementaridade 1 (CDR1), região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e região determinante de complementaridade 3 (CDR3), onde a sequência de Aceptor de Frameworkde lg inclui a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do tipo lis e onde a fonte de diversidade é uma CDR selecionada de sequências de CDR ocorrendo naturalmente que contêm sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo IIs fora da região CDR, (b) introdução de uma fonte de diversidade dentro de cada Aceptor de Frameworkde lg por digestão de ambos a fonte de diversidade e Aceptor de Frameworksde lg com uma enzima de restrição do Tipo lis; e (c) ligação da fonte digerida de diversidade no Aceptor de Frameworkde lg, tal que, sequências codificando um domínio variável de imunoglobulina completo que não contém os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b) são restauradas.
[0089]As sequências de região CDR que ocorrem naturalmente não são substancialmente alteradas de seu tipo selvagem, isto é, estado natural. Estas sequências de região CDR ocorrendo naturalmente são flanqueadas por sequências de aminoácidos que foram construídas (ou de outra forma manipuladas artificialmente) para conter dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do tipo Ils, com um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do tipo lis em cada lado da se-quência de região CDR ocorrendo naturalmente. Os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis estão fora da região de codificação de CDR. A sequência das regiões CDR são inalteradas nos limites da região de codificação de CDR - as enzimas de restrição reconhecem e se dividem em uma região que está acima dos limites da região de codificação de CDR, porém não se dividem dentro da região de codificação da CDR.
[0090]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e flanqueando as sequências de CDR ocorrendo naturalmente são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e flanqueando as sequências de CDR ocorrendo naturalmente são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[0091]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg é derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[0092]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências selecionadas de sequências de CDR3 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificados.
[0093]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente codifica regiões CDR3 e o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0094]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências selecionadas de sequências de CDR1 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificados.
[0095]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente codifica regiões CDR1 e o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências de imunoglobulina que ocorrem natu- ralmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0096]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências selecionadas de sequências de CDR2 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[0097]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente codifica regiões CDR2 e o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[0098]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg inclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework de cadeia leve variável (VL).
[0099]Em algumas modalidades, os métodos providos incluem as etapas adicionais de (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca. Por exemplo, a célula hospedeira é E. colí. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fage- mídeo. Por exemplo, o vetor fagemideo é pNDS1.
[00100]A invenção também fornece métodos para produção de uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina. Esses métodos incluem as etapas de (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg dentro das quais uma fonte de diversidade é introduzida em uma região determinante de complementaridade simples (CDR) selecionada do grupo consistindo na região determinante de complementaridade 1 (CDR1), região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e região determinante de complementaridade 3 (CDR3), onde a sequência de Aceptor de Frameworkde lg inclui a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do tipo lis e onde a fonte de diversidade é uma CDR selecionada de sequências de CDR produzidas sinteticamente que contêm sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis fora da região CDR, (b) introdução de uma fonte de diversidade dentro de cada Aceptor de Frameworkde lg por digestão de ambos a fonte de diversidade e o Aceptor de Frameworkde lg com uma enzima de restrição do Tipo IIs; e (c) ligação da fonte digerida de diversidade no Aceptor de Frameworkde lg, tal que, sequências codificando um domínio variável de imunoglobulina completo que não contém os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b) são restauradas.
[00101]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e as sequências de CDR produzidas sinteticamente são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e as sequências de CDR produzidas sinteticamente são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[00102]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg é derivada de uma sequência humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[00103]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00104]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00105]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00106]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework de lg inclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework de cadeia leve variável.
[00107]Em algumas modalidades, os métodos providos incluem as etapas adicionais de (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca. Por exemplo, a célula hospedeira é E. coli. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemídeo. Por exemplo, o vetor fagemídeo é pNDS1.
[00108]A invenção também fornece métodos para obtenção de um polipeptídeo de imunoglobulina. Esses métodos incluem as etapas de (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg dentro das quais uma fonte de diversidade é introduzida em uma região determinante de complementaridade simples (CDR) selecionada do grupo consistindo na região determinante de complementaridade 1 (CDR1), região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e região determinante de complementaridade 3 (CDR3), onde a sequência de Aceptor de Frameworkde lg inclui a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do tipo lis e onde a fonte de diversidade é uma CDR selecionada de sequências de CDR ocorrendo naturalmente que contêm sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis fora da região CDR, (b) introdução de uma fonte de diversidade dentro de cada Aceptor de Frameworkde lg por digestão de ambos a fonte de diversidade e o Aceptor de Frameworkde Igs com uma enzima de restrição do Tipo IIs; (c) ligação da fonte digerida de diversidade no Aceptor de Frameworkde lg tal que, uma sequência codificando gene variável de imunoglobulina completa é restaurada; e (d) clonagem da sequência codificando gene variável de imunoglobulina completa da etapa (c) em um vetor de expressão; e (e) transformação do vetor de expressão da etapa (d) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar as sequências codificando gene de imunoglobulina completas que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo IIs sendo restauradas.
[00109]Nestas modalidades, as sequências de região CDR que ocorrem naturalmente não são substancialmente alteradas de seu tipo selvagem, isto é, estado natural. Estas sequências de região CDR ocorrendo naturalmente são flanqueadas por sequências de aminoácidos que foram construídas (ou de outra forma manipuladas artificialmente) para conter dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do tipo Ils, com um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do tipo lis em cada lado da sequência de região CDR ocorrendo naturalmente.
[00110]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e flanqueando as sequências de CDR ocorrendo naturalmente são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e flanqueando as sequências de CDR ocorrendo naturalmente são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[00111]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3- 15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[00112]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências selecionadas de sequências de CDR3 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00113]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente codifica regiões CDR3 e o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00114]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências selecionadas de sequências de CDR1 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00115]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente codifica regiões CDR1 e o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00116]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui ou é derivado de sequências selecionadas de sequências de CDR2 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00117]Em algumas modalidades, o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente codifica regiões CDR2 e o conjunto de ácidos nucléicos ocorrendo naturalmente inclui sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00118]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework de cadeia leve variável.
[00119]Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemídeo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli.
[00120]Em algumas modalidades, o método também inclui as etapas de contato da célula hospedeira com um antígeno alvo e determinação de quais sequências de codificação de gene variável de lg completas expressas se ligam ao antígeno alvo, desta forma identificando anticorpos específicos alvo, região variável de anticorpos ou suas porções. Em algumas modalidades, o método inclui a etapa adicional de (i) sequenciamento do domínio variável de imunoglobulina codificando sequências que se ligam ao antígeno alvo.
[00121]A invenção também fornece métodos para obtenção de um polipeptídeo de imunoglobulina. Esses métodos incluem as etapas de (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg dentro das quais uma fonte de diversidade é introduzida em uma região determinante de complementaridade simples (CDR) selecionada do grupo consistindo na região determinante de complementaridade 1 (CDR1), região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e região determinante de complementaridade 3 (CDR3), onde a sequência de Aceptor de Frameworkde lg inclui a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do tipo lis e onde a fonte de diversidade é uma CDR selecionada de sequências de CDR produzidas sinteticamente que contêm sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis fora da região CDR, (b) introdução de uma fonte de diversidade dentro de cada Aceptor de Frameworkde lg por digestão de ambos a fonte de diversidade e o Aceptor de Frameworkde lg com uma enzima de restrição do Tipo lis ; (c) ligação da fonte digerida de diversidade no Aceptor de Framework de lg tal que, uma sequência codificando gene variável de imunoglobulina completa é restaurada; (d) clonagem do Aceptor de Frameworkde lg ligado da etapa (c) em um vetor de expressão; e (e) transformação do vetor de expressão da etapa (d) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar as sequências codificando gene de imunoglobulina completa que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são restauradas.
[00122]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e as sequências de CDR produzidas sinteticamente são reconhecidos pela mesma enzima de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis dentro das sequências de ácidos nucléicos de filamento principal e as sequências de CDR produzidas sinteticamente são reconhecidos por diferentes enzimas de restrição do Tipo lis. Por exemplo, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento Fokl, sítios de reconhecimento Bsal, e/ou sítios de reconhecimento BsmBI.
[00123]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg é derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5- 51. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3- 15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[00124]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00125]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequên- cias sintéticas.
[00126]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00127]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde lg inclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework de cadeia leve variável.
[00128]Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemí- deo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli.
[00129]Em algumas modalidades, o método também inclui as etapas de contato da célula hospedeira com um antígeno alvo e determinação de quais sequências de codificação de gene variável de lg completas expressas se ligam ao antígeno alvo, desta forma identificando anticorpos específicos alvo, região variável de anticorpos ou suas porções. Em algumas modalidades, o método inclui a etapa adicional de (i) sequenciamento do domínio variável de imunoglobulina codificando sequências que se ligam ao antígeno alvo.
[00130]A invenção provê métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de uma espécie de mamífero. A invenção também fornece métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 2 (CDR2) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de uma espécie de mamífero. A invenção também fornece métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências da região determinante de complementaridade 1 (CDR1) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de uma espécie de mamífero.
[00131]A invenção provê métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de espécies de mamíferos não-humanos. A invenção também fornece métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 2 (CDR2) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de espécies de mamíferos não-humanos. A invenção também fornece métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequên-cias de região determinante de complementaridade 1 (CDR1) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de uma espécie de mamífero não-humano.
[00132]Em algumas modalidades, a espécie não-humana é uma espécie de primatas, roedores, caninos, felinos, camelídeos, caprinos, bovinos, equinos, um elemento da família dos Camelídeos, lhamas, camelos, dromedários ou porcos.
[00133]A invenção provê métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de um ser humano. A invenção provê métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 2 (CDR2) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de um ser humano. A invenção provê métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 1 (CDR1) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de um ser humano.
[00134]A invenção provê métodos para produção de uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas separadamente do repertório do domínio variável de imunoglobulina de uma espécie não-humana.
[00135]Em algumas modalidades, esses métodos incluem as etapas de (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina humana distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcompreendendo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal compreendendo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas a partir do repertório e imuno- globulina da espécie de mamífero, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados compreende um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR3 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkempregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR3 ou as sequências de aminoácidos da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR3 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR3 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapas (a) e (b) são restaurados. Estas etapas também podem ser realizadas empregando uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de região determinante de complementaridade 2 (CDR2) isoladas do repertório de imunoglobulina da espécie de mamífero. Estas etapas também podem ser realizadas empregando uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de região determinante de complementaridade 1 (CDR1) isoladas do repertório de imunoglobulina da espécie de mamífero.
[00136]Em algumas modalidades, a etapa (b) é realizada por ampliação da sequência de CDR3 de uma espécie de mamífero empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo iniciador é projetado para melhorar a compatibilidade entre a sequência de CDR3 de mamífero e o Aceptor de Frameworkcodificando um domínio variável de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo iniciador é designado para modificar a sequência nos limites da sequência de CDR3 de mamíferos para permitir ligação eficiente através das extremidades coesivas compatíveis no Aceptor de Frameworkcodificando um domínio variável de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades as sequências de DNA de mamíferos flanqueando as regiões CDR3 podem, não mediante clivagem pelas enzimas de restrição do Tipo lis, gerar extremidades coesivas compatíveis com as extremidades coesivas do Aceptor de Frameworkdigerido. Em tais casos, os oligonucleotídeos usados para ampliação são projetados para modificar a sequência de mamífero alvo, de modo que após clivagem com uma enzima de restrição do Tipo Ils, as extremidades coesivas são compatíveis e uma ligação eficiente pode ocorrer. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR2 de uma espécie de mamífero empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição do Tipo lis. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR1 de uma espécie de mamífero empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição do Tipo lis.
[00137]Em algumas modalidades, a etapa (b) é realizada por ampliação da sequência de CDR3 de uma espécie não-humana empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição Fokl lis. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR2 de uma espécie de mamífero empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição Fokl lis. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR1 de uma espécie de mamífero empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição Fokl lis.
[00138]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por uma enzima de restrição diferente do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento BsmBI, sítios de reconhecimento Bsal, Fokl ou uma combinação dos mesmos.
[00139]Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR3 codificam sequências de CDR3 de cadeia pesada (CDR H3). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR3 codificam sequências de CDR3 de cadeia leve (CDR L3). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR2 codificam sequências de CDR2 de cadeia pesada (CDR H2). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR2 codificam sequências de CDR2 de cadeia leve (CDR L2). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR1 codificam sequências de CDR1 de cadeia pesada (CDR H1). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR1 codificam sequências de CDR1 de cadeia leve (CDR L1).
[00140]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui ou é derivada de, pelo menos, uma porção de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1- 18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5-51. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de pelo menos uma porção de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui ou é derivada de, pelo menos, uma porção de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[00141]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcompreende uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework de cadeia leve variável.
[00142]Em algumas modalidades, os métodos descritos no presente documento também incluem as etapas de (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um fagemídeo ou vetor fago. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli.
[00143]A invenção provê métodos para produção de uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas separadamente dos domínios variáveis de imunoglobulina de uma espécie não-humana de mamíferos imunizada ou espécie de não-humanos. A invenção também fornece métodos para produção uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imu-noglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 2 (CDR2) isoladas separadamente dos domínios variáveis de imunoglobulina de um mamífero não-humano imunizado. A invenção também fornece métodos para produção de uma coletânea de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina humana incluindo uma pluralidade de sequências de região determinante de complementaridade 1 (CDR1) isoladas separadamente dos domínios variáveis de imunoglobulina de um mamífero não-humano imunizado.
[00144]Em algumas modalidades, a espécie não-humana é de primatas não- humanos, roedores, caninos, felinos, ovinos, caprinos, bovinos, equinos, membros da família Camelidae, tais como, lhama, camelo, dromedário, ou suínos.
[00145]Em algumas modalidades, os métodos incluem as etapas de (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework codificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, humanos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcompreendendo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal compreendendo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas de mamíferos não-humanos imunizados, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados compreende um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo IIs em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR3 empregando uma enzima de restrição do Tipo IIs, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo IIs da etapa (b) e digestão da sequência de ácidos nucléicos de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkempregando uma enzima de restrição do Tipo IIs, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo IIs da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR3 ou das sequências de aminoácidos da etapa (c) ao Aceptor de Fra-meworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR3 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR3 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo Ils da etapas (a) e (b) são restaurados. Estas etapas também podem ser realizadas empregando uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de região determinante de complementaridade 2 (CDR2) isoladas de mamíferos não-humanos imunizados. Estas etapas também podem ser realizadas empregando uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de região determinante de complementaridade 1 (CDR1) isoladas de mamíferos não- humanos imunizados.
[00146]Em algumas modalidades, a etapa (b) é realizada por ampliação da sequência de CDR3 de mamíferos não-humanos imunizados empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição do Tipo lis. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo iniciador é projetado para melhorar a compatibilidade entre a sequência de CDR3 de mamífero e o Aceptor de Frameworkcodificando um domínio variável de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo iniciador é designado para modificar a sequência nos limites da sequência de CDR3 de mamíferos para permitir ligação eficiente através das extremidades coesivas compatíveis no Aceptor de Frameworkcodificando um domínio variável de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades as sequências de DNA de mamíferos flanqueando as regiões CDR3 podem, não mediante clivagem pelas enzimas de restrição do Tipo lis, gerar extremidades coesivas compatíveis com as extremidades coesivas do Aceptor de Frameworkdigerido. Em tais casos, os oligonucleotí- deos usados para ampliação são projetados para modificar a sequência de mamífero alvo, de modo que após clivagem com uma enzima de restrição do Tipo Ils, as extremidades coesivas são compatíveis e uma ligação eficiente pode ocorrer. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR2 de uma espécie de mamífero não-humano imunizado empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição do Tipo lis. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR1 de um mamífero não-humano imuni- zado empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição do Tipo lis.
[00147]Em algumas modalidades, a etapa (b) é realizada por ampliação da sequência de CDR H3 de mamífero não-humano empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição Fokl lis. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR2 do mamífero não-humano empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição Fokl lis. Estas etapas também podem ser realizadas por ampliação da sequência de CDR1 do mamífero não-humano empregando oligonucleotídeo iniciadores contendo um sítio de restrição Fokl lis.
[00148]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por uma enzima de restrição diferente do Tipo lis. Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento BsmBI, sítios de reconhecimento Bsal, sítios de reconhecimento Fokl ou uma combinação dos mesmos.
[00149]Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR3 codificam sequências de CDR3 de cadeia pesada (CDR H3). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR3 codificam sequências de CDR3 de cadeia leve (CDR L3). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR2 codificam sequências de CDR2 de cadeia pesada (CDR H2). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR2 codificam sequências de CDR2 de cadeia leve (CDR L2). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR1 codificam sequências de CDR1 de cadeia pesada (CDR H1). Em algumas modalidades, as sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando sequências de CDR1 codifi- cam sequências de CDR1 de cadeia leve (CDR L1).
[00150]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui ou é derivada de, pelo menos, uma porção de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1- 18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5-51.
[00151]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui ou é derivada de, pelo menos, uma porção de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3- 15 e VK3-20. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui ou é derivada de, pelo menos, uma porção de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1-44 e VL1-51.
[00152]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcompreende uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework de cadeia leve variável.
[00153]Em algumas modalidades, os métodos também incluem as etapas de (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. colí. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um fagemídeo ou um vetor de fago.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[00154]A figura 1A é uma representação esquemática de um domínio de proteína com um frameworke alças provendo resíduos de contato com outra proteína ou molécula. Várias situações são ilustradas: um domínio de proteína estável com regiões de alça dobradas apropriadamente; alças dobradas apropriadamente inseridas em um domínio de estabilidade intrínseca limitada; um domínio de proteína intrinsecamente estável, a estabilidade do mesmo sendo afetada pelas regiões de alça.
[00155]A figura 1B é uma representação esquemática de diferentes tipos de bibliotecas de repertórios de proteínas gerados usando diferentes estratégias de diversificação.
[00156]A figura 2 é uma representação esquemática de um Aceptor de Frameworkvariável de anticorpo. As regiões framework,CDRs e sítio de restrição do Tipo lls-RM são indicados.
[00157]A figura 3 é uma representação esquemática de uma estratégia usada para captura das sequências CDR H3 de repertórios naturais.
[00158]A figura 4 é uma representação esquemática do benefício do uso de iniciadores contendo enzimas de restrição do Tipo lls-RM para a ampliação e inserção de regiões CDR naturais no Aceptor de Frameworks.
[00159]A figura 5 é uma ilustração mostrando as sequências gênicas germi- nativas do domínio variável de cadeia pesada e leve selecionadas para a geração de Aceptor de Frameworks.
[00160]A figura 6 é uma representação esquemática de uma estratégia de ampliação utilizada para a geração de Aceptor de Frameworkspor adição às sequências germ inativas de um fragmento de material e uma região FR4.
[00161]A figura 7, painel superior, é uma ilustração mostrando o detalhe da sequência de fragmentos principais do Aceptor de FrameworkVH. Sequências de DNA reconhecidas e clivadas pela enzima de restrição BsmBI estão encerradas em caixas vermelha e preta, respectivamente, e indicadas no painel inferior da figura. O quadro de leitura correspondente à sequência variável de anticorpos é sublinhado.
[00162]A figura 8 é uma ilustração mostrando as sequências de 20 Aceptor de Frameworks.
[00163]A figura 9 é uma representação esquemática do vetor pNDSI sozinho ou combinado com uma região de cadeia pesada variável fictícia ou uma região de cadeia leve variável fictícia.
[00164]A figura 10 é uma tabela que descreve as sequências de CDRH3 que foram recuperadas de uma fonte de DNAc humano e inseridas no Aceptor de Frameworkshumano.
[00165]A figura 11 é uma tabela que representa o projeto de sequências sintéticas de CDR para VH, VK e VÀ. As posições são numeradas de acordo com o esquema numérico de Kabat. A diversidade teórica da CDR usando uma estratégia de diversificação de códon definida (NNS, DVK, NVT, TVP) é indicada. As estratégias adotadas para a síntese de CDR VH são colocadas em caixas.
[00166]A figura 12 é uma representação esquemática e mostra detalhes da sequência de inserção de CDR sintética em um Aceptor de Framework.
[00167]A figura 13 é uma representação esquemática das bibliotecas Primárias e a recombinação da cadeia realizada para gerar bibliotecas Secundárias.
[00168]A figura 14 é uma representação esquemática da geração de bibliotecas Acceptor VH combinadas com bibliotecas sintéticas VL e a captura de repertórios de CDRH3 de origem humana ou não-humana.
[00169]A figura 15 é uma representação esquemática da geração de bibliotecas MnA, MiB e MiC usando o repertório de CDRH3 de um camundongo não desafiado ou camundongos imunizados com hlFNy ou hCCL5/RANTES como fonte de diversidade. O tamanho das bibliotecas é indicado nos painéis superiores. Os painéis inferiores mostram a distribuição dos comprimentos de CDRH3 encontrados nessas bibliotecas.
[00170]A figura 16 é uma série de gráficos que ilustram a titulação de saída do fago durante a seleção contra hlFNy com as bibliotecas secundárias ADI e AEI.
[00171]A figura 17 é uma série de gráficos que ilustram a titulação de saída do fago durante a seleção contra o anticorpo monoclonal 5E3 com as bibliotecas secundárias ADI e AEI.
[00172]A figura 18 é uma série de gráficos que ilustram a frequência dos comprimentos de CDR H3 encontrados nas bibliotecas AEI e ADI e após três rodadas da seleção contra o anticorpo monoclonal 5E3. A distribuição de cada comprimento de CDR H3 dentro das diferentes famílias de VH é indicada. Entretanto, quando CDR H3 apresentar um comprimento mais longo que 16 aminoácidos, as sequências de 70 bp liberadas pela plataforma de sequenciamento Ilumina não cobrirão a sequência frameworko suficiente para identificar inequivocadamente a família VHI e portanto a família VH é indicada como não determinada.
[00173]A figura 19 é uma série de gráficos mostrando a resposta de dose ELISA utilizando preparações purificadas 6 scFv contra 5E3 de camundongo ou um anticorpo de camundongo irrelevante 1A6. Os sete clones codificam diferentes scFvs. O clone A6 é scFv específico para hlFNy e foi usado como controle negativo.
[00174]A figura 20 é um gráfico que ilustra a resposta de dose ELISA utilizando preparações scFv purificadas contra hlFNy e comparadas a um scFv positivo específico para hlFNy (A6).
[00175]A figura 21 é um gráfico que ilustra o efeito inibidor de preparações scFv purificadas em um ensaio de gene repórter de luciferase acionado por hlFNy. A atividade neutralizante dos dois candidatos scFv (AD1R4P1A9 e AE14R3P2E4) foi comparada com a atividade de um controle positivo scFv (G9) e um scfv de controle negativo (Dll).
[00176]A figura 22 é um gráfico que ilustra o efeito inibidor das preparações de scFv purificadas em um ensaio de indução MHCII em resposta a hlFNy. A atividade neutralizante dos dois candidatos scFv (AD1R4P1A9 e AE14R3P2E4) foi comparada com a atividade de um scFv de controle negativo (Dll).
[00177]A figura 23 é uma série de gráficos que ilustram o efeito inibidor de dois candidatos AD1R4P1A9 e AE14R3P2E4 reformatados em IgG em um ensaio de gene repórter de luciferase acionado por hlFNy. A atividade neutralizante de duas IgGs foi comparada com a atividade de uma IgG irrelevante direcionada contra RANTES humana (NI-0701).
[00178]A figura 24 ilustra uma série de gráficos que descrevem uma resposta de dose ELISA usando IgG GI1 e DA4 contra camundongo 5E3, 5E3 de rato quimérico e o camundongo correspondente e anticorpos de isotipo de rato.
[00179]A figura 25 é uma série de gráficos ilustrando um ELISA para a detecção de 5E3 de rato em diferentes diluições de soro de camundongo IgGs GI1 an- ti-idiotípicos e DA4 como anticorpos de captura.
[00180]A figura 26 é um gráfico que ilustra as razões de saída/entrada de fago durante a seleção contra hlFNy com as bibliotecas MnA e MiB.
[00181]A figura 27 é um gráfico ilustrando as taxas de acerto obtidas em uma classificação de scFv ELISA com clones obtidos a partir das bibliotecas de MnA, MiB e MiC após cada rodada de seleção contra hlFNy. O limite foi definido para a metade do sinal obtido com o scFv controle A6.
[00182]Figura 28 é um gráfico que representa a frequência de distribuição de scFv fornecendo diferentes níveis de sinal em experimentos de ligação contra hlFNy obtido com clones derivados de bibliotecas MnA e MiB.
[00183]A figura 29 é um gráfico que ilustra resposta de dose ELISA usando preparações de scFv purificadas a partir de clones derivados das bibliotecas de MnA e MiB contra hlFNy e comparado a um scFv positivo específico para hlFNv(A6).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[00184]Bibliotecas de proteínas sintéticas e especificamente bibliotecas de anticorpos sintéticos são atraentes, uma vez que é possível durante o processo de geração da biblioteca, selecionar os blocos de construção que compõem essas proteínas sintéticas e incluir características desejadas. Uma limitação importante, no entanto, é que a aleatorização de porções destas proteínas sintéticas para gerar uma coletânea de variantes muitas vezes leva à proteínas não funcionais e, portanto, pode diminuir drasticamente o tamanho da biblioteca e seu desempenho funcional. Outra limitação da diversidade sintética é que o tamanho da biblioteca necessário para cobrir a diversidade teórica de trechos de aminoácidos aleatórios não pode ser coberto por causa de limitações práticas. Mesmo com sistemas de exibição, tais como, exibição de ribossomo, uma diversidade de 1013a 1014 pode ser gerada e amostrada, o que pode cobrir maximamente a aleatorização completa dos trechos de 9 aminoácidos. Como o tamanho médio da CDR H3 natural (também referida no presente documento como a cadeia pesada CDR3 ou VH CDR3) está acima de 9 e pode ter mais de 20 aminoácidos de comprimento, a diversidade sintética não é uma abordagem possível para gerar tais CDRs.
[00185]A combinação de métodos geralmente utilizados para a manipulação de DNA e que são empregados no curso da geração de uma biblioteca de variantes de proteínas introduz erros nas sequências de DNA. Estes erros podem levar a alterações no quadro de leitura do DNA, que já não codificará um polipeptídeo funcional. Tipicamente, as bibliotecas de anticorpos gerados usando conjunto de fragmentos de DNA por PCR e/ou clonagem de restrição contém entre 15% e 45% das sequências que não estão no quadro de leitura correto para a tradução de proteínas. Estes elementos não-funcionais da biblioteca podem comprometer a eficiência da seleção de anticorpos e do processo de identificação e são, portanto, reconhecidos como uma limitação no campo. Os métodos descritos permitem uma introdução mais robusta da diversidade em uma biblioteca de anticorpos usando uma estratégia de clonagem alternativa. Normalmente, a frequência das sequências no quadro é de aproximadamente 90%. Outra vantagem da invenção é que ela combina frameworks variáveis de anticorpo aceptor selecionado com alças de CDR que apresentam uma alta probabilidade de dobra correta. Isto permite a captura de CDRs longas que são difíceis de cobrir com abordagens de aleatorização sintética. Além disso, os métodos descritos não empregam qualquer modificação na região de codificação da variável de anticorpos aceptores para clonagem das sequências diversificadas. Outra vantagem deste método é que várias fontes de diversidade pode ser capturadas no mesmo conjunto de frameworksde anticorpos aceptores. Estas fontes incluem, mas não estão limitadas a: CDRs de anticorpos naturais de seres humanos ou outra origem, CDR de anticorpos de galinha, CDRs de moléculas semelhantes a anticorpos, tais como, VHH de camelídeos, IgNARs de tubarões, alças variáveis de receptores de células T. Além disso, CDRs naturais podem ser derivadas de animais não desafiados ou imunizados. Neste último caso, as CDRs recuperadas são enriquecidas nas sequências que foram envolvidas no reconhecimento do antígeno utilizado para imunização.
[00186]Uma característica única dos métodos descritos no presente documento é a captura eficiente das sequências de codificação da cadeia pesada CDR3 de espécie não-humana e sua inserção nas frameworksde imunoglobulina humana. Usando esses métodos, é possível, portanto, gerar anticorpos diferentes combinando sítios que são moldados pelo repertório de CDR H3 capturada de outra espécie e permitindo a amostragem de um espaço tridimensional diferente. Estes métodos permitem a geração de anticorpos humanos com novas especificidades visando uma gama diferente de classes alvo e epítopos em relação aos acessíveis a um repertório CDRH3 humano. Além disso, esses novos anticorpos codificam frameworkhumana, bem como regiões CDR1 e CDR2 e, portanto, são apropriados para terapia humana.
[00187]Neste método domínios de proteínas selecionados, conforme exemplificado pelos domínios variáveis de anticorpos, são modificados através da introdução de uma sequência de fragmento principal que servirá como um sítio de integração para sequências diversificadas. Após a integração, o fragmento principal é removido por completo, deixando intacta a região de codificação da proteína receptora e os fragmentos de proteína inseridos (isto é, as CDRs). Este evento de integração é mediado pela utilização da enzima de restrição do Tipo lis que reconhece um sítio definido na sequência de DNA, porém cliva o DNA a uma distância definida deste sítio. Esta abordagem tem duas vantagens principais: (1) permite a digestão de aceptores de frameworksem afetar suas sequências de codificação (não há necessidade de construção de sítios de restrição silenciosos); e (2) permite a digestão e clonagem de sequências naturalmente diversificadas, que por definição, não possuem sítios de restrição compatíveis.
[00188]Como descrito acima, as tentativas anteriores para geração de bibliotecas e/ou exibições de sequências de anticorpos diferem dos métodos fornecidos no presente documento. Por exemplo, alguns métodos requerem o enxerto de cada CDR, como descrito, por exemplo, pela Patente US no. 6.300.064, em que os sítios de enzima de restrição são construídos nos limites de cada CDR, não apenas a região CDR H3. Em outros métodos, as sequências de CDR, a partir de fontes naturais são ampliadas e reorganizadas, conforme descrito, por exemplo, na Patente US no. 6.989.250. Em alguns métodos, tais como os descritos na Publicação de Pedido de Patente US no. 20060134098, sequências de um camundongo (ou outro mamífero) são adicionadas a uma estrutura humana, de modo que o anticorpo resultante apresenta regiões CDR1 e CDR2 de origem murina e uma região CDR3 de origem humana. Outros métodos, tais como aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente US no. 20030232333, geram anticorpos que apresentam regiões de CDR1 sintética e/ou CDR1/CDR2, juntamente com uma região CDR3 natural. No entanto, estes métodos não fornecem bibliotecas que contêm regiões de frameworkestáveis e CDRs dobradas corretamente.
[00189]Os métodos fornecidos no presente documento projetam o aceptor de frameworkde anticorpo para clonagem de diversidade. A estratégia foi concebida para introduzir diversidade à CDR3 de domínios de anticorpo humano selecionados, o que evita a modificação da sequência de frameworkoriginal. A estratégia ba- seia-se na introdução fora da região de codificação da imunoglobulina dos sítios de restrição do Tipo lis. Esta classe de enzimas de restrição reconhece sequências assimétrica e ininterrupta de 4-7 pares de bases, porém clivam DNA a uma distância definida de até 20 bases de forma independente da sequência de DNA encontrada no sítio de clivagem. A fim de tirar vantagem deste sistema para clonagem de sequências diversificadas nas frameworksselecionadas, foi projetado o aceptor de frameworkcontendo um fragmento de DNA de fragmento principal, em vez da CDR3, que inclui dois sítios de restrição do Tipo lis. Da mesma forma, as sequências de DNA diversificadas são geradas com sequências de flanqueamento que incluem Tipo lis. Desde que as extremidades coesas geradas pelas enzimas de restrição sejam compatíveis e que o quadro de leitura seja mantido, os fragmentos de DNA podem ser ligados no aceptor de frameworke restauram a CDR3 codificada no novo contexto do frameworkde anticorpo aceptor (figura 2).
[00190]Os métodos providos no presente documento capturam diversidade de CDR natural. A estratégia que foi desenvolvida para capturar fragmentos de proteína diversificados naturalmente como uma fonte de diversidade também tira vantagem das enzimas de restrição do Tipo lis. Como um exemplo foram projetados oligonucleotídeo iniciadoress específicos para regiões de flanqueamento da sequência de DNA que codifica a CDR H3 das imunoglobulinas, ou seja, específica para a FR 3 e FR4 da região variável. Estes oligonucleotídeos contêm em sua extremidade 5 ‘ um sítio para uma enzima de restrição do Tipo lis considerando que a sua porção 3' combina com a sequência de DNA alvo. O sítio da enzima de restrição utilizado é de preferência uma enzima que cliva DNA longe do sítio de reconhecimento de DNA, tal como Fokl. Este é um elemento-chave do método, uma vez que permite a ampliação eficaz das sequências naturais de DNA, uma vez que mantém uma boa combinação entre a extremidade 3' do iniciador e o DNA flanqueando a CDR H3, enquanto permitindo a excisão da sequência de codificação de CDRH3 por clivagem de DNA no limite entre as regiões de CDR e de framework(figura 3). Esta excisão precisa da sequência de codificação CDR é muito difícil quando se emprega enzimas do Tipo II que clivam DNA que em seu sítio de reconhecimento, uma vez que o sítio de restri- ção correspondente não está presente nas sequências naturais de DNA e a introdução de tais sítios durante a ampliação seria difícil, devido à recombinação fraca do iniciador. Assim, este método permite a ampliação de sequências de proteínas diversificadas e sua inserção em qualquer frameworkde anticorpo aceptor, independentemente da origem da diversidade ampliada (figura 4).
[00191]Os métodos descritos no presente documento produzem uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina por: (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal contendo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 3, regiões (CDR3) ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR3 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácido nucléico de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkem- pregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR3 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR3 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR3 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapas (a) e (b) são restaurados.
[00192]Os métodos providos no presente documento produzem um método para obtenção de uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina por: (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal contendo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória, as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são interca-ladas por uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 1, regiões (CDR1) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR1 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácido nucléico de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkempregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo IIs da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR1 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR1 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR1 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b) são restaurados.
[00193]Os métodos providos no presente documento produzem uma biblioteca de ácidos nucléicos, onde cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina, por: (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma região 3 determinante de complementaridade (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de se- quências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 2 (CDR2) regiões ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconheci-mento de enzima de restrição do Tipo IIs em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR2 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácido nucléico de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Framework empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); e (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR2 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR2 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR2 e um domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapas (a) e (b) são restaurados.
[00194]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) nos métodos estabelecidos acima são reconhecidos por uma enzima de restrição diferente do Tipo lis. Por exemplo, em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento BsmBI, sítios de reconhecimento Bsal, sítios de reconhecimento Fokl ou uma combinação dos mesmos.
[00195]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Framework é derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5-51.
[00196]Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1 -33, VK1 -39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20.
[00197]Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1 -44 e VL1 -51.
[00198]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR3 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00199]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00200]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00201]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR1 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00202]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00203]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00204]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR2 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeo naturalmente diversificados.
[00205]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00206]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00207]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
[00208]Em algumas modalidades, os métodos providos no presente documento incluem, adicionalmente, as etapas de (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca.
[00209]Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli. Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemideo.
[00210]Os métodos providos no presente documento geram ou de outra forma produzem anticorpos específicos para alvo, região variável de anticorpo ou uma porção do mesmo por: (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal apresentando, pelo menos, dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 3, regiões (CDR3) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconheci-mento de enzima de restrição do Tipo IIs em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR3 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácido nucléico de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Framework empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR3 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR3 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR3 e domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapas (a) e (b) são restaurados; (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão; (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificada pela biblioteca; (g) contato da pluralidade de domínios de imunoglobulina da etapa (f) com um antígeno alvo; e (h) determinação de quais sequências de codificação de domínio variável de imunoglobulina expressas se ligam ao antígeno alvo.
[00211]Os métodos providos no presente documento geram ou de outra forma produzem anticorpo específico para o alvo, região variável de anticorpo ou uma porção do mesmo por: (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória, as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 1, regiões (CDR1) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconheci-mento de enzima de restrição do Tipo IIs em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR1 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácido nucléico de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Framework empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR1 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR1 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR1 e domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapas (a) e (b) são restaurados; (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão; (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca; (g) contato da pluralidade de domínios de imunoglobulina da etapa (f) com um antígeno alvo; e (g) determinação de quais sequências de codificação de domínio variável de imunoglobulina expressas se ligam ao antígeno alvo.
[00212]Os métodos providos no presente documento geram ou de outra forma produzem anticorpo específico para o alvo, região variável de anticorpo ou uma porção do mesmo, por: (a) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcodificando domínios variáveis de imunoglobulina distintos, cada sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkincluindo uma primeira região framework(FR 1), uma segunda região framework(FR 2), uma terceira região framework(FR 3), e uma quarta região framework(FR 4), onde as regiões FR 1 e FR 2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal incluindo pelo menos dois sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis intercalados por uma sequência de áci- dos nucléicos aleatória e as regiões FR 3 e FR 4 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 3 (CDR3); (b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados codificando região determinante de complementaridade 2, regiões (CDR2) ou codificando sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2, onde cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificados inclui um sítio de reconheci-mento de enzima de restrição do Tipo IIs em cada extremidade; (c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos codificando as regiões CDR2 ou sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digestão da sequência de ácido nucléico de fragmento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Framework empregando uma enzima de restrição do Tipo lis, que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a); (d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridos codificando as regiões CDR2 ou as sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR2 da etapa (c) ao Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c) tal que, as regiões FR 2 e FR 3 são intercaladas pelas sequências de ácidos nucléicos codificando a região CDR2 ou a sequência de aminoácidos que pode desempenhar o papel de uma região CDR2 e domínio variável de imunoglobulina completo codificando sequências que não contêm os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapas (a) e (b) são restaurados; (e) clonagem da biblioteca de ácidos nucléicos codificando domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão; (f) transformação do vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivo da célula hospedeira sob condições suficientes para expressar uma variedade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca; (g) contato da pluralidade de domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (f) com um antígeno alvo; e (h) determinação de quais sequências de codificação de domínio variável de imuno- globulina expressas se ligam ao antígeno alvo.
[00213]Em algumas modalidades, os métodos providos no presente documento incluem adicionalmente a etapa de (i) sequenciamento do domínio variável de imunoglobulina codificando sequências que se ligam ao antígeno alvo.
[00214]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (a) e etapa (b) são reconhecidos por uma enzima de restrição diferente do Tipo lis.
[00215]Em algumas modalidades, os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são sítios de reconhecimento BsmBI, sítios de reconhecimento Bsal, sítios de reconhecimento Fokl ou uma combinação dos mesmos.
[00216]Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworké derivada de uma sequência gênica humana. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia pesada humana é selecionada de VH1-2, VH1-69, VH1- 18, VH3-30, VH3-48, VH3-23 e VH5-51.
[00217]Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia leve, kappa, humana é selecionada de VK1 -33, VK1 -39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20.
[00218]Em algumas modalidades, a sequência humana é uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana ou uma sequência derivada de uma sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana. Por exemplo, em algumas modalidades, a sequência gênica variável de cadeia leve, lambda, humana é selecionada de VL1 -44 e VL1 -51.
[00219]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR3 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00220]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00221]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR3 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00222]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR1 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00223]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00224]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica sequências de aminoácidos que podem desempenhar o papel de uma região CDR1 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui sequências sintéticas.
[00225]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados incluiu ou é derivada de sequências selecionadas de sequências de CDR2 ocorrendo naturalmente, sequências de lg de seres humanos ocorrendo naturalmente, sequências de lg de um mamífero ocorrendo naturalmente, sequências de uma região de alça ocorrendo naturalmente de um receptor de célula T em um mamífero e outras coletâneas de polipeptídeos naturalmente diversificados.
[00226]Em algumas modalidades, a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados codifica regiões CDR2 e a pluralidade de ácidos nucléicos diversificados inclui ou é derivada de sequências de imunoglobulina que ocorrem naturalmente em seres humanos que foram expostos a um imunógeno específico ou sequências derivadas de animais que foram identificados como tendo sido expostos a um antígeno específico.
[00227]Em algumas modalidades, a pluralidade de sequências de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkinclui uma mistura de, pelo menos, uma sequência de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e, pelo menos, uma sequência de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
[00228]Em algumas modalidades, o vetor de expressão é um vetor fagemí- deo. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é E. coli.
[00229]Salvo indicação em contrário, os termos científicos e técnicos usados em conexão com a presente invenção terão os significados que são comumente compreendidos pelos versados na técnica comum. Além disso, salvo de outra forma indicado no contexto, termos no singular devem incluir pluralidade e termos no plural incluirão o singular. De modo geral, as nomenclaturas utilizadas em conexão com e técnicas de cultura de células e tecidos, biologia molecular e química de proteínas e oligo- ou polinucleotídeo além de hibridização descritas no presente documento são conhecidas e usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas par DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos, e cultura de tecidos e transformação (por exemplo, eletroporação, lipofecção). Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante ou como comumente realizado na técnica ou como descrito no presente documento. As técnicas e procedimentos precedentes são geralmente realizados de acordo com os métodos convencionais conhecidos na técnica e, conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo do presente relatório descritivo. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)). As nomenclaturas utilizadas em conexão e os procedimentos e técnicas de laboratório de química analítica, química orgânica sintética, e da química médica e farmacêutica descritas neste documento são conhecidas e usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação e liberação e tratamento dos pacientes.
[00230]Como utilizados de acordo com a presente revelação, os termos que se seguem, salvo indicação em contrário, devem ser entendidos como apresentando os seguintes significados:
[00231]Conforme empregado no presente documento, o termo "anticorpos" se refere a moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas das moléculas de imunoglobulina (lg), ou seja, moléculas que contêm um sítio de ligação do antígeno que se liga especificamente (imunoreage com) um antígeno. "Se ligam especificamente" ou "imunoreagem com" ou "se ligam imunoespecificamente” significa que o anticorpo reage com um ou mais determinantes antigênicos do antígeno desejado e não reage com outros polipeptídeos ou se liga em afinidade muito menor (Kd > 10’6). Os anticorpos incluem, mas não estão limitados ao policlonal, monoclonal, quimérico, dAb (anticorpo de domínio), cadeia simples, fragmentos Fab, Fab’ e F (ab') 2, scFvs, e uma biblioteca de expressão Fab.
[00232]A unidade estrutural básica do anticorpo é conhecida por compor um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias polipeptí- dicas, cada par apresentando uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" (cerca de 50-70 kDa). A porção de término amino de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primariamente responsáveis pelo reconhecimento de antígeno. A porção de término carbóxi de cada cadeia define uma região constante primariamente responsável pela função efetora. Em geral, as moléculas de anticorpos obtidas de seres humanos se relacionam com qualquer uma das classes de IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que diferem uma da outra pela natureza da cadeia pesada presente na molécula. Certas classes apresentam subclasses, assim como, lgG1, lgG2, e outras. Além disso, em seres humanos, a cadeia leve pode ser uma cadeia kappa ou uma cadeia lambda.
[00233]O termo "anticorpo monoclonal"(MAb) ou "composição de anticorpo monoclonal", como utilizado aqui, se refere a uma população de moléculas de anticorpos que contêm apenas uma espécie molecular da molécula de anticorpo que consiste em um único produto do gene de cadeia leve e um único produto do gene de cadeia pesada. Especificamente, as regiões determinantes de complementaridade (CDRs) do anticorpo monoclonal são idênticas em todas as moléculas da população. MAbs contêm um local de ligação do antígeno capaz de imunoreagir com um epítopo específico do antígeno que se caracteriza pela afinidade de ligação única com o mesmo.
[00234]O termo "sítio e ligação ao antígeno," ou "porção de ligação" se refere à parte da molécula de imunoglobulina que participa na ligação do antígeno. O sítio de ligação de antígeno é formado por resíduos de aminoácidos das regiões variáveis de término N (“V”) de cadeias pesada (“H”) e leve (“L”). Três trechos altamente divergentes dentro das regiões V das cadeias pesada e leve, conhecidos como "regiões hipervariáveis", se interpõem entre trechos de flanqueamento mais con-servados conhecidos como “regiões framework’ou “FRs”. Assim, o termo "FR"se refere às sequências de aminoácidos que são encontradas naturalmente entre e adjacentes às regiões hipervariáveis nas imunoglobulinas. Em uma molécula de anticorpo, as três regiões hipervariáveis da cadeia leve e as três regiões hipervariáveis da cadeia pesada são dispostas uma em relação a outra no espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação de antígenos. A superfície de ligação de antígeno é complementar à superfície tridimensional de um antígeno de ligação e as três regiões hipervariáveis de cada uma das cadeias pesadas e leves são referidas como "regiões determinantes de complementaridade", ou "CDRs." A atribuição de aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Sequências Kabat das proteínas de interesse imunológico (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1987 e 1991)), ou Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia e outros, Nature 342:878-883 (1989).
[00235]Conforme empregado no presente documento, o termo "epítopo" inclui qualquer proteína determinante capaz de ligação específica a uma imunoglobulina, um scFv, ou um receptor de células T. O termo "epítopo" inclui qualquer proteína determinante capaz de ligação específica a uma imunoglobulina ou receptor de células T. Determinantes epitópicos consistem geralmente em grupos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como, aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente apresentam características estruturais tridimensionais, bem como características de carga específicas. Por exemplo, os anticorpos podem surgir contra peptídeos de término N ou término C de um polipeptídeo. Diz-se que um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando a constante de dissociação for igual ou menor a 1 pM; por exemplo, menor ou igual a 100 nM, preferivelmente menor ou igual a 10 nM e mais preferivelmente menor ou igual a 1 nM.
[00236]Conforme empregado no presente documento, os termos “ligação imunológica” e “propriedades de ligação imunológica” se referem às interações não covalentes do tipo que ocorre entre uma molécula de imunoglobulina e um antígeno para o qual a imunoglobulina é específica. A resistência ou afinidade das interações imunológicas pode ser expressa em ermos da constante de dissociação (Kd) da interação, onde uma Kd menor representa uma afinidade maior. As propriedades de ligação imunológicas dos polipeptídeos selecionados podem ser quantificadas usando métodos bem conhecidos na técnica. Um tal método é a medição das taxas do sítio de ligação ao antígeno/formação de complexo de antígeno e dissociação, onde aquelas taxas dependem das concentrações de padrão de complexo, a afinidade de interação e parâmetros geométricos que influenciam igualmente a taxa em ambos direções. Assim, ambas a “constante de taxa de associação” (Kon) e a “constante de taxa de dissociação” (Koff) podem ser determinadas pelo cálculo das concentrações e das taxas reais de associação e dissociação. (Vide Nature 361:186-87 (1993)). A proporção de Koff/Kon permite o cancelamento de todos parâmetros não relacionados à afinidade e é igual à constante de dissociação Kd. (Vide, em geral, Davies e outros, (1990) Anual Rev Biochem 59:439-473). Um anticorpo da presente invenção é dito que se ligando especificamente ao seu alvo, quando a constante de ligação de equilíbrio (Kd) for menor ou igual a 1 pM, por exemplo, menor ou igual a 100 nM, preferivelmente menor ou igual a 10 nM e mais preferivelmente menor ou igual a 1 nM, conforme medida por ensaios, tais como, ensaios de ligação de radioligante ou ensaios similares conhecidos pelos versados na técnica.
[00237]O termo "polinucleotídeo isolado", tal como empregado no presente documento significa um polinucleotídeo de origem genômica, cDNA, ou sintética, ou alguma combinação destes, que em virtude de sua origem o "polinucleotídeo isolado" (1) não está associado a totalidade ou uma parte de um polinucleotídeo em que o "polinucleotídeo isolado" é encontrado na natureza, (2) é operavelmente ligado a um polinucleotídeo que não está ligado à natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior. Os polinucleotídeos de acordo com a invenção incluem a moléculas de ácido nucléico codificando as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada e moléculas de ácido nucléico codificando as moléculas de imu- noglobuliπa de cadeia leve descritas no presente documento.
[00238]O termo "proteína isolada" referido no presente documento significa uma proteína de cDNA, RNA recombinante ou origem sintética ou alguma combinação destes, que em virtude de sua origem ou fonte de derivação, a "proteína isolada" (1) não está associada às proteínas encontradas na natureza, (2) está livre de outras proteínas da mesma fonte, por exemplo, não apresenta proteínas marinhas, (3) é expressa por uma célula de uma espécie diferente, ou (4) não ocorre na natureza.
[00239]O termo "polipeptídeo" é empregado no presente documento como um termo genérico para se referir à proteína nativa, fragmentos ou análogos a uma sequência polipeptídica. Assim, fragmentos de proteínas nativas, e análogos são espécies do gênero polipeptídeo. Polipeptídeos de acordo com a invenção compreendem moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada, e as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve descritas no presente documento, bem como moléculas de anticorpos formadas por combinações compreendendo as moléculas de imunoglobulina de cadeia pesada com as moléculas de imunoglobulina de cadeia leve, tais como, moléculas de imunoglobulina de cadeia leve kappa, e vice-versa, bem como fragmentos e análogos às mesmas.
[00240]O termo "ocorrendo naturalmente", usado no presente documento como aplicado a um objeto se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptídeos ou polinucleotídeos que estão presentes em um organismo (incluindo vírus) que podem ser isolados a partir de uma fonte na natureza e que não tenham sido intencionalmente modificados pelo homem em laboratório ou de outra forma, são ditos como ocorrendo naturalmente.
[00241]O termo "ligado operavelmente" como empregado no presente documento se refere às posições de componentes, assim descritas, estando em uma relação que permite que os mesmos funcionem em seu modo pretendido. Uma sequência de controle "ligada operavelmente" a uma sequência de codificação é ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é alcançada em condições compatíveis com as sequências de controle.
[00242]O termo "sequência de controle" conforme usado no presente documento se refere às sequências de polinucleotídeos que são necessárias para efetuar a expressão e processamento das sequências de codificação as quais são ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro nos procariotes, tais sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossômica e transcrição da sequência de terminação nos eucariotos, em geral, tais sequências de controle incluem promotores e transcrição da sequência de terminação. O termo "sequências de controle" destina-se a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e pode também incluir componentes adicionais, cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências parceiras de fusão. O termo "polinucleotídeo" conforme referido no presente documento significa um boro polimérico de nucleotí- deos de pelo menos 10 bases de comprimento, tanto de ribonucleotídeos ou desoxi- nucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. O termo inclui formas simples e dupla fita de DNA.
[00243]Conforme empregado no presente documento, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviaturas seguem o uso convencional. Vide Immunology - A Synthesis (2a Edição, E.S Golub e D.R. Gren, Eds, Sinauer Associates, Sunderland Mass. (1991)). Estereoisômeros (por exemplo, aminoácidos D) dos vinte aminoácidos convencionais, aminoácidos não naturais, tais como, a-, aminoácidos a- dissubstituídos, aminoácidos N-alquila, ácidos láticos e outros aminoácidos não con-vencionais que também podem ser componentes apropriados para polipeptídeos da presente invenção. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4 hidroxi- prolina, y-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetilisina, ε-N-acetilisina, O-fosfoserina, N- acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina e outros aminoácidos semelhantes e imino ácidos (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na citação do polipeptídeo empregado no presente documento, a direção esquerda é a direção do terminal amino e a direção à direita é a direção de término carbóxi de acordo com o uso padrão e convenção.
[00244]Quando aplicado aos polipeptídeos, o termo "identidade substancial" significa que duas sequências de peptídeos, quando perfeitamente alinhadas, tais como pelos programas GAP ou BESTFIT empregando pesos de intervalo padrão, compartilham pelo menos 80 por cento de identidade de sequência, de preferência pelo menos 90 por cento de identidade sequência, mais preferivelmente pelo menos 95 por cento de identidade de sequência, e mais preferivelmente pelo menos 99 por cento de identidade de sequência.
[00245]De preferência, as posições de resíduos que não são idênticos diferem por substituições de aminoácidos conservadoras.
[00246]Substituições de aminoácidos conservadoras se referem a intercam- bialidade de resíduos apresentando cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos com cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais de hidroxila alifáticas é a serina e a treonina; um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais contendo amida é o de asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina e um grupo de aminoácidos apresentando cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservadores preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina valina, glutâmico-aspártico e asparagina-glutamina.
[00247]Conforme representado no presente documento, variações menores nas sequências de aminoácido dos anticorpos ou moléculas de imunoglobulina são contempladas como sendo englobadas pela presente invenção, contanto que as variações na sequência de aminoácido se mantenham pelo menos em 75%, mais preferivelmente pelo menos 80%, 90%, 95% e mais preferivelmente de 99%. Especifi- camente, substituições de aminoácidos conservadoras são contempladas. Substituições conservadoras são aquelas que ocorrem dentro de uma família de aminoácidos que são relacionados em suas cadeias laterais. Aminoácidos geneticamente codificados são geralmente divididos em famílias: (1) aminoácidos ácidos são aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos são lisina, arginina, histidina, (3) aminoácidos apoiares são alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano e (4) aminoácidos polares não carregados são glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. Os aminoácidos hidrófilos amino incluem arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina e treonina. Os aminoácidos hidrófobos incluem alanina, cisteína, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptofano, tirosina e valina. Outras famílias de aminoácidos incluem (i) de serina e treonina, que são a família hidróxi-alifática; (ii) asparagina e glutamina, que são a amida contendo a família; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que são a família alifática, e (iv) fenilalanina, triptofano e tirosina que são a família aromática. Por exemplo, é razoável esperar que uma substituição isolada de uma leucina com uma isoleucina ou valina, aspartato com um glutamato, uma treonina com uma serina ou um substituto semelhante de um aminoácido com um aminoácido estruturalmente relacionado não terá um grande efeito na ligação ou propriedades da molécula resultante, especialmente se a substituição não envolver um aminoácido dentro de um sítio framework.Quando uma alteração de aminoácido resultar em um peptídeo funcional, isto pode ser prontamente determinado por ensaio da atividade específica do derivado de polipeptídeo. Os ensaios são descritos em detalhes no presente documento. Fragmentos ou análogos aos anticorpos ou moléculas de imunoglobulina podem ser prontamente preparados pelos versados na técnica comum. Os terminais amino e carbóxi preferidos dos fragmentos ou análogos ocorrem próximo aos limites dos domínios funcionais. Domínios estruturais e funcionais podem ser identificados por comparação do nucleotídeo e/ou dados de sequência de aminoácido para bases de dados de sequência públicas ou patenteadas. Preferivelmente, os métodos de comparação computadorizada são usados para identificar os motivos da sequencia ou domínios de conformação de proteína previstos que ocorrem em outras proteínas de estrutura conhecida e/ou função. São conhecidos os métodos para identificar sequências de proteínas que se dobram em uma estrutura tridimensional conhecida. Bowie e outros, Science 253:164 (1991). Assim, os exemplos precedentes demonstram que os versados na técnica podem reconhecer motivos sequência e conformações estruturais que podem ser usados para definir domínios estruturais e funcionais de acordo com a invenção.
[00248]Substituições de aminoácidos preferidas são aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação para a formação de complexos de proteína, (4) alteram afinidade de ligação, e (4) conferem ou modificam outras propriedades físico- químicas ou funcionais de tais análogos. Análogos podem incluir várias muteínas de uma sequência diferente da sequência de peptídeos que ocorre naturalmente. Por exemplo, substituições de aminoácidos simples ou múltiplas (de preferência substituições de aminoácidos conservadoras) podem ser feitas na sequência que ocorre naturalmente (de preferência na parte do polipeptídeo fora do(s) domínio(s)) formando contatos intermoleculares. A substituição conservadora do aminoácido não deve alterar substancialmente as características estruturais da sequência de origem (por exemplo, a substituição de um aminoácido poderia não tender a romper uma hélice que ocorre na sequência de origem ou interromper outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência de origem). Exemplos de estruturas terciárias e secundárias de polipeptídeos reconhecidas na técnica são descritas em Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed, WH Freeman and Company, New York (1984).); Introduction to Protein Structure (Branden C. e J. Tooze, eds, Garland Publishing, New York, NY (1991));. Thornton e outros, Nature 354:105 (1991).
[00249]Conforme empregado no presente documento, os termos "rótulo"ou "rotulados" se refere a incorporação de um marcador detectável, por exemplo, pela incorporação de um aminoácido radiorotulado ou anexação a um polipeptídeo de frações biotinila que pode ser detectado por avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática, que pode ser detectada por métodos ópticos ou calorimétrico). Em certas situações, o rótulo ou marcador também pode ser terapêutico. Vários métodos de seleção de polipeptídeos e glicoproteinas são conhecidos na arte e pode ser usado. Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, mas não estão limitados ao que se segue: radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Tc, 111 In, 125l, 131l), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvrestre, p-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescente, grupos biotinila, epítopos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de leucina par zíper, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo). Em algumas modalidades, os rótulos são anexados por braços espaçadores de vários comprimentos de reduzir impedimento estérico em potencial. O termo "agente farmacêutico ou medicamento", tal como utilizado no presente documento se refere a um composto químico ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado, quando devidamente administrado a um paciente.
[00250]Outros termos químicos no presente documento são utilizados de acordo com o uso convencional na técnica, conforme exemplificado pelo McGraw- Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
[00251]Conforme empregado no presente documento, "substancialmente puro" significa que uma espécie objeto é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição), e de preferência uma fração substancialmente purificada é uma composição onde as espécies objeto compreendem pelo menos cerca de 50 por cento (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes.
[00252]Geralmente, uma composição substancialmente pura será composta por mais de cerca de 80 por cento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição, preferivelmente mais de cerca de 85%, 90%, 95% e 99%. Mais preferivelmente, a espécie objeto é purificada à homogeneidade fundamental (espécie contaminante não podem ser detectada na composição por métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.
[00253]O termo paciente inclui seres humanos e veterinária.
[00254]Os anticorpos são purificados por técnicas bem conhecidas, tais como cromatografia de afinidade utilizando proteína A ou proteína G, que fornecem principalmente a fração IgG de soro imune. Subsequente ou alternativamente, o antígeno específico que é o alvo da imunoglobulina procurado, ou mesmo um epítopo, pode ser imobilizado em uma coluna para purificar o anticorpo imune específico por cromatografia de imunoafinidade. A purificação das imunoglobulinas é discutida, por exemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicada or The Scientist, Inc., Philadelphia PA, vol. 14, número 8 (17 de abril de 2000), páginas 25-28).
[00255]A invenção será melhor descrita nos exemplos a seguir, que não limitam o escopo da invenção descrito nas reivindicações.
EXEMPLOS EXEMPLO 1: Clonagem de genes germinativos variáveis de imunoglobulina
[00256]Sete genes germinativos variáveis de cadeia pesada humanos (VH1- 2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23, VH5-51), cinco genes germinativos variáveis de cadeia leve, kappa, humana (VK1-33, VK1-39, VK3-11, VK3-15, VK3- 20) e dois genes germinativos variáveis de cadeia leve, lambda, humana (VL1-44, VL1-51) foram selecionados para a construção das bibliotecas (Lefranc, M.-P. e outros, 1999 Nucleic Acids Research, 27, 209-212). Esses genes foram selecionados porque são frequentemente usados em repertórios de anticorpo expressos em hu- manos e os frameworksque eles codificam podem exibir estabilidade favorável e perfis de expressão como domínios individuais ou no contexto de um par VH/VL (Ewert S e outros, J Mol Biol. 2003 Jan 17; 325 (3) :531-53). Dois conjuntos de iniciadores específicos foram usados para amplificar esses genes a partir de DNA ge- nômico humano por PCR aninhada. Esta abordagem foi necessária como sequências 5' de genes germinativos de uma mesma família são idênticas ou muito semelhantes. Para cada gene, um primeiro par de iniciadores, chamado localizadores ge- nômicos, foi projetado para ser específico para as regiões não traduzidas 5' e 3' que flanqueiam o gene germ inativo. O segundo par foi projetado para ser específico para o início da região framework1 (FR1) e o final da FR2. Os 14 produtos da PCR inde-pendentes foram clonados no pGEMT-easy (Promega, Madison Wl) e sua identidade e integridade foram verificadas por sequenciamento. A sequência de aminoácidos dos genes germinativos selecionados é mostrada na figura 5.
[00257]0s iniciadores e combinação de iniciadores utilizados são indicados abaixo. Localizadores genômicos 5K1 -33TGTTTCTAATCGCAGGTGCCAGATG(SEQIDNO: 120) 3 K1-33ATTTATGTTATG ACTTGTTAC ACTG (S E QID N 0:121) 5K1-39TATTTGTTTTTATGTTTCCAATCTC(SEQIDNO:122) 3K1-39CCTTGGAGGTTTATGTTATGACTTG(SEQIDNO:123) 5K3-11 TTATTTCCAATTTCAGATACCACCG(SEQIDNO: 124) 3K3-11 TTGTTGGGGTTTTTGTTTCATGTGG(SEQIDNO: 125) 5K3-15TATTTCCAATTTCAGATACCACTGG(SEQIDNO:126) 3K3-15ATGTTGAATCACTGTGGGAGGCCAG(SEQIDNO: 127) 5K3-20TTATTTCCAATCTCAGATACCACCG(SEQIDNO:128) 3 K3-20TTTTGTTTC AAG CTGAATC ACTGTG (S E QID N 0:129) 5L1 -44ATGTCTGTGTCTCTCTCACTTCCAG(SEQIDNO: 130) 3L1-44TTCCCCATTGGCCTGGAGCACTGTG(SEQIDNO:131) 5L1 -51 GTGTCTGTGTCTCTCCTGCTTCCAG(SEQIDNO: 132) 3L1 -51 CTTGTCTCAGTTCCCCATTGGGCTG(SEQIDN0:133) 5H1-2ATCTCATCCACTTCTGTGTTCTCTC(SEQIDNO:134) 3H1 -2TTGGGTTTCTGACACCCTCAGGATG(SEQIDN0:135) 5H1-18CAGGCCAGTCATGTGAGACTTCACC(SEQIDNO:136) 3H1 -18CTGCCTCCTCCCTGGGGTTTCTGAA(SEQIDN0:137) 5H1-69CCCCTGTGTCCTCTCCACAGGTGTC(SEQIDNO:138) 3H1-69CCGGCACAGCTGCCTTCTCCCTCAG(SEQIDNO:139) 5DP-47GAGGTGCAGCTGTTGGAG(SEQ ID NO:140) 5H3-23TCTGACCAGGGTTTCTTTTTGTTTGC(SEQID NO: 141) 3H3-23TTGTGTCTGGGCTCACAATGACTTC(SEQIDNO:142) 5H3-30TGGCATTTTCTGATAACGGTGTCC(SEQIDNO:143) 3H3-30CTGCAGGGAGGTTTGTGTCTGGGCG(SEQIDNO: 144) 5H3-48ATATGTGTGGCAGTTTCTGACCTTG(SEQIDNO:145) 3H3-48GGTTTGTGTCTGGTGTCACACTGAC(SEQIDNO:146) 5H5-aGAGTCTGTGCCGGAAGTGCAGCTGG(SEQIDNO:147) Específicos para a codificação de sequência 5VH1TATCAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQIDNO:148) 5VH3TATCAGGTGCAGCTGGTGGAG(SEQIDNO:149) 5VH5TATGAGGTGCAGCTGGTGCAG(SEQIDNO: 150) 3VH1Z3 ATATCTCTCGCACAGTAATACAC(SEQID N0:151) 3 VH3 ATATCTCTCGCACAGTAATATAC (SEQ ID NO: 152) 3 VH5 ATATGTCTCGCACAGTAATACAT (SEQ ID NO: 153) 5 VK1 TATGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTC (SEQ ID NO: 154) 3 DPK9 ATAGGAGGGGTACTGTAACT (SEQ ID NO: 155) 3 DPK1 ATAGGAGGGAGATTATCATA (SEQ ID NO: 156) 5 DPK22_L6 TATGAAATTGTGTTGACGCAGTCT (SEQ ID NO: 157) 3 DPK22 ATAGGAGGTGAGCTACCATACTG (SEQ ID NO: 158) 5 DPK21 TATGAAATAGTGATGACGCAGTCT (SEQ ID NO: 159) 3 DPK21 ATAGGAGGCCAGTTATTATACTG (SEQ ID NO: 160) 3 L6 CAGCGTAGCAACTGGCCTCCTAT (SEQ ID NO: 161) 5 DPL2 TACAGTCTGTGCTGACTCAG (SEQ ID NO: 162) 3 DPL2 ATAGGACCATTCAGGCTGTCATC (SEQ ID NO: 163) 5 DPL5 TATCAGTCTGTGTTGACGCAG (SEQ ID NO: 164) 3 DPL5 ATAGGAGCACTCAGGCTGCTAT (SEQ ID NO: 165)
[00258]Combinações de iniciadores utilizados para amplificar genes germi nativos selecionados.
Figure img0001
Figure img0002
EXEMPLO 2: Geração de Aceptor de Framework
[00259]As sequências dos genes germinativos selecionadas foram analisadas quanto à presença de sítios de restrição do Tipo lis. Nenhum sítio BsmBI estava presente nos genes germinativos variáveis de anticorpo selecionados. Dois sítios BsmBI foram encontrados na estrutura de pNDSI, o vetor fagemideo no qual o Aceptor de Frameworkseria clonado. Estes dois locais foram removidos por mutagênese direcionada ao sítio, de modo que sítios BsmBI únicos poderiam ser introduzidos nas sequências de DNA de fragmento principal do Aceptor de Frameworks.Cada gene germinativo foi ampliado por múltiplas PCR aninhadas, de modo a adicionar uma sequência de DNA de fragmento principal na extremidade 3’ da sequência FR3 seguido por uma sequência codificando FR4 que é específica para cada segmento variável correspondente (VH, Vk, VÀ). A sequência de aminoácidos de VH FR4 corresponde à região FR4 codificada pelos genes germinativos J, JH1, JH3, JH4 e JH5. A sequência de aminoácidos de VK FR4 corresponde à região FR4 codificada pelos genes germinativos J, JK1. A sequência de aminoácidos de VÀ FR4 corresponde à região FR4 codificada pelos genes germinativos J, JL2 e JL3. Duas variantes da sequência Vk FR4 foram geradas com uma única substituição de aminoácido na posição 106 (Arginina ou Glicina). Para o Aceptor de Frameworkcom base no gene germinativo VH3-23, duas variantes também foram construídas diferindo por um único aminoácido (Lisina para Arginina) na posição 94, o último resíduo de FR 3. Durante a etapa de ampliação final, os sítios Sfill/Ncol e Xhol foram introduzidos na extremidade 5 'e 3' de VH, respectivamente.
[00260]Da mesma forma, os sítios Sail e Notl foram introduzidos nas extremidades 5’ e 3’ de VL, respectivamente (figura 6). O fragmento principal foi designado de modo que o quatro de leitura de tradução foi mutado assim impedindo a expressão de qualquer proteína funcional do Aceptor de Frameworks(figura 7). Os ini- ciadores usados neste processo são listados a seguir. VH 5 VH1 CAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAG (SEQ ID NO: 166) 5 VH3-30 CAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAG (SEQ ID NO: 167) 5 VH3-23 CAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGTTGGAG (SEQ ID NO: 168) 5 VH3-48 CAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAG (SEQ ID NO: 169) 5 VH5-51 CAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAG (SEQ ID NO: 170) 3 VH1/3 CTTACCGTTATTCGTCTCATCTCGCACAGTAATACAC (SEQ ID NO: 171) 3 VH3-23 CTTACCGTTATTCGTCTCATTTCGCACAGTAATATAC (SEQ ID NO: 172) 3 VH3-48 CTCGCACAGTAATACACAGCCGTGTCCTCGGCTCTCAGGCTG (SEQ ID NO: 173) 3 VH5-51 CTTACCGTTATTCGTCTCATCTCGCACAGTAATACAT (SEQ ID NO: 174) 3 VHextl CAATACGCGTTTAAACCTGGTAAACCGCCTTACCGTTATTCGTCTCA (SEQ ID NO: 175) 3 VHext2 GTTCCCTGGCCCCAAGAGACGCGCCTTCCCAATACGCGTTTAAACCTG (SEQ ID NO: 176) 3 VHext3 CCTCCACCGCTCGAGACTGTGACCAGGGTTCCCTGGCCCCAAGAG (SEQ ID NO: 177) VK 5 VK1 CGGGTCGACGGACATCCAGATGACCCAGTC (SEQ ID NO: 178) 5 VK3-11 CGGGTCGACGGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGC (SEQ ID NO: 179) 5 VK3-15 CGGGTCGACGGAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGC (SEQ ID NO: 180) 5 VK3-20 CGGGTCGACGGAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCAGG (SEQ ID NO: 181) 3 VK1-33 CCTTACCGTTATTCGTCTCGCTGCTGACAGTAATATGTTGCAATA (SEQ ID NO: 182) 3 VK1-39 CCTTACCGTTATTCGTCTCGCTGCTGACAGTAGTAAGTTGCAAAA (SEQ ID NO: 183) 3 VK3 CCTTACCGTTATTCGTCTCGCTGCTGACAGTAATAAACTGCAAAATC (SEQ ID NO: 184) 3 VKextl CCAATACGCGTTTAAACCTGGTAAACCGCCTTACCGTTATTCGTCTC (SEQ ID NO: 185) 3 VKext2 GGTCCCTTGGCCGAATGAGACGCGCCTTCCCAATACGCGTTTAAAC (SEQ ID NO: 186) 3 Vkext3R GTGCGGCCGCCCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAATG (SEQ ID NO: 187) 3 VKext3G GTGCGGCCGCCCCTTTGATTTCCACCTTGGTCCCTTGGCCGAATG (SEQ ID NO: 188) VÀ 5 VL1-44 CGGGTCGACGCAGTCTGTGCTGACTCAGCCAC (SEQ ID NO: 189) 5 VL1-51 CGGGTCGACGCAGTCTGTGTTGACGCAGCCGC (SEQ ID NO: 190) 3 VL1-44 CCTTACCGTTATTCGTCTCCTGCTGCACAGTAATAATC (SEQ ID NO: 191) 3 VL1-51 CCTTACCGTTATTCGTCTCCTGTTCCGCAGTAATAATC (SEQ ID NO: 192) 3 Vlext2 CCCTCCGCCGAACACAGAGACGCGCCTTCCCAATACGCGTTTAAAC (SEQ ID NO: 193) 3 Vlext3 GTGCGGCCGCCCCTAGGACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACAGA (SEQ ID NO: 194)
[00261]As sequências dos 20 Aceptores de Frameworkssão mostradas na Figura 8. EXEMPLO 3: Geração de vetores Acceptor de fagemídeo contendo um domínio variável invariante O vetor fagemídeo pNDS1 utilizado para a expressão de scFvfoi modificado primeiro para remover dois sítios BsmBI. Um domínio VH3-23 contendo uma sequência de CDR3 definida foi clonado no pNDS1 modificado usando os sítios de restrição Sfil e Xhol para obter o vetor fagemídeo pNDS_VH fictício Este domínio continha um sítio BsmBI na região FR4, que foi corrigido por mutagênese dirigida ao sítio silenciosa. Em paralelo, um domínio VKI-39 contendo uma sequência CDR3 definida foi então clonado no pNDS1 modificado usando os sítios de restrição Sail e Notl para obter o vetor fagemídeo pNDS_VK fictício (figura 9). Os 8 VH Aceptores de Frameworksforam clonados em pNDS_VK fictício usando os sítios de restrição Sail e Notl. Os 12 VL Aceptores de Frameworksforam clonados em pNDS_VH fictício usando os sítios de restrição Sfil e Xhol. Os 20 vetores fagemídeo pNDS resultantes que estão listados a seguir poderiam nestes estágio ser usados para clonagem de CDR3 diversificada usando os sítios BsmBI presentes nos fragmentos de DNA de fragmento principal.
[00262]VH Aceptores: pNDS_VH1-2 VKd; pNDS_VH1-18_VKd; pNDS VH1- 69_VKd; pNDS_VH3-23R_VKd; pNDS_VH3-23K_VKd; pNDS_VH3-30_VKd; pNDS_VH5-51_VKd; pNDS_VH3-48_VKd. VL Aceptores: pNDS_VHd_VK1-33G; pNDS_VHd_VK1-33R;  pNDS_VHd_VK1-51.
EXEMPLO 4: Captura da diversidade de CDR H3 natural dos repertórios humanos
[00263]Múltiplas fontes de cDNA humano foram usadas como um modelo para a ampliação de sequências de CDR H3. Estas fontes incluíram baço fetal humano, bem como piscinas de células sanguíneas purificadas periféricas de adultos normais, homens e mulheres. Várias estratégias para a ampliação foram utilizadas a fim de recuperar sequências CDR H3 provenientes de cDNA de VH reorganizados codificados por um gene germinativo específico ou sequências de CDR H3 originárias de qualquer cDNA de VH.
[00264]Primeiro, as misturas de iniciadores emparelhando as regiões de codificação 5’ da maioria das famílias de VH humano foram usadas em combinação com as misturas de iniciadores correspondendo a todas as regiões JH humanas. Isto permitiu a ampliação por PCR da maioria dos genes variáveis de imunoglobulina de cadeia pesada. Os produtos de ampliação esperados de aproximadamente 400 pares de base (pb) foram isolados por eletroforese em gel de agarose e purificados. Este DNA serviu como modelo em uma segunda etapa da PCR utilizando iniciadores com 13 pb e 14 pb para coincidir com a região FR 3 final e o início de FR4, respectivamente. Na maioria dos casos, o último resíduo da FR 3 é arginina ou uma lisina. Como os últimos emparelhamentos de BP são importantes para a extensão do iniciador pela polimerase, dois iniciadores 5’ diferentes foram usados: 5 VHR_FOK (SEQ ID NO: 205 mostrada abaixo) e 5 VHK_FOK (SEQ ID NO: 206 mostrada abaixo). De modo importante, estes iniciadores contêm também um sítio de restrição Fokl para a excisão da sequência de CDR H3 (figura 4). Os iniciadores utilizados na segunda etapa da PCR foram biotinilados em suas extremidades 5’ para facilitar as etapas de purificação a jusante (vide Exemplo 5). Esta abordagem em duas etapas permite uma ampliação eficaz das sequências da CDR H3, apesar do número limitado de emparelhamento dos pares de bases. As ampliações foram realizadas em várias temperaturas de recombinação (entre 30°C e 70°C) e com várias polimerases de DNA termoestáveis para estabelecer as condições ideais. Uma temperatura de recombinação de 55-58°C em combinação com GoTaq polimerase (Promega) foi encontrada como sendo ótima para este conjunto de iniciadores. O segundo produto de ampliação foi separado em gel de agarose a 2% e resultou em um esfregaço na parte inferior do gel correspondendo à CDR H3 de comprimento diferente. Tanto o esfregaço de DNA completo foi extraído do gel quanto uma região correspondendo aos maiores fragmentos de DNA a fim de enriquecer muito a CDR H3.
[00265]Altemativamente, a primeira etapa de ampliação foi realizada usando o iniciador 5’, 5 VH3-23H2 (SEQ ID NO: 201 mostrado abaixo), que é específico para a sequência codificando a H2 CDR do VH3-23 germ inativo. Uma vez que os genes germ inativos diferentes são diversos nesta CDR, cDNAs VH codificados pelo gene germinativo selecionado podem ser preferivelmente ampliados. As etapas de purificação e ampliação subsequentes eram idênticas. Desta forma, é possível recuperar CDRs provenientes de um ambiente de frameworkespecífico e reintroduzir as mesmas em um frameworksemelhante, diferente ou no mesmo.
[00266]A seguir encontra-se uma lista de iniciadores utilizados para a ampliação de repertórios de CDR H3 naturais de seres humanos. 1a Etapa PCR 5 VH1/5 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG (SEQ ID NO: 195) 5 VH3 CCGCACAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG (SEQ ID NO: 196) 5 VH2 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGRTCACCTTGCTCGAGTCTGG (SEQ ID NO: 197) 5 VH4 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG (SEQ ID NO: 198) 5 VH4DP64 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGCTGCAGCTGCAGGAGTCCGG (SEQ ID NO: 199) 5 VH4DP63 CCGCACAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG (SEQ ID NO: 200) 5 VH3-23H2 TGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGT (SEQ ID NO: 201) 3 HJ1/2 CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACRGTGACCAGGGTGCC (SEQ ID NO: 202) 3 HJ3/6 CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAAGAGACGGTGACCRTKGTCCC (SEQ ID NO: 203) 3 HJ4/5 CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC (SEQ ID NO: 204) 2a Etapa PCR 5 VHR-FOK GAGCCGAGGACACGGCCGGATGTTACTGTGCGAGA (SEQ ID NO: 205) 5 VHK-FOK GAGCCGAGGACACGGCCGGATGTTACTGTGCGAAA (SEQ ID NO: 206) 3 JH1-F0K GAGGAGACGGTGACGGATGTGCCCTGGCCCCA (SEQ ID NO: 207) 3 JH2-F0K GAGGAGACGGTGACGGATGTGCCACGGCCCCA (SEQ ID NO: 208) 3 JH3456-FOK GAGGAGACGGTGACGGATGTYCCTTGGCCCCA (SEQ ID NO: 209)
EXEMPLO 5:Geração de bibliotecas primárias por clonagem de CDR H3 humana, naural em Aceptor de Frameworks
[00267]CDR H3 ampliadas foram digeridas com Fokl, e as extremidades clivadas, bem como DNA não digerido foram removidos usando microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Em paralelo, vetores pNDS VH Acceptor foram digeridos utilizando BsmBI. Como as protuberâncias geradas por essas digestões são compatíveis, uma coleção de CDR H3 naturais foi capaz de ser ligada ao VH Aceptor de Frameworkrestaurando o quadro de leitura apropriado. O DNA ligado foi purificado e concentrado para transformação em células E.colí XL1 Blu competentes e clones aleatórios analisados por sequenciamento a fim de verificar quais sequências de CDR H3 foram reconstituídas e aquelas uniões entre a CDR e a região de Frameworksão corrigidas (figura 10). Os resultados indicaram que todos os clones continham sequências CDR H3 e que o quadro de leitura foi restaurado, assim, codificando uma cadeia pesada variável de imunoglobulina. Além disso, todas as CDRs eram diferentes, indicando que uma diversidade maior de sequências que ocorrem naturalmente tinha sido capturada por esta abordagem. O comprimento da CDR H3 também foi variável e CDRs relativamente longas de 10 a 15 resíduos foram encontradas, ressaltando assim a vantagem desta abordagem para a amostragem de sequências longas de CDR que são difíceis de cobrir usando diversidade sintética.
[00268]Usando este método, sequências naturais CDR H3, derivadas tanto de células sanguíneas periféricas, purificadas, humanas agrupadas ou baço fetal humano, foram clonadas em cada um dos pNDS VH Aceptor de Frameworkse transformadas em células E.coli TG1 eletrocompetentes e colocadas em placas 2xTYAG Bioassay (meio 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e glicose a 2%). Após incubação por toda a noite a 30°C, 10 mL de meio líquido 2xTYAg foram adicionados às placas e as células foram raspadas da superfície e transferidas para um tubo de polipropileno de 50 mL. 2xTYAG contendo 50% de glicerol foi adicionado à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. Alíquotas das bibliotecas foram armazenadas a -80°C. Neste processo, 14 bibliotecas primárias foram geradas representando um total de 8,1 x 109 transformantes. 180 clones coletados aleatoriamente foram seqüenciados para determinar a qualidade e diversidade das bibliotecas. Todos os clones codificaram diferentes sequências VH e >89% estavam no quadro. Estas bibliotecas primárias contêm diversidade apenas na CDR H3 uma vez que elas são combinadas com um domínio VL fictício.
EXEMPLO 6: Geração de bibliotecas primárias por clonagem de CDR3 sintética no Aceptor de Frameworks
[00269]Embora o método seja de interesse específico para recuperar a diversidade natural, também pode ser aplicado para a integração de diversidade sintética em Aceptor de Frameworks.As sequências sintéticas de CDR3 foram projetadas tanto para VH e VL. O projeto levou em conta a freqüência das CDRs com um determinado comprimento e da estratégia de diversificação (códons NNS, DVK, NVT ou DVT), que permitiria uma cobertura completa da diversidade teórica dentro de um número razoável de transform antes em uma biblioteca (~ 5x109 transformantes) (figura 11). Resíduos chave para manter a estrutura canônica da CDR foram mantidos constantes no projeto de CDR3 para cadeias VK e VÀ. Para a cadeia pesada, apenas CDR3 com até 10 posições diversificadas foi gerada, uma vez que o número de clones necessários para cobrir a diversidade codificada por CDRs mais longas está além dos limites práticos de eficiência de transformação.
[00270]Oligonucleotídeos degenerados de diferentes comprimentos foram sintetizados usando códons NNS, NVT, DVK ou TVP aleatorizados. Para cada CDR H3, dois oligonucleotídeos foram sintetizados codificando uma metionina ou fenilalanina na posição 100z (figura 11). Cada oligonucleotídeo foi estendido e ampliado com dois iniciadores biotinilados externos para gerar fragmentos de DNA de filamentos duplos codificando as CDRs projetadas. Estes iniciadores externos contêm sítios de restrição BsmBI para a excisão subsequente da sequência de CDR e inserção no Aceptor de Frameworks(figura 12). Os fragmentos de DNA montados foram processados sem purificação com gel e digeridos com BsmBI. As extremidades clivadas, bem como DNA não digerido foram removidas usando microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina. Os fragmentos de DNA digeridos foram concentrados por precipitação com etanol e ligados aos vetores aceptores correspondentes pNDS VH, VK ou VÀ. Os produtos de ligação foram purificados e concentrados para transformação nas células E.coli TG1 eletrocompetentes e colocadas em placas 2xTYAG Bioassay (meio 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e glicose a 2%). Após incubação por toda a noite a 30°C, 10 mL de meio líquido 2xTYAg foram adicionados às placas e as células foram raspadas da superfície e transferidas para um tubo de polipropileno de 50 mL. 2xTYAG contendo 50% de glicerol foi adicionado à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. Alíquotas das bibliotecas foram armazenadas a -80°C. Um total de 24 bibliotecas primárias foram geradas representando um total de 1,6 x 1010 transformantes. De modo semelhante, 13 bibliotecas de cadeia leve primária foram geradas representando um total de 6,9 x 109 transformantes. Estas bibliotecas primárias contêm diversidade apenas na CDR H3, uma vez que elas são combinadas com um domínio VL fictício. Um total de 330 clones selecionados aleatoriamente foram seqüenciados para determinar a qualidade e diversidade das bibliotecas. Todos os clones codificaram diferentes sequências de domínio variável e >90% estavam no quadro. A baixa frequência das sequências contendo mutações no quadro de leitura contrasta bastante com os resultados obtidos tradicionalmente durante a construção das bibliotecas de fragmentos de anticorpo sintéticas usando abordagens de PCR de sobreposição que são mais propensas à introdução da inserção e perda significativa de clones funcionais (15- 45%) foi frequentemente reportada.
[00271]A diversidade nessas bibliotecas primárias foi restrita à CDR H3 ou CDR L3 uma vez que elas são combinadas com uma cadeia VL ou VH fictícia, respectivamente.
[00272]lniciadores usados para montagem de CDR sintética estão listados a seguir. 5 H3_R_biot ATGATGCTGCTGGCACGTCTCCGAGA (SEQ ID NO: 210) 3 H3_M_biot CCACGTCATCCGATCCGTCTCCCCCAATAATCCAT (SEQ ID NO: 211) 3 H3_F_biot CCACGTCATCCGATCCGTCTCCCCCAATAATCAAA (SEQ ID NO: 212) H3_4nnsF GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSTTTGATTATTGGGGGAGACG (SEQ ID NO: 213) H3_4nnsM GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSATGGATTATTGGGGGAGACG (SEQ ID NO: 214) H3_5nnsF GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSTTTGATTATTGGGGGAGACG (SEQ ID NO:215) H3_5nnsM GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSATGGATTATTGGGGGAGACG (SEQ ID NO:216) H3_6nnsF GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSNNSTTTGATTATTGGGGGAG ACG (SEQ ID NO: 217) H3_6nnsM GCTGGCACGTCTCCGAGANNSNNSNNSNNSNNSNNSATGGATTATTGGGGGAG ACG (SEQ ID NO: 218) H3_6dvkF GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKTTTGATTATTGGGGGAGA CG (SEQ ID NO: 219) H3_6dvkM GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKATGGATTATTGGGGGAGA CG (SEQ ID NO: 220) H3_7dvkF GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKDVKTTTGATTATTGGGGG AGACG (SEQ ID NO: 221) H3_7dvkM GCTGGCACGTCTCCGAGADVKDVKDVKDVKDVKDVKDVKATGGATTATTGGGGG AGACG (SEQ ID NO: 222) H3_7nvtF GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTTTTGATTATTGGGGGA GACG (SEQ ID NO: 223) H3_7nvtM GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTATGGATTATTGGGGG AGACG (SEQ ID NO: 224) H3_8nvtF GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTTTTGATTATTGGG GGAGACG (SEQ ID NO: 225) H3_8nvtM GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTATGGATTATTGGG GGAGACG (SEQ ID NO: 226) H3_9nvtF GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTTTTGATTATT GGGGGAGACG (SEQ ID NO: 227) H3_9nvtM GCTGGCACGTCTCCGAGANVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTNVTATGGATTATT GGGGGAGACG (SEQ ID NO: 228) H3_9dvtF GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTTTTGATTATT GGGGGAGACG (SEQ ID NO: 229) H3_9dvtM GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTATGGATTATT GGGGGAGACG (SEQ ID NO: 230) H3_10dvtF GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTTTTGATT ATTGGGGGAGACG (SEQ ID NO: 231) H3_1 OdvtM GCTGGCACGTCTCCGAGADVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTDVTATGGATT ATTGGGGGAGACG (SEQ ID NO: 232) 5 KL3_biot CCGGTGTAGCGAAGGCGTCTCAGCAG (SEQ ID NO: 233) 3 KL3_ biot TAGGGTCGCCTTGATCGTCTCCCGAAGGTCGG (SEQ ID NO: 234) K_4nns GAAGGCGTCTCAGCAGNNSNNSNNSNNSCCGACCTTCGGGAGACG (SEQ ID NO: 235) K_5nns GAAGGCGTCTCAGCAGNNSNNSNNSNNSCCGNNSACCTTCGGGAGACG (SEQ ID NO: 236) K_6nns GAAGGCGTCTCAGCAGNNSNNSNNSNNSNNSCCGNNSACCTTCGGGAGACG (SEQ ID NO: 237) 5 L44W_biot CGGTCAGTCGCAATACGTCTCCAGCATGGGAT (SEQ ID NO: 238) 5 L44Y_biot CGGTCAGTCGCAATACGTCTCCAGCATATGAT (SEQ ID NO: 239) 3 L_biot CAGGACCAGTCTCGTGAGGATCGTCTCAACAC (SEQ ID NO: 240) L44W_4nns CGTCTCCAGCATGGGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 241) L44Y_4nns CGTCTCCAGCATATGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 242) L44W_5nns CGTCTCCAGCATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 243) L44Y_5nns CGTCTCCAGCATATGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 244) L44W_6nns CGTCTCCAGCATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 245) L44Y_6nns C GTCTC C AGC ATATG ATN NSNNSNNSNNSNNSNN S GTGTTG AG AC G ATC CTC (SEQ ID NO: 246) 5 L51W_biot CGGTCAGTCGCAATACGTCTCGAACATGGGAT (SEQ ID NO: 247) 5 L51Y_biot CGGTCAGTCGCAATACGTCTCGAACATATGAT (SEQ ID NO: 248) L51W_4nns CGTCTCGAACATGGGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 249) L51Y_4nns CGTCTCGAACATATGATNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 250) L51W_5nns CGTCTCGAACATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 251) L51Y_5nns CGTCTCGAACATATGATNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 252) L51W_6nns CGTCTCGAACATGGGATNNSNNSNNSNNSNNSNNSGTGTTGAGACGATCCTC (SEQ ID NO: 253) L51Y_6nns C GTCTC GAACATATGATN NSNNSNNSNNSNNSNNS GTGTTGAG AC G ATC CTC (SEQ ID NO: 254)
EXEMPLO 7: Geração de bibliotecas secundárias
[00273]A fim de gerar bibliotecas de scFv portando diversidade em ambas as cadeias da pesada e leve, as bibliotecas de cadeia leve, sintética, primária foram combinadas com as bibliotecas de cadeia pesada, sintética, primária ou bibliotecas de cadeia pesada, natural, primária (figura 13). DNA de fagemídeo foi preparado de cada biblioteca primária e digerido com enzimas de restrição Xhol/NoTI. Os fragmentos de DNA correspondentes ao ligante e cadeias leves das bibliotecas sintéticas primárias foram inseridos por ligação aos vetores de cadeia pesada, sintética ou natural, primária digeridos. Alternativamente, a sequência ligante-VL foi também ampliada com iniciadores específicos antes da digestão com Xhol/Notl e ligação. Os produtos de ligação foram purificados por extração com fenol/clorofórmio e precipitação antes da transformação nas células E.colí TG1 eletrocompetentes e colocadas em placas 2xTYAG Bioassay (meio 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e glicose a 2%). Após incubação por toda a noite a 30°C, 10 mL de meio líquido 2xTYAg foram adicionados às placas e as células foram raspadas da superfície e transferidas para um tubo de polipropileno de 50 mL. 2xTYAG contendo 50% de glicerol foi adicionado à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. Alíquotas das bibliotecas foram armazenadas a -80°C. De modo a limitar o número de bibliotecas a serem recombinadas, elas foram agrupadas por subclasses de cadeia (isto é, VH1, VH3, VH5, VK1, VK3, V1A) e assim 9 combinações de bibliotecas foram realizadas para (isto é, VH1xVK1, VH1xVK3, VH1xVA1, VH3xVK1, VH3xVK3, VH3xVA1, VH5xVK1, VH5xVK3, VH5xVA1). O tamanho total das bibliotecas sintéticas secundárias (portando diversidade sintética em ambos VH e VL) foi de 7,3 x 109 transformantes. O tamanho total das bibliotecas naturais secundárias (portando diversidade natural na VH e diversidade sintética na VL) era de 1,5 x 1010 transformantes.
[00274]EXEMPLO 8: Geração de bibliotecas de anticorpos humanos exibindo um repertório CDRH3 derivado de uma espécie não-humana.
[00275]A fim de utilizar fontes alternativas de diversidade que permitiriam explorar um espaço tridimensional diferente dentro do sítio de combinação de anticorpos foi criada uma biblioteca para captura de CDR H3 de camundongos e a mesma foi introduzida em uma coletânea de frameworksde anticorpo humano. Para esta abordagem uma biblioteca aceptora contendo uma coletânea de genes VL com diversidade de CDR L3 sintética foi construída e combinada com uma coletânea de sequências aceptoras contendo uma sequência de DNA de fragmento principal pronta e apropriada para clonagem de restrição Tipo lis conforme descrito no Exemplo 2. Esta biblioteca representa o ponto de partida para a geração rápida de bibliotecas secundárias com múltiplas fontes de recursos naturais (humanos, bem como não- humanos) ou CDR H3 sintética. Neste exemplo, a diversidade de CDR H3 natural foi capturada de camundongos Balb/c não desafiados que foram imunizados com hlFNy ou hCCL5 (hRANTES).
[00276]A primeira etapa foi a geração de bibliotecas aceptoras por clonagem de uma coletânea de VL contendo diversidade de CDR L3 sintética nos vetores de aceptor VH framework(figura 14). As sequências de VL foram obtidas a partir das sete Bibliotecas Sintéticas Primárias descritas no Exemplo 6 por ampliação da PCR usando iniciadores 5'biot-VH fictício e 3'biot-fdtseq. Os fragmentos contendo VL resultantes de aproximadamente 400 pb foram digeridos utilizando Xhol/Notl e purificados em colunas de giro para remover iniciadores e enzimas. Similarmente, os vetores de aceptor VH pNDS contendo um fragmento principal de CDRH3 e uma ca-deia leve fictícia foram digeridos com Xhol/Notl e Swal (corte Swal dentro do de VL fictício) e purificados nas colunas Chroma Spin TE com um corte de 1.000 pb para abandonar o fragmento de VL fictício. Os fragmentos VL digeridos foram então ligados aos vetores aceptores VH (figura 14). De modo a limitar o número de bibliotecas a serem recombinadas, vetores aceptores VH e fragmentos VL foram agrupados por subclasses de cadeia (isto é, VH1, VH3, VH5, VK1, VK3, VÀ1) e assim 9 combinações de bibliotecas foram realizadas para (isto é, VH1xVK1, VH1xVK3, VHIxVÀl, VH3xVK1, VH3xVK3, VH3XVÀ1, VH5xVK1, VH5xVK3, VH5xVÀ1). Os produtos de ligação foram transformados em células E.coli TG1 eletrocompetentes e colocadas em placas 2xTYAG Bioassay (meio 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e glicose a 2%). Após incubação por toda a noite a 30°C, 6 mL de meio líquido 2xTYAg foram adicionados às placas e as células foram raspadas da superfície e transferi-das para um tubo de polipropileno de 50 mL. Glicerol a 50% de glicerol foi adicionado à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. Alíquotas das bibliotecas foram armazenadas a -80°C. O tamanho desta biblioteca aceptora portando densidade sintética na CDR L3 era de 1,9 x 109transformantes.
[00277]A próxima etapa foi isolar as sequências de CDRH3 de uma fonte não-humana. As células foram isoladas de baço de cinco camundongos Balb/c imunizados ou não desafiados e o RNA total ou purificado. cDNA foi obtido a partir do RNA extraído por RT-PCR. Este cDNA foi utilizado como modelo para isolar e amplificar VH de camundongo por PCR. Uma série de PCRs foi realizada utilizando 15 diferentes iniciadores 5' (um para cada subgrupo de VH de camundongo) específico para o início da região FR1 e um agrupamento de iniciadores 3' (quatro iniciadores abrangendo a região JH). Estas primeiras PCRs foram agrupadas e purificadas em gel de agarose 2%. O DNA purificado serviu como modelo para realizar uma segunda PCR de modo a isolar a região CDR H3 de camundongo.
[00278]Os iniciadores 5’ e 3’ para esta segunda PCR alvejam as regiões FR3 e FR4 de VH de camundongo, respectivamente. Estes iniciadores adicionaram um sítio de restrição Fokl, a fim de permitir a excisão precisa da CDR H3 e clonagem em vetores aceptores humanos. No entanto, os alinhamentos de sequências VH de murinos revelaram que a sequência no limite 5’ da CDR H3 de murino e aquelas que estão localizadas no sítio de clivagem de Fokl quase sempre diferem dos humanos por uma sequência de base, considerando que a extremidade 3' manteve empare- Ihamento entre estas duas espécies. As sequências clivadas por Fokl estão encerradas em caixas na Tabela a seguir:
Figure img0003
[00279]Por conseguinte, a base precisaria ser corrigida durante a segunda etapa de ampliação, a fim de gerar extremidades coesas que são compatíveis com as extremidades coesas geradas quando da digestão do Aceptor de Frameworks. Ampliação eficiente foi observada, sugerindo que esta conversão ocorreu rapidamente. Na extremidade 3 ', sequências de camundongos e seres humanos que serão cortadas pelas enzimas de restrição do Tipo lis são idênticas, evitando assim qualquer problema de correção.
[00280]lniciadores para a segunda ampliação foram biotinilados em suas extremidades 5' para facilitar a etapas de purificação a jusante. Os vetores de aceptor foram digeridos com BsmBI e purificados em colunas Chroma Spin TE apresentando um corte de 1.000 bp. Após digestão e purificação, as nove combinações diferentes de biblioteca foram agrupadas em razão equimolar para ligação da CDR H3 de camundongo capturado.
[00281]O DNA ligado foi purificado por extrações com fenol/ clorofórmio e concentrado por precipitação antes da transformação em células de TG1 competentes de E.coli e semeadas em placas de bioensaio 2xTYAG (méio 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e 2% de glicose). Após a incubação durante a noite a 30°C, 6 mL de meio líquido 2xTYAG foram adicionados às placas e as células foram raspadas da superfície e transferidas para um tubo de polipropileno de 50 mL. Glicerol a 50% foi adicionado à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. Alíquotas das bibliotecas foram armazenadas a -80°C. Três bibliotecas de tamanho similar foram obtidas: MnA, 2,5x108 transformantes (portando uma diversidade de frameworkhumano, natural, restrita, diversidade de camundongos não desafiados na CDR H3 e diversidade sintética na CDR L3); MiB, 7,3x107 transformantes (com uma diversidade de frameworkhumano, natural, restrita, diversidade de camundongo imune contra hlFNy na CDR H3 e diversidade sintética na CDR L3) e MiC, 1,8x108transformantes (portando uma diversidade de frameworkhumano, natural, restrita, a diversidade do camundongo imune contra hCCL5 na CDR H3 e diversidade sintética na CDR L3). Clones aleatórios foram analisados por sequenci- amento a fim de verificar que a sequência da CDR H3 havia sido reconstituída e que junções entre as regiões de CDR e Frameworkestavam corretas. Os resultados indicaram que todos os clones continham sequências CDR H3 e que o quadro de leitura havia sido restaurado, assim, codificando uma imunoglobulina de cadeia pesada variável. Todas as CDRs eram diferentes e pareciam sequências típicas de CDR H3 de camundongo, indicando que uma grande diversidade de sequências de CDR H3 de camundongo ocorrendo naturalmente havia sido obtida por esta abordagem. Além disso, a análise dos perfis de comprimento da CDR H3 indicou que uma distribuição de Gaussiana foi obtida na biblioteca de não desafiado que corresponde à distribuição esperada de comprimentos no repertório normal de camundongo. Em contraste, nas duas bibliotecas imunes os perfis eram diferentes, sugerindo que um repertório de CDRH3 diferente havia sido obtido (figura 15). Iniciadores utilizados para ampliação de CDRH3 de camundongo 1a PCR •5’ iniciadores: m5 VH1 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSAGGTYCAGCTBCAGCAGTC (SEQ ID NO: 256) m5 VH2 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTTCACCTGCAGCARTC (SEQ ID NO: 257) m5 VH3 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTRCAGCTGAAGGAGTC (SEQ ID NO: 258) m5 VH4 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTCCAACTVCAGCARCC (SEQ ID NO: 259) m5 VH5 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGATCCAGTTGGTVCAGTC (SEQ ID NO: 260) m5 VH6 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGAAGSASTC (SEQ ID NO: 261) m5 VH7 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGSKGGTGGAGTC (SEQ ID NO: 262) m5 VH8 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGAARSTTGAGGAGTC (SEQ ID NO: 263) m5 VH9 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAKGTSVAGCTTCAGGAGTC (SEQ ID NO: 264) m5 VH10 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAASSTGGTGGAATC (SEQ ID NO: 265) m5 VH11 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGRTGGARTC (SEQ ID NO: 266) m5 VH12 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTGRTGGAGTC (SEQ ID NO: 267) m5 VH13 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAGTGCAGCTGTTGGAGAC (SEQ ID NO: 268) m5 VH14ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGARGTGAAGCTTCTCSAGTC (SEQ ID NO: 269) m5 VH15 ATGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCARGTTACTCTGAAAGAGT (SEQ ID NO: 270) 3’ iniciadores:• m3 HJ1CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACGGTGACCGTGGTCCC (SEQ ID NO: 271) m3 HJ2CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACTGTGAGAGTGGTGCC (SEQ ID NO: 272) m3 HJ3CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACAGTGACCAGAGTCCC (SEQ ID NO: 273) m3 HJ4CCTGAACCGCCGCCTCCGCTCGAGACGGTGACTGAGGTTCC (SEQ ID NO: 274) 2 ª PCR 5’ iniciadores:• 5 VHR_FOK_biotGAGCCGAGGACACGGCCGGATGTTACTGTGCGAGA (SEQ ID NO: 275) 3’ iniciadores:• 3'mJH1_Fok_biotGGGGCGCAGGGACATCCGTCACCGTCTCCTC (SEQ ID NO: 276) 3'mJH2_Fok_biotGAGGAGACTGTGAGGGATGTGCCTTGGCCCCA (SEQ ID NO: 277) 3'JH1_FokGAGGAGACGGTGACGGATGTGCCCTGGCCCCA (SEQ ID NO: 278) 3'mJH4_Fok_biotGAGGAGACGGTGACGGATGTTCCTTGACCCCA (SEQ ID NO: 279)
EXEMPLO 9: Resgate de fago das bibliotecas
[00282]Cada biblioteca Primária e Secundária foi resgatada de forma independente de acordo com procedimentos de exibição padrão de fago resumidos a seguir. Um volume de célula a partir das alíquotas da biblioteca congelada suficiente para cobrir pelo menos 10 vezes a diversidade teórica da biblioteca foi adicionado a 500 mL de 2xTYAG e cresceu a 37°C com agitação (240 rpm) até que um OD600 de 0,3 a 0,5 fosse alcançado. A cultura foi, então, superinfectada com fago auxiliar MK13K07 e incubada por uma hora a 37°C (150 rpm). O meio foi então alterado por centrifugação das células a 2.000 rpm por 10 minutos, removendo a médio e res- suspendendo a microesfera em 500 mL de 2xTY-AK (100 pm/mL de ampicilina, 50 pm g/mL de canamicina). A cultura, então, cresceu durante a noite a 30 °C (240 rpm). A cultura foi centrifugada a 4.000 rpm por 20 minutos para esferonizar as célu-las. O sobrenadante foi coletado e 30% (v/v) de PEG 8000 (20%) Z2,5 M de NaCI foram adicionados para precipitar as partículas de fago por incubação da mistura de uma hora no gelo. As partículas de fago foram coletadas por centrifugação a 10.000 rpm por 30 minutos e ressuspensas em 10 mL de tampão TE (10 mM Tris-HCI pH 8,0; 1 mM de EDTA). A solução ressuspensa foi centrifugada a 10.000 rpm para limpar os fragmentos de bactérias e o procedimento de precipitação foi repetido. Após a ressuspensão final, o fago foi titulado por infecção de E.coli e absorção em 280 nm. O nível de exibição de scFv na superfície dos fagos foi também avaliado por análise de Western blot usando um anticorpo monoclonal anti-c-myc. O fago purificado a partir de diferentes bibliotecas foi armazenado congelado a -80°C após a adição de glicerol a uma concentração final de 15% (peso/volume).
[00283]A fim de usar um número razoável de bibliotecas durante os procedimentos de seleção, o fago purificado foi agrupado em quatro bibliotecas de trabalho: AAL - Fago de todas as bibliotecas primárias sintéticas de VH; AB1 - Fago de todas as bibliotecas primárias sintéticas de VL; AC1 - Fago de todas as bibliotecas primárias naturais de VH; AD1 - Fago de todas as bibliotecas secundárias naturais; AE1 - Fago de todas as bibliotecas secundárias sintéticas; MnA - Bibliotecas com a diversidade obtida de camundongos não desafiados; MiB - Bibliotecas com a diversidade capturada de camundongos imunizados com hlFNy; MiC - Bibliotecas com a diversidade obtida de camundongos imunizados com hCCL5/RANTES.
[00284]EXEMPLQ 10. Sequenciamento de alto rendimento de bibliotecas de anticorpos.
[00285]A qualidade e diversidade de uma biblioteca podem ser avaliadas por sequenciamento do DNA dos elementos aleatórios da biblioteca. Na maioria dos casos, algumas centenas de clones são sequenciados os quais representam apenas uma fração muito pequena da biblioteca (menos de 1 em 10.000.000 elementos da biblioteca). A fim de analisar o desempenho dos métodos fornecidos no presente documento, a tecnologia de sequenciamento de próxima geração foi utilizada para analisar um número mais representativo de elementos da biblioteca. DNA isolado da biblioteca AE1 foi usado como um modelo para o sequenciamento de alto rendimento utilizando um instrumento illumina Genome Analyzer. Este sistema de sequenciamento de DNA de próxima geração permite a leitura de bilhões de bases em poucos dias. As leituras do sequenciamento são relativamente curtas (cerca de 70 bases), mas perfeitamente compatíveis com nosso projeto de biblioteca. Como a diversidade está confinada às regiões de CDR3, uma leitura de 70 bases é suficiente para cobrir a CDRH3 e parte da região de framework3 para identificação da família VH. Esta tecnologia tem sido aplicada para seqüenciar muitos milhões de regiões de CDRH3 da biblioteca AE1. 5.078.705 sequências foram obtidas para um total de 365.666.760 bases. Análise dos dados indicou que 5.007.022 sequências (98,6% do total) eram únicas. Um total de 4.680.882 sequências poderia ser inequivocamente atribuído a uma família VH (VH1, VH3 e VH5) e a representação das famílias VH na biblioteca AE1 determinada (41% da VH1, 30% VH3; 29% VH5). Uma verificação importante foi a de que a proporção de inserções no quadro variou entre 88 e 91%. Estes dados confirmaram de maneira muito mais estatística os resultados de sequenciamento das 24 bibliotecas primárias VH sintéticas descritas no Exemplo 6. Este conjunto combinado de dados de sequenciamento demonstra que o processo de clonagem por restrição do Tipo lis empregado neste método é muito robusto, levando a uma inserção eficiente e produtiva nas 24 construções de biblioteca independentes realizadas para gerar a diversidade VH da biblioteca AE1.
[00286]O sequenciamento de milhões de elementos da biblioteca representa um passo sem precedentes de controle de qualidade para uma biblioteca de anticorpos. Os resultados demonstram que o método permite a geração de bibliotecas de alta qualidade e alta diversidade de uma maneira que pode ser reproduzida além de ser robusta.
EXEMPLO 11: Seleções de exibição de fago usando bibliotecas secundárias Seleções de fase liquida contra interferon gama humano (hlFNy):
[00287]AI[quotas das bibliotecas de fago AD1 e AE1 (1011 - 1012 Pfu) foram bloqueadas com PBS contendo 3% (peso/volume) de leite desnatado por uma hora a temperatura ambiente em um agitador giratório. O fago bloqueado foi então desmarcado nas microesferas magnéticas de estreptavidina (Dynal M-280) por uma hora a temperatura ambiente em um agitador giratório. O fago desmarcado foi então incubado com hlFNy biotinilado in vivo (100 nM) por duas horas à temperatura ambiente em um agitador giratório. As microesferas foram capturadas usando um suporte magnético, seguido de quatro lavagens com PBS/0,1% Tween 20 e 3 lavagens com PBS. Microesferas foram adicionadas diretamente a 10 mL de células em crescimento exponencial TG1 e incubados por uma hora a 37°C com agitação lenta (100 rpm). Uma alíquota de TG1 infectado foi diluída em série para titular o rendimento da seleção. O restante de TG1 infectado foi girado a 3.000 rpm por 15 minutos e res- suspenso em 0,5 mL 2xTYAG (meio 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e 2% de glicose) e espalhado sobre placas Bioassay 2xTYAG agar. Após a incubação durante a noite a 30°C, 10 mL de 2xTYAG foram adicionados às placas e as células foram raspadas da superfície e transferidas para um tubo de polipropileno de 50 mL. 2xTYAG contendo glicerol a 50% foi adicionado à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. Alíquotas da rodada de seleção foram mantidas a -80°C. Os rendimentos de fago foram titulados após cada rodada e o aumento progressivo de rendimento indicou que o enriquecimento de clones específicos para o alvo estava ocorrendo (figura 16).
Seleções por "panning” contra anticorpo monoclonal 5E3 de ratos:
[00288]lmunotubos foram revestidos com 5E3 a 10 pg/mL em PBS durante a noite a 4°C e imunotubos para desmarcar fago foram revestidos com um anticorpo de rato irrelevante sob as mesmas condições. Após lavagem os imunotubos foram bloqueados com PBS contendo leite desnatado a 3% (peso/volume) por uma hora a temperatura ambiente. Alíquotas de bibliotecas de fago AD1 e AE1 (1011-1012 Pfu) foram bloqueadas com PBS contendo 3% (peso/volume) de leite desnatado por uma hora a temperatura ambiente em um agitador giratório. O fago bloqueado foi então desmarcado nos imunotubos revestidos com um anticorpo de rato irrelevante por uma hora a temperatura ambiente em um agitador giratório. O fago desmarcado foi então transferido para os imunotubos revestidos com 5E3 e incubado por duas horas a temperatura ambiente em um agitador giratório. Os tubos foram lavados cinco vezes com PBS/0,1% Tween 20 e 3 lavagens com PBS. O fago foi eluído com TEA 100 mM por 10 minutos e neutralizado com 1M Tris HCI pH 7,5. O fago foi adicionado a 10 mL de células em crescimento exponencial TG1 e incubado por uma hora a 37°C com agitação lenta (100 rpm). Uma alíquota de TG1 infectado foi diluída em série para titular o rendimento da seleção. O restante de TG1 infectado foi girado a 3.000 rpm por 15 minutos e ressuspenso em 0,5 mL 2xTYAG (meio 2xTY contendo 100 pg/mL de ampicilina e 2% de glicose) e espalhado sobre placas Bioassay 2xTYAG agar. Após a incubação durante a noite a 30°C, 10 mL de 2xTYAG foram adicionados às placas e as células foram raspadas da superfície e transferidas para um tubo de polipropileno de 50 mL. 2xTYAG contendo glicerol a 50% foi adicionado à suspensão de células para obter uma concentração final de glicerol a 17%. Alíquotas da rodada de seleção foram mantidas a -80°C. Rodadas de seleção foram realizadas por alternância entre 5E3 de rato e uma versão quimérica de 5E3 onde a região variável foi fundida aos domínios constantes do camundongo. Estas rodadas alternadas foram realizadas a fim de enriquecer clones específicos para a região variável de 5E3 e geração de anticorpos antiidiotípicos. Os rendimentos de fago foram titulados após cada rodada e o aumento progressivo de rendimento indicou que o enriquecimento de clones específicos para o alvo estava ocorrendo (figura 17).
[00289]Resgate de fago: 100 pL de suspensão de células obtidas de rodadas de seleção anteriores foram adicionados a 20 mL de 2xTYAG e cresceram a 37°C com agitação (240 rpm) até que um OD600 de 0,3 a 0,5 fosse alcançado. A cultura foi, então, superinfectada com 3,3 x 1010 de fago auxiliar MK13K07 e incubada por uma hora a 37°C (150 rpm). O meio foi então alterado por centrifugação das células a 2.000 rpm por 10 minutos, removendo o médio e ressuspendendo a micro- esfera em 20 mL de 2xTY-AK (100 pg/mL de ampicilina, 50 p g/mL de canamicina). A cultura então se desenvolveu durante a noite a 30°C (240 rpm).
[00290]Resgate de fago monoclonal para ELISA: Clones simples foram escolhidos em uma placa de microtitulação contendo 150 pL de meio 2xTYAG (2% de glicose) por poço e se desenvolveram a 37°C (100-120 rpm) por 5-6 horas. Fago auxiliador M13KO7 foi adicionado a cada poço para obter uma multiplicidade de infecção (MOI), de 10 (ou seja, 10 fagos para cada célula na cultura) e incubado a 37°C (100 rpm) por 1 hora. Após crescimento, as placas foram centrifugadas a 3.200 rpm por 10 minutos. Sobrenadante foi cuidadosamente removido, as células ressus- pensas em 150 pL de médio 2xTYAK e se desenvolveu durante a noite a 30°C (120 rpm). Para o ELISA, os fagos são bloqueados por adição de 150 pL de PBS em concentração dupla contendo leite em pó desnatado a 5%, seguido por incubação de uma hora a temperatura ambiente. As placas foram então centrifugadas por 10 minutos a 3.000 rpm e o sobrenadante contendo o fago foi usado para o ELISA.
[00291]Fago ELISA: Placas ELISA (Maxisorb, NUNC) foram revestidas por toda noite com 2 pg/mL de hlFNy em PBS ou 2 pg/mL de 5E3 de rato em PBS. Placas de controle foram revestidas com 2 pg/mL de BSA ou um anticorpo monoclonal de rato irrelevante. As placas foram então bloqueadas com 3% de leite desnata- do/PBS em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS 0,05% Tween 20 antes de transferir os sobrenadantes de fago pré-bloqueados e incubação por uma hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween 20 0,05%. 50 pL de 3% de leite desnatado/PBS contendo anticorpo anti-M13 conjugado (HRP) (Amersham, diluído 1:10.000) foram adicionados a cada poço. Após incubação à temperatura ambiente por 1 hora, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS 0,05% Tween 20. ELISA foi então desenvolvido por adição de 50 pL de TMB (Sigma) e 50 pL de 2N H2SO4 para parar a reação. A intensidade da absorção foi lida a 450 nm. Clones específicos para hlFNy seriam identificados e as taxas de acerto variaram entre 10% e 30% após a terceira rodada de seleção. Clones específicos para a região variável de 5E3 poderiam também ser identificados e as taxas de acerto variaram entre 7 e 48% após a terceira rodada de seleção.
[00292]Sequenciamento do clone de fago:Clones de fago foram cultivados em 5 mL de meio 2xTYAG (2% glicose) por poço e se desenvolveram a 37°C (120 rpm) durante a noite. No dia seguinte, o DNA do fegemido foi purificado e utilizado para sequenciamento do DNA empregando um iniciador específico para pNDSI: mycseq, 5 '-CTCTTCTGAGATGAGTTTTTG. (SEQ ID: 255).
[00293]Purificação de scFv em larga escala: A cultura inicial de 1 mL de 2xTYAG foi inoculada com uma única colônia de uma placa de ágar de 2xTYAG recém raiada e incubada com agitação (240 rpm) a 37°C por 5 horas. 0,9 mL desta cultura foi usado para inocular uma cultura de 400 mL do mesmo meio e foi cultivado durante a noite a 30°C com agitação vigorosa (300 rpm).
[00294]No dia seguinte, a cultura foi induzida por adição de 400 pL de IM IPTG e a incubação continuou por mais 3 horas. As células foram coletadas por centrifugação a 5.000 rpm por 10 minutos a 4°C. Células esferonizadas foram ressus- pensas em 10 mL de tampão TES resfriado em gelo complementado com inibidores da protease, como descrito acima. Choque osmótico foi obtido por adição de 15 mL de 1: 5 de tampão TES diluído e incubação por 1 hora no gelo. As células foram cen-trifugadas a 10.000 rpm por 20 minutos a 4°C para esferonizar os fragmentos de células. O sobrenadante foi cuidadosamente transferido para um novo tubo. Imidazol foi adicionado ao sobrenadante a uma concentração final de 10 mM. 1 mL de Ni- NTA (Qiagen), equilibrado em PBS foi adicionado a cada tubo e incubado em um agitador rotativo a 4°C (20 rpm) por 1 hora. Os tubos foram centrifugados a 2.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante cuidadosamente removido. A resina granulada foi ressuspensa em 10 mL de tampão Wash frio 1 (4°C) (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI, 10 mM imidazol, pH 8,0). A suspensão foi adicionada a uma coluna polyprep (BioRad). 8 mL de tampão Wash frio 2 (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI, 20 mM imidazol, pH a 8,0) foram usados para lavar a coluna por fluxo de gravidade. O scFvs foram eluídos da coluna com 2 mL de tampão de eluição (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI, 250 mM imidazol, pH 8,0). As frações foram analisadas por absorção em 280 nm e as frações contendo proteínas contendo foram combinadas antes da troca de tampão em uma coluna de dessalinização PD10 (Amersham) equilibrada com PBS. Os scFvs em PBS foram analisados por SDS-PAGE e quantificados por absorção em 280 nm. Os scFvs purificados foram aliquotados e estocados a -20 Cea 4°C.
EXEMPLO 12. Análise de perfis de CDR3 obtidos após seleção usando o sequenciamento de alto rendimento
[00295]Usando a tecnologia de sequenciamento de próxima geração, como descrito no Exemplo 10, a distribuição de comprimentos CDR H3 dentro de cada família VH nas bibliotecas AE1 e AD1, assim como no rendimento obtido após a terceira rodada de seleção foram analisados. Os perfis das bibliotecas AE1 e AD1 são claramente diferentes (figura 18). A distribuição do comprimento de CDR H3 na biblioteca AE1 corresponde ao projeto da biblioteca pretendida, com comprimentos que variam entre 9-15 aminoácidos. Em contraste, CDR H3 muito mais longa de até 22 aminoácidos é encontrada na biblioteca AD1, e o perfil corresponde à distribuição do comprimento observado em repertórios naturais de seres humanos. Estes resultados confirmam que um repertório de CDR H3 natural de ser humano foi obtido durante a construção da biblioteca AD1. Uma análise semelhante realizada após três rodadas de seleção contra 5E3 revelou que perfis de comprimento de CDR H3 completamente diferentes foram selecionados. Especificamente, um enriquecimento dramático de CDR H3, de 8 e 21 aminoácidos de comprimento pode ser observado na seleção realizada com a biblioteca AD1. Este conjunto de dados demonstrou que diferentes perfis CDR H3 foram enriquecidos das duas bibliotecas após a seleção contra o mesmo alvo. Além disso, esta análise demonstra que, utilizando-se a presente invenção, CDR H3 longa que é muito difícil de cobrir usando diversidade sinté-tica pode ser capturada em frameworkshumanos selecionados humanos e selecionada.
EXEMPLO 13. Avaliação de scFvs Identificados em ensaios de ligação
[00296]Preparações scFvs purificadas de clones com sequências diferentes e que foram identificadas positivamente contra a região variável de 5E3 foram testadas quanto a ligação contra 5E3 quimérico em um ELISA de resposta de dose. Estas preparações também foram testadas contra um anticorpo do camundongo irrelevante (1 A6). Placas ELISA (Maxisorb, NUNC) foram revestidas por toda noite com 2 pg/mL de 4E3 de camundongo em PBS. Placas de controle foram revestidas com 2 pg/mL de anticorpo monoclonal 1A6. As placas foram então bloqueadas com 3% de leite desnatado/PBS em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS 0,05% Tween 20 antes da adição de concentrações diferentes de scFv purificado e incubação por uma hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween 20 0,05%. 50 pL de 3% de leite desnatado/PBS contendo anticorpo anti-myc conjugado (HRP) foram adicionados a cada poço. Após incubação à temperatura ambiente por 1 hora, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS 0,05% Tween 20. ELISA foi então desenvolvido por adição de 50 pL de substrato vermelho fluorescente Amplex e o sinal foi vermelho no espectrofotô- metro de fluorescência. Os dados mostram que a maioria dos clones é altamente específica para 5E3 uma vez que eles não reconhecem 1A6 e que eles são direcionados contra as regiões reviáveis de 5E3 (figura 19).
[00297] Da mesma forma, preparações de scFvs purificadas de clones apre- sentando sequências diferentes e que foram identificados no fago ELISA como ligan- tes contra hlFNy foram testados quanto a ligação contra hlFNy em um experimento de resposta de dose. Placas ELISA (Maxisorb, NUNC) foram revestidas por toda noite com 2 pg/mL de hlFNy em PBS e as placas de controle foram revestidas com 2 pg/mL de BSA em PBS. As placas foram então bloqueadas com 3% de leite desna- tado/PBS em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS 0,05% Tween 20 antes da adição de concentrações diferentes de scFv purificado e incubação por uma hora em temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween 20 0,05%. 50 pL de 3% de leite desnatado/PBS contendo anticorpo anti-myc conjugado (HRP) foram adicionados a cada poço. Após incubação à temperatura ambiente por 1 hora, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS 0,05% Tween 20. ELISA foi então desenvolvido por adição de 50 pL de substrato de TMB e 50 pL de 2N H2SO4 para parar a reação. O sinal foi vermelho no es- pectrofotômetro de absorvência a 450 nm. Os dados mostram que os clones selecionados se ligam ao hlFNy em um modo dependente de dose e fornecem um sinal muito bom quando comparados a um scFv A6 de controle positivo que apresenta uma alta afinidade para hlFNy (figura 20).
EXEMPLO 14. Inibição da expressão de gene repórter induzida por interferon gama em ScFv
[00298]Um painel de scFv selecionados específicos para hlFNy foi produzido e purificado como descrito acima e testado quanto a capacidade de bloquear a atividade biológica do hlFNy. Um gene repórter (firefly luciferase) direcionado pelo promotor GBP1 induzível para IFNy foi transfectado em linhagem de células de melanoma humano Me67.8. Várias concentrações de scFv foram incubadas com 2ng/mL de hlFNy e então adicionadas à cultura celular. Após um tempo de incubação de 6 horas, o ensaio de repórter luciferase foi realizado e da intensidade da luminescência medida. A atividade foi comparada a um scFv isolado de outra biblioteca de anticorpos humanos scFv construída por captura tradicional de repertórios VH/VL de doadores humanos (clone G9). Os dados mostram que scFv isolado, quer de bibliotecas de diversidade humana (AE1 e AD1) natural ou sintética foram capazes de neutralizar a atividade biológica do hlFNy de um modo dependente de dose (figura 21). O potencial de neutralização destes scFvs foi superior ao clone G9 de scFv de marca.
EXEMPLO 15. Inibição da expressão da MHC classe II induzida por interferon gama em scFv
[00299] Um ensaio de citometria de fluxo foi implementado para identificar anticorpos de IgG plenamente humanos, ou fragmentos dos mesmos, capazes de bloquear a expressão de moléculas da MHC classe II induzido por IFN y. Após a colocação em placa das células Me67.8, 5 ng/mL de IFNy humano recombinante foi adicionado às culturas, na presença de várias concentrações de anticorpos mono- clonais anti-IFNy completamente humanos. Após 48 horas na cultura, as células foram coradas com anticorpo da MHC classe II anti-humano marcado fluorescente- mente (HLA-DR) e analisadas usando um FACSCalibur®. Assim, o ICso (onde 50% da expressão da MHC classe II induzida por IFN y são inibidos, isto é 50% da concentração inibidora) para cada anticorpo candidato é medido.
[00300]scFv humanos completamente purificados foram produzidos conforme descrito acima. O efeito dos scFv selecionados na expressão de MHC classe II induzida por IFNy nas células de melanoma foi avaliado usando o ensaio com base em célula por citometria de fluxo. Estes scFv inibiram a expressão de MHC II induzida por IFNy nas células de melanoma (figura 22).
EXEMPLO 16: Reformatação de scFv em formato IgG
[00301]A sequência de VH e VL de scFv selecionados foi ampliada com oli- gonucleotídeos específicos introduzindo uma sequência líder e um sítio de restrição Hindlll na extremidade 5'. Um sítio Apal foi introduzido na extremidade 3' da pesada considerando-se que um sítio Avrll e um sítio BsiVI foram introduzidos na extremidade 3' das sequências de cadeia leve lambda ou kappa, respectivamente. As se- quências ampliadas VH foram digeridas com Hindlll/Apal e clonadas no vetor de expressão pCon_gama1 (Lonza, Basel, Suíça). (Lonza, Basel, Suíça). As sequências lambda VL ampliadas foram digeridas com Hindlll/Avrll e clonadas no vetor de expressão pCon_lambda2 e as sequências kappa VL ampliadas foram digeridas com Hindlll/BsiWI e clonadas no vetor de expressão pCon_kappa (LONZA, Basel, Suíça). As construções foram verificadas por sequenciamento antes da transfecção em células de mamíferos.
[00302]As sequências de cDNA VH e VL em seus vetores de expressão adequados foram transfectadas em células de mamíferos utilizando o Reagente de Transfecção Fugene 6 (Roche, Basel, Suíça). Resumidamente, células Peak foram cultivadas em placas de 6 poços a uma concentração de 6 x 105 células por poço em 2 mL de meio de cultura contendo soro fetal bovino. Os vetores de expressão, codificando as sequências candidatas de VH e VL foram cotransfectados nas células usando o reagente de transfecção Fugene 6 de acordo com instruções do fabricante. Um dia após a transfecção, o meio de cultura foi aspirado e 3 mL de meio fresco isento de soro foram adicionados às células e cultivados por três dias a 37°C. Após período de três dias de cultura, o sobrenadante foi colhido para IgG purificada nas colunas de fluxo rápido Proteína G-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, MO) de acordo com instruções do fabricante. Resumidamente, os sobrenadantes das células transfectadas foram incubados durante a noite a 4°C com tampão de ligação de IgG ImmunoPure (G) (Pierce, Rockford IL). As amostras foram então passadas pelas colunas de fluxo rápido de Proteína G-Sepharose 4B e a IgG consequentemente purificada utilizando tampão de eluição. A fração eluída de IgG foi então dialisada contra PBS e o conteúdo de IgG quantificado por absorção em 280 nm. Pureza e integridade IgG foram verificadas por SDS-PAGE.
EXEMPLO 17: Inibição da atividade biológica de interferon gama em IgG
[00303]Dois scFv, AE1-4-R3-P2E4 (2E4) e A2-AD1-R4P1A9 (1A9), que confirmaram ação inibitória contra hlFNy em ensaios funcionais foram reformatados em IgG, conforme descrito no Exemplo 16 e testados no ensaio de gene repórter induzido por interferon-gama descrito no Exemplo 14. Os resultados mostrados na Figura 23 indicam que, em um formato de IgG ambos 1A9 e 2E4 poderiam neutralizar a atividade de hlFNy com ICso de 42 nM e 10 nM, respectivamente, considerando que um controle negativo de IgG (NI-0701) não teve nenhum efeito neste ensaio. Assim, estes dois candidatos isolados de ambas as bibliotecas de diversidade sintética e natural podem ser reformatados na IgG total e possuem atividade neutralizante contra o alvo selecionado.
EXEMPLO 18: Desenvolvimento de um ensaio farmacocinético para a detecção de 5E3 no soro de camundongos
[00304]Dois candidatos scFv, AD15E3R3P1_A4 e AD25E3R3P1_G11 que se ligam especificamente ao anticorpo monoclonal de camundongo 5E3 (figura 19) foram reformatados em IgG humana plena, conforme descrito no Exemplo 16. A especificidade de IgGs DA4 e G11 correspondentes foi confirmada em ELISA contra 5E3 de camundongo e uma versão quimérica desse anticorpo monoclonal em que as regiões variáveis do camundongo foram fundidas às regiões de IgG constantes do rato. Os resultados mostrados na Figura 24 demonstram que IgG DA4 e G11 são específicas para a região variável de 5E3 como elas se ligam a ambos 5E3 quimérico de rato e camundongo e não aos controles de isotipo de camundongo e rato. Esses dois anticorpos monoclonais foram usados para desenvolver um ensaio para a quantificação de 5E3 no soro de camundongo para estudos farmacocinéticos. Várias diluições de soro de camundongo foram incrementadas com 5 pg/mL de anticorpos 5E3 de camundongo e diluídas serialmente, de tal forma que a concentração sérica foi mantida constante ao longo da série de diluição. Placas Maxisorb (Nunc, Dinamarca) foram revestidas durante a noite com 1 pg/mL de IgG DA4 ou IgG G11. Após bloqueio com PBS; uma série de diluições em 1% BSA das preparações séricas incrementadas foi adicionada aos poços. Após incubação e lavagem, o sinal foi revelado através de um anticorpo monoclonal de cadeia leve kappa anti-camundongo para peroxidase de rábano silvestre (HRP) e um substrato fluorescente (Amplex vermelho; Invitrogen). Os resultados mostram que ambos os anticorpos podem ser usados para detectar especificamente o anticorpo 4E3 monoclonal de camundongo no soro de camundongo (figura 25). O limite de detecção de 5E3 de camundongo no soro foi de cerca de 200 ng/mL e o ensaio não foi significativamente afetado pela concentração sérica indicando que IgG DA4 e IgG G11 são altamente específicos para 5E3 de camundongo e não se ligam à outra imunoglobulina do camundongo. Estas experiências demonstram que anticorpos antiidiotípicos altamente específicos poderiam ser isolados de bibliotecas naturais ou sintéticas AE1 e AD1.
EXEMPLO 19: Seleção de fago usando bibliotecas contendo diversidade de CDRH3 obtida de camundongos não desafiados e imunizados
[00305]As bibliotecas de MnA, MiB e MiC descritas nos Exemplos 8 e 9 foram empregadas em paralelo para seleções de fago contra hlFNy, seguindo-se o processo descrito no Exemplo 11. Dependendo do processo de seleção, um enriquecimento semelhante do fago foi observado (figura 26).
[00306]Expressão de scFv no formato de placa de microtitulação:Clones simples foram escolhidos em uma placa de microtitulação contendo 150 pL de meio 2xTYAG (2% de glicose) por poço e se desenvolveram a 37°C (100-120 rpm) por 5-6 horas. As placas foram centrifugadas a 280 rpm, o meio descartado e as microesferas de célula ressuspensas em 100 pL de médio 2xTYAK contendo 1 mM de IPTG. As placas foram incubadas por toda noite a 30C com agitação (100 rpm). Seguindo- se o desenvolvimento, as placas foram centrifugadas a 3.200 rpm por 10 minutos e o sobrenadante cuidadosamente transferido para uma placa contendo PBS duplamente concentrado contendo 5% de leite em pó desnatado para bloqueio.
[00307]scFv ELISA'. Placas ELISA (Maxisorb, NUNC) foram revestidas por toda noite com 2 pg/mL de hlFNy em PBS. Placas de controle foram revestidas com 2 pg/mL de BSA recombinante (Sigma). As placas foram então bloqueadas com 3% de leite desnatado/PBS em temperatura ambiente por 1 hora. As placas foram lava- das 3 vezes com PBS 0,05% Tween 20 antes de transferir os sobrenadantes de scFv pré-bloqueados e incubação por uma hora a temperatura ambiente. As placas foram lavadas 3 vezes com PBS Tween 20 a 0,05%. 50 pL de leite desnatado a 3%/PBS contendo anticorpo anti-cMyc conjugado (HRP) (diluído 1:5.000) foram adicionados a cada poço. Após incubação à temperatura ambiente por 1 hora, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS 0,05% Tween 20. ELISA foi então desenvolvido por adição de 50 pL de Amplex Vermelho (Invitrogen). A intensidade da fluorescência foi lida a 590 nm em excitação a 530 nm. A frequência de acertos fornecendo um sinal de metade da intensidade do clone de controle A6 foi avaliada para cada rodada de seleção para as três bibliotecas (figura 27). A taxa de acerto obtida com a biblioteca MiB foi dramaticamente superior em comparação com as duas outras bibliotecas e o nível médio de sinal foi superior para os clones derivados da biblioteca MiB, indicando que scFvs de maior afinidade foram enriquecidos (figura 28). Para confirmar esta observação, clones positivos foram sequenciados, expressos em maior escala e purificados para serem testados em experimentos de ligação de resposta de dose de acordo com o Exemplo 13. Todos scFvs derivados da biblioteca MiB tinham uma maior afinidade aparente para hlFNy que aqueles isolados da biblioteca MnA de não desafiados (figura 29). Os resultados indicam que o repertório de CDRH3 dos camundongos imunizados com uma proteína poderia ser capturado em um contexto de frameworkde anticorpo humano de uma forma produtiva para gerar a maior frequência de fragmentos de anticorpo humanos de alta afinidade. As bibliotecas geradas usando a presente invenção, portanto, representam um meio poderoso para geração de anticorpos com potencial terapêutico.
OUTRAS MODALIDADES
[00308]Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com a descrição detalhada da mesma, a descrição precedente se destina a ilustrar e não limitar o âmbito da invenção, que é definido pelo escopo das reivindicações anexas. Outros aspectos, vantagens e modificações estão dentro do escopo das reivindicações que se seguem.

Claims (39)

1. Método para produzir uma coleção de ácidos nucléicos, em que cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina compreendendo uma sequência da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isolada de uma espécie de mamífero, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: a) ) fornecer uma pluralidade de sequências de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkhumana que codificam domínios variáveis de imunoglobulina distintos compreendendo uma mistura de pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável, em que cada sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkcompreende uma primeira região framework(FR1), uma segunda região framework(FR2), uma terceira região framework(FR3) e uma quarta região framework(FR4), em que as regiões FR1 e FR2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR2 e FR3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal compreendendo pelo menos dois sítios de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificadas codificando sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas do repertório de imunoglobulina de espécies de mamíferos, em que cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificadas compreende um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos que codificam as regiões CDR3 utilizando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digerir a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkusando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis da etapa (a); e d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridas que codificam as regiões CDR3 da etapa (c) no Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c), tal que, as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por sequências de ácidos nucléicos que codificam a região CDR3 produzindo assim uma coleção de ácidos nucléicos que codificam um domínio variável da imunoglobulina compreendendo uma sequência CDR3 que não contém os sítios de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b).
2. Método para produzir uma coleção de ácidos nucléicos, em que cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina compreendendo uma sequência da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isolada de uma espécie de mamífero não humano, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: a) ) fornecer uma pluralidade de sequências de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkhumana que codificam domínios variáveis de imunoglobulina distintos compreendendo uma mistura de pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável, em que cada sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkcompreende uma primeira região framework(FR1), uma segunda região framework(FR2), uma terceira região framework(FR3) e uma quarta região framework(FR4), em que as regiões FR1 e FR2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR2 e FR3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucleicos de filamento principal compreendendo pelo menos dois sítios de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucleicos aleatória; b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucleicos diversificadas codificando sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas do repertório de imunoglobulina de espécies de mamíferos não humanos, em que cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucleicos diversificadas compreende um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucleicos que codificam as regiões CDR3 utilizando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digerir a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkusando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis da etapa (a); e d) ligar as sequências de ácidos nucleicos digeridas que codificam as regiões CDR3 da etapa (c) no Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c), tal que, as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por sequências de ácidos nucleicos que codificam a região CDR3 produzindo assim uma coleção de ácidos nucleicos que codificam um domínio variável da imunoglobulina compreendendo uma sequência CDR3 que não contém os sítios de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b).
3. Método para produzir uma coleção de ácidos nucleicos, em que cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina compreendendo uma sequência da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isolada de um ser humano, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: a) ) fornecer uma pluralidade de sequências de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkhumana que codificam domínios variáveis de imunoglobulina distintos compreendendo uma mistura de pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável, em que cada sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkcompreende uma primeira região framework(FR1), uma segunda região framework(FR2), uma terceira região framework(FR3) e uma quarta região framework(FR4), em que as regiões FR1 e FR2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR2 e FR3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal compreendendo pelo menos dois sítios de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificadas codificando sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas do repertório de imunoglobulina humanas, em que cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificadas compreende um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo IIs em cada extremidade; c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos que codificam as regiões CDR3 utilizando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digerir a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkusando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis da etapa (a); e d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridas que codificam as regiões CDR3 da etapa (c) no Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c), tal que, as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por sequências de ácidos nucléicos que codificam a região CDR3 produzindo assim uma coleção de ácidos nucléicos que codifi- cam um domínio variável da imunoglobulina compreendendo uma sequência CDR3 que não contém os sítios de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b).
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) é realizada por ampliação da sequência CDR3 de uma espécie de mamífero usando iniciadores oligonucleotídicos contendo um sítio de restrição do Tipo IIs.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o iniciador oligonucleotídico é projetado para melhorar a compatibilidade entre a sequência CDR3 de mamífero e o Aceptor de Frameworkhumano que codifica um domínio variável de imunoglobulina.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o iniciador oligonucleotídico é projetado para modificar uma sequência de ácidos nucléicos em um limite da sequência CDR3 de mamífero para produzir uma sequência de nucleotídeos coesa e compatível no Aceptor de Frameworkhumano que codifica um domínio variável de imunoglobulina.
7. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) é realizada amplificando a sequência CDR3 a partir de uma espécie de mamífero não humano, usando iniciadores oligonucleotídicos contendo um sítio de restrição de Fokl Tipo lis.
8. Método, de acordo com a reivindicação 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a espécie de mamífero não-humano é um primata não-humano, um roedor, um canino, um felino, uma ovelha, uma cabra, um gado, um cavalo, membros da família Camelídae, uma lhama, um camelo, um dromedário, ou um porco.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que os sítios de reconhecimento de enzima de restrição Tipo lis das etapas (a) e (b) são reconhecidos por uma enzima de restrição Tipo IIs diferente.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são os sítios de reconhecimento BsmBI, sítios de reconhecimento Bsal, sítios de reconhecimento Fokl ou uma combinação destes.
11. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que as sequências de ácidos nucléicos diversificadas que codificam sequências CDR3 codificam sequências de CDR3 de cadeia pesada (CDR H3).
12. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que as sequências de ácidos nucléicos diversificadas que codificam sequências CDR3 codificam sequências CDR3 de cadeia leve (CDR L3).
13. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcompreende uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana selecionada dentre VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23, e VH5-51.
14. Método, de acordo com qualquer umas das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucléicos de Aceptor de Frameworkcompreende uma sequência gênica variável de cadeia leve kappa humana.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência gênica variável da cadeia leve kappa humana é selecionada dentre VK1 -33, VK1 -39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20.
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que sequência de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkcompreende uma sequência gênica variável da cadeia leve lambda humana.
17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência gênica variável da cadeia leve lambda humana é selecionada dentre VL1-44 eVL1-51.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda as etapas de (e) clonar a biblioteca de ácidos nucleicos que codificam domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformar o vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivar a célula hospedeira em condições suficientes para expressar uma pluralidade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é E. coli.
20. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão é um fagemídeo ou um vetor de fago.
21. Método para produzir uma coleção de ácidos nucleicos, em que cada ácido nucléico codifica um domínio variável de imunoglobulina compreendendo uma sequência da região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isolada de um de mamífero não humano imunizado, CARACTERIZADO pelo fato de que o método compreende: a) ) fornecer uma pluralidade de sequências de ácido nucléico de Aceptor de Frameworkhumana que codificam domínios variáveis de imunoglobulina distintos compreendendo uma mistura de pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável, em que cada sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkcompreende uma primeira região framework(FR1), uma segunda região framework(FR2), uma terceira região framework(FR3) e uma quarta região framework(FR4), em que as regiões FR1 e FR2 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 1 (CDR1), as regiões FR2 e FR3 são intercaladas por uma região determinante de complementaridade 2 (CDR2) e as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por uma sequência de ácidos nucléicos de filamento principal compreendendo pelo menos dois sítios de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis intercalados por uma sequência de ácidos nucléicos aleatória; b) fornecer uma pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificadas codificando sequências de região determinante de complementaridade 3 (CDR3) isoladas do repertório de imunoglobulina de mamíferos não humanos imunizados, em que cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos diversificadas compreende um sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis em cada extremidade; c) digerir cada uma da pluralidade de sequências de ácidos nucléicos que codificam as regiões CDR3 utilizando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis da etapa (b) e digerir a sequência de ácidos nucléicos de filamento principal da etapa (a) a partir do Aceptor de Frameworkusando uma enzima de restrição do Tipo lis que se liga ao sítio de reconhecimento da enzima de restrição Tipo lis da etapa (a); e d) ligar as sequências de ácidos nucléicos digeridas que codificam as regiões CDR3 da etapa (c) no Aceptor de Frameworkdigerido da etapa (c), tal que, as regiões FR3 e FR4 são intercaladas por sequências de ácidos nucléicos que codificam a região CDR3 produzindo assim uma coleção de ácidos nucléicos que codificam um domínio variável da imunoglobulina compreendendo uma sequência CDR3 que não contém os sítios de reconhecimento da enzima de restrição do Tipo lis das etapas (a) e (b).
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) é realizada por ampliação da sequência CDR3 de uma espécie de mamífero não humano imunizado usando iniciadores oligonucleotídicos contendo um sítio de restrição do Tipo IIs.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que o iniciador oligonucleotídico é projetado para melhorar a compatibilidade entre a sequência CDR3 de mamífero não humano imunizado e o Aceptor de Framework humano que codifica um domínio variável de imunoglobulina.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de que o iniciador oligonucleotídico é projetado para modificar uma sequência de ácidos nucléicos em um limite da sequência CDR3 de mamífero não humano imunizado para produzir uma sequência de nucleotídeos coesa e compatível no Aceptor de Frameworkhumano que codifica um domínio variável de imunoglobulina.
25. Método, de acordo com a reivindicação 22, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) é realizada amplificando a sequência CDR H3 a partir de um mamífero não humano humanizado, usando iniciadores oligonucleotídicos contendo um sítio de restrição de Fokl Tipo lis.
26. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que o mamífero não-humano imunizado é um primata não-humano, um roedor, um canino, um felino, uma ovelha, uma cabra, um gado, um cavalo, uma lhama, um camelo, um dromedário, ou um porco.
27. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que os sítios de reconhecimento de enzima de restrição Tipo lis das etapas a) e b) são reconhecidos por uma enzima de restrição Tipo lis diferente.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, CARACTERIZADO pelo fato de que os sítios de reconhecimento de enzima de restrição do Tipo lis são os sítios de reconhecimento BsmBI, sítios de reconhecimento Bsal, sítios de reconhecimento Fokl ou uma combinação destes.
29. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que as sequências de ácidos nucléicos diversificadas que codificam sequências CDR3 codificam sequências de CDR3 de cadeia pesada (CDR H3).
30. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que as sequências de ácidos nucléicos diversificadas que codificam sequências CDR3 codificam sequências CDR3 de cadeia leve (CDR L3).
31. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos de Aceptor de Frameworkhumano compreende uma sequência gênica variável de cadeia pesada humana selecionada dentre VH1-2, VH1-69, VH1-18, VH3-30, VH3-48, VH3-23, eVH5-51.
32. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos de Aceptor de Frameworkhumano compreende uma sequência gênica variável de cadeia leve kappa humana.
33. Método, de acordo com a reivindicação 32, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência gênica variável da cadeia leve kappa humana é selecionada dentre VK1 -33, VK1 -39, VK3-11, VK3-15 e VK3-20.
34. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência de ácidos nucleicos do Aceptor de Frameworkhumano compreende uma sequência gênica variável da cadeia leve lambda humana.
35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de que a sequência gênica variável da cadeia leve lambda humana é selecionada dentre VL1 -44 e VL1 -51.
36. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que a pluralidade de sequências de ácido nucléico do Aceptor de Framework humano compreende uma mistura de pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia pesada variável (VH) e pelo menos uma sequência de ácido nucléico do Aceptor de Frameworkde cadeia leve variável.
37. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda as etapas de (e) clonar a biblioteca de ácidos nucleicos que codificam domínios variáveis de imunoglobulina da etapa (d) em um vetor de expressão e (f) transformar o vetor de expressão da etapa (e) em uma célula hospedeira e cultivar a célula hospedeira em condições suficientes para expressar uma pluralidade de domínios variáveis de imunoglobulina codificados pela biblioteca.
38. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que a célula hospedeira é E. coli.
39. Método, de acordo com a reivindicação 37, CARACTERIZADO pelo fato de que o vetor de expressão é um fagemídeo ou um vetor de fago.
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