CN114249831A - 纯化双特异性抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纯化双特异性抗体的方法。本发明涉及从单特异性抗体的混合物中纯化双特异性抗体，所述双特异性抗体携带针对免疫球蛋白分子的每个结合位点的不同特异性。双特异性抗体由单一重链和两条不同的轻链组成，所述轻链一条含有κ恒定域并且另一条含有λ恒定域。本发明具体而言涉及从包含具有两条κ轻链或其部分的单特异性抗体和具有两条λ轻链或其部分的单特异性抗体的混合物中分离这些双特异性抗体。本发明还提供有效纯化这些双特异性抗体的方法。

Description

纯化双特异性抗体的方法
本申请为分案申请，原申请的申请日为2016年3月14日，申请号为201680027247.X(PCT/EP2016/055474)，发明名称为“纯化双特异性抗体的方法”。
相关申请
本申请要求2015年3月13日提交的美国临时申请号62/132,782的权益，所述美国临时申请的内容以全文引用的方式并入本文。
发明领域
本发明涉及从单特异性抗体的混合物中纯化双特异性抗体，所述双特异性抗体携带针对免疫球蛋白分子的每个结合位点的不同特异性。双特异性抗体由单一重链和两条不同的轻链组成，所述轻链一条含有κ恒定域并且另一条含有λ恒定域。本发明具体而言涉及从包含具有两条κ轻链或其部分的单特异性抗体和具有两条λ轻链或其部分的单特异性抗体的混合物中分离这些双特异性抗体。本发明还提供有效纯化这些双特异性抗体的方法。
发明背景
抗体由四个多肽组成：两条重链和两条轻链。抗体的抗原结合部分由轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)形成。在这些域的一个末端处六个突环形成抗原结合位点并且还被称为互补性决定区(CDR)。三个CDR位于VH域上(H1、H2和H3)并且另外三个位于VL域上(L1、L2和L3)。在B细胞发育期间，通过被称为V(D)J重组的体细胞重组来形成唯一的免疫球蛋白区。免疫球蛋白重链或轻链的可变区由不同基因节段编码。重链由被称为可变(V)、多样(D)和连接(J)节段的三个节段编码，而轻链可变区由仅两个节段V和J的重组形成。大量抗体互补位可通过基因组中存在的V、D和J节段的多拷贝的一者之间的重组来产生。V节段编码CDR1和CDR2，而CDR3由重组事件产生。在免疫响应的过程期间，通过被称为体细胞高突变(SHM)的过程将进一步的差异引入至抗原结合位点中。在这一过程期间，点突变被引入重链和轻链的可变基因中并且具体而言引入至编码CDR的区域中。这种另外的可变性允许利用对抗体的同源抗原改进的亲和力来选择和扩张表达抗体变体的B细胞。
绝大多数免疫球蛋白是二价和单特异性分子，在两个臂上携带相同的特异性，因为它们由两个相同的重链多肽和两个相同的轻链多肽组成。然而，在开发杂交瘤技术期间的极早期就认识到可通过两个杂交瘤之间的融合事件产生杂交的杂交瘤(Suresh MR等人，Methods Enzymol 1986；121：210-228)。这些‘四源杂交瘤’表达两种不同的重链和两种不同的轻链，并且因此产生由重链和轻链的随机配对造成的各种不同抗体物质。在这些不同物质之中，产生了在每个臂上携带不同特异性的双特异性抗体(bsAb)。另一种天然存在的例外是IgG4同种型的免疫球蛋白，其因为由该同种型的铰链区介导的更不稳定二聚化而能够经受重链交换(van der Neut Kolfschoten M等人，Science. 2007 317(5844)：1554-7)。虽然这种交换似乎在体内发生，但其生物学意义仍不清楚。
单特异性抗体已作为在人类疾病的几个领域中用于治疗性干预的一类成功和吸引人的分子出现。然而，靶向或中和单一蛋白质不一定足以在限制治疗性使用单特异性抗体的某些疾病中实现效力。日益明显的是在多种指征中中和生物系统的一种组分不足以实现效力。对这一问题的一种解决方案是共同施用几种单特异性抗体。然而，如果在待组合的抗体先前尚未单独获批，这种方法因监管方面而复杂化。此外，从制造观点来看组合方法也是昂贵的。因此，需要使得能够用单一分子靶向多种抗原的抗体和疗法。
发明内容
本发明允许纯化在序列上不能与标准抗体区分的双特异性抗体。纯化抗体的未修饰性质向它们提供与标准单特异性抗体相似的有利制造特性。
本文提供的方法可用于纯化各种双特异性抗体，特别是本文中称为“κλ-体”(卡帕兰姆达体)的双特异性抗体，其具有共同的IgG重链和两条不同的轻链，一条具有卡帕(κ)恒定区并且另一条具有兰姆达(λ)恒定区，所述轻链驱使针对两种独立靶标的特异性。本文提供的方法可用于从包含具有两条κ轻链或其部分的单特异性抗体（本文中还称为“κ单特异性抗体”或“κ单-Ab”）以及具有两条λ轻链或其部分的单特异性抗体（本文中还称为“λ单特异性抗体”或“λ单-Ab”）的混合物中纯化这些双特异性κλ体。
可使用各种方法的任何者来产生其待纯化的双特异性抗体。例如，双特异性抗体可通过以下方法来产生：(i)例如通过使用具有固定重链的抗体库或包含单一VH基因的转基因动物，分离具有不同特异性和共享相同可变重链域但可变轻链不同的两种抗体；(ii)将可变重链域融合至重链的恒定区，将一个轻链可变域融合至κ恒定域，并且将另一个可变轻链域融合至λ恒定域；以及(iii)在宿主细胞或细胞系，例如哺乳动物细胞和/或哺乳动物细胞系中共表达三种链，导致在上清液中组装和分泌三种抗体的混合物：两种单特异性抗体和携带两条不同轻链的一种双特异性抗体。在使用这种方法产生的一些抗体中，第一轻链的至少第一部分属于κ型并且第二轻链的至少一部分属于λ型。在使用这种方法产生的一些抗体中，第一轻链包括至少κ恒定区。在使用这种方法产生的一些抗体中，第一轻链进一步包括κ可变区。在使用这种方法产生的一些抗体中，第一轻链进一步包括λ可变区。在使用这种方法产生的一些抗体中，第二轻链包括至少λ恒定区。在使用这种方法的一些抗体中，第二轻链进一步包括λ可变区。在使用这种方法的一些抗体中，第二轻链进一步包括κ可变区。在使用这种方法产生的一些抗体中，第一轻链包括κ恒定区和κ可变区，并且第二轻链包括λ恒定区和λ可变区。在使用这种方法产生的一些抗体中，恒定和可变框架区序列是人类的。
使用用于抗体纯化的标准层析技术来纯化使用这种方法或本领域已知的任何其他合适方法制成的双特异性抗体。还可使用其他分离技术，诸如以非限制性和非详尽实例方式，膜过滤技术和蛋白质沉淀技术，来纯化使用这种方法或本领域已知的任何其他合适方法产生的双特异性抗体。在优选实施方案中，使用多元层析（也被称为混合模式层析）或者使用疏水相互作用层析来纯化一种或多种双特异性抗体。
本发明提供通过以下步骤从抗体的混合物中纯化双特异性抗体的方法：(a)提供混合抗体组合物，其包含至少一种双特异性抗体，所述双特异性抗体具有每个结合位点中不同的特异性以及两拷贝的单一重链多肽、具有κ恒定区的第一轻链和具有λ恒定区的第二轻链(κλ-体)；以及以下的一者或多者：(i)至少一种单特异性抗体，其具有两条λ轻链或其部分(λ单-Ab)；和/或(ii)至少一种单特异性抗体，其具有两条κ轻链或其部分(κ单-Ab)；(b)提供分离工具；(c)在允许与κ单-Ab和/或λ单-Ab结合至分离工具相比κλ-体差异性结合至分离工具的条件下，使分离工具与混合抗体组合物接触；以及(d)在允许与从分离工具上脱离κ单-Ab和/或λ单-Ab相比从分离工具上优先脱离κλ-体的条件下，从分离工具上洗脱κλ-体、κ单-Ab和/或λ单-Ab。
在一些实施方案中，混合抗体组合物包括至少一种κλ-体和至少一种λ单-Ab。在一些实施方案中，混合抗体组合物包括至少一种κλ-体和κ单-Ab。在一些实施方案中，混合抗体组合物包括至少以下各种：(i)至少一种κλ-体；(ii)至少一种λ单-Ab；以及(iii)κ单-Ab。
在一些实施方案中，所述方法通过差异性结合三种抗体物质的每一者，使用单一分离工具将双特异性κλ-体与κ单-Ab和/或λ单-Ab分离。在一些实施方案中，所述方法通过从分离工具上差异性洗脱三种抗体物质的每一者，使用单一分离工具将双特异性κλ-体与κ单-Ab和/或λ单-Ab分离。在一些实施方案中，所述方法通过差异性结合三种抗体物质的每一者接着从分离工具上差异性洗脱三种抗体物质的每一者，使用单一分离工具将双特异性κλ-体与κ单-Ab和/或λ单-Ab分离。
在一些实施方案中，通过连续结合至亲和层析接着是疏水相互作用层析来进行κλ-体的纯化。在一些实施方案中，通过连续结合至蛋白A层析接着是疏水相互作用层析来进行κλ-体的纯化。在一些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。在一些实施方案中，亲和层析是除了蛋白A层析以外任何本领域公认的亲和层析技术，诸如以非限制性实例方式，基于使用蛋白A模拟物或其他亲和蛋白的层析技术。在一些实施方案中，对生物样本进行亲和层析，例如蛋白A层析或除了蛋白A层析以外任何本领域公认的亲和层析技术。在一些实施方案中，生物样本是细胞上清液。在一些实施方案中，用包括至少一个γ1重链cDNA序列、一个κ轻链cDNA序列和一个λ cDNA序列的κλ-双特异性表达载体转染细胞。
在一些实施方案中，通过连续结合至亲和层析接着是多元层析（也被称为混合模式层析）来进行κλ-体的纯化。在一些实施方案中，通过连续结合至蛋白A层析接着是多元层析来进行κλ-体的纯化。在一些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。在一些实施方案中，亲和层析是除了蛋白A层析以外任何本领域公认的亲和层析技术，诸如以非限制性实例方式，基于使用蛋白A模拟物或其他亲和蛋白的层析技术。在一些实施方案中，对生物样本进行亲和层析，例如蛋白A层析或除了蛋白A层析以外任何本领域公认的亲和层析技术。在一些实施方案中，生物样本是细胞上清液。在一些实施方案中，用包括至少一个γ1重链cDNA序列、一个κ轻链cDNA序列和一个λ cDNA序列的κλ双特异性表达载体转染细胞。
在一些实施方案中，通过连续结合至亲和层析接着是疏水相互作用层析(HIC)接着是多元(混合模式)层析来进行κλ-体的纯化。在一些实施方案中，亲和层析是蛋白A层析。在一些实施方案中，亲和层析是除了蛋白A层析以外任何本领域公认的亲和层析技术，诸如以非限制性实例方式，基于使用蛋白A模拟物或其他亲和蛋白的层析技术。在一些实施方案中，对生物样本进行亲和层析，例如蛋白A层析或除了蛋白A层析以外任何本领域公认的亲和层析技术。在一些实施方案中，生物样本是细胞上清液。在一些实施方案中，用包括至少一个γ1重链cDNA序列、一个κ轻链cDNA序列和一个λ cDNA序列的κλ双特异性表达载体转染细胞。
在一些实施方案中，通过连续结合至蛋白A层析接着是多元(混合模式)层析接着是疏水相互作用层析(HIC)来进行κλ-体的纯化。在一些实施方案中，对生物样本进行亲和层析，例如蛋白A层析或除了蛋白A层析以外任何本领域公认的亲和层析技术。在一些实施方案中，生物样本是细胞上清液。在一些实施方案中，用包括至少一个γ1重链cDNA序列、一个κ轻链cDNA序列和一个λ cDNA序列的κλ双特异性表达载体转染细胞。
在一些实施方案中，分离工具是树脂、膜、磁珠、颗粒或整料(monolith)。
在一些实施方案中，分离手段是多元层析(也被称为混合模式层析)。在一些实施方案中，分离手段是疏水相互作用层析。
在一些实施方案中，分离工具是混合模式层析树脂。在一些实施方案中，混合模式层析树脂是TOYOPEARL MX-Trp 650M树脂(Tosoh Bioscience LLC)。TOYOPEARL MX-Trp-650M基于TOYOPEARL介质的甲基丙烯酸聚合物骨架并且将色氨酸用作活性配体。
在一些实施方案中，分离工具是疏水相互作用层析树脂。在一些实施方案中，疏水相互作用层析树脂是TOYOPEARL丁基600M树脂(Tosoh Bioscience LLC)。TOYOPEARL丁基600M树脂基于TOYOPEARL介质的甲基丙烯酸聚合物骨架并且包括丁基配体。
在一些实施方案中，分离工具是至少两种树脂的组合。在一些实施方案中，分离工具是至少两种混合模式层析树脂的组合。在一些实施方案中，分离工具是多于两种混合模式层析树脂，例如三种或更多种、四种或更多种和/或五种或更多种混合模式层析树脂的组合。在一些实施方案中，分离工具是至少两种疏水相互作用层析树脂的组合。在一些实施方案中，分离工具是多于两种疏水相互作用层析树脂，例如三种或更多种、四种或更多种和/或五种或更多种疏水相互作用层析树脂的组合。在一些实施方案中，分离工具是至少一种混合模式层析树脂和至少一种疏水相互作用层析树脂的组合。
在一些实施方案中，分离手段包括使用混合模式层析树脂接着使用疏水相互作用层析树脂。在一些实施方案中，分离手段包括使用TOYOPEARL MX-Trp 650M树脂(TosohBioscience LLC)接着使用TOYOPEARL丁基600M树脂(Tosoh Bioscience LLC)。
在一些实施方案中，分离手段包括使用疏水相互作用层析树脂接着使用混合模式层析树脂。在一些实施方案中，分离手段包括使用TOYOPEARL丁基600M树脂(TosohBioscience LLC)接着使用TOYOPEARL MX-Trp 650M树脂(Tosoh Bioscience LLC)。
在一些实施方案中，结合和/或洗脱条件包括pH水平的阶段变化和/或对应于盐浓度变化的传导性的阶段变化。在一些实施方案中，结合和/或洗脱条件包括无机盐浓度诸如氯化钠(NaCl)浓度或其他无机盐浓度的阶段变化，所述其他无机盐诸如以非限制性和非详尽实例方式，是来自离子的霍夫迈斯特序列(Hofmeister series)的无机盐组合，例如硫酸盐。在一些实施方案中，所述方法包括针对结合和/或洗脱而改变硫酸铵的浓度的步骤。在一些实施方案中，所述方法包括测定双特异性抗体、κ单-Ab和/或λ单-Ab在洗脱级分中的纯度和比例的进一步步骤。这一步骤可使用各种本领域公认的技术的任何者来完成，诸如以非限制性和非详尽实例方式，疏水相互作用-高效液相层析(HIC-HPLC)、离子交换-高效液相层析(IEX-HPLC)、阳离子交换-高效液相层析(CEX-HPLC)或反相-高效液相层析(RP-HPLC)。
本文提供的实施例展现出使用更高盐或更低盐阶段洗脱来相比于κ单-Ab和/或λ单-Ab而言从TOYOPEARL MX-Trp-650M混合模式层析或疏水相互作用树脂TOYOPEARL丁基600M树脂上优先洗脱双特异性抗体的可行性，以及另外，使用混合模式层析和疏水相互作用层析的组合的可行性。例如，更低盐阶段洗脱，例如降低硫酸铵的浓度，被用来相比于κ单-Ab和/或λ单-Ab而言从疏水相互作用树脂TOYOPEARL丁基600M树脂上优先洗脱双特异性抗体。
附图简述
图1A、1B和1C是由两拷贝的唯一重链多肽和两个不同轻链多肽组成的不同κλ-体双特异性抗体的结构的一系列示意性表示。图1A描绘出融合至κ恒定域的κ可变域和融合至λ恒定域的λ可变域。图1B描绘出融合至κ恒定域和λ恒定域的κ可变域。图1C描绘出融合至κ恒定域和λ恒定域的λ可变域。
图2是描绘在CHO细胞中三顺反子表达载体的表达产生具有25:50:25理论比率的三种抗体产物的说明。
图3A是描绘使用缓冲液阶段梯度洗脱的TOYOPEARL丁基600M的代表性UV吸光度迹线轮廓的图表。
图3B是描绘使用CEX-HPLC的TOYOPEARL丁基600M洗脱级分分析的说明的图表。
图3C是描绘使用NaCl阶段梯度洗脱的TOYOPEARL MX-Trp 650 M的代表性UV吸光度迹线轮廓的图表。
图3D是描绘对TOYOPEARL MX-Trp 650M级分进行非还原和还原SDS-PAGE分析的说明。
图3E是描绘对TOYOPEARL MX-Trp 650M级分进行HIC-HPLC分析的图表。
图4A是描绘在更大柱规模下获得的使用NaCl阶段梯度洗脱的TOYOPEARL MX-Trp650M的代表性UV吸光度迹线轮廓的图表。
图4B是描绘使用CEX-HPLC的TOYOPEARL MX-Trp 650M洗脱级分分析的说明的图表。
图5A是描绘在更大柱规模下使用NaCl阶段梯度洗脱的TOYOPEARL丁基600M的代表性UV吸光度迹线轮廓的图表。
图5B是描绘使用CEX-HPLC的TOYOPEARL丁基600M洗脱级分分析的说明的图表。
详述
本发明提供纯化与人免疫球蛋白结构相同的双特异性抗体的方法。这种类型的分子由两拷贝的唯一重链多肽、融合至恒定κ域的第一轻链可变区和融合至恒定λ域的第二轻链可变区组成。每个结合位点展示由重链和轻链两者促成的不同抗原特异性。轻链可变区可属于λ或κ家族并且优选分别融合至λ和κ恒定域。这是优选的以便避免产生非天然多肽连结。然而，还可能通过将κ轻链可变域融合至恒定λ域以实现第一特异性并且将λ轻链可变域融合至恒定κ域以实现第二特异性来获得本发明的双特异性抗体(图1A-1C)。本文所述的双特异性抗体也被称为IgG κλ抗体或“κλ体”，完全的人双特异性IgG格式。这种κλ-体格式允许对不能与标准单特异性抗体，例如标准IgG分子区分的双特异性抗体进行亲和纯化，因此与先前的格式相比是有利的。
这些图中所示的κ轻链和λ轻链(或其部分)的位置和/或布置不意图为限制性的。本领域普通技术人员将理解还可布置κ轻链和λ轻链(或其部分)以便产生图1A-1C中所示的双特异性抗体的镜像。本领域普通技术人员还将理解在图1A-1C中以完全IgG格式表示的双特异性抗体还可使用其他免疫球蛋白同种型或以诸如F(ab')2的其他免疫球蛋白格式产生。
通过识别具有不同抗原特异性、共享相同重链可变域的两个抗体Fv区(每一者由可变轻链和可变重链域组成)来产生κλ-体。
使用产生抗体的各种方法的任何一种来产生待使用本发明的方法纯化的κλ-体。已描述了用于产生抗体和其片段的众多方法。(参见，例如Antibodies: A LaboratoryManual，Harlow E和Lane D，1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，以引用的方式并入本文)。完全人抗体是其中轻链和重链两者的序列、包括CDR1和2由人基因产生的抗体分子。CDR3区可具有人起源或通过合成方式设计。这类抗体在本文中被称为“人抗体”或“完全人抗体”。人单特异性抗体可通过使用三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参见Kozbor等人，1983 Immunol Today 4：72)和产生人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术(参见Cole等人，1985，在Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss, Inc.，第77-96页中)来制备。人抗体可被利用并且可通过使用人杂交瘤(参见Cote等人，1983. Proc Natl Acad Sci USA 80：2026-2030)或通过用爱泼斯坦巴里(EpsteinBarr)病毒体外转化人B细胞(参见Cole等人，1985，在Monoclonal Antibodies and CancerTherapy，Alan R. Liss, Inc.，第77-96页中)来产生。
在一些实施方案中，例如使用其中对于所有库成员而言重链可变域相同并因此差异限于轻链可变域的抗体库来产生待纯化的κλ-体。这类库描述于例如PCT公布号WO 2010/135558和PCT公布号WO 2011/084255中，所述PCT公布的每一者特此以全文通过引用的方式并入本文。然而，因为轻链可变域与重可变域结合表达，两个域可促成抗原结合。为了进一步促进该过程，包含相同重链可变域和λ可变轻链或κ可变轻链的任一差异的抗体库可平行地用于对抗不同抗原的抗体进行体外选择。这种方法使得能够识别具有共同的重链但一者携带λ轻链可变域且另一者携带κ轻链可变域的两种抗体，所述λ轻链可变域和κ轻链可变域可用作产生本发明的完全免疫球蛋白格式的双特异性抗体的构件。待使用本发明的方法纯化的双特异性抗体可属于不同同种型，并且其Fc部分可被修饰以便改变对不同Fc受体的结合性质并以这种方式修改抗体的效应物功能以及其药物动力学性质。用于修饰Fc部分的众多方法已被描述并且可适用于本发明的抗体。(参见例如Strohl, WR，“Optimization ofFc-mediated Effector Functions of Monoclonal Antibodies”，Curr. Opin.Biotechnol.，2009 (6)：685-91；美国专利号6,528,624；美国专利申请公布号2009/0191199)。本发明的方法还可用来纯化缺乏Fc部分的F(ab')2格式的双特异性抗体和抗体混合物。
优选地，待纯化的κλ-体已被优化用于共表达共同的重链和两种不同的轻链到单一细胞中，来允许组装本发明的双特异性抗体。如果所有多肽在相同水平上得到表达并且同样充分地得到组装以形成免疫球蛋白分子，则单特异性(相同轻链)和双特异性(两条不同轻链)的比率应为50%。然而，可能的是不同轻链以不同的水平表达和/或不以相同效率组装。而且，逃脱组装成完整IgG分子的轻链可作为“游离轻链”分泌至细胞培养物上清液中。调节不同多肽的相对表达量以补偿其固有表达特性或对与共同重链组装的不同倾向的手段包括：以非限制性实例方式，使用具有可变强度的一种或多种启动子，使用特征为不同效率的内核糖体进入位点(IRES)或者可在转录或翻译水平上起作用以及作用于mRNA稳定性的其他类型的调控元件。还可通过多次连续转染细胞以增加表达一种或另一种轻链的个体基因的拷贝数并因此修改其相对表达量来实现对表达的调节。
重链和两种轻链的共表达产生分泌至细胞培养物上清液中的三种不同抗体的混合物：两种单特异性二价抗体和一种双特异性二价抗体。后者必须从混合物中纯化以获得所关心的κλ-体。由于赋予高结合能力并允许有效纯化双特异性抗体、包括纯化κλ-体的各种相互作用机制，诸如以非限制性实例方式，离子交换特性和疏水特性，多元层析或混合模式层析促进κλ-体的纯化。多元或混合模式层析方法是有效的，因为同时利用多种模式的层析。由于允许有效纯化特异性抗体的疏水特性，疏水层析促进κλ-体的纯化。由于多种相互作用机制连续应用，多元或混合模式层析接着疏水层析的组合促进κλ-体的纯化，因此允许比单独任一机制甚至更有效地纯化双特异性抗体。
三种链的共表达导致三种不同抗体的组装：两种单特异性和一种双特异性抗体。它们的理论相对比率应为1:1:2，条件是两种轻链的表达水平和组装速率相似。使用蛋白A亲和层析程序接着是多元层析或疏水层析或者蛋白A亲和层析接着是多元层析和疏水层析来纯化双特异性抗体。
旨在使用不同抗体工程学方法来强迫产生同源双特异性分子的产生和纯化双特异性抗体格式的先前方法以产物的生产率、可量测性和稳定性为代价进行。本文所述的方法提供纯化双特异性抗体的有效手段。
与产生和纯化双特异性抗体格式的先前方法形成对比，本文提供的方法通过差异性结合三种抗体物质的每一者或通过从分离工具上差异性洗脱三种抗体物质的每一者，使用单一分离工具将双特异性κλ-体与κ单-Ab和/或λ单-Ab分离。
本文提供的方法首先使用诸如混合模式层析和/或疏水相互作用层析和/或这两种层析方法的组合的过程，将具有两条不同轻链、一条含有κ恒定域且另一条含有λ恒定域的双特异性抗体与具有两条κ轻链或其部分的单特异性抗体和具有两条λ轻链或其部分的单特异性抗体分离。相比之下，先前方法，诸如PCT公布号WO 2013/088259中的那些被设计成从诸如图2中所示游离轻链的不完整抗体中移除完整的全长双特异性抗体。因此，本文提供的方法比先前方法更有利。
实施例
实施例1：利用疏水相互作用层析来纯化双特异性抗体
κλ-体是新颖的双特异性IgG格式，其包括共同的IgG1重链和驱使针对两种独立靶标的特异性的两条不同轻链。为了允许可适用于大规模工业过程的有效纯化规程，所述格式需要一条轻链含有κ恒定区而另一条含有λ恒定区。(参见图1A-1C)。
为了产生κλ-体，使用三基因表达载体在CHO细胞中表达共同的重链和两种轻链。这种载体格式允许构造三种产物：单特异性κ抗体(κ单-Ab)，双特异性κλ-体和单特异性λ抗体(λ单-Ab)。理论产物比率是25:50:25。(参见图2)。
在这些研究中，通过连续结合至蛋白A亲和层析接着是疏水相互作用树脂TOYOPEARL丁基600M来进行这种κλ-体格式的纯化。
本文提供的研究展现出使用缓冲液阶段洗脱层析将κλ-体与单特异性λ和单特异性κ抗体(单-Ab)成功分离。
起始材料：用κλ双特异性表达载体(包含一个γ1重链cDNA，一个κ轻链cDNA和一个λ轻链cDNA)转染的CHO细胞的澄清25L波袋发酵上清液被用作蛋白A层析接着是疏水相互作用层析的起始材料。
步骤：使用疏水相互作用层析(HIC)介质(Tosoh Bioscience)纯化κλ-体双特异性IgG抗体。在100 mM磷酸钠1 M硫酸铵pH 7.0缓冲液(平衡缓冲液)中1:1稀释样本之后，以10mg/mL装柱。在利用平衡缓冲液(5个柱体积)的洗涤步骤之后，使用10 mM磷酸钠pH 7.0缓冲液进行阶段洗脱(在两个连续阶段中为60%和75%) (图3A)。将洗脱的级分收集并且通过280nm下的UV吸光度测量(使用NanoDrop UV-Vis分光光度计，Thermo Scientific)来分析以便测定产物回收率。进行阳离子交换-高效液相层析(CEX-HPLC)以便测定纯化过程将κλ-体双特异性IgG与两种单特异性抗体副产物分离的能力(图3B)。
实施例2：利用多元混合式层析来纯化双特异性抗体
如实施例1中所述，κλ-体是新颖的双特异性IgG格式，其包括共同的IgG1重链和驱使针对两种独立靶标的特异性的两条不同轻链。为了允许可适用于大规模工业过程的有效纯化规程，所述格式要求一条轻链含有κ恒定区而另一条含有λ恒定区。(参见图1A-1C)。
为了产生κλ-体，使用三基因表达载体在CHO细胞中表达共同的重链和两种轻链。这种载体格式允许构造三种产物：单特异性κ抗体(κ单-Ab)，双特异性κλ-体和单特异性λ抗体(λ单-Ab)。理论产物比率是25:50:25。(参见图2)。
在这些研究中，通过连续结合至蛋白A亲和层析接着是混合模式层析树脂TOYOPEARL MX-Trp 650 M来进行这种κλ-体格式的纯化。
本文提供的研究展现出使用NaCl阶段洗脱层析将κλ-体与单特异性λ和单特异性κ抗体(单-Ab)成功分离。
起始材料：用κλ双特异性表达载体(包含一个γ1重链cDNA，一个κ轻链cDNA和一个λ轻链cDNA)转染的CHO细胞的澄清25L波袋发酵上清液被用作蛋白A层析接着是多元(混合模式)相互作用层析的起始材料。
步骤：使用多元(混合模式)层析介质(Tosoh Bioscience)纯化κλ-体双特异性IgG抗体。在以25 mg/mL装柱和利用100 mM磷酸钠pH 6.0 (5个柱体积)的洗涤步骤之后，使用100 mM磷酸钠pH 6.0缓冲液进行NaCl阶段洗脱(在两个连续阶段中为15%和100%的500 mMNaCl缓冲液)(图3C)。将流出物和洗脱的级分收集并且通过以下来分析：280 nm下的吸光度测量(使用NanoDrop UV-Vis分光光度计，Thermo Scientific)以便测定产物回收率，还原和非还原SDS-PAGE (使用Invitrogen Novex NuPAGE 12孔4-20%梯度凝胶，按照制造商的指导路线)以便测定样本的纯度和组成(图3D)，以及疏水相互作用-高效液相层析(HIC-HPLC) (图3E)以便测定纯化过程将κλ-体双特异性IgG与两种单特异性抗体副产物分离的能力。
如由图3C中的UV吸光度迹线(红色)所示，施加于TOYOPEARL MX-Trp 650M层析混合模式树脂的阶段洗脱允许三种级分的连续分离。图3D中所示的对在混合模式纯化期间收集的级分进行的还原和非还原SDS-PAGE分析揭示出15% NaCl下包含κλ-体的洗脱级分(第2峰)的高纯度，而单特异性λ单-Ab和κ单-Ab IgG分别被分离和收集，对于λλ而言在未保留级分(第1峰)中且对于κκ而言在100% NaCl阶段级分(第3峰)中。通过HIC-HPLC分析和对HIC-HPLC层析谱(图3E)的峰面积进行后续积分来进一步表征三种级分。表1中概述的结果是根据SDS-PAGE分析，展现出15% NaCl下第2洗脱级分中κλ-体的高纯度(96%)。
表1.对TOYOPEARL MX Trp-650M收集的结合级分进行的HIC-HPLC分析的UV峰积分
级分 κ单-Ab，% λ单-Ab，% κλ-体，%
流出物 0 99.5 0.5
15%阶段 2 2 96
100%阶段 85 15 0
实施例3：利用多元混合模式层析接着是疏水层析来纯化双特异性抗体
如实施例1中所述，κλ-体是新颖的双特异性IgG格式，其包括共同的IgG1重链和驱使针对两种独立靶标的特异性的两条不同轻链。为了允许可适用于大规模工业过程的有效纯化规程，所述格式要求一条轻链含有κ恒定区而另一条含有λ恒定区。(参见图1A-1C)。
为了产生κλ-体，使用三基因表达载体在CHO细胞中表达共同的重链和两条轻链。这种载体格式允许构造三种产物：单特异性κ抗体(κ单-Ab)，双特异性κλ-体和单特异性λ抗体(λ单-Ab)。理论产物比率是25:50:25。(参见图2)。
在这个实施例中，通过连续结合至蛋白A亲和层析接着进行用TOYOPEARL MX-Trp650M混合模式树脂的多元(混合模式)层析接着是使用TOYOPEARL丁基600M树脂的疏水相互作用层析来进行这种κλ-体格式的纯化。
步骤：使用混合模式层析介质(Tosoh Bioscience)接着是疏水相互作用层析(HIC)介质(Tosoh Bioscience)来纯化包含κλ-体双特异性IgG抗体的蛋白A亲和洗脱物。将TOYOPEARL丁基600M柱用利用混合模式柱纯化的洗脱样本(对应于图4A中的级分2)装载并在100 mM磷酸钠1 M硫酸铵pH 7.0缓冲液中稀释，并且在洗涤步骤之后，进行缓冲液阶段洗脱来降低硫酸铵的水平(图5A)。将洗脱级分收集并且通过280 nm下的UV吸光度测量(使用NanoDrop UV-Vis分光光度计，Thermo Scientific)来分析以便测定产物回收率。进行阳离子交换-高效液相层析(CEX-HPLC)以便测定纯化过程将κλ-体双特异性IgG与两种单特异性抗体副产物分离的能力(图5B)。
如由图4A中的UV吸光度迹线(红色)所示，施加于TOYOPEARL MX-Trp 650M混合模式层析树脂的阶段洗脱允许三种级分的连续分离。对在混合模式纯化期间收集的级分进行的CEX-HPLC分析证实了洗脱的κλ-体的高纯度(图4B)。将于乙酸盐pH 6.0缓冲液中的20%NaCl下洗脱的主级分(池2)进一步装载至TOYOPEARL丁基600M疏水相互作用层析树脂上。结果描绘于图5A中。
如由图5A中的UV吸光度迹线(红色)所示，施加于TOYOPEARL丁基600M疏水相互作用层析树脂的阶段洗脱允许两种级分的连续分离。对级分进行的CEX-HPLC (图5B)分析证实了在使用10 mM磷酸钠pH 7.0缓冲液(75%)进行的阶段洗脱中在第2级分中洗脱的κλ-体与在使用10 mM磷酸钠pH 7.0缓冲液(54%)进行的阶段洗脱中在第一级分中洗脱的剩余κκ-单特异性的分离和纯度。对应于κλ-体的主级分(池2)的高纯度被测得>95%。
这些工作实施例中呈现的数据证明了使用多元(混合模式)层析或疏水相互作用层析或者多元(混合模式)层析和疏水相互作用层析的组合来从IgG混合物中纯化双特异性抗体（包括κλ-体）的可行性。
HIC-HPLC方法：为了测定在样本混合物中λ单-Ab、κ单-Ab和κλ-体的相对比例，使用了利用Dionex ProPac HIC-10柱的HIC-HPLC (疏水相互作用层析-高效液相层析)测定法。在装载样本之后将85%至25%之间的硫酸铵下行梯度施加于柱以便以高分辨率洗脱3种物质，首先洗脱κ单-Ab，接着是κλ-体并且最后是λ单-Ab。进行在280 nm下监测的UV迹线的峰面积积分以便测定每个物质的量。
CEX-HPLC方法：使用阳离子交换-高效液相层析(CEX-HPLC)方法来测定在纯化的样本中单特异性和双特异性抗体的比例。CEX-HPLC方法允许根据蛋白质变体的电荷分布来分离蛋白质变体。制备样本以将50 μg装载至A BioMab NP5-SS柱(Agilent)上，并且以0.8mL/min的流速施加10 mM磷酸钠、500 mM NaCl、pH 6.5的线性梯度(0%至100% NaCl浓度)以便分离不同的抗体产物。采用214 nm下的UV检测来监测样本洗脱。识别出三个群体(根据参考标准品)并且根据它们的百分比相对面积来分析。通过计算每种组分相对于总峰面积的峰面积来测定每种同种型的百分比。
其他实施方案
尽管已结合其详述描述了本发明，但前面的描述意图说明并且不限制本发明的范围，本发明的范围由随附权利要求书的范围来定义。其他方面、优点和修改在随后的权利要求书的范围内。

Claims (11)

1.一种从抗体的混合物中纯化双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(a) 对生物样本进行蛋白A层析以产生包含以下的混合抗体组合物：(i)至少一种双特异性抗体，其具有每个结合位点中不同的特异性以及两拷贝的单一重链多肽、具有κ恒定区的第一轻链和具有λ恒定区的第二轻链(κλ-体)；(ii)至少一种单特异性抗体，其具有两条λ轻链或其部分(λ单-Ab)；以及(iii)至少一种单特异性抗体，其具有两条κ轻链或其部分(κ单-Ab)；
(b) 提供分离工具；
(c) 在允许与所述κ单-Ab和所述λ单-Ab结合至所述分离工具相比所述κλ-体差异性结合至所述分离工具的条件下，使所述分离工具与所述混合抗体组合物接触；以及
(d) 在允许与从所述分离工具上脱离κ单-Ab和所述λ单-Ab相比从所述分离工具上优先脱离所述κλ-体的条件下，从所述分离工具上洗脱所述κλ-体、所述κ单-Ab和所述λ单-Ab，
其中所述分离工具包括疏水相互作用层析树脂和混合模式层析树脂的组合。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述结合条件包括pH水平、盐水平、或pH水平和盐水平两者的变化。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述洗脱条件包括pH水平、盐水平、pH水平和盐水平两者、霍夫迈斯特离子水平、pH和霍夫迈斯特离子水平两者、缓冲液浓度、缓冲液组成、缓冲液浓度和组成两者、以及它们的组合的阶段变化。
4.如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述混合模式层析树脂是TOYOPEARLMX-Trp 650M树脂。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述疏水相互作用层析树脂是TOYOPEARL丁基600M树脂。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述生物样本是细胞上清液。
7.如权利要求6所述的方法，其中用包括一个γ1重链cDNA序列、一个κ轻链cDNA序列和一个λ cDNA序列的κλ双特异性表达载体转染所述细胞。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述分离工具包括使用疏水相互作用层析树脂接着使用混合模式层析树脂。
9.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述分离工具包括使用混合模式层析树脂接着使用疏水相互作用层析树脂。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述疏水相互作用层析树脂包括TOYOPEARL®丁基600M树脂，和其中所述混合模式层析树脂包括TOYOPEARL® MX-Trp 650M树脂。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述混合模式层析树脂包括TOYOPEARL® MX-Trp650M树脂，和其中所述疏水相互作用层析树脂包括TOYOPEARL®丁基600M树脂。
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