KR20220014531A - 헤테로이량체 Ｆｃ 융합 단백질, 및 관련 조성물, 용도 및 방법 - Google Patents

헤테로이량체 Ｆｃ 융합 단백질, 및 관련 조성물, 용도 및 방법 Download PDF

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Abstract

정제가 신속 간편하고 효율적일 뿐만 아니라, 증가된 FcRn 결합능이나 증가된 FcγR 결합능과 같은 치료제로서 바람직할 수 있는 특성을 나타내는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법이 개시된다

Description

헤테로이량체 Ｆｃ 융합 단백질, 및 관련 조성물, 용도 및 방법{Heterodimeric Fc fusion proteins, and related compositions, uses and methods}
본 개시는 Fc 융합 기술(Fc fusion technology)에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(heterodimeric Fc fusion proteins), 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법에 관한 것이다.
면역글로불린 Fc 융합 기술
인간 면역글로불린(전형적으로 IgG)의 Fc 잔기에 목적 단백질(protein of interest)을 결합하는 Fc 융합 기술은 생물학적 활성 단백질의 치료적 성질을 개선시키는 유용한 도구이다. 목적 단백질에 Fc 영역이 결합된 융합 단백질은 FcRn(neonatal Fc receptor)에 결합하여 엔도좀 분해(endosomal degradation)를 감소시킴으로써 혈중 반감기를 연장시킨다. 또한 Fc 영역은 면역 세포에 대한 Fcγ 수용체(receptor)의 반응을 매개하여 융합 단백질의 면역 효과기 기능(immune effector function)을 증가시킬 수 있다.
자연적으로 발생하는 IgG의 Fc 영역은 호모이량체(homodimer)를 형성하는 경향이 있다. 따라서 Fc 융합 기술에 기반하여 치료 단백질을 개발하는 가장 간단한 방법은 생물학적으로 활성인 목적 단백질(즉, 리간드, 세포 외 영역 수용체, 사이토카인)을 Fc 영역에 결합시켜 적당한 숙주세포에서 발현시켜 호모이량체 Fc 융합 단백질(homodimeric Fc fusion protein)을 생산하는 것이며, 이것은 IgG Fc에 특이적인 친화도 시약(affinity reagent)을 이용하여 쉽게 분리해낼 수 있다.
어떤 상황에서는 헤테로이량체 Fc 융합(heterodimeric Fc fusion)이 요구된다. 사이토카인(cytokine)과 그 수용체를 포함하는 많은 단백질은 자연적으로 헤테로이량체로 존재 및 기능하며, 일부 단백질은 치료 목적으로 선택되는 파트너 단백질과 헤테로이량체로 생성될 때 증가된 약리학적 성질을 나타낸다.
인간 IgG1 형태의 비대칭형 이중항체(Asymmetric bispecific antibody)를 구성하기 위한 놉-인투-홀(knob-into-hole) 돌연변이 기술은 놉-놉 및 홀-홀 호모이량체(Homodimer) 및 단량체 등과 같은 많은 부산물의 발생을 수반한다. 이러한 부산물을 제거하고 헤테로이량체를 확보하기 위한 정제는 복잡한 공정을 요구한다. 특히 헤테로이량체의 물리화학적 성질이 호모이량체 및 단량체와 유사할 경우 헤테로이량체를 인간의 치료제로 사용하기에 적합한 수준으로 분리 정제하는데 매우 큰 어려움이 따른다. 이를 극복하기 위한 전략으로 항체의 경우 헤테로이량체의 물리화학적 성질을 호모이량체 및 단량체와 구별되도록 만드는 항체 가변부위(variable region) 엔지니어링, 헤테로이량체의 경쇄부위를 각각 카파경쇄와 람다경쇄로 구성함으로써 카파경쇄 및 람다경쇄 특이적 수지(resin)를 활용하여 헤테로이량체를 순수 분리하는 방법(예: 국제공개 WO2016-146594호)이 알려져 있다. 그러나 항체와는 달리 자연상에 존재하는 상이한 2개의 단백질을 비대칭적으로 Fc에 결합시킨 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 경우 헤테로이량체 분리를 위한 단백질 서열 엔지니어링에 많은 제약이 존재한다.
인터루킨-1(IL-1)
인터루킨-1(IL-1)은 감염 및 염증 반응에서, 단핵 식세포를 포함한, 다양한 세포 타입에 의해 생산될 수 있는 강력한 염증유발성(pro-inflammatory) 사이토카인이다. IL-1 패밀리는 IL-1α 및 IL-1β를 포함하는 7개의 작용제(agonist), 및 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)를 포함하는 3개의 자연 발생 수용체 길항제로 구성된다. 2개의 IL-1 수용체, IL-1R 타입 Ⅰ 및 IL-1R 타입 Ⅱ가 확인되었다. 이 두 개의 수용체는 3개 형태의 IL-1 패밀리 분자와 모두 상호 작용할 수 있다. IL-1RⅠ은 IL-1-유도 세포 활성을 매개하지만, IL-1/IL-1RⅠ 복합체는 그 자체로 신호전달을 할 수 없고, 제2 수용체 사슬, IL-1R 부속 단백질(IL1RAcP)의 관여에 의존적이다. IL1-신호전달 외에, IL1RAcP는 ST2/IL1RAP 복합체를 통한 IL33의 효과를 매개하고 IL1Rrp2/IL1RAcP 복합체를 통한 IL36의 효과를 매개하는데 결정적 역할을 한다. IL-1은 류마티스 관절염과 골관절염 등의 관절, 뼈 및 근육 질환; 가족성 지중해 열 등의 유전성 전신 자가염증 질환; 전신의 청소년 특발성 관절염과 성인형 스틸(Still) 병 등의 전신 자가염증 질환; 통풍 및 제2형 당뇨병 등의 일반적인 염증성 질환; 심근 경색과 같은 급성 발병 허혈성 질환; 및 암과 같은 다양한 질환에 관여하는 것으로 알려져 있다. IL-1 활성을 차단하기 위한 다수의 치료법들이 허가 및 개발 중에 있다. IL-1 타겟팅은 1993년에 아나킨라(anakinra)(Kineret; 암젠)의 도입으로 시작되었다. 아나킨라는 천연 IL-1 수용체 길항제(IL-1Ra)의 재조합 형태로, IL-1α 및 IL-1β 둘 다의 활성을 차단한다. 항체 또는 가용성 수용체로 IL-1을 중화시키는 것도 효과적인 것으로 판명되었고, 가용성 유인 수용체 릴로나셉트(rilonacept)(Arcalyst; Regeneron)와 항-IL-1β 중화 단일클론 항체 카나키누맙(카나키누맙)(Ilaris; 노바티스)이 허가되었다. 또한, 국제공개 WO 2014/126582호는 인간 IL-1R1 및 인간 IL-1RAcP의 세포외 영역을 포함하되, IL-1R1 영역과 IL-1RAcP 영역이 각각 인간 IgG1의 Fc 부분의 다른 돌연변이체에 융합된 헤테로이량체 단백질을 개시하고 있다.
인플라마솜(inflammasome)
인플라마솜(inflammasome)은 병원균 또는 세포손상에 반응하여 IL-1β와 IL-18의 분비를 촉진하고 염증성세포사(pyroptosis)를 유발하는 세포내 단백질 복합체이다. 인플라마솜에 의한 IL-1β와 IL-18 분비는 주로 골수성 세포(myeloid cell)에서 일어나며, 염증성세포사가 유발될 경우 가스더민 포어(gasdermin pore)를 통한 알라민(alarmin) 단백질 IL-1α와 HMGB1 분비 또한 촉진된다. 정상적인 인플라마솜은 선천면역에 중요한 역할을 담당하지만, 인플라마솜의 비정상적 활성은 염증질환, 퇴행성 신경질환, 암 등 각종 질환의 원인으로 작용한다. 인플라마솜 활성과 연관된 질병의 치료 전략으로는 1) Nlrp3 등 인플라마솜 센서(sensor) 단백질 저해, 2) 가스더민 포어 형성 및 사이토카인 분비를 매개하는 효소인 카스파아제(caspase)의 저해, 3) 이펙터 단백질의 저해 등이 있다. 특히 이펙터 단백질 저해는 상위 신호 경로와 무관하게 인플라마솜에 의한 염증반응을 제어할 수 있기 때문에, 다양한 관련 질환에서 효능을 가질 것으로 기대할 수 있다.
형질전환 성장인자 β(TGF-β)
인간의 종양에는 암세포뿐 아니라 종양성장을 억제하는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 자연살해세포(Natural killer cell) 등의 면역세포가 관찰되며, 또한 종양성장을 촉진하는 면역억제세포인 조절 T 세포(regulatory T cell; Treg), MDSC(myeloid-derived suppressor cell) 등도 함께 관찰된다. MDSC는 만성 염증(chronic inflammation)에 의한 골수성세포(myeloid)의 비정상적 분화로 인해 발생하며, 만성염증을 유발하는 IL-1, IL-6 등의 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 및 케모카인이 MDSC의 발생 및 종양 내 침윤에 핵심적 역할을 담당한다. 종양 내 면역세포 및 면역억제세포의 분포 및 활성은 종양면역환경 혹은 TIME(tumor immune microenvironment)이라 불리며, PD-1 항체와 같은 면역항암제의 반응에 크게 기여하는 것으로 알려져 있다. 종양 내 주요 면역억제 세포인 MDSC와 Treg은 다양한 기작을 통해 세포독성 T 세포와 자연살해세포의 기능을 저하시키는 것으로 알려져 있으며, 특히 이들 면역억제세포와 암세포에서 분비되는 사이토카인인 transforming growth factor β(TGF-β)가 면역억제에 핵심적 역할을 담당하는 것으로 밝혀졌다. 최근에는 마우스 및 인간에서 TGF-β의 저해가 면역항암제의 반응을 크게 개선시킴이 보고되었다. 그러나 TGF-β는 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)으로 TGF-β1의 결손은 마우스에서 심각한 염증질환을 유발하며, 암세포에서 TGF-β 신호전달 경로를 저해할 경우 MDSC의 종양 내 침윤이 증가하는 것으로 보고되었다. 형질전환 성장인자 베타(Transforming growth factor beta; TGF-β) 수용체 패밀리는 TGF-βRⅠ, TGF-βRⅡ, TGF-βRⅢ로 구성되어 있으며, 특히 TGF-βRⅡ는 TGF-β1, TGF-β3에 고친화도로 결합하고 TGF-β2에는 상대적으로 낮은 결합능으로 결합하는 것으로 알려져 있다.
본 개시의 목적은 정제가 신속 간편하고 효율적일 뿐만 아니라, 증가된 FcRn 결합능이나 증가된 FcγR 결합능과 같은 바람직할 수 있는 치료 특성을 나타내는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 다른 목적은 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질과 관련된 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질과 관련된 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질과 관련된 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 개시의 제1 측면은,
ⅰ) N-말단에서 C-말단 방향으로 제1 목적 단백질, 제1 링커 및 면역글로불린의 제1 Fc 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및,
ⅱ) N-말단에서 C-말단 방향으로 제2 목적 단백질, 제2 링커 및 면역글로불린의 제2 Fc 부위를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하고,
상기 제1 목적 단백질과 제2 목적 단백질은 서로 상이한 단백질이며,
상기 제1 링커 및 제2 링커는 각각 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체인 것인,
헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 제공한다.
본 개시의 제2 측면은 유효성분으로 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 제약 조성물을 제공한다.
본 개시의 제3 측면은 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 포함하는, 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시의 제4 측면은 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하기 위한 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체의 용도를 제공한다.
본 개시의 제5 측면은 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시의 제6 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 개시의 제7 측면은 헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 친화도에 기반하여 정제하는 단계를 포함하는, 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 정제 방법을 제공한다.
본 개시의 제8 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 FcRn 결합능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 개시의 제9 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
본 개시의 제10 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 FcγR 결합능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 개시의 제11 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 개시에 따르면, 정제가 신속 간편하고 효율적일 뿐만 아니라, 증가된 FcRn 결합능 및/또는 증가된 FcγR 결합능과 같은 치료제로서 바람직할 수 있는 특성을 나타내는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질, 및 이와 관련된 조성물, 용도 및 방법이 제공된다.
도 1은 상이한 2개의 단백질을 결합시킨 Fc 융합 단백질 제조 방법의 모식도이다.
도 2는 IL-1 수용체 Fc 융합 단백질 제조 방법의 모식도이다.
도 3은 헤테로이량체 IL-1 트랩인 IL1T의 SDS-PAGE 분석 결과(A) 및 크기배제크로마토그래피 분석 결과(B)이다.
도 4a는 κλ 헤테로이량체 IL-1 트랩인 PET101의 정제단계 별 주요산물 및 부산물의 모식도이다.
도 4b는 PET101 정제단계별 용출액의 SDS-PAGE 분석 결과(⑴), PET101 1차 정제용출액의 크기배제크로마토그래피 분석 결과(⑵), 및 PET101 3차 정제용출액의 크기배제크로마토그래피 분석 결과(⑶)이다.
도 5는 PET101의 소수성상호작용크로마토그래피(HIC) 분석 결과이다.
도 6은 ELISA를 이용한 IL1T, PET101, 카나키누맙, 릴로나셉트의 인간 IL-1β에 대한 결합능 분석 결과이다.
도 7a는 표면플라스몬공명(SPR)을 이용한 PET101의 인간 IL-1α, 인간 IL-1β, 원숭이 IL-1β, 마우스 IL-1α, 마우스 IL-1β에 대한 결합능 분석 결과이다.
도 7b는 표면플라스몬공명(SPR)을 이용한 릴로나셉트의 인간 IL-1α, 인간 IL-1β, 원숭이 IL-1β, 마우스 IL-1α, 마우스 IL-1β에 대한 결합능 분석 결과이다.
도 7c는 표면플라스몬공명(SPR)을 이용한 카나키누맙의 인간 IL-1α, 인간 IL-1β, 원숭이 IL-1β, 마우스 IL-1α, 마우스 IL-1β에 대한 결합능 분석 결과이다.
도 8은 IL-1 리포터 세포주에서 PET101, 릴로나셉트, 카나키누맙의 IL-1α 신호 경로 억제능 분석 결과(A) 및 IL-1β 신호 경로 억제능 분석 결과(B)이다.
도 9는 A549 비소세포성 폐암 세포주에서 PET101, 릴로나셉트, 카나키누맙의 IL-1β 매개 IL-6 분비 억제능 분석 결과이다.
도 10은 릴로나셉트와 IL1T와 PET101의 단백질 열 안정성 분석 결과이다.
도 11은 37 ℃에서 4주 간 PET101의 PBS내에서 안정성을 SDS-PAGE(A) 및 크기배제크로마토그래피(B)를 이용하여 분석한 결과이다.
도 12는 인간 FcRn에 대한 IL1T, PET101, 릴로나셉트, 카나키누맙의 BLI 센소그램 결과이다.
도 13a는 인간 FcγRⅠ에 대한 PET101, 릴로나셉트의 BLI 센소그램 결과이다.
도 13b는 인간 FcγRⅢA에 대한 PET101, 릴로나셉트의 BLI 센소그램 결과이다.
도 14는 PET101, 릴로나셉트의 투여농도에 따른 인간 IL-1β 매개 마우스 IL-6 분비 억제능 분석 결과이다.
도 15는 PET101, 릴로나셉트의 투여 후 시간에 따른 인간 IL-1β 매개 마우스 IL-6 분비 억제능 분석 결과이다.
도 16은 사이노몰거스 원숭이에서 PET101, 릴로나셉트의 3 ㎎/㎏ 피하투여 조건에서 시간에 따른 시험물질들의 혈장농도 분석 결과이다.
도 17은 IL-1/IL-18 이중특이성 보유 헤테로이량체 트랩 118T3의 모식도(A), 환원 및 비환원 조건에서 118T3 정제산물의 SDS-PAGE 결과(B), IL-1/IL-18 이중특이성 보유 κλ 헤테로이량체 트랩 118T3v01의 모식도(C), 및 환원 및 비환원 조건에서 118T3v01 단계별 정제산물의 SDS-PAGE 결과(D)이다.
도 18은 ELISA를 이용한 인간 IL-1β(A) 및 인간 IL-18(B)에 대한 118T3, 118T3v01의 결합분석 결과이다.
도 19는 표면플라스몬공명(SPR)을 이용한 118T3v01의 인간 IL-1β, 인간 IL-18에 대한 동시결합능 분석 결과이다.
도 20은 118T3v01에서 IL18BP 1개를 제거한 118T3B의 모식도(A), 및 환원 및 비환원 조건에서 118T3B 단계별 정제산물의 SDS-PAGE 결과(B)이다.
도 21a는 인간 IL-1α, 인간 IL-1β, 레서스원숭이 IL-1β, 마우스 IL-1β에 대한 118T3B의 BLI 센소그램 결과이다.
도 21b는 인간 IL-18, 레서스원숭이 IL-18, 마우스 IL-18에 대한 118T3B의 BLI 센소그램 결과이다.
도 22는 IL-1 리포터 세포주에서 118T3v01과 118T3B의 인간 IL-1β(A) 및 인간 IL-18(B) 신호전달 경로 억제능 분석 결과이다.
도 23은 IL-1/TGF-β 이중특이성 보유 헤테로이량체 PET301의 모식도(A), 및 환원 및 비환원 조건에서 PET301의 정제단계별 산물에 대한 SDS-PAGE 결과(B)이다.
도 24는 ELISA를 이용한 인간 IL-1β(A), 인간 TGF-β1(B), 인간 TGF-β3 및 인간 TGF-β2에 대한 PET301의 결합분석 결과이다.
도 25는 IL-1 리포터 세포주를 이용한 PET301의 인간 IL-1β 억제능 분석 결과(A), 및 TGF-β 리포터 세포주를 이용한 PET301의 인간 TGF-β1(B), 인간 TGF-β3(C) 및 인간 TGF-β2 억제능(D) 분석 결과이다.
정의
달리　정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속한 분야에 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시의 이해를 위해, 하기　정의가 적용될 것이고, 단수형으로 사용되는 용어는 복수형을 포함하며, 이의 역도 마찬가지이다.
본원에서 사용되는, 용어 '폴리펩타이드' 및 '단백질'은 천연 단백질의 아미노산 서열 또는 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입과 같은 하나 이상의 돌연변이를 갖는 아미노산 서열을 갖는 긴 사슬의 펩타이드를 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
용어 '융합 단백질'은 함께 공유 결합된 2개 이상의 부분을 갖는 단백질을 지칭하며, 여기서 각 부분은 상이한 단백질로부터 유도된다.
용어 'Fc', 'Fc 부위' 및 'Fc 영역'은 항체분자 중의 힌지부 또는 그의 일부, CH2, CH3 영역으로 이루어지는 부분을 말한다. IgG 클래스의　Fc영역은 EU 넘버링(EU INDEX라고도 불린다)으로, 예를 들면 226번째의 시스테인으로부터 C 말단, 또는 230번째의 프롤린으로부터 C 말단까지를 의미하는데 이것에 한정되지 않는다. Fc 부위는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 단일클론 항체 등을 펩신이나 파파인 등의 단백질 분해효소로 부분 소화한 후에, 단백질 A 칼럼 또는 단백질 G 칼럼에 흡착된 분획을 재용출함으로써 적절하게 취득될 수 있다.
용어 '헤테로이량체'란 아미노산 서열이 상이한 2개의 폴리펩티드로 구성되는 폴리펩티드를 의미한다.
용어 '링커'는 하나 이상의 분자, 예를 들면, 하나 이상의 성분 영역 사이에 삽입될 수 있는 핵산, 아미노산 또는 비-펩타이드 잔기를 의미한다. 예를 들어, 링커는 조작을 용이하게 하기 위해 성분간에 관심 있는 바람직한 부위를 제공하는데 사용될 수 있다. 링커는 또한 숙주세포로부터 융합 단백질의 발현을 증진시키고, 성분이 이의 최적의 3차 구조를 취하고/거나 표적 분자와 적절하게 상호 작용할 수 있도록 입체 장애를 감소시키기 위해 제공될 수 있다. 링커 서열은, 수용체 성분에 자연적으로 연결된 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있거나, 융합 단백질의 발현을 증진시키기 위해, 관심 있는 바람직한 부위를 제공하기 위해, 성분 영역이 최적의 3차 구조를 형성할 수 있도록 하고/거나 성분과 이의 표적 분자와의 상호 작용을 증진시키기 위해 사용되는 첨가된 서열일 수 있다. 바람직하게는, 링커는 융합 단백질 내의 각각의 기능성 성분의 구조를 간섭하지 않고 융합 단백질 성분의 유연성을 증가시킨다.
헤테로이량체 Fc 융합 단백질
본 개시의 일 측면은,
ⅰ) N-말단에서 C-말단 방향으로 제1 목적 단백질, 제1 링커 및 면역글로불린의 제1 Fc 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및,
ⅱ) N-말단에서 C-말단 방향으로 제2 목적 단백질, 제2 링커 및 면역글로불린의 제2 Fc 부위를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하고,
상기 제1 목적 단백질과 제2 목적 단백질은 서로 상이한 단백질이며,
상기 제1 링커 및 제2 링커는 각각 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 변이체인 것인,
헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 제공한다.
헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 정제 상의 문제를 극복하기 위하여, 본 발명자들은 상이한 2개의 목적 단백질의 C-말단과 Fc 영역의 힌지 영역 N-말단 사이에 각각 항체 카파 경쇄 불변부위(CLκ) 및 람다 경쇄 불변부위(CLλ)를 도입한 κλ Fc 융합 단백질 기술을 고안하였다. 본 개시에 따른 κλ Fc 융합 단백질 기술은 상업적으로 생산되는 CLκ 특이적 수지 및 CLλ 특이적 수지를 활용하여 빠르고 간단하게 헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 고순도로 분리하는 것을 가능하게 한다.
CLκ 및 CLλ 영역은 각각 약 12.5 kDa의 분자량을 가지고 있어 이들의 도입에 의한 Fc 융합 단백질의 분자량 증가는 약 25 kDa 정도 수준으로 예상된다. 본 개시에 따른 κλ Fc 융합 단백질 기술은 융합 단백질의 분자량, 안정성 및 안전성에 큰 변화를 일으키지 않으면서도, 헤테로이량체의 분리정제의 편의성 및 효율을 향상시킬 수 있다.
일 태양에서, CLλ 변이체는 C-말단 세린(Ser)이 결실된 것일 수 있다. 구체적으로, C-말단 세린(Ser)은 카밧(Kabat) 넘버링 기준으로 215번 위치에 있는 것일 수 있다.
일 태양에서, CLκ 변이체 및/또는 CLλ 변이체는 중쇄 불변부위 CH1과 디설파이드(disulfide) 결합을 형성하는 시스테인(Cys)이 세린(Ser), 알라닌(Ala) 또는 발린(Val)으로 치환된 것일 수 있다. 구체적으로, 중쇄 불변부위 CH1과 디설파이드(disulfide) 결합을 형성하는 시스테인(Cys)은 카밧(Kabat) 넘버링 기준으로 214번 위치에 있는 것일 수 있다.
도 1에서, A는 상이한 2개의 단백질(단백질 1, 2)을 단일 사슬로 연결한 폴리펩타이드를 인간 면역글로불린 G(immunoglobulin G; IgG)의 Fc 영역 힌지(hinge) 영역 N-말단에 결합시킨 인라인 호모이량체 Fc 융합 단백질(in-line homodimeric Fc fusion protein)을; B는 IgG Fc 영역 힌지 영역 N-말단에 상이한 2개의 단백질을 각각 연결한 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(heterodimeric Fc fusion protein)을; C는 IgG Fc의 CH3 영역에 헤테로이량체 형성을 촉진하는 돌연변이를 도입한 놉-인투-홀 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(KiH heterodimeric Fc fusion protein)을; D는 상이한 2개의 단백질을 각각 인간 면역글로불린 카파 경쇄(kappa light chain) 불변부위(CLκ) 및 람다 경쇄(lambda light chain) 불변 부위(CLλ)에 단일 사슬로 연결한 후 Fc 영역 힌지(hinge) 부위 N-말단에 결합시킨 κλ 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(κλ-Fc fusion protein)을; E는 Fc의 CH3 영역에 헤테로이량체 형성을 촉진하는 돌연변이를 도입한 놉-인투-홀 κλ 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(KiH κλ-Fc fusion protein)을 나타낸다. 도 1에서, A, B 및 C는 종래 기술에 해당하며, D와 E, 특히 E는 본 개시의 범위 내에 속하는 것이다.
일 태양에서, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질은 제1 폴리펩타이드의 C-말단 또는 제2 폴리펩타이드의 C-말단 중 하나 이상에 제3 목적 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
일 태양에서, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질은 단일특이성(mono-specificity) 또는 다중특이성(multi-specificity)을 갖는 것일 수 있다. 용어 '단일특이성'은 하나의 표적(target)에 특이적으로 결합가능함을 의미하며, '다중특이성'은 2개 이상의 구별되는 표적에 특이적으로 결합가능함을 의미한다. 예컨대, 융합 단백질은 제1 표적에 특이적으로 결합가능한 영역 및 제2 표적에 특이적으로 결합가능한 영역을 포함하는 이중특이성(bi-specificity)이다.
일 태양에서, 상기 목적 단백질은 리간드, 수용체, 사이토카인, 효소 또는 펩티드일 수 있다. 구체예에서, 수용체는 사이토카인 수용체일 수 있다. 구체예에서, 사이토카인 및/또는 수용체는 자연적으로 헤테로이량체로 존재 및 기능하는 것일 수 있으며, 예를 들어 인터루킨-1(IL1), 인터루킨-2(IL2), 인터루킨-3(IL3), 인터루킨-4(IL4), 인터루킨-5(IL5), 인터루킨-6(IL6), 인터루킨-11(IL11), 인터루킨-13(IL13), 인터루킨-15(IL15), 인터루킨-18(IL18), 인터루킨-23(IL23), 인터루킨-31(IL31), 인터루킨-33(IL33), 인터루킨-35(IL35), 인터루킨-36(IL36), 백혈병 억제 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 감마-인터페론(IFN-γ), 흉선 기질상 림포포이에틴(TSLP), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
구체적인 예로서, 본 발명자들은 Fc에 결합시킨 2개의 폴리펩타이드를 동시에 가지는 융합 단백질의 형성비율이 높고 정제가 상대적으로 용이할 것으로 예상되는 3종(인라인 호모이량체(도 1A), KiH 헤테로이량체(도 1C), KiH κλ 헤테로이량체(도 1E))을 이용하여 자연상에서 헤테로이량체로 이루어진 IL-1 수용체(IL-1R1, IL-1RAcP)의 세포외 부위를 결합시킨 Fc 융합 단백질을 구성하였다. 도 2에서, A는 IL-1 수용체의 세포외 부위를 도 1의 A 구조에 따라 Fc에 결합시킨 IL-1 특이적 인라인 호모이량체 Fc 융합 단백질로서, IL-1 특이적 인라인 호모이량체 Fc 융합 단백질의 예시로서 릴로나셉트와 동일한 서열을 가지는 융합 단백질(종래 기술)을; B는 IL-1 수용체의 세포외 부위를 도 1의 C 구조에 따라 Fc에 결합시킨 IL-1 특이적 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(IL1T)(종래 기술)을; C는 IL-1 특이적 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 예시로서, IL-1 수용체의 세포외 부위를 도 1의 E 구조에 따라 CLκ 및 CLλ에 연결한 후 Fc에 결합시킨 IL-1 특이적 κλ 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(PET101)(본 개시의 일 구체예)을 구성하였다.
상기 구체예와 같이, 제1 목적 단백질과 제2 목적 단백질 중 하나는 인터루킨-1 수용체 타입 1(IL1R1)이고, 다른 하나는 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAcP)일 수 있다. 예를 들어, 제1 목적 단백질은 인터루킨-1 수용체 타입 1(IL1R1)이고 제1 링커는 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체이며, 제2 목적 단백질은 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAcP)이고 제2 링커는 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 인터루킨-1 수용체 타입 1(IL1R1) 및 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAcP)은 각각 이들의 세포외 영역(ectodomain)인 것일 수 있다.
다른 구체적 예로서, 본 발명자들은 인플라마솜 이펙터 사이토카인 IL-1α, IL-1β, IL-18 동시 저해제를 개발하기 위하여, IL-1 수용체 Fc 융합 단백질의 C-말단 부위에 자연상 인간 IL-18 저해 단백질인 IL18BP(interleukin-18-binding protein)를 융합한 형태의 이중 저해제를 구성하였다. IL-1 저해제 중 인라인 호모이량체 릴로나셉트는 약 250 kDa의 분자량을 가지고 있어 IL18BP의 융합 시 추가적 분자량 증가로 인한 조직 투과성 감소의 문제가 발생할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 상대적으로 분자량이 작은 헤테로이량체 IL-1 저해제 IL1T와 PET101를 IL18BP와 융합한 형태의 IL-1/IL-18 이중 저해제를 제작하였다.
또 다른 구체적 예로서, 본 발명자들은 IL-1의 저해가 TGF-β 저해에 의한 염증 및 MDSC 형성을 감소시키고 항암 효능을 증가시킬 가능성이 있음에 착안하여, PET101을 기반으로 하는 IL-1/TGF-β 이중 저해제를 제작하였다. 구체적으로, 인간 IL-1과 TGF-β에 이중특이성을 보유하는 Fc 융합 단백질을 제조하기 위해, PET101의 Fc 영역 C-말단에 TGF-βRⅡ의 세포외 부분(extracellular domain)이 결합된 형태의 PET301 구조체를 디자인하였다(도 23(A)).
따라서, 일 구체예에 따르면, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질은 제3 목적 단백질로서 인터루킨-18 결합 단백질(IL18BP) 또는 타입 Ⅱ 형질전환 성장인자-베타 수용체(TGFβR Ⅱ)를 포함할 수 있다.
구체적으로, 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 C-말단 중 하나에 인터루킨-18 결합 단백질(IL18BP)을 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 제2 폴리펩타이드의 C-말단에 인터루킨-18 결합 단백질(IL18BP)을 포함할 수 있다.
다른 예에서, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질은 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 C-말단 둘 다에 타입 Ⅱ 형질전환 성장인자-베타 수용체(TGFβRⅡ)를 포함하는 것일 수 있다.
일 태양에서, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질은 제1 Fc 부위 및 제2 Fc 부위가 헤테로이량체의 형성이 촉진되도록 CH3 영역이 변이된 것일 수 있다. 헤테로이량체 형성을 촉진하기 위한 변이들이 당업계에 알려져 있으며, 이들 변이는 특별한 제한 없이 포함될 수 있다. 예를 들면, 제1 Fc 부위 및 제2 Fc 부위의 CH3 영역은 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변이를 포함하는 것일 수 있다.
일 태양에서, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질은 제1 링커, 제2 링커, 또는 이들 둘 다가 Fc 부위 힌지(hinge)의 N-말단에 결합된 것일 수 있다. '힌지'는 야생형　항체　중쇄에서 CH1 도메인과 CH2 도메인을 연결(예컨대 카밧 EU 번호 체계에 따라 대략 위치 216으로부터 대략 위치 320, 또는 대략 위치 226으로부터 대략 위치 230)하는　항체　중쇄 폴리펩티드의 부분을 나타내는 것으로, 통상적으로 25개 이하의 아미노산 잔기를 갖고 회합되는 결합 부위가 독립적으로 움직일 수 있도록 가요성을 갖는다. 예를 들면, 힌지는 아미노산 서열 DKTHTCPXCP, HTCPXCP 또는 CPXCP(여기서 X는 S 또는 P이다)를 갖는 것일 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니다.
일 태양에서, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질은 제1 및/또는 제2 폴리펩타이드의 C-말단과 제3 목적 단백질 사이에 제3 링커를 추가로 포함할 수 있다. 구체예에서, 링커 잔기는 2 내지 100 개의 아미노산 길이를 갖는 펩타이드 링커이다. 예시적인 링커는 Gly-Gly, Gly-Ala-Gly, Gly-Pro-Ala, Gly(G)n 및 Gly-Ser(GS) 링커와 같은 적어도 2 개의 아미노산 잔기를 갖는 선형 펩타이드를 포함한다. GS 링커는 (GS)n, (GSGSG)n, (G2S)n, G2S2G, (G2SG)n, (G3S)n, (G4S)n, (GGSGG)nGn 및 GSG4SG4SG를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 여기서 n은 1 이상이다. 특정 예에서, 링커는 (G4S)2일 수 있다.
일 태양에서, 면역글로불린　Fc 영역은　IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 Fc 영역일 수 있다. 구체적으로, IgG Fc 영역이며, 특히 IgG1 Fc 영역이나, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
조성물, 용도 및 방법
헤테로이량체 Fc 융합 단백질과 관련하여 위에서 기술한 내용은 하기하는 조성물, 용도, 방법 등에도 동일하게 적용된다.
본 개시의 다른 측면은 유효성분으로서 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 제약 조성물이 제공된다.
제약상 허용되는 담체는　조성물을 증진 또는 안정화하거나, 조성물의 제조를 용이하게 한다.　제약상 허용되는 담체는 생리학상 상용성인 용매, 분산 매질, 코팅제, 항박테리아제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.
본 개시의　제약　조성물은 관련 기술분야에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 목적하는 결과에 따라 달라진다. 투여가 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하이거나, 표적 부위에 인접하게 투여되는 것일 수 있다.　제약상 허용되는 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입에 의함)에 적합해야 한다. 조성물은 멸균이고 유체여야 한다. 조성물은 동결건조된 형태일 수 있다. 등장화제, 예를 들어 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을　조성물　내에 포함시킬 수 있다. 본 발명의　제약　조성물은 관련 기술분야에 널리 공지되고 통상적으로 실시되는 방법에 따라 제조될 수 있다.
제약　조성물　중 유효성분의 투여량 수준은, 환자에게 독성이 아니면서 특정한 환자,　조성물　및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 유효성분의 양을 수득하도록 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 다양한 약동학적 인자, 예컨대 사용된 본 개시의 특정한　조성물, 또는 투여 경로, 투여 시간, 배출 속도, 치료 지속기간, 조합되어 사용된 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료할 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적 건강 및 이전 병력 및 기타 인자에 따라 달라진다. 비제한적인 예로서, 투여량은 약 0.0001 내지 100 mg/kg 체중, 보다 통상적으로는 0.1 내지 20 mg/kg 체중의 범위이다. 예시적인 치료 요법은 1주마다 1회, 또는 2주마다 1회, 또는 매월 1회, 또는 3 내지 6개월마다 1회 투여를 수반한다.
일 태양에서, 상기 조성물은 면역 관련 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 것일 수 있다. 구체예에서, 면역 관련 질환 또는 장애는 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환일 수 있다.
일 태양에서, 상기 조성물은 하나 이상의 치료제를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체예에서, 치료제는 면역 관문 억제제(Immune Checkpoint Inhibitor), 예를 들어, PD1 저해제, PD-L1 저해제 및 CTLA4 저해제 중 하나 이상의 것일 수 있다.
본 개시의 또 다른 측면은 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 포함하는, 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하기 위한 조성물을 제공한다.
본 개시의 또 다른 측면은 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하기 위한 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체의 용도를 제공한다.
본 개시의 또 다른 측면은 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하는 방법을 제공한다.
본 개시의 또 다른 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 개시의 또 다른 측면은 헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 친화도에 기반하여 정제하는 단계를 포함하는, 상기 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 정제 방법을 제공한다. 구체예에서, 정제 방법은
1) 면역글로불린 친화도 크로마토그래피를 수행하는 단계;
2) κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 친화도 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
3) λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 친화도 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
다양한　Fc 변이체는　신생아 Fc　수용체((Neonatal Fc Receptor; FcRn)에 대한 결합을 증가시키고, 혈청 반감기를 증가시키는 데 사용될 수 있다. Fc 영역과 FcRn의 결합은 항체 혹은 Fc 융합 단백질이 엔도사이토시스(endocytosis) 되었을 때 엔도솜(endosome)에 의한 분해(degradation)를 막고 pH 의존적 해리를 통해 혈액으로 재방출되도록 유도함으로써, 긴 약물 반감기, 높은 혈액 내 노출 등 항체 및 Fc 융합 단백질의 약동학적 특성을 매개한다. 하지만 많은 Fc 융합 단백질들은 Fc 영역과 결합 단백질 사이의 간섭(interference)으로 인하여 항체 대비 FcRn 결합이 낮은 특징을 보이며, 낮은 FcRn 결합강도는 Fc 융합 단백질의 짧은 반감기와 상관관계를 가진다.
본 발명자들은 κλ Fc 융합 단백질 기술이 정제의 장점 이외에도 CLκ 및 CLλ 영역을 힌지 영역 N-말단에 위치시킴으로써 Fc 영역과 결합 단백질 사이의 거리를 증가시키고, 서로에 의한 간섭을 줄여 FcRn 결합의 장점을 가질 수 있음에 착안하여, 이를 실험을 통해 확인하였다.
이에, 본 개시의 또 다른 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 FcRn 결합능을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한, 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체m 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 방법을 제공한다.
항체의 Fc 영역은 FcRn 이외에도 면역세포 표면의 Fc 감마 수용체(Fcγ receptor)와 결합함으로써 항체의 면역 이펙터 기능을 매개한다. 본 발명자들은 κλ Fc 융합 단백질 기술이 FcRn 뿐만 아니라 Fc 감마 수용체 결합의 장점을 가질 가능성에 대하여 시험한 결과, 증가된 FcγRⅠ 및 FcγRⅢa에 대한 결합능을 가짐을 확인하였다.
항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)은　FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고, 후속하여 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC는　FcγRⅢa에 대한 결합과 상관되며, FcγRⅢa에 대한 증가된 결합은 ADCC 활성의 증가를 유도한다.
이에, 본 개시의 또 다른 측면은 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 FcγR 결합능을 증가시키는 방법이 제공된다.
또한, 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 증가시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 개시를 구체적인 실시예를 들어 보다 상세히 설명하나, 이는 본 개시의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 개시의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하는 것은 아니다.
비교예 1: IL-1 특이성 보유 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(IL1T) 제조
도 2(B)의 구성을 가지는 IL-1 특이적 헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 구현하기 위해 인간 면역글로불린 G1(Immunoglobulin G1; IgG1)의 Fc 영역(서열번호 1)에 놉-인투-홀 돌연변이 기술을 적용하여, 놉 돌연변이 보유 Fc(S354C, T366W; 서열번호 2)와 홀 돌연변이 보유 Fc(Y349C, T366S, L368A, Y407V; 서열번호 3)의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자 서열을 확보하였다. 인간 IL-1R1(GenBank: AAM88423.1)의 신호 서열(signal peptide)과 세포외 부분(extracellular domain)을 구성하는 아미노산 잔기 1 내지 333 또는 인간 IL-1RAcP(GenBank: BAA25421.1)의 신호 서열과 세포외 부분을 구성하는 아미노산 잔기 1 내지 359의 아미노산 잔기를 암호화하는 유전자 서열은 화학적으로 합성하였고(Integrated DNA Technologies, IA, USA), 각각의 벡터에 클로닝하였다. IL-1R-hinge region-CH2-CH3(S354C, T366W)(서열번호 4)과 IL-1RAcP-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V)(서열번호 5)에 해당하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 벡터는 각각 P001, P002로 칭하였다.
P001과 P002 벡터의 동시형질전환(Co-transfection)을 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 유래 세포주인 엑스피초-에스(ExpiCHO-S??; Gibco, A29127)에서 수행하였으며, 이 일시발현(transient expression)을 통해 발현된 헤테로이량 인터루킨-1 트랩(heterodimeric IL-1 trap)을 IL1T라 칭하였다. 일시발현 과정에 사용되는 모든 시약은 제조사(Gibco)의 매뉴얼에 따라 준비되었고, 매뉴얼 내 최대 역가 생산 프로토콜에 따라 수행되었다. Sartoclear Dynamics® Lab V(Sartorius, SDLV-1000-40C-E) 필터시스템을 이용하여, 12일차 배양액을 여과하였으며, 연이어 HiTrap MabSelect SuRe(GE helathcare, 11003493) 정제 컬럼을 이용하여 정제하였고, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit(Merck millipore)를 이용하여, 샘플의 농축을 수행하였다. 최종 정제완료 산물은 샘플 고유의 흡광계수(extinction coefficient)와 분자량을 바탕으로 농도를 정량하였다. 정제 산물은 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)과 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC)를 이용하여 분석을 수행하였다(도 3). SDS-PAGE 분석은 비환원(non-reducing) 조건과 환원(reducing) 조건에서 수행되었으며, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색을 통해 각 사이즈의 밴드를 확인하였다(도 3(A)). 환원 조건에서는 약 70 kDa에서 IL-1R-hinge region-CH2-CH3(S354C, T366W) 단량체와 IL-1RAcP-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V) 단량체의 혼합물이 확인되었다. 비환원 조건에서 약 150 kDa에서 헤테로이량체 및 호모이량체의 혼합물로 추정되는 산물이 확인되었고, 약 70 kDa에서 어셈블리가 되지 않은 단량체가 확인되었다(도 3(A)). 크기배제크로마토그래피 분석에는 Agilent Bio SEC-3 HPLC 컬럼(Agilent, 5190-2511)이 장착된 Alliance® HPLC - e2695 Separations Module(Waters, 2695)을 사용하였다. 분석 결과 7.142분의 정체시간에 헤테로이량체(IL1T)와 호모이량체 혼합물이 82.88% 존재하는 것이 확인되었으며, 5.470분과 6.344분의 정체시간에 응집체(Aggregates)가 검출되었으며, 7.893분의 정체시간에는 단량체 혼합물이 검출되었다(도 3(B)).
실시예 1: IL-1 특이성 보유 κλ 헤테로이량체 Fc 융합 단백질(PET101) 제조
κλ Fc 융합 단백질 기술이 적용된 IL-1 특이성 보유 헤테로이량체 Fc 융합 단백질 제조를 위하여, IL-1R 세포외 부위와 힌지 영역 사이에 항체 경쇄 카파 불변부위를 도입하였으며(서열번호 6), IL-1RAcP 세포외 부위와 힌지 영역 사이에 항체 경쇄 람다 불변부위를 도입하였다(서열번호 7). 이 과정에서 불필요한 어셈블리를 막기 위해 자연상의 카파와 람다의 불변부위 C-말단에 존재하는 시스테인은 세린으로 치환하였다. 이러한 구성으로 제작된 IL-1R-CLκ-hinge region-CH2-CH3(S354C, T366W)와 IL-1RAcP-CLλ-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V)의 아미노산 서열(서열번호 8, 서열번호 9)을 암호화하는 발현벡터를 각각 P003과 P004라고 하며, 엑스피초-에스 세포주에 동시형질전환(co-transfection)을 진행하여 생성되는 헤테로이량체를 PET101이라 칭하였다.
PET101의 정제과정과 정제단계 별 예상되는 주요산물 및 부산물을 도 4a에 표시하였다. 상세하게 설명하면, 비교예 1과 동일한 방식으로 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 기반 정제를 수행하였다. 1차 정제 산물에 대해 KappaSelect 수지(GE helathcare, 17545801)와 연이은 LambdaFabSelect 수지(GE helathcare, 17548201)를 이용한 친화도 크로마토그래피를 수행하였다. 1차(MabSelect), 2차(KappaSelect), 3차(LambdaFabSelect) 정제 산물의 투석, 농축, 정량, SDS-PAGE, 크기배제크로마토그래피 분석은 비교예 1에서 언급한 방식으로 수행하였다. MabSelect 1차 정제 용출액의 비환원 조건 SDS-PAGE 분석 결과에서 약 70 kDa에서 어셈블리되지 않은 단량체가 확인되었으며, 3차 정제까지 완료한 경우 단량체가 제거되고 약 180 kDa의 PET101로 예상되는 단백질이 확인되었다(도 4b의 ⑴). 크기배제크로마토그래피를 이용한 순도 분석에서 1차 정제산물은 헤테로이량체, 호모이량체, 단량체 등이 존재하고, 이량체의 피크는 정체시간 6.836초에서 확인되었으며, 이 혼합물의 면적은 87.57%로 확인되었다(도 4b의 ⑵). 1차 정제산물에서 헤테로이량체 분리를 위하여 2차(KappaSelect), 3차(LambdaFabSelect) 친화도크로마토그래피 연속 정제를 수행하였다. 최종정제산물인 LambdaFabSelect 3차 정제산물의 SDS-PAGE 결과에서 단량체는 확인되지 않으며, 헤테로이량체 추정 산물의 피크가 확인되었다(도 4b의 ⑶). 크기배제크로마토그래피 분석에서 헤테로이량체 추정 산물의 피크는 6.838분의 정체시간을 가지며 용출되었으며, 최종정제산물의 순도는 99.31%로 확인되었다(도 4b의 ⑶).
시험예 1: PET101 헤테로이량체 함량 분석
실시예 1에서 얻어진 PET101 최종정제산물 중 헤테로이량체의 함량을 확인하기 위하여 헤테로이량체와 호모이량체를 분리할 수 있는 소수성 상호작용 크로마토그래피(Hydrophobic Interaction Chromatography) 분석을 수행하였다. 크로마토그래피 컬럼으로는 MAbPac HIC-10 column(4.6×250 mm, 5 μm; Thermo Fisher Scientific)을 사용하였다. 호모이량체 분석을 위하여 IL-1R-CLκ-hinge region-CH2-CH3 호모이량체(PET101 knob κκ) 및 IL-1RAcP-CLλ-hinge region-CH2-CH3 호모이량체(PET101 hole λλ)를 실시예 1에서 언급한 방식으로 발현 정제하여 PET101 최종정제산물과 비교하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 도 5와 같이 PET101 놉 ββ 호모이량체가 가장 먼저 용출됨을 확인하였고, 이후 PET101 최종정제산물, PET101 홀 ββ 호모이량체 순으로 용출됨을 확인하였다. PET101 최종정제산물 중 호모이량체가 아닌 헤테로이량체(PET101 κλ)의 비율은 98.02%로 측정되었으며, 실시예 1에서 언급한 정제과정을 통하여 고순도의 헤테로이량체 분리가 가능함을 입증하였다.
시험예 2: 효소결합면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)를 이용한 IL-1β에 대한 결합능 분석
IL-1 특이성 보유 Fc 융합 단백질 3종(릴로나셉트, IL1T, PET101)의 인간 IL-1β에 대한 결합 분석을 ELISA법을 이용해 수행하였다. 결합능의 비교를 위해 인간 IL-1β 항체 카나키누맙을 대조물질로 사용하였다. 96-하프 웰 면역흡착검사용 플레이트(Corning, 3690)에 30 ng/웰 농도로 인간 IL-1β(Sino Biological, 10139-HNAE)를 처리하고 4 ℃에서 밤샘 코팅을 진행하였다. 다음날, Phosphate Buffered Saline with Tween-20(PBST; TEKNOVA, P1192)을 이용하여, 플레이트 세척을 수행하였다. 본 분석의 모든 세척 과정은 AquaMax 2000 plate washer(Molecular Devices, 0310-5363)를 이용하여 수행하였다. IL1T, PET101, 릴로나셉트, 카나키누맙은 적절한 농도로 1%(w/v) 탈지유 포함 PBST에 희석하여 각 웰에 처리하고, 1시간 동안 상온에서 결합을 유도하고, 3회 플레이트 세척을 진행하였다. 이후 퍼옥시다아제가 결합된 항-인간 IgG Fc 염소항체(Invitrogen 31413)를 1%(w/v) 탈지유 포함 PBST에 희석(1:10,000)하여 결합을 유도하고, PBST 3회 세척 후 암실에서 TMB 기질 용액(Thermo Fisher Scientific, 34028)의 상온 처리를 통한 발색 반응을 유도하였다. 이후 1N 황산(DUKSAN, 255)을 처리하여 반응을 종료하고, SpctraMax i3 멀티모드 플레이트 리더(Molecular Devices, 10192-220)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. PET101은 IL1T, 릴로나셉트와 인간 IL-1β에 대해 유사한 EC50 값을 보이며 결합하는 것으로 확인되었다(도 6). 같은 몰 농도로 처리할 경우 카나키누맙이 높은 OD450 값을 보이는데, 이는 이가(bivalent) 항체인 카나키누맙의 어비디티(avidity) 효과 때문인 것으로 보인다(도 6). 본 시험의 결과는 인간 IL-1 수용체와 Fc 힌지 영역 N-말단 사이에 도입된 CLκ 및 CLλ 영역이 인간 IL-1 수용체와 인간 IL-1β 사이의 결합에 영향을 미치지 않음을 시사한다.
시험예 3: 표면플라스몬공명(Surface plasmon resonance; SPR)을 통한 결합상수 측정
PET101의 IL-1α와 IL-1β에 대한 결합력을 더 정량적으로 분석하기 위하여 Biacore T200(GE healthcare)을 이용하여 표면플라스몬공명 분석을 수행하였다. 결합상수 측정에는 Series S CM5 Senser Chip(GE healthcare, BR100530)을 사용하였으며, Human Antibody Capture Kit(GE healthcare, BR100839)에 포함된 항-인간 Fc 항체를 Amine coupling kit(GE healthcare, BR100050)를 이용해 제조사 매뉴얼에 따라 센서칩에 항-인간 Fc 항체의 고정(Immobilization)을 수행하였다. 항-인간 Fc 항체가 고정된 CM5 센서의 Flow cell 1은 공백칸으로 사용하였으며, Flow cell 2, 3, 4에는 각각 100 nM PET101(18 ㎍/㎖), 100 nM 릴로나셉트(25 ㎍/㎖), 100 nM 카나키누맙(15 ㎍/㎖)을 10 ㎕/분 유속으로 1분 간 로딩하였다. 모든 Flow cell의 준비 완료 후 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8 nM의 인간 IL-1α(R&D systems, 200-LA), 인간 IL-1β(R&D systems, 201-LB), 마우스 IL-1α(R&D systems, 400-ML), 마우스 IL-1β(R&D systems, 401-ML), 레서스원숭이(Rhesus macaque) IL-1β(R&D systems, 1318-RL) 항원을 30 ㎕/분의 유속으로 투입하여 4분 동안 결합반응을 수행하였고, 연이어 30 ㎕/분의 유속으로 1X HBS-EP+ 버퍼(GE healthcare, BR100669)만을 투입하여 10분 간 해리반응을 수행하였다. 획득된 각 센소그램(sensorgram)은 공백 칸(blank cell)과 비교하여 정상화(normalization) 및 절감(subtraction)하여 친화도를 계산하였다. 친화도의 계산에는 BIAevaluation 소프트웨어(GE healthcare)를 사용하였으며, 1:1 랭뮤어 결합 모델(Langmuir model) 분석을 통해 결합속도상수와 해리속도상수를 계산하였다. 평형해리상수(KD)는 해리 속도 상수(Kd)를 결합 속도 상수(Ka)로 나눈 값으로, PET101은 인간 IL-1α, 인간 IL-1β, 원숭이 IL-1β에는 각각 6.97 pM, 3.46 pM, 1.43 pM의 높은 수준의 KD 값을 가짐을 확인하였으며, 마우스 IL-1α, 마우스 IL-1β에는 19.42 pM, 304.54 pM의 KD 값을 가짐을 확인하였다(도 7a, 표 1). 릴로나셉트는 PET101과 유사한 결합패턴을 보이며 측정된 결합상수 표 1과 같다(도 7b). 인간 IL-1β 특이적 항체 카나키누맙은 인간 IL-1β에 대해서 68.39 pM의 KD 값을 가지고, 인간 IL-1α에는 결합하지 않으며, 마우스 항원에 대한 종간 교차결합능이 없는 것으로 확인되었다(도 7c, 표 1). 카나키누맙의 레서스원숭이 IL-1β에 대해 측정된 KD 값은 2.847 μM로 급속도로 해리되는 패턴을 보이며, 굉장히 낮은 결합능을 가지는 것으로 분석되었다(도 7c, 표 1).
PET101, 릴로나셉트, 카나키누맙의 인간 IL-1α, 인간 IL-1β, 원숭이 IL-1β, 마우스 IL-1α, 인간 IL-1β에 대한 평형해리상수(KD), 결합속도상수(Ka), 해리속도상수(Kd)
PET101 릴로나셉트 카나키누맙
Ka(1/Ms)1) Kd(1/s)2) K D (pM) 3) Ka(1/Ms)1) Kd(1/s)2) K D (pM) 3) Ka(1/Ms)1) Kd(1/s)2) K D (pM) 3)
인간 IL-1α 6.32E+6 4.40E-5 6.97 9.18E+6 4.505E-5 4.91 ND4) ND4) NB 5)
인간 IL-1β 2.13E+7 7.38E-5 3.46 3.39E+7 8.669E-5 2.56 7.62E+5 5.21E-5 68.39
원숭이 IL-1β 4.02E+7 7.75E-5 1.43 1.36E+7 2.430E-5 1.78 6.35E+3 1.81E-2 2847244
마우스 IL-1α 4.36E+6 8.47E-5 19.42 4.66E+6 1.784E-4 38.28 ND4) ND4) NB 5)
마우스 IL-1β 5.36E+5 1.62E-4 304.54 8.90E+5 3.28E-4 368.54 ND4) ND4) NB 5)
1) Ka: Association constant
2) Kd: Dissociation constant
3) KD: Equilibrium dissociation constant
4) ND: Not determined
5) NB: No binding
시험예 4: 리포터 세포주를 이용한 IL-1 신호전달 경로 억제능 평가
IL-1β 리포터 HEK 293 세포주(Invivogen, hkb-il1b)는 분비형 리포터 단백질인 SEAP(secreted embryonic alkaline phosphatase)를 인간 IL-1α, IL-1β에 의해 농도의존적으로 분비한다(https://www.invivogen.com/hek-blue-il1b). 상기 세포주에서 IL-1과 IL-1 저해물질들을 동시 처리하고, 배양액 내 SEAP를 정량함으로서 신호전달경로의 억제능을 측정하였다. IL-1β 리포터 HEK 293 세포주를 DMEM(Gibco, 11965-092) + 10% FBS(Gibco, 16140-071) 배지 내에서 배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific, 167008)에서 완전배양배지 내에 1×104 세포/웰로 플레이팅하고, 37 ℃, 5%(v/v) CO2 습윤배양기에서 철야 배양하였다. 무혈청 DMEM 배지에 용해된 20 ng/㎖ 인간 IL-1α(Sino Biological, 10128-HNCH) 또는 인간 IL-1β(Sino Biological, 10139-HNAE)와 무혈청 DMEM 배지에 용해된 0.0001024, 0.000512, 0.00256, 0.0128, 0.064, 0.32, 1.6, 8, 40, 200 nM의 IL-1 저해물질(PET101, 릴로나셉트 또는 카나키누맙)을 1:1의 비율로 30분 동안 예비-혼합하였다. 이 경우 최종농도 10 ng/㎖ 인간 IL-1α 또는 인간 IL-1β와 0.0000512, 0.000256, 0.00128, 0.0064, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, 100 nM IL-1 저해물질(PET101, 릴로나셉트 또는 카나키누맙)이 혼합된 형태로 존재하며, 앞서 철야 배양을 통해 준비된 세포배양플레이트의 배양액을 흡인하고, 예비-혼합한 배지를 웰 당 100 ㎕가 되도록 세포에 처리 후 5시간 동안 37 ℃, 5%(v/v) CO2 습윤배양기에서 배양하였다. 상기 상청액을 SEAP 리포터 유전자 분석 키트(Invitrogen, T1017)를 사용하여, IL-1 저해물질의 IL-1β 신호전달 경로의 억제능을 결정하였다. 오직 10 ng/㎖ 인간 IL-1α 또는 인간 IL-1β만 처리해서 측정된 발광값의 평균값을 SEAP 분비량 100%로 환산하고, 처리되는 물질들과 같은 부피의 PBS(Gibco, 10010)를 처리해서 측정된 발광값의 평균값을 SEAP 분비량 0%로 환산하여, 모든 값을 계산하였다. IL-1β 리포터 HEK 293 세포주에서 IL-1α 억제능 분석 결과 PET101은 0.293 nM의 EC50 값을 가짐을 확인하였으며, 릴로나셉트는 0.308 nM의 EC50 값을 가짐을 확인하였다(도 8(A)). 이 경우 카나키누맙은 효과적인 억제를 유도하지 못하였다(도 8(A)). 동일 세포에서 인간 IL-1β 억제능 분석 결과 PET101은 0.275 nM의 EC50 값을 가짐을 확인하였으며, 릴로나셉트는 0.243 nM의 EC50 값을 가짐을 확인하였다(도 8(B)). 4 nM PET101 또는 릴로나셉트가 처리될 경우 약 99.5%의 SEAP 분비 억제가 리포터 세포주에서 확인되었지만, 4 nM 카나키누맙 처리조건에서는 약 30%의 SEAP 분비 억제만이 확인되었다(도 8(B)).
시험예 5: A549 비소세포성 폐암 세포주를 이용한 IL-1 신호전달 경로 억제능 평가
A549 비소세포성 폐암세포주는 IL-1β에 반응성을 보이며, 포스포이노시티드 3-인산화효소(Phosphoinositide 3-kinase; PI3K), 인터루킨-1 관련 인산화효소-4(Interleukin-1 receptor-associated kinase 4; IRAK4)의 활성화를 통해 인터루킨-6(Interleukin-6; IL-6)의 분비를 유도한다(Hiroyuki Eda et al. Cell Biol Int. 2011). 이 메커니즘을 이용하여, 인위적으로 제작된 리포터 세포주가 아닌 인간 폐암세포주에서 PET101의 효능평가를 수행하였다. A549 비소세포성 폐암 세포주(ATCC, CCL-185)는 RPMI-1640(Welgene, LM001-03) + 10% FBS(Gibco, 16140-071) 배지 내에서 배양하였다. 세포를 96-웰 플레이트에서 위에서와 같은 완전혈청 배지 내에 2×105 세포/웰로 플레이팅한 후, 37 ℃, 5%(v/v) CO2 습윤배양기에서 7시간 동안 배양하여 세포부착을 유도하였다. 이어서, 배지를 웰로부터 제거하고, 무혈청 RPMI-1640 배지(Welgene, LM001-03) 100 ㎕를 투입하고, 18시간 동안 37 ℃, 5%(v/v) CO2 습윤배양기에서 단식시켰다. 무혈청 RPMI-1640 배지 내에 30분 동안 실온에서 예비-혼합된 최종농도 1 ng/㎖ IL-1β(Sino Biological, 10139-HNAE)와 적절한 농도의 IL-1 저해물질(PET101, 릴로나셉트 또는 카나키누맙)을 각각의 웰에 100 ㎕ 처리하였다. 처리 3시간 후, Mouse IL-6 DuoSet ELISA kit(R&D systems, DY406)를 이용하여 상층액 내 IL-6의 양을 제조사의 매뉴얼에 따라 정량하였다. IL-6 정량을 통한 A549 세포주의 IL-1β 저해능 평가 결과 PET101은 44 pM EC50 값을 가지는 것으로 확인되었고, 릴로나셉트는 이와 유사한 37 pM의 EC50 값을 가지는 것으로 확인되었다. 카나키누맙은 동일한 조건에서 2678 pM의 EC50 값을 가지는 것으로 확인되었다(도 9).
시험예 6: PET101의 열 안정성(Thermal stability) 분석
PET101의 열 안정성(Thermal stability) 분석은 Protein Thermal Shift™ Dye Kit(Applied biosystems, 4461146)를 이용하여 제조사 매뉴얼에 따라 수행하였다. 측정결과 릴로나셉트, IL1T, PET101은 각각 56, 56, 55 ℃의 유사한 Tm 값을 가짐을 확인하였다(도 10).
시험예 7: 37 ℃ 조건에서 PET101의 안정성 분석
PBS(pH 7.4; Gibco, 10010)에 용해된 PET101의 안정성 분석은 37 ℃ 조건에서 수행되었다. 1 ㎎/㎖ PET101은 37 ℃ 조건에서 인큐베이션하였으며, 0, 1, 2, 3, 4, 7, 10, 14, 21, 28일에 샘플은 -80 ℃로 옮겨, 실시예 1에서 언급한 방식으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다(도 11(A)). 환원 조건과 비환원 조건 분석 결과에서 단편화(fragmentation) 및 응집현상(aggregation)은 확인되지 않았다. 크기배제크로마토그래피를 이용한 응집체의 존재 유무를 분석한 결과, 정체시간 약 6.2분경에 응집체의 피크가 확인되었으며, 37 ℃ 7일 차 샘플까지는 아주 낮은 피크가 감지되었으며(도 11(B)), Empower software(Waters)를 이용한 면적 분석에서 측정이 되지 않았다(표 2). 37 ℃ 10일 차 샘플에서는 PET101이 99.12% 존재하고, 응집체는 0.88%가 확인되었다(표 2). 37 ℃ 28일 차 샘플에서는 PET101이 98.85% 존재하고, 응집체는 1.15%가 확인되었다(표 2).
크기배제크로마토그래피를 이용한 PBS에서 37 ℃ 인큐베이션 시간에 따른 응집체 양 분석
시간(일) 샘플 정체시간(분) 높이(μV) 면적 면적(%)
0 PET101 6.923 51721 1389703 100
응집체 검출 안 됨 0 0 0
1 PET101 6.916 57457 1473261 100
응집체 검출 안 됨 0 0 0
2 PET101 6.920 57212 1466081 100
응집체 검출 안 됨 0 0 0
3 PET101 6.918 57264 1463598 100
응집체 검출 안 됨 0 0 0
4 PET101 6.926 55570 1429275 100
응집체 검출 안 됨 0 0 0
7 PET101 6.912 57433 1473833 100
응집체 검출 안 됨 0 0 0
10 PET101 6.910 57614 1495529 99.12
응집체 6.241 570 13283 0.88
14 PET101 6.910 56284 1483131 99.03
응집체 6.259 613 14520 0.97
21 PET101 6.907 56942 1484995 98.95
응집체 6.211 671 15762 1.05
28 PET101 6.908 56049 1482170 98.85
응집체 6.222 709 17316 1.15
시험예 8: PET101의 FcRn 결합능 평가
FcRn에 대한 PET101과 릴로나셉트의 결합능 평가는 Bio-Layer Interferometry(BLI) 분석 장비인 Octet Red96e(Fortebio)를 이용하여 30 ℃ 조건에서 분석되었다. Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Fortebio, 18-5120)가 사용되었으며, 분석용 버퍼는 10× Kinetics Buffer(ForteBio, 18-1042)와 PBS pH 7.4(Gibco, 10010)를 1:9로 혼합하고, 최종 pH를 6.0으로 제조하여 러닝버퍼로 사용하였다. 분석플레이트의 회전속도는 모든 조건에서 1,000 rpm으로 진행하였다. His tag을 포함하고 있는 인간 FcRn(Acrobiosystems, FCM-H82W4)을 2 ㎍/㎖ 농도로 러닝버퍼에 희석하여 바이오센서에 로딩하였다. 31.25~1000 nM IL1T, PET101, 릴로나셉트 또는 카나키누맙은 결합속도상수(Ka)를 측정하기 위해 결합시간은 120초로 진행하였으며, 연이어 러닝버퍼에서 해리시간을 120초로 진행하여 해리속도상수(Kd)를 결정하였다. Ka(0 초~120 초)와 Kd(120 초~125초)값은 Octet 분석용 소프트웨어(Fortebio)에서 1:1 결합모델을 통해 산출하였고, 이를 바탕으로 평형해리상수(KD) 값을 결정하였다(도 12).
시험예 9: Fc 감마 수용체에 대한 PET101의 결합능 평가
Fc 감마 수용체에 대한 PET101의 결합능 평가는 Bio-Layer Interferometry(BLI) 분석 장비인 Octet Red96e(Fortebio)를 이용하여 30 ℃ 조건에서 분석하였다. Anti-Penta-HIS(HIS1K) 바이오센서(Fortebio, 18-5120)를 사용하였으며, 분석용 버퍼는 10× Kinetics Buffer(ForteBio, 18-1042)를 PBS pH 7.4(Gibco, 10010)에 희석하여 러닝버퍼로 제조하여 사용하였으며, 분석플레이트의 회전속도는 1,000 rpm으로 진행하였다. His tag을 포함하고 있는 인간 FcγRⅠ(R&D systems, 1257-FC) 또는 인간 FcγRⅢA(R&D systems, 4325-FC)를 2 ㎍/㎖ 농도로 러닝버퍼에 희석하여 바이오센서에 로딩하였다. 결합속도상수(Ka)를 측정하기 위해 80~1280 nM PET101 또는 릴로나셉트를 120초 동안 결합을 진행하였으며, 연이어 러닝버퍼에서 120초 동안 해리를 진행하여 해리속도상수(Kd)를 결정하였다. FcγRⅠ에 대한 KD는 Octet 분석용 소프트웨어(Fortebio)에서 1:1 결합모델을 통해 산출하였고, 이 분석에서 Curve fitting을 수행한 구간은 Ka(0 초~120 초)와 Kd(120 초~240초)이다. 이 경우 PET101과 릴로나셉트의 FcγRⅠ에 대한 KD 값은 각각 19.82 nM, 45.79 nM로 확인되었다(도 13a). FcγRⅢA에 대한 KD는 Octet 분석용 소프트웨어(Fortebio)에서 1:1 결합모델을 통해 산출되었고, 이 분석에서 Curve fitting을 수행한 구간은 Ka(0 초 ~ 120 초)와 Kd(120 초 ~ 125초)이다. 이 경우 PET101과 릴로나셉트의 FcγRⅢA에 대한 KD 값은 각각 661 nM, 913 nM로 확인되었다(도 13b).
시험예 10: PET101의 투여 농도에 따른 in vivo 중화능 평가
PET101의 농도에 따른 in vivo 중화능 평가 실험(n = 5/그룹)을 위하여 개체 당 약 20 g의 6주령 C57BL/6 암컷을 사용하였다. 동물실험 진행과 관련하여 모든 실험절차는 개시 이전에 메디톡스 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC) 승인 하에 진행되었다. PET101의 in vivo 중화능 평가는 이전의 문헌에서 확립된 방법을 이용하여 진행하였으며, C57BL/6 암컷 마우스에 인간 또는 원숭이의 IL-1α 또는 IL-1β를 투여하였을 때 마우스 혈액 내 IL-6가 증가되는 현상을 이용하였다(Economides et al., Nat Med. 2003 & Lacy et al. mAbs. 2015). 구체적으로 마우스에 인위적으로 외인성 인간 IL-1β를 투입한 후 IL-6의 증가를 PET101이 얼마나 억제할 수 있는지를 릴로나셉트와 비교분석하였다. 먼저 0.001(0.3배), 0.003(1배), 0.01(3배), 0.03(10배), 0.1(30배), 0.3(100배), 1(300배) ㎎/㎏의 PET101 또는 0.0014(0.3배), 0.0047(1배), 0.14(3배), 0.465(10배), 0.140(30배), 0.465(100배), 1.40(300배) ㎎/㎏의 릴로나셉트가 마우스에 피하(s.c.) 투여되었다(괄호 안의 수치 = 항-IL-1 트랩 몰 수/나중에 투여될 300 ng/㎏에 해당하는 인간 IL-1β 몰 수). 피하 투여 24시간 후 인간 IL-1β(Sino Biological, 10139-HNAE)가 복강(i.p.) 투여방식으로 300 ng/㎏(5 ㎖/㎏)로 투여 되었다. 투여 2시간 후 각 마우스의 혈청이 확보되었다. 마우스 혈청의 IL-6의 정량은 Mouse IL-6 DuoSet ELISA kit(R&D systems, DY406)를 이용하여 수행되었다. 항-IL-1 트랩의 투여 없이 동량의 PBS만 피하 투여 진행하고, 24시간 뒤 동량의 PBS를 복강 투여하여 확보한 혈청의 정량된 IL-6 값을 0%로 계산하였으며, 항-IL-1 트랩의 투여 없이 동량의 PBS만 피하 투여 진행하고, 24시간 뒤 300 ng/㎏(5 ㎖/㎏) IL-1β를 복강 투여하여 확보한 혈청의 정량된 IL-6 값을 100%로 계산한다. 이를 바탕으로 각 그룹의 정량값은 억제능(%)으로 변환되었다. 분석결과 PET101의 EC50 값은 3.32 ㎍/㎏이며, 릴로나셉트의 EC50 값은 10.52 ㎍/㎏로 PET101이 릴로나셉트 대비 약 3.17배 우월한 활성이 확인되었다(도 14). 투여된 IL-1β 대비 PET101 또는 릴로나셉트를 3배(몰 수 기준) 과량 투여한 경우, PET101은 약 80%의 억제능을 보이는 반면 릴로나셉트는 약 50%의 억제능을 보인다(도 14).
시험예 11: PET101의 투여 시간에 따른 in vivo 중화능 평가
PET101의 시간에 따른 in vivo 중화능 평가 실험(n = 5/그룹; 총 16 그룹)을 위하여 개체 당 약 20 g의 6주령 C57BL/6 암컷을 사용하였다. 동물실험 진행과 관련하여 모든 실험절차는 개시 이전에 메디톡스 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee; IACUC) 승인 하에 진행되었다. 실험은 마우스에 PET101을 투여한 후 다양한 시간에 인위적으로 인간 IL-1β를 투입하여 생성되는 IL-6의 양을 정량하는 방식으로 진행되었으며, 구체적으로 투여 후 1일, 2일, 3일, 6일에 잔존하는 PET101이 IL-6를 얼마나 억제할 수 있는지를 릴로나셉트와 비교분석하였다. 먼저 PBS, 10 ㎎/㎏ PET101 또는 10 ㎎/㎏ 릴로나셉트를 마우스에 피하(s.c.) 투여하였다. 피하 투여 1일, 2일, 3일, 6일 후, PBS 또는 인간 IL-1β(Sino Biological, 10139-HNAE)를 복강(i.p.) 투여방식으로 300 ng/㎏(5 ㎖/㎏)로 투여하였다. 투여 2시간 후 각 마우스의 혈청을 확보하였으며, 마우스 혈청의 IL-6의 정량은 Mouse IL-6 DuoSet ELISA kit(R&D systems, DY406)를 이용하여 시험예 5에서 언급한 방식으로 수행하였다. 정량분석 결과 PBS(s.c.) + PBS(i.p.)를 투여한 그룹에서는 시간에 관계없이 0~6 pg/㎖의 마우스 IL-6가 정량되었다(도 15). 이는 정상 C57BL/6 암컷 마우스의 혈액에 IL-6가 존재하지 않거나 미량 존재하는 것으로 해석된다(도 15). PBS(s.c.) + hIL-1β(i.p.) 투여의 경우, 투여된 인간 IL-1β가 마우스 IL-6의 발현을 유도하여, 3352~3769 pg/㎖의 IL-6가 정량되었다. PET101이 투여되었을 경우, 3일 차까지 IL-6의 유도를 완벽히 억제하였으며, PET101 투여 6일 후 인간 IL-1β를 처리한 조건에서는 약 2005 pg/㎖의 IL-6가 정량되었다(도 15). 릴로나셉트 투여 군의 경우, 1일 차에서만 IL-6의 유도가 완벽히 억제되었고, 2, 3, 6일 차에 각각 8, 31, 2348 pg/㎖의 IL-6가 혈액에서 측정되었다(도 15). 본 분석을 통해 PET101은 마우스 체내에서 인간 IL-1β를 억제하는 효능의 지속성 측면에서 릴로나셉트 대비 우위에 있음을 확인하였다(도 15).
시험예 12: 사이노몰거스 원숭이를 이용한 PET101의 영장류 PK 분석
PET101의 사이노몰거스 원숭이를 이용한 PK 분석을 수행하였다. 대조물질로는 릴로나셉트를 이용하였다. PET101, 릴로나셉트를 피하(s.c.) 투여 경로로 3 ㎎/㎏ 투여하였다(n = 3/그룹). 0분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 2일, 3일, 6일, 10일, 14일, 21일, 28일에 혈액 샘플을 확보하고, 혈장분리를 수행하였다. 혈장 내 PET101, 릴로나셉트의 농도를 ELISA에 의해 측정하였다. 간단하게 96-웰 ELISA용 플레이트(Corning, 3590)에 1 ㎍/㎖ 고친화도 키메릭 항-인간-IL-1R 마우스 항체를 4 ℃ 밤샘 보관함으로써 코팅을 수행하였고, 다음날 PBST로 플레이트 세척을 수행하고, 상온에서 1시간 동안 3% BSA 용액(Sigma)을 이용해 블로킹을 진행하고, 연이은 PBST 세척을 수행하였다. 각각의 시간에 확보된 혈장들은 적절하게 희석하여, 코팅된 항 인간-IL-1R 토끼항체에 대한 결합반응을 유도하였다. PBST를 이용한 세척 후, 고친화도 키메릭 항-인간-IL-1RAcP 토끼항체를 처리하여, 1시간 동안 상온에서 결합반응을 유도하였다. PBST를 이용해 세척을 진행하고, 퍼옥시다제-접합된 항-토끼 IgG 항체(Cell Signaling Technology, 7074S)를 처리하여, 상온에서 1시간 동안 결합을 유도하였다. PBST를 이용하여, 3회 플레이트 세척을 수행하였고, TMB 기질 용액(Thermo Fisher Scientific, 34028)을 처리하고, 상온인 암실에 20분간 반응을 유도하였다. 1N 황산용액(DUKSAN, 255)을 처리하여, 반응을 종료시키고, SpectraMax i3x 멀티모드 플레이트 리더(Molecular Devices, i3x)를 이용하여, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. PET101과 릴로나셉트의 표준정량시료를 제작하여 정량에 사용하였으며, 각 농도를 함유하는 나이브 사이노몰거스 혈청으로부터 생성된 표준 곡선을 통해, 각 시간 별 분석물질의 농도를 정량하였다. 3 ㎎/㎏ 피하투여에서 PET101과 릴로나셉트는 각각 약 59.3시간, 약 62.5시간의 유사한 수준의 반감기(T1/2)를 가짐을 확인하였다(표 3). 하지만 PET101의 혈중 농도-시간 곡선하 면적(Area under the curve from time 0 to infinity, AUCinf)은 릴로나셉트 대비 2.17배로 측정되어 원숭이 체내 약물 노출에서 우위에 있음을 확인하였다(도 16, 표 3).
사이노몰거스 원숭이에서 PET101과 릴로나셉트의 PK 파라미터
투여물질(용량, 투여경로) PET101(3 ㎎/㎏, s.c.) 릴로나셉트(3 ㎎/㎏, s.c.)
T1/2(h) 59.3±0.7 62.5±6.7
Tmax(h) 24.0±0.0 24.0±0.0
Cmax(ng/㎖) 7576±2325 3964±316
AUClast(ng*h/㎖) 776430±59152 356766±6022
AUCinf(ng*h/㎖) 776681±59146 358670±5101
MRTinf(h) 90.9±5.0 86.4±4.6
비교예 2: IL-1과 IL-18 이중특이성 보유 헤테로이량체 폴리펩타이드(118T3) 제조
먼저 IL1T의 Fc 영역 C-말단 부위에 인간 IL18BP를 융합한 헤테로이량체를 제작하였다(도 17(A)). 인간 IL18BP(GenBank: BAA76374.1)를 구성하는 아미노산 잔기 31~194의 유전자 서열을 화학적으로 합성하였으며(Integrated DNA Technologies, IA, USA), 각각의 발현을 위한 벡터에 클로닝하였다. 구체적으로 IL1R-hinge region-CH2-CH3(S354C, T366W, K447del)-(G4S)2-IL18BP(서열번호 10)와 IL1RAcP-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V, K447del)-IL18BP(서열번호 11)에 해당하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 벡터의 동시형질전환(co-transfection)으로 발현되는 헤테로이량체를 118T3이라 한다(도 17의 A). 118T3의 일시발현은 비교예 1과 동일한 방식으로 진행되었으며, 12일 차 배양액은 Sartoclear Dynamics® Lab V(Sartorius, SDLV-1000-40C-E) 필터시스템을 이용하여 여과된 후 HiTrap MabSelect SuRe(GE helathcare, 11003493) 정제 컬럼을 이용하여 정제되었다. 최종 정제 산물은 비교예 1과 동일한 방식으로 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 분석하였다(도 17(B)). 분석 결과 환원조건에서는 약 110 kDa에서 단량체 혼합물이 확인되었으며, 비환원조건에서는 약 220 kDa에서 헤테로이량체 및 호모이량체 혼합물로 추정되는 산물과 함께 약 110 kDa에서 어셈블리되지 않은 단량체가 확인되었다(도 17의 B).
실시예 2: IL-1과 IL-18 이중특이성 보유 κλ 헤테로이량체 폴리펩타이드(118T3v01) 제조
PET101의 Fc 영역 C-말단 부위에 인간 IL18BP를 융합한 헤테로이량체를 제작하였다(도 17(C)). 구체적으로 IL1R-kappa constant region-hinge region-CH2-CH3(S354C, T366W, K447del)-(G4S)2-IL18BP(서열번호 12)와 IL1RAcP-lambda constant region-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V, K447del)-IL18BP(서열번호 13)에 해당하는 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 벡터의 동시형질전환(co-transfection)으로 발현되는 헤테로이량체를 118T3v01이라 한다(도 17(C)). 상세하게 실시예 1에서 언급한 방식으로 발현을 진행한 후 12일 차에 배양액을 회수하고, Sartoclear Dynamics® Lab V(Sartorius, SDLV-1000-40C-E) 필터시스템을 이용하여 여과를 수행한 후 HiTrap MabSelect SuRe(GE helathcare, 11003493) 정제 컬럼을 이용하여 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 기반 정제를 진행하였다. 1차 정제 산물에 대해 KappaSelect 수지(GE helathcare, 17545801)와 연이은 LambdaFabSelect 수지(GE helathcare, 17548201)를 이용한 친화도 크로마토그래피를 수행하였다. 1차(MabSelect), 2차(KappaSelect), 3차(LambdaFabSelect) 정제 산물의 투석, 농축, 정량, SDS-PAGE 분석은 실시예 1에서 언급한 방식으로 수행되었다. MabSelect 1차 정제 용출액의 비환원조건 SDS-PAGE 분석 결과에서 약 130 kDa에서 어셈블리되지 않은 단량체가 확인되었으며, 3차 정제까지 완료한 경우 단량체가 확인되지 않으며, 약 250 kDa에 118T3v01로 추정되는 이량체 산물이 확인되었다(도 17(D)).
시험예 13: 효소결합면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)를 이용한 IL-1/IL-18 이중특이성 헤테로이량체의 인간 IL-1β, 인간 IL-18 결합능 분석
IL-1/IL-18 이중특이성 헤테로이량체 118T3와 118T3v01의 인간 IL-1β 및 인간 IL-18에 대한 결합 분석을 시험예 2와 동일한 방식으로 ELISA법을 이용하여 수행하였다. 분석 결과 118T3와 118T3v01은 유사한 인간 IL-1β 결합능을 가짐을 확인하였고(도 18(A)), 인간 IL-18 결합능 역시 유사함을 확인하였다(도 18(B)).
시험예 14: 표면플라스몬공명(surface plasmon resonance; SPR)을 통한 118T3v01의 결합특성 분석
118T3v01이 인간 IL-1β과 인간 IL-18에 동시에 결합하는지 확인하기 위해 Biacore T200(GE healthcare)을 이용하여 표면플라스몬공명 분석을 수행하였다. 다음의 분석에서 사용된 모든 샘플에 희석 및 이동상으로 1× HBS-EP+ 버퍼(GE healthcare, BR100669)를 사용하였다. 상세하게, Human Antibody Capture Kit(GE healthcare, BR100839)에 포함된 항-인간 Fc 항체를 Amine coupling kit(GE healthcare, BR100050)를 이용해 제조사 매뉴얼에 따라 Series S CM5 Senser Chip(GE healthcare, BR100530)에 고정(immobilization)하였다. 항-인간 Fc가 고정된 센서에 100 nM 118T3v01(25 ㎍/㎖)을 10 ㎕/분 유속으로 1분 간 로딩하고, 2분간 평형상태를 유지하였으며 센서의 표면에 1766.1 RU의 118T3v01이 로딩됨을 확인하였다(도 19). 이후 연이어 3분간 200 nM 인간 IL-18(Sino Biological, 10119-HNCE)의 결합반응을 유도하고, 5분간 해리반응을 유도하였으며, 평형상태일 때 인간 IL-18은 134.5 RU가 결합함을 확인하였다(도 19). 연이어 200 nM 인간 IL-1β(Sino Biological, 10139-HNAE)의 결합반응과 해리반응을 각각 3분, 5분간 진행하였으며, 인간 IL-1β는 137.5 RU 결합함을 확인하였다. 표면플라스몬 공명분석에서 RU 값은 센서 표면에 로딩된 물질의 질량에 비례하며, 1 RU는 1 pg/㎟의 물질이 센서에 고정 또는 상호작용에 의해 결합됨을 의미한다. 118T3v01의 분자량은 약 250 kDa이며, 인간 IL-1β와 IL-18은 분자량이 약 18.4 kDa이다(도 19). 이를 바탕으로 1개의 118T3v01 단백질은 1.03개의 인간 IL-18과 결합하고, 동시에 1.06개의 인간 IL-1β와 결합함을 확인하였다(도 19). 118T3v01은 Fc 영역 C-말단에 인간 IL-18과 결합할 수 있는 인간 IL18BP 단백질 2개가 결합되어 있지만, 이들 중 1개만이 IL-18과 결합하는 것으로 확인되었다(도 19). 이는 결합된 2개의 IL18BP 단백질 사이에 입체 장애(steric hindrance)가 발생하고 있음을 시사한다.
실시예 3: IL-1과 IL-18 이중특이성 보유 κλ 헤테로이량체 최적화(118T3B)
시험예 14에서, 118T3v01에 존재하는 인간 IL18BP 단백질 2개 중 1개는 타겟 결합에 참여하지 않음을 확인하였다. 불필요하게 결합된 1개의 IL18BP를 제거하고 분자량을 줄이기 위하여 놉 부분의 IL18BP를 제거한 118T3B를 제작하였다(도 20(A)). 118T3B를 발현하기 위하여 IL1R-kappa constant region-hinge region-CH2-CH3(S354C, T366W)(서열번호 8)과 IL1RAcP-lambda constant region-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V, K447del)-IL18BP(서열번호 13)를 코딩하는 발현벡터로 비교예 1에서 언급한 방식으로 발현이 수행되었으며, 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제가 수행되었다(도 20(B)). SDS-PAGE 분석 결과 환원 조건에서 약 90 kDa과 약 130 kDa의 단량체가 확인되었으며, 비환원 조건에서 3차 정제 후 단량체가 제거되고 약 220 kDa에서 118T3B 헤테로이량체로 추정되는 고순도 물질을 확보하였음을 확인하였다(도 20(B)).
시험예 15: IL-1과 IL-18에 대한 118T3B의 결합능 평가
인간 IL-1α(R&D systems, 200-LA), 인간 IL-1β(R&D systems, 201-LB), 레서스원숭이 IL-1β(R&D systems, 1318-RL), 마우스 IL-1β(R&D systems, 401-ML), 인간 IL-18(Sino Biological, 10139-HNAE), 레서스원숭이 IL-18(R&D systems, 2548-RM), 마우스 IL-18(Sino Biological, 50073-MNCE)에 대한 118T3B의 결합능 평가는 Bio-Layer Interferometry(BLI) 분석 장비인 Octet Red96e(Fortebio)를 이용하여 30 ℃ 조건에서 수행되었다. Anti-Human IgG Fc Capture(AHC) 바이오센서(Fortebio, 18-5063)가 사용되었으며, 분석용 버퍼는 10× Kinetics Buffer(ForteBio, 18-1042)를 PBS pH 7.4(Gibco, 10010)에 희석하여 러닝버퍼로 제조하여 사용하였으며, 분석플레이트의 회전속도는 1,000 rpm으로 진행하였다. 118T3B는 20 ㎍/㎖ 농도로 러닝버퍼에 희석하여 바이오센서에 5분간 로딩하였다. 0.25~8 nM 인간 IL-1α, 인간 IL-1β, 레서스원숭이 IL-1β, 마우스 IL-1β는 결합속도상수(Ka)를 측정하기 위해 결합시간은 300초로 진행되었으며, 연이어 러닝버퍼에서 해리시간을 1200초로 진행하여 해리속도상수(Kd)를 결정하였다(도 21a). 1~64 nM 인간 IL-18, 레서스원숭이 IL-18, 마우스 IL-18은 결합속도상수(Ka)를 측정하기 위해 결합시간은 300초로 진행되었으며, 연이어 러닝버퍼에서 해리시간을 600초로 진행하여 해리속도상수(Kd)를 결정하였다(도 21b). Ka 와 Kd 값은 Octet 분석용 소프트웨어(Fortebio)에서 1:1 결합모델을 통해 측정하였고, 이를 바탕으로 평형해리상수(KD) 값을 결정하였다(도 21a, 도 21b).
시험예 16: 리포터 세포주를 이용한 IL-1/IL-18 이중특이성 헤테로이량체의 IL-1, IL-18 신호전달 경로 억제능 평가
IL-1/IL-18 이중특이성 헤테로이량체 118T3v01과 118T3B의 인간 IL-1β 신호전달 경로 억제능 평가를 위하여 시험예 4에서 언급한 인간 IL-1β 리포터 세포주(Invivogen, hkb-il1b) 및 실험방법을 이용하였다. 분석 결과 118T3v01와 118T3B는 각각 123 pM, 135 pM의 유사한 EC50 값을 가짐을 확인하였다(도 22(A)). 118T3v01과 118T3B의 인간 IL-18에 대한 억제능을 분석하기 위하여 IL-18 Reporter HEK293 세포주(Invivogen, hkb-hmil18)를 이용하였으며, 1 ng/㎖의 인간 IL-18(Sino Biological, 10139-HNAE)를 사용하여 시험예 4와 동일한 방법으로 분석을 진행하였다. 분석 결과 118T3v01과 118T3B는 각각 392 pM, 305 pM의 유사한 EC50 값을 가짐을 확인하였다(도 22(B)).
실시예 4: IL-1과 TGF-β 이중특이성 보유 κλ 헤테로이량체 폴리펩타이드(PET301) 제조
인간 TGFβRⅡ(GenBank: ACZ58377.1)의 세포외 부위를 구성하는 아미노산 잔기 24 내지 184의 아미노산 잔기를 암호화하는 유전자 서열을 화학적으로 합성하였다(Integrated DNA Technologies, IA, USA). 합성된 유전자들은 XhoⅠ, XbaⅠ 제한부위를 통해 각각의 발현을 위한 벡터에 클로닝하였으며, 수득한 양성 클론은 DNA 시퀀싱을 통해 검증하였다. 구체적으로 IL1R-kappa constant region-hinge region-CH2-CH3(S354C, T366W, K447A)-(G4S)4G-TGFβRⅡ(서열번호 14)과 IL1RAcP-lambda constant region-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V, K447A)-(G4S)4G-TGFβRⅡ(서열번호 15)에 해당하는 폴리펩타이드를 발현하는 벡터의 동시형질전환(Co-transfection)으로 생산세포주에서 발현되는 헤테로이량체를 PET301이라 하였다(도 23(A)). IL-1/TGF-β 이중특이성 헤테로이량체는 비교예 1에서 언급한 방식으로 일시 발현이 수행되었으며, 실시예 1에서 언급한 방식으로 정제가 수행되었다. 각 정제 단계별 산물은 소듐도데실설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 분석이 수행되었다(도 23(B)). 분석 결과 환원조건에서는 약 110 kDa에서 단량체가 확인되었으며, 비환원조건에서는 3차 정제 후 단량체가 제거되고 약 220 kDa에서 PET301 헤테로이량체로 추정되는 산물이 확인되었다(도 23(B)).
시험예 17: 효소결합면역흡착검사(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)를 이용한 PET301의 인간 IL-1β, 인간 TGF-β에 대한 결합능 분석
PET301의 인간 IL-1β, 인간 TGF-β에 대한 결합 분석을 ELISA법을 이용해 수행하였다. 96-웰 면역흡착검사용 플레이트(Corning, 3590)에 60 ng/웰 농도로 인간 IL-1β(Sino Biological, 10139-HNAE) 또는 인간 TGF-β1(R&D systems, 7754-BH) 또는 인간 TGF-β3(R&D systems, 8420-B3)를 코팅하였다. 다음날, Phosphate Buffered Saline with Tween-20(PBST; TEKNOVA, P1192)을 이용하여, 플레이트 세척을 수행하였다. 1%(w/v) 소혈청알부민(Bovine Serum Albumin; BSA)이 첨가된 PBST를 이용해 블로킹을 상온에서 1시간 인큐베이션 후 3회 플레이트 세척을 진행하였다. PET301은 적절한 농도로 1%(w/v) BSA 포함 PBST에 희석하여 각 웰에 처리하고, 1시간 동안 상온에서 결합을 유도하고, 3회 플레이트 세척을 진행하였다. 퍼옥시다아제가 결합된 항-인간 IgG Fc 염소항체(Invitrogen, 31413)를 1%(w/v) BSA 포함 PBST에 희석(1:10,000)하여, 결합을 유도하고, PBST를 이용해 3회 세척을 수행하고, TMB 기질 용액(Thermo Fisher Scientific, 34028)을 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도를 바탕으로 EC50 값을 Prism 7 소프트웨어(GraphPad Software)를 이용하여 산출하였다(도 24(A), 도 24(B), 도 24(C), 표 4).
PET301과 인간 TGF-β2의 결합능의 분석은 96-웰 면역흡착검사용 플레이트(Corning, 3590)에 60 ng/웰 농도로 PET301을 코팅하여 수행하였다. 1%(w/v) BSA 포함 PBST에서 상온 1시간 블로킹을 진행하고, 적절한 농도의 인간 TGF-β2(Peprotech, 100-35B)는 1%(w/v) BSA 포함 PBST에 희석하여 상온에서 1시간 동안 결합반응을 유도하고, Anti-TGF-β2 biotinylated antibody(R&D systems, BAF302)를 처리하여, 상온에서 1시간동안 결합반응을 유도하였다. Streptavidin-HRP(R&D systems)를 처리하여 상온에서 30분 동안 결합반응을 유도하고, 이후 과정은 위에서 언급한 것과 같은 방식으로 수행하였다(도 24(D), 표 4).
분석 결과 PET301은 인간 IL-1β, 인간 TGF-β1, 인간 TGF-β3에 대해 각각 0.226 nM, 0.799 nM, 0.357 nM의 EC50 값을 가지며, 이들 항원에 고친화도를 가짐을 확인하였다(표 4). PET301은 인간 TGF-β2에 3.081 nM의 EC50 값을 가지며, 상대적으로 낮은 친화도를 가지는 것으로 확인되었다(표 4).
인간 IL-1β, 인간 TGF-β1, 인간 TGF-β2, 인간 TGF-β3에 대한 PET301의 결합능 분석
인간 IL-1β 인간 TGF-β1 인간 TGF-β2 인간 TGF-β3
EC50(nM) 0.226 0.799 3.081 0.357
시험예 18: 리포터 세포주를 이용한 PET301의 IL-1과 TGF-β 신호전달 경로 억제능 평가
PET301의 인간 IL-1β 신호전달 경로 억제능 평가는 시험예 4에서 언급한 방식과 동일하게 IL-1β Reporter HEK 293 세포주(Invivogen, hkb-il1b)를 사용하여 진행하였다. 분석 결과 IL-1β Reporter HEK 293 세포주에서 PET301은 1.056 nM의 EC50 값을 가짐을 확인하였다(도 25(A)). PET301의 인간 TGF-β1, 인간 TGF-β2, 인간 TGF-β3에 대한 억제능을 분석하기 위해 TGF-β Reporter HEK 293 세포주(Invivogen, hkb-tgfb)를 사용하였으며, 세포주의 활성화를 위해 1 ng/㎖ 인간 TGF-β1(R&D systems, 7754-BH) 또는 10 ng/㎖ 인간 TGF-β2(Peprotech, 100-35B) 또는 1 ng/㎖ 인간 TGF-β3(R&D systems, 8420-B3)를 사용하였다. PET301의 TGF-β 억제능 분석에는 Quanti-Blue?? solution(Invivogen, rep-qbs)을 사용하여 SEAP의 발현을 정량하였다. 분석 결과 PET301은 인간 TGF-β1, 인간 TGF- β3에 대해 각각 30 pM, 89 pM의 EC50 값을 가지며, 인간 TGF-β2는 효율적으로 억제하지 못함을 확인하였다(도 25(B), (C), (D)).
<110> Medytox Inc. <120> Heterodimeric Fc fusion proteins, and related compositions, uses and methods <130> MT107 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 217 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 1 5 10 15 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 20 25 30 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 35 40 45 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 50 55 60 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 65 70 75 80 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 85 90 95 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 100 105 110 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met 115 120 125 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 130 135 140 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 145 150 155 160 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 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Asp Arg Leu Ile Val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly 180 185 190 Asn Tyr Thr Cys His Ala Ser Tyr Thr Tyr Leu Gly Lys Gln Tyr Pro 195 200 205 Ile Thr Arg Val Ile Glu Phe Ile Thr Leu Glu Glu Asn Lys Pro Thr 210 215 220 Arg Pro Val Ile Val Ser Pro Ala Asn Glu Thr Met Glu Val Asp Leu 225 230 235 240 Gly Ser Gln Ile Gln Leu Ile Cys Asn Val Thr Gly Gln Leu Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly Ser Val Ile Asp Glu Asp Asp Pro 260 265 270 Val Leu Gly Glu Asp Tyr Tyr Ser Val Glu Asn Pro Ala Asn Lys Arg 275 280 285 Arg Ser Thr Leu Ile Thr Val Leu Asn Ile Ser Glu Ile Glu Ser Arg 290 295 300 Phe Tyr Lys His Pro Phe Thr Cys Phe Ala Lys Asn Thr His Gly Ile 305 310 315 320 Asp Ala Ala Tyr Ile Gln Leu Ile Tyr Pro Val Thr Asn Ser Gly Thr 325 330 335 Val Ala Ala Pro Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro 340 345 350 Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu 355 360 365 Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 370 375 380 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp 385 390 395 400 Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys 405 410 415 Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln 420 425 430 Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Asp 435 440 445 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 450 455 460 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 465 470 475 480 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 485 490 495 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 500 505 510 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 515 520 525 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 530 535 540 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 545 550 555 560 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 565 570 575 Thr Leu Pro Pro Cys Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 580 585 590 Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 595 600 605 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 610 615 620 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 625 630 635 640 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 645 650 655 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 660 665 670 Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 675 680 685 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val 690 695 700 Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro 705 710 715 720 Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln 725 730 735 Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro 740 745 750 Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr 755 760 765 Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile 770 775 780 Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys 785 790 795 800 Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn 805 810 815 Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp 820 825 830 <210> 15 <211> 853 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL1RAcP-lambda constant region-hinge region-CH2-CH3(Y349C, T366S, L368A, Y407V, K447A)-(G4S)4G-TGFbetaRII <400> 15 Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser 1 5 10 15 Ser Arg Ala Ser Glu Arg Cys Asp Asp Trp Gly Leu Asp Thr Met Arg 20 25 30 Gln Ile Gln Val Phe Glu Asp Glu Pro Ala Arg Ile Lys Cys Pro Leu 35 40 45 Phe Glu His Phe Leu Lys Phe Asn Tyr Ser Thr Ala His Ser Ala Gly 50 55 60 Leu Thr Leu Ile Trp Tyr Trp Thr Arg Gln Asp Arg Asp Leu Glu Glu 65 70 75 80 Pro Ile Asn Phe Arg Leu Pro Glu Asn Arg Ile Ser Lys Glu Lys Asp 85 90 95 Val Leu Trp Phe Arg Pro Thr Leu Leu Asn Asp Thr Gly Asn Tyr Thr 100 105 110 Cys Met Leu Arg Asn Thr Thr Tyr Cys Ser Lys Val Ala Phe Pro Leu 115 120 125 Glu Val Val Gln Lys Asp Ser Cys Phe Asn Ser Pro Met Lys Leu Pro 130 135 140 Val His Lys Leu Tyr Ile Glu Tyr Gly Ile Gln Arg Ile Thr Cys Pro 145 150 155 160 Asn Val Asp Gly Tyr Phe Pro Ser Ser Val Lys Pro Thr Ile Thr Trp 165 170 175 Tyr Met Gly Cys Tyr Lys Ile Gln Asn Phe Asn Asn Val Ile Pro Glu 180 185 190 Gly Met Asn Leu Ser Phe Leu Ile Ala Leu Ile Ser Asn Asn Gly Asn 195 200 205 Tyr Thr Cys Val Val Thr Tyr Pro Glu Asn Gly Arg Thr Phe His Leu 210 215 220 Thr Arg Thr Leu Thr Val Lys Val Val Gly Ser Pro Lys Asn Ala Val 225 230 235 240 Pro Pro Val Ile His Ser Pro Asn Asp His Val Val Tyr Glu Lys Glu 245 250 255 Pro Gly Glu Glu Leu Leu Ile Pro Cys Thr Val Tyr Phe Ser Phe Leu 260 265 270 Met Asp Ser Arg Asn Glu Val Trp Trp Thr Ile Asp Gly Lys Lys Pro 275 280 285 Asp Asp Ile Thr Ile Asp Val Thr Ile Asn Glu Ser Ile Ser His Ser 290 295 300 Arg Thr Glu Asp Glu Thr Arg Thr Gln Ile Leu Ser Ile Lys Lys Val 305 310 315 320 Thr Ser Glu Asp Leu Lys Arg Ser Tyr Val Cys His Ala Arg Ser Ala 325 330 335 Lys Gly Glu Val Ala Lys Ala Ala Lys Val Lys Gln Lys Val Pro Ala 340 345 350 Pro Arg Tyr 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Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 565 570 575 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 580 585 590 Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 595 600 605 Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 610 615 620 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 625 630 635 640 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val 645 650 655 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 660 665 670 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 675 680 685 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 690 695 700 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ile Pro Pro 705 710 715 720 His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn 725 730 735 Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe 740 745 750 Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr 755 760 765 Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys 770 775 780 Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu 785 790 795 800 Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile 805 810 815 Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys 820 825 830 Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn 835 840 845 Thr Ser Asn Pro Asp 850

Claims (37)

  1. ⅰ) N-말단에서 C-말단 방향으로 제1 목적 단백질, 제1 링커 및 면역글로불린의 제1 Fc 부위를 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및,
    ⅱ) N-말단에서 C-말단 방향으로 제2 목적 단백질, 제2 링커 및 면역글로불린의 제2 Fc 부위를 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하고,
    상기 제1 목적 단백질과 제2 목적 단백질은 서로 상이한 단백질이며,
    상기 제1 링커 및 제2 링커는 각각 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, λ형 경쇄 불변부위(CLλ)의 변이체는 C-말단 세린이 결실된 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, κ형 경쇄 불변부위(CLκ)의 변이체, λ형 경쇄 불변부위(CLλ)의 변이체, 또는 이들 각각은 중쇄 불변부위 CH1과 디설파이드 결합을 형성하는 시스테인이 세린, 알라닌 또는 발린으로 치환된 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 폴리펩타이드의 C-말단 또는 제2 폴리펩타이드의 C-말단 중 하나 이상에 제3 목적 단백질을 추가로 포함하는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일특이성 또는 다중특이성을 갖는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 목적 단백질은 리간드, 수용체, 사이토카인, 효소 또는 펩티드인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 수용체는 사이토카인 수용체인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 사이토카인은 인터루킨-1(IL1), 인터루킨-2(IL2), 인터루킨-3(IL3), 인터루킨-4(IL4), 인터루킨-5(IL5), 인터루킨-6(IL6), 인터루킨-11(IL11), 인터루킨-13(IL13), 인터루킨-15(IL15), 인터루킨-18(IL18), 인터루킨-23(IL23), 인터루킨-31(IL31), 인터루킨-33(IL33), 인터루킨-35(IL35), 인터루킨-36(IL36), 백혈병 억제 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 감마-인터페론(IFN-γ), 흉선 기질상 림포포이에틴(TSLP), 형질전환 성장인자-베타(TGF-β), 혈관 내피세포 성장인자(VEGF) 및 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 목적 단백질과 제2목적 단백질 중 하나는 인터루킨-1 수용체 타입 1(IL1R1)이고, 다른 하나는 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAcP)인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  10. 제9항에 있어서, 제1 목적 단백질은 인터루킨-1 수용체 타입 1(IL1R1)이고 제1 링커는 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체이며, 제2 목적 단백질은 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAcP)이고 제2 링커는 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 인터루킨-1 수용체 타입 1(IL1R1) 및 인터루킨-1 수용체 부속 단백질(IL1RAcP)은 각각 이들의 세포외 영역(ectodomain)인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 목적 단백질로서 인터루킨-18 결합 단백질(IL18BP) 또는 타입 Ⅱ 형질전환 성장인자-베타 수용체(TGFβR Ⅱ)를 포함하는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 C-말단 중 하나에 인터루킨-18 결합 단백질(IL18BP)을 포함하는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  14. 제13항에 있어서, 제2 폴리펩타이드의 C-말단에 인터루킨-18 결합 단백질(IL18BP)을 포함하는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  15. 제12항에 있어서, 제1 폴리펩타이드의 C-말단과 제2 폴리펩타이드의 C-말단 둘 다에 타입 Ⅱ 형질전환 성장인자-베타 수용체(TGFβRⅡ)를 포함하는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Fc 부위 및 제2 Fc 부위는 헤테로이량체의 형성이 촉진되도록 CH3 영역이 변이된 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 제1 Fc 부위 및 제2 Fc 부위의 CH3 영역은 놉-인투-홀(knob-into-hole) 변이를 포함하는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 링커는 Fc 부위 내 힌지(hinge)의 N-말단에 결합되는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩타이드의 C-말단과 목적 단백질 사이에 제3 링커를 추가로 포함하는 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 제3 링커는 GS 링커인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린은 IgG인 것인, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질.
  22. 유효성분으로 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 헤테로이량체 Fc 융합 단백질, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는, 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 면역 관련 질환 또는 장애를 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 면역 관련 질환 또는 장애는 암, 자가면역 질환 또는 염증성 질환인 것인 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 치료제를 추가로 포함하는 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 치료제는 면역 관문 억제제(Immune Checkpoint Inhibitor)인 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 면역 관문 억제제는 PD1 저해제, PD-L1 저해제 및 CTLA4 저해제 중 하나 이상의 것인 조성물.
  28. κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 포함하는, 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하기 위한 조성물.
  29. 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하기 위한 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체의 용도.
  30. κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 목적 단백질과 면역글로불린 Fc 부위를 포함하는 헤테로이량체 Fc 융합 단백질에 있어서 목적 단백질과 Fc 부위 사이의 링커로 사용하는 방법.
  31. 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 제조 방법.
  32. 헤테로이량체 Fc 융합 단백질을 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 친화도에 기반하여 정제하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 정제 방법.
  33. 제32항에 있어서, 1) 면역글로불린 친화도 크로마토그래피를 수행하는 단계;
    2) κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 친화도 크로마토그래피를 수행하는 단계; 및
    3) λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 친화도 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  34. 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 FcRn 결합능을 증가시키는 방법.
  35. 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 반감기를 증가시키는 방법.
  36. 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 FcγR 결합능을 증가시키는 방법.
  37. 목적 단백질과 Fc 부위 사이에 링커로서 κ형 경쇄 불변부위(CLκ) 또는 그의 변이체, 및 λ형 경쇄 불변부위(CLλ) 또는 그의 변이체를 각각 도입하는 단계를 포함하는, 헤테로이량체 Fc 융합 단백질의 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)을 증가시키는 방법.
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