ES2960329T3 - Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes - Google Patents
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Abstract
La divulgación proporciona proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes que comprenden cuatro cadenas polipeptídicas que forman tres sitios de unión a antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana, en donde un primer par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen dominios variables duales que tienen una orientación cruzada y en el que un segundo par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen un único dominio variable. La divulgación también proporciona métodos para preparar proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes y usos de dichas proteínas de unión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La divulgación se refiere a proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana, en donde un primer par de polipéptidos que forman la proteína de unión posee dominios variables dobles que tienen una orientación cruzada y en donde un segundo par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen un único dominio variable. La divulgación también se refiere a vectores de expresión y células hospedadoras aisladas para la preparación de proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes y dichas proteínas de unión para sus usos en prevenir y/o tratar cáncer o una enfermedad o trastorno inflamatorio.
ANTECEDENTES
Los terapéuticos basados en anticuerpos monoclonales se han convertido en una importante vía para el desarrollo de nuevos fármacos. La tecnología de anticuerpos monoclonales ofrece direccionamiento específico, administración de señalización precisa y/o carga a una población de células específica, y proporciona un efecto biológico de larga duración a través de sus funciones de Fc. Esfuerzos en la manipulación de anticuerpos han permitido desarrollar anticuerpos biespecíficos que combinan las especificidades de dos anticuerpos monoclonales para diversas aplicaciones biológicas, lo que amplía el alcance del desarrollo de fármacos de anticuerpo. Los anticuerpos neutralizantes recientemente descubiertos con espectro y potencia mejorados pueden proporcionar más opciones para el desarrollo de bioterapéuticos para tratar enfermedades complejas, tales como cáncer, artritis y/o trastornos inflamatorios. El documento de patente WO 2014/116846 se refiere a proteínas de unión multiespecíficas y a métodos de uso de estas proteínas de unión multiespecíficas para modular la activación de células inmunitarias.
BREVE SUMARIO
En el presente documento se proporcionan proteínas de unión multiespecíficas (por ejemplo, anticuerpos) que forman tres sitios de unión al antígeno. Estas proteínas de unión se pueden unir específicamente a una, dos, o tres dianas de antígeno o proteínas diana.
En una realización, la divulgación proporciona una proteína de unión que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L2>-L<1>-V<L1>-L<2>-C<L>[I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H1>-L<3>-V<H2>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H3>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vl3-Cl [IV]
en donde:
V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L3>es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H3>es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
C<hi>es un dominio constante de la cadena pesada C<hi>de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
C<h>3 es un dominio constante de la cadena pesada C<h>3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y
L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son conectores de aminoácido;
y en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada.
En algunas realizaciones, la proteína de unión es triespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno diferentes. En algunas realizaciones, la proteína de unión es trivalente, pero biespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno, siendo dos de ellas idénticas. En algunas realizaciones, la proteína de unión de la presente divulgación es trivalente pero monoespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno, siendo todas ellas idénticas. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de inhibir la función de una o más proteínas diana. En algunas realizaciones, la proteína de unión es triespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno diferentes.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende uno, dos, o tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a proteínas diana seleccionadas de A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (también conocida como VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (también conocida como MCP-1), CCL3 (también conocida como MIP-1a), CCL4 (también conocida como MIP-1 b), CCL5 (también conocida como RANTES), CCL7 (también conocida como MCP-3), CCL8 (también conocida como mcp-2), CCL11 (también conocida como eotaxina), CCL15 (también conocida como MIP-1 d), CCL17 (también conocida como TARC), CCL19 (también conocida como MIP-3b), CCL20 (también conocida como MIP-3a), Cc L21 (también conocida como MIP-2), CCL24 (también conocida como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (también conocida como TECK), CCL26 (también conocida como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, c D20, CD23 (también conocida como FCER2 , un receptor para IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (también conocida como B7-1), CD86 (también conocida como B7-2), CD122, c D137 (también conocida como 41BB), Cd 137L, CD152 (también conocida como CTLA4), CD154 (también conocida como CD40L), CD160, CD272, CD273 (también conocida como PDL2), CD274 (también conocida como PDL1), CD275 (también conocida como B7H2), CD276 (también conocida como B7H3), CD278 (también conocida como ICOS), CD279 (también conocida como PD-1), CDH1 (también conocida como E-cadherina), quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (también conocida como M-CSF), CSF-2 (también conocida como GM-CSF), CSF-3 (también conocida como GCSF), CX3CL1 (también conocida como SCYD1), CXCL12 (también conocida como SDF1), CXCL13, CXCR3, d Ng R-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (también conocida como un receptor para IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (también conocida como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1 H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (también conocida como un receptor para IL33), STEAP2, cinasa Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (también conocida como un co-receptor para IL7Ra), TSl Pr , t W eAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM y XCR1 (también conocida como GPR5/CCXCR1). En algunas realizaciones, una o más de las dianas de antígeno anteriores son dianas de antígeno humanas. En algunas realizaciones, la proteína de unión de la presente divulgación es triespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno diferentes seleccionadas de la lista anterior. En algunas realizaciones, la proteína de unión de la presente divulgación es trivalente, pero biespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno seleccionadas de la lista anterior, siendo dos de ellas idénticas. En algunas realizaciones, la proteína de unión de la presente divulgación es trivalente pero monoespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno seleccionadas de la lista anterior, siendo todas ellas idénticas. En algunas realizaciones, la proteína de unión se une específicamente a tres proteínas diana que corresponden a dos proteínas diana en linfocitos T y a una diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, una de dichas proteínas diana en linfocitos T es CD3. En algunas realizaciones, una de dichas proteínas diana en linfocitos T es CD28. En algunas realizaciones, dicha diana de proteína tumoral es CD38. En algunas realizaciones, la proteína de unión se une específicamente a tres proteínas diana que corresponden a dos proteínas diana en linfocitos T y a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, cinasa Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, y XCR1.
En otra realización, la divulgación proporciona una proteína de unión que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L2>-L<1>-V<L1->L<2>-C<L>[I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H1>-L<3>-V<H2>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H3>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L3>-C<L>[IV]
en donde:
V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L3>es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H3>es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
Ch3 es un dominio constante de la cadena pesada Ch3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y
L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son conectores de aminoácido;
en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada;
en donde:
(a) cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 10, 14, 18, 22, 115;
(b) cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera de un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 43-59, 123-125;
(c) cada uno de Vl1 , Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165 y 167;
(d) cada uno de Vl i, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138-140 y 149; o
(e) cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera y/o una secuencia del dominio variable mostrada en las Tablas 2-5;
en donde:
(a) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 1,3, 9, 13, 17, 21, 114;
(b) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada de un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 25-42, 120-122;
(c) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164 y 166;
(d) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 25-42, 120-122 y 126-128; o
(e) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y/o una secuencia del dominio variable mostrada en las Tablas 2-5.
En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165 y 167; y cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164 y 166. En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138 140 y 149; y (d) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 25-42, 120-122 y 126-128.
En algunas realizaciones de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento, (a) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; (b) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; (c) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57; (d) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57; (e) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; V<l>2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59; (f) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; V<l>2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59; (g) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:138, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:139 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140; (h) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; VL1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:138, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:139 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140; (i) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:121 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:122; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125; o (j) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; V<l>2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:121 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:122; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125. En algunas realizaciones, (a) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45.
En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína de la superficie de linfocitos T y otro sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno, por ejemplo, una diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral seleccionada del grupo que consiste en CD19, CD20, CD38, Her2 y LAMP1. En algunas realizaciones, Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 humano, Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 humano, y V<h>3 y V<l>3 forman un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana de tumor humano. En algunas realizaciones, Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 humano, Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y Vh3 y Vl3 forman un tercer sitio de unión que se une específicamente a una proteína diana de tumor humano. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno se une específicamente a una proteína diana de tumor humano seleccionada del grupo que consiste en CD19, CD20, CD38, Her2 y LAMP1. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende: (a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; o (b) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende seis CDR, o un dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, mostrado en las Tablas 2-5. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende: (a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; o (b) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende seis CDR, o un dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, mostrado en las Tablas 2-5. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral comprende: (a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157; (b) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159; (c) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165; (d) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151; o (e) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral comprende seis CDR, o un dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, mostrado en las Tablas 2-5. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral comprende seis CDR, o un dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, de un dominio de unión anti-Her2, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD38 o anti-LAMP1 mostrado en las Tablas 2-5.
En otra realización, la divulgación proporciona una proteína de unión que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L2>-L<1>-V<L1->L<2>-C<L>[I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H1>-L<3>-V<H2>-L<4>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H3>-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L3>-C<L>[IV]
en donde:
V<L1>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L2>es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<L3>es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<H1>es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H2>es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<H3>es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
C<L>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
C<H1>es un dominio constante de la cadena pesada C<H1>de inmunoglobulina;
C<H2>es un dominio constante de la cadena pesada C<H2>de inmunoglobulina;
C<h>3 es un dominio constante de la cadena pesada C<h>3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y
L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada;
en donde:
(a) cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 61,63, 69, 71,74, 76, 82, 86, 88, 94;
(b) cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera de un dominio variable de al menos una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de SEQ ID NO: 61,63, 69, 71,74, 76, 82, 86, 88, 94;
(c) cada uno de Vl1 , Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:169, 171 y 173;
(d) cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 141-147, 178 y 179; o
(e) cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera y/o una secuencia del dominio variable mostrada en las Tablas 2-5;
en donde:
(a) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81,85, 87, 93;
(b) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada de un dominio variable de al menos una secuencia de aminoácidos expuesta en una cualquiera de en una cualquiera de SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81,85, 87, 93;
(c) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:168, 170, y 172;
(d) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 129-137;
(e) cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y/o una secuencia del dominio variable mostrada en las Tablas 2-5.
En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:169, 171 y 173; y cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:168, 170 y 172. En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 141-147, 178 y 179; y cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 129-137.
En algunas realizaciones de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento, (a) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; (b) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; (c) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; (d) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; (e) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; (f) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; (g) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; (h) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; (i) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; o (j) Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144. En algunas realizaciones, uno o más de Vh1, Vl1, Vh2, Vl2, Vh3 y Vl3 comprenden una, dos, o tres secuencias de CDR de un anticuerpo mostrado en las Tablas 2-5.
En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende tres sitios de unión al antígeno, donde uno, dos, o tres del (de los) sitio(s) de unión al antígeno se une(n) específicamente a una proteína diana de citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-13 y TNFa. En algunas realizaciones, (a) Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a TNFa humano, Vh2 y Vl2 forman un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL13 humana, y V<h>3 y V<l>3 forman un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL4 humana; (b) Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a TNFa humano, Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL4 humana, y Vh3 y Vl3 forman un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL13 humana; (c) Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL4 humana, Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a TNFa humano, y Vh3 y Vl3 forman un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL13 humana; (d) Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL4 humana, Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL13 humana, y Vh3 y Vl3 forman un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a TNFa humano; (e) Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL13 humana, Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL4 humana, y Vh3 y Vl3 forman un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a TNFa humano; o (f) Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL13 humana, Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a TNFa humano, y Vh3 y Vl3 forman un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL4 humana. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a TNFa humano comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:168 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:169. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL4 humana comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:170 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:171. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a IL13 humana comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:172 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:173.
En algunas realizaciones de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento, la segunda y/o tercera cadena de polipéptidos comprende además una región Fc unida a Ch1, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, al menos uno de L<1>, L<2>, L<3>o L<4>es independientemente 0 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, cada uno de L<1>, L<2>, L<3>o L<4>es independientemente al menos un aminoácido en longitud. En algunas realizaciones, la proteína de unión es triespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno diferentes. En algunas realizaciones, la proteína de unión es triespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno diferentes. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de inhibir la función de una o más proteínas diana.
En algunas realizaciones de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento, al menos uno de L<1>, L<2>, L<3>o L<4>es independientemente 0 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, cada uno de L<1>, L<2>, L<3>o L<4>es independientemente al menos un aminoácido en longitud. En algunas realizaciones, uno, dos, tres o los cuatro de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son entre 0 y 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, al menos dos de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son entre 1 y 15 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, (a) cada uno de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>es independientemente cero aminoácidos de longitud o comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), y GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148); o (b) cada uno de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>comprende independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GGGGSGGGGS (SEq ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), y GGSGSSGSGG (SEQ ID N<o>:148). En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), L<2>comprende la secuencia TKGPS (SEQ ID NO:106), L<3>comprende la secuencia S, y L<4>comprende la secuencia RT; L<1>comprende la secuencia GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L<2>comprende la secuencia GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L<3>es 0 aminoácidos de longitud y L<4>es 0 aminoácidos de longitud; L<1>comprende la secuencia GGSGSSGSGG (SeQ ID NO:148), L<2>comprende la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L<3>es 0 aminoácidos de longitud y L<4>es 0 aminoácidos de longitud; o L<1>comprende la secuencia GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), L<2>es 0 aminoácidos de longitud, L<3>comprende la secuencia GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105) y L<4>es 0 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento, a segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG 1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada C<h>2 y C<h>3 de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada C<h>2 y C<h>3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada C<H2>y C<H3>de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada C<H2>y C<H3>de inmunoglobulina, y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la primera y/o segunda regiones Fc comprenden sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S. En algunas realizaciones, el dominio Ch3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en donde el dominio C<h>3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V. En algunas realizaciones, el dominio C<h>3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V; y en donde el dominio C<h>3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W. En algunas realizaciones, los dominios Ch3 de una segunda y tercera cadenas de polipéptidos comprenden ambas sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada C<H2>y C<H3>de inmunoglobulina; en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; y en donde solo una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son H435R y Y436F. En algunas realizaciones, los dominios C<h>3 de una segunda y tercera cadenas de polipéptidos son dominios C<h>3 de IgG1 humana, y en donde solo uno de los dominios C<h>3 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son H435R y Y436F. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana; y en donde cada una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 228 y 409 de human IgG4 según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S228P y R409K. En algunas realizaciones, los dominios C<H3>de una segunda y tercera cadenas de polipéptidos son dominios C<H3>de IgG4 humana y en donde cada uno de los dominios C<H3>comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 228 y 409 de IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S228P y R409K. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a C<h>1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana; y en donde cada una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son F234A y L235A. En algunas realizaciones, los dominios C<H3>de una segunda y tercera cadenas de polipéptidos son dominios C<H3>de IgG4 humana, y en donde cada uno de los dominios Ch3 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son F234A y L235A. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a C<h>1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana; y en donde cada una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son L234A y L235A. En algunas realizaciones, los dominios Ch3 de una segunda y tercera cadenas de polipéptidos son dominios C<h>3 de IgG1 humana, y en donde cada uno de los dominios Ch3 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son L234A y L235A. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana.
En algunas realizaciones de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento, el dominio CL de la primera cadena de polipéptidos es un dominio CL kappa humano, y el dominio CL de la cuarta cadena de polipéptidos es un dominio CL lambda humano; o el dominio CL de la primera cadena de polipéptidos es un dominio CL lambda humano, y el dominio CL de la cuarta cadena de polipéptidos es un dominio CL kappa humano. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende un dominio CL lambda; en donde el dominio Ch3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; en donde el dominio C<h>3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, 407, 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R y Y436F; y en donde la cuarta cadena de polipéptidos comprende un dominio CL kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende un dominio CL lambda; en donde el dominio C<h>3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; en donde el dominio C<h>3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, 407, 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R y Y436F; y en donde la cuarta cadena de polipéptidos comprende un dominio CL kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende un dominio CL lambda; en donde el dominio Ch3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354, 366, 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C, T366W, H435R y Y436F; en donde el dominio C<h>3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V; y en donde la cuarta cadena de polipéptidos comprende un dominio CL kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende un dominio CL kappa; en donde el dominio Ch3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; en donde el dominio C<h>3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, 407, 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R y Y436F; y en donde la cuarta cadena de polipéptidos comprende un dominio Cl lambda. En algunas realizaciones, la segunda y/o tercera cadena de polipéptidos comprende una región Fc de IgG1 o IgG4 humana.
En otra realización, la divulgación proporciona una proteína de unión que comprende una primera cadena de polipéptidos, una segunda cadena de polipéptidos, una tercera cadena de polipéptidos y una cuarta cadena de polipéptidos en donde:
(a) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
(b) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2;
(c) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
(d) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14;
(e) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18
(f) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18;
(g) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;
(h) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22;
(i) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61;
(j) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61;
(k) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71;
(l) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74;
(m) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74;
(n) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:88; la segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86;
(o) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86;
(p) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74;
(q) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86;
(r) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74;
(s) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86;
(t) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115; o
(u) la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115.
En otra realización, la divulgación proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de unión o polipéptido de la misma según cualquiera de las realizaciones anteriores. En otra realización, la divulgación proporciona un vector de expresión que comprende la molécula del ácido nucleico según una de las realizaciones anteriores. En otra realización, la divulgación proporciona una célula hospedadora aislada que comprende la molécula del ácido nucleico según cualquiera de las realizaciones anteriores. En otra realización, la divulgación proporciona una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión según cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, la célula hospedadora aislada es una célula de mamífero o una célula de insecto. En una realización, la divulgación proporciona un sistema de vector que comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena de polipéptidos de una proteína de unión según cualquiera de las realizaciones anteriores. En algunas realizaciones, el sistema de vector comprende un primer vector que codifica la primera cadena de polipéptidos de la proteína de unión, un segundo vector que codifica la segunda cadena de polipéptidos de la proteína de unión, un tercer vector que codifica la tercera cadena de polipéptidos de la proteína de unión y un cuarto vector que codifica la cuarta cadena de polipéptidos de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema de vector comprende un primer vector que codifica la primera y segunda cadenas de polipéptidos de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la tercera y cuarta cadenas de polipéptidos de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el uno o más vectores son vectores de expresión. En una realización, la divulgación proporciona una célula hospedadora aislada que comprende el sistema de vector según cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización, la divulgación proporciona un método de producción de una proteína de unión, comprendiendo el método: a) cultivar una célula hospedadora según cualquiera de las realizaciones anteriores en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la proteína de unión; y b) aislar la proteína de unión de la célula hospedadora. En una realización, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión según cualquiera de las realizaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otra realización, la divulgación proporciona al menos una proteína de unión o composición farmacéutica según cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de cáncer en un paciente. En otra realización, la divulgación proporciona una proteína de unión o composición farmacéutica según cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en prevenir y/o tratar cáncer en un paciente. En otra realización, la divulgación proporciona una proteína de unión según cualquiera de las realizaciones anteriores para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar cáncer en un paciente. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína de la superficie de linfocitos T y otro sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral seleccionada del grupo que consiste en CD19, CD20, CD38, Her2 y LAMP1. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se coadministra con un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de inhibir la función de una o más proteínas diana seleccionadas del grupo que consiste en A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, cinasa Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, y XCR1.
En otra realización, la divulgación proporciona al menos una proteína de unión o composición farmacéutica según cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio en un paciente. En otra realización, la divulgación proporciona una proteína de unión o composición farmacéutica según cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso en prevenir y/o tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio en un paciente. En otra realización, la divulgación proporciona una proteína de unión según cualquiera de las realizaciones anteriores para la fabricación de un medicamento para prevenir y/o tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio en un paciente. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende tres sitios de unión al antígeno, cada uno de los cuales se une específicamente a una proteína diana de citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-13 y TNFa. En algunas realizaciones, dos de los tres sitios de unión se unen específicamente a una proteína diana de citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-13 y TNFa. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se coadministra con un agente antiinflamatorio. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de inhibir la función de una o más proteínas diana seleccionadas del grupo que consiste en A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, cinasa Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, y XCR1.
Estas y otras realizaciones de la invención se describen además por la descripción detallada que sigue.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
LasFIG. 1A-1Cmuestran representaciones esquemáticas de proteínas de unión triespecíficas que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a tres proteínas diana, en donde un primer par de polipéptidos posee dominios variables dobles que tienen una orientación cruzada (VH1-VH2 y VL2-VL1) que forman dos sitios de unión al antígeno, y en donde un segundo par de polipéptidos posee un único dominio variable (VH3 y VL3) que forma un único sitio de unión al antígeno. LaFIG. 1Amuestra una proteína de unión triespecífica que comprende una mutación "botón en ojal", donde el botón está en un segundo par de polipéptidos con un único dominio variable. LaFIG. 1Bmuestra una proteína de unión triespecífica que comprende una mutación "botón en ojal", donde el botón está en el primer par de polipéptidos que tienen la orientación cruzada. LaFIG. 1Cmuestra la orientación de dominios variables en las cadenas de polipéptidos, y la orientación botón/ojal para las proteínas de unión mostradas en las Tablas 1-3. "Cadena pesada A" (por ejemplo, una tercera cadena de polipéptidos de la presente divulgación) indica el dominio variable de cadena pesada A. "Cadena ligera A" (por ejemplo, una cuarta cadena de polipéptidos de la presente divulgación) indica el dominio variable de cadena ligera A. "Cadena pesada B" (por ejemplo, una segunda cadena de polipéptidos de la presente divulgación) indica el dominio variable 1 y el dominio variable 2 de la cadena pesada B. "Cadena ligera B" (por ejemplo, una primera cadena de polipéptidos de la presente divulgación) indica el dominio variable 1 y el dominio variable 2 de la cadena ligera B.
LaFIG.2muestra los resultados de un ensayo de ELISA que determina la unión de un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 (proteína de unión 1), o anticuerpo de control de isotipo, a CD3, CD28 y Her2 humano. Los anticuerpos unidos se detectaron usando un anticuerpo secundario anti-Fab conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP).
LasFIG. 3A-3Cmuestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células de cáncer de mama Her2<+>usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 (denominado en el presente documento "proteína de unión 1"), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpo IgG 1 anti-Her2, o un anticuerpo de control (lgG1 humana), usando CMSP humanas en E:T=10. LaFIG. 3Amuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo triespecífico de células ZR-75-1. LaFIG. 3Bmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo triespecífico de células AU565. LaFIG. 3Cmuestra los resultados de análisis de FACS que determinan la expresión de la superficie celular de los marcadores indicados en células ZR-75-1 y AU565.
LasFIG. 4 y 5muestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células de cáncer de mama Her2<+>usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 (proteína de unión 1), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpo IgG1 anti-Her2 o un anticuerpo de control (IgG1 humana). LaFIG. 4muestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células ZR-75-1 usando células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas de KP45926 de donante en E:T=10. LaFIG. 5muestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células AU565 usando CMSP humanas de KP45944 de donante en E:T=10. LasFIG. 4 y 5confirman resultados de destrucción celular similares como se muestra en las FIG. 3A-3C usando CMSP de un donante diferente
LasFIG.6A y 6Bmuestran la activación (CD69<+>) y proliferación de linfocitos T humanos tratados con proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3 IgG4 (HER2/CD28<sup>x CD3<m id>; denominada en el presente documento "proteína de unión 1"), proteína de unión triespecífica IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 que carece del dominio de unión anti-CD28 (HER2/ACD28<sup>x CD3<mid>), proteína de unión triespecífica IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 que carece del dominio de unión anti-CD3 (HER2/CD28<sup>xACD3<mid>), proteína de unión triespecífica IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 que carece de ambos dominios de unión anti-CD28 y anti-CD3 (HER2/A(CD28<sup>XACD3<mid>)), anticuerpo monoclonal anti-CD3 de control o anticuerpo IgG4 de control. LaFIG. 6Amuestra la activación (CD69<+>) de linfocitos T CD4<+>humanos de tres donantes. LaFIG. 6Bmuestra la activación (CD69<+>) de linfocitos T CD8<+>humanos de tres donantes. CD28<sup>: anticuerpo superagonista anti-CD28. CD3<m id>: anticuerpo anti-CD3.
LasFIG. 7A-Cmuestran la activación de la vía de IL-2, NF<k>B y factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT) por señalización anti-CD3 y anti-CD28, como se mide por ensayo de luciferasa usando linfocitos T de Jurkat humanos con una construcción de promotor de IL-2-luciferasa (FIG. 7A), una construcción de promotor de NFKB-luciferasa (FIG. 7B) o una construcción de promotor de NFAT-luciferasa (FIG. 7C). Los anticuerpos probados fueron los descritos anteriormente en referencia a lasFIG. 6A-6D.
LaFIG.8muestra los resultados de un ensayo de ELISA que determina la unión en un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD19 x CD28 x CD3 (denominado en el presente documento "proteína de unión 3"), o anticuerpo de control de isotipo, a CD3, CD28 y CD19. Los anticuerpos unidos se detectaron usando un anticuerpo secundario anti-Fab conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP).
LasFIG. 9A-9Nmuestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células de linfoma GCB humano CD19<+>usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD19 x CD28 x CD3 (denominado en el presente documento "proteína de unión 3"), o los controles indicados, usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 9Amuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células OCI-LY19. LaFIG. 9Bmuestra los resultados de análisis de FACS que determina la expresión de la superficie celular de los marcadores indicados en células OCI-LY19. LaFIG. 9Cmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células OCI-LY19 usando CMSP de KP48572 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Dmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células OCI-LY19 usando CMSP de KP48573 de donante a E:T=10. LaFIG. 9Emuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células KARPASS-422 de linfoma humano usando CMSP de KP48572 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Fmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células KARPASS-422 usando CMSP de KP48573 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Gmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células MeC1 de leucemia crónica de linfocitos B humana usando CMSP de donante KP48572 en E:T=10. LaFIG.
9Hmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células RPMI8226 de mieloma múltiple humano usando CMSP de KP48775 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Imuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células Raji de linfoma de Burkitt humano usando CMSP de KP48572 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Jmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células HBL1 de linfoma difuso de linfocitos B grandes humano usando CMSP de KP48775 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Kmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células SUDHL8 de linfoma de células grandes usando CMSP de KP48572 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Lmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células SUDHL8 usando CMSP de KP48573 de donante en E:T=10. LaFIG. 9Mmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células ARH77 de linfoma de linfocitos B humano usando CMSP de donante KP48775 en E:T=10. LaFIG. 9Nmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células OCI-Ly3 usando CMSP de KP48775 de donante en E:T=10.
LaFIG. 10muestra los resultados de un ensayo de ELISA que determina la unión de un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5), o anticuerpo de control de isotipo, a CD3, CD28 y CD38. Los anticuerpos unidos se detectaron usando un anticuerpo secundario anti-Fab conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP).
LasFIG. 11A-11Dmuestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células cancerosas de mieloma múltiple humano CD38+ usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpo IgG 1 anti-CD38 o un anticuerpo de control (IgG1 humana). LaFIG. 11Amuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células MOLP-8 usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 11Bmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células RPMI-8226 usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 11Cmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células KMS-12-BM usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 11Dmuestra los resultados del análisis de FACS que determina la expresión de la superficie celular de los marcadores indicados en células MOLP-8, RPMI-8226 y KMS-12-BM.
LasFIG. 12A-12Dmuestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células cancerosas de mieloma múltiple humano CD38+ usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpo IgG 1 anti-CD38 o un anticuerpo de control (IgG1 humana), usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 12Amuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células NCI-H929. LaFIG. 12Bmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células MM.1S. LaFIG. 12Cmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células MM.1 R. LaFIG. 12Dmuestra los resultados de análisis de FACS que determinan la expresión de la superficie celular de los marcadores indicados en células NCI-H929, MM.1S y MM.1 R.
LasFIG. 13A-13Dmuestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células cancerosas de mieloma múltiple humano CD38+ usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpo IgG 1 anti-CD38 o un anticuerpo de control (IgG1 humana), usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 13Amuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células OPM-2. LaFIG. 13Bmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células KMS-26. LaFIG. 13Cmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células U266. LaFIG. 13Dmuestra los resultados de análisis de FACS que determinan la expresión de la superficie celular de los marcadores indicados en células OPM-2, KMS-26 y U226.
LasFIG. 14A-14Cmuestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células cancerosas de linfoma humano CD38+ usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpo IgG 1 anti-CD38 o un anticuerpo de control (IgG1 humana), usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 14Amuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células SUDHL-8. LaFIG. 14Bmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células OCI-LY19. LaFIG. 14Cmuestra los resultados de análisis de FACS que determinan la expresión de la superficie celular de los marcadores indicados en células SUDHL-8 y OCI-LY19.
LasFIG. 15A-15Dmuestran los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células cancerosas de ALL CD38+ usando un anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpo IgG1 anti-CD38 o un anticuerpo de control (IgG 1 humana), usando CMSP humanas como células efectoras en E:T=10. LaFIG. 15Amuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células KOPN-8. LaFIG. 15Bmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células HAL-1. LaFIG. 15Cmuestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células CCRF-SB. LaFIG. 15Dmuestra los resultados de análisis de FACS que determinan la expresión de la superficie celular de los marcadores indicados en células KOPN-8, HAL-1 y CCRF-SB.
LaFIG. 16muestra los resultados de la destrucción específica mediada por anticuerpo de células cancerosas de mieloma CD38+ usando anticuerpos triespecíficos IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (denominados en el presente documento "proteína de unión 5" y "proteína de unión 6", dependiendo del dominio de unión anti-CD28 específico usado), un anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD28 x CD3 (huCD28 x CD3), un anticuerpp IgG1 anti-CD38, un anticuerpo IgG 1 anti-CD38 de control o un anticuerpo de control (IgG1 humana) usando CMSP de PK45926 de donante en E:T=10.
LasFIG. 17A y 17Bmuestran la activación de la vía de IL-2, NF<k>B y factor nuclear de linfocitos T activados (NFAT) por señalización anti-CD3 y anti-CD28, como se mide por ensayo de luciferasa usando linfocitos T Jurkat humanos con una construcción de promotor de IL-2-luciferasa (FIG. 17A)o una construcción de promotor de NFAT-luciferasa (FIG. 17B). Los anticuerpos probados fueron anticuerpo IgG4 triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5, marcada como "Ab-Tri"), anticuerpo IgG4 triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 que carece del dominio de unión a CD28 (marcado como "Ab-Tri (ACD28)), anticuerpo IgG4 triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 que carece del dominio de unión a CD3 (marcado como "Ab-Tri (ACD3)) y anticuerpo IgG4 triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 que carece de los dominios de unión a CD3 y CD28 (marcado como "Ab-Tri (ACD28 x ACD3)). Se realizaron por duplicado ensayos de luciferasa para cada uno de los Ab-Tri indicados.
LasFIG. 18A-18Emuestran los resultados de un estudio de toxicidad de aumento de dosis usando el anticuerpo triespecífico IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 (denominado en el presente documento "proteína de unión 1") en primates no humanos (aumento de la dosis desde 0,1,0,5, 2,5, 5, 10, hasta 100 pg/kg; animales marcados como "409" y "410"). LaFIG. 18Amuestra los resultados del porcentaje de linfocitos T CD4+ circulantes en cada animal, 6 horas después de administrar el anticuerpo triespecífico anti-Her2 x CD28 x CD3. LaFIG. 18Bmuestra los resultados del porcentaje de linfocitos T CD8+ circulantes en cada animal, 6 horas después de administrar el anticuerpo triespecífico anti-Her2 x CD28 x CD3. LaFIG. 18Cmuestra los resultados de la activación (CD69+) de linfocitos T CD4+ circulantes 6 horas después de la administración. LaFIG. 18Dmuestra los resultados de la activación (CD69+) de linfocitos T CD8+ circulantes 6 horas después de la administración. LaFIG. 18Emuestra la liberación de citocina inflamatoria observada 6 horas después de administrar el anticuerpo triespecífico anti-Her2 x CD28 x CD3 en cada dosis.
LasFIG. 19A-Bmuestran la actividad antitumoralin vivodel anticuerpo triespecífico IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 (denominado en el presente documento "proteína de unión 1") en el modelo de ratón NSG humanizado de células de sangre del cordón umbilical CD34+ implantadas con células BT474. LaFIG. 19Amuestra el cambio en el peso corporal de ratones tratados con las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3 o control de PBS. LaFIG. 19Bmuestra el cambio en el volumen del tumor en ratones tratados con las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3 o control de PBS.
LasFIG.20A-20Hmuestran la actividad antitumoralin vivodel anticuerpo triespecífico IgG4 anti-Her2 x CD28 x CD3 (denominado en el presente documento "proteína de unión 1") en el modelo de ratón NSG humanizado con CMSP humanas implantado con células BT474. LaFIG. 20Amuestra el efecto de administrar las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3, las concentraciones indicadas de Herceptin, o control de vehículo, sobre el peso corporal de los ratones. LaFIG. 20Bmuestra la actividad antitumoral dependiente de la dosis de la proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3, Herceptin o controles indicados, como en ratones individuales. LaFIG.20Cmuestra el volumen promedio del tumor en los ratones después de administración de las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3 o control de PBS. LaFIG.20Dmuestra el volumen promedio del tumor en los ratones después de administración de las concentraciones indicadas de Herceptin o control de PBS. LaFIG. 20Emuestra gráficos de barras del volumen promedio del tumor en el día 34 en los ratones después de la administración de las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3, las concentraciones indicadas de Herceptin, o control de PBS. LaFIG. 20Fmuestra el peso promedio del tumor en el día 34 en los ratones después de administración de las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-Her2 x CD28 x CD3, las concentraciones indicadas de Herceptin, o control de PBS. LaFIG. 20Gmuestra las células CD45+, CD3+, CD4+, CD8+ humanas en la sangre de los ratones al final del estudio. LaFIG. 20Hmuestra las células CD45+, CD3+, CD4+, CD8+ humanas en los bazos de los ratones al final del estudio.
LasFIG.21A-Fmuestran los resultados de un estudio de toxicidad de aumento de dosis usando el anticuerpo triespecífico IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5) en primates no humanos (aumento de dosis desde 0,1,0,5, 2,5, 5, 10 hasta 100 pg/kg). LaFIG. 21Amuestra la activación de linfocitos T (CD69+) (gráfico de líneas) y la proliferación (gráfico de barras) de linfocitos T CD4+ circulantes después de la administración del anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD3. LaFIG. 21Bmuestra la activación de linfocitos T (CD69+) (gráfico de líneas) y la proliferación (gráfico de barras) de linfocitos T CD8+ circulantes después de la administración del anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD3. LaFIG. 21Cmuestra la liberación de IL6 en animales que recibieron el anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD36 horas después de cada administración por animal individual. LaFIG. 21Dmuestra la liberación de IL10 en animales que recibieron el anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD3 6 horas después de cada administración por animal individual. LaFIG. 21Emuestra la liberación de TNFa en animales que recibieron el anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD3. LaFIG. 21Fmuestra la liberación de IFN<y>en animales que recibieron el anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD36 horas después de cada administración por animal individual.
LasFIG. 22A-22Cmuestran la actividad antitumoralin vivodel anticuerpo triespecífico lgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5) en el modelo de ratón NSG humanizado con glóbulos sanguíneos del cordón umbilical CD34+ implantado con células RPMl-8226 de mieloma múltiple transducidas con CD38 y PD-L1. Como estudio piloto, este experimento determinó el intervalo de dosis de trabajo para la proteína de unión 5. LaFIG. 22Amuestra la curva de crecimiento tumoralin vivoen grupos de las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-CD38 x CD28 x CD3 o controles. LaFIG. 22Bmuestra linfocitos T CD8+ humanos infiltrantes de tumores en ratones administrados con la proteína de unión triespecífica anti-CD38 x CD28 x CD3 o los controles indicados. LaFIG. 22Cmuestra linfocitos T CD4+ humanos infiltrantes de tumores en ratones administrados con la proteína de unión triespecífica anti-CD38 x CD28 x CD3 o los controles indicados.
LasFIG. 23A-23Dmuestran la actividadin vivodel anticuerpo triespecífico lgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5) en el modelo de ratón NSG humanizado con glóbulos sanguíneos del cordón umbilical CD34+ implantado con células RPMl-8226 transducidas con CD38 y PD-L1. LaFIG. 23Amuestra el cambio en el peso corporal de ratones tratados con las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-CD38 x CD28 x CD3 o control de PBS. LaFIG. 23Bmuestra el cambio en volumen del tumor en ratones tratados con las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-CD38 x CD28 x CD3 o control de PBS. LaFIG. 23Cmuestra los volúmenes de tumor en cada grupo en el día 19. Los volúmenes de tumor en todos los grupos tratados mostraron una reducción marcada, que es estadísticamente diferente del grupo de control de PBS. LaFIG. 23Dmuestra la concentración en suero de citocinas inflamatorias IFN-g, TNF e lL-2 en ratones cuatro horas después de la primera dosis de las concentraciones indicadas de la proteína de unión triespecífica anti-CD38 x CD28 x CD3 o control de PBS.
LasFIG. 24 y 25muestran la activaciónin vivode linfocitos T en el modelo de ratón NSG humanizado con glóbulos sanguíneos del cordón umbilical CD34+ administrando un anticuerpo triespecífico lgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5; triángulos), un anticuerpo biespecífico lgG4 anti-CD28 x CD3 (cuadrados) o un anticuerpo lgG4 anti-CD28 (círculos) determinando el aumento en el porcentaje de linfocitos T CD69+. LaFIG. 24muestra la activaciónin vivode linfocitos T CD4+. LaFIG. 25muestra la activaciónin vivode linfocitos T CD8+.
LasFIG. 26A-26Cmuestran la activaciónin vivode linfocitos T en el modelo de ratón NSG humanizado con glóbulos sanguíneos del cordón umbilical CD34+ administrando un anticuerpo triespecífico lgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5; triángulos), un anticuerpo biespecífico lgG4 anti-CD28 x CD3 (cuadrados) o un anti-CD28 lgG4 anticuerpo (círculos) determinando los niveles en suero de citocinas inflamatorias. LaFIG. 26Amuestra los niveles en suero de lL-2. LaFIG. 26Bmuestra los niveles en suero de TNF. LaFIG. 26Cmuestra los niveles en suero de IFN-<y>.
LasFIG. 27A y 27Bmuestran la purificación de las proteínas indicadas por cromatografía de exclusión por tamaño. LaFIG. 27Amuestra la purificación de las proteínas de unión 9-15 por cromatografía de exclusión por tamaño. LaFIG. 27Bmuestra la purificación de las proteínas de unión 16-19 por cromatografía de exclusión por tamaño.
LaFIG. 28Arepresenta la proteína de unión triespecífica usada en experimentos para optimizar un esquema de purificación y configuración de características de proteínas de unión opcionales (por ejemplo, cadenas ligeras kappa/lambda, mutaciones botón/ojal y mutaciones H435R/Y436F).
LaFIG. 28Bmuestra cada una de las configuraciones probadas.
LaFIG.29muestra cromatogramas representativos de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) analítica, que demuestra que proteínas de unión triespecíficas fueron distinguibles de especies emparejadas erróneamente.
LasFIG.30A y 30Bmuestran la purificación satisfactoria de una proteína de unión con cadena ligera lambda para el brazo CODV, cadena ligera kappa para el brazo Fab, mutaciones de botón en el brazo de CODV, mutaciones de ojal en el brazo Fab y mutaciones RF en el brazo Fab por proteína A, seguido por etapas de purificación KappaSelect (GE Healthcare). La purificación satisfactoria de proteína de unión de especies emparejadas erróneamente se demostró por cromatografía de interacción hidrófoba (HIC;FIG. 30A) y SDS-PAGE(FIG. 30B).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
La divulgación proporciona proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes que comprenden cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana, en donde un primer par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen dominios variables dobles que tienen una orientación cruzada y en donde un segundo par de polipéptidos que forman la proteína de unión poseen un único dominio variable.
Definiciones generales
Como se utiliza según la presente divulgación, se debe entender que los siguientes términos, a menos que se indique lo contrario, tienen los siguientes significados. A menos que se requiera de otro modo por el contexto, términos en singular deben incluir pluralidades y términos en plural deben incluir el singular.
El término "polinucleótido", como se usa en el presente documento, se refiere a polímeros de ácido nucleico monocatenarios o bicatenarios de al menos 10 nucleótidos de longitud. En ciertas realizaciones, los nucleótidos que comprenden el polinucleótido puede ser ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. Dichas modificaciones incluyen modificaciones de bases, tales como bromuridina, modificaciones de ribosa, tales como arabinósido y 2',3'-didesoxirribosa, y modificaciones de enlaces internucleotídicos, tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato y fosforoam idato. El término "polinucleótido" incluye específicamente formas monocatenarias y bicatenarias de ADN.
Un "polinucleótido aislado" es un polinucleótido de origen genómico, ADNc o sintético o alguna combinación de los mismos, que: (1) no se asocia a todo o una porción de un polinucleótido en el que el polinucleótido aislado se encuentra en la naturaleza, (2) se une a polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia mayor.
Un "polipéptido aislado" es uno que: (1) está libre de al menos algunos otros polipéptidos con los que se encontraría normalmente, (2) está esencialmente libre de otros polipéptidos de la misma fuente, por ejemplo, de la misma especie, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, (4) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de polinucleótidos, lípidos, hidratos de carbono, u otros materiales con los que está asociado en la naturaleza, (5) no está asociado (por interacción covalente o no covalente) con porciones de un polipéptido con las que el "polipéptido aislado" está asociado en la naturaleza, (6) está asociado operativamente (por interacción covalente o no covalente) con un polipéptido con el que no está asociado en la naturaleza, o (7) no ocurre en la naturaleza. Dicho polipéptido aislado se puede codificar por ADN genómico, ADNc, ARNm u otro ARN, de origen sintético, o cualquier combinación de los mismos. Preferentemente, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de polipéptidos u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirían con su uso (terapéutico, diagnóstico, profiláctico, de investigación o de otro modo).
Los anticuerpos naturales comprenden normalmente un tetrámero. Cada dicho tetrámero está compuesto normalmente por dos pares de cadenas de polipéptidos idénticas, teniendo cada par una cadena "ligera" de longitud completa (que tiene normalmente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" de longitud completa (que tiene normalmente un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Los términos "cadena pesada" y "cadena ligera", como se usan en el presente documento, se refieren a cualquier polipéptido de inmunoglobulina que tiene secuencia del dominio variable suficiente para conferir especificidad por un antígeno diana. La porción aminoterminal de cada cadena ligera y pesada incluye normalmente un dominio variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos que normalmente es responsable del reconocimiento del antígeno. La porción carboxiterminal de cada cadena define normalmente un dominio constante responsable de la función efectora. Por lo tanto, en un anticuerpo natural, un polipéptido de inmunoglobulina de cadena pesada de longitud completa incluye un dominio variable (Vh) y tres dominios constantes (Ch1, Ch2 y Cm), en donde el dominio Vh está en el extremo amino del polipéptido y el dominio C<h>3 está en el extremo carboxilo, y un polipéptido de inmunoglobulina de cadena ligera de longitud completa incluye un dominio variable (Vl) y un dominio constante (Cl), en donde el dominio Vl está en el extremo amino del polipéptido y el dominio CL está en el extremo carboxilo.
Las cadenas ligeras humanas se clasifican normalmente como cadenas ligeras kappa y lambda, y las cadenas pesadas humanas se clasifican normalmente como mu, delta, gamma, alfa o épsilon, y definen el isotipo del anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. IgG tiene varias subclases, incluidas, sin carácter limitante, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. IgM tiene varias subclases que incluyen, sin carácter limitante, IgM1 e IgM2. IgA esta igualmente subdividida en subclases que incluyen, sin carácter limitante, IgA1 e IgA2. Dentro de las cadenas ligeras y pesadas de longitud completa, los dominios variables y constantes se unen normalmente por una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 más aminoácidos. Véase, por ejemplo, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul, W., ed., Raven Press, 2.a ed., 1989). Las regiones variables de cada par cadena ligera/pesada forman normalmente un sitio de unión al antígeno. Los dominios variables de anticuerpos que existen de forma natural presentan normalmente la misma estructura general de regiones estructurales (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también llamadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas normalmente por las regiones de armazón, lo que puede permitir la unión a un epítopo específico. De extremo amino a extremo carboxilo, los dominios variables tanto de la cadena ligera como pesada comprenden normalmente los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4.
El término "conjunto de CDR" se refiere a un grupo de tres CDR que ocurren en una única región variable capaz de unirse al antígeno. Los límites exactos de estas CDR se han definido de forma diferente según sistemas diferentes. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de residuos inequívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites precisos de residuos que definen las tres CDR. Estas CDR se pueden denominar CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) descubrieron que ciertas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptaban conformaciones de esqueleto de péptido casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad al nivel de secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se designaron L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 donde "L" y "H" designa las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones se pueden denominar CDR de Chothia, que tienen límites que se solapan con las CDR de Kabat. Otros límites que definen las CDR que se solapan con las c Dr de Kabat se han descrito por Padlan, 1995, FASEB J. 9: 133-39; MacCallum, 1996, J. Mol. Biol. 262(5): 732-45; y Lefranc, 2003, Dev. Comp. Immunol. 27: 55-77. Todavía otras definiciones de límites de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas del presente documento sistemas, pero, sin embargo, se solaparán con las CDR de Kabat, aunque pueden ser acortadas o alargadas en vista de la predicción o hallazgos experimentales de que residuos o grupos de residuos particular o incluso CDR completas no afectan significativamente la unión al antígeno. Los métodos usados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas según cualquiera de estos sistemas, aunque ciertas realizaciones usan CDR definidas por Kabat o Chothia. La identificación de CDR predichas usando la secuencia de aminoácidos se conoce bien en el campo, tal como en Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains", en Antibody Engineering, Vol. 2. Kontermann R., Dübel S., eds. Springer-Verlag, Berlin, p. 33-51 (2010). La secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera también se puede inspeccionar para identificar las secuencias de las CDR por otros métodos convencionales, por ejemplo, por comparación con secuencias de aminoácidos conocidas de otras regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras para determinar las regiones de hipervariabilidad de secuencia. Las secuencias numeradas se pueden alinear a simple vista o empleando un programa de alineación, tal como uno del paquete de programas CLUSTAL, como se describe en Thompson, 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-80. Se usan convencionalmente modelos moleculares para delinear correctamente región estructural y regiones CDR y así corregir las asignaciones basadas en secuencia.
El término "Fc", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que comprende la secuencia de un fragmento que no se une al antígeno resultante de la digestión de un anticuerpo o producido por otros medios, tanto en forma monomérica como multimérica, y puede contener la región bisagra. La fuente de inmunoglobulina original de Fc nativo es preferentemente de origen humano y puede ser cualquiera de las inmunoglobulinas, aunque se prefieren IgG1 e IgG2. Las moléculas de Fc están constituidos por polipéptidos monoméricos que pueden unirse en formas diméricas o multiméricas por asociación covalente (es decir, enlaces disulfuro) y no covalente. El número de enlaces disulfuro intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas oscila desde 1 hasta 4 dependiendo de la clase (por ejemplo, IgG, IgA e IgE) o subclase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1 e IgGA2). Un ejemplo de un Fc es un dímero unido por disulfuro resultante de la digestión con papaína de una IgG. El término "Fc nativo", como se usa en el presente documento, es genérico para las formas monoméricas, diméricas y multiméricas.
Un fragmento F(ab) incluye normalmente una cadena ligera y los dominios Vh y Ch1 de una cadena pesada, en donde la porción de cadena pesada Vh-Ch1 del fragmento F(ab) no puede formar un enlace disulfuro con otro polipéptido de cadena pesada. Como se usa en el presente documento, un fragmento F(ab) también puede incluir una cadena ligera que contiene dos dominios variables separados por un conector de aminoácido y una cadena pesada que contiene dos dominios variables separados por un conector de aminoácido y un dominio Ch1.
Un fragmento F(ab') incluye normalmente una cadena ligera y una porción de una cadena pesada que contiene más de la región constante (entre los dominios Ch1 y Ch2), de manera que se puede formar un enlace disulfuro intercatenario entre dos cadenas pesadas para formar una molécula F(ab')2.
El término "proteína de unión", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que no existen de forma natural (o recombinante o manipulada) que se une específicamente a al menos un antígeno diana, y que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman al menos tres sitios de unión al antígeno, en donde una primera cadena de polipéptidos tiene una estructura representada por la fórmula:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos tiene una estructura representada por la fórmula:
VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II]
y una tercera cadena de polipéptidos tiene una estructura representada por la fórmula:
VH3- Chi [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos tiene una estructura representada por la fórmula:
Vl3- Cl [IV]
en donde:
Vl1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<l>3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
VH2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de la cadena pesada Ch1 de inmunoglobulina; y
L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
y en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligeracadena pesada.
Una molécula "recombinante" es una que ha sido preparada, expresada, creada o aislada por medios recombinantes. Una realización de la divulgación proporciona proteínas de unión que tienen especificidad biológica e inmunológicas por entre uno y tres antígenos diana. Otra realización de la divulgación proporciona moléculas del ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican cadenas de polipéptidos que forman dichas proteínas de unión. Otra realización de la divulgación proporciona vectores de expresión que comprenden moléculas del ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican cadenas de polipéptidos que forman dichas proteínas de unión. Otra realización más de la divulgación proporciona células hospedadoras que expresan dichas proteínas de unión (es decir, que comprenden moléculas del ácido nucleico o vectores que codifican cadenas de polipéptidos que forman dichas proteínas de unión).
El término "capacidad de intercambio", como se usa en el presente documento, se refiere a la intercambiabilidad de dominios variables dentro del formato de la proteína de unión y con retención de plegamiento y afinidad de unión final. "Capacidad de intercambio completa" se refiere a la capacidad de cambiar orden de tanto los dominios Vh1 como Vh2 y, por lo tanto, el orden de los dominios Vl1 y Vl2, en la cadena de polipéptidos de la fórmula I o la cadena de polipéptidos de la fórmula II (es decir, para invertir el orden), mientras se mantiene la funcionalidad completa de la proteína de unión como se demuestra por la retención de afinidad de unión. Además, se debe observar que las designaciones V<h>y V<l>se refieren solo a la localización de dominios en una cadena de proteína particular en el formato final. Por ejemplo, Vh1 y Vh2 podrían derivar de dominios Vl1 y Vl2 en anticuerpos parentales y dispuestos en las posiciones Vh1 y Vh2 en la proteína de unión. Asimismo, Vl1 y Vl2 podrían derivar de dominios Vh1 y Vh2 en anticuerpos parentales y dispuestos en las posiciones Vh1 y Vh2 en la proteína de unión. Por lo tanto, las designaciones Vh y Vl se refieren a la presente localización y no a la localización original en un anticuerpo parental. Los dominios V<h>y V<l>son, por lo tanto, "intercambiables".
El término "antígeno" o "antígeno diana" o "diana de antígeno", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula o una porción de una molécula que es capaz de ser unida por una proteína de unión, y adicionalmente es capaz de ser usada en un animal para producir anticuerpos capaces de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno diana puede tener uno o más epítopos. Con respecto a cada antígeno diana reconocido por una proteína de unión, la proteína de unión es capaz de competir con un anticuerpo intacto que reconoce el antígeno diana.
El término "Her2" se refiere a receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano que es un miembro de la familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico.
"CD3" es el polipéptido del factor 3 del cúmulo de diferenciación y es una proteína de la superficie de linfocitos T que normalmente es parte del complejo del receptor de linfocitos T (TCR).
"CD28" es el polipéptido del factor 28 del cúmulo de diferenciación y es una proteína de la superficie de linfocitos T que proporciona señales coestimulantes para la activación y supervivencia de linfocitos T.
"CD19" es el polipéptido del cúmulo de diferenciación 19 y se localiza en linfocitos B.
"CD20" es el polipéptido del cúmulo de diferenciación 20 y es una fosfoproteína glucosilada activada expresada en la superficie de linfocitos B.
"CD38" es el polipéptido del cúmulo de diferenciación 38 y es una glucoproteína encontrada en la superficie de muchas células inmunitarias.
"LAMP1" es la proteína 1 de la membrana asociada a lisosomas.
"IL-4" es interleucina 4 y es una citocina que induce la diferenciación de linfocitos T cooperadores intactos.
"IL-13" es interleucina 13 y es una citocina secretada por muchos tipos de células, tales como linfocitos T.
"TNFa" es el factor de necrosis tumoral alfa y es una citocina implicada en la inflamación sistémica.
El término "acoplador de linfocito T" se refiere a proteínas de unión dirigidas a un sistema inmunitario del hospedador, más específicamente la actividad citotóxica de linfocitos T, así como dirigida a una diana de proteína tumoral.
El término "proteína de unión monoespecífica" se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a una diana de antígeno.
El término "proteína de unión monovalente" se refiere a una proteína de unión que tiene un sitio de unión al antígeno. El término "proteína de unión biespecífica" se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a dos dianas de antígeno diferentes.
El término "proteína de unión bivalente" se refiere a una proteína de unión que tiene dos sitios de unión.
El término "proteína de unión triespecífica" se refiere a una proteína de unión que se une específicamente a tres dianas de antígeno diferentes.
El término "proteína de unión trivalente" se refiere a una proteína de unión que tiene tres sitios de unión. En realizaciones particulares, la proteína de unión trivalente puede unirse a una diana de antígeno. En otras realizaciones, la proteína de unión trivalente puede unirse a dos dianas de antígeno. En otras realizaciones, la proteína de unión trivalente puede unirse a tres dianas de antígeno.
Una proteína de unión "aislada" es una que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con usos diagnósticos o terapéuticos para la proteína de unión, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En algunas realizaciones, la proteína de unión se purificará: (1) hasta más del 95 % en peso de anticuerpo como se ha determinado por el método de Lowry, y lo más preferentemente más del 99 % en peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos aminoterminal o interna por uso de un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. Las proteínas de unión aisladas incluyen la proteína de uniónin situdentro de células recombinantes puesto que al menos un componente del entorno de la proteína de unión no estará presente.
Los términos "sustancialmente puro" o "sustancialmente purificado", como se usan en el presente documento, se refieren a un compuesto o especie que es la especie predominante presente (es decir, en términos molares es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición). En algunas realizaciones, una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie comprende al menos aproximadamente 50 % (en términos molares) de todas las especies macromoleculares presentes. En otras realizaciones, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de todas las especies macromolares presentes en la composición. En otras realizaciones más, la especie se purifica hasta homogeneidad esencial (no se pueden detectar especies contaminantes en la composición por métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente en una única especie macromolecular.
Una proteína de unión "neutralizante", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula que es capaz de bloquear o reducir sustancialmente una función efectora de un antígeno diana al que se une. Como se usa en el presente documento, "reducir sustancialmente" significa al menos aproximadamente el 60 %, preferentemente al menos aproximadamente el 70 %, más preferentemente al menos aproximadamente el 75 %, incluso más preferentemente al menos aproximadamente el 80 %, todavía más preferentemente al menos aproximadamente el 85 %, lo más preferentemente al menos aproximadamente el 90 % reducción de una función efectora del antígeno diana.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante, preferentemente un determinante de polipéptido, capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. En ciertas realizaciones, los determinantes epitópicos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo, y, en ciertas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que es unida por un anticuerpo o proteína de unión. En ciertas realizaciones, una proteína de unión se dice que se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas. En algunas realizaciones, una proteína de unión se dice que se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación en equilibrio es < 10-8 M, más preferentemente cuando la constante de disociación en equilibrio es < 10-9 M, y lo más preferentemente cuando la constante de disociación es < 10-10 M.
La constante de disociación (KD) de una proteína de unión se puede determinar, por ejemplo, por resonancia de plasmones superficiales. En general, el análisis por resonancia de plasmones superficiales mide interacciones de unión en tiempo real entre ligando (un antígeno diana en una matriz biosensora) y analito (una proteína de unión en disolución) por resonancia de plasmones superficiales (SPR) usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). El análisis de plasmones superficiales también se puede realizar inmovilizando el analito (proteína de unión en una matriz biosensora) y presentando el ligando (antígeno diana). El término "K<d>", como se usa en el presente documento, se refiere a la constante de disociación de la interacción entre una proteína de unión particular y un antígeno diana.
El término "se une específicamente a", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad de una proteína de unión o un fragmento de unión al antígeno de la misma para unirse a un antígeno que contiene un epítopo con una Kd de al menos aproximadamente 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, o más, y/o para unirse a un epítopo con una afinidad que es al menos dos veces superior a su afinidad por un antígeno no específico.
El término "conector", como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más residuos de aminoácidos insertados entre dominios de inmunoglobulina para proporcionar movilidad suficiente para que los dominios de las cadenas ligeras y pesadas se plieguen en las inmunoglobulinas de región variable doble cruzada. Un conector se inserta en la transición entre dominios variables o entre dominios variables y constantes, respectivamente, al nivel de secuencia. La transición entre dominios se puede identificar debido a que se entiende bien el tamaño aproximado de los dominios de inmunoglobulina. La localización precisa de una transición de dominio se puede determinar localizando tramos de péptidos que no forman elementos estructurales secundarios, tales como hojas beta o hélices alfa, como se demuestra por datos experimentales o como se pueden asumir por técnicas de modelado o predicción de estructuras secundarias. Los conectores descritos en el presente documento se denominan L1, que se localiza en la cadena ligera entre el extremo C del dominio Vl2 y el extremo N de Vl1 ; y L2, que se localiza en la cadena ligera entre el extremo C del dominio Vl1 y el extremo N de Cl. Los conectores de cadena pesada se conocen como L3, que se localiza entre el extremo C del dominio Vh1 y el extremo N de Vh2; y L4, que se localiza entre el extremo C del dominio Vh2 y el extremo N de Ch1.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido o virus) que se usa para transferir información de codificación a una célula hospedadora. El término "vector" incluye una molécula del ácido nucleico que es capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a una molécula de ADN bicatenario circular en la que se pueden insertar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, en donde segmentos de ADN adicionales se pueden insertar en el genoma vírico. Ciertos vectores son capaces de replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) se pueden integrar en el genoma de una célula hospedadora tras la introducción en la célula hospedadora y así se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante están frecuentemente en forma de plásmidos. Los términos "plásmido" y "vector" se pueden usar indistintamente en el presente documento, ya que un plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la divulgación pretende incluir otras formas de vectores de expresión, tales como vectores víricos (por ejemplo, defective retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que cumplen funciones equivalentes.
La expresión "célula hospedadora recombinante" (o "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, se refiere a una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Una célula hospedadora recombinante o célula hospedadora pretende referirse no solo a la célula objeto particular, sino también a la descendencia de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias medioambientales, en realidad, dicha descendencia puede no ser idéntica a la célula parental, pero dichas células todavía se incluyen dentro del alcance del término "célula hospedadora" como se usa en el presente documento. Se puede usar una amplia variedad de sistemas de expresión de células hospedadoras para expresar las proteínas de unión, que incluyen sistemas de expresión bacterianos, de levadura, baculovíricos y de mamífero (así como sistemas de expresión por presentación en fagos). Un ejemplo de un vector de expresión bacteriano adecuado es pUC19. Para expresar una proteína de unión recombinantemente, una célula hospedadora se transforma o transfecta con uno o más vectores de expresión recombinantes que llevan fragmentos de ADN que codifican las cadenas de polipéptidos de la proteína de unión de forma que las cadenas de polipéptidos se expresan en la célula hospedadora y, preferentemente, se secretan en el medio en que las células hospedadoras se cultivan, de cuyo medio se puede recuperar la proteína de unión.
El término "transformación", como se usa en el presente documento, se refiere a un cambio en las características genética de una célula, y una célula ha sido transformada cuando se ha modificado para contener un nuevo ADN. Por ejemplo, una célula se transforma donde se modifica genéticamente de su estado nativo. Tras la transformación, el ADN transformante puede recombinarse con el de la célula por integración física en un cromosoma de la célula, o se puede mantener transitoriamente como un elemento episómico sin ser replicado, o se puede replicar independientemente como un plásmido. Se considera que una célula ha sido transformada establemente cuando el ADN se replica con la división de la célula. El término "transfección", como se usa en el presente documento, se refiere a la captación de ADN extraño o exógeno por una célula, y una célula se ha "transfectado" cuando el ADN exógeno se ha introducido en el interior de la membrana celular. Se conocen bien en la técnica varias técnicas de transfección. Dichas técnicas se pueden usar para introducir una o más moléculas de ADN exógeno en células hospedadoras adecuadas.
El término "natural", como se usa en el presente documento y se aplica a un objeto, se refiere al hecho de que el objeto se puede descubrir en la naturaleza y no ha sido manipulado por el hombre. Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificado intencionadamente por el hombre es natural. Similarmente, "no natural", como se usa en el presente documento, se refiere a un objeto que no se encuentra en la naturaleza o que ha sido modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre.
Como se usa en el presente documento, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales; aminoácidos no naturales y análogos, tales como aminoácidos a-,a-disustituidos, N-alquil-aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales, también pueden ser componentes adecuados para las cadenas de polipéptidos de las proteínas de unión. Los ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, s-N,N,N-trimetil-lisina, e-N-acetillisina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina, y otros aminoácidos similares e iminoácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos usada en el presente documento, la dirección izquierda es la dirección de extremo amino y la dirección derecha es la dirección de extremo carboxilo, según los usos y convencionales habituales.
Los residuos naturales se pueden dividir en clases basadas en propiedades comunes de la cadena lateral:
(1) hidrófobos: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro;
(2) hidrófilos polares: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr ;
(3) alifáticos: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro;
(4) hidrófobos alifáticos: Ala, Ile, Leu, Val, Pro;
(5) hidrófilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(6) ácidos: Asp, Glu;
(7) básicos: His, Lys, Arg;
(8) residuos que influyen en la orientación de cadena: Gly, Pro;
(9) aromáticos: His, Trp, Tyr, Phe; y
(10) hidrófobos aromáticos: Phe, Trp, Tyr.
Sustituciones de aminoácidos conservativas puede implicar intercambio de un miembro de una de estas clases con otro miembro de la misma clase. Sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases con un miembro de otra clase.
Un experto será capaz de determinar variantes adecuadas de las cadenas de polipéptidos de las proteínas de unión usando técnicas bien conocidas. Por ejemplo, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de una cadena de polipéptidos que se pueden cambiar sin destruir la actividad dirigiéndose a regiones que no se crea que son importantes para la actividad. Alternativamente, un experto en la técnica puede identificar residuos y porciones de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. Además, incluso áreas que pueden ser importantes para la actividad biológica o para la estructura se pueden someter a sustituciones de aminoácidos conservativas sin destruir la actividad biológica o sin afectar adversamente la estructura del polipéptido.
El término "paciente", como se usa en el presente documento, incluye sujetos humanos y animales.
Los términos "tratamiento" o "tratar", como se usan en el presente documento, se refieren tanto al tratamiento terapéutico y profiláctico como a medidas preventivas. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos que tiene un trastorno, así como los propensos a tener el trastorno o aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. En realizaciones particulares, las proteínas de unión se pueden usar para tratar seres humanos con cáncer, o seres humanos susceptibles al cáncer, o mejorar el cáncer en un sujeto humano. Las proteínas de unión también se pueden usar para prevenir cáncer en un paciente humano. En realizaciones particulares, el cáncer es mieloma múltiple, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide aguda, linfoma, cáncer de mama, tal como cáncer de mama Her2+, linfoma de linfocitos B del centro germinativo o leucemia linfoblástica aguda de linfocitos B. En otras realizaciones, las proteínas de unión se pueden usar para tratar seres humanos con trastornos inflamatorios, o seres humanos susceptibles a trastornos inflamatorios, o mejorar trastornos inflamatorios en un sujeto humano.
Los términos "composición farmacéutica" o "composición terapéutica", como se usan en el presente documento, se refieren a un compuesto o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.
El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" o "vehículo fisiológicamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más materiales de formulación adecuados para llevar a cabo o potenciar la administración de una proteína de unión.
Los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz", cuando se usan en referencia a una composición farmacéutica que comprende una o más proteínas de unión, se refieren a una cantidad o dosis suficiente para producir un resultado terapéutico deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de una proteína de unión suficiente para inhibir, durante un cierto periodo de tiempo, uno o más de los procesos patológicos clínicamente definidos asociados a la afección que está tratándose. La cantidad eficaz puede variar dependiendo de la proteína de unión específica que se use, y también depende de una variedad de factores y condiciones relacionadas con el paciente que está tratándose y la intensidad del trastorno. Por ejemplo, si la proteína de unión se va a administrarin vivo,factores tales como la edad, el peso y la salud del paciente, así como curvas de respuesta a dosis y datos de toxicidad obtenidos en trabajo preclínico en animales, estarían entre los factores considerados. La determinación de una cantidad eficaz o cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica dada está perfectamente dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
Una realización de la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión.
Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes
En una realización, la proteína de unión de la divulgación es una proteína de unión triespecífica y/o trivalente que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más (por ejemplo, tres) dianas de antígeno diferentes o proteínas diana, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L2>-L1-V<L1>-L2-C<L>[I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<H1>-L3-V<H2>-L4-C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[II]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<h>3- C<H1>-bisagra-C<H2>-C<H3>[III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<L3>- C<L>[IV]
en donde:
V<li>es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
V<l>3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
C<h>3 es un dominio constante de la cadena pesada C<h>3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
y en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligeracadena pesada.
En una realización, la proteína de unión de la divulgación es una proteína de unión triespecífica y/o trivalente que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más (por ejemplo, tres) dianas de antígeno o proteínas diana, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vh1 -L3-VH2-L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [I I]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vh3- CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vl3- Cl [IV]
en donde:
Vl1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
C<l>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
C<h>3 es un dominio constante de la cadena pesada C<h>3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
y en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligeracadena pesada.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos tienen una orientación cruzada que forma dos sitios de unión al antígeno distintos. En algunas realizaciones, VH1 y VL1 forman un par de unión y forman el primer sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, VH2 y VL2 forman un par de unión y forman un segundo sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido forman un tercer sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, VH3 y VL3 forman un par de unión y forman el tercer sitio de unión al antígeno.
En una realización, la proteína de unión de la divulgación es una proteína de unión triespecífica y/o trivalente que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más (por ejemplo, tres) dianas de antígeno o proteínas diana, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VD1-L1-VD2-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VD3-L3-VD4-L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [II]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vh3- CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vl3- Cl [IV]
en donde:
Vd1 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una primera inmunoglobulina; VD2 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una segunda inmunoglobulina; VD3 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una tercera inmunoglobulina; VD4 es un dominio variable de cadena pesada o ligera de una cuarta inmunoglobulina; V<h>3 es un dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
V<l>3 es un dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
C<l>es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de la cadena pesada Ch1 de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
Ch3 es un dominio constante de la cadena pesada Ch3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
y en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligeracadena pesada.
En algunas realizaciones, la proteína de unión de la divulgación comprende tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una, dos o tres dianas de antígeno o proteínas diana. En algunas realizaciones, la proteína de unión se une a tres dianas de antígeno. En algunas realizaciones, la proteína de unión se une a tres dianas de antígeno diferentes. En algunas realizaciones, dos de los sitios de unión al antígeno se unen a la misma diana de antígeno. En las realizaciones, la proteína de unión comprende los mismos dominios de unión dos veces, o diferentes dominios de unión, y/o se une específicamente a diferentes antígenos o epítopos en la misma diana de antígeno. En algunas realizaciones, tres de los sitios de unión al antígeno se unen a la misma diana de antígeno. En las realizaciones, la proteína de unión comprende los mismos dominios de unión tres veces, o diferentes dominios de unión, y/o se une específicamente a diferentes antígenos o epítopos en la misma diana de antígeno.
En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 2, 4, 10, 14, 18, 22 o 115; y cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 1,3, 9, 13, 17, 21 o 114. En otras realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 61,63, 69, 71,74, 76, 82, 86, 88 o 94; y cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 es independientemente un dominio variable derivado de una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81,85, 87 o 93. En otras realizaciones, cada uno de V<l>1, V<l>2 y V<l>3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera de un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 43-59, 123-125; y cada uno de V<h>1, V<h>2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada de un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 25-42, 120-122. En otras realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera de un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 61,63, 69, 71,74, 76, 82, 86, 88 o 94; y cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada de un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 60, 62, 68, 73, 75, 81, 85, 87 o 93. En algunas realizaciones, cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada y/o una secuencia del dominio variable mostrada en las Tablas 2-5.
En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:169, 171 y 173; y/o cada uno de Vh1, Vh2, y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:168, 170, y 172. En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 141-147, 178 y 179; y/o cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 129-137. En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, y 167; y/o cada uno de Vh1, Vh2, y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:150, 152, 154, 156, 158, 160, 162, 164, y 166. En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138-140, y 149; y/o cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada de un dominio variable que comprende una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 25-42, 120-122, y 126 128. En algunas realizaciones, cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera y/o una secuencia del dominio variable mostrada en las Tablas 2-5.
En realizaciones particulares, se cambia el orden de los dominios V<H1>y V<H2>y, por lo tanto, el orden de los dominios Vl1 y Vl2, en la cadena de polipéptidos de la fórmula I o la cadena de polipéptidos de la fórmula II (es decir, para invertir el orden).
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que comprende opcionalmente c Dr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 1; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 1; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que comprende opcionalmente<c>D<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 13; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 que comprende opcionalmente CD<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 13; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que comprende opcionalmente CDr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 17; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 que comprende opcionalmente CDr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 17; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 18.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que comprende opcionalmente<c>D<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 21; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 22.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 que comprende opcionalmente CDr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 21; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 22.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 63; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 62; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 60; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 61.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 que comprende opcionalmente CDr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 60; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 61 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 61.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 que comprende opcionalmente CD<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 60 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 60; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 71 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 71.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 76 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 76; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 75 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 75; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 74.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 82; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 81 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:81 que comprende opcionalmente<c>D<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 81; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 74.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 88 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 88; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 87 que comprende opcionalmente CD<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 87; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 86.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 94 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 94; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 93 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 93; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 86.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 que comprende opcionalmente CDr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 74.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 69; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 68 que comprende opcionalmente CDr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 68; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 86.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 63; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 que comprende opcionalmente<c>D<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 62; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 73; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 74 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 74.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 63 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 63; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 62 que comprende opcionalmente CDr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 62; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 85 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 85; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 86 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 86.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 4; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 que comprende opcionalmente CD<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 3; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 114; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 115.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 10; una segunda cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 que comprende opcionalmente CD<r>que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 9; la tercera cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 114 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 114; y la cuarta cadena de polipéptidos comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 115 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 115.
En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos y la segunda cadena de polipéptidos tienen una orientación cruzada que forma dos sitios de unión al antígeno distintos. En algunas realizaciones, VH1 y VL1 forman un par de unión y forman el primer sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, VH2 y VL2 forman un par de unión y forman un segundo sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, el tercer polipéptido y el cuarto polipéptido forman un tercer sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, VH3 y VL3 forman un par de unión y forman el tercer sitio de unión al antígeno. En algunas realizaciones, la segunda cadena de polipéptidos y la tercera cadena de polipéptidos comprenden una o más modificaciones. En algunas realizaciones, la segunda cadena de polipéptidos y la tercera cadena de polipéptidos de una proteína de unión son diferentes, por ejemplo, tienen dominio(s) Chi, Ch2 y/o Ch3 diferentes (tales como los que incluyen una modificación descrita en el presente documento). En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos y la cuarta cadena de polipéptidos comprenden una o más modificaciones. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos y la cuarta cadena de polipéptidos de una proteína de unión son diferentes, por ejemplo, tienen dominios Cl diferentes (tales como los que incluyen una modificación descrita en el presente documento, y/o dominios C<l>lambda frente a kappa).
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:150, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 150, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:151, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 151. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:152, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 152, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:153, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 153. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:154, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 154, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:155, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 155. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:156, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 156, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:157, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 157. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:158, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 158, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:159, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 159. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:160, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 160, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:161, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 161. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:162, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 162, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:163, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 163. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:164, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 164, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:165, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 165. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:166, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 166, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:167, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 167. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:168, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 168, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:169, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 169. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:170, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 170, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:171, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 171. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:172, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 172, y/o un dominio variable de la cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, al menos 99 % o 100 % idéntica a SEQ ID NO:173, que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO: 173.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a una, dos o tres dianas de antígeno con una constante de disociación en equilibrio (K<d>) que es inferior o igual a 1 pM, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 5 nM o 1 nM. Ensayos a modo de ejemplo para determinar Kd se conocen en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, Kd se determina midiendo la cinética de unión a entre 0 °C y 37 °C, por ejemplo, a 0 °C, 4 °C, 25 °C o 37 °C) usando las técnicas descritas en el Ejemplo 1 (por ejemplo, SPR o ELISA).
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación activa linfocitos T CD4 y/o CD8in vitroy/o induce la destrucción celularin vitromediada por anticuerpos de una célula que expresa una o más dianas de antígeno de uno o más dominios de unión de la proteína de unión. Se conocen en la técnica ensayos de destrucción celularin vitroy activación de linfocitos T a modo de ejemplo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la destrucción celularin vitroy/o activación de linfocitos T se ensayan usando las técnicas descritas en el Ejemplo 1.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une específicamente a, y/o bloquea, la señalización mediada por, una o más citocinas. Se conocen en la técnica ensayos de liberación de citocinas a modo de ejemplo. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la liberación de citocinas se ensaya usando las técnicas descritas en el Ejemplo 1.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana en linfocitos T, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana en linfocitos T y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno o proteína diana. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana en linfocitos T, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana en linfocitos T y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana en linfocitos T, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana en linfocitos T y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana de tumor humano. En algunas realizaciones, el primer y segundo sitios de unión al antígeno se unen específicamente a una diana de proteína tumoral, por ejemplo, seleccionada de CD3 y CD28, respectivamente. En algunas realizaciones, el primer y segundo sitios de unión al antígeno se unen específicamente a una diana de proteína tumoral, por ejemplo, seleccionada de CD28 y CD3, respectivamente. En algunas realizaciones, el tercer sitio de unión al antígeno se une específicamente a CD19, CD20, CD38, Her2 o LAMP1. Los ejemplos adicionales de dichas dianas y proteínas diana se proporcionan abajo.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno o proteína diana. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno o proteína diana. Los ejemplos adicionales de dichas dianas de antígeno o proteínas diana se proporcionan abajo. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 humano, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 humano y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana de tumor humano. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 humano, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 humano y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana de tumor humano. En algunas realizaciones, el tercer sitio de unión al antígeno se une específicamente a CD19, CD20, CD38, Her2 o LAMP1. Los ejemplos adicionales de dichas dianas de antígeno tumoral o proteínas diana tumorales se proporcionan abajo.
En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; o un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155. Secuencias de VH, VL y/o CDR adicionales de anticuerpos que se unen específicamente a CD3 adecuados para su uso en cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento se pueden descubrir en la publicación internacional n.° WO2016/116626. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende seis CDR, o un dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, mostrado en las Tablas 2-5. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende (i) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:34, 35 y 36, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:52, 53 y 54, respectivamente; o (ii) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:34, 35 y 36, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:149, 53 y 54, respectivamente. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 es parte de una cadena de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 que comprende opcionalmente c Dr que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 es parte de una cadena de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO:4.
En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; o un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende seis CDR, o un dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, mostrado en las Tablas 2-5. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende (i) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:28, 29 y 30, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:46, 47 y 48, respectivamente; o (ii) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:31,32 y 33, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:49, 50 y 51, respectivamente. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 es parte de una cadena de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO:3. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 es parte de una cadena de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o una secuencia de aminoácidos que es al menos 95 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 que comprende opcionalmente CDR que son 100 % idénticas a las CDR de la cadena de polipéptidos de SEQ ID NO:4.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD38, o un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD38, en donde:
• el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende (i) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:34, 35 y 36, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:52, 53 y 54, respectivamente; o (ii) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:34, 35 y 36, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:149, 53 y 54, respectivamente; y
• el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende (i) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:28, 29 y 30, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:46, 47 y 48, respectivamente; o (ii) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:31,32 y 33, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:49, 50 y 51, respectivamente; y
• el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD38 comprende (i) tres CDR de cadena pesada de SEQ ID NO:40, 41 y 42, respectivamente, y tres CDR de cadena ligera de SEQ ID NO:58, 44 y 59, respectivamente.
En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral comprende un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157; un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159; un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165; un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151; o un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral comprende seis CDR, o un dominio variable de la cadena pesada y de la cadena ligera, mostrado en las Tablas 2-5. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral comprende seis CDR de un dominio de unión anti-Her2, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD38 o anti-LAMP1 mostrado en las Tablas 2-5.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VH1-L3-VH2-L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [II]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VH3-CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vls-Cl [IV]
en donde:
VL1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VH1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
VH2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
VH3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina;
CH2 es un dominio constante de la cadena pesada CH2 de inmunoglobulina;
Ch3 es un dominio constante de la cadena pesada Ch3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Chi y Ch2; y Li, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada;
en donde:
cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:169, 171 y 173; y
en donde:
cada uno de Vh1 , Vh2 y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de S<e>Q ID NO:168, 170 y 172.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vh1 -L3-VH2-L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [I I]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VH3-CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<l>3-C<l>[IV]
en donde:
Vl1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Ch1 es un dominio constante de la cadena pesada Ch1 de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
C<h>3 es un dominio constante de la cadena pesada C<h>3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y
L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada;
en donde:
cada uno de Vl i, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 141-147, 178 y 179; y
en donde:
cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 129-137.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vh1 -L3-VH2-L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [I I]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VH3-CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<l>3-C<l>[IV]
en donde:
Vl1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vl3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Cl es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
C<h>3 es un dominio constante de la cadena pesada C<h>3 de inmunoglobulina; bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y
L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada;
en donde:
cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO:151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165 y 167; y
en donde:
cada uno de Vh1 , Vh2 y Vh3 comprende independientemente una secuencia del dominio variable como se expone en una cualquiera de S<e>Q ID NO:150, 152, 154, 156, 158, 160, 162 164, y 166.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno, en donde una primera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
V<h>1 -L3-VH2-L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [I I]
y una tercera cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
VH3-CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos comprende una estructura representada por la fórmula:
Vl3-Cl [IV]
en donde:
VL1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
VH2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
C<h>3 es un dominio constante de la cadena pesada C<h>3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y
L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligera-cadena pesada;
en donde:
cada uno de Vl1, Vl2 y Vl3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 43-59, 123-125, 138-140 y 149; y
en donde:
cada uno de Vh1, Vh2 y Vh3 comprende independientemente regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada que comprenden una secuencia de aminoácidos como se expone en una cualquiera de SEQ ID NO: 25-42, 120-122 y 126-128.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno distinta de CD3 o CD28. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 humano, un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 humano y un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno humano distinta de CD3 o CD28. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende (a) un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, en donde el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende (i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153, (ii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155, (iii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una
CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54, o (iv) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:149, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; (b) un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28, en donde el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende (i) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161, (ii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163, (iii) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48, o (iv) un dominio variable de la cadena pesada que comprende una
CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33, y un dominio variable de la cadena ligera que comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de
SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; y (c) un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno distinta de CD3 o CD28. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una primera cadena de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:4 o 10, una segunda cadena de polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 o 9 y una tercer y una cuarta cadena de polipéptidos, en donde la tercera y cuarta cadenas de polipéptidos forman un dominio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno distinta de
CD3 o CD28. En algunas realizaciones, el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de antígeno distinta de CD3 o CD28 se une a una diana de antígeno seleccionada de A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (también conocida como VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1,
B7-4, C3, C5, CCL2 (también conocida como MCP-1), CCL3 (también conocida como MIP-1a), CCL4 (también conocida como MIP-1 b), CCL5 (también conocida como RANTES), CCL7 (también conocida como MCP-3), CCL8 (también conocida como mcp-2), CCL11 (también conocida como eotaxina), CCL15 (también conocida como MIP-1 d), CCL17 (también conocida como TARC), CCL19 (también conocida como MIP-3b), CCL20 (también conocida como
MIP-3a), CCL21 (también conocida como MIP-2), CCL24 (también conocida como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (también conocida como TECK), CCL26 (también conocida como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD19, C<d>20, CD23 (también conocida como FCER2, un receptor para IgE), CD24, CD27, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (también conocida como B7-1), CD86 (también conocida como B7-2), CD122, CD137 (también conocida como 41BB), CD137L, CD152 (también conocida como CTLA4), CD154 (también conocida como CD40L), CD160, CD272, CD273 (también conocida como PDL2), CD274 (también conocida como PDL1), CD275 (también conocida como B7H2), CD276 (también conocida como B7H3), CD278 (también conocida como ICOS), CD279 (también conocida como PD-1), CDH1 (también conocida como E-cadherina), quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (también conocida como M-CSF),
CSF-2 (también conocida como GM-CSF), CSF-3 (también conocida como GCSF), CX3CL1 (también conocida como SCYD1), CXCL12 (también conocida como SDF1), CXCL13, CXCR3,<d>N<g>R-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6,
IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (también conocida como un receptor para IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (también conocida como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1 H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (también conocida como un receptor para IL33), STEAP2, cinasa
Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (también conocida como un co-receptor para IL7Ra), TSl Pr , t W eAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM y XCR1 (también conocida como GPR5/CCXCR1).
En algunas realizaciones, V<h>1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende
la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; V<li>comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; V<h>2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; y VL3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; V<l>1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:25, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:26 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:27; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:43, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:45.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; V<l>1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; V<h>2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:37, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:38 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:39; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:55, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:56 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:57.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; VH3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y VL3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; V<h>2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:40, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:41 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:42; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:58, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:44 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:59.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:138, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:139 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:126, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:127 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:128; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:138, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:139 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:140.
En algunas realizaciones, V<hi>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; V<l>1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:129, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:130 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:131; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:141, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:178 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:142; V<h>2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; V<l>1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; V<H3>comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; V<l>1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:135, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:136 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:137; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:145, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:146 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:147; Vh3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:132, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:133 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:134; y Vl3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:143, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:179 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:144.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:121 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:122; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125.
En algunas realizaciones, Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:31, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:32 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:33; Vl1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:49, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:50 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:51; Vh2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36; Vl2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54; V<h>3 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:120, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:121 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:122; y V<l>3 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:123, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:124 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:125.
Dianas de antígeno
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a una o más (por ejemplo, una, dos o tres) de las siguientes dianas de antígeno o proteínas diana: A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (también conocida como VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (también conocida como MCP-1), CCL3 (también conocida como MIP-1a), CCL4 (también conocida como MIP-1 b), CCL5 (también conocida como RANTES), CCL7 (también conocida como MCP-3), CCL8 (también conocida como mcp-2), CCL11 (también conocida como eotaxina), CCL15 (también conocida como MIP-1 d), CCL17 (también conocida como TARC), CCL19 (también conocida como MIP-3b), CCL20 (también conocida como MIP-3a), CCL21 (también conocida como MIP-2), CCL24 (también conocida como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (también conocida como T<e>CK), CCL26 (también conocida como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, C<d>20, CD23 (también conocida como FCER2, un receptor para IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (también conocida como B7-1), CD86 (también conocida como B7-2), CD122, CD137 (también conocida como 41BB), CD137L, CD152 (también conocida como CTLA4), CD154 (también conocida como CD40L), CD160, CD272, CD273 (también conocida como PDL2), CD274 (también conocida como PDL1), CD275 (también conocida como B7H2), CD276 (también conocida como B7H3), CD278 (también conocida como ICOS), CD279 (también conocida como PD-1), CDH1 (también conocida como E-cadherina), quitinasa, CLEC9, CLEC91, c Rt H2, c Sf -1 (también conocida como M-CSF), CSF-2 (también conocida como GM-CSF), CSF-3 (también conocida como GCSF), CX3CL1 (también conocida como SCYD1), CXCL12 (también conocida como SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (también conocida como un receptor para IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (también conocida como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (también conocida como un receptor para IL33), STEAP2, cinasa Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (también conocida como un co-receptor para IL7Ra), TSLPR,<t>W<e>AK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM y XCR1 (también conocida como GPR5/CCXCR1). En algunas realizaciones, una o más de las dianas de antígeno anteriores son dianas de antígeno humanas.
En una realización, las proteínas de unión se unen específicamente a una o más dianas de antígeno tumoral (por ejemplo, proteínas diana). En otras realizaciones, las proteínas de unión se unen específicamente a una o más dianas de proteína tumoral y una o más proteínas diana en un linfocito T que incluye un complejo de receptor de linfocitos T. Estas proteínas de unión a acopladores de linfocitos T son capaces de reclutar linfocitos T transitoriamente a las células diana y, al mismo tiempo, activar la actividad citolítica de los linfocitos T. Los ejemplos de proteínas diana en linfocitos T incluyen, pero no se limitan a, CD3 y CD28, entre otros. Los ejemplos adicionales de dichas dianas de antígeno o proteínas diana se proporcionan arriba. En algunas realizaciones, las proteínas de unión triespecíficas se pueden generar combinando los dominios de unión al antígeno de dos o más anticuerpos monoespecíficos (anticuerpos parentales) en un anticuerpo. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a una o más (por ejemplo, una, dos o tres) de las siguientes dianas de antígeno: CD3, CD19, CD20, CD28, CD38, Her2, LAMP1, IL-4, IL-13 y TNFa.
En algunas realizaciones de la divulgación, la proteína de unión trivalente es capaz de unirse a tres dianas de antígeno. En algunas realizaciones de la divulgación, la proteína de unión trivalente es capaz de unirse a tres dianas de antígeno diferentes. En una realización, la proteína de unión es triespecífica y un par de cadena ligera-cadena pesada es capaz de unirse a dos dianas de antígeno diferentes o epítopos y un par de cadena ligera-cadena pesada es capaz de unirse a una diana de antígeno o epítopo. En otra realización, la proteína de unión es capaz de unirse a tres dianas de antígeno tumoral. En otra realización, la proteína de unión es capaz de unirse a tres dianas de antígeno tumoral diferentes. En otras realizaciones, la proteína de unión es capaz de inhibir la función de una o más de las dianas de antígeno.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a una o más proteínas diana tumorales. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres epítopos en una única diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres epítopos diferentes en una única diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse a dos epítopos diferentes en una primera diana de proteína tumoral, y un epítopo en una segunda diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, la primera y segunda proteínas diana tumorales son diferentes. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres proteínas diana tumorales diferentes.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a una o más proteínas diana de citocina. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres epítopos en una única proteína diana de citocina. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres epítopos diferentes en una única proteína diana de citocina. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse a dos epítopos diferentes en una primera proteína diana de citocina, y un epítopo en una segunda proteína diana de citocina. En algunas realizaciones, la primera y segunda proteínas diana de citocina son diferentes. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a tres proteínas diana de citocina diferentes. En algunas realizaciones, la una o más proteínas diana de citocina son una o más de IL-4, IL-13 y/o TNFa. Los ejemplos adicionales de proteínas diana de citocina se proporcionan abajo.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une a una o más proteínas diana tumorales y una o más proteínas diana de linfocitos T. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una diana de proteína tumoral y dos epítopos diferentes en una única proteína diana de linfocitos T. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una diana de proteína tumoral y dos proteínas diana de linfocitos T diferentes (por ejemplo, CD28 y CD3). En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una proteína diana de linfocitos T y dos epítopos diferentes en una única diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, la proteína de unión es capaz de unirse específicamente a una proteína diana de linfocitos T y dos proteínas diana tumorales diferentes. En algunas realizaciones, la primera y segunda cadenas de polipéptidos de la proteína de unión forman dos sitios de unión al antígeno que se dirigen específicamente a dos proteínas diana de linfocitos T, y la tercera y cuarta cadenas de polipéptidos de la proteína de unión forman un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral. En algunas realizaciones, la primera y segunda cadenas de polipéptidos de la proteína de unión forman dos sitios de unión al antígeno que se dirigen específicamente a dos proteínas diana tumorales, y la tercera y cuarta cadenas de polipéptidos de la proteína de unión forman un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana de linfocitos T. En algunas realizaciones, la una o más proteínas diana tumorales son una o más de CD3, CD19, CD20, CD28, CD38, Her2, LAMP1, IL-4, IL-13 y/o TNFa. En algunas realizaciones, la una o más proteínas diana de linfocitos T son una o más de CD3 y CD28. Los ejemplos adicionales de proteínas diana tumorales y proteínas diana de linfocitos T se proporcionan arriba.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se une, independientemente entre sí, a una, dos o tres dianas de antígeno o proteínas diana iguales o diferentes, seleccionadas de proteínas diana de citocina, antígenos diana tumorales o proteínas diana tumorales, proteínas diana de linfocitos T, inhibidores inmunitarios del punto de control, moduladores inmunitarios del punto de control, moléculas coestimulantes inmunitarias del punto de control y/o moléculas diana en la superficie de una célula inmunitaria. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación es trivalente, pero biespecífica, y capaz de unirse específicamente dos veces a las mismas dianas de antígeno o proteínas diana. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación es capaz de unirse específicamente a dos epítopos diferentes en una única proteína diana de citocina, antígeno diana tumoral o proteína diana tumoral, proteína diana de linfocitos T, inhibidor inmunitario del punto de control, modulador inmunitario del punto de control, molécula coestimulante inmunitarias del punto de control y/o molécula diana en la superficie de una célula inmunitaria. Los ejemplos adicionales de dichas dianas de antígeno o proteínas diana se proporcionan arriba.
Las proteínas de unión de la divulgación se pueden preparar usando dominios o secuencias obtenidos o derivados de cualquier anticuerpo humano o no humano, que incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanos, murinos o humanizados.
Conectores
En algunas realizaciones, los conectores L1, L2, L3 y L4 varían de ningún aminoácido (longitud=0) a aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o menos de 100, 50, 40, 30, 20 o 15 aminoácidos o menos. Los conectores también pueden ser de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 aminoácidos de longitud. Todos de L1, L2, L3 y L4 en una proteína de unión pueden tener la misma secuencia de aminoácidos o pueden todos tener secuencias de aminoácidos diferentes.
Ejemplos de conectores adecuados incluyen una único residuo de glicina (Gly); un péptido de diglicina (Gly-Gly); un tripéptido (Gly-Gly-Gly); un péptido con cuatro restos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 98); un péptido con cinco restos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 99); un péptido con seis restos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 100); un péptido con siete restos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SEQ ID NO: 101); un péptido con ocho restos de glicina (Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly; SeQ ID NO: 102). Se pueden usar otras combinaciones de residuos de aminoácidos, tales como el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 103), el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 104), el péptido Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NO: 105), y el péptido Gly-Gly-Ser-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID n O: 148). Otros conectores adecuados incluyen un único residuo de Ser y Val; el dipéptido Arg-Thr, Gln-Pro, Ser-Ser, Thr-Lys, y Ser-Leu; Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 106), Thr-Val-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 107), Gln-Pro-Lys-Ala-Ala (SEQ ID NO: 108), Gln-Arg-Ile-Glu-Gly (SEQ ID NO: 109); Ala-Ser-Thr-Lys-Gly-Pro-Ser (SEQ ID NO: 110), Arg-Thr-Val-Ala-Ala-Pro-Ser (SEQ ID NO:111), Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO:112), e His-Ile-Asp-Ser-Pro-Asn-Lys (SEQ ID NO:113). Los ejemplos enumerados anteriormente no pretenden limitar el alcance de la divulgación en modo alguno, y se ha mostrado que conectores que comprenden aminoácidos elegidos aleatoriamente seleccionados del grupo que consiste en valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina y prolina son adecuados en las proteínas de unión. Para descripciones adicionales de secuencias conectoras, véase, por ejemplo, el documento de patente WO2012135345.
La identidad y secuencia de residuos de aminoácidos en el conector puede variar dependiendo del tipo de elemento estructural secundario necesario para lograr el conector. Por ejemplo, glicina, serina y alanina son los mejores para conectores que tienen flexibilidad máxima. Alguna combinación de glicina, prolina, treonina y serina es útil si es necesario un conector más rígido y extendido. Cualquier residuo de aminoácido se puede considerar un conector en combinación con otros residuos de aminoácidos para construir conectores peptídicos mayores según sea necesario dependiendo de las propiedades deseadas.
En algunas realizaciones, la longitud de L<1>es al menos dos veces la longitud de L<3>. En algunas realizaciones, la longitud de L<2>es al menos dos veces la longitud de L<4>. En algunas realizaciones, la longitud de L<1>es al menos dos veces la longitud de L<3>, y la longitud de L<2>es al menos dos veces la longitud de L<4>. En algunas realizaciones, L<1>es 3 a 12 residuos de aminoácidos de longitud, L<2>es 3 a 14 residuos de aminoácidos de longitud, L<3>es 1 a 8 residuos de aminoácidos de longitud, y L<4>es 1 a 3 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>es 5 a 10 residuos de aminoácidos de longitud, L<2>es 5 a 8 residuos de aminoácidos de longitud, L<3>es 1 a 5 residuos de aminoácidos de longitud, y L<4>es 1 a 2 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>es 7 residuos de aminoácidos de longitud, L<2>es 5 residuos de aminoácidos de longitud, L<3>es 1 residuo de aminoácido en longitud, y L<4>es 2 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>es 10 residuos de aminoácidos de longitud, L<2>es 10 residuos de aminoácidos de longitud, L<3>es 0 residuos de aminoácidos de longitud y L<4>es 0 residuos de aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, cada uno de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>tienen una longitud seleccionada independientemente desde 0 hasta 15 aminoácidos (por ejemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos), en donde al menos dos de los conectores tienen una longitud de 1 a 15 aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 aminoácidos). En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y L<4>son cada uno 0 aminoácidos de longitud.
En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>, y/o L<4>comprenden la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525). En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525). En algunas realizaciones, L<3>comprende la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).
En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y/o L<4>comprenden una secuencia derivada de una secuencia natural en la unión entre un dominio variable de anticuerpo y un dominio constante de anticuerpo (por ejemplo, como se describe en el documento de patente WO2012/135345). Por ejemplo, en algunas realizaciones, el conector comprende una secuencia encontrada en la transición entre un dominio Vh y Ch1 endógeno, o entre un dominio Vl y Cl endógeno (por ejemplo, kappa o lambda). En algunas realizaciones, el conector comprende una secuencia encontrada en la transición entre un dominio V<h>y C<h>1 humano endógeno, o entre un dominio V<l>y C<l>humano endógeno (por ejemplo, human kappa o lambda).
En algunas realizaciones, L<1>, L<2>, L<3>y/o L<4>comprenden la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 175). En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 175). En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 175), L<2>comprende la secuencia Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 176), L<3>comprende la secuencia Ser y L<4>comprende la secuencia Arg-Thr. En algunas realizaciones, L<3>comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 175). En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia Ser, L<2>comprende la secuencia Arg-Thr, L<3>comprende la secuencia Gly-Gln-Pro-Lys-Ala-Ala-Pro (SEQ ID NO: 175) y L<4>comprende la secuencia Thr-Lys-Gly-Pro-Ser-Arg (SEQ ID NO: 176).
En algunas realizaciones, cada uno de L<1>, L<2>, L<3>y L<4>comprende independientemente una secuencia seleccionada de (GGGGS)<n>(en donde n es un número entero entre 0 y 5; SEQ ID NO:174), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) y GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148). En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), L<2>comprende la secuencia TKGPS (SEQ ID NO:106), L<3>comprende la secuencia S, y L<4>comprende la secuencia RT. En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L<2>comprende la secuencia GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 104), L<3>es 0 aminoácidos de longitud, y L<4>es 0 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L<2>comprende la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L<3>es 0 aminoácidos de longitud y L<4>es 0 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>comprende la secuencia GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), L<2>es 0 aminoácidos de longitud, L<3>comprende la secuencia GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105) y L<4>es 0 aminoácidos de longitud. En algunas realizaciones, L<1>y L<2>son cero aminoácidos de longitud, y cada uno de L<3>y L<4>comprende una secuencia elegida independientemente seleccionada de (GGGGS)<n>(en donde n es un número entero entre 0 y 5; SEQ ID NO:174), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) y GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148). En algunas realizaciones, L<3>y L<4>son cero aminoácidos de longitud y cada uno de L<1>y L<2>comprende una secuencia elegida independientemente seleccionada de (GGGGS)<n>(en donde n es un número entero entre 0 y 5; SEQ ID NO:174), GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) y GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148).
Regiones Fc y dominios constantes
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una segunda cadena de polipéptidos que comprende además una región Fc unida a CH1, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende a tercera cadena de polipéptidos que comprende además una región Fc unida a CH1, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una segunda cadena de polipéptidos que comprende además una región Fc unida a CH1, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, y una tercera cadena de polipéptidos que comprende además una región Fc unida a CH1, comprendiendo la región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación incluye una o dos variantes de Fc. El término "variante de Fc", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula o secuencia que se modifica de una Fc nativa, pero todavía comprende un sitio de unión para el receptor de rescate, FcRn (receptor de Fc neonatal). Variantes de Fc a modo de ejemplo, y su interacción con el receptor de rescate, se conocen en la técnica. Por lo tanto, el término "variante de Fc" puede comprender una molécula o secuencia que se humaniza de un Fc nativo no humano. Además, un Fc nativo comprende regiones que se pueden retirar debido a que proporcionan características estructurales o actividad biológica que no son requeridas por las proteínas de unión de tipo anticuerpo de la invención. Por lo tanto, el término "variante de Fc" comprende una molécula o secuencia que carece de uno o más sitios o residuos de Fc nativos, o en la que uno o más sitios o residuos de Fc se tienen que modificar, que afectan o participan en: (1) formación de enlaces disulfuro, (2) incompatibilidad con una célula hospedadora seleccionada, (3) heterogeneidad aminoterminal tras la expresión en una célula hospedadora seleccionada, (4) glucosilación, (5) interacción con el complemento, (6) unión a un receptor de Fc distinto de un receptor de rescate, o (7) citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).
Para mejorar los rendimientos de las proteínas de unión, los dominios C<h>3 se pueden alterar por la tecnología de "botón en ojal" que se describe con detalle con varios ejemplos en, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO 96/027011, Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; y Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 677-81. Específicamente, las superficies de interacción de los dos dominios Ch3 se alteran para aumentar la heterodimerización de ambas cadenas pesadas que contienen estos dos dominios Ch3. Cada uno de los dos dominios Ch3 (de las dos cadenas pesadas) pueden ser el "botón", mientras que el otro es el "ojal". La introducción de un puente disulfuro adicional estabiliza los heterodímeros (Merchantet al.,1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) y aumenta el rendimiento. En realizaciones particulares, el botón está en un segundo par de polipéptidos con un único dominio variable. En otras realizaciones, el botón está en el primer par de polipéptidos que tiene la orientación cruzada. En aún otras realizaciones, los dominios Ch3 no incluyen un botón en ojal.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una mutación de "botón" en una segunda cadena de polipéptidos y una mutación de "ojal" en la tercera cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una mutación de "botón" en la tercera cadena de polipéptidos y una mutación de "ojal" en una segunda cadena de polipéptidos. En algunas realizaciones, la mutación de "botón" comprende sustitución (sustituciones) en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y/o 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son S354C, T366W, T366Y, S354C y T366W, o S354C y T366Y. En algunas realizaciones, la mutación de "botón" comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W. En algunas realizaciones, la mutación de "ojal" comprende sustitución (sustituciones) en las posiciones correspondientes a las posiciones 407 y, opcionalmente, 349, 366 y/o 368 y de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son Y407V o Y407T y opcionalmente Y349C, T366S y/o L368A. En algunas realizaciones, la mutación de "ojal" comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG 1 o IgG4 humana según el índice EU. En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V.
En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a CH1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustitución (sustituciones) de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 366 y opcionalmente 354 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son T366W o T366Y y opcionalmente S354C; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a CH1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustitución (sustituciones) de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 407 y opcionalmente 349, 366, y/o 368 y de IgG 1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y407V o Y407T y opcionalmente Y349C, T366S y/o L368A.
En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a CH1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustitución (sustituciones) de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 407 y opcionalmente 349, 366 y/o 368 y de IgG 1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y407V o Y407T y opcionalmente Y349C, T366S y/o L368A; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a CH1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustitución (sustituciones) de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 366 y opcionalmente 354 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son T366W o T366Y y opcionalmente S354C.
En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a CH1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustitución de aminoácidos en la posición correspondientes una posición 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde la sustitución de aminoácidos es T366W; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a CH1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustitución (sustituciones) de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 366, 368 y/o 407 y de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son T366S, L368A y/o Y407V.
En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a CH1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustitución (sustituciones) de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 366, 368 y/o 407 y de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son T366S, L368A y/o Y407V; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a CH1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustitución de aminoácidos en la posición correspondientes una posición 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde la sustitución de aminoácidos es T366W.
En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a CH1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a CH1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a CH1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la primera región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368 y 407 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V; y en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a CH1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la segunda región Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una o más mutaciones para mejorar semivida en suero (véase, por ejemplo, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). En algunas realizaciones, la mutación comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende una segunda cadena de polipéptidos que comprende además una primera región Fc unida a CH1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, y una tercera cadena de polipéptidos que comprende además una segunda región Fc unida a CH1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina, en donde la primera y/o segunda regiones Fc comprenden sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 428 y 434 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son M428L y N434S. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende mutaciones de botón y ojal y una o más mutaciones para mejorar semivida en suero. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una o más mutaciones para mejorar la estabilidad, por ejemplo, de la interfase región bisagra y/o dímero de IgG4 (véase, por ejemplo, Spiess, C.
et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:26583-26593). En algunas realizaciones, la mutación comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 228 y 409 de IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S228P y R409K. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende una segunda cadena de polipéptidos que comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina, y una tercera cadena de polipéptidos que comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la primera y segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana; y en donde cada una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 228 y 409 de IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S228P y R409K. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende botón y hol mutaciones y una o más mutaciones para mejorar estabilidad. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una o más mutaciones para mejorar la purificación, por ejemplo, modulando la afinidad por un reactivo de purificación. Por ejemplo, se conoce que proteínas de unión heterodiméricas pueden purificarse selectivamente de sus formas homodiméricas si una de las dos regiones Fc de la forma heterodimérica contiene mutación (mutaciones) que reducen o eliminan la unión a proteína A, debido a que la forma heterodimérica tendrá una afinidad intermedia por la purificación basada en proteína A que la forma homodimérica y se puede eluir selectivamente de la proteína A, por ejemplo, usando un pH diferente (véase, por ejemplo, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943). En algunas realizaciones, la mutación comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son H435R y Y436F. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende una segunda cadena de polipéptidos que comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina, y una tercera cadena de polipéptidos que comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina; y en donde solo una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son H435R y Y436F. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende mutaciones de botón y ojal y una o más mutaciones para mejorar la purificación. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende una o más mutaciones para reducir la función efectora, por ejemplo, la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) mediada por receptor de Fc, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC). En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada CH2 y CH3 de inmunoglobulina; en donde la primera y segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana; y en donde cada una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son L234A y L235A. En algunas realizaciones, las regiones Fc de la segunda y tercera cadenas de polipéptidos son regiones Fc de IgG1 humana, y en donde cada una de las regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son L234A y L235A. En algunas realizaciones, una segunda cadena de polipéptidos comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la tercera cadena de polipéptidos comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; en donde la primera y segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana; y en donde cada una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234, 235, 329 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A, y P329A. En algunas realizaciones, las regiones Fc de la segunda y tercera cadenas de polipéptidos son regiones Fc de IgG1 humana, y en donde cada una de las regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234, 235, y 329 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son L234A, L235A, y P329A. En algunas realizaciones, la mutación comprende sustituciones en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son F234A y L235A. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende una segunda cadena de polipéptidos que comprende además una primera región Fc unida a Ch1, comprendiendo la primera región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina, y una tercera cadena de polipéptidos que comprende además una segunda región Fc unida a Ch1, comprendiendo la segunda región Fc una región bisagra de inmunoglobulina y dominios constantes de la cadena pesada Ch2 y Ch3 de inmunoglobulina; y en donde cada una de la primera y segunda regiones Fc comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 234 y 235 de IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son F234A y L235A. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende mutaciones de botón y ojal y una o más mutaciones para reducir función efectora. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG1 humana. En algunas realizaciones, la primera y/o segunda regiones Fc son regiones Fc de IgG4 humana. Para una descripción adicional de mutaciones de Fc en la posición 329, véase, por ejemplo, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 y el documento de patente WO1999051642.
En algunas realizaciones, los tipos de mutaciones descritas arriba se pueden combinar en cualquier orden o combinación. Por ejemplo, una proteína de unión de la presente divulgación puede comprender dos o más de las mutaciones de "botón" y "ojal", mejorando la una o más mutaciones la semivida en suero, mejorando la una o más mutaciones la estabilidad de IgG4, mejorando la una o más mutaciones la purificación y/o reduciendo la una o más mutaciones la función efectora descrita arriba.
En ciertas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación comprende: una primera cadena de polipéptidos que comprende un dominio Cl lambda; un dominio Ch3 de una segunda cadena de polipéptidos que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; un dominio C<h>3 de una tercera cadena de polipéptidos que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, 407, 435 y 436 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R y Y436F; y una cuarta cadena de polipéptidos que comprende un dominio Cl kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende un dominio Cl lambda; en donde el dominio C<h>3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG 1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; en donde el dominio C<h>3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, 407, 435 y 436 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R y Y436F; y en donde la cuarta cadena de polipéptidos comprende un dominio C<l>kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende un dominio C<l>lambda; en donde el dominio C<h>3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354, 366, 435 y 436 de IgG 1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C, T366W, H435R y Y436F; en donde el dominio Ch3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, y 407 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A y Y407V; y en donde la cuarta cadena de polipéptidos comprende un dominio Cl kappa. En algunas realizaciones, la primera cadena de polipéptidos comprende un dominio C<l>kappa; en donde el dominio C<h>3 de una segunda cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; en donde el dominio Ch3 de la tercera cadena de polipéptidos comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, 407, 435 y 436 de IgG 1 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R y Y436F; y en donde la cuarta cadena de polipéptidos comprende un dominio C<l>lambda.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se purifica por cromatografía de afinidad por proteína A, cromatografía de afinidad por cadena ligera kappa (por ejemplo, usando una resina KappaSelect según las instrucciones del fabricante; GE Healthcare), y opcionalmente cromatografía de afinidad por cadena ligera lambda (por ejemplo, usando una resina LambdaFabSelect según las instrucciones del fabricante; GE Healthcare). En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se purifica por cromatografía de afinidad por proteína A, cromatografía de afinidad por cadena ligera lambda (por ejemplo, usando una resina LambdaFabSelect según las instrucciones del fabricante; GE Healthcare) y opcionalmente cromatografía de afinidad por cadena ligera kappa (por ejemplo, usando una resina KappaSelect según instrucciones del fabricante; GE Healthcare). En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende dos regiones Fc, cada una de las cuales comprende un dominio Ch3, y solo uno de los dominios CH3 comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 435 y 436 de IgG1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son H435R y Y436F. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se purifica por cromatografía de afinidad por proteína A, entonces cromatografía de afinidad por cadena ligera kappa (por ejemplo, usando una resina KappaSelect según las instrucciones del fabricante; GE Healthcare), entonces opcionalmente cromatografía de afinidad por cadena ligera lambda (por ejemplo, usando una resina LambdaFabSelect según las instrucciones del fabricante; GE Healthcare) en secuencia. En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se purifica por cromatografía de afinidad por proteína A, entonces cromatografía de afinidad por cadena ligera lambda (por ejemplo, usando una resina LambdaFabSelect según las instrucciones del fabricante; GE Healthcare), entonces opcionalmente cromatografía de afinidad por cadena ligera kappa (por ejemplo, usando una resina KappaSelect según las instrucciones del fabricante; GE Healthcare) en secuencia. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína de unión se pone en contacto con proteína A, se eluye de la proteína A en condiciones adecuadas para aislar la proteína de unión de las proteínas de unión que comprenden o 0 o 2 dominios CH3 que comprenden sustituciones de aminoácidos que son H435R y Y436F, entran en contacto con un medio de afinidad por cadena ligera kappa (por ejemplo, como se usa en la resina KappaSelect; GE Healthcare) y se eluyen del medio de afinidad por cadena ligera kappa en condiciones adecuadas para aislar la proteína de unión de las proteínas de unión que comprenden solo dominios Cl lambda (por ejemplo, según las instrucciones del fabricante). Condiciones adecuadas para la elución de proteína A se conocen en la técnica, que incluyen, sin limitación, un gradiente en elución escalonado de pH 4,5-2,8. En algunas realizaciones, se emplea la proteína A o una variante de proteína A útil para la purificación de proteínas. En algunas realizaciones, la proteína A está unida a un sustrato o resina, por ejemplo, como parte de un medio de cromatografía. En algunas realizaciones, después de la elución del medio de afinidad por cadena ligera kappa, la proteína de unión se pone en contacto con un medio de afinidad por cadena ligera lambda (por ejemplo, como se usa en la resina LambdaFabSelect; GE Healthcare) y se eluye del medio de afinidad por cadena ligera lambda en condiciones adecuadas para aislar la proteína de unión de las proteínas de unión que comprenden solo dominios C<L>kappa (por ejemplo, según las instrucciones del fabricante). En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se detecta usando cromatografía HIC. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende: una primera cadena de polipéptidos que comprende un dominio Cl lambda; un dominio Ch3 de una segunda cadena de polipéptidos que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 354 y 366 de IgG 1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son S354C y T366W; un dominio Ch3 de una tercera cadena de polipéptidos que comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones correspondientes a las posiciones 349, 366, 368, 407, 435 y 436 de IgG 1 o IgG4 humana según el índice EU, en donde las sustituciones de aminoácidos son Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R y Y436F; y una cuarta cadena de polipéptidos que comprende un dominio C<l>kappa. En algunas realizaciones, la proteína de unión se produce por una célula hospedadora. En algunas realizaciones, la proteína de unión se purifica de un medio de cultivo celular o extracto de células hospedadoras. En algunas realizaciones, las proteínas de unión son secretadas por una célula hospedadora o producidas y extraídas de una célula hospedadora (por ejemplo, antes de ser puestas en contacto con la proteína A). En algunas realizaciones, la proteína de unión está en un medio de cultivo celular o extracto de células hospedadoras cuando se pone en contacto con la proteína A. En algunas realizaciones, la proteína de unión se purifica de otras proteínas de unión, polipéptidos y/u otros componentes celulares.
En algunas realizaciones, CH1, CH2, CH3 y CL de las proteínas de unión triespecíficas descritas en el presente documento pueden comprender cualquiera de las secuencias de CH1, CH2, CH3 y CL de proteínas de unión 1 -53.
Ácidos nucleicos
Se usan metodologías habituales de ADN recombinante para construir los polinucleótidos que codifican los polipéptidos que forman las proteínas de unión, incorporar estos polinucleótidos en vectores de expresión recombinantes e introducir dichos vectores en células hospedadoras. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3.a ed.). Se pueden realizar reacciones enzimáticas y técnicas de purificación según las especificaciones de los fabricantes, como se realiza comúnmente en la técnica, o como se describe en el presente documento. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada a propósito de, y los procedimientos de laboratorio y técnicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descrita en el presente documento son los bien conocidos y comúnmente usados en la técnica. Similarmente, se pueden usar técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación, administración y tratamiento de pacientes.
Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a moléculas de ácido nucleico aisladas que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado está unido operativamente a un promotor heterólogo para dirigir la transcripción de la secuencia del ácido nucleico que codifica la proteína de unión. Un promotor puede referirse a secuencias de control de ácido nucleico que dirigen la transcripción de un ácido nucleico. Una primera secuencia del ácido nucleico está unida operativamente a una segunda secuencia del ácido nucleico cuando la primera secuencia del ácido nucleico se pone en una relación funcional con la segunda secuencia del ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante de una proteína de unión si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante. Los ejemplos de promotores pueden incluir, pero no se limitan a, promotores obtenidos de los genomas de virus (tales como virus del polioma, virus de la viruela aviar, adenovirus (tal como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B, virus 40 simio (SV40) y similares), de promotores eucariotas heterólogos (tales como el promotor de actina, un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico y similares), el promotor de CAG (Niwa et al., Gene 108(2):193-9, 1991), el promotor de la fosfoglicerato cinasa (PGK), un promotor inducible de tetraciclina (Masui et al., Nucleic Acids Res. 33:e43, 2005), el sistema lac, el sistema trp, el sistema tac, el sistema trc, regiones operadoras y promotoras principales de fago lambda, el promotor para la 3-fosfoglicerato cinasa, los promotores de levadura fosfatasa ácida y el promotor de los factores de apareamiento alfa de levadura. Los polinucleótidos que codifican proteínas de unión de la presente divulgación pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo, un promotor inducible, o cualquier otro promotor adecuado descrito en el presente documento u otro promotor adecuado que será reconocido fácilmente por un experto en la técnica.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico aislado se incorpora en un vector. En algunas realizaciones, el vector es un vector de expresión. Los vectores de expresión pueden incluir una o más secuencias reguladoras unidas operativamente al polinucleótido a expresar. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Los ejemplos de potenciadores adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, secuencias potenciadoras de genes de mamífero (tales como globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, insulina y similares) y secuencias potenciadoras de un virus de célula eucariota (tal como el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (pb 100-270), el potenciador del promotor temprano del citomegalovirus, el potenciador del polioma en el lado tardío del origen de replicación, adenovirus potenciadores y similares). Los ejemplos de vectores adecuados pueden incluir, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, episomas, transposones y vectores víricos (por ejemplo, vectores adenovíricos, víricos de la variolovacuna, víricos de Sindbis, de sarampión, víricos de herpes, lentivíricos, retrovíricos, víricos adenoasociados, etc.). Los vectores de expresión se pueden usar para transfectar células hospedadoras, tales como, por ejemplo, células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero. Vectores víricos y de ADN de plásmido funcionales biológicamente capaces de expresarse y replicarse en un hospedador se conocen en la técnica, y se pueden usar para transfectar cualquier célula de interés.
Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un sistema de vector que comprende uno o más vectores que codifican una primera, segunda, tercera y cuarta cadena de polipéptidos de cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el sistema de vector comprende un primer vector que codifica la primera cadena de polipéptidos de la proteína de unión, un segundo vector que codifica la segunda cadena de polipéptidos de la proteína de unión, un tercer vector que codifica la tercera cadena de polipéptidos de la proteína de unión y un cuarto vector que codifica la cuarta cadena de polipéptidos de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema de vector comprende un primer vector que codifica la primera y segunda cadenas de polipéptidos de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la tercera y cuarta cadenas de polipéptidos de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema de vector comprende un primer vector que codifica la primera y tercera cadenas de polipéptidos de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la segunda y cuarta cadenas de polipéptidos de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema de vector comprende un primer vector que codifica la primera y cuarta cadenas de polipéptidos de la proteína de unión, y un segundo vector que codifica la segunda y tercera cadenas de polipéptidos de la proteína de unión. En algunas realizaciones, el sistema de vector comprende un primer vector que codifica la primera, segunda, tercera y cuarta cadenas de polipéptidos de la proteína de unión. El uno o más vectores del sistema de vector puede ser cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, el uno o más vectores son vectores de expresión.
Células hospedadoras aisladas
Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a una célula hospedadora aislada que comprende uno o más polinucleótidos aislados, vectores y/o sistemas de vectores descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula bacteriana (por ejemplo, una célula deE. coli).En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de levadura (por ejemplo, una célula de S.cerevisiae).En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de insecto. Los ejemplos de células hospedadoras de insecto pueden incluir, por ejemplo, células deDrosophila(por ejemplo, células S2), células deTrichoplusia ni(por ejemplo, células High Five™) y células deSpodoptera frugiperda(por ejemplo, células Sf21 o Sf9). En algunas realizaciones, la célula hospedadora es una célula de mamífero. Los ejemplos de células hospedadoras de mamífero puede incluir, por ejemplo, células renales embrionarias humanas (por ejemplo, células 293 o 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspensión), células Expi293TM, células CHO, células de riñón de cría de hámster (por ejemplo, BHK, ATCC CCL 10), células Sertoli de ratón (por ejemplo, células TM4), células de riñón de mono (por ejemplo, CV1 ATCC CCL 70), células de riñón de mono verde africano (por ejemplo, VERO-76, ATCC CRL-1587), células de carcinoma de cuello uterino humano (por ejemplo, HELA, ATCC<c>C<l>2), células de riñón canino (por ejemplo, MDCK, ATCC CCL 34), células de hígado de rata Buffalo (por ejemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmón humano (por ejemplo, W138, ATCC CCL 75), células de hígado humano (por ejemplo, Hep G2, HB 8065), células de tumor de mama ratón (por ejemplo, MMT 060562, ATCC CCL51), células TRI, células MRC 5, células FS4, una línea de hepatoma humano (por ejemplo, Hep G2) y células de mieloma (por ejemplo, células NS0 y Sp2/0).
Otros aspectos de la presente divulgación se refieren a un método de producción cualquiera de las proteínas de unión descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el método incluye a) cultivar una célula hospedadora (por ejemplo, cualquiera de las células hospedadoras descritas en el presente documento) que comprende un ácido nucleico aislado, vector y/o sistema de vector (por ejemplo, cualquiera de los ácidos nucleicos aislados, vectores y/o sistemas de vector descrito en el presente documento) en condiciones tales que la célula hospedadora expresa la proteína de unión; y b) aislar la proteína de unión de la célula hospedadora. Los métodos de cultivo de células hospedadoras en condiciones para expresar una proteína se conocen bien por un experto habitual en la técnica. Los métodos de aislamiento de proteínas de células hospedadoras cultivadas se conocen bien por un experto habitual en la técnica, que incluyen, por ejemplo, por cromatografía de afinidad (por ejemplo, cromatografía de afinidad de dos etapas que comprende cromatografía de afinidad por proteína A seguido por cromatografía de exclusión por tamaño).
Usos de proteínas de unión
Las proteínas de unión se pueden emplear en cualquier método de ensayo conocido, tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directo e indirecto y ensayos de inmunoprecipitación para la detección y cuantificación de uno o más antígenos diana. Las proteínas de unión se unirán al uno o más antígenos diana con una afinidad que es apropiada para el método de ensayo que se emplea.
Para aplicaciones de diagnóstico, en ciertos aspectos de la presente divulgación, las proteínas de unión se pueden marcar con un resto detectable. El resto detectable puede ser uno cualquiera que es capaz de producir, ya sea directa o indirectamente, una señal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S, 125I, 99Tc, 111In o 67Ga; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante.
En otros aspectos de la presente divulgación, las proteínas de unión también son útiles para la obtención de imágenesin vivo.Una proteína de unión marcada con un resto detectable se puede administrar a un animal, preferentemente en la circulación sanguínea, y ensayar la presencia y localización del anticuerpo marcado en el hospedador. La proteína de unión se puede marcar con cualquier resto que sea detectable en un animal, tanto por resonancia magnética nuclear, radiología, como otro medio de detección conocido en la técnica.
Las proteínas de unión también se pueden usar para la activación celular, el direccionamiento tumoral, la neutralización de actividades de citocina, la neutralización de infección vírica, combinación de múltiples acontecimientos de señalización, para tratar cáncer, artritis y/o trastornos inflamatorios. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una proteína de unión se une específicamente a una, dos o tres dianas de antígeno seleccionadas de A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (también conocida como VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (también conocida como MCP-1), CCL3 (también conocida como M iP-1 a), CCL4 (también conocida como MIP-1 b), CCL5 (también conocida como RANTES), CCL7 (también conocida como MCP-3), CCL8 (también conocida como mcp-2), CCL11 (también conocida como eotaxina), CCL15 (también conocida como MIP-1 d), CCL17 (también conocida como TARC), CCL19 (también conocida como MIP-3b), CCL20 (también conocida como MIP-3a), CCL21 (también conocida como MIP-2), CCL24 (también conocida como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (también conocida como TECK), CCL26 (también conocida como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, c D20, CD23 (también conocida como FCER2 , un receptor para IgE), CD24, CD27, CD28 , CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (también conocida como B7-1), CD86 (también conocida como B7-2), CD122, CD137 (también conocida como 41BB), CD137L, CD152 (también conocida como CTLA4), CD154 (también conocida como CD40L), CD160, CD272, CD273 (también conocida como PDL2), CD274 (también conocida como PDL1), CD275 (también conocida como B7H2), CD276 (también conocida como B7H3), CD278 (también conocida como ICOS), CD279 (también conocida como PD-1), CDH1 (también conocida como E-cadherina), quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (también conocida como M-CSF), CSF-2 (también conocida como g M-CSF), CSF-3 (también conocida como GCSF), CX3CL1 (también conocida como SCYD1), CXCL12 (también conocida como SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGf R, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FlA p , FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6 , IL7, IL7Ra, IL8 , IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (también conocida como un receptor para IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, iL35, ITGB4 (también conocida como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (también conocida como un receptor para IL33), STEAP2, cinasa Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, T<r>E<m>1 , TSLP (también conocida como un co-receptor para IL7Ra), TSLPR, TWE<a>K, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM y XCR1 (también conocida como GPR5/CCXCR1). En algunas realizaciones, una o más de las dianas de antígeno anteriores son dianas de antígeno humanas.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se administra a un paciente en necesidad de la misma para el tratamiento o la prevención de cáncer. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la proteína de unión comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína de la superficie de linfocitos T y otro sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral (por ejemplo, dos sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a proteínas de la superficie de linfocitos T y un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral, o dos sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a proteínas diana tumorales y un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína de la superficie de linfocitos T). En ciertas realizaciones, la proteína de unión comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral seleccionada de CD19, CD20, CD38, Her2 y LAMP1. En algunas realizaciones, la proteína de unión se coadministra con un agente quimioterapéutico. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano.
En algunas realizaciones, una proteína de unión de la presente divulgación se administra a un paciente en necesidad de la misma para el tratamiento o la prevención de una enfermedad o trastorno inflamatorio. En algunas realizaciones, la proteína de unión comprende tres sitios de unión al antígeno, cada uno de los cuales se une específicamente a una proteína diana de citocina seleccionada de IL-4, IL-13 y TNFa. En algunas realizaciones, la proteína de unión se coadministra con un agente antiinflamatorio. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano.
La divulgación también se refiere a un kit que comprende una proteína de unión y otros reactivos útiles para detectar niveles de antígeno diana en muestras biológicas. Dichos reactivos pueden incluir una marca detectable, suero bloqueante, muestras de control positivo y negativo, y reactivos de detección. En algunas realizaciones, el kit comprende una composición que comprende cualquier proteína de unión, polinucleótido, vector, sistema de vector y/o célula hospedadora descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, el kit comprende un recipiente y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al recipiente. Recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, bolsas de disolución IV, etc. Los recipientes se pueden formar de una variedad de materiales, tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que, sola o combinada con otra composición, es eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar una afección y pueden tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). En algunas realizaciones, la etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para prevenir, diagnosticar y/o tratar la afección de elección. Alternativamente, o además, el artículo de fabricación o kit puede comprender además un segundo (o tercer) recipiente que comprende un tampón aceptable farmacéuticamente, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, disolución de Ringer y disolución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y de usuario, que incluye otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
Composiciones terapéuticas de proteína de unión y administración de las mismas
Las composiciones terapéuticas o farmacéuticas que comprenden proteínas de unión están dentro del alcance de la divulgación. Dichas composiciones terapéuticas o farmacéuticas pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína de unión, o conjugado proteína de unión-fármaco, en mezcla con un agente de formulación farmacéuticamente o fisiológicamente aceptable seleccionado por su idoneidad con el modo de administración.
Materiales de formulación aceptables son preferentemente no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas.
La composición farmacéutica puede contener materiales de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la tasa de disolución o liberación, la adsorción o la penetración de la composición. Materiales de formulación adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tal escomo ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio), tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos), agentes de carga (tales como manitol o glicina), agentes quelantes (tales como ácido etilendiaminatetraacético (EDTA)), agentes complejantes (tales como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina), cargas, monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas), proteínas (tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas), colorantes, aromatizantes y agentes de dilución, emulsionantes, polímeros hidrófilos (tales como polivinilpirrolidona), polipéptidos de bajo peso molecular, contraiones formadores de sal (tales como sodio), conservantes (tales como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, tiomersal, alcohol fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno), disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol), alcoholes de azúcar (tales como manitol o sorbitol), agentes de suspensión, tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronics; PEG; ésteres de sorbitano; polisorbatos, tales como polisorbato 20 o polisorbato 80; Triton; trometamina; lecitina; colesterol o tiloxapal), agentes potenciadores de la estabilidad (tales como sacarosa o sorbitol), agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metal alcalino -preferentemente sodio o cloruro de potasio- o manitol sorbitol), vehículos de administración, diluyentes, excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos (véase, por ejemplo, REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (18.a Ed., A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990) y ediciones posteriores del mismo).
La composición farmacéutica óptima será determinada por un experto dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración prevista, el formato de administración y la dosis deseada. Dichas composiciones pueden influir en el estado físico, la estabilidad, la tasa de liberaciónin vivoy la tasa de depuraciónin vivode la proteína de unión.
El vehículo o soporte primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o soporte adecuado para inyección puede ser agua, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. Vehículos adicionales a modo de ejemplo son solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina de suero. Otras composiciones farmacéuticas a modo de ejemplo comprenden tampón Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampón acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que pueden incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado. En una realización de la divulgación, las composiciones de proteína de unión se pueden preparar para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado deseado de pureza con agentes de formulación opcionales en forma de una torta liofilizada o una disolución acuosa. Además, la proteína de unión se puede formular como un liofilizado usando excipientes apropiados, tales como sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas de la divulgación se pueden seleccionar para administración parenteral o subcutánea. Alternativamente, las composiciones se pueden seleccionar para inhalación o para administración a través del tubo digestivo, tal como por vía oral. La preparación de dichas composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de la experiencia de la técnica.
Los componentes de formulación están presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. Por ejemplo, se usan tampones para mantener la composición a pH fisiológico o a un pH ligeramente menor, normalmente dentro de un intervalo de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.
Cuando se contempla administración parenteral, las composiciones terapéuticas para su uso pueden estar en forma de una disolución acuosa sin pirógenos, aceptable por vía parenteral, que comprende la proteína de unión deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente adecuado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que una proteína de unión se formula como una disolución isotónica estéril, apropiadamente conservada. Otra preparación más puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (tales como ácido poliláctico o ácido poliglicólico), perlas o liposomas, que proporcionan la liberación controlada o sostenida del producto que entonces se puede administrar por una inyección de liberación prolongada. También se pueden usar ácido hialurónico, y este puede tener el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. Otros medios adecuados para la introducción de la molécula deseada incluyen dispositivos de administración de fármaco implantable.
En una realización, una composición farmacéutica se puede formular para inhalación. Por ejemplo, una proteína de unión se puede formular como un polvo seco para inhalación. También se pueden formular disoluciones para inhalación de proteína de unión con un propulsor para la administración de aerosol. En otra realización más, se pueden nebulizar las disoluciones.
También se contempla que ciertas formulaciones se puedan administrar por vía oral. En una realización de la divulgación, las proteínas de unión que se administran de este modo se pueden formular con o sin los vehículos habitualmente usados en la incorporación mediante mezclado de formas farmacéuticas sólidas, tales como comprimidos y cápsulas. Por ejemplo, una cápsula se puede diseñar para liberar la porción activa de formulación en el momento en el tubo gastrointestinal cuando la biodisponibilidad es máxima y la degradación presistémica es mínima. Agentes adicionales se pueden incluir para facilitar la absorción de la proteína de unión. También se pueden emplear diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes disgregantes de comprimidos y aglutinantes.
Otra composición farmacéutica puede implicar una cantidad eficaz de proteínas de unión en una mezcla con excipientes no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Disolviendo los comprimidos en agua estéril, u otro vehículo apropiado, se pueden preparar disoluciones en forma de dosis unitaria. Excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato cálcico, carbonato sódico o bicarbonato, lactosa, o fosfato de calcio; o aglutinantes, tales como almidón, gelatina o goma arábiga; o agentes lubricantes, tales como estearato de magnesio, ácido esteárico o talco.
Composiciones farmacéuticas adicionales de la divulgación serán evidentes para los expertos en la técnica, que incluyen formulaciones que implican proteínas de unión en formulaciones de administración sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una diversidad de otros medios de suministro sostenido o controlado, tales como soportes de liposomas, micropartículas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices de polímero semipermeables en forma de artículos moldeados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, poli(2-hidroxietil-metacrilato), etileno-acetato de vinilo o ácido poli-D(-)-3-hidroxibutírico. Las composiciones de liberación sostenida también pueden incluir liposomas, que se pueden preparar por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica.
Las composiciones farmacéuticas que se van a usar para administraciónin vivodeben ser normalmente estériles. Esto se puede llevar a cabo por filtración a través de membranas de filtración estériles. Donde la composición se liofiliza, la esterilización usando este método se puede realizar ya sea antes de, o tras, la liofilización y reconstitución. La composición para administración parenteral se puede almacenar en forma liofilizada o en una disolución. Además, en general, se ponen composiciones parentales en un recipiente que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de disolución intravenosa o vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.
Una vez la composición farmacéutica se ha formulado, se puede almacenar en viales estériles como una disolución, suspensión, gel, emulsión, sólido, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones se pueden almacenar ya sea en una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitución antes de administración.
La divulgación también engloba kits para producir una unidad de administración de dosis única. Cada uno de los kits puede contener tanto un primer recipiente que tiene una proteína secada como un segundo recipiente que tiene una formulación acuosa. También se incluyen dentro del alcance de la presente divulgación kits que contienen jeringas de una y múltiples cámaras (por ejemplo, jeringas y liojeringas de líquido).
La cantidad eficaz de una composición farmacéutica de proteína de unión a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, del contexto y objetivos terapéuticos. Por lo tanto, un experto en la técnica apreciará que los niveles de dosis apropiados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la que se usa la proteína de unión, la vía de administración y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño del órgano) y el estado (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el profesional clínico puede ajustar la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo.
La frecuencia de administración dependerá de los parámetros farmacocinéticos de la proteína de unión en la formulación que se usa. Normalmente, un profesional clínico administrará la composición hasta que se alcance una dosis que logra el efecto deseado. Por lo tanto, la composición se puede almacenar administrar como una dosis única, como dos o más dosis (que pueden o pueden no contener la misma cantidad de molécula deseada) con el tiempo, o como una infusión continua por un dispositivo o catéter de implantación. El refino adicional de la dosis apropiada se hace rutinariamente por los expertos habituales en la técnica y está dentro del ámbito de tareas rutinariamente realizadas por ellos. Se pueden determinar dosis apropiadas mediante el uso de datos de dosis apropiada-respuesta.
La vía de administración de la composición farmacéutica es de acuerdo con métodos conocidos, por ejemplo, por vía oral; a través de inyección por vías intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intrarterial, intraportal o intralesional; por sistemas de liberación sostenida; o por dispositivos de implantación. Donde se desee, las composiciones se pueden administrar por inyección en embolada o continuamente por infusión, o por dispositivo de implantación.
La composición también se puede administrar por vía local por implantación de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molécula deseada. Donde se usa un dispositivo de implantación, el dispositivo se puede implantar en cualquier tejido u órgano adecuado, y la administración de la molécula deseada puede ser por difusión, bolo liberado con el tiempo o administración continua.
En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a al menos una de las proteínas de unión descritas en el presente documento para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de una enfermedad proliferativa o trastorno (por ejemplo, cáncer). En algunas realizaciones, comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una de las proteínas de unión descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra en combinación con una o más terapias antineoplásicas (por ejemplo, cualquier terapia antineoplásica conocida en la técnica). En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra antes de la una o más terapias antineoplásicas. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra simultáneamente con la una o más terapias antineoplásicas. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra después de la una o más terapias antirretrovirales.
En algunas realizaciones, la presente divulgación se refiere a al menos una de las proteínas de unión descritas en el presente documento para su uso en un método de prevención y/o tratamiento de una enfermedad o trastorno inflamatorio (por ejemplo, cáncer). En algunas realizaciones, comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos una de las proteínas de unión descritas en el presente documento. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra en combinación con una o más terapias antiinflamatorias (por ejemplo, cualquier terapia antiinflamatoria conocida en la técnica). En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra antes de la una o más terapias antiinflamatorias. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra simultáneamente con la una o más terapias antiinflamatorias. En algunas realizaciones, la al menos una proteína de unión se administra después de la una o más terapias antiinflamatorias.
EJEMPLOS
Los ejemplos que siguen son ilustrativos de realizaciones específicas de la divulgación, y diversos usos de las mismas. Se exponen únicamente a efectos explicativos y no se debe considerar que limitan el alcance de la invención de ninguna manera.
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Se usaron los siguiente materiales y métodos para los experimentos descritos en los Ejemplos 2-5.
D iseño de anticuerpos triespecíficos
Una ilustración esquemática del diseño general de anticuerpos triespecíficos se ilustra en lasFIG. 1A-1C. Se diseñaron anticuerpos triespecíficos individuales basándose en 5 parámetros: 1) selección de sitios de unión al anticuerpo; 2) consideración de la posición de cada sitio de unión; 3) elección de conectores para el brazo de unión biespecífica (es decir, cadena pesada/cadena ligera B en laFIG. 1C); 4). integración de mutaciones de "botón" y "ojal" en mitades respectivas del anticuerpo; 5) elección de isotipo de Fc (IgG1 o IgG4). Después del ensamblaje de las secuencias de aminoácidos para cada molécula triespecífica, se sintetizaron cuatro genes para cada Ab triespecífico usando codones preferidos humanos (CambrY Applied Biosciences, Cambridge, MA, EE. UU.) y se clonaron en un vector de expresión eucariota.
Producción y purificación de anticuerpos triespecíficos
Se produjeron anticuerpos triespecíficos por transfección transitoria de 4 plásmidos de expresión en Expicells 293 usando el kit de transfección de 293 ExpiFectamine<™>(Thermo Fisher Scientific) según el protocolo del fabricante. Brevemente, se diluyó 25 % (p/p) de cada plásmido en Opti-MEM, se mezcló con reactivo ExpiFectamine prediluido durante 20-30 minutos a temperatura ambiente (TA) y se añadió en Expicells 293 (2,5x10<6>células/ml). Se usó frecuentemente una optimización de la transfección para determinar la mejor relación de plásmidos para producir el anticuerpo triespecífico con buen rendimiento y pureza.
4-5 días después de la transfección, el sobrenadante de células transfectadas se recogió y se filtró a través de una unidad de filtro de 0,45 gm (Nalgene). El anticuerpo triespecífico en el sobrenadante se purificó usando un procedimiento de 3 etapas. Primera, se usó purificación por afinidad en proteína A y el Ab unido se eluyó usando "Tampón de elución de IgG" (Thermo Fisher Scientific). Segunda, se dializó el producto contra PBS (pH 7,4) durante la noche con 2 cambios de tampón de PBS. Cualquier precipitado se eliminó por filtración a través de una unidad de filtro de 0,45 gm (Nalgene) antes de la siguiente etapa. Tercera, se usó purificación por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Hiload 16/600 Superdex 200pg, o Hiload 26/600 Superdex 200pg, GE Healthcare) para retirar agregados y diferentes especies en el preparado. Las fracciones se analizaron en SDS-PAGE reducida y no reducida para identificar las fracciones que contenían el anticuerpo triespecífico monomérico antes de combinarlas. El anticuerpo purificado se puede tomar en alícuotas y almacenar a -80 °C a largo plazo.
Ensayos de ELISA
Las propiedades de unión de los anticuerpos purificados se analizaron ya fuera usando métodos de ELISA o SPR. Para ELISA, se usaron antígenos correspondientes para cada sitio de unión en el anticuerpo triespecífico para recubrir una Immuno Plate (Nunc 439454, Thermo Fisher Scientific) de 96 pocillos durante la noche a 4 °C usando 2 gg/ml de cada antígeno en PBS (pH 7,4). La placa recubierta se bloqueó usando 5 % de leche desnatada 2 % de BSA en PBS durante una hora a TA, seguido por lavado con PBS 0,25 % de Tween 20 tres veces (Aqua Max 400, Molecular Devices). Se hicieron diluciones sucesivas de anticuerpos (Ab triespecíficos y de control) y se añadieron a las placas de ELISA (100 gl/pocillo por duplicado), se incubaron a TA durante una hora, seguido por lavado 5 veces con PBS 0,25 % de Tween 20.
Después de lavar, el Fab antihumano secundario conjugado con HRP (1:5000, Cat. n.° 109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc) se añadió a cada pocillo y se incubó a TA durante 30 minutos. Después de lavar 5 veces con PBS 0,25 % de Tween 20, se añadieron 100 gl de TMB Microwell Peroxidase Substrate (KPL, Gaithersburg, MD, EE. UU.) a cada pocillo. La reacción se terminó añadiendo 50 gl de H<2>SO<4>1 M y se midió la DO<450>usando EspectraMax M5 (Molecular Devices) y se analizó usando el software SoftMax Pro6.3 (Molecular Devices). Los datos finales se transfirieron al software GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, EE. UU.) y se representaron como se muestra. La CE50 se calculó usando el mismo software.
E nsayos de SPR
Se seleccionaron dos pares de cadenas pesadas y ligeras para el análisis cinético completo. La caracterización cinética de anticuerpos purificados se realizó usando tecnología de resonancia de plasmones superficiales (SPR) en un BIACORE 3000 (GE Healthcare). Se usó un ensayo de captura usando una captura de anticuerpo específico de marca y orientación de anticuerpos investigados. Para la captura de construcciones de proteína que contienen Fc, se usó el kit de captura de anticuerpo humano (GE Healthcare), para la captura de construcciones de proteína que contienen la marca His, se usó el kit de captura de His (GE Healthcare). El anticuerpo de captura se inmovilizó mediante grupos amina primarios (11000 UR) en un chip CMS de calidad para investigación (GE Life Sciences) usando procedimientos convencionales. El anticuerpo analizado se capturó a un caudal de 10 gl/min con un valor ajustado de UR que daría como resultado la máxima señal de unión al analito de normalmente 30 UR.
Para un ensayo a modo de ejemplo, se compraron IL13 humana recombinante (catálogo n.° IL012) e IL4 humana (catálogo n.° IL004) de Millipore, se compró TNFa humano recombinante (catálogo n.° H8916) de Sigma Aldrich. Se midió la cinética de unión contra IL4 humana recombinante e IL13 a lo largo un intervalo de concentración entre 0,1 a 3 nM para IL4 y 0,8 a 25 nM para IL13. Para TNFa humano, se usó un intervalo de concentración desde 3 hasta 100 nM. Como tampón de ensayo se usó HBS EP (HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y 0,005 % de tensioactivo P20) a un caudal de 30 gl/min. Se generaron superficies de chip con la disolución de regeneración del kit de captura respectivo. Se analizaron los parámetros cinéticos y se calcularon en el paquete de programas BIAevaluation v4.1 usando una celda de flujo sin anticuerpo capturado como referencia y el modelo de unión de Langmuir 1:1 con transferencia de masa. Para estudiar la unión simultánea de antígenos, los anticuerpos triespecíficos fueron capturados por una superficie de captura de anticuerpo anti-humano. Los antígenos se usaron en concentraciones individuales con IL4 a 3 nM, IL13 a 25 nM y TNFa a 100 nM. Para mostrar unión simultánea de los tres antígenos, se inyectó una mezcla de IL4, IL13 y TNFa. En ciclos de análisis separados, se inyectó IL13 sola, seguido por o IL4 o TNFa, y seguido por una inyección conjunta de cualquiera de IL4/TNFa o una inyección conjunta de TNFa/IL4. Se comparó la respuesta final medida en cada ciclo para mostrar similitud de la unión consecutiva de cualesquiera dos o tres antígenos y la unión simultánea de una mezcla de los tres antígenos.
Activación de linfocitos T in vitro y ensayos de proliferación
Se purificaron CMSP humanas de la capa leucocítica comprada de Blood Research Component (Brookline, MA, EE. UU.) usando el método de Ficoll-Paque Plus. Brevemente, se diluyó en primer lugar la capa leucocítica fresca en una relación 1:3 en PBS (pH 7,4) y se mezcló minuciosamente con disolución de Ficoll-Paque Plus (Ficoll) antes de su uso invirtiendo la botella varias veces. Se añadieron 15 ml de medio de gradiente de densidad a cada tubo Leucosep® y se centrifugó durante 30 s a 1000 x g, TA. El medio se encuentra ahora debajo de la barrera porosa. Entonces se vertió cuidadosamente 30-40 ml de capa leucocítica diluida en cada tubo Leucosep, y se centrifugó a 800 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente, con el freno quitado y aceleración máxima a 5. Se retiró la capa de plasma y el resto del sobrenadante, que contenía las CMSP enriquecidas, se transfirió a un tubo nuevo (el tubo Leucosep no se mantuvo en la posición invertida durante más de 2 segundos). Se lavaron las CMSP enriquecidas con 45 ml de PBS y se centrifugaron a 250 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se repitió el lavado y se combinaron múltiples tubos en un tubo. Las células se resuspendieron en 20 ml de PBS y se contaron usando un Bio-Rad TC20.
Para establecer el ensayo de activaciónin vitrode linfocitos T, se resuspendieron CMSP humanas purificadas en medio de cultivo (RPMI1640 con 10 % de FBS y complementado con glutamina/estreptomicina) (Thermo Fisher Scientific) (106 células/ml). Se añadieron concentraciones indicadas de diferentes anticuerpos triespecíficos y de control a cada pocillo, o se usaron para recubrir la placa antes de uso, como se describe en Stebbings, R. et al. (2007) J. Immunol. 179:3325-3331, y se incubaron durante 16-24 horas en una estufa de incubación de cultivo de tejido. Las células se centrifugaron, y el sobrenadante o se recogió para medir la liberación de citocinas, o se desechó. Las células se tiñeron con anticuerpos fluorescentes marcados para marcadores de linfocitos T (CD3, CD4, CD8, etc.) y marcadores de activación (CD69, CD62L, etc.) y se analizaron haciendo pasar las muestras en un citómetro de flujo Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA), seguido por análisis usando el software Flowjo (FlowJo v10) y se representó como se muestra.
Para establecer el ensayo de proliferaciónin vitrode linfocitos T, se resuspendieron CMSP humanas purificadas en medio de cultivo (RPMM640 con 10 % de FBS y complementado con glutamina glutamina/estreptomicina) (Thermo Fisher Scientific) (106 células/ml). Se añadieron concentraciones indicadas de diferentes anticuerpos triespecíficos y de control a cada pocillo y se incubaron durante 1-7 días en una estufa de incubación de cultivo de tejido. Las células se centrifugaron y el sobrenadante o se recogió para medir la liberación de citocinas, o se desechó. Las células se tiñeron con anticuerpos fluorescentes marcados para marcadores de linfocitos T (CD3, CD4, CD8, etc.) y marcadores de activación (CD69, CD62L, etc.) y se analizaron haciendo pasar las muestras en un citómetro de flujo Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA), seguido por análisis usando el software Flowjo (FlowJo v10) y se representó como se muestra.
Ensayo de destrucción celular in vitro
Se usaron CMSP humanas purificadas para ensayos de destrucciónin vitrocontra diversas células cancerosas usando diferentes anticuerpos triespecíficos. Brevemente, el ensayo de destrucción se estableció en una placa de 96 pocillos de fondo en V. Para cada placa, se sembraron 40 ml de CMSP de cada donante a 2x10A6 células/ml y se prepararon 30 ml de células diana marcadas con PKH26 (Sigma n.° MINI26) a 2,5x10A5 células/ml (4 gl de colorante para teñir hasta 1 x10A7 células). Primero, se añadieron 20 gl/pocillo de proteínas de prueba a diversas concentraciones o PMA en cada pocillo, seguido de la adición de 80 gl/pocillo de células diana marcadas en cada pocillo (2x10A4 células/pocillo). Entonces se añadieron 100 gl de CMSP a cada pocillo, alcanzando bien E:T=10:1 (2x10A5 células/pocillo) y se incubaron durante 24 horas en estufa de incubación a 37 °C, 5 % de CO2. Las células se centrifugaron, y el sobrenadante o se recogió para medir la liberación de citocinas, o se desechó. Las células se tiñeron con tampón de tinción Vivid LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell (Life Technologies n.° L34955) (el tampón de tinción se preparó añadiendo 60 gl de reactivo Vivid en 60 ml de PBS). Las células se resuspendieron en 100 gl de tampón de tinción por incubación durante 15 min a TA en la oscuridad. Después de lavar las células con 1xPBS, las células se resuspendieron en 200 gl de PBS con 0,5 % de paraformaldehído, y se recogieron células cancerosas PKH26+Vivid+ por el citómetro de flujo Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA), seguido por análisis usando el software Flowjo. El porcentaje de destrucción se calcula como "destrucción específica - destrucción espontánea / células totales" y se representó como se muestra.
Ensayo de liberación de citocinas
Para medir las concentraciones de citocinas inflamatorias en los ensayos de activaciónin vitro,ensayos de destrucciónin vitro,ensayos de activaciónin vivoen ratones NSG humanizados con células del cordón umbilical CD34+ y el estudio de toxicidad, se recogió el sobrenadante de cultivo celular y se diluyeron muestras de suero según el protocolo del fabricante usando el kit Milliplex Human High Sensitivity T cell 13-plex (EMD Millipore). Estas se analizaron posteriormente por el sistema EMD Millipore MAGPIX® y el software MILLIPLEX® Analyst 5.1.
Modelos de ratón in vivo y estudios de eficacia
Se usaron ratones NSG injertados con células madre hematopoyéticas CD34+ humanas (hu-CD34) como un modelo de ratónin vivo.Estos ratones desarrollan células inmunitarias humanas multilinaje y son una plataforma validada para estudios de eficacia de inmunooncología (véase, por ejemplo, Shultz, L.D. et al. (2014) Cold Spring Harb. Protoc.
2014:694-708). Se producen ratones NSG hu-CD34+ inyectando células madre hematopoyéticas CD34+, que muestran injerto multilinaje eficaz de poblaciones inmunitarias humanas de células que incluyen linfocitos T, linfocitos B y algunas otras poblaciones (McDermott, S.P. et al. (2010) Blood 116:193-200). La hematopoyesis multilinaje ocurre en 12 semanas. El injerto es estable durante más de un año sin enfermedad injerto contra huésped.
Para el estudio de eficacia usando ratones NSG hu-CD34, se compraron ratones de The Jackson Laboratory (Maine, EE. UU.) y se validaron poblaciones de células humanas antes de uso. En general, se usaron 5x106 células tumorales mezcladas en Matrigel (BD Biosciences) (50 % v/v) para inocular el tumor en cada ratón. Una vez el tamaño del tumor alcanzó el intervalo de 100-150 mm3, los ratones se seleccionaron y aleatorizaron en cada grupo para el estudio. Se administraron anticuerpos por vía intravenosa a dosis dadas 3 veces a la semana. Se monitorizó el peso corporal 1-3 veces a la semana. Se midió el tamaño del tumor por mediciones de tumor con compás calibrador 1 -3 veces/semana. Todos los ratones se sacrificaron cuando el tamaño del tumor alcanzó 1.500 mm3, o 24 horas después de la última dosis. Se recogieron muestras de sangre terminal (0,3 ml) en tubos separadores de suero, se mezclaron invirtiendo suavemente cinco veces y se pusieron en una gradilla para tubos. También se recogieron tumores terminales y se pesaron antes de poner en fijador para el análisis de inmunohistoquímica.
Se usaron ratones NSG humanizados con CMSP humanas (hu-PBMC) como otro modelo de ratónin vivo.Estos ratones se producen inyectando CMSP humanas purificadas de donantes sanos, que tienen la tasa de injerto más rápida usando células mononucleares de sangre periférica adultas y permiten estudios a corto plazo que requieren una fuerte función efectora y de linfocitos T de memoria y células NK, y son adecuados para estudio a corto plazo de eficacia (3-4 semanas) debido a la enfermedad injerto contra huésped.
Para el estudio de eficacia usando ratones NSG hu-PBMC, se compraron ratones NSG de 8-10 semanas de edad (Cat. n.°: 005557, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/SzJ) de The Jackson Laboratory (Maine, EE. UU.). Cada ratón se inoculó con 5x106 células tumorales mezcladas en Matrigel (BD Biosciences) (50 % v/v). Una vez el tamaño del tumor alcanzó el intervalo de 50-100 mm3, se reconstituyeron 10x106 CMSP humanas de un donante sano a cada ratón. La reconstitución de células humanas se validó al día siguiente. Una vez el tamaño del tumor alcanzó el intervalo de 100 150 mm3, los ratones se seleccionaron y aleatorizaron en cada grupo para el estudio. Se administraron anticuerpos por vía intravenosa a dosis dadas 3 veces a la semana. Se monitorizó el peso corporal 1-3 veces a la semana. Se midió el tamaño del tumor por mediciones de tumor con compás calibrador 1-3 veces/semana. Todos los ratones se sacrificaron cuando el tamaño del tumor alcanzó 1.500 mm3, o 24 horas después de la última dosis. Se recogieron muestras de sangre terminal (0,3 ml) en tubos separadores de suero, se mezclaron invirtiendo suavemente cinco veces y se pusieron en una gradilla para tubos. También se recogieron tumores terminales y se pesaron antes de poner en fijador para el análisis de inmunohistoquímica.
Tolerabilidad de N H P y estudio farm acocinético
Todos los estudios de NHP se llevaron a cabo por Covance (Princeton, New Jersey, EE. UU.) según el protocolo ICUCA de Covance. Se usaron macacos cangrejeros macho sin tratamiento previo con fármaco y proteína o sin tratamiento previo con proteína en todos los estudios. Basándose en el diseño del estudio, se seleccionaron monos y se agruparon para cada anticuerpo triespecífico. El anticuerpo se administró por infusión intravenosa durante 1 hora por la vena safena. Se administraron dosis crecientes en días consecutivos para dosis bajas (<10 pg/kg), pero con un intervalo de 1 -2 días para dosis mayores (> 10 pg/kg) para fines de observación. Se recogieron muestras de sangre a 0 horas (día 1 solo), 0,5 horas (medio de la infusión), 1 y 6 horas desde el inicio de la infusión para todos los animales después de cada dosis, según se especifica. Se recogieron muestras de sangre no programadas adicionales a criterio del director del estudio, anatomopatólogo y/o veterinario clínico. Se devolvieron todos los animales a la colonia en el día 60. Se prepararon CMSP y suero de las muestras de sangre usando métodos convencionales, y se conservaron para el análisis futuro.
E nsayo ind icador de luciferasa
Se compraron células de Jurkat IL2-luc2P GloResponse™ de descongelar y usar (artículo de Promega n.° CS 187002) y células de Jurkat GloResponse™ NFAT-Luc2 (cat. de Promega n.° CS 176401) de Promega (WI, EE. UU.) y se prepararon para su uso según el protocolo del fabricante.
Brevemente, las células se descongelaron durante 2 min en un baño de agua a 37 °C y se transfirieron suavemente a un tubo cónico de centrifugadora de 15 ml que contenía 10 ml de medio R10 precalentado. El tubo se centrifugó a 300 g durante 5 min a TA. Se retiró el sobrenadante, y las células se resuspendieron en 20 ml de medio R10 precalentado y se transfirieron a un matraz de cultivo de 75 cm2, seguido por incubación en una estufa de incubación de tejido de cultivo de 37 °C hasta que las células crecieron y fueron estables (~3-4 días). Las células se dividieron dos veces a la semana hasta 0,1e6 células/ml. Las células se mantuvieron en medio R10 higromicina B para la selección. Las células se usaron para ensayos ~7 días después de la descongelación.
Para la estimulación de anticuerpos, se prepararon anticuerpos triespecíficos o de control a diversas concentraciones y se diluyeron en serie en PBS. Se dispensaron 25 gl de anticuerpos por pocillo. Para Ab unidos a placa, se usó la placa Maxisorp y se incubó a 4 °C durante la noche. Para Ab solubles, se usó una placa de fondo en U. Se resuspendieron las células indicadoras hasta 0,3-0,5 e6/ml y se añadieron 175 ul de células a cada pocillo, y se incubaron en estufa de incubación a 37 °C, CO<2>durante 6 horas. La placa se sacó entonces de la estufa de incubación y se dejó que se equilibrara hasta temperatura ambiente (10-15 min). Entonces se añadieron 50 gl de reactivo Bio-Gio<™>(cat. de Promega n.° G7941) (temperatura ambiente) a cada pocillo de la placa de ensayo. Después de incubar durante 5 minutos, se midió la actividad de luminiscencia usando el contador de microplacas MicroBeta2 LumiJET (Perkin Elmer; tiempo de 1.a lectura). Los datos se representaron usando el software GraphPad Prism.
E stab ilidad conform acional
Se determinaron mediciones de termoestabilidad (por ejemplo, puntos de fusión, T<m>) usando fluorimetría diferencial de barrido (DSF). Las muestras se diluyeron en tampón D-PBS (Invitrogen) a una concentración final de 0,2 gg/gl que incluye una disolución 4x concentrada de colorante SYPRO-Orange (Invitrogen, disolución madre 5000x en DMSO) en D-PBS en placas de 96 pocillos blancas con semifaldón (BIORAD). Todas las mediciones se hicieron por duplicado usando un instrumento de PCR en tiempo real MyiQ2 (BIORAD). Se generaron curvas de la primera derivada negativa (-d(RFU)/dT) de las curvas de fusión en el software iQ5 v2.1 (BIORAD). Los datos se exportaron entonces a Microsoft Excel para la determinación de Tm y la presentación gráfica de los datos.
M ediciones de C I50
Detección de la actividad de anticuerpos contra IL-4 y IL-13 con una estirpe celular indicadora
Se determinaron las actividades de anticuerpos biespecíficos o derivados contra citocinas IL4 e IL13 en células indicadoras HEK-Blue IL-4/IL-13 disponibles comercialmente (InvivoGen). Se diseñan células HEK-Blue IL-4/IL-13 para monitorizar la activación de la vía de STAT6 por IL-4 o IL13. La estimulación de las células con cualquier citocina da como resultado la producción de fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) por gen que se puede medir en el sobrenadante de cultivo con el ensayo QUANTI-Blue. Para probar las actividades de anticuerpo contra IL4 o IL13, las citocinas se preincubaron durante 1 hora con diferentes concentraciones de los anticuerpos y se añadieron a 50.000 células HEK-Blue IL-4/IL-13. Se midió la inducción de SEAP mediada por citocina después de 24 horas de incubación en el sobrenadante de cultivo celular con el ensayo QUANTI-Blue (InvivoGen). Cada experimento se realizó con n = 3 puntos de datos para cada concentración de anticuerpo. Se calculó la concentración inhibidora al 50 % (CI50) para cada anticuerpo por la aplicación interna Biostat-Speed V2.0 (Sanofi).
Detección de actividad de anticuerpos contra TNFa con una estirpe celular indicadora
Se determinaron las actividades de anticuerpos biespecíficos o derivados contra TNFa usando células indicadoras HEK-Blue TNF-a disponibles comercialmente (InvivoGen). Se diseñan células HEK-Blue TNF-a para detectar TNFa bioactivo monitorizando la activación de la vía de NFkB por la expresión de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada (SEAP) por gen indicador que se puede medir en el sobrenadante de cultivo con un ensayo QUANTI Blue (InvivoGen). Para determinar las actividades de anticuerpo contra TNFa, las citocinas se preincubaron durante 1 hora con diferentes concentraciones de los anticuerpos y se añadieron a 50.000 células HEK Blue TNF-a. Se midió la inducción de SEAP mediada por citocina después de 24 horas en el sobrenadante de cultivo con el ensayo QUANTI-Blue (InvivoGen). Cada experimento se realizó con n = 3 puntos de datos para cada concentración de anticuerpo. Se calculó la concentración inhibidora al 50 % para cada anticuerpo.
Ejemplo 2: Visión general de las proteínas de unión triespecíficas
Se desarrolló una novedosa estrategia para la generación de proteínas de unión triespecíficas. Las proteínas triespecíficas comprendieron cuatro polipéptidos que formaron tres sitios de unión diana(FIG. 1A-C). Cada sitio de unión diana comprendió el dominio Vh y Vl de un anticuerpo que se dirigió a una diana de antígeno humano distinta (véase, por ejemplo, laTabla 1). Las proteínas de unión triespecíficas contuvieron un primer par de polipéptidos que poseyeron dominios variables dobles que tienen una orientación cruzada que forman dos sitios de unión al antígeno distintos (llamado el formato de Ig de CODV) y un segundo par de polipéptidos, cada uno con un único dominio variable que formó un tercer sitio de unión al antígeno(FIG. 1A y 1B).
Tabla 1: SEQ ID NO de cadena pesada y ligera para proteínas de unión 1-21, y los antígenos diana a los que iri n l r ín ni n
El primer par de polipéptidos (que poseyeron los dominios variables dobles) comprendió un primer polipéptido que tiene la estructura VL2-Conector-VL1-Conector-Dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo polipéptido que tiene la estructura Vm-Conector-VH2-Conector-Dominio constante de la cadena pesada Ch1 de inmunoglobulina, dando como resultado un par de polipéptidos que tuvieron una orientación cruzada que formaron dos sitios de unión al antígeno distintos: Vh1-Vl1 y Vh2-Vl2 (FIG. 1C,véanse las cadenas ligeras y pesadas B). LaTabla Aproporciona un resumen del diseño del brazo biespecífico (es decir, el brazo que comprende cadenas pesadas y ligeras B) de variantes de IgG 1 e IgG4 de proteínas de unión triespecíficas representativas, que incluye indicar las diversas combinaciones de los conectores usados en el brazo biespecífico de las proteínas de unión triespecíficas. Un segundo par de polipéptidos (cada uno de los cuales poseyó un único dominio variable) comprendió un primer polipéptido que tenía la estructura VH3-Dominio constante de la cadena pesada Ch1 de inmunoglobulina, y un segundo polipéptido que tenía la estructura VL3-Dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina, dando como resultado un par de polipéptidos que formaron un tercer sitio de unión al antígeno: Vh3-Vl3 (FIG. 1C,véanse las cadenas ligeras y pesadas A). Además, las proteínas de unión triespecíficas se construyeron de forma que cualquiera de los dominios Ch3 pudiera incluir una modificación de botón u ojal para facilitar la heterodimerización de anticuerpos(FIG. 1).
Tabla A: Resumen del diseño del brazo biespecífico de las proteínas de unión triespecíficas como IgG1 (ojal) o I G4 oal
Ejemplo 3: Actividad de unión in vitro y destrucción específica mediada por anticuerpo de acopladores de linfocitos T
Este ejemplo describe ensayosin vitropara caracterizar las actividades de acopladores de linfocitos T.
Usando el enfoque descrito en el Ejemplo 2 anterior para el diseño de proteínas de unión triespecíficas, se generaron cuatro proteínas de unión triespecíficas (proteínas de unión 1, 3, 5 y 6). Estas proteínas de unión triespecíficas se crearon injertando en una región estructural de la proteína de unión triespecífica los dominios VH y VL aislados de anticuerpos que se dirigen a distintas proteínas humanas: CD3, CD19, CD28, CD38 o Her2. La proteína de unión 1 se construyó de forma que el primer par de polipéptidos (que formó dos sitios de unión al antígeno) se dirigiera a CD28 y CD3 y el segundo par de polipéptidos (que formó el sitio de unión al antígeno único) se dirigiera a Her2 (proteína de unión 1 = Her2 x (CD28 x CD3)). La proteína de unión 3 se construyó de forma que el primer par de polipéptidos (que formó dos sitios de unión al antígeno) se dirigiera a CD28 y CD3 y el segundo par de polipéptidos (que formó el sitio de unión al antígeno único) se dirigiera a CD19 (proteína de unión 3 = CD19 x (CD28 x CD3)). La proteína de unión 5 se construyó de forma que el primer par de polipéptidos (que formó dos sitios de unión al antígeno) se dirigiera a CD28 y CD3 y el segundo par de polipéptidos (que formó el sitio de unión al antígeno único) se dirigiera a CD38 (proteína de unión 5 = CD38 x (CD28 x CD3)). La proteína de unión 6 se construyó de forma que el primer par de polipéptidos (que formó dos sitios de unión al antígeno) se dirigiera a CD28 y CD3 y el segundo par de polipéptidos (que formó el sitio de unión al antígeno único) se dirigiera a CD38 (proteína de unión 6 = CD38 x (CD28 x CD3)).
Ensayos in vitro usando proteínas de unión triespecíficas que comprenden anti-Her2
Para probar la capacidad de las proteínas de unión triespecíficas para dirigirse y unirse a tres antígenos humanos diferentes, se examinó en primer lugar por ensayo de ELISA la especificidad de la proteína de unión 1 por sus dianas. La proteína de unión 1 fue capaz de unirse a las tres de sus proteínas diana -CD3, CD28 y Her2 (FIG. 2)- que indica que cada dominio de unión en el formato triespecífico retuvo su función
Se marcaron células ZR-75-1, AU565 (Her2+), ARH-77 (CD19+), MOLP-8 , RPMI-8226, KMS-12_BM, NCI-H929, MM.1S, MM.1R, OPM-2, KMS-26 y U266 (CD38+) con el colorante de membrana PKH-26 (Sigma) y se usaron como células diana en un ensayo de citotoxicidad. Estas estirpes celulares marcadas se cocultivaron en una relación E:T de 10:1 con linfocitos T Pan humanos enriquecidos en presencia de concentraciones crecientes de un anticuerpo triespecífico, anticuerpo biespecífico o proteínas de control durante 24 horas. El grado de lisis celular en las células diana se determinó por tinción con un marcador de células vivas/muertas (Life Technologies) y midiendo el número de células muertas en la población de células diana marcada sometiendo las muestras a un citómetro de flujo Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA) seguido por análisis usando el software FlowJo (FlowJo v10).
Se tiñeron estirpes celulares de tumor Her2+, CD19+, CD38+ con anticuerpos contra CD3 humano conjugados fluorescentemente, CD28, CD19, CD38, LAMP1 y/o Her2 (Biolegend). También se incluyó tinción con anticuerpos de control de isotipo equiparable respectivos. Las células se adquirieron entonces en el instrumento Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA). El análisis de flujo se realizó en FlowJo v10. Los resultados de la destrucción mediada de diversas proteínas de unión se muestran en lasFIG. 3A-5, 9A, 9By11A-16.
Se probó la capacidad de la proteína de unión 1 para inducir la destrucción mediada por anticuerpo de células tumorales que expresan proteínas HER2 sobre su superficie. No solo la proteína de unión 1 fue capaz de unirse a las tres de sus proteínas diana, sino que también fue capaz de inducir la destrucción celular mediada por anticuerpo de estirpes celulares Her2+(FIG. 3A-4). La proteína de unión 1 presentó potentes actividades de destrucción de células mediada por anticuerpo, mientras que Ab biespecíficos anti-CD3/CD28 y anticuerpos anti-Her2 mostraron actividades de destrucción mínimas (FIG. 3A, 3b , 4 y 5), lo que demuestra la eficacia de uso del Ab biespecífico para acoplarse a células tumorales con linfocitos T a través de un antígeno de tumor (HER2) y marcadores de linfocitos T (CD3 y CD28). Anti-CD3/CD28 no solo es importante para el reclutamiento de linfocitos T, sino que también proporciona activación más eficaz de linfocitos T y señalización de supervivencia, lo que mejora posiblemente la eficacia.
Además, se llevaron a cabo estudios en activación y proliferación de linfocitos Tin vitro, así como producción de citocinas, usando el anticuerpo triespecífico anti-Her2 x CD28 x CD3 (proteína de unión 1). Se usaron la proteína de unión 1 y variantes de control que tienen uno o dos dominios de unión inactivados por mutagénesis dirigida al sitio (ACD28: inactivado por anti-CD28; ACD3: inactivado por anti-CD3; A(CD3xCD28): inactivado tanto por anti-CD3 como anti-CD28) en el ensayo de activaciónin vitrode CMSP humanas como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que se la proteína de unión 1 activó tanto los linfocitos T CD4 primarios humanos como los linfocitos T CD8 eficazmentein vitro.La inactivación de anti-CD28 redujo la potencia de activación, que indica la importancia de la vía de coseñalización anti-CD28. La inactivación del sitio de unión anti-CD3 llevó la proteína de unión 1 a actividad mínima, lo que indica que anti-CD3 proporcionó la señalización de activación primaria de linfocitos T(FIG. 6A y 6B). Se obtuvieron resultados similares usando estirpes de linfocitos T humanos indicadores de IL2 y NFAT (Jurkat-IL2 y Jurkat-NFAT)(FIG. 7A-7C).
Ensayos in vitro usando proteínas de unión triespecíficas que comprenden anti-CD19
La proteína de unión triespecífica anti-CD19 x CD28 x CD3 fue capaz de unirse a sus antígenos diana(FIG. 8), que indica que cada dominio de unión en el formato triespecífico retuvo su función
La proteína de unión triespecífica anti-CD19 x CD28 x CD3 también fue capaz de inducir la destrucción celular mediada por anticuerpo de células CD19+(FIGS. 9A-9N). Similarmente, la proteína de unión triespecífica anti-CD19 x CD28 x CD3 presentó una potente actividad de destrucción contra células de linfoma humano, mientras que tanto los anticuerpos anti-CD3/CD28, anti-CD19 como de control de isotipo mostraron actividades destructoras mínimas, lo que demuestra la eficacia de uso del Ab triespecífico para acoplar células tumorales con linfocitos T a través de un antígeno de tumor (CD19) y marcadores de linfocitos T (CD3 y CD28).
Ensayos in vitro usando proteínas de unión triespecíficas que comprenden anti-CD38
Como se observa con las proteínas de unión 1 y 3, la proteína de unión 5 fue capaz de unirse a sus tres proteínas diana (CD3, CD28 y CD38), como se evaluó por el ensayo de ELISA(FIG. 10), que indica que cada dominio de unión en la forma triespecífica retuvo su función
También se descubrió que la proteína de unión 5 inducía la destrucción de células mediada por anticuerpo de células(FIG. 11A-15D)contra 9 células de mieloma múltiple humano con diversos niveles de expresión de CD38 y CD28 (véanse lasFIG. 11D, 12D y 13D). Similarmente, la proteína de unión triespecífica 5 presentó una potente actividad de destrucción contra células de mieloma múltiple humano, mientras que tanto los anticuerpos anti-CD38 como de control de isotipo mostraron actividades de destrucción mínima, lo que demuestra la eficacia de uso del Ab triespecífico para acoplar células tumorales con linfocitos T a través de antígenos de tumor (CD38 y CD28) y marcadores de linfocitos T (CD3 y CD28). El anticuerpo de control anti-CD3/CD28 biespecífico también mostró actividad de destrucción marginal contra células de<m>M CD28+, véanse lasFIG. 11B, 12A-C y 13A-C).
Estos resultados demuestran que la plataforma de anticuerpos triespecíficos descrita en el presente documento proporciona la posibilidad de integrar sitios de unión para dos marcadores tumorales, o dos sitios de unión para marcadores de linfocitos T, lo que permite flexibilidad para diseños científicos y diversas aplicaciones. La proteína de unión 5 también fue eficaz contra 5 estirpes celulares de linfoma humano CD38+ (FIG. 14C y 15D), que muestran potentes actividades de destrucción (FIG. 14A-B y 15A-C).
Se probó la destrucción de células mediada por anticuerpo contra múltiples estirpes celulares de mieloma RPMI8226 usando las proteínas de unión 5 y 6 , y se calcularon y se compararon sus CE<50>con las de un anticuerpo biespecífico de formato CODV que se dirigía a CD28 y CD3 (FIG. 16y Tabla B). Las proteínas de unión 5 y 6 solo se diferencian en el dominio de unión anti-CD28; la proteína de unión 5 contiene un superagonista anti-CD28, mientras que la proteína de unión 6 contiene un anti-CD28 convencional. La proteína de unión 5 mostró actividad de destrucción más potente.
Tabla B: Valores de CE<50>calculados para proteínas de unión biespecíficas triespecíficas
Se probó la actividad de la proteína de unión triespecífica 5 anti-CD38 x CD28 x CD3 y variantes de control que tenían uno o dos dominios de unión inactivados por mutagénesis dirigida al sitio (ACD28: inactivado por anti-CD28; ACD3: inactivado por anti-CD3; A(CD3xCD28): inactivado tanto por anti-CD3 como por anti-CD28) usando estirpes de linfocitos T indicadores de IL2 y NFAT (Jurkat-IL2 y Jurkat-NFAT) en el ensayo de activaciónin vitrocomo se describe en el Ejemplo 1. Los resultados mostraron que la proteína de unión 5 activó tanto los promotores IL2 como NFAT humanos eficazmentein vitro(FIG. 17A y 17B). La inactivación de anti-CD28 redujo la potencia de activación, que fue más destacada para el indicador IL2, que indica la importancia de la vía de coseñalización anti-CD28. La inactivación del sitio de unión anti-CD3 llevó la proteína de unión 5 a actividad mínima, lo que sugiere que anti-CD3 proporcionó la señalización de activación primaria de linfocitos T.
Ejemplo 4: Actividad in vivo de los acopladores de linfocitos T
Este ejemplo describe experimentos que caracterizan las propiedades y actividades de acopladores de linfocitos T que contienen anti-Her2 o anti-CD38in vivo.
Ensayos in vivo usando proteínas de unión triespecíficas que comprenden anti-Her2
Se llevó a cabo un estudio de aumento de dosis usando el anticuerpo triespecífico Her2 x CD28 x CD3 en primates no humanos(FIG. 18A-18E)como se describe en el Ejemplo 1. Los tres dominios de unión en la proteína de unión 1 reaccionan de forma cruzada con CD3/CD28/HER2 de mono. Se ideó un estudio de toxicidad de aumento de dosis para evaluar el posible perfil de toxicidad de molecular. Se recogieron muestras de sangre para aislamientos de suero y CMSP. Se investigaron poblaciones de linfocitos T circulantes después de cada administración(FIG. 18A y 18B), junto con la activación de la subpoblación de linfocitos T (CD69+)(FIG. 18C y 18D). El porcentaje de linfocitos T CD4 y CD8 en circulación aumentó a aumento de dosis baja, pero con el tiempo disminuyó a aumento de dosis alta. Solo destacó la significativa activación de linfocitos T CD4 y CD8 a dosis de 100 pg/kg, lo que indica más bien una dosis tolerable relativa alta. También se midió el nivel en suero de varias citocinas. Solo se observó una liberación significativa de citocinas a la mayor dosis (100 pg/kg;FIG. 18E).
A continuación, se examinó el efecto del anticuerpo triespecífico de proteína de unión 1 anti-Her2 x CD28 x CD3 sobre el crecimiento tumoral en modelos de ratón humanizados como se describe en el Ejemplo 1(FIG. 19A-20H). LasFIG.
19A y 19Bresumen los resultados obtenidos usando el modelo de ratón NSG injertado con células madre hematopoyéticas humanas CD34+ (hu-CD34) inoculado con la línea BT474 de cáncer de mama HER2+ humano. Fueron evidentes actividades antitumorales significativas en todos los grupos de dosis. La actividad antitumoral fue dependiente de la dosis, que es estadísticamente diferente en comparación con el grupo de control a 25 pg/kg. No se observó pérdida significativa de peso corporal en los grupos tratados observados.
Se hizo un 2.° estudio in vivo usando el modelo de ratón NSG reconstituido con CMSP humanas inoculado con la línea BT474 de cáncer de mama HER2+ humano(FIG. 20A-20H). Se observaron actividades antitumorales significativas en los grupos de dosis alta (100 y 500 pg/kg). El encogimiento tumoral se observó en el 40 % de los ratones en el grupo de 500 pg/kg. La actividad antitumoral fue dependiente de la dosis. La actividad antitumoral en grupos tratados con dosis de 100 y 500 pg/kg fue significativamente mejor que en los grupos tratados con anti-HER2 (0,1 a 10 mg/kg), que indica actividad antitumoral superior de la proteína de unión 1. No se observó pérdida significativa de peso corporal en ningún grupo tratado.
Ensayos in vivo usando proteínas de unión triespecíficas que comprenden anti-CD38
Se realizó un estudio de aumento de dosis en primates no humanos usando el anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD3 (proteína de unión 5) como se describe en el Ejemplo 1(FIG. 21A-21F). Dos de los tres dominios de unión en la proteína de unión 5 reaccionan de forma cruzada con CD3 y CD28 de mono. Se ideó un estudio de toxicidad de aumento de dosis para evaluar el posible perfil de toxicidad de la molécula. Se recogieron muestras de sangre para aislamientos de suero y CMSP. Se investigaron poblaciones de linfocitos T circulantes después de cada administración (FIG.21A y 21B, gráficos de barras), junto con la activación de subpoblaciones de linfocitos T (CD69+) (FIG. 21A y 21B, gráficos de líneas). El porcentaje de linfocitos T CD4 y CD8 en circulación aumentó a aumento de dosis baja, pero con el tiempo disminuyó a aumento de dosis alta. Solo destacó la significativa activación de linfocitos T CD4 y CD8 a dosis de 100 pg/kg, lo que indica más bien una dosis tolerable relativa alta. También se midió el nivel en suero de varias citocinas. Solo se observó una liberación significativa de citocinas a la mayor dosis (100 pg/kg;FIG.
21C-21F).
A continuación, se probó la actividadin vivodel anticuerpo triespecífico anti-CD38 x CD28 x CD3 en ratones humanizados(FIG. 22A-23D)como se describe en el Ejemplo 1. LasFIG. 22A-22Cresumieron el resultado de un estudio piloto de determinación de dosis usando el modelo de ratones NSG injertados con células madre hematopoyéticas CD34+ humanas (hu-CD34) implantados con la estirpe celular RPMI-8226 de MM humano transducida con CD38 y PD-L1, tratados con proteína de unión 5 a dosis de 5, 50 y 100 pg/kg. Solo fue evidente actividad antitumoral significativa en el grupo tratado con 5 pg/kg(FIG. 22A). Se observó infiltración de linfocitos T CD8 en los ratones tratados con proteína de unión 5 (5 pg/kg) (FIG. 22B y 22C).
Se realizó un estudio de seguimiento en el mismo en modelo usando la proteína de unión 5 a dosis desde 0,04-5 pg/kg(FIG. 23A-23D). Se mostró actividad antitumoral significativa en todos los grupos tratados con la proteína de unión 5(FIG. 23B), fueron estadísticamente diferentes del control al final del estudio
significativa de peso corporal en ninguno de los grupos tratados(FIG. 23A). Se observó inducción dependiente de la dosis de citocinas inflamatorias del suero IFN-y, TNF-a e IL-2 cuatro horas después de la primera dosis en ratones tratados con concentraciones indicadas de la proteína de unión 5 o control de PBS(FIG. 23D), que indica activación eficaz de linfocitos T por la proteína de unión triespecífica 5in vivo.
Se inyectaron i.v. ratones NSG CD34+ humanizados (n=3) con 100 mcg/kg de Ab triespecífico (triángulo), Ab biespecífico (cuadrado) o Ab monoespecífico (círculo). La activación de linfocitos T CD4+ o CD8+ se midió a 0 (preinyección), 1,24 y 72 horas después de la inyección de Ab por determinación del aumento medio en el % de CD69, disminución del % de CD62L y/o concentración de citocinas inflamatorias en plasma en cada punto de tiempo por la tecnología múltiple xMAP de Luminex. Los resultados de activación de linfocitos T de diversos anticuerpos triespecíficos se muestran en lasFIG. 24-26C.
Se estudió la activación de linfocitos T sistémica in vivo en el modelo de ratones NSG injertados con células madre hematopoyéticas CD34+ humanas (hu-CD34) después de la administración de la proteína de unión 5, anticuerpo biespecífico anti-CD3/CD28_IgG4 y controles de anticuerpo IgG4 anti-CD28(FIG. 24). Se administraron 100 gg/kg de la proteína de unión 5 y anticuerpos de control en 3 ratones/grupo. Se recogieron muestras de sangre antes de la administración, 1 hora, 24 horas y 72 horas después de la administración. Se aislaron sueros de ratón y linfocitos T humanos de sangre, y se conservaron para el análisis de activación de linfocitos T y para la medición del nivel de citocinas en suero. LasFIG. 24 y 25muestran que tanto los linfocitos T CD4 como CD8 humanos se activaron 1 hora después de la infusión de anticuerpos, que volvió al nivel basal a las 72 horas. LasFIG.26A-26Cmuestran la elevación de la liberación de IFN-y, TNF-a e IL-2 en suero en los mismos ratones, que se observó 1 hora después de la infusión, y volvió al nivel basal 24 horas después. Estos resultados demostraron que tanto la proteína de unión 5 como el anticuerpo biespecífico IgG4 anti-CD3/CD28 son eficaces en activar el linfocito T en el modelo animal dado, que hace que sea adecuado para el estudio de eficacia in vivo.
Ejemplo 5: Caracterización de proteínas de unión triespecíficas y biespecíficas-trivalentes dirigidas a citocina
El siguiente ejemplo describe experimentos que caracterizan la estabilidad, propiedades de unión y actividades de novedosas proteínas de unión triespecíficas y biespecíficas-trivalentes que se dirigen a citocinas humanas.
Se diseñaron proteínas de unión triespecíficas (por ejemplo, que se unen a tres proteínas diana diferentes; proteínas de unión 9-15), así como proteínas de unión biespecíficas-trivalentes (por ejemplo, que se unen a un antígeno bivalentemente en un antígeno monovalentemente; proteínas de unión 16-19) (Tabla C). Con la excepción de la proteína de unión 11 donde un dominio constante kappa se usó en tanto CODV-LC como LC del brazo Fab, todas las otras proteínas de unión (9-10 y 12-19) se produjeron con un dominio constante kappa en CODV-LC y un dominio constante lambda en LC del brazo Fab. Como esqueleto de Fc se usó la secuencia de IgG1. Mientras que CODV-HC aloja las mutaciones RF de botón (S354C, T366W; H435R y Y436F), HC del brazo Fab contiene las mutaciones de ojal (Y349C, T366S, L368A, Y407V).
T l : R m n l r ín ni n ri ífi riv l n iri i n i-IL-4 IL-1 TNF
Se produjeron y purificaron proteínas de unión triespecíficas y biespecíficas-trivalentes como se ha descrito anteriormente(FIG. 27).
T l D: P rifi i n r E r ín ni n 1 -1
Para evaluar la estabilidad de las proteínas de unión triespecíficas, se evaluó su punto de fusión por DSF y se comparó con la termoestabilidad de los anticuerpos parentales (Tabla E).
Tabla E: Resumen de la termoestabilidad por DSF y porcentaje de monómeros de cromatografía de exclusión por tamaño preparativa para diversas proteínas de unión triespecíficas
Para evaluar la afinidad de unión de cada dominio de unión a anticuerpo único dentro del formato triespecífico, se realizó análisis de SPR para cada antígeno único como se describe previamente. Los resultados se evaluaron comparativamente con las afinidades de anticuerpos parentales (Tablas F, G y H).
Tabla F: Resumen de resultados de resonancia de plasmones superficiales para IL-4 para diversas proteínas de unión triespecíficas
Tabla G: Resumen de resultados de resonancia de plasmones superficiales para IL-13 para diversas proteínas de unión triespecíficas
Tabla H: Resumen de resultados de resonancia de plasmones superficiales para TNFa para diversas proteínas de unión triespecíficas
Para evaluar la actividad de neutralización de las proteínas de unión triespecíficas, se realizó un ensayo celular usando diferentes kits HEK Blue (Invivogen). Se preincubaron las citocinas con diferentes concentraciones de anticuerpos anti-citocina durante 30 minutos a temperatura ambiente en una placa de 96 pocillos. Los controles incluyeron el uso de solo la citocina o solo el anticuerpo. Se añadieron 50.000 células HEK Blue (células TNFa/IL1p HEK Blue (InvivoGen, Cat. n.° hkb-tnfill; células STAT-6 HEK Blue (InvivoGen, Cat. n.° Hkb.stat6) a la mezcla de citocina/anticuerpo y se incubaron durante 23 horas a 37 °C, 5 % de CO2 en una estufa de incubación. Se añadió reactivo QuantiBlue a cada pocillo de cultivo y se incubaron durante 2 horas a 37 °C. La DO se midió a 620 nm y la CI50 se calculó usando BioStat Speed 2.0. Los resultados del ensayo de células indicadoras HEK Blue de diversos anticuerpos triespecíficos se muestran en las Tablas I y M.
A continuación, se calcularon valores de CI<50>para las proteínas de unión 9-15 y se evaluaron comparativamente con anticuerpos parentales individuales (Tabla I).
Tabla I: Resumen de ensayos indicadores HEK Blue (datos de CI<50>) para diversas proteínas de unión triespecíficas
Se midió la termoestabilidad de las proteínas de unión biespecíficas-trivalentes por fluorimetría diferencial de barrido (DSF; Tabla J).
T l : R m n l rm ili r D F r iv r r ín ni n riv l n
Se midió la afinidad de unión y el número de proteínas diana unidas por cada una de las proteínas de unión biespecíficas-trivalentes para IL-4 humana (Tabla K) e IL-13 (Tablas K y L).
Tabla K: Resumen de resultados de resonancia de plasmones superficiales para IL-4 para diversas proteínas de unión trivalentes
Tabla L: Resumen de resultados de resonancia de plasmones superficiales para IL-13 para diversas proteínas de unión trivalentes
Finalmente, se calcularon los valores de CI<50>para las proteínas de unión 16-19 (Tabla M).
Tabla M: Resumen de ensayos indicadores HEK Blue (datos de CI<50>) para diversas proteínas de unión trivalentes
Ejemplo 6: Optimización del formato de proteína de unión triespecífica
Un problema con muchos formatos de proteínas de unión heterodiméricas existentes (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos y variantes de los mismos) es que puede ser difícil purificar solo las especies heterodiméricas deseadas sin también incluir especies homodiméricas. Por lo tanto, un proceso para la eficiente purificación de la proteína de unión heterodimérica deseada es de gran interés, por ejemplo, para la producción a escala industrial.
Como se describe en el presente documento, las proteínas de unión de la presente divulgación pueden incluir varias características opcionales, que incluyen, sin limitación, mutaciones de botón y ojal (por ejemplo, para promover la apropiada formación de heterodímeros) y mutaciones para mejorar la purificación. Además, estas proteínas de unión incluyen dos cadenas ligeras, que conducen a cuatro configuraciones posibles: dos cadenas ligeras kappa, dos cadenas ligeras lambda, una cadena ligera kappa en el brazo con dominios variables dobles (el "brazo CODV") y una cadena ligera lambda en el brazo de anticuerpo tradicional (el "brazo Fab") y una cadena ligera lambda en el brazo CODV y una cadena ligera kappa en el brazo Fab.
Por lo tanto, se realizaron experimentos para identificar un proceso que permitiera la eficiente purificación de la proteína de unión deseada de interés. También se probaron variantes de proteína de unión para su eficiencia de purificación.
LaFIG. 28Amuestra un diagrama una proteína de unión a modo de ejemplo de la presente divulgación, que indica variaciones que conducen a configuraciones únicas. Estos experimentos probaron el efecto de la colocación de: cadenas ligeras kappa y lambda (por ejemplo, dos kappa, dos lambda, kappa en el brazo CODV y lambda en el brazo Fab, y lambda en el brazo CODV y kappa en el brazo Fab), mutaciones de botón y ojal (por ejemplo, mutaciones de botón en el brazo CODV y mutaciones de ojal en el brazo Fab, o mutaciones de ojal en el brazo CODV y mutaciones de botón en el brazo Fab) y mutaciones H435R/Y436F ("mutaciones RF", por ejemplo, mutaciones r F en el brazo CODV o Fab, o sin mutaciones RF). Se probó un total de 18 variantes diferentes, como se muestra en laFIG. 28B. Para estos experimentos, el brazo CODV tuvo sitios de unión al antígeno específicos para TNFa (es decir, secuencias de VH y VL de SEQ ID NO:168 y 169, respectivamente) e IL4 (es decir, secuencias de VH y VL de SEQ ID NO:170 y 171, respectivamente), mientras que el brazo Fab tuvo un sitio de unión al antígeno específico de IL13 (es decir, secuencias de VH y VL de SEQ ID NO:172 y 173, respectivamente). S354C y T366W se usaron para las mutaciones de botón, y Y349C, T366S, L368A y Y407V se usaron para las mutaciones de ojal.
Se probaron diversas etapas de procesamiento para la capacidad para monitorizar el correcto emparejamiento de brazos CODV y Fab (por ejemplo, a diferencia de homodímeros de CODV o Fab), así como el correcto emparejamiento cadena pesada-cadena ligera (por ejemplo, a diferencia del emparejamiento entre la cadena ligera del brazo Fab y la cadena pesada del brazo CODV, o entre la cadena pesada del brazo Fab y la cadena libera del brazo CODV). Se descubrió que la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) analítica era ineficaz en distinguir el correcto emparejamiento de cadenas pesadas y cadenas ligeras; se descubrió que proteínas de unión con cadena ligera del brazo Fab emparejada erróneamente con cadena pesada CODV y proteínas de unión homodiméricas con dos brazos Fab eluyen conjuntamente con las proteínas de unión triespecíficas deseadas. Sin embargo, se descubrió que la cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) analítica resolvía las proteínas de unión triespecíficas deseadas de proteínas de unión con la cadena ligera del brazo Fab emparejada erróneamente con la cadena pesada de CODV y proteínas de unión homodiméricas con dos brazos Fab(FIG. 29).
Las 18 configuraciones de proteína de unión mostradas en laFIG. 28Bse purificaron por cromatografía de afinidad por proteína A, luego purificación KappaSelect (GE Healthcare). Las especies se monitorizaron por cromatografía HIC. Se purificó eficientemente una configuración proteína de unión sin inclusión de especies emparejadas erróneamente: cadena ligera lambda para el brazo CODV, cadena ligera kappa para el brazo Fab, mutaciones de botón en el brazo CODV, mutaciones de ojal en el brazo Fab y mutaciones RF en el brazo Fab. La cromatografía HIC(FIG. 30A), SDS-PAGE(FIG. 30B)y el análisis de masas intactas demuestra que se purificó una especie única correspondiente a la proteína de unión triespecífica deseada
Estos resultados identifican una configuración de proteína de unión que permite una purificación más eficiente de proteínas de unión de interés de las especies emparejadas erróneamente. Además, se mostró que el proceso de purificación de proteína A seguido por etapas de purificación KappaSelect proporcionaba separación eficaz de proteínas de unión de interés de las especies emparejadas erróneamente.
SECUENCIAS
Tabla 1: SEQ ID NO de cadena pesada y ligera para las proteínas de unión 1-21 y los antígenos diana a los que iri n l r ín ni n.
��
��
��
Tabla 3: Secuencias de la cadena pesada y ligera de proteínas de unión específicamente dirigidas a IL-4, IL-13 y/o TNFa.
Secuencias de aminoácidos de la proteína de unión 9
ı54
ı55
Claims (26)
1. Una proteína de unión que comprende cuatro cadenas de polipéptidos que forman tres sitios de unión al antígeno que se unen específicamente a una o más proteínas diana, en donde una primera cadena de polipéptidos de la proteína de unión comprende una estructura representada por la fórmula:
VL2-L1-VL1-L2-CL [I]
y una segunda cadena de polipéptidos de la proteína de unión comprende una estructura representada por la fórmula:
V<h>1 -L3-VH2-L4-CH1-bisagra-CH2-CH3 [I I]
y una tercera cadena de polipéptidos de la proteína de unión comprende una estructura representada por la fórmula:
VH3-CH1-bisagra-CH2-CH3 [III]
y una cuarta cadena de polipéptidos de la proteína de unión comprende una estructura representada por la fórmula:
V<l>3-C<l>[IV]
en donde:
VL1 es un primer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL2 es un segundo dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
VL3 es un tercer dominio variable de la cadena ligera de inmunoglobulina;
Vh1 es un primer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
VH2 es un segundo dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
Vh3 es un tercer dominio variable de la cadena pesada de inmunoglobulina;
CL es un dominio constante de la cadena ligera de inmunoglobulina;
CH1 es un dominio constante de la cadena pesada CH1 de inmunoglobulina;
Ch2 es un dominio
constante de la cadena pesada Ch2 de inmunoglobulina;
Ch3 es un dominio constante de la cadena pesada Ch3 de inmunoglobulina;
bisagra es una región bisagra de inmunoglobulina que conecta los dominios Ch1 y Ch2; y
L1, L2, L3 y L4 son conectores de aminoácido;
y en donde el polipéptido de la fórmula I y el polipéptido de la fórmula II forman un par cruzado de cadena ligeracadena pesada.
2. La proteína de unión de la reivindicación 1, en donde (a) cada uno de L1, L2, L3 y L4 son independientemente cero aminoácidos de longitud o comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), y GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148); o (b) cada uno de L1, L2, L3 y L4 comprende independientemente una secuencia seleccionada del grupo que consiste en GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:105), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO:106), GQPKAAP (SEQ ID NO: 175) y GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148).
3. La proteína de unión de la reivindicación 1, en donde
(a) L1 comprende la secuencia GQPKAAP (SEQ ID NO: 175), L2 comprende la secuencia TKGPS (SEQ ID NO:106), L3 comprende la secuencia S y L4 comprende la secuencia RT;
(b) L1 comprende la secuencia GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L2 comprende la secuencia GGGGSGGGGS (SEQ ID NO:104), L3 es 0 aminoácidos de longitud y L4 es 0 aminoácidos de longitud;
(c) L1 comprende la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L2 comprende la secuencia GGSGSSGSGG (SEQ ID NO:148), L3 es 0 aminoácidos de longitud y L4 es 0 aminoácidos de longitud.
4. La proteína de unión de la reivindicación 1, en donde la proteína de unión es triespecífica y capaz de unirse específicamente a tres dianas de antígeno diferentes.
5. La proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de unión se une específicamente a tres proteínas diana que corresponden a dos proteínas diana en linfocitos T y a una diana de proteína tumoral; en donde opcionalmente una de dichas proteínas diana en linfocitos T es CD3, una de dichas proteínas diana en linfocitos T es CD28 y/o dicha diana de proteína tumoral es CD38.
6. La proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la proteína de unión se une específicamente a tres proteínas diana que corresponden a dos proteínas diana en linfocitos T y a una proteína diana seleccionada del grupo que consiste en A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, eGf R, ENTPD1, FCER1 A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, clase II de MHC, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, cinasa Syk, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM y XCRl.
7. La proteína de unión de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde L1, L2, L3 y/o L4 comprenden la secuencia Asp-Lys-Thr-His-Thr (SEQ ID NO: 525).
8. La proteína de unión de la reivindicación 1 o la reivindicación 5, en donde
Vh1 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:28, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:29 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:30;
VL1 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:46, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:47 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:48; y
VH2 comprende una CDR-H1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:34, una CDR-H2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:35 y una CDR-H3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:36;
VL2 comprende una CDR-L1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:52, una CDR-L2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:53 y una CDR-L3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:54.
9. La proteína de unión de la reivindicación 1, en donde Vh1 y Vl1 forman un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 humano, en donde Vh2 y Vl2 forman un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 humano, y en donde V<h>3 y V<l>3 forman un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína diana de tumor humano.
10. La proteína de unión de la reivindicación 9, en donde el tercer sitio de unión al antígeno se une específicamente a una proteína diana de tumor humano seleccionada del grupo que consiste en CD19, CD20, CD38, Her2 y LAMP1.
11. La proteína de unión de la reivindicación 9 o 10, en donde el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3 comprende:
(a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 152 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 153; o
(b) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 154 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 155.
12. La proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 comprende:
(a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 160 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 161; o
(b) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 162 y un dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163.
13. La proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde el sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral comprende:
(a) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 156yun dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 157;
(b) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 158yun dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 159;
(c) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 164yun dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165;
(d) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 150yun dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 151; o
(e) un dominio variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 166yun dominio variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 167.
14. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -13.
15. Un vector de expresión que comprende la molécula del ácido nucleico de la reivindicación 14.
16. Una célula hospedadora aislada que comprende la molécula del ácido nucleico de la reivindicación 14, o el vector de expresión de la reivindicación 15, en donde opcionalmente la célula hospedadora es una célula de mamífero o una célula de insecto.
17. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 13 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
18. La proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 5-13 o la composición de la reivindicación 17 para su uso en prevenir y/o tratar cáncer en un paciente.
19. La proteína de unión para el uso o la composición para el uso de la reivindicación 18, en donde la proteína de unión comprende un sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una proteína de la superficie de linfocitos T y otro sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral.
20. La proteína de unión para el uso o la composición para el uso de la reivindicación 19, en donde la proteína de unión comprende un primer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD3, un segundo sitio de unión al antígeno que se une específicamente a CD28 y un tercer sitio de unión al antígeno que se une específicamente a una diana de proteína tumoral seleccionada del grupo que consiste en CD19, CD20, CD38, Her2 y LAMP1.
21. La proteína de unión para el uso o la composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en donde la proteína de unión se coadministra con un agente quimioterapéutico.
22. La proteína de unión de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8 o la composición farmacéutica de la reivindicación 17 para su uso en prevenir y/o tratar una enfermedad o trastorno inflamatorio en un paciente.
23. La proteína de unión para el uso o la composición para el uso de la reivindicación 22, en donde la proteína de unión comprende tres sitios de unión al antígeno, cada uno de los cuales se une específicamente a una proteína diana de citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-4, IL-13 y TNFa.
24. La proteína de unión para el uso o la composición para el uso de la reivindicación 22 o la reivindicación 23, en donde la proteína de unión se coadministra con un agente antiinflamatorio.
25. La proteína de unión para el uso o la composición para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 18-24, en donde el paciente es un ser humano.
26. La proteína de unión para el uso o la composición para el uso de la reivindicación 18 o la reivindicación 22, en donde la proteína de unión es capaz de inhibir la función de una o más proteínas diana seleccionadas del grupo que consiste en A2AR, APRIL, ATPDasa, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinasa, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, Fc Er 1, FLa P, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNa, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC clase II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDasa-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, cinasa Syk,
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