BR112020007002A2 - anticorpos anti-cd38 e métodos de uso - Google Patents

anticorpos anti-cd38 e métodos de uso Download PDF

Info

Publication number
BR112020007002A2
BR112020007002A2 BR112020007002-5A BR112020007002A BR112020007002A2 BR 112020007002 A2 BR112020007002 A2 BR 112020007002A2 BR 112020007002 A BR112020007002 A BR 112020007002A BR 112020007002 A2 BR112020007002 A2 BR 112020007002A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
sequence
cdr
Prior art date
Application number
BR112020007002-5A
Other languages
English (en)
Inventor
Lan Wu
Catherine Prades
Ling Xu
Edward Seung
Ronnie Wei
Gary Nabel
Zhi-Yong Yang
Tarik Dabdoubi
Béatrice Cameron
Cendrine Lemoine
Original Assignee
Sanofi
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=63963620&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BR112020007002(A2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Sanofi filed Critical Sanofi
Publication of BR112020007002A2 publication Critical patent/BR112020007002A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/64—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising a combination of variable region and constant region components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Abstract

A presente invenção refere-se as proteínas de ligação que ligam polipeptídeos CD38, por exemplo, polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo. Por exemplo, as proteínas de ligação podem ser proteínas de ligação monoespecíficas, biespecíficas ou triespecíficas com pelo menos um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38. A descrição também provê métodos para produzir proteínas de ligação que ligam polipeptídeos CD38 e usos de tais proteínas de ligação.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICORPOS ANTI-CD38 E MÉTODOS DE USO".
REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade do Pedido Provisório dos EUA Nº. de Série 62/570.655, depositado em 10 de outubro de 2017; Pedido Provisório dos EUA Nº. de Série 62/570,660, depositado em 11 de outubro de 2017; Pedido Provisório dos EUA Nº. de Série 62/676,221, depositado em 24 de maior de 2018; e Pedido EP Nº. EP18187186.4, depositado em 3 de agosto de 2018; todos os quais são aqui incorporados por referência em sua totalidade.
SUBMISSÃO DE LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS EM ARQUIVO DE TEXTO ASCII
[002] O conteúdo da seguinte submissão em formato de arquivo ASCII é incorporado neste documento por referência em sua totalidade: uma forma legível por computador (CRF) da Listagem de Sequências (nome de arquivo: 183952029941seqlist.TXT, data de gravação: 8 de outubro de 2018, tamamho: 158 KB).
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A descriçãopresente invenção refere-se a proteínas de ligação que ligam polipeptídeos CD38 (por exemplo, polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo), incluindo proteínas de ligação monoespecíficas, biespecíficas ou triespecíficas com pelo menos um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, bem como polinucleotídeos, células hospedeiras, métodos de produção e métodos de uso relacionados aos mesmos.
ANTECEDENTES
[004] Produtos bioterapêuticos baseados em anticorpos monoclonais têm se tornado uma avenida importante para o desenvolvimento de novas drogas. A tecnologia de anticorpos monoclonais oferece direcionamento específico, entrega de sinalização precisa e/ou carga útil para a população celular específica, e provê efeito biológico duradouro através de suas funções Fc. Os esforços na engenharia de anticorpos têm permitido o desenvolvimento de anticorpos multiespecíficos combinando as especificidades de múltiplos anticorpos monoclonais para várias aplicações biológicas, expandindo o escopo do desenvolvimento de drogas de anticorpos.
[005] CD38 é um alvo de drogas atraente, uma vez que é expresso na superfície celular de uma variedade de células tumorais linfoides (ver Stevenson, G.T. (2006) Mol. Med. 12:345-346). DARZALEX® (daratumumab) é um anticorpo anti-CD38 aprovado para uso no tratamento de mieloma múltiplo. No entanto, existe a necessidade de terapêutica de direcionamento de CD38 com um modo de ação diferente e/ou propriedades melhoradas, incluindo, mas sem limitação, ligação de alta afinidade a CD38, reatividade cruzada entre polipeptídeos CD38 humanos e de macaco de cinomolgo, ligação a células de linfoma (por exemplo, linhagens celulares de linfoma de células B grandes de mieloma múltiplo), e a capacidade de induzir apoptose e/ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) e atividades antitumorais mediadas por células T.
BREVE SUMÁRIO
[006] São providas neste documento proteínas de ligação que ligam polipeptídeos CD38 (por exemplo, polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo), incluindo proteínas de ligação monoespecíficas, biespecíficas ou triespecíficas com pelo menos um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38. Vantajosamente, essas proteínas de ligação têm a capacidade de recrutar células T na proximidade de células de câncer, subsequentemente para ativar células T e promover a o extermínio de células T ativadas de células de câncer adjacentes através de um mecanismo de Granzima/Perforina, provendo um modo de ação diferente para atividade antitumor de anticorpos anti-CD38, tais como DARZALEX® (daratumumab). Além disso, a capacidade de ligar ambos os polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo permite que proteínas de ligação sejam facilmente testadas em estudos toxicológicos pré-clínicos, por exemplo, para avaliar seus perfis de segurança para uso clínico posterior.
[007] Em algumas modalidades, são providas neste documento proteínas de ligação monoespecíficas que se ligam a um polipeptídeo CD38 humano. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação reagem de forma cruzada com polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação se ligam a polipeptídeos CD38 humanos de isoforma A e isoforma E. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação possuem uma ou mais das seguintes características (em qualquer combinação): liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada com uma KD de 1,5 nM ou menos, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada com uma KD de 3,5 nM ou menos, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 7,5 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105) como uma proteína purificada, como análise por ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; induz apoptose ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de uma célula expressando CD38 em sua superfície celular; e tem uma ou mais mutações (por exemplo, em uma região Fc) resultando em ligação reduzida a FcRI e/ou FcRII, em comparação com a mesma proteína de ligação sem as uma ou mais mutações. Para ensaios exemplificativos, ver Exemplos 1, 3 e 4. Em algumas modalidades, a KD é medida a 4°C ou 25°C.
[008] Em algumas modalidades, são providas neste documento proteínas de ligação triespecíficas que se ligam a um polipeptídeo CD38 humano. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação triespecíficas se ligam (por exemplo, simultaneamente) a um polipeptídeo CD38 (por exemplo, expresso na superfície de uma célula) e um ou mais outros antígenos alvo expresssos na superfície de uma segunda célula, recrutando assim a segunda célula em proximidade com a célula expressando o polipeptídeo CD38. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação triespecíficas se ligam (por exemplo, simultaneamente) a um polipeptídeo CD38 (por exemplo, expresso na superfície de uma célula) e um ou dois antígenos alvo expressos na superfície de uma célula T, recrutando assim a célula T em proximidade com a célula expressando o polipeptídeo CD38. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação triespecíficas ativam a célula T e/ou proveem um sinal coestimulatório mediado por CD28 à célula T.
Em algumas modalidades, as proteínas de ligação triespecíficas reagem de forma cruzada com polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo.
Em algumas modalidades, as proteínas de ligação triespecíficas se ligam a polipeptídeos CD38 humanos de isoforma A e isoforma E.
Em algumas modalidades, as proteínas de ligação triespecíficas possuem uma ou mais das seguintes características (em qualquer combinação): liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada com uma KD de 1,5 nM ou menos, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 20 nM, 15 nM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada com uma KD de 3,5 nM ou menos, como análise por SPR; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 7,5 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105) como uma proteína purificada, como análise por ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; induz apoptose ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de uma célula expressando CD38 em sua superfície celular; e tem uma ou mais mutações (por exemplo, em uma região Fc) resultando em ligação reduzida a FcRI e/ou FcRII, em comparação com a mesma proteína de ligação sem as uma ou mais mutações; induz proliferação de células T (por exemplo, célula T CD4+ e/ou CD8+); induz expressão de células T (por exemplo, célula T CD4+ e/ou CD8+) de Bcl-xL; induz apoptose de células CD38+; liga-se a CD38 expresso na superfície de uma célula e um ou mais antígeno(s) alvo de célula T expresso(s) na superfície de uma célula T; liga-se a CD38 expresso na superfície de uma célula, CD28 expresso na superfície de uma célula T, e CD3 expresso na superfície de uma célula T; estimula ativação do receptor de célula T; induz coestimulação de sinalização de receptor de célula T (por exemplo, como mediado por CD28); e tem uma ou mais mutações (por exemplo, em uma região Fc) resultando em indução reduzida de liberação de citocina (por exemplo, IFN-, IL-2 e/ou TNF-α) por PBMCs, em comparação com a mesma proteína de ligação sem as uma ou mais mutações; induz liberação de citocina (por exemplo, IFN- e/ou IL-6) por PBMCs na presença de uma célula alvo CD38+. Para ensaios exemplificativos, ver Exemplos 1, 3 e 4. Em algumas modalidades, a KD é medida a 4°C ou 25°C.
[009] Em algumas modalidades, é aqui provida uma proteína de ligação compreendendo um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, em que o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e/ou (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ
ID NO: 36). Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e/ou (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e/ou (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-H1—FR2—CDR-
H2—FR3—CDR-H3—FR4; em que FR1 compreende a sequência QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 87), ou QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO: 88); em que FR2 compreende a sequência MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO: 90) ou MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO: 91); em que FR3 compreende a sequência NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 93) ou NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 94); e em que FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 96). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, e/ou o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, e/ou o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, e/ou o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23, e/ou o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-H1—FR2—CDR-H2—FR3—CDR-H3—FR4; em que FR1 compreende a sequência QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 87), ou QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO: 88); em que FR2 compreende a sequência MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO: 90) ou MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO: 91); em que FR3 compreende a sequência NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 93) ou NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 94); e em que FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS
(SEQ ID NO: 96). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e/ou o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
[0010] Em algumas modalidades, é aqui provida uma proteína de ligação compreendendo um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, em que o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43); e (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e/ou o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga o polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 2,1 nM ou menos. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga o polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 1,3 nM ou menos.
[0011] Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a proteína de ligação é um anticorpo quimérico ou humanizado. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo humano. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma ou mais cadeias pesadas de anticorpo de comprimento total compreendendo uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc humana compreendendo uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam função efetora e/ou ligação a receptor Fc da região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG1 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A, L235A e P329A. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG1 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299 e 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S298N, T299A e Y300S.
Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana.
Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P e R409K.
Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A e L235A.
Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236. Em algumas modalidades, a região Fc de IgG4 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-237 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que a sequência EFLGG é substituída por PVAG.
Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende um fragmento F(ab), F(ab’)2, Fab’-SH, Fv ou scFv de anticorpo.
Em algumas modalidades, a proteína de ligação é conjugada a um rótulo ou agente citotóxico.
Em algumas modalidades, a proteína de ligação é uma proteína de ligação biespecífica compreendendo o primeiro sítio de ligação a antígeno que liga o polipeptídeo CD38 e um segundo sítio de ligação a antígeno.
Em algumas modalidades, a proteína de ligação é uma proteína de ligação triespecífica compreendendo o primeiro sítio de ligação a antígeno que liga o polipeptídeo CD38, um segundo sítio de ligação a antígeno, e um terceiro sítio de ligação a antígeno.
Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antígeno liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano, e em que o segundo e terceiro sítios de ligação a antígeno ligam, cada um, uma proteína de superfície de célula T. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antígeno liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano, e em que (a) o segundo sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 humano, e o terceiro sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 humano, ou (b) o segundo sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 humano, e o terceiro sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 humano.
[0012] Em algumas modalidades, é aqui provida uma proteína de ligação compreendendo três sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma ou mais proteínas alvo, em que pelo menos um dos três sítios de ligação a antígeno reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo. Em algumas modalidades, a proteína de ligação reage de maneira cruzada com um polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 105. Em algumas modalidades, a proteína de ligação reage de maneira cruzada com um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo e dois sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma proteína de superfície de célula T. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo, um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD28 humano, e um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD3 humano. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam os três sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que:
[0013] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0014] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0015] VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0016] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0017] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0018] VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0019] CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;
[0020] CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[0021] CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina;
[0022] CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina;
[0023] dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e
[0024] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0025] em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada, e
[0026] em que: (a) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR- H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36);
[0027] (b) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); ou
[0028] (c) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam os três sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:
VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que:
[0029] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0030] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0031] VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0032] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0033] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0034] VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0035] CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;
[0036] CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[0037] CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina;
[0038] CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina;
[0039] dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e
[0040] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0041] em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada, e
[0042] em que: (a) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR- H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36);
[0043] (b) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); ou
[0044] (c) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID
NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de
GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); ou o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de
GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); ou o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6; o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; ou o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam os três sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que:
[0045] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0046] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0047] VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0048] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0049] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0050] VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0051] CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;
[0052] CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[0053] CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina;
[0054] CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina;
[0055] dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e
[0056] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0057] em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada, e
[0058] em que (a) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR- H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID
NO: 46);
[0059] (b) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46); ou
[0060] (c) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54; o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54; o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54; o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54 o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85; o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85; o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85; ou o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; ou o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, pelo menos um de L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácido de comprimento.
Em algumas modalidades, L1, L2, L3 ou L4 têm, cada um independentemente, pelo menos um aminoácido de comprimento.
Em algumas modalidades, (a) L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, têm zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59); ou (b) L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO: 57), L3 compreende a sequência S, e L4 compreende a sequência RT; L1 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L2 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L3 tem 0 aminoácido de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento; L1 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L2 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L3 tem 0 aminoácido de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento; ou L 1 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), L2 tem 0 aminoácido de comprimento, L3 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), e L4 tem 0 aminoácido de comprimento.
Em algumas modalidades, os domínios dobradiça-CH2- CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça- CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A e L235A.
Em algumas modalidades, os domínios dobradiça-CH2- CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça- CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236. Em algumas modalidades, os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P e R409K.
Em algumas modalidades, os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A, L235A e P329A.
Em algumas modalidades, os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299 e 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S298N, T299A e Y300S.
Em algumas modalidades, o domínio dobradiça-CH2-CH3 da segunda cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que o domínio dobradiça-CH2-CH3 da terceira cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S354C e T366W.
Em algumas modalidades, o domínio dobradiça-CH2-CH3 da segunda cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S354C e T366W; e em que o domínio dobradiça-CH2-CH3 da terceira cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A e Y407V.
Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 62, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 65, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 68, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69. Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69. Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 71, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
[0061] Em algumas modalidades, é aqui provida uma proteína de ligação compreendendo três sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma ou mais proteínas alvo, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam os três sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:
VL3-CL [IV] em que:
[0062] VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0063] VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0064] VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
[0065] VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0066] VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0067] VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina;
[0068] CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;
[0069] CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina;
[0070] CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina;
[0071] CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina;
[0072] dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e
[0073] L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
[0074] em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada; e
[0075] em que (a) os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem,
cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299 e 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S298N, T299A e Y300S; ou (b) os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236. Em algumas modalidades, os domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana compreendem substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-237 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que a sequência EFLGG é substituída por PVAG.
Em algumas modalidades, pelo menos um par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38. Em algumas modalidades, um, dois ou três pares de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 formam um sítio de ligação a antígeno que liga um alvo de antígeno selecionado do grupo que consiste em A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8,
IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase- 1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, e XCR1. Em algumas modalidades, um primeiro par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD3 humano, um segundo par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD28 humano, e um terceiro par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um alvo de antígeno humano selecionado do grupo que consiste em A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase- 1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1,
SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, e XCR1.
[0076] Em algumas modalidades, é aqui provido um kit de polinucleotídeos, compreendendo: (a) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 72, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 74, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75; (b) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 77, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75; (c) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 79, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75; (d) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 72, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 80, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81; (e) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 82, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81; ou (f) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID
NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 83, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81.
[0077] Em algumas modalidades, é aqui provido um polinucleotídeo compreendendo a proteína de ligação de qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, é aqui provido um vetor compreendendo um polinucleotídeo compreendendo a proteína de ligação de qualquer uma das modalidades acima.
[0078] Em algumas modalidades, é aqui provida uma célula hospedeira compreendendo o kit de polinucleotídeos, polinucleotídeo ou vetor de qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, é aqui provido um método de produzir uma proteína de ligação, o método compreendendo cultivar a célula hospedeira de qualquer uma das modalidades acima, tal que a proteína de ligação seja produzida. Em algumas modalidades, o método ainda compreende recuperar a proteína de ligação da célula hospedeira.
[0079] Em algumas modalidades, é aqui provida uma composição farmacêutica compreendendo a proteína de ligação de qualquer uma das modalidades acima e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0080] Em algumas modalidades, é aqui provido um método de prevenir e/ou tratar câncer em um paciente compreendendo administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma proteína de ligação de qualquer uma das modalidades acima ou a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades acima. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é uma proteína de ligação triespecífica compreendendo um primeiro sítio de ligação a antígeno que liga CD3, um segundo sítio de ligação a antígeno que liga CD28, e um terceiro sítio de ligação a antígeno que liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano. Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é coadministrada com um agente quimioterápico. Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), ou um linfoma de células B. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano. Em algumas modalidades, o paciente é selecionado para tratamento porque as células do câncer expressam um polipeptídeo de isoforma E de CD38 humano (por exemplo, como estabelecido na SEQ ID NO: 105) em sua superfície celular. Em algumas modalidades, as células de câncer expressam CD38 e CD28. Em algumas modalidades, as células de câncer expressam CD38 e não expressam CD28.
[0081] Em algumas modalidades, é aqui provida pelo menos uma proteína de ligação de qualquer uma das modalidades acima ou a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades acima para uso na prevenção e/ou tratamento de câncer em um paciente (por exemplo, um paciente em necessidade do mesmo, tal como um paciente com câncer). Em algumas modalidades, é aqui provida pelo menos uma proteína de ligação de qualquer uma das modalidades acima ou a composição farmacêutica de qualquer uma das modalidades acima para uso na fabricação de um medicamento para prevenir e/ou tratar câncer em um paciente (por exemplo, um paciente em necessidade do mesmo, tal como um paciente com câncer). Em algumas modalidades de qualquer uma das modalidades acima, a proteína de ligação é uma proteína de ligação triespecífica compreendendo um primeiro sítio de ligação a antígeno que liga CD3, um segundo sítio de ligação a antígeno que liga CD28, e um terceiro sítio de ligação a antígeno que liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano. Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação deve ser coadministrada com um agente quimioterápico. Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo.
Em algumas modalidades, o câncer é leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), ou um linfoma de células B. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano. Em algumas modalidades, o paciente é selecionado para tratamento porque as células do câncer expressam um polipeptídeo de isoforma E de CD38 humano (por exemplo, como estabelecido na SEQ ID NO: 105) em sua superfície celular. Em algumas modalidades, as células de câncer expressam CD38 e CD28. Em algumas modalidades, as células de câncer expressam CD38 e não expressam CD28.
[0082] Deve-se compreender que uma, alguma ou todas as propriedades das várias modalidades descritas neste documento podem ser combinadas para formar outras modalidades da presente invenção. Esses e outros aspectos da invenção se tornarão evidentes para um versado na técnica. Essas e outras modalidades da invenção são ainda descritas pela descrição detalhada a seguir.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0083] O arquivo de patente ou pedido contém pelo menos um desenho executado em cores. Cópias dessa patente ou publicação de pedido de patente com desenhos em cores serão fornecidas pelo Escritório mediante solicitação e pagamento da taxa necessária.
[0084] A Figura 1A mostra a ligação de anticorpos anti-CD38 mAb1 (superior) e isatuximab (inferior) a células de linfoma humano SU-DHL- 8 ou células de mieloma múltiplo humano MOLP-8 usando citometria de fluxo.
[0085] A Figura 1B mostra os resultados de ensaios de ligação por citometria de fluxo examinando a ligação de anticorpos anti-CD38 mAb1 ou isatuximab (nenhuma ligação observada) a células expressando CD38 de macaco cinomolgo em sua superfície.
[0086] As Figuras 2A-2I mostram os resultados de ensaios caracterizando a ligação de anticorpos anti-CD38 a polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo.
A Figura 2A mostra a ligação de anticorpo anti-CD38 humanizado mAb2 a CD38 humano solúvel (superior, "hCD38::Histag") ou CD38 de macaco cinomolgo (superior, "cynoCD38::Histag") por ELISA, bem como a ligação de mAb2 à superfície de células expressando CD83 humano (inferior, como indicado) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior, como indicado) por citometria de fluxo.
A Figura 2B mostra a ligação de mAb2 a CD38 humano (superior) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior) por ressonância de plasmons de superfície (SPR). A Figura 2C mostra a ligação de anticorpo anti-CD38 humanizado mAb3 a CD38 humano solúvel (superior, "hCD38::Histag") ou CD38 de macaco cinomolgo (superior, "cynoCD38::Histag") por ELISA, bem como a ligação de mAb3 à superfície de células expressando CD83 humano (inferior, como indicado) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior, como indicado) por citometria de fluxo.
A Figura 2D mostra a ligação de mAb3 a CD38 humano (superior) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior) por SPR.
A Figura 2E mostra a ligação de anticorpo anti-CD38 humanizado mAb5 a CD38 humano solúvel (superior, "hCD38::Histag") ou CD38 de macaco cinomolgo (superior, "cynoCD38::Histag") por ELISA, bem como a ligação de mAb5 à superfície de células expressando CD83 humano (inferior, como indicado) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior, como indicado) por citometria de fluxo.
A Figura 2F mostra a ligação de mAb5 a CD38 humano (superior) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior) por SPR.
A Figura 2G mostra a ligação de humano anti-CD38 anticorpo hhy1370 a CD38 humano solúvel (superior, "hCD38::Histag") ou CD38 de macaco cinomolgo (superior, "cynoCD38::Histag") por ELISA, bem como a ligação de hhy1370 à superfície de células expressando CD83 humano (inferior, como indicado) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior, como indicado) por citometria de fluxo.
A Figura 2H mostra a ligação de hhy1370 a CD38 humano (superior) ou CD38 de macaco cinomolgo (inferior) por SPR. A Figura 2I resume os dados de ligação dos experimentos ELISA, SPR e FACS, bem como a identidade percentual de cada domínio VH ("H") ou VL ("L") de anticorpo à sequência de região V humana de cima para baixoit corresponde a mAb2, mAb3, mAb 4, mAb 5, e mAb6 última linha (1195 HHKK-3 tem não foi descrito por sua sequência de aminoácido VL/VH no texto abaixo).
[0087] A Figura 2J mostra a indução dependente de concentração de apoptose de células SU-DHL-8 por mAb7 e mAb1 após incubação por 72 horas a 37°C.
[0088] A Figura 2K mostra atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) de isatuximab e mAb1 contra células SU-DHL-8 na presença de células NK92.
[0089] A Figura 2L mostra atividade de citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC) dependente de concentração de isatuximab (direita) e mAb1 (esquerda) contra células SU-DHL-8 na presença de NK92 células após 4 horas a 37°C.
[0090] As Figuras 2M-2Q mostraram os resultados de ensaios de indução de apoptose usando os anticorpos anti-CD38 indicados contra células tumorais SU-DHL-8. Apoptose foi quantificada medindo dual absorção de iodeto de propídio e Anexina V através de citometria de fluxo. A Figura 2M mostra a porcentagem de células apoptóticas induzidas por cada anticorpo. As Figuras 2N-2Q mostram indução dependente de dose de apoptose em células de linfoma SU-DHL-8 por anticorpos anti-CD38 mAb2 (Figura 2N), mAb3 (Figura 2O), mAb4 (Figura 2P), e mAb5 (Figura 2Q), bem como o IC50 para cada anticorpo.
[0091] A Figura 3A provê uma representação esquemática de uma proteína de ligação triespecífica compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam três sítios de ligação a antígeno que liga três proteínas alvo: CD28, CD3, e CD38. Um primeiro par de polipeptídeos possui dual domínios variáveis tendo uma orientação cruzada (VH1- VH2 e VL2-VL1) formando dois sítios de ligação a antígeno que reconhecem CD3 e CD28, e um segundo par de polipeptídeos possui a domínio variável único (VH3 e VL3) formando um único sítio de ligação a antígeno que reconhece CD38. A proteína de ligação triespecífica mostrada na Figura 3A usa uma região constante de IgG4 com uma mutação "knobs-into-holes", em que o knob está no segundo par de polipeptídeos com um domínio variável único.
[0092] A Figura 3B provê uma representação esquemática de um ensaio baseado em SPR para examinar a capacidade de cada domínio de ligação a antígeno de proteínas de ligação triespecíficas anti- CD38/anti-CD28/anti-CD3 de ligarem seu antígeno cognato.
[0093] A Figura 3C mostra os resultados de ensaios baseados em SPR para examinar ligação de CD38 a proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38/anti-CD28/anti-CD3. A ligação de CD38 humano a proteínas de ligação triespecíficas foi examinada individualmente (esquerda superior), após pré-ligação com CD3 (centro superior), após pré-ligação com CD28 (direita superior), após pré- ligação a CD3, em seguida, CD28 (esquerda inferior), ou após pré- ligação a CD28, em seguida, CD3 (direita inferior).
[0094] A Figura 4 mostra a ligação sequencial de CD3 humano, CD28, e polipeptídeos CD38 a proteínas de ligação triespecíficas anti- CD38/anti-CD28/anti-CD3, como análise por SPR.
[0095] A Figura 5 resume as afinidades de ligação de proteínas de ligação triespecíficas indicadas contra seus antígenos cognatos (CD3, CD28 e CD38 humano) como medido por SPR.
[0096] A Figura 6A compara a afinidade aparente de domínio de ligação a antígeno isatuximab em formato de IgG1 humana (2ª folha) ou em um formato proteína de ligação triespecífica com os domínios de ligação a antígeno isatuximab, anti-CD28, e anti-CD3 (formato de acordo com a Figura 3A; 1ª folha) para ligar polipeptídeos CD38 humanos (superior) ou de macaco cinomolgo (inferior), como análise por citometria de fluxo.
[0097] As Figuras 6B-6D comparam as afinidades aparentes de proteína de ligação triespecífica CD38VH1xCD28supxCD3mid, CD38VH1xCD28cvnxCD3mid, ou anticorpo anti-CD38 monoespecífico mAb2 para ligação a células expressando polipeptídeos CD38 humanos ou de macaco cinomolgos, como análise por citometria de fluxo. A Figura 6B mostra a ligação de proteína de ligação triespecífica CD38VH1xCD28supxCD3mid a células expressando polipeptídeos CD38 humanos (superior) ou de macaco cinomolgo (inferior). A Figura 6C mostra a ligação de proteína de ligação triespecífica CD38VH1xCD28cvnxCD3mid a células expressando polipeptídeos CD38 humanos (superior) ou de macaco cinomolgo (inferior). A Figura 6D mostra a ligação de anticorpo anti-CD38 monoespecífico mAb2 a células expressando polipeptídeos CD38 humanos (superior) ou de macaco cinomolgo (inferior).
[0098] A Figura 6E compara as afinidades aparentes de proteína de ligação triespecífica CD38HHY1370xCD28supxCD3mid ou anticorpo anti- CD38 monoespecífico mAb6 para ligação a células expressando polipeptídeos CD38 humanos (superior) ou de macaco cinomolgo (inferior), como análise por citometria de fluxo.
[0099] A Figura 6F resume a afinidade de ligação das proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3 indicadas para CD38 humano, como medido por SPR ou citometria de fluxo (FACS).
[00100] A Figura 6G mostra a afinidade aparente de proteína de ligação triespecífica ΔCD38VH1xCD28supxCD3mid sem o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 para ligação a células expressando polipeptídeos CD38 humanos (superior) ou de macaco cinomolgo (inferior), como análise por citometria de fluxo.
[00101] As Figuras 7A & 7B mostram os resultados de um ensaio ELISA determinando as afinidades de ligação de várias proteínas de ligação triespecíficas de IgG4 anti-CD38 x CD28 x CD3, ou anticorpos de controle, a polipeptídeos CD3, CD28 e CD38 humanos e de macaco rhesus.
[00102] As Figuras 8A-8D mostram os resultados de extermínio específico mediado por anticorpo de células CD38+ por PBMCs de três doadores humanos diferentes usando as proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38 x CD28 x CD3 indicadas e anticorpos de controle. Resultados representativos usando linhagens celulares de mieloma múltiplo RPMI8266 (Figura 8A), NCI-H929 (Figura 8B), KMS- 26 (Figura 8C), e linhagens celulares KMS-11 (Figura 8D) são mostrados, e valores EC50 são providos na Tabela N. Valores EC50 obtidos usando células NCI-H929, KMS-26 e KMS-11 são providas nas Tabelas O-Q.
[00103] As Figuras 8E & 8F mostram os resultados de extermínio específico mediado por anticorpo de células CD38+ por PBMCs de dois doadores diferentes usando as proteínas de ligação triespecíficas anti- CD38 x CD28 x CD3 indicadas com regiões Fc variantes e anticorpos de controle. Resultados representativos usando linhagens celulares KMS-11 (Figura 8D) e U266 (Figura 8E) de CD38+ são mostrados, e valores EC50 são providos nas Tabelas Q2 e Q3.
[00104] As Figuras 9A, 9B & 10 mostram a ativação (CD69+) de células T humanas tratadas com várias proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38 x CD28 x CD3 ou anticorpos de controle por 24 horas. A Figura 9A mostra a ativação (CD69+) de células T CD3+ humanas. A Figura 9B mostra a ativação (CD69+) de células T CD3+ CD4+ humanas. A Figura 10 mostra a ativação (CD69+) de células T CD3+ CD8+ humanas.
[00105] As Figuras 11A-11B mostram os resultados de análises de liberação de citocina in vitro de PBMCs humanas tratadas com as proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38 x CD28 x CD3 indicadas ou anticorpos de controle com base em método de placas secas como descrito em Stebbings, R. et al. (2007) J. Immunol. 179:3325-3331. A Figura 11A mostra os resultados usando 5µg/ml dos anticorpos indicados. A Figura 11B mostra os resultados usando 25ng/ml dos anticorpos indicados.
[00106] As Figuras 12A-12E mostram a atividade in vivo da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) no modelo de camundongo NSG humanizado com células sanguíneas do cordão umbilical CD34+ implantado com células de mieloma múltiplo RPMI-
8226. A Figura 12A mostra a alteração de volume tumoral em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38. A Figura 12B mostra o volume tumoral médio no dia 18 em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38. A Figura 12C mostra o peso de tumor terminal médio em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38. A Figura 12D mostra a curva de crescimento tumoral média pela duração do experimento em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti- CD3/CD38. A Figura 12E mostra a alteração média de peso corporal em vários pontos no tempo pela duração do experimento de camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti- CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38.
[00107] As Figuras 13A-13F mostram a atividade in vivo da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) no modelo de camundongo NSG humanizado com PBMCs implantado com células de mieloma múltiplo RPMI-8226. A Figura 13A mostra a alteração de volume tumoral em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti- CD3/CD38. A Figura 13B mostra o volume tumoral no dia 4 em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38. A Figura 13C mostra o volume tumoral no dia 21 em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38. A Figura 13D mostra o volume tumoral médio no dia 21 em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38. A Figura 13E mostra o peso de tumor terminal médio em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38. A Figura 13F mostra o volume tumoral médio em vários pontos no tempo pela duração do experimento em camundongos tratados com as concentrações indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) vs. camundongos tratados com um anticorpo biespecífico anti-CD3/CD38.
[00108] As Figuras 14A-14U mostram os resultados de um estudo de escalonamento de dose (0,5, 2,5, 12,5 µg/kg) usando as proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid), anti-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid), anti-CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid), e anti- CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) em primatas não humanos.
A Figura 14A mostra a ativação de células T (CD69+) de células T CD3+ em circulação após a administração de diferentes doses da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid). A Figura 14B mostra a ativação de células T (CD69+) de células T CD3+ em circulação após a administração de diferentes doses da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid). A Figura 14C mostra a ativação de células T (CD69+) de células T CD3+ em circulação após a administração de diferentes doses da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid). A Figura 14D mostra a ativação de células T (CD69+) de células T CD3+ em circulação após a administração de diferentes doses da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid). A Figura 14E mostra as alterações na porcentagem de células T CD4+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid). A Figura 14F mostra as alterações na porcentagem de células T CD8+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid). A Figura 14G mostra as alterações na porcentagem de células T CD4+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid). A Figura 14H mostra as alterações na porcentagem de células T CD8+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid). A Figura 14I mostra as alterações na porcentagem de células T CD4+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti-
CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid). A Figura 14J mostra as alterações na porcentagem de células T CD8+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti- CD38(hhy1370) x CD28(sup) x CD3(mid). A Figura 14K mostra as alterações na porcentagem de células T CD4+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti- CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid). A Figura 14L mostra as alterações na porcentagem de células T CD8+ em circulação após a administração das doses indicadas da proteína de ligação triespecífica anti- CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid). A Figura 14M mostra as alterações no total de células T CD4+ 6, 24 e 48 horas após a administração de 12,5 µg/kg das proteínas de ligação triespecíficas indicadas.
A Figura 14N mostra as alterações no total de NK células 6, 24 e 48 horas após a administração de 12,5 µg/kg das proteínas de ligação triespecíficas indicadas.
A Figura 14O mostra as alterações no total de células T CD8+ 6, 24 e 48 horas após a administração de 12,5 µg/kg das proteínas de ligação triespecíficas indicadas.
A Figura 14P mostra as alterações no total de células B 6, 24 e 48 horas após a administração de 12,5 µg/kg das proteínas de ligação triespecíficas indicadas.
A Figura 14Q mostra as alterações nos níveis de citocina 6 horas após a administração das três doses crescentes (0,5, 2,5, 12,5 µg/kg) da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VH1) x CD28(sup) x CD3(mid) (resultados de diferentes animais de teste rotulados como "117065" e "117066"). A Figura 14R mostra as alterações nos níveis de citocina 6 horas após a administração das três doses crescentes (0,5, 2,5, 12,5 µg/kg) da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(VH1) x CD28(cvn) x CD3(mid) (resultados de diferentes animais de teste rotulados como "117067" e "117068"). A Figura 14S mostra as alterações nos níveis de citocina 6 horas após a administração das três doses crescentes (0,5, 2,5, 12,5 µg/kg) da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(hhy1370) x CD28(sup)
x CD3(mid) (resultados de diferentes animais de teste rotulados como "117069" e "117070"). A Figura 14T mostra as alterações nos níveis de citocina 6 horas após a administração das três doses crescentes (0,5, 2,5, 12,5 µg/kg) da proteína de ligação triespecífica anti-CD38(hhy1370) x CD28(cvn) x CD3(mid) (resultados de diferentes animais de teste rotulados como "117071" e "117072"). A Figura 14U mostra as alterações nos níveis de citocina 24 horas após a administração das três doses crescentes (0,5, 2,5, 12,5 µg/kg) das proteínas de ligação triespecíficas indicadas (resultados mostrados de todos os animais de teste).
[00109] As Figuras 14V & 14W mostram que proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) e anti-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid) induziram a depleção de células T in vivo em sangue de primata não humano em doses mais altas (6 horas pós-dose).
[00110] As Figuras 14X & 14Y mostram que proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38(HHY1370) x CD28(sup) x CD3(mid) e anti- CD38(HHY1370 x CD28(cvn) x CD3(mid) induziram a depleção de células T in vivo em sangue de primata não humano em doses mais altas (6 horas pós-dose).
[00111] As Figuras 14Z & 14AA mostram a quantidade de células T sanguíneas em primatas não humanos ao longo do tempo após a administração de proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38(VHI) x CD28(sup) x CD3(mid) ou anti-CD38(VHI) x CD28(cvn) x CD3(mid).
[00112] As Figuras 14AB & 14AC mostram a quantidade de células T sanguíneas em primatas não humanos ao longo do tempo após a administração de proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38(HHY1370) x CD28(sup) x CD3(mid) ou anti-CD38(HHY1370) x CD28(cvn) x CD3(mid).
[00113] As Figuras 14AD & 14AE mostram a quantidade de células T CD4+ com proteína de ligação triespecífica ligada após a administração de dose de 100µg/kg em primatas não humanos.
[00114] As Figuras 14AF & 14AG mostram a quantidade de células
T CD8+ com proteína de ligação triespecífica ligada após a administração de dose de 100µg/kg em primatas não humanos.
[00115] As Figuras 15A-15C mostram ligação ou falta desta de diversas variantes Fc a receptores Fc humanos FcR I (Figura 15A), FcR IIa (Figura 15B), e FcR IIIb/c (Figura 15C). As variantes testadas foram IgG1 humana, IgG4 humana e IgG4 humana com mutações FALA.
[00116] A Figura 16 mostra a ligação de IgG4 humana, com ou sem mutações FALA, a FcRn.
[00117] A Figura 17 resume parâmetros PK das proteínas de ligação triespecíficas indicadas (CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG1 LALA P329A, e CD38HHY1370xCD28supxCD3mid IgG4 FALA) em camundongos NSG.
[00118] As Figuras 18A-18C mostram liberação mediada por interação Fc/FcR (não específica) de IFN- (Figura 18A), IL-2 (Figura 18B) ou TNF-α (Figura 18C) por PBMCs humanas incubadas com proteínas de ligação triespecíficas tendo regiões Fc variantes FALA ou de tipo selvagem.
[00119] A Figura 18D mostra ativação in vitro de PBMCs humanas por proteínas de ligação triespecíficas CD38VH1xCD28supxCD3mid e CD38HHY1370xCD28supxCD3mid, bem como Variantes Fc de IgG1 e IgG4 das mesmas.
[00120] As Figuras 19A&19B mostram que a indução de Bcl-xL em células T CD4+ (Figura 19A) ou CD8+ (Figura 19B) pela proteína de ligação triespecífica CD38VH1xCD28supxCD3mid requer ambos domínios de ligação a antígeno CD3 e CD28. Gráfico de barras=média e s.d. de 3 doadores de PBMC. *p=<0,009.
[00121] As Figuras 19C&19D mostram que CD38VH1xCD28xCD3 com variante Fc FALA de IgG4 sobrerregula Bcl-xL em células T CD4+
(Figura 19C) ou CD8+ (Figura 19D) mais do que um anticorpo biespecífico de referência. Gráfico de barras=média e s.d. de 3 doadores de PBMC. *p=<0,045
[00122] A Figura 19E mostra que a ativação de células T por proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3, como análise por expressão de IL-2 em uma linhagem repórter de células T Jukart, é dependente do domínio de ligação a antígeno anti- CD3.
[00123] A Figura 19F mostra a liberação de citocinas TNF, IFNg, IL- 2, IL-6 e IL-10 por proteínas de ligação triespecíficas CD38VH1xCD28supxCD3mid, em comparação com proteínas de ligação com anti-CD28, anti-CD38, ou anti-CD28, anti-CD38 e anti-CD3 mutados, bem como a referência.
[00124] A Figura 19G mostra a proliferação de células T ativadas por proteína de ligação triespecífica anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3 com variante Fc FALA de IgG4, anticorpo biespecífico anti-CD38xanti-CD3 de referência, ou controle de isótipo (proteína de ligação triespecífica com variante Fc FALA de IgG4 tendo domínios de ligação mutados).
[00125] A Figura 20 mostra a proliferação de células T ativadas por proteína de ligação triespecífica anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3 com variante Fc FALA de IgG4, proteínas de ligação triespecíficas anti- CD38xanti-CD28xanti-CD3 com variante Fc FALA de IgG4 e uma mutação no domínio de ligação a antígeno CD38, CD28 ou CD3, ou controle de isótipo (proteína de ligação triespecífica com variante Fc FALA de IgG4 tendo três domínios de ligação mutados).
[00126] A Figura 21 mostra atividade antitumoral in vivo de proteína de ligação triespecífica FALA de IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid administrada nas doses indicadas em um modelo de tumor disseminado NCI-H929-Luc em camundongos NSG humanizados com PBMC.
[00127] A Figura 22 mostra atividade antitumoral in vivo de proteína de ligação triespecífica FALA de IgG4 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid administrada nas doses indicadas em um modelo de tumor disseminado NCI-H929-Luc em camundongos NSG humanizados com PBMC.
[00128] As Figuras 23A & 23B mostram potente atividade de extermínio de tumor in vitro de células NCI-929-Luc com proteínas de ligação triespecíficas CD38VH1xCD28supxCD3mid e CD38HHY1370xCD28supxCD3mid, e anticorpo biespecífico anti-CD38xanti- CD3 de referência usando as PBMCs humanas usadas no estudo in vivo. PBMCs humanas de dois camundongos NSG humanizados doadores foram usadas após 24h. Incubação com uma proporção efetora:PBMC de 10:1.
[00129] A Figura 23C mostra superior atividade antitumoral in vivo de proteínas de ligação triespecíficas CD38VH1xCD28supxCD3mid e CD38hhy1370xCD28supxCD3mid, em comparação com anticorpo biespecífico anti-CD38xanti-CD3 de referência, administradas nas doses indicadas em um modelo de tumor disseminado NCI-H929-Luc em camundongos NSG humanizados com PBMC. As proteínas de ligação foram administradas por injeção intraperitoneal (IP) semanalmente a 30µg/kg.
[00130] A Figura 24A mostra os resultados de um ensaio repórter de luciferase usando células Jukart GloResponse™ IL2-luc2P (Promega) após estimulação por CD38VH1/ CD28supxCD3mid e seus mutantes KO triplos e KO de sítio de ligação únicos em concentração de 10 nM.
[00131] A Figura 24B mostra a otimização de anticorpo anti- CD3xCD28 CODV-Fab. A configuração ideal de α-CD3 e α-CD28 em posições alternativas do Fab biespecífico de CODV foi avaliada por ensaios de liberação de citocina usando PBMCs humanas in vitro. CD28 distal x CD3 proximal foi identificado como posicionamento ideal com base na secreção de IFN-γ e IL-2 em sobrenadante após 24 horas.
[00132] A Figura 25 mostra que sobrerregulação induzida por
CD38VH1/ CD28supxCD3mid de membro Bcl-xL da família Bcl-2 em células T primárias é dependente de CD28.
[00133] A Figura 26 mostra que anti-CD28 no Ab triespecífico forneceu sinalização secundária essencial para suportar proliferação de células T primárias in vitro.
[00134] A Figura 27 mostra a configuração do anticorpo triespecífico, codificado por cor por anticorpo de origem (esquerda). Sombras escuras (roxas ou verdes) representam peptídeos de cadeia pesada; sombras claras representam peptídeos de cadeia leve. É também mostrado um modelo de estrutura do Ab triespecífico CD38VH1/CD28supxCD3mid com base em estruturas de cristal de Fab VH1 anti-CD38 e Fab CODV CD28sup/CD3mid (direita).
[00135] As Figuras 28A & 28B mostram que células de mieloma múltiplo (MM) com alta (RPMI-8226; Figura 28A) e baixa (KMS-11; Figura 28B) expressão de superfície de CD38 foram lisadas de forma eficiente por PBMCs humanas (E:T=10:1) incubadas com várias concentrações do Ab triespecífico. Contribuição para a atividade de extermínio por cada sítio de ligação foi demonstrada por mutações KO de sítio de ligação, como indicado.
[00136] As Figuras 29A-29C mostram que o mutante KO anti- CD28sup do Ab triespecífico apresentou atividade antitumoral marcadamente reduzida contra células MM CD38high, CD38mid e CD38low in vitro. São mostrados ensaios usando células RPMI-8226 (Figura 29A), U266 (Figura 29B) ou KMS-11 (Figura 29C).
[00137] A Figura 30 mostra que redução de carga tumoral em grupos de tratamento com anticorpo triespecífico CD38VH1/ CD28supxCD3mid_FALA foi dependente de dose e estatisticamente diferente em um modelo de linhagem celular de mieloma múltiplo humano disseminado usando um camundongo NSG reconstituído com células T primárias humanas amplificadas in vitro.
[00138] As Figuras 31A & 31B mostram análise por microscopia vital de citólise de células de mieloma pelo Ab triespecífico CD38 in vitro na presença de células T humanas primárias. A fotografia de tempo transcorrido de imagens microscópicas foi realizada usando um controle negativo (KO triplo triespecífico; Figura 31A) ou o Ab triespecífico CD38/CD28xCD3 (Figura 31B) usando PBMCs humanas incubadas com linhagem celular de mieloma RPMI-8226 rotulada com corante vermelho intenso CellTrackerTM. As imagens apresentadas foram coletadas após incubação de 24 horas. Barra de escala: 50µm.
[00139] A Figura 32 mostra mutações alternativas na região Fc de IgG4 preparada para análise em ensaios de ligação ao receptor Fc. São mostradas as SEQ ID NOs: 111-116 (de cima para baixo, respectivamente).
[00140] A Figura 33 mostra os resultados dos ensaios de SPR para medir a afinidade das variantes Fc de IgG4 especificadas para os receptores Fc humanos indicados.
[00141] A Figura 34 mostra que uma proteína de ligação triespecífica CD38 com ligação mínima de FcR reduziu liberação de citocina não específica por PBMCs humanas in vitro. Diferentes mutações de inativação de FcR (como indicado) foram analisadas quanto aos seus efeitos pró-inflamatórios no isótipo de IgG4 humano. As PBMCs humanas foram incubadas em meios (não estimulados) ou na presença das células de mieloma, RPMI-8226 (estimuladas), e as barras indicam os níveis de IFN-γ de sobrenadante medidos por ELISA.
[00142] A Figura 35 mostra que uma proteína de ligação triespecifica CD38 com ligação de FcR mínima lisou células de mieloma múltiplo humano com diferentes níveis de expressão de CD38. A citólise de células de mieloma com IgG4 ou as mutações Fc indicadas foi avaliada in vitro usando PBMCs humanas com os alvos tumorais indicados.
[00143] A Figura 36 mostra uma comparação da atividade citolítica in vitro do Ab anti-CD38/CD28/CD3 triespecífico e o anticorpo anti-CD38 daratumumab medido usando PBMC humana como células efetoras contra as linhagens celulares RPMI-8226, U266 e KMS -11 (E:T=10:1).
[00144] As Figuras 37A-37D mostram a caracterização da expansão do subconjunto de células T in vitro em resposta a CD38/CD3xCD28. A avaliação da expansão do subconjunto de células T foi realizada revestindo cavidades com 350 ng/cavidade do Ab triespecífico CD38 na ausência de citocinas exógenas. As populações de células T foram medidas nos pontos no tempo indicados. O Ab triespecífico triplo mutante foi usado como controle negativo. Citometria de fluxo foi usada para determinar células T CD4 de memória efetoras e centrais (Figura 37A), células T auxiliares (Figura 37B), células T CD8 de memória efetoras e centrais (Figura 37C) e células CD8 pp65 específicas de CMV (Figura 37D) como descrito no Exemplo 12. A análise de células efetoras pp65 específicas de CMV foi realizada por coloração em pentâmero de PBMCs de doadores de HLA-A2 CMV+ tratados com triespecífico CD38 ou o controle negativo triplo.
[00145] A Figura 38 mostra a contribuição da expressão de CD28 em células alvo para suscetibilidade à citólise por CD38/CD3xCD28. CD28 foi eliminado em células KMS-11 usando direcionamento de gene CRISPR/Cas 9 e usado como alvos citolíticos in vitro. Em comparação com KMS-11 de origem, a expressão de CD38 foi preservada enquanto CD28 foi eliminado, como demonstrado por citometria de fluxo (painel superior, KMS-11 vs. KMS-11 (CD28KO). Citólise da célula KO de CD28 foi examinada com o triespecífico nulo de CD28 ou WT (painel inferior; triespecífico vs. triespecífica (CD28KO)).
[00146] A Figura 39 mostra a atividade citolítica do Ab mutante FALA triespecífico CD38/CD28xCD3 contra as linhagens CD38+CD28- indicadas, incluindo leucemia mielocítica aguda (AML (KG-1)), um linfoma de células B (OCI-Ly19), leucemia linfocítica T aguda (ALL
(KOPN8)) e linfoma linfocítico crônico (CLL(Z-138)).
[00147] A Figura 40 mostra que ativação in vitro de PBMC humana por superagonista α-CD28 requer bivalência do anticorpo.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00148] A descrição provê proteína de ligação compreendendo pelo menos um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38. I. Definições Gerais
[00149] Como usado de acordo com a presente invenção, os termos a seguir, salvo indicado de outra forma, devem ser entendidos como tendo os seguintes significados. Salvo disposição em contrário pelo contexto, os termos singulares devem incluir pluralidades e os termos plurais devem incluir o singular. Como usado nesta especificação e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um/a", e "o/a" incluem referentes plurais, a menos que o conteúdo indique claramente o contrário. Dessa forma, por exemplo, referência a "uma molécula" opcionalmente inclui uma combinação de duas ou mais dessas moléculas, e semelhantes.
[00150] Entende-se que aspectos e modalidades da presente invenção descritos neste documento incluem "compreendendo", "consistindo" e "consistindo essencialmente em" aspectos e modalidades.
[00151] O termo "polinucleotídeo", como usado neste documento, refere-se a polímeros de ácido nucleico de filamento simples ou filamento duplo com pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento. Em determinadas modalidades, os nucleotídeos compreendendo o polinucleotídeo podem ser ribonucleotídeos ou desoxirribonucleotídeos ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Tais modificações incluem modificações básicas, tais como bromuridina, modificações de ribose, tais como arabinosídeo e 2’, 3’-didesoxirribose, e modificações nas ligações internucleotídicas, tais como fosforotioato,
fosforoditioato, fosforosselenoato, fosforodisselenoato, fosfororoanilotioato, fosforaniladato e fosforanilamidato. O termo "polinucleotídeo" especificamente inclui as formas de DNA de filamento simples e filamento duplo.
[00152] Um "polinucleotídeo isolado" é um polinucleotídeo de origem genômica, de cDNA ou sintética, ou alguma combinação dos mesmos, que: (1) não está associado a todo ou uma porção de um polinucleotídeo no qual o polinucleotídeo isolado é encontrado na natureza, (2) é ligado a um polinucleotídeo ao qual não está ligado na natureza, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma sequência maior.
[00153] Um "polipeptídeo isolado" é aquele que: (1) é livre de pelo menos alguns outros polipeptídeos com os quais normalmente seria encontrado; (2) é essencialmente livre de outros polipeptídeos da mesma fonte, por exemplo, da mesma espécie, (3) é expresso por uma célula de espécie diferente, (4) foi separado de menos cerca de 50% de polinucleotídeos, lipídios, carboidratos ou outros materiais com os quais está associado na natureza, (5) não é associado (por interação covalente ou não covalente) com porções de um polipeptídeo com o qual o "polipeptídeo isolado" está associado na natureza, (6) é operativamente associado (por interação covalente ou não covalente) com um polipeptídeo com o qual não está associado na natureza, ou (7) não ocorre na natureza. Esse polipeptídeo isolado pode ser codificado por DNA, cDNA, mRNA ou outro RNA genômico, de origem sintética, ou qualquer combinação dos mesmos. De preferência, o polipeptídeo isolado é substancialmente livre de polipeptídeos ou outros contaminantes que são encontrados em seu ambiente natural que interfeririam com seu uso (terapêutico, diagnóstico, profilático, pesquisa ou outro).
[00154] Anticorpos de ocorrência natural geralmente compreendem um tetrâmero. Cada um desses tetrâmeros é tipicamente composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptídicas, cada par tendo uma cadeia "leve" de comprimento total (normalmente tendo um peso molecular de cerca de 25 kDa) e uma cadeia "pesada" de comprimento total (normalmente tendo um peso molecular de cerca de 50-70 kDa). Os termos "cadeia pesada" e "cadeia leve", como usados neste documento, referem-se a qualquer polipeptídeo de imunoglobulina tendo sequência de domínio variável suficiente para conferir especificidade para um antígeno alvo. A porção amino-terminal de cada cadeia leve e pesada normalmente inclui um domínio variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos que normalmente é responsável pelo reconhecimento de antígenos. A porção carbóxi-terminal de cada cadeia define tipicamente um domínio constante responsável pela função efetora. Dessa forma, em um anticorpo de ocorrência natural, um polipeptídeo de imunoglobulina de cadeia pesada de comprimento total inclui um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3), em que o domínio VH está no terminal amino do polipeptídeo e o domínio CH3 está no terminal carboxila, e um polipeptídeo de imunoglobulina de cadeia leve de comprimento total inclui um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), em que o domínio VL está no terminal amino do polipeptídeo e o domínio CL está no terminal carboxil.
[00155] As cadeias leves humanas são tipicamente classificadas como cadeia leves kapa e lambda, e as cadeias pesadas humanas são tipicamente classificadas como mu, delta, gama, alfa ou epsilon, e definem o isótipo do anticorpo como IgM, IgD, IgG, IgA e IgE, respectivamente. A IgG possui várias subclasses, incluindo, mas sem limitação, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. A IgM tem subclasses incluindo, mas sem limitação, IgM1 e IgM2. IgA é similarmente subdividida em subclasses incluindo, mas sem limitação, IgA1 e IgA2. Dentro de cadeias leves e pesadas de comprimento total, os domínios variáveis e constantes geralmente são unidos por uma região "J" de cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada também incluindo uma região "D" de cerca de 10 aminoácidos. Ver, por exemplo, Fundamental Imunology (Paul, W., ed., Raven Press, 2ª ed., 1989), que é incorporado por referência na sua totalidade para todos os fins. As regiões variáveis de cada par de cadeia leve/pesada geralmente formam um sítio de ligação a antígeno. Os domínios variáveis de anticorpos de ocorrência natural exibem tipicamente a mesma estrutura geral de regiões de quadro relativamente conservadas (FR) unidas por três regiões hipervariáveis, também denominadas regiões de determinação de complementaridade ou CDRs. As CDRs das duas cadeias de cada par são tipicamente alinhadas pelas regiões de quadro, o que pode permitir a ligação a um epítopo específico. Do terminal amino ao terminal carboxila, ambos os domínios variáveis de cadeia leve e pesada tipicamente compreendem os domínios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4.
[00156] O termo "conjunto de CDR" refere-se a um grupo de três CDRs que ocorrem em uma única região variável capaz de ligar o antígeno. Os limites exatos dessas CDRs foram definidos diferentemente de acordo com diferentes sistemas. O sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institures of Health, Bethesda, Maryland (1987) e (1991)) não apenas provou um sistema de numeração de resíduos inequívoco aplicável a qualquer região variável de um anticorpo, mas também provê limites precisos de resíduos que definem as três CDRs. Essas CDRs podem ser referidas como CDRs de Kabat. Chothia e colaboradores (Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877-83) descobriram que certas subporções nas CDRs de Kabat adotam conformações de esqueleto peptídico quase idênticas, apesar de terem grande diversidade no nível de sequência de aminoácido. Essas subporções foram designadas como L1, L2 e L3 ou
H1, H2 e H3, em que "L" e "H" designam as regiões de cadeia leve e de cadeia pesada, respectivamente.
Essas regiões podem ser referidas como CDRs de Chothia, que têm limites que se sobrepõem às CDRs de Kabat.
Outros limites que definem CDRs que se sobrepõem às CDRs de Kabat foram descritos por Padlan, 1995, FASEB J. 9:133-39; MacCallum, 1996, J.
Mol.
Biol. 262 (5):732-45; e Lefranc, 2003, Dev.
Comp.
Immunol. 27:55-77. Ainda outras definições de limites de CDR podem não seguir estritamente um dos sistemas deste documento, mas, no entanto, se sobrepõem às CDRs de Kabat, embora elas possam ser encurtadas ou prolongadas em função de previsões ou descobertas experimentais de que resíduos específicos ou grupos de resíduos ou mesmo CDRs inteiras não afetam significativamente a ligação a antígeno.
Os métodos usados neste documento podem usar CDRs definidas de acordo com qualquer um desses sistemas, embora certas modalidades usem CDRs definidas por Kabat ou Chothia.
A identificação de CDRs previstas usando a sequência de aminoácidos é bem conhecida no campo, tal como em Martin, A.C. "Protein sequence and structure analysis of antibody variable domains", In Antibody Engineering, vol. 2. Kontermann R., Dubel S., eds.
Springer-Verlag, Berlim, p. 33-51 (2010). A sequência de aminoácido do domínio variável de cadeia leve e/ou pesada também pode ser inspecionada para identificar as sequências das CDRs por outros métodos convencionais, por exemplo, por comparação com sequências de aminoácido conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade de sequência.
As sequências numeradas podem ser alinhadas no olho, ou usando um programa de alinhamento, tal como uma suíte CLUSTAL de programas, como descrito em Thompson, 1994, Nucleic Acid Res. 22:4673-80. Modelos moleculares são convencionalmente usados para delinear corretamente regiões de quadro e CDR e, dessa forma, corrigir as atribuições baseadas em sequência.
[00157] Em algumas modalidades, a definição de CDR/FR em uma cadeia leve ou pesada de imunoglobulina deve ser determinada com base na definição de IMGT (Lefranc et al. Dev. Comp. Immunol., 2003, 27(1):55-77; www.imgt.org).
[00158] O termo "Fc", como usado neste documento, refere-se a uma molécula que compreende a sequência de um fragmento de não ligação a antígeno resultante da digestão de um anticorpo ou produzido por outros meios, seja na forma monomérica ou multimérica, e pode conter a região de dobradiça. A fonte original de imunoglobulina da Fc nativa é preferencialmente de origem humana e pode ser qualquer uma das imunoglobulinas. As moléculas de Fc são constituídas por polipeptídeos monoméricos que podem ser ligados em formas diméricas ou multiméricas por associação covalente (isto é, ligações dissulfeto) e não covalentes. O número de ligações dissulfeto intermoleculares entre subunidades monoméricas de moléculas Fc nativas varia de 1 a 4 dependendo da classe (por exemplo, IgG, IgA e IgE) ou subclasse (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, IgGA2 e IgG4). Um exemplo de Fc é um dímero ligado a dissulfeto resultante da digestão de papaína de uma IgG. O termo "Fc nativo", como usado neste documento, é genérico para as formas monomérica, dimérica e multimérica.
[00159] Um fragmento F(ab) normalmente inclui uma cadeia leve e os domínios VH e CH1 de uma cadeia pesada, em que a porção de cadeia pesada VH-CH1 do fragmento F(ab) não pode formar uma ligação dissulfeto com outro polipeptídeo de cadeia pesada. Como usado neste documento, um fragmento F(ab) também pode incluir uma cadeia leve contendo dois domínios variáveis separados por um ligante de aminoácido e uma cadeia pesada contendo dois domínios variáveis separados por um ligante de aminoácido e um domínio CH1.
[00160] Um fragmento F(ab’) geralmente inclui uma cadeia leve e uma porção de uma cadeia pesada que contém mais da região constante (entre os domínios CH1 e CH2), tal que uma ligação dissulfeto intercadeia possa ser formada entre duas cadeias pesadas para formar uma molécula de F(ab’)2.
[00161] O termo "proteína de ligação", como usado neste documento, refere-se a uma molécula de ocorrência não natural (ou recombinante ou modificada) que especificamente se liga a pelo menos um antígeno alvo, por exemplo, um polipeptídeo CD38 da presente invenção.
[00162] Uma molécula "recombinante" é uma que foi preparada, expressa, criada ou isolada por meios recombinantes.
[00163] Uma modalidade da descrição provê proteínas de ligação com especificidade biológica e imunológica para entre um e três antígenos alvo. Outra modalidade da descrição provê moléculas de ácido nucleico que compreendem sequências de nucleotídeo que codificam cadeias de polipeptídeo que formam essas proteínas de ligação. Outra modalidade da descrição provê vetores de expressão compreendendo moléculas de ácido nucleico compreendendo sequências de nucleotídeo que codificam cadeias de polipeptídeo que formam essas proteínas de ligação. Ainda outra modalidade da descrição provê células hospedeiras que expressam essas proteínas de ligação (isto é, compreendendo moléculas de ácido nucleico ou vetores codificando cadeias de polipeptídeo que formam essas proteínas de ligação).
[00164] O termo "trocabilidade", como usado neste documento, refere-se à permutabilidade de domínios variáveis dentro deo formato de proteína de ligação e com retenção de dobras e afinidade final de ligação. "Permutabilidade total" refere-se à capacidade de trocar a ordem de ambos os domínios VH1 e VH2 e, portanto, a ordem dos domínios VL1 e VL2, na cadeia de polipeptídeo de fórmula I ou na cadeia de polipeptídeo de fórmula II (ou seja, para inverter a ordem), mantendo a funcionalidade completa da proteína de ligação, como evidenciado pela retenção de afinidade de ligação. Além disso, deve-se notar que as designações VH e VL se referem apenas à localização do domínio em uma determinada cadeia de proteína no formato final. Por exemplo, VH1 e VH2 podem ser derivados de domínios VL1 e VL2 em anticorpos de origem e colocados nas posições de VH1 e VH2 na proteína de ligação. Da mesma forma, VL1 e VL2 podem ser derivados de domínios VH1 e VH2 em anticorpos de origem e colocados nas posições de VH1 e VH2 na proteína de ligação. Dessa forma, as designações de VH e VL referem- se à localização atual e não, à localização original em um anticorpo de origem. Os domínios VH e VL são, portanto, "permutáveis".
[00165] O termo "antígeno" ou "antígeno alvo" ou "alvo de antígeno", como usado neste documento, refere-se a uma molécula ou a uma porção de uma molécula que é capaz de ser ligada por uma proteína de ligação e, adicionalmente, é capaz de ser usada em um animal para produzir anticorpos capazes de ligação a um epítopo daquele antígeno. Um antígeno alvo pode ter um ou mais epítopos. Com relação a cada antígeno alvo reconhecido por uma proteína de ligação, a proteína de ligação é capaz de competir com um anticorpo intacto que reconhece o antígeno alvo.
[00166] "CD38" é agrupamento de 38 polipeptídeos de diferenciação e é uma glicoproteína encontrada na superfície de muitas células imunes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga o domínio extracelular de um ou mais polipeptídeos CD38. Sequências de polipeptídeo de domínio extracelular de CD38 exemplificativos incluem, mas sem limitação, o domínio extracelular de CD38 humano (por exemplo, como representado por SEQ ID NO: 1) e o domínio extracelular de CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, como representado por SEQ ID NO: 30).
[00167] O termo "acoplador de célula T" refere-se a proteínas de ligação direcionadas a um sistema imune do hospedeiro, mais especificamente a atividade citotóxica das células T, bem como direcionadas a uma proteína alvo de tumor.
[00168] O termo "proteína de ligação monoespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que especificamente se liga a um alvo de antígeno.
[00169] O termo "proteína de ligação monovalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem um sítio de ligação a antígeno.
[00170] O termo "proteína de ligação biespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que especificamente se liga a dois alvos de antígeno diferentes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação biespecífica se liga a dois antígenos diferentes. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação biespecífica se liga a dois diferentes epítopos no mesmo antígeno.
[00171] O termo "proteína de ligação bivalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem dois sítios de ligação.
[00172] O termo "proteína de ligação triespecífica" refere-se a uma proteína de ligação que especificamente se liga a três diferentes alvos de antígeno. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação triespecífica se liga a três diferentes antígenos. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação triespecífica se liga a um, dois ou três diferentes epítopos no mesmo antígeno.
[00173] O termo "proteína de ligação trivalente" refere-se a uma proteína de ligação que tem três sítios de ligação. Em modalidades particulares, a proteína de ligação trivalente pode se ligar a um alvo de antígeno. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode se ligar a dois alvos de antígeno. Em outras modalidades, a proteína de ligação trivalente pode se ligar a três alvos de antígeno.
[00174] Uma proteína de ligação "isolada" é a que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes de seu ambiente natural são materiais que interfeririam no diagnóstico ou no uso terapêutico para a proteína de ligação, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteicos ou não proteicos. Em algumas modalidades, a proteína de ligação será purificada: (1) para mais de 95% em peso de anticorpo como especificado pelo método de Lowry, e mais preferencialmente para mais de 99% em peso, (2) em um grau suficiente para obter pelo menos 15 resíduos de sequência de aminoácido N-terminal ou interna por uso de um sequenciador de copo giratório, ou (3) até a homogeneidade por SDS-PAGE sob condições de redução ou não redução usando azul de Coomassie ou, preferencialmente, mancha de prata. Proteínas de ligação isoladas incluem a proteína de ligação in situ dentro de células recombinantes, desde que pelo menos um componente do ambiente natural da proteína de ligação não esteja presente.
[00175] Os termos "substancialmente puro" ou "substancialmente purificado", como usados neste documento, referem-se a um composto ou espécie que é a espécie predominante presente (ou seja, em uma base molar, é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Em algumas modalidades, uma fração substancialmente purificada é uma composição em que a espécie compreende pelo menos de cerca de 50% (em uma base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Em outras modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% de todas as espécies macromolares presentes na composição. Ainda em outras modalidades, a espécie é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não podem ser detectadas na composição por métodos de detecção convencionais), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular.
[00176] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante, preferencialmente um determinante de polipeptídeo, capaz de especificamente se ligar a um receptor de imunoglobulina ou célula T. Em determinadas modalidades, determinantes de epítopo incluem agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforil ou grupos sulfonil e, em determinadas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo ou proteína de ligação. Em determinadas modalidades, diz-se que uma proteína de ligação especificamente liga um antígeno quando preferencialmente reconhece seu antígeno alvo em uma mistura complexa de proteínas e/ou macromoléculas. Em algumas situações, diz-se que uma proteína de ligação especificamente liga um antígeno quando a constante de dissociação de equilíbrio é ≤ 10-8 M, mais preferencialmente quando a constante de dissociação de equilíbrio é ≤ 10-9 M, e mais preferencialmente quando a constante de dissociação é ≤ 10-10 M.
[00177] A constante de dissociação (KD) de uma proteína de ligação pode ser determinada, por exemplo, por ressonância de plasmons de superfície. Geralmente, a análise por ressonância de plasmons de superfície mede interações de ligação em tempo real entre ligado (um antígeno alvo em uma matriz de biossensores) e analito (uma proteína de ligação em solução) por ressonância de plasmons de superfície (SPR) usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ). A análise por plasmons de superfície também pode ser realizada por imobilização do analito (proteína de ligação em uma matriz de biossensores) e apresentação do ligando (antígeno alvo). O termo "KD", como usado neste documento, refere-se à constante de dissociação da interação entre uma determinada proteína de ligação e um antígeno alvo.
[00178] O termo "se liga a", como usado neste documento em referência a uma proteína de ligação, refere-se à capacidade de uma proteína de ligação ou um fragmento de ligação a antígeno da mesma de se ligar a um antígeno contendo um epítopo com uma Kd de pelo menos cerca de 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-8 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, 1 x 10-12 M, ou mais, e/ou de se ligar a um epítopo com uma afinidade que seja pelo menos duas vezes maior do que sua afinidade por um antígeno não específico. Em algumas amostras, uma proteína de ligação da presente invenção se liga a dois ou mais antígenos, por exemplo, um polipeptídeo CD38 humano e de macaco cinomolgo.
[00179] Em algumas modalidades, um domínio de ligação a antígeno e/ou proteína de ligação da presente invenção "reage de forma cruzada" com polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo, por exemplo, domínios extracelulares CD38, tais como SEQ ID NO: 1 (isoforma A de CD38 humano), SEQ ID NO: 105 (isoforma E de CD38 humano) e SEQ ID NO: 30 (CD38 de macaco cinomolgo). Uma proteína de ligação ligando-se a antígeno 1 (Ag1) é "reativa de forma cruzada" ao antígeno 2 (Ag2) quando os EC50s estão em um intervalo semelhante para ambos os antígenos. No presente pedido, uma proteína de ligação ligando-se a Ag1 é reativa de forma cruzada a Ag2 quando a razão de afinidade de Ag2 para afinidade de Ag1 é igual ou inferior a 10 (por exemplo 5, 2, 1 ou 0,5), as afinidades sendo medidas com o mesmo método para ambos os antígenos.
[00180] Uma proteína de ligação ligando-se o Ag1 "não é significativamente reativa de forma cruzada" a Ag2 quando as afinidades são muito diferentes para os dois antígenos. A afinidade para Ag2 pode não ser mensurável se a resposta de ligação for muito baixa.
No presente pedido, uma proteína de ligação ligando-se a Ag1 não é significativamente reativa de forma cruzada a Ag2, quando uma resposta de ligação da proteína de ligação a Ag2 é inferior a 5% da resposta de ligação da mesma proteína de ligação a Ag1 na mesma configuração experimental e na mesma concentração anticorpo. Na prática, a concentração de proteína de ligação usada pode ser o EC50 ou a concentração necessária para atingir o platô de saturação obtido com Ag1.
[00181] O termo "ligante", como usado neste documento, refere-se a um ou mais resíduos de aminoácido inseridos entre domínios de imunoglobulina para prover mobilidade suficiente para que os domínios das cadeias pesada e leve se dobrem em cruzamentos de imunoglobulinas de região variável dupla. Um ligante é inserido na transição entre domínios variáveis ou entre domínios variáveis e constantes, respectivamente, no nível de sequência. A transição entre domínios pode ser identificada porque o tamanho aproximado dos domínios de imunoglobulina é bem conhecido. A localização precisa de uma transição de domínio pode ser determinada localizando extensões de peptídeo que não formam elementos estruturais secundários, tais como folhas beta ou hélices alfa, como demonstrado por dados experimentais ou como pode ser assumido por técnicas de modelagem ou previsão de estrutura secundária. Os ligantes descritos neste documento são referidos como L1, que está localizado na cadeia leve entre o terminal C do domínio VL2 e o terminal N do domínio VL1; e L2, que é localizado na cadeia leve entre o terminal C do VL1 e o terminal N do domínio CL. Ligantes de cadeia pesada são conhecidos como L3, que está localizado entre o terminal C do domínio VH1 e o terminal N do domínio VH2; e L4, que está localizado entre o terminal C do domínio VH2 e o terminal N do domínio CH1.
[00182] O termo "vetor", como usado neste documento, refere-se a qualquer molécula (por exemplo, ácido nucleico, plasmídeo ou vírus) usada para transferir informações de codificação para uma célula hospedeira. O termo "vetor" inclui uma molécula de ácido nucleico que é capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual está ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma molécula de DNA circular de filamento duplo na qual segmentos adicionais de DNA podem ser inseridos. Outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem ser inseridos no genoma viral. Determinados vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com origem bacteriana de replicação e vetores epissômicos de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissômicos) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira após a introdução na célula hospedeira e, portanto, são replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, determinados vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais estão operacionalmente ligados. Esses vetores são referidos neste documento como "vetores de expressão recombinantes" (ou simplesmente "vetores de expressão"). Em geral, vetores de expressor de utilidade em técnicas de DNA recombinante geralmente estão na forma de plasmídeos. Os termos "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados aqui de forma intercambiável, uma vez que plasmídeo é a forma de vetor mais comumente usada. No entanto, a descrição destina-se a incluir outras formas de vetores de vírus, tais como vetores virais (por exemplo, retrovírus, adenovírus e vírus adeno-associados com replicação defectiva), que atendem a funções equivalentes.
[00183] A frase "célula hospedeira recombinante" (ou "célula hospedeira"), como usada neste documento, refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão recombinante foi introduzido. Uma célula hospedeira recombinante ou célula hospedeira destina-se a se referir não apenas à célula em questão, mas também à progênie dessa célula. Como certas modificações podem ocorrer nas gerações seguintes devido a uma mutação ou influências ambientais, essa progênie pode não ser de fato idêntica à célula de origem, mas essas células ainda estão incluídas no escopo do termo "célula hospedeira", como usado neste documento. Uma ampla variedade de sistemas de expressão de células hospedeiras pode ser usada para expressar as proteínas de ligação, incluindo sistemas de expressão bacteriana, de levedura, baculoviral e de mamífero (bem como sistemas de expressão de exibição de fagos). Um exemplo de um vetor de expressão bacteriano adequado é pUC19. Para expressar uma proteína de ligação recombinantemente, uma célula hospedeira é transformada ou transfectada com um ou mais vetores de expressão recombinantes que transportam fragmentos de DNA que codificam as cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação, tal que as cadeias de polipeptídeo sejam expressas na célula hospedeira e, de preferência, secretadas no meio em que as células hospedeiras são cultivadas, do qual a proteína de ligação pode ser recuperada.
[00184] O termo "transformação", como usado neste documento, refere-se a uma alteração nas características genéticas de uma célula, e uma célula foi transformada quando foi modificada para conter um novo DNA. Por exemplo, uma célula é transformada quando é geneticamente modificada de seu estado nativo. Após a transformação, o DNA transformador pode recombinar-se com aquele da célula integrando-se fisicamente em um cromossomo da célula, ou pode ser mantido de forma transiente como um elemento epissômico sem ser replicado, ou pode replicar-se de forma independente como um plasmídeo. Uma célula é considerada ter sido transformada de maneira estável quando o DNA é replicado com a divisão da célula. O termo "transfecção", como usado neste documento, refere-se à captação de
DNA estrangeiro ou exógeno por uma célula, e uma célula foi "transfectada" quando o DNA exógeno foi introduzido dentro da membrana celular. Várias técnicas de transfecção são bem conhecidas na técnica. Tais técnicas podem ser usadas para introduzir uma ou mais moléculas de DNA exógeno em células hospedeiras adequadas.
[00185] O termo "de ocorrência natural", como usado neste documento e aplicado a um objeto, refere-se ao fato de que o objeto pode ser encontrado na natureza e que não foi manipulado pelo homem. Por exemplo, um polinucleotídeo ou polipeptídeo que está presente em um organismo (incluindo vírus) que pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem é de ocorrência natural. Da mesma forma, "de ocorrência não natural", como usado neste documento, refere-se a um objeto que não é encontrado na natureza ou que foi estruturalmente modificado ou sintetizado pelo homem.
[00186] Como aqui usado, os vinte aminoácidos convencionais e suas abreviações seguem o uso convencional. Estereoisômeros (por exemplo, D-aminoácidos) dos vinte aminoácidos convencionais; aminoácidos e análogos não naturais, tais como aminoácidos α- e α- dissubstituídos, aminoácidos N-alquil, ácido láctico e outros aminoácidos não convencionais também podem ser componentes adequados para as cadeias de polipeptídeo das proteínas de ligação. Exemplos de aminoácidos não convencionais incluem: 4-hidroxiprolina, γ-carboxiglutamato, ε-N,N,N-trimetillisina, ε-N-acetillisina, O- fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metil-histidina, 5- hidroxilisina, σ-N-metilarginina e outros aminoácidos e iminoácidos semelhantes (por exemplo, 4-hidroxiprolina). Na notação polipeptídica usada aqui, a direção à esquerda é a direção do terminal amino e a direção à direita é a direção do terminal carboxila, de acordo com o uso e a convenção padrão.
[00187] Resíduos de ocorrência natural podem ser divididos em classes com base em propriedades comuns de cadeia lateral: (1) hidrofóbicos: Met, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Pro; (2) hidrofílicos polares: Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, His, Lys, Ser, Thr; (3) alifáticos: Ala, Gly, Ile, Leu, Val, Pro; (4) hidrofóbicos alifáticos: Ala, Ile, Leu, Val, Pro; (5) hidrofílicos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (6) ácidos: Asp, Glu; (7) básicos: His, Lys, Arg; (8) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: Gly, Pro; (9) aromáticos: His, Trp, Tyr, Phe; e (10) hidrofóbicos aromáticos: Phe, Trp, Tyr.
[00188] Substituições de aminoácido conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por outro membro da mesma classe. Substituições não conservadoras podem envolver a troca de um membro de uma dessas classes por um membro de outra classe.
[00189] Uma pessoa versada será capaz de determinar variantes adequadas das cadeias de polipeptídeo das proteínas de ligação usando técnicas bem conhecidas. Por exemplo, um versado na técnica pode identificar áreas adequadas de uma cadeia de polipeptídeo que podem ser alteradas sem destruir a atividade por direcionamento de regiões que não se acredita serem importantes para a atividade. Alternativamente, um versado na técnica pode identificar resíduos e porções das moléculas que são conservados entre polipeptídeos semelhantes. Além disso, mesmo áreas que podem ser importantes para a atividade biológica ou para a estrutura podem estar sujeitas a substituições de aminoácidos conservadoras sem destruir a atividade biológica ou afetar adversamente a estrutura do polipeptídeo.
[00190] O termo "paciente", como usado neste documento, inclui seres humanos e animais (por exemplo, mamíferos, tais como cães, porcos, cavalos, gatos, vacas etc.).
[00191] Os termos "tratamento" ou "tratar", como usado neste documento, referem-se a tratamento terapêutico e a medidas profiláticas ou preventivas. Aqueles em necessidade de tratamento incluem aqueles que sofrem de um distúrbio, bem como aqueles que são propensos a ter o distúrbio ou aqueles em que o distúrbio deve ser prevenido. Em modalidades particulares, as proteínas de ligação podem ser usadas para tratar seres humanos com câncer, ou seres humanos suscetíveis ao câncer, ou melhorar o câncer em um indivíduo humano. As proteínas de ligação também podem ser usadas para prevenir o câncer em um paciente humano. Em modalidades particulares, o câncer é mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma, câncer de mama, tal como câncer de mama Her2+, câncer de próstata, linfoma de células B do centro germinativo ou leucemia linfoblástica aguda de células B.
[00192] Os termos "composição farmacêutica" ou "composição terapêutica", como usado neste documento, referem-se a um composto ou composição capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado adequadamente a um paciente.
[00193] O termo "veículo farmaceuticamente aceitável" ou "veículo fisiologicamente aceitável", como usado neste documento, refere-se a um ou mais materiais de formulação adequados para realizar ou melhorar a entrega de uma proteína de ligação.
[00194] Os termos "quantidade eficaz" e "quantidade terapeuticamente eficaz", quando usados em referência a uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais proteínas de ligação, referem-se a uma quantidade ou dosagem suficiente para produzir um resultado terapêutico desejado. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz é uma quantidade de uma proteína de ligação suficiente para inibir, por algum período de tempo, um ou mais dos processos patológicos clinicamente definidos associados à condição a ser tratada. A quantidade eficaz pode variar dependendo da proteína de ligação específica que está sendo usada, e também depende de uma variedade de fatores e condições relacionados ao paciente sendo tratado e à gravidade do distúrbio. Por exemplo, se a proteína de ligação tiver que ser administrada in vivo, fatores como idade, peso e saúde do paciente, bem como as curvas de resposta à dose e os dados de toxicidade obtidos no trabalho pré-clínico em animais estariam entre os fatores considerados. A determinação de uma quantidade eficaz ou de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma determinada composição farmacêutica está bem dentro da habilidade dos versados na técnica.
[00195] Uma modalidade da descrição provê uma composição farmacêutica compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação. II. Proteínas de Ligação Anti-CD38
[00196] Determinados aspectos da presente invenção referem-se a proteínas de ligação que compreendem um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação são monoespecíficas e/ou monovalentes, biespecíficas e/ou bivalentes, triespecíficas e/ou trivalentes, ou multiespecíficas e/ou multivalentes.
[00197] Uma variedade de recursos de proteínas de ligação monoespecíficas, biespecíficas ou triespecíficas exemplificativas é descrita neste documento. Por exemplo, em algumas modalidades, uma proteína de ligação ou fragmento de ligação a antígeno da mesma reage de maneira cruzada com CD38 humano (por exemplo, um polipeptídeo de isoforma A e/ou isoforma E de CD38 humano) e CD38 de macaco cinomolgo. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação induz apoptose de uma célula CD38+. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação recruta uma célula T para uma célula CD38+ e opcionalmente ativa a célula T (por exemplo, através de estimulação e/ou coestimulação de TCR).
[00198] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de
ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 CDRs de uma sequência de domínio VH e/ou VL de anticorpo de mAb1, mAb2, mAb3, mAb4, mAb5, mAb6, mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, ou mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, como mostrado na Tabela G, H ou I.
[00199] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID
NO: 36).
[00200] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em outras modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
[00201] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-H1—FR2—CDR- H2—FR3—CDR-H3—FR4; em que FR1 compreende a sequência QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 87), ou QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO: 88); em que FR2 compreende a sequência MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO: 90) ou MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO: 91); em que FR3 compreende a sequência NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 93) ou NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 94); e em que FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 96). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-L1—FR2—CDR- L2—FR3—CDR-L3—FR4; em que FR1 compreende a sequência DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRAS (SEQ ID NO: 97); em que FR2 compreende a sequência MHWYQQKPGQPPRLLIY (SEQ ID NO: 99); em que FR3 compreende a sequência SRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYYC (SEQ ID NO: 101); e em que FR4 compreende a sequência FGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 103).
[00202] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos
92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
[00203] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos
96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%
idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
[00204] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
[00205] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e/ou uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e/ou uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 e/ou uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 e/ou uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 e/ou uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
[00206] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
[00207] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43); ou um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, as proteínas de ligação compreendem um sítio de ligação a antígeno compreendendo: um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43); e um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-
L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46).
[00208] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-H1—FR2—CDR- H2—FR3—CDR-H3—FR4; em que FR1 compreende a sequência QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAAS (SEQ ID NO: 89); em que FR2 compreende a sequência MHWVRQAPGKGLEWVAV (SEQ ID NO: 92); em que FR3 compreende a sequência YYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC (SEQ ID NO: 95); e em que FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 96). Em algumas modalidades, o domínio VL compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-L1—FR2—CDR- L2—FR3—CDR-L3—FR4; em que FR1 compreende a sequência AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRAS (SEQ ID NO: 98); em que FR2 compreende a sequência GWYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO: 100); em que FR3 compreende a sequência SLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYC (SEQ ID NO: 102); e em que FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 104).
[00209] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9; e/ou o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos
88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
[00210] Em algumas modalidades, o domínio VH compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9; e o domínio VL compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10. Em algumas modalidades, o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9; e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
[00211] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 ou uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12.
[00212] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências CDR de uma sequência de anticorpo mostrada na Tabela G.
Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências CDR, uma sequência de domínio VH e/ou uma sequência de domínio VL de uma sequência de anticorpo mostrada na Tabela H.
Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 sequências CDR, uma sequência de domínio VH e/ou uma sequência de domínio VL de uma sequência de anticorpo mostrada na Tabela I.
Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende 1, 2, 3 ou 4 sequências de polipeptídeo mostradas na Tabela I.
Tabela G: Sequências CDR de proteínas de ligação anti-CD38 Ab CDR_H1 CDR_H2 CDR_H3 CDR_L1 CDR_L2 CDR_L3
LAS
GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF QQNKEDPWT mAb1 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 36) 35)
GAS
GYTFTSYA IYPGQGGT ARTGGLRRAYFTY QSVSSYGQGF QQNKEDPWT mAb2 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 37) (SEQ ID NO: 38) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 39) (SEQ ID NO: 36) 40)
LAS 88/263
GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF QQNKEDPWT mAb3 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 36) 35)
LAS
GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF QQNKEDPWT mAb4 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 36) 35)
LAS
GYTFTSFN IYPGNGGT ARTGGLRRAYFTY ESVDSYGNGF QQNKEDPWT mAb5 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 31) (SEQ ID NO: 32) (SEQ ID NO: 33) (SEQ ID NO: 34) (SEQ ID NO: 36) 35)
AAS
GFTFSSYG IWYDGSNK ARMFRGAFDY QGIRND LQDYIYYPT mAb6 (SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 41) (SEQ ID NO: 42) (SEQ ID NO: 43) (SEQ ID NO: 44) (SEQ ID NO: 46) 45)
Tabela H. Sequências de domínio variável de anti-CD38 (mAb1-7) e outras proteínas de ligação. Ab VH (PROTEÍNA) VL (PROTEÍNA)
QVQLQQSGAELVRSGASVKMSC DIVLTQSPASLAVSLGQRATISC KASGYTFTSF RASESVDSYGNGFMHWYQQKP
NMHWVKETPGQGLEWIGYIYPG GQPPKLLIYLASNLESGVPARFS mAb1 NGGTNYNQKFKGKATLTADTSS GSGSRTDFTLTIDPVEADDAATY
STAYMQISSLTSEDSAVYFCART YCQQNKEDPWTFGGGTKLEIK GGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 6 (SEQ ID NO: 5)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSC DIVLTQSPATLSLSPGERATISCR KASGYTFTSYAMHWVKEAPGQR ASQSVSSYGQGFMHWYQQKPG
LEWIGYIYPGQGGTNYNQKFQG QPPRLLIYGASSRAT mAb2
RATLTADTSASTAYMELSSLRSE GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLE
DTAVYFCARTGGLRRAYFTYWG PEDFAVYYCQQNKEDPWTFGG QGTLVTVSS (SEQ ID NO: 13) GTKLEIK (SEQ ID NO: 14)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSC DIVLTQSPATLSLSPGERATISCR KASGYTFTSF ASESVDSYGNGFMHWYQQKPG
NMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPG QPPRLLIYLASSRAT mAb3 NGGTNYNQKFQGRATLTADTSA GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLE
STAYMELSSLRSEDTAVYFCART PEDFAVYYCQQNKEDPWTFGG GGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS GTKLEIK (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 17)
QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSC DIVLTQSPATLSLSPGERATISCR KASGYTFTSF ASESVDSYGNGFMHWYQQKPG
NMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPG QPPRLLIYLASSRAT mAb4 NGGTNYNQKFQGRATLTADTSA GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLE
STAYMEISSLRSEDTAVYFCART PEDFAVYYCQQNKEDPWTFGG GGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS GTKLEIK (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 21)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSC DIVLTQSPATLSLSPGERATISCR KASGYTFTSF ASESVDSYGNGFMHWYQQKPG
NMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPG QPPRLLIYLASSRAT mAb5 NGGTNYNQKFQGRATLTADTSA GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLE
STAYMEISSLRSEDTAVYFCART PEDFAVYYCQQNKEDPWTFGG GGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS GTKLEIK (SEQ ID NO: 18) (SEQ ID NO: 23)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC AASGFTFSSYGMHWVRQAPGK RASQGIRNDLGWYQQKPGKAP
GLEWVAVIWYDGSNKYYADSVK KLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGS mAb6
GRFTISGDNSKNTLYLQMNSLRA GTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQ EDTAVYYCARMFRGAFDYWGQ DYIYYPTFGQGTKVEIK (SEQ ID GTLVTVSS (SEQ ID NO: 9) NO: 10)
QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSC DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITC KASGYTFTDYWMQWVKQRPGQ KASQDVSTVVAWYQQKPGQSP
GLEWIGTIYPGDGDTGYAQKFQG RRLIYSASYRYIGVPDRFTGSGA mAb7
KATLTADKSSKTVYMHLSSLASE GTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQ DSAVYYCARGDYYGSNSLDYWG HYSPPYTFGGGTKLEIK (SEQ ID QGTSVTVSS (SEQ ID NO: 47) NO: 48)
Ab VH (PROTEÍNA) VL (PROTEÍNA)
QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSC DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC
KASGYTFTSYYIHWVRQAPGQG QASQNIYVWLNWYQQKPGKAP Anti-
LEWIGSIYPGNVNTNYAQKFQGR KLLIYKASNLHTGVPSRFSGSGS CD28su
ATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDT GTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQ p AVYYCTRSHYGLDWNFDVWGK GQTYPYTFGQGTKLEIK (SEQ ID GTTVTVSS (SEQ ID NO: 49) NO: 50)
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCT DIVLTQSPASLAVSPGQRATITC
VSGFSLSDYGVHWVRQPPGKGL RASESVEYYVTSLMQWYQQKP Anti- EWLGVIWAGGGTNYNPSLKSRK GQPPKLLIFAASNVESGVPARFS CD28cvn TISKDTSKNQVSLKLSSVTAADTA GSGSGTDFTLTINPVEANDVANY
VYYCARDKGYSYYYSMDYWGQ YCQQSRKVPYTFGQGTKLEIK GTTVTVSS (SEQ ID NO: 51) (SEQ ID NO: 52)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC
AASGFTFTKAWMHWVRQAPGK KSSQSLVHNNANTYLSWYLQKP Anti- QLEWVAQIKDKSNSYATYYADS GQSPQSLIYKVSNRFSGVPDRF CD3mid VKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSL SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG
RAEDTAVYYCRGVYYALSPFDY VYYCGQGTQYPFTFGSGTKVEI WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53) K (SEQ ID NO: 54)
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSC DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISC
AASGFTFTKAWMHWVRQAPGK KSSQSLVHNNGNTYLSWYLQKP Anti- GLEWVAQIKDKSNSYATYYADS GQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRF CD3low VKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSL SGSGSGTDFTLKISRVEAEDVG
RAEDTAVYYCRGVYYALSPFDY VYYCGQGTQYPFTFGGGTKVEI WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 84) K (SEQ ID NO: 85)
[00213] Nota: sequências CDR estão em negrito e sublinhadas nas sequências de aminoácidos acima. Tabela I. Sequências de comprimento total de proteínas de ligação. mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID IgG4(hole) FALA TSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTN NO: 60 Cadeia pesada 1 YAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSD (por exemplo, uma DTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGKGTTVTV segunda cadeia de SSSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG polipeptídeo de uma FTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDK proteína de ligação SNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQ triespecífica da MNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ presente invenção) GTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPCSRSTSE
STAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTK TYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPP CPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE VTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLVSKLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSLG CD28supxCD3mid DIVMTQTPLSLSVTPGQPASISCKSSQSLVH SEQ ID Cadeia leve 1 NNANTYLSWYLQKPGQSPQSLIYKVSNRFS NO: 61
(por exemplo, uma GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVY primeira cadeia de YCGQGTQYPFTFGSGTKVEIKGQPKAAPDI polipeptídeo de uma QMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNIYVW proteína de ligação LNWYQQKPGKAPKLLIYKASNLHTGVPSRF triespecífica da SGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYYCQQGQ presente invenção) TYPYTFGQGTKLEIKTKGPSRTVAAPSVFIF
PPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT
KSFNRGEC mAb2 IgG4(knob) QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID FALA Cadeia pesada TSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGT NO: 62 2 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRS (por exemplo, uma EDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVT terceira cadeia de VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGC polipeptídeo de uma LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL proteína de ligação QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDH triespecífica da KPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAG presente invenção) GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV
SQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC QEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSLG mAb2 Cadeia leve 2 DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSS SEQ ID (por exemplo, uma YGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRAT NO: 63 quarta cadeia de GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYY polipeptídeo de uma CQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFI proteína de ligação FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ triespecífica da WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLS presente invenção) STLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVT
KSFNRGEC mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID IgG1(hole) LALA TSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTN NO: 64 P329A Cadeia pesada YAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSD 1 DTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGKGTTVTV (por exemplo, uma SSSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG segunda cadeia de FTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDK polipeptídeo de uma SNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQ proteína de ligação MNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ triespecífica da GTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSG presente invenção) GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG
VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT PEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALAAPIEKTISKAKGQPR EPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS FFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSPG CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb2 IgG1(knob) QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID LALA P329A Cadeia TSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGT NO: 65 pesada 2 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRS (por exemplo, uma EDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVT terceira cadeia de VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC polipeptídeo de uma LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL proteína de ligação QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH triespecífica da KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPE presente invenção) AAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPR EEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKC KVSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEW ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQK
SLSLSPG mAb2 Cadeia leve 2 VER ACIMA. SEQ ID (por exemplo, uma NO: 63 quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID IgG1(hole) NNSA TSYYIHWVRQAPGQGLEWIGSIYPGNVNTN NO: 66 Cadeia pesada 1 YAQKFQGRATLTVDTSISTAYMELSRLRSD (por exemplo, uma DTAVYYCTRSHYGLDWNFDVWGKGTTVTV segunda cadeia de SSSQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASG polipeptídeo de uma FTFTKAWMHWVRQAPGKQLEWVAQIKDK proteína de ligação SNSYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQ triespecífica da MNSLRAEDTAVYYCRGVYYALSPFDYWGQ presente invenção) GTLVTVSSRTASTKGPSVFPLAPSSKSTSG
GTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSG VHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTC PPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNNASRVVSVLTVLHQDWLN GKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPRE PQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALH
NHYTQKSLSLSPG CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb2 IgG1(knob) QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID NNSA Cadeia pesada TSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGT NO: 67 2 NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRS (por exemplo, uma EDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVT terceira cadeia de VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC polipeptídeo de uma LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL proteína de ligação QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH triespecífica da KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL presente invenção) LGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPG CD38VH1 Cadeia leve VER ACIMA. SEQ ID 2 NO: 63 (por exemplo, uma quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID IgG4(hole) FALA NO: 60 Cadeia pesada 1 (por exemplo, uma segunda cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção)
mAb6 IgG4(knob) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTF SEQ ID FALA Cadeia pesada SSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSN NO: 68 2 KYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLR (por exemplo, uma AEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVS terceira cadeia de SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLV polipeptídeo de uma KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ proteína de ligação SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHK triespecífica da PSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGG presente invenção) PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
QEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ FNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC QEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS
LSLG mAb6 Light2 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR SEQ ID (por exemplo, uma NDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVP NO: 69 quarta cadeia de SRFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCL polipeptídeo de uma QDYIYYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP proteína de ligação SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK triespecífica da VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST presente invenção) LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID IgG1(hole) LALA NO: 64 P329A Cadeia pesada 1 (por exemplo, uma segunda cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6 IgG1(knob) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTF SEQ ID LALA P329A Cadeia SSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSN NO: 70 pesada 2 KYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLR (por exemplo, uma AEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVS terceira cadeia de SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV polipeptídeo de uma KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ proteína de ligação SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK triespecífica da PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEA presente invenção) AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALAAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP CRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPG mAb6 Light2 VER ACIMA. SEQ ID (por exemplo, uma NO: 69 quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID IgG1(hole) NNSA NO: 66 Cadeia pesada 1 (por exemplo, uma segunda cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 61 (por exemplo, uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6 IgG1(knob) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTF SEQ ID NNSA Cadeia pesada SSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSN NO: 71 2 KYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLR (por exemplo, uma AEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVS terceira cadeia de SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV polipeptídeo de uma KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ proteína de ligação SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK triespecífica da PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL presente invenção) GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD
VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNNASRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPC RDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPG mAb6 Light2 VER ACIMA. SEQ ID (por exemplo, uma NO: 69 quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) anticorpo monovalente mAb1 mAb1 cadeia pesada QVQLQQSGAELVRSGASVKMSCKASGYTF SEQ ID TSF NO: 7
NMHWVKETPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN QKFKGKATLTADTSSSTAYMQISSLTSEDS AVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLA GPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG mAb1 cadeia leve DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDS SEQ ID YGNGFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLES NO: 8
GVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATY YCQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSV FIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAK VQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTY SLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSS
PVTKSFNRGEC anticorpo monovalente mAb2 mAb2 cadeia pesada QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID TSYAMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGQGGT NO: 15
NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRS EDTAVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH KPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEL LAGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV DVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS
LSLSPG mAb2 cadeia leve DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASQSVSS SEQ ID YGQGFMHWYQQKPGQPPRLLIYGASSRAT NO: 16
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYY CQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV
TKSFNRGEC anticorpo monovalente mAb3 mAb3 cadeia pesada QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKASGYTF SEQ ID TSF NO: 19
NMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN QKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDT AVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLA GPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG mAb3 cadeia leve DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDS SEQ ID YGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT NO: 20
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYY CQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV
TKSFNRGEC anticorpo monovalente mAb4 mAb4 cadeia pesada QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKASGYTF SEQ ID TSF NO: 22
NMHWVKEAPGQGLEWIGYIYPGNGGTNYN QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDT AVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLA GPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG mAb4 cadeia leve DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDS SEQ ID YGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT NO: 20
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYY CQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV
TKSFNRGEC anticorpo monovalente mAb5 mAb5 cadeia pesada QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKASGYTF SEQ ID TSF NO: 24
NMHWVKEAPGQRLEWIGYIYPGNGGTNYN QKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDT AVYFCARTGGLRRAYFTYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKP SNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLA GPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ YNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL
SPG mAb5 cadeia leve DIVLTQSPATLSLSPGERATISCRASESVDS SEQ ID YGNGFMHWYQQKPGQPPRLLIYLASSRAT NO: 20
GIPARFSGSGSGTDFTLTISPLEPEDFAVYY CQQNKEDPWTFGGGTKLEIKRTVAAPSVF IFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSL SSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPV
TKSFNRGEC anticorpo monovalente mAb6 mAb6 cadeia pesada QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTF SEQ ID SSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSN NO: 11
KYYADSVKGRFTISGDNSKNTLYLQMNSLR AEDTAVYYCARMFRGAFDYWGQGTLVTVS SASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV KDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHK PSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL AGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPG mAb6 cadeia leve AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIR SEQ ID NDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVP NO: 12
S RFSGSGSGTDFTLTISGLQPEDSATYYCLQ DYIYYPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC anticorpo monovalente mAb7 mAb7 cadeia pesada QVQLVQSGAEVAKPGTSVKLSCKASGYTF SEQ ID TDYWMQWVKQRPGQGLEWIGTIYPGDGD NO: 107
TGYAQKFQGKATLTADKSSKTVYMHLSSLA SEDSAVYYCARGDYYGSNSLDYWGQGTS VTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTC VVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEY KCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVE WESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSK LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYT
QKSLSLSPGK mAb7 cadeia leve DIVMTQSHLSMSTSLGDPVSITCKASQDVS SEQ ID TVVAWYQQKPGQSPRRLIYSASYRYIGVPD NO: 106
RFTGSGAGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCQQ HYSPPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKS
FNRGEC Tabela J: Sequências de polinucleotídeo de comprimento total de proteínas de ligação. mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCG SEQ ID IgG4(hole) FALA AGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAA NO: 72 Cadeia pesada 1 GGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACC (por exemplo, TTTACCAGCTACTACATCCACTGGGTGCG codificando uma CCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGG segunda cadeia de ATCGGCAGCATCTACCCCGGCAACGTGA polipeptídeo de uma ACACCAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGG proteína de ligação CAGAGCCACCCTGACCGTGGACACCAGC triespecífica da ATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCC presente invenção) GGCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTA
CTACTGCACCCGGTCCCACTACGGCCTG GATTGGAACTTCGACGTGTGGGGCAAGG GCACCACCGTGACAGTGTCTAGCAGCCA GGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGA GTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGAC TGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTT CACCAAGGCCTGGATGCACTGGGTGCGC CAGGCCCCTGGAAAGCAGCTGGAATGGG TGGCCCAGATCAAGGACAAGAGCAACAG CTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACG ACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGAT GAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTCGGGGCGTGTACTAT GCCCTGAGCCCCTTCGATTACTGGGGCC AGGGAACCCTCGTGACCGTGTCTAGTCG GACCGCCAGCACAAAGGGCCCATCGGTG TTCCCTCTGGCCCCTTGCAGCAGAAGCA CCAGCGAATCTACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCC GTGACCGTGTCCTGGAACTCTGGCGCTC TGACAAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGC CGTGCTCCAGAGCAGCGGCCTGTACTCT CTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCA GCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTG TAACGTGGACCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGCGGGTGGAATCTAAGT ACGGCCCTCCCTGCCCTCCTTGCCCAGC CCCTGAAGCTGCCGGCGGACCCTCCGTG TTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACAC CCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGG AAGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTAC GTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCA AGACCAAGCCCAGAGAGGAACAGTTCAA CAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACG GCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAA CAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAA ACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCC GCGAGCCTCAAGTGTGTACCCTGCCCCC TAGCCAGGAAGAGATGACCAAGAACCAG GTGTCCCTGAGCTGTGCCGTGAAAGGCT TCTACCCCAGCGACATTGCCGTGGAATG GGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACA GCGACGGCTCATTCTTCCTGGTGTCCAA GCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAG GAAGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGA TGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACAC
CCAGAAGTCCCTGTCTCTGTCCCTGGGC CD28supxCD3mid GACATCGTGATGACCCAGACCCCCCTGA SEQ ID Cadeia leve 1 GCCTGAGCGTGACACCTGGACAGCCTGC NO: 73 (por exemplo, CAGCATCAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGC codificando uma CTGGTGCACAACAACGCCAACACCTACCT primeira cadeia de GAGCTGGTATCTGCAGAAGCCCGGCCAG polipeptídeo de uma AGCCCCCAGTCCCTGATCTACAAGGTGT proteína de ligação CCAACAGATTCAGCGGCGTGCCCGACAG triespecífica da ATTCTCCGGCAGCGGCTCTGGCACCGAC presente invenção) TTCACCCTGAAGATCAGCCGGGTGGAAG
CCGAGGACGTGGGCGTGTACTATTGTGG CCAGGGCACCCAGTACCCCTTCACCTTT GGCAGCGGCACCAAGGTGGAAATCAAGG GCCAGCCCAAGGCCGCCCCCGACATCCA GATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGTCT GCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCA CCTGTCAGGCCAGCCAGAACATCTACGT GTGGCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCC GGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACA AGGCCAGCAACCTGCACACCGGCGTGCC CAGCAGATTTTCTGGCAGCGGCTCCGGC ACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCT GCAGCCCGAGGACATTGCCACCTACTAC TGCCAGCAGGGCCAGACCTACCCCTACA CCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAAAT CAAGACCAAGGGCCCCAGCCGTACGGTG GCCGCTCCCAGCGTGTTCATCTTCCCAC CTAGCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCAC AGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTGAACAACT TCTACCCCCGCGAGGCCAAAGTGCAGTG GAAGGTGGACAACGCCCTGCAGAGCGGC AACAGCCAGGAAAGCGTGACCGAGCAGG ACAGCAAGGACTCCACCTACAGCCTGAG CAGCACCCTGACACTGAGCAAGGCCGAC TACGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCG AAGTGACCCACCAGGGCCTGTCTAGCCC CGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGCGAG
TGT mAb2 IgG4(knob) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCG SEQ ID FALA Cadeia pesada AAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAA NO: 74 2 GGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACC (por exemplo, TTTACCAGCTACGCCATGCACTGGGTCAA codificando uma AGAGGCCCCTGGCCAGAGACTGGAATGG terceira cadeia de ATCGGCTACATCTACCCCGGCCAGGGCG polipeptídeo de uma GCACCAACTACAACCAGAAGTTCCAGGG proteína de ligação CAGAGCCACCCTGACCGCCGATACAAGC triespecífica da GCCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCA presente invenção) GCCTGCGGAGCGAGGATACCGCCGTGTA
CTTCTGTGCCAGAACAGGCGGCCTGAGG CGGGCCTACTTTACCTATTGGGGCCAGG GCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTAG CACAAAGGGCCCATCGGTGTTCCCTCTG GCCCCTTGCAGCAGAAGCACCAGCGAAT CTACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAA GGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTG TCCTGGAACTCTGGCGCTCTGACAAGCG GCGTGCACACCTTTCCAGCCGTGCTCCA GAGCAGCGGCCTGTACTCTCTGAGCAGC GTCGTGACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGG GCACCAAGACCTACACCTGTAACGTGGA CCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGCGGGTGGAATCTAAGTACGGCCCTC CCTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTGAAGC TGCCGGCGGACCCTCCGTGTTCCTGTTC CCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGA TCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCGT GGTGGTGGATGTGTCCCAGGAAGATCCC GAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGACG GCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAA GCCCAGAGAGGAACAGTTCAACAGCACC TACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGC TGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGA GTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGC CTGCCCAGCTCCATCGAGAAAACCATCA GCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAGC CTCAAGTGTATACCCTGCCCCCTTGCCAG GAAGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCC TGTGGTGTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCC AGCGACATTGCCGTGGAATGGGAGAGCA ACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGAC CACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGC TCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGT GGACAAGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAA CGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGT
CCCTGTCTCTGTCCCTGGGC mAb2 Cadeia leve 2 GACATCGTGCTGACACAGAGCCCTGCCA SEQ ID (por exemplo, CCCTGTCTCTGAGCCCTGGCGAGAGAGC NO: 75 codificando uma CACCATCAGCTGTAGAGCCAGCCAGAGC quarta cadeia de GTGTCCAGCTACGGCCAGGGCTTCATGC polipeptídeo de uma ACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCCAGCC proteína de ligação CCCCAGACTGCTGATCTATGGCGCCAGC triespecífica da AGCAGAGCCACAGGCATCCCCGCCAGAT presente invenção) TTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTT
CACCCTGACAATCAGCCCCCTGGAACCC GAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGC AGAACAAAGAGGACCCCTGGACCTTCGG CGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGT ACGGTGGCCGCTCCCAGCGTGTTCATCT TCCCACCTAGCGACGAGCAGCTGAAGTC CGGCACAGCCTCTGTCGTGTGCCTGCTG AACAACTTCTACCCCCGCGAGGCCAAGG TGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCA GAGCGGCAACAGCCAGGAAAGCGTGACC GAGCAGGACAGCAAGGACTCCACCTACA GCCTGAGCAGCACCCTGACCCTGTCCAA GGCCGATTACGAGAAGCACAAGGTGTAC GCCTGCGAAGTGACCCACCAGGGCCTGT CTAGCCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCG
GGGCGAGTGC mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCG SEQ ID IgG1(hole) LALA AGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAA NO: 76 P329A Cadeia pesada GGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACC 1 TTTACCAGCTACTACATCCACTGGGTGCG (por exemplo, CCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGG codificando uma ATCGGCAGCATCTACCCCGGCAACGTGA segunda cadeia de ACACCAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGG polipeptídeo de uma CAGAGCCACCCTGACCGTGGACACCAGC proteína de ligação ATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCC triespecífica da GGCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTA presente invenção) CTACTGCACCCGGTCCCACTACGGCCTG
GATTGGAACTTCGACGTGTGGGGCAAGG GCACCACCGTGACAGTGTCTAGCAGCCA GGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGA GTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGAC TGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTT CACCAAGGCCTGGATGCACTGGGTGCGC CAGGCCCCTGGAAAGCAGCTGGAATGGG TGGCCCAGATCAAGGACAAGAGCAACAG CTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACG ACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGAT GAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTCGGGGCGTGTACTAT GCCCTGAGCCCCTTCGATTACTGGGGCC AGGGAACCCTCGTGACCGTGTCTAGTCG GACCGCCAGCACAAAGGGCCCCAGCGTG TTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCA CATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCC GTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCC TGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGC TGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACAGC CTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCA GCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGA GCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCC TTGTCCTGCCCCCGAAGCCGCCGGAGGC CCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCC CAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACC CCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATG TGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG CACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGG AACAGTACAACAGCACCTACCGGGTGGT GTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGAC TGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCA AGGTGTCCAACAAGGCCCTGGCCGCCCC CATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAG GGCCAGCCCCGCGAACCCCAGGTGTGCA CACTGCCCCCAAGCAGGGACGAGCTGAC CAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGTGCC GTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGC CGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCC GAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTG TGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCT GGTGTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCC CGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTG
AGCCCCGGC CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 73
(por exemplo, codificando uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb2 IgG1(knob) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCG SEQ ID LALA P329A Cadeia AAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAA NO: 77 pesada 2 GGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACC
TTTACCAGCTACGCCATGCACTGGGTCAA
AGAGGCCCCTGGCCAGAGACTGGAATGG (por exemplo,
ATCGGCTACATCTACCCCGGCCAGGGCG codificando uma
GCACCAACTACAACCAGAAGTTCCAGGG terceira cadeia de
CAGAGCCACCCTGACCGCCGATACAAGC polipeptídeo de uma
GCCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCA proteína de ligação
GCCTGCGGAGCGAGGATACCGCCGTGTA triespecífica da
CTTCTGTGCCAGAACAGGCGGCCTGAGG presente invenção)
CGGGCCTACTTTACCTATTGGGGCCAGG GCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTAG CACAAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTG GCCCCTAGCAGCAAGAGCACATCTGGCG GAACAGCCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAA GGACTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTG TCCTGGAATTCTGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTTCCAGCTGTGCTGCA GTCCAGCGGCCTGTACAGCCTGAGCAGC GTCGTGACAGTGCCCAGCAGCTCTCTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAA CCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC AAGAAGGTGGAACCCAAGAGCTGCGACA AGACCCACACCTGTCCCCCTTGTCCTGC CCCCGAAGCCGCCGGAGGCCCTTCCGTG TTCCTGTTCCCCCCAAAGCCCAAGGACAC CCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAAGTG ACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCACG AGGACCCTGAAGTGAAGTTCAATTGGTAC GTGGACGGCGTGGAAGTGCACAACGCCA AGACCAAGCCAAGAGAGGAACAGTACAA CAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTG ACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACG GCAAAGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAA CAAGGCCCTGGCCGCCCCCATCGAGAAA ACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCC GCGAACCCCAGGTGTACACACTGCCCCC ATGCAGGGACGAGCTGACCAAGAACCAG GTGTCCCTGTGGTGTCTGGTGAAAGGCT TCTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAATG GGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAAC TACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACA GCGACGGCTCATTCTTCCTGTACTCCAAG CTGACAGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGC AGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGAT GCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACC
CAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCCCGGC mAb2 Cadeia leve 2 VER ACIMA. SEQ ID (por exemplo, NO: 75 codificando uma quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCG SEQ ID IgG1(hole) NNSA AGGTCGTGAAACCTGGCGCCTCTGTGAA NO: 78 Cadeia pesada 1 GGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACC (por exemplo, TTTACCAGCTACTACATCCACTGGGTGCG codificando uma CCAGGCCCCTGGACAGGGACTGGAATGG segunda cadeia de ATCGGCAGCATCTACCCCGGCAACGTGA polipeptídeo de uma ACACCAACTACGCCCAGAAGTTCCAGGG proteína de ligação CAGAGCCACCCTGACCGTGGACACCAGC triespecífica da ATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCC presente invenção) GGCTGAGAAGCGACGACACCGCCGTGTA
CTACTGCACCCGGTCCCACTACGGCCTG GATTGGAACTTCGACGTGTGGGGCAAGG GCACCACCGTGACAGTGTCTAGCAGCCA GGTGCAGCTGGTGGAATCTGGCGGCGGA GTGGTGCAGCCTGGCAGAAGCCTGAGAC TGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTT CACCAAGGCCTGGATGCACTGGGTGCGC CAGGCCCCTGGAAAGCAGCTGGAATGGG TGGCCCAGATCAAGGACAAGAGCAACAG CTACGCCACCTACTACGCCGACAGCGTG AAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACG ACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGAT GAACAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGC CGTGTACTACTGTCGGGGCGTGTACTAT GCCCTGAGCCCCTTCGATTACTGGGGCC AGGGAACCCTCGTGACCGTGTCTAGTCG GACCGCCAGCACAAAGGGCCCCAGCGTG TTCCCTCTGGCCCCTAGCAGCAAGAGCA CATCTGGCGGAACAGCCGCCCTGGGCTG CCTCGTGAAGGACTACTTTCCCGAGCCC GTGACCGTGTCCTGGAATTCTGGCGCCC TGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCAGC TGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACAGC CTGAGCAGCGTCGTGACAGTGCCCAGCA GCTCTCTGGGCACCCAGACCTACATCTG CAACGTGAACCACAAGCCCAGCAACACC AAGGTGGACAAGAAGGTGGAACCCAAGA GCTGCGACAAGACCCACACCTGTCCCCC TTGTCCTGCCCCCGAACTGCTGGGAGGC CCTTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCAAAGCC CAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACC CCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGTGGATG TGTCCCACGAGGACCCTGAAGTGAAGTT CAATTGGTACGTGGACGGCGTGGAAGTG CACAACGCCAAGACCAAGCCAAGAGAGG AACAGTACAACAATGCCTCCCGGGTGGT GTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGAC TGGCTGAACGGCAAAGAGTACAAGTGCA AGGTGTCCAACAAGGCCCTGCCTGCCCC CATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAG GGCCAGCCCCGCGAACCCCAGGTGTGCA CACTGCCCCCAAGCAGGGACGAGCTGAC CAAGAACCAGGTGTCCCTGAGCTGTGCC GTGAAAGGCTTCTACCCCTCCGATATCGC CGTGGAATGGGAGAGCAACGGCCAGCCC GAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTG TGCTGGACAGCGACGGCTCATTCTTCCT GGTGTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCC CGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCAGCT GCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAA CCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTG
AGCCCCGGC CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb2 IgG1(knob) CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGCGCCG SEQ ID NNSA Cadeia pesada AAGTCGTGAAACCTGGCGCCTCCGTGAA NO: 79 2 GGTGTCCTGCAAGGCCAGCGGCTACACC (por exemplo, TTTACCAGCTACGCCATGCACTGGGTCAA codificando uma AGAGGCCCCTGGCCAGAGACTGGAATGG terceira cadeia de ATCGGCTACATCTACCCCGGCCAGGGCG polipeptídeo de uma GCACCAACTACAACCAGAAGTTCCAGGG proteína de ligação CAGAGCCACCCTGACCGCCGATACAAGC triespecífica da GCCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCA presente invenção) GCCTGCGGAGCGAGGATACCGCCGTGTA
CTTCTGTGCCAGAACAGGCGGCCTGAGG CGGGCCTACTTTACCTATTGGGGCCAGG GCACCCTCGTGACCGTGTCTAGCGCTAG CACAAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTG GCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGG GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAA GGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTG TCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCG GCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACA GTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGC GTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGG GCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAAT CACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACA AGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAA ACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCAC CTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTT CCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACC CTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGA AGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTATG TTGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAA GACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAAC AATGCCTCCCGTGTGGTCAGCGTCCTCA CCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGG CAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAC AAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAA CCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCA TGCCGGGATGAGCTGACCAAGAATCAAG TCAGCCTGTGGTGCCTGGTAAAAGGCTT CTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGG GAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCAAAAC TCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCA GGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATG CATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGC
AGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGT mAb2 Cadeia leve 2 VER ACIMA. SEQ ID (por exemplo, NO: 75 codificando uma quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID IgG4(hole) FALA NO: 72 Cadeia pesada 1 (por exemplo, codificando uma segunda cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção)
mAb6 IgG4(knob) CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGA SEQ ID FALA Cadeia pesada GGCGTGGTGCAGCCTGGCAGGTCTCTGA NO: 80 2 GACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAC (por exemplo, CTTCAGCAGCTACGGAATGCACTGGGTG codificando uma CGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAAT terceira cadeia de GGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGGCAG polipeptídeo de uma CAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAG proteína de ligação GGCCGGTTCACCATCAGCGGCGACAACA triespecífica da GCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAA presente invenção) CAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGT
GTACTACTGCGCCAGAATGTTCAGAGGC GCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAC TCGTGACCGTGTCTAGTGCGTCGACCAA GGGCCCATCGGTGTTCCCTCTGGCCCCT TGCAGCAGAAGCACCAGCGAATCTACAG CCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTA CTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGG AACTCTGGCGCTCTGACAAGCGGCGTGC ACACCTTTCCAGCCGTGCTCCAGAGCAG CGGCCTGTACTCTCTGAGCAGCGTCGTG ACAGTGCCCAGCAGCAGCCTGGGCACCA AGACCTACACCTGTAACGTGGACCACAA GCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGG GTGGAATCTAAGTACGGCCCTCCCTGCC CTCCTTGCCCAGCCCCTGAAGCTGCCGG CGGACCCTCCGTGTTCCTGTTCCCCCCA AAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCC GGACCCCCGAAGTGACCTGCGTGGTGGT GGATGTGTCCCAGGAAGATCCCGAGGTG CAGTTCAATTGGTACGTGGACGGCGTGG AAGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAG AGAGGAACAGTTCAACAGCACCTACCGG GTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACC AGGACTGGCTGAACGGCAAAGAGTACAA GTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCC AGCTCCATCGAGAAAACCATCAGCAAGG CCAAGGGCCAGCCCCGCGAGCCTCAAGT GTATACCCTGCCCCCTTGCCAGGAAGAG ATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGTGGT GTCTCGTGAAAGGCTTCTACCCCAGCGA CATTGCCGTGGAATGGGAGAGCAACGGC CAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCC CCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCTCATT CTTCCTGTACTCCAAGCTGACCGTGGACA AGAGCCGGTGGCAGGAAGGCAACGTGTT CAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTG CACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTC
TCTGTCCCTGGGC mAb6 Light2 GCCATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCA SEQ ID (por exemplo, GCCTGTCTGCCAGCGTGGGCGACAGAGT NO: 81 codificando uma GACCATCACCTGTAGAGCCAGCCAGGGC quarta cadeia de ATCCGGAACGACCTGGGCTGGTATCAGC polipeptídeo de uma AGAAGCCTGGCAAGGCCCCCAAGCTGCT proteína de ligação GATCTACGCCGCTAGCTCTCTGCAGTCC triespecífica da GGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCAGCG presente invenção) GCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACAAT
CTCTGGCCTGCAGCCCGAGGACAGCGCC ACCTACTACTGTCTGCAAGACTACATCTA CTACCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAG GTGGAAATCAAGCGTACGGTGGCCGCTC CCAGCGTGTTCATCTTCCCACCTAGCGAC GAGCAGCTGAAGTCCGGCACAGCCTCTG TCGTGTGCCTGCTGAACAACTTCTACCCC CGCGAGGCCAAAGTGCAGTGGAAGGTGG ACAACGCCCTGCAGAGCGGCAACAGCCA GGAAAGCGTGACCGAGCAGGACAGCAAG GACTCCACCTACAGCCTGAGCAGCACCC TGACACTGAGCAAGGCCGACTACGAGAA GCACAAGGTGTACGCCTGCGAAGTGACC CACCAGGGCCTGTCTAGCCCCGTGACCA
AGAGCTTCAACCGGGGCGAGTGT mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID IgG1(hole) LALA NO: 76 P329A Cadeia pesada 1 (por exemplo, codificando uma segunda cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6 IgG1(knob) CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGA SEQ ID LALA P329A Cadeia GGCGTGGTGCAGCCTGGCAGGTCTCTGA NO: 82 pesada 2 GACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAC (por exemplo, CTTCAGCAGCTACGGAATGCACTGGGTG codificando uma CGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAAT terceira cadeia de GGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGGCAG polipeptídeo de uma CAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAG proteína de ligação GGCCGGTTCACCATCAGCGGCGACAACA triespecífica da GCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAA presente invenção) CAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGT
GTACTACTGCGCCAGAATGTTCAGAGGC GCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAC TCGTGACCGTGTCTAGTGCGTCGACCAA GGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCT AGCAGCAAGAGCACATCTGGCGGAACAG CCGCCCTGGGCTGCCTCGTGAAGGACTA CTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCCTGG AATTCTGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTTCCAGCTGTGCTGCAGTCCAGC GGCCTGTACAGCCTGAGCAGCGTCGTGA CAGTGCCCAGCAGCTCTCTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAACCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGT GGAACCCAAGAGCTGCGACAAGACCCAC ACCTGTCCCCCTTGTCCTGCCCCCGAAG CCGCCGGAGGCCCTTCCGTGTTCCTGTT CCCCCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATG ATCAGCCGGACCCCCGAAGTGACCTGCG TGGTGGTGGATGTGTCCCACGAGGACCC TGAAGTGAAGTTCAATTGGTACGTGGACG GCGTGGAAGTGCACAACGCCAAGACCAA GCCAAGAGAGGAACAGTACAACAGCACC TACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGC TGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAAGA GTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGCC CTGGCCGCCCCCATCGAGAAAACCATCA GCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGCGAAC CCCAGGTGTACACACTGCCCCCATGCAG GGACGAGCTGACCAAGAACCAGGTGTCC CTGTGGTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCC CTCCGATATCGCCGTGGAATGGGAGAGC AACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGA CCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGG CTCATTCTTCCTGTACTCCAAGCTGACAG TGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAA CGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAG GCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGT
CCCTGAGCCTGAGCCCCGGC mAb6 Light2 VER ACIMA. SEQ ID (por exemplo, NO: 81 codificando uma quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID IgG1(hole) NNSA NO: 78 Cadeia pesada 1 (por exemplo, codificando uma segunda cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção)
CD28supxCD3mid VER ACIMA. SEQ ID Cadeia leve 1 NO: 73 (por exemplo, codificando uma primeira cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) mAb6 IgG1(knob) CAGGTGCAGCTGGTGGAAAGCGGCGGA SEQ ID NNSA Cadeia pesada GGCGTGGTGCAGCCTGGCAGGTCTCTGA NO: 83 2 GACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCAC (por exemplo, CTTCAGCAGCTACGGAATGCACTGGGTG codificando uma CGCCAGGCCCCTGGCAAAGGACTGGAAT terceira cadeia de GGGTGGCCGTGATTTGGTACGACGGCAG polipeptídeo de uma CAACAAGTACTACGCCGACAGCGTGAAG proteína de ligação GGCCGGTTCACCATCAGCGGCGACAACA triespecífica da GCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAA presente invenção) CAGCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGT
GTACTACTGCGCCAGAATGTTCAGAGGC GCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACAC TCGTGACCGTGTCTAGTGCGTCGACCAA GGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCC TCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTA CTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGG AACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGC ACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCA GGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCA GACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGC CCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACA CATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACT CCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTC CCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGAT CTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTG GTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTG AGGTCAAGTTCAACTGGTATGTTGACGGC GTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGC CGCGGGAGGAGCAGTACAACAATGCCTC CCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGT ACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTC CCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAA AGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAG GTGTACACCCTGCCCCCATGCCGGGATG AGCTGACCAAGAATCAAGTCAGCCTGTG GTGCCTGGTAAAAGGCTTCTATCCCAGC GACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCC TTCTTCCTCTACTCAAAACTCACCGTGGA CAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCT GCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTC
TCCCTGTCTCCGGGT mAb6 Light2 VER ACIMA. SEQ ID (por exemplo, NO: 81 codificando uma quarta cadeia de polipeptídeo de uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção) Polipeptídeos CD38
[00214] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende um sítio de ligação a antígeno que liga um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo. Ensaios exemplificativos para determinar se um sítio de ligação a antígeno liga um antígeno são descritos neste documento e conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, a ligação é determinada por ensaio ELISA, por exemplo, como descrito acima. Em algumas modalidades, a ligação é determinada por ensaio SPR, por exemplo, como descrito acima. Em algumas modalidades, a ligação é determinada por ensaio de citometria de fluxo usando células expressando um polipeptídeo CD38 em sua superfície celular, por exemplo, como descrito acima. Ver, por exemplo, Exemplos 1, 3 e 4.
[00215] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga um polipeptídeo purificado ou fragmento do mesmo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e/ou 30 (por exemplo, como medido por ELISA ou SPR). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga a polipeptídeo ou compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 e/ou 30 quando expressa na superfície de uma célula (por exemplo, como medido por citometria de fluxo).
[00216] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção se liga a um polipeptídeo de isoforma A de CD38 (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção se liga a um polipeptídeo de isoforma E de CD38 (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105 e não compreendendo a sequência de aminoácido total de SEQ ID NO: 1, que consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105, ou que consiste essencialmente na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção se liga a um polipeptídeo de isoforma A de CD38 (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) e um polipeptídeo de isoforma E de CD38 (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105 e não compreendendo a sequência de aminoácido total de SEQ ID NO: 1, que consiste na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105, ou que consiste essencialmente na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105). Sem desejar estar ligado à teoria, acredita-se que a ligação a um polipeptídeo de isoforma E de CD38 pode ser vantajosa, por exemplo, no direcionamento de uma proteína de ligação da presente invenção a célula(s) expressando um polipeptídeo de isoforma E de CD38. Sequência de polipeptídeo de domínio extracelular de isoforma A de CD38 humana
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAF KGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQ VQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNN PVSVFWKTVSRRFAEAACDVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVHN
LQPEKVQTLEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIQFSCKNI YRPDKFLQCVKNPEDSSCTSEI (SEQ ID NO: 1). Sequência de polipeptídeo de isoforma E de CD38 humano
RWRQQWSGPGTTKRFPETVLARCVKYTEIHPEMRHVDCQSVWDAF KGAFISKHPCNITEEDYQPLMKLGTQTVPCNKILLWSRIKDLAHQFTQ
VQRDMFTLEDTLLGYLADDLTWCGEFNTSKINYQSCPDWRKDCSNN PVSVFWKTVSRRHFWECGSP (SEQ ID NO: 105).
[00217] Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em algumas modalidades, o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30. Sequência de polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo
RWRQQWSGSGTTSRFPETVLARCVKYTEVHPEMRHVDCQSVWDA FKGAFISKYPCNITEEDYQPLVKLGTQTVPCNKTLLWSRIKDLAHQFT QVQRDMFTLEDMLLGYLADDLTWCGEFNTFEINYQSCPDWRKDCSN NPVSVFWKTVSRRFAETACGVVHVMLNGSRSKIFDKNSTFGSVEVH
NLQPEKVQALEAWVIHGGREDSRDLCQDPTIKELESIISKRNIRFFCK NIYRPDKFLQCVKNPEDSSCLSGI (SEQ ID NO: 30). Proteínas de ligação multiespecíficas (por exemplo, biespecífica, triespecífica ou multiespecífica) que ligam polipeptídeos CD38
[00218] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é uma proteína de ligação biespecífica compreendendo um sítio de ligação a antígeno que liga um ou mais polipeptídeos CD38 e um segundo sítio de ligação a antígeno que liga um antígeno alvo diferente. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é uma proteína de ligação biespecífica compreendendo um sítio de ligação a antígeno que liga um ou mais polipeptídeos CD38 e um segundo sítio de ligação a antígeno que liga um ou mais polipeptídeos CD38.
[00219] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é uma proteína de ligação triespecífica compreendendo um sítio de ligação a antígeno que liga um ou mais polipeptídeos CD38, um segundo sítio de ligação a antígeno, e um terceiro sítio de ligação a antígeno. Por exemplo, em algumas modalidades, um dos sítios de ligação a antígeno liga um ou mais polipeptídeo(s) CD38 (por exemplo, o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo e/ou humano), e um ou dois dos sítios de ligação a antígeno liga uma proteína de superfície de célula T. Em algumas modalidades, um dos sítios de ligação a antígeno liga um ou mais polipeptídeo(s) CD38 (por exemplo, o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo e/ou humano), um dos sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 humano, e um dos sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 humano. Polipeptídeos CD3 e CD28 humanos são conhecidos na técnica. As sequências de aminoácido de domínios variáveis de anticorpo exemplificativos e não limitantes que ligam polipeptídeos CD3 e CD28 humanos são providos neste documento.
[00220] Em algumas modalidades, são providas neste documento proteínas de ligação compreendendo três sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma ou mais proteínas alvo. Em algumas modalidades, pelo menos um dos três sítios de ligação a antígeno liga um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo. Em algumas modalidades, o polipeptídeo CD38 humano compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e/ou o polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que liga um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo e dois sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma proteína de superfície de célula T (por exemplo, um polipeptídeo CD28 humano e/ou um polipeptídeo CD3 humano).
[00221] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga uma ou mais proteínas alvo de tumor (por exemplo, um ou mais polipeptídeo(s) CD38) e uma ou mais proteínas alvo de célula T. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é capaz de ligar uma proteína alvo de tumor (por exemplo, um ou mais polipeptídeo(s) CD38) e dois diferentes epítopos em uma única proteína alvo de célula T. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é capaz de ligar uma proteína alvo de tumor (por exemplo, um ou mais polipeptídeo(s) CD38) e duas proteínas alvo de célula T diferentes(por exemplo, CD28 e CD3). Em algumas modalidades, a proteína de ligação é capaz de ligar uma proteína alvo de célula T e dois diferentes epítopos em uma única proteína alvo de tumor (por exemplo, um ou mais polipeptídeo(s) CD38). Em algumas modalidades, a proteína de ligação é capaz de ligar uma proteína alvo de célula T e duas proteínas alvo de tumor diferentes (por exemplo, um ou mais polipeptídeo(s) CD38 e outra proteína alvo de tumor). Em algumas modalidades, as primeira e segunda cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação formam dois sítios de ligação a antígeno que direcionam duas proteínas alvo de célula T, e as terceira e quarta cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação formam um sítio de ligação a antígeno que liga um ou mais polipeptídeo(s) CD38. Em algumas modalidades, as primeira e segunda cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação formam dois sítios de ligação a antígeno que direcionam duas proteínas alvo de tumor (por exemplo, um ou mais polipeptídeo(s) CD38 e outra proteína alvo de tumor), e as terceira e quarta cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação formam um sítio de ligação a antígeno que liga uma célula T proteína alvo. Em algumas modalidades, as uma ou mais proteínas alvo de célula T são um ou mais de CD3 e CD28.
[00222] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação especificamente se ligam a um ou mais polipeptídeo(s) CD38 e uma ou mais proteínas alvo em uma célula T incluindo um complexo receptor de célula T. Essas proteínas de ligação acopladoras de célula T são capazes de recruitar células T transientemente para células alvo e, ao mesmo tempo, ativar a atividade citolítica das células T. Exemplos de proteínas alvo em células T incluem, mas sem limitação, CD3 e CD28, entre outras. Exemplos adicionais de tais alvos de antígeno ou proteínas alvo são providos acima. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação triespecíficas podem ser geradas combinando o domínio de ligação a antígenos de dois ou mais anticorpos monoespecíficos (anticorpos de origem) em um anticorpo. Formatos de proteína de ligação biespecífica
[00223] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da descrição é uma proteína de ligação biespecífica e/ou bivalente compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam quatro sítios de ligação a antígeno que ligam um ou mais (por exemplo, dois) alvos de antígeno ou proteínas alvo diferentes (por exemplo, tendo uma estrutura descrita na Publicação Internacional Nº. WO2012/135345). Em algumas modalidades, a proteína de ligação é bivalente e/ou biespecífica. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é tetravalente e/ou tetraespecífica. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é tetravalente e/ou biespecífica. Em algumas modalidades, pelo menos um dos sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, o domínio extracelular de polipeptídeo CD38 humano e/ou de macaco cinomolgos).
[00224] Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende duas cadeias de polipeptídeo tendo uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] e duas cadeias de polipeptídeo têm uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1-Fc [II] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; Fc compreende uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2, CH3; L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido; e em que os polipeptídeos de fórmula I e os polipeptídeos de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada. Em algumas modalidades, VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno. Em algumas modalidades, VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno.
[00225] Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende duas cadeias de polipeptídeo que formam dois sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende
VL1-L1-VL2-L2-CL-Fc e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc em que: VLI é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina; Fc compreende uma região de dobradiça de imunoglobulina e Domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2, CH3; e L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido; em que os primeiro e segundo polipeptídeos formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada.
Em algumas modalidades, VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno.
Em algumas modalidades, VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno.
[00226] Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende três cadeias de polipeptídeo que formam dois sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende VL1-L1-VL2-L2-CL uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende VH2-L3-VHI-L4-CH1-Fc a terceira cadeia de polipeptídeo compreende um anticorpo Fc region em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é o domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina; Fc compreende uma região de dobradiça de imunoglobulina e Domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2, CH3; e
L1, L2, L3, e L4 são ligantes de aminoácido; em que os primeiro e segundo polipeptídeos formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada. Em algumas modalidades, VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno. Em algumas modalidades, VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno.
[00227] Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma primeira cadeia de polipeptídeo compreendendo uma estrutura representada pela fórmula: VL1-L1-VL2-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreendendo uma estrutura representada pela fórmula: VH2-L3-VH1-L4-CH1 [II] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada. Em algumas modalidades, VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno. Em algumas modalidades, VH2 e VL2 formam um domínio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, e VH1 e VL1 formam um domínio de ligação a antígeno que liga outro alvo de antígeno.
[00228] Em qualquer uma das proteínas de ligação biespecíficas descritas acima, o antígeno alvo que não CD38 pode ser qualquer um dos seguintes alvos de antígeno exemplificativos: A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (também conhecido como VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (também conhecido como MCP-1), CCL3 (também conhecido como MIP-1a), CCL4 (também conhecido como MIP-1b), CCL5 (também conhecido como RANTES), CCL7 (também conhecido como MCP-3), CCL8 (também conhecido como mcp-2), CCL11 (também conhecido como eotaxina), CCL15 (também conhecido como MIP-1d), CCL17 (também conhecido como TARC), CCL19 (também conhecido como MIP-3b), CCL20 (também conhecido como MIP-3a), CCL21 (também conhecido como MIP-2), CCL24 (também conhecido como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (também conhecido como TECK), CCL26 (também conhecido como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (também conhecido como FCER2, um receptor para IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (também conhecido como B7-1), CD86 (também conhecido como B7- 2), CD122, CD137 (também conhecido como 41BB), CD137L, CD152 (também conhecido como CTLA4), CD154 (também conhecido como CD40L), CD160, CD272, CD273 (também conhecido como PDL2), CD274 (também conhecido como PDL1), CD275 (também conhecido como B7H2), CD276 (também conhecido como B7H3), CD278 (também conhecido como ICOS), CD279 (também conhecido como PD-1), CDH1 (também conhecido como E-caderina), quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (também conhecido como M-CSF), CSF-2 (também conhecido como GM-CSF), CSF-3 (também conhecido como GCSF), CX3CL1 (também conhecido como SCYD1), CXCL12 (também conhecido como SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (também conhecido como um receptor para IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (também conhecido como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (também conhecido como um receptor para IL33), STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (também conhecido como um correceptor para IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, e XCR1 (também conhecido como GPR5/CCXCR1). Em algumas modalidades, um ou mais dos alvos de antígeno acima são alvos de antígeno humanos.
[00229] Em qualquer uma das proteínas de ligação biespecíficas descritas acima, qualquer ligante ou combinação de ligantes descrito neste documento pode ser usado. Por exemplo, em algumas modalidades, pelo menos um de L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3 ou L4 têm, cada um independentemente, pelo menos um aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, têm zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO: 57), L3 compreende a sequência S, e L4 compreende a sequência RT. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L2 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L3 tem 0 aminoácidos de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L2 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L3 têm 0 aminoácidos de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), L2 tem 0 aminoácidos de comprimento, L3 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Proteínas de ligação triespecíficas que se ligam a polipeptídeos CD38
[00230] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da descrição é uma proteína de ligação triespecífica e/ou trivalente compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam três sítios de ligação a antígeno que ligam um ou mais (por exemplo, três) alvos de antígeno ou proteínas alvo diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos um dos sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo
CD38 (por exemplo, o domínio extracelular de polipeptídeo CD38 humano e/ou de macaco cinomolgos). Em algumas modalidades, uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina;
CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina; dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada.
[00231] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da descrição é uma proteína de ligação triespecífica e/ou trivalente compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam três sítios de ligação a antígeno que ligam um ou mais (por exemplo, três) alvos de antígeno ou proteínas alvo diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos um dos sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, o domínio extracelular de polipeptídeo CD38 humano e/ou de macaco cinomolgos). Em algumas modalidades, uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula:
VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido; e em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada. Em algumas modalidades, a segunda e a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendem uma região Fc ligada a CH1, as regiões Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3.
[00232] Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeo têm uma orientação cruzada que forma dois sítios de ligação a antígeno distintos. Em algumas modalidades, o VH1 e VL1 formam um par de ligação e formam o primeiro sítio de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, o VH2 e
VL2 formam um par de ligação e formam o segundo sítio de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 (por exemplo, CD3 humano), e o segundo sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 (por exemplo, CD28 humano). Em algumas modalidades, o segundo sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 (por exemplo, CD3 humano), e o primeiro sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 (por exemplo, CD28 humano). Em algumas modalidades, o terceiro polipeptídeo e o quarto polipeptídeo formam um terceiro sítio de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, o VH3 e VL3 formam um par de ligação e formam o terceiro sítio de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, o terceiro sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, CD38 humano e opcionalmente de macaco cinomolgo). Formatos de proteína de ligação exemplificativos com orientações cruzadas contemplados para uso neste documento são também descritos em Pedido de Patente dos EUA Nº. de Série 15/487.243 e Pedido Internacional Nº. PCT/US2017/027488.
[00233] Em algumas modalidades em qualquer uma das proteínas de ligação biespecíficas, triespecíficas ou multiespecíficas descritas neste documento, um sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, CD38 humano e opcionalmente de macaco cinomolgo). Em algumas modalidades, outros (por exemplo, não ligação a CD38) sítio(s) de ligação a antígeno de qualquer uma das proteínas de ligação biespecíficas, triespecíficas ou multiespecíficas descritas neste documento se ligam a CD28 ou CD3. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-
L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQG (SEQ ID NO: 132), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR- L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
[00234] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e/ou o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e/ou o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e/ou o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46).
[00235] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46). Em algumas modalidades, o domínio
VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46).
[00236] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL1 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL2 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL3 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
[00237] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY
(SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
[00238] Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36). Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e/ou o domínio VL3 compreende uma sequência CDR- L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
[00239] Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, ou o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, ou o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, ou o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
18. Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23, ou o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, ou o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
[00240] Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, e/ou o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6. Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio
VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
18. Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18. Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
[00241] Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e/ou o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46).
[00242] Em algumas modalidades, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e/ou o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
[00243] Em algumas modalidades de qualquer uma das proteínas de ligação triespecíficas da presente invenção, um domínio de ligação a antígeno se liga a um polipeptídeo CD3 (por exemplo, CD3 humano) e um domínio de ligação a antígeno se liga a um polipeptídeo CD28 (por exemplo, CD28 humano). Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 49 ou 51 como mostrado na Tabela H, e o domínio VL1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 50 ou 52 como mostrado na Tabela H. Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 49 ou 51 como mostrado na Tabela H, e o domínio VL2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 50 ou 52 como mostrado na Tabela H. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 53 ou 84 como mostrado na Tabela H, e o domínio VL1 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 54 ou 85 como mostrado na Tabela H. Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 53 ou 84 como mostrado na Tabela H, e o domínio VL2 compreende três CDRs de SEQ ID NOs: 54 ou 85 como mostrado na Tabela H.
[00244] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54. Em algumas modalidades, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54.
[00245] Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14. Em algumas modalidades, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
10.
[00246] Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 62, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 65, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
63. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 68, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95%
idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO:
69. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 71, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma sequência de polipeptídeo que é pelo menos 95% idêntica à sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
[00247] Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 62, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 65, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 68, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69. Em determinadas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 71, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
[00248] Em qualquer uma das proteínas de ligação triespecíficas descritas acima, o antígeno alvo que não CD38 pode ser qualquer um dos seguintes alvos de antígeno exemplificativos: A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (também conhecido como VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (também conhecido como MCP-1), CCL3 (também conhecido como MIP-1a), CCL4 (também conhecido como MIP-1b), CCL5 (também conhecido como RANTES), CCL7 (também conhecido como MCP-3), CCL8 (também conhecido como mcp-2), CCL11 (também conhecido como eotaxina), CCL15 (também conhecido como
MIP-1d), CCL17 (também conhecido como TARC), CCL19 (também conhecido como MIP-3b), CCL20 (também conhecido como MIP-3a), CCL21 (também conhecido como MIP-2), CCL24 (também conhecido como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (também conhecido como TECK), CCL26 (também conhecido como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (também conhecido como FCER2, um receptor para IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (também conhecido como B7-1), CD86 (também conhecido como B7- 2), CD122, CD137 (também conhecido como 41BB), CD137L, CD152 (também conhecido como CTLA4), CD154 (também conhecido como CD40L), CD160, CD272, CD273 (também conhecido como PDL2), CD274 (também conhecido como PDL1), CD275 (também conhecido como B7H2), CD276 (também conhecido como B7H3), CD278 (também conhecido como ICOS), CD279 (também conhecido como PD-1), CDH1 (também conhecido como E-caderina), quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (também conhecido como M-CSF), CSF-2 (também conhecido como GM-CSF), CSF-3 (também conhecido como GCSF), CX3CL1 (também conhecido como SCYD1), CXCL12 (também conhecido como SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (também conhecido como um receptor para IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (também conhecido como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (também conhecido como um receptor para IL33), STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4,
TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (também conhecido como um correceptor para IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, e XCR1 (também conhecido como GPR5/CCXCR1). Em algumas modalidades, um ou mais dos alvos de antígeno acima são alvos de antígeno humanos.
[00249] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é um anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
[00250] As proteínas de ligação da descrição podem ser preparadas usando domínios ou sequências obtidos ou derivados de qualquer anticorpo humano ou não humano, incluindo, por exemplo, anticorpos humanos, de murino ou humanizados. Ligantes
[00251] Em algumas modalidades, os ligantes L1, L2, L3 e L4 variam de nenhum aminoácido (comprimento=0) a cerca de 100 aminoácidos de comprimento, ou menos de 100, 50, 40, 30, 20, ou 15 aminoácidos ou menos. Os ligantes podem também ter 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1 aminoácidos de comprimento. L1, L2, L3 e L4 em uma proteína de ligação pode ter todos a mesma sequência de aminoácido ou pode ter todos diferentes sequências de aminoácidos.
[00252] Exemplos de ligantes adequados incluem um único resíduo de glicina (Gly); um peptídeo de diglicina (Gly-Gly); um tripeptídeo (Gly- Gly-Gly); um peptídeo com quatro resíduos de glicina; um peptídeo com cinco resíduos de glicina; um peptídeo com seis resíduos de glicina; um peptídeo com sete resíduos de glicina; e um peptídeo com oito resíduos de glicina. Outras combinaçãos de resíduos de aminoácido podem ser usadas, tais como o peptídeo GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), o peptídeo GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), o peptídeo TKGPS (SEQ ID NO: 57), o peptídeo GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e o peptídeo GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Os exemplos listados acima não pretendem limitar o escopo da descrição de qualquer forma, e ligantes compreendendo aminoácidos selecionados aleatoriamente selecionados do grupo que consiste em valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, lisina, arginina, histidina, aspartato, glutamato, asparagina, glutamina, glicina e prolina mostraram se adequados nas proteínas de ligação. Para descrições adicionais de sequências de ligante, ver, por exemplo, WO2012135345 e Pedido Internacional Nº. PCT/US2017/027488.
[00253] A identidade e sequência de resíduos de aminoácido no ligante pode variar dependendo do tipo de elemento estrutural secundário necessário para alcançar no ligante. Por exemplo, glicina, serina e alanina são os melhores para ligantes com flexibilidade máxima. Algumas combinações de glicina, prolina, treonina e serina são úteis se for necessário um ligante mais rígido e estendido. Qualquer resíduo de aminoácido pode ser considerado um ligante em combinação com outros resíduos de aminoácido para construir ligantes de peptídeo maiores, como necessário dependendo das propriedades desejadas.
[00254] Em algumas modalidades, pelo menos um de L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3 ou L4 têm, cada um independentemente, pelo menos um aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, o comprimento de L1 é pelo menos duas vezes o comprimento de L3. Em algumas modalidades, o comprimento de L2 é pelo menos duas vezes o comprimento de L4. Em algumas modalidades, o comprimento de L1 é pelo menos duas vezes o comprimento de L3, e o comprimento de L2 é pelo menos duas vezes o comprimento de L4. Em algumas modalidades, L1 tem 3 a 12 resíduos de aminoácido de comprimento, L 2 tem 3 a 14 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 tem 1 a 8 resíduos de aminoácido de comprimento, e L4 tem 1 a 3 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 5 a 10 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 tem 5 a 8 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 tem 1 a 5 resíduos de aminoácido de comprimento, e L4 tem 1 a 2 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 7 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 tem 5 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 tem 1 resíduo de aminoácido de comprimento, e L4 tem 2 resíduos de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 tem 10 resíduos de aminoácido de comprimento, L2 tem 10 resíduos de aminoácido de comprimento, L3 tem 0 resíduos de aminoácido de comprimento, e L4 tem 0 resíduo de aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3, e L4 têm, cada um, um comprimento independentemente selecionado de 0 a 15 aminoácidos (por exemplo, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 aminoácidos), em que pelo menos dois dos ligantes têm um comprimento de 1 a 15 aminoácidos (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 aminoácidos). Em algumas modalidades, L1, L2, L3, e L4 têm, cada um, 0 aminoácidos de comprimento.
[00255] Em algumas modalidades, L1, L2, L3, e/ou L4 compreendem uma sequência derivada de uma sequência de ocorrência natural na junção entre um domínio variável de anticorpo e um domínio constante de anticorpo (por exemplo, como descrito no WO2012/135345). Por exemplo, em algumas modalidades, o ligante compreende uma sequência encontrada na transição entre um domínio VH e CH1 endógeno, ou entre um domínio VL e CL endógeno (por exemplo, kapa ou lambda). Em algumas modalidades, o ligante compreende uma sequência encontrada na transição entre um domínio VH e CH1 endógeno humano, ou entre um domínio VL e CL endógeno humano (por exemplo, humano kapa ou lambda).
[00256] Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, têm zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59).
[00257] Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO: 57), L3 compreende a sequência S, e L4 compreende a sequência RT. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L2 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L3 tem 0 aminoácidos de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L2 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L3 tem 0 aminoácidos de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), L2 tem 0 aminoácidos de comprimento, L3 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), e L4 tem 0 aminoácidos de comprimento. Domínios constantes e regiões Fc
[00258] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo de comprimento total ou uma cadeia de polipeptídeo compreendendo uma região Fc. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc humana, por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana. Em algumas modalidades, a região Fc inclui um anticorpo dobradiça, CH1, CH2, CH3, e opcionalmente CH4. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana. Em algumas modalidades, a região Fc inclui uma ou mais das mutações descritas acima.
[00259] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção inclui uma ou duas variantes Fc. O termo "variante Fc" como usado neste documento refere-se a uma molécula ou sequência que é modificada de uma Fc nativa, mas ainda compreende um sítio de ligação para o receptor de salvamento, FcRn (receptor Fc neonatal). Exemplos de variantes Fc, e sua interação com o receptor de salvamento, são conhecidos na técnica. Dessa forma, o termo "variante Fc" pode compreender uma molécula ou sequência que é humanizada a partir de uma Fc nativa não humana. Além disso, uma Fc nativa compreende regiões que podem ser removidas porque proveem recursos estruturais ou atividade biológica que não são necessários para as proteínas de ligação do tipo anticorpo da invenção. Dessa forma, o termo "variante Fc" compreende uma molécula ou sequência que não possui um ou mais sítios ou resíduos nativos de Fc, ou em que um ou mais sítios ou resíduos de Fc devem ser modificados, que afetam ou estão envolvidos em: (1) formação de ligação dissulfeto, (2) incompatibilidade com uma célula hospedeira selecionada, (3) heterogeneidade de terminal N após expressão em uma célula hospedeira selecionada, (4) glicosilação, (5) interação com complemento, (6) ligação a um receptor Fc que não um receptor de salvamento, ou (7) citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC).
[00260] Em algumas modalidades, a região Fc compreende uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam função efetora e/ou de ligação a receptor Fc da região Fc (por exemplo, fagocitose celular dependente de anticorpo mediada por receptor Fc (ADCP), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC)).
[00261] Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235 e/ou 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são L234A, L235A e/ou P329A. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299 e/ou 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são S298N, T299A e/ou Y300S.
[00262] Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam ligação de FcI e/ou FcII ligação. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam ligação de FcI e/ou FcII, mas não afetam ligação de FcRn. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228 e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são S228P e/ou R409K. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e/ou 235 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são F234A e/ou L235A. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 234, 235, e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são S228P, F234A, L235A e/ou R409K. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236. Em algumas modalidades, a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo mutações de aminoácido em substituições correspondentes às posições 228, 233-236, e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as mutações de aminoácido são S228P; E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236; e/ou R409K.
[00263] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a purificação, por exemplo, modulando a afinidade para um reagente de purificação. Por exemplo, sabe-se que proteínas de ligação heterodiméricas podem ser seletivamente purificadas a partir de sua forma homodimérica se uma das duas regiões Fc da forma heterodimérica contém mutações que reduzem ou eliminam ligação à Proteína A, porque a forma heterodimérica terá uma afinidade intermediária purificação com base em Proteína A do que a forma homodimérica e pode ser seletivamente eluída da Proteína A, por exemplo, por uso de um pH diferente (Ver, por exemplo, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são H435R e Y436F. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, e uma terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina C H2 e CH3; e em que apenas uma das primeira e segunda regiões Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são H435R e Y436F. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob e hole e uma ou mais mutações para melhorar a purificação. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana.
[00264] Para melhorar os rendimentos de algumas proteínas de ligação (por exemplo, proteínas de ligação biespecíficas ou triespecíficas), os domínios CH3 podem ser alterados pela tecnologoa "knob-into-holes" que é descrita em detalhes com vários exemplos em, por exemplo, Publicação Internacional Nº. WO 96/027011, Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9: 617-21; e Merchant et al., 1998, Nat. Biotechnol. 16: 677-81. Especificamente, as superfícies de interação dos dois domínios CH3 são alteradas para aumentar a heterodimerização de ambas as cadeias pesadas contendo esses dois domínios CH3. Cada um dos dois domínios CH3 (das duas cadeias pesadas) pode ser o "knob", enquanto o outro é o "hole". A introdução de uma ponte dissulfeto ainda estabiliza os heterodímeros (Merchant et al., 1998; Atwell et al., 1997, J. Mol. Biol. 270: 26-35) e aumenta o rendimento. Em modalidades particulares, o knob está no segundo par de polipeptídeos com um único domínio variável. Em outras modalidades, o knob está no primeiro par de polipeptídeos tendo a orientação cruzada. Ainda em outras modalidades, os domínios CH3 não incluem um knob in hole.
[00265] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção (por exemplo, uma proteína de ligação triespecífica) compreende uma mutação "knob" na segunda cadeia de polipeptídeo e uma mutação "hole" na terceira cadeia de polipeptídeo. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma mutação "knob" na terceira cadeia de polipeptídeo e uma mutação "hole" na segunda cadeia de polipeptídeo. Em algumas modalidades, a mutação "knob" compreende substituição(ões) em posições correspondentes às posições 354 e/ou 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são S354C, T366W, T366Y, S354C e T366W ou S354C e T366Y. Em algumas modalidades, a mutação "knob" compreende substituições em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são S354C e T366W. Em algumas modalidades, a mutação "hole" compreende substituição(ões) em posições correspondentes às posições 407 e, opcionalmente, 349, 366 e/ou 368 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são Y407V ou Y407T e opcionalmente Y349C, T366S e/ou L368A. Em algumas modalidades, a mutação "hole" compreende substituições em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A e Y407V.
[00266] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituição(ões) de aminoácido em posições correspondentes às posições 366 e opcionalmente 354 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são T366W ou T366Y e opcionalmente S354C; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituição(ões) de aminoácido em posições correspondentes às posições 407 e opcionalmente 349, 366, e/ou 368 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y407V ou Y407T e opcionalmente Y349C, T366S e/ou L368A.
[00267] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituição(ões) de aminoácido em posições correspondentes às posições 407 e opcionalmente 349, 366, e/ou 368 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y407V ou Y407T e opcionalmente Y349C, T366S e/ou L368A; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituição(ões) de aminoácido em posições correspondentes às posições 366 e opcionalmente 354 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são T366W ou T366Y e opcionalmente S354C.
[00268] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituição de aminoácido em posição correspondente à posição 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que a substituição de aminoácido é T366W; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituição(ões) de aminoácido em posições correspondentes às posições 366, 368, e/ou 407 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são T366S, L368A e/ou Y407V.
[00269] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituição(ões) de aminoácido em posições correspondentes às posições 366, 368, e/ou 407 e de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são T366S, L368A e/ou Y407V; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituição de aminoácido em posição correspondente à posição 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que a substituição de aminoácido é T366W.
[00270] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S354C e T366W; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S354C e T366W. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana.
[00271] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 354, 366, e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, S354C, T366W e R409K; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K. Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 354, 366 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, S354C, T366W e R409K.
[00272] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235, 354 e 366 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A, L235A, S354C e T366W; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235, 349, 366, 368 e 407 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A e Y407V. Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235, 349, 366, 368 e 407 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235, 354, e 366 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A, L235A, S354C e T366W.
[00273] Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 234, 235, 354, 366 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, F234A, L235A, S354C, T366W e R409K; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K. Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, em que a primeira região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 234, 235, 349, 366, 368, 407 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, F234A, L235A, Y349C, T366S, L368A, Y407V e R409K; e em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, em que a segunda região Fc é uma região Fc de IgG4 humana compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a segunda região Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228, 234, 235, 354, 366 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P, F234A, L235A, S354C, T366W e R409K.
[00274] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica (ver, por exemplo, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são M428L e N434S. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, e uma terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira e/ou segunda regiões Fc compreendem substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são M428L e N434S. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob e hole e uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana.
[00275] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a estabilidade, por exemplo, da interface de dímero e/ou região de dobradiça de IgG4 (ver, por exemplo, Spiess, C. et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:26583-26593). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P e R409K. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, e uma terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; em que a primeira e segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana; e em que a primeira e a segunda regiões Fc compreendem, cada uma, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P e R409K. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob e hole e uma ou mais mutações para melhorar a estabilidade. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana.
[00276] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a purificação, por exemplo, modulando a afinidade para um reagente de purificação. Por exemplo, sabe-se que proteínas de ligação heterodiméricas podem ser seletivamente purificadas a partir de sua forma homodimérica se uma das duas regiões Fc da forma heterodimérica contém mutação(ões) que reduzem ou eliminam ligação à Proteína A, porque a forma heterodimérica terá uma afinidade intermediária purificação com base na Proteína A do que a forma homodimérica e pode ser seletivamente eluída da Proteína A, por exemplo, por uso de um pH diferente (ver, por exemplo, Smith, E.J. et al. (2015) Sci. Rep. 5:17943). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são H435R e Y436F. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, e uma terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região
Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina C H2 e CH3; e em que apenas uma das primeira e segunda regiões Fc compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são H435R e Y436F. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob e hole e uma ou mais mutações para melhorar a purificação. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana.
[00277] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica (ver, por exemplo, Hinton, P.R. et al. (2006) J. Immunol. 176(1):346-56). Em algumas modalidades, a mutação compreende substituições em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são M428L e N434S. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, e uma terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, em que a primeira e/ou segunda regiões Fc compreendem substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 428 e 434 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são M428L e N434S. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob e hole e uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana.
[00278] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende uma ou mais mutações para reduzir a função efetora, por exemplo, fagocitose celular dependente de anticorpo mediada por receptor Fc (ADCP), citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC). Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; em que a primeira e segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana; e em que a primeira e a segunda regiões Fc compreendem, cada uma, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A e L235A. Em algumas modalidades, as regiões Fc da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são regiões Fc de IgG1 humana, e em que as regiões Fc compreendem, cada uma, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A e
L235A.
Em algumas modalidades, a segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; em que a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreende uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; em que a primeira e segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana; e em que a primeira e a segunda regiões Fc compreendem, cada uma, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A, L235A e P329A.
Em algumas modalidades, as regiões Fc da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são regiões Fc de IgG1 humana, e em que as regiões Fc compreendem, cada uma, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A, L235A e P329A.
Em algumas modalidades, as regiões Fc da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são regiões Fc de IgG4 humana, e as regiões Fc compreendem, cada uma, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A e L235A.
Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende uma segunda cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma primeira região Fc ligada a CH1, a primeira região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3, e uma terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendendo uma segunda região Fc ligada a CH1, a segunda região Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3; e em que a primeira e a segunda regiões Fc compreendem, cada uma, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A e L235A.
[00279] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende mutações knob e hole e uma ou mais mutações para reduzir a função efetora. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana. Em algumas modalidades, a primeira e/ou segunda regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana. Para outras descrições de mutações Fc na posição 329, ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604 e WO1999051642.
[00280] Em algumas modalidades, os tipos de mutations descritas acima podem ser combinados em qualquer ordem ou combinação. Por exemplo, uma proteína de ligação da presente invenção pode compreender duas ou mais das mutações "knob" e "hole", as uma ou mais mutações para melhorar a meia-vida sérica, as uma ou mais mutações para melhorar a estabilidade de IgG4, as uma ou mais mutações para melhorar a purificação e/ou as uma ou mais mutações para reduzir a função efetora descrita acima.
[00281] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção compreende um fragmento de anticorpo, incluindo, mas sem limitação, fragmentos F(ab), F(ab’)2, Fab’-SH, Fv ou scFv de anticorpo. Ensaios
[00282] A presente invenção provê proteínas de ligação a antígeno que ligam polipeptídeos CD38 humanos e/ou cinomolgos, induzem a proliferação de células T (por exemplo, célula T CD4+ e/ou CD8+), e/ou induzem a apoptose de células CD38+. Ensaios exemplificativos para medir esses parâmetros e identificar tais proteínas de ligação são providos neste documento. Por exemplo, em algumas modalidades, a afinidade de ligação entre uma proteína de ligação ou fragmento de ligação a antígeno da mesma e um polipeptídeo CD38 purificado é medida por SPR (por exemplo, como descrito acima), e afinidade de ligação entre uma proteína de ligação ou fragmento de ligação a antígeno da mesma e um polipeptídeo CD38 expresso na superfície de uma célula é medida por citometria de fluxo (por exemplo, como descrito acima).
[00283] Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno de uma proteína de ligação da presente invenção liga o polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, 1 nM ou menos, ou 0,8 nM ou menos, como medido por um ensaio de citometria de fluxo usando células que expressam o polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 em sua superfície celular, por exemplo, como descrito acima. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga o polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, 1 nM ou menos, ou 0,75 nM ou menos, como medido por um ensaio de citometria de fluxo usando células que expressam o polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 em sua superfície celular, por exemplo, como descrito acima. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga o polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, 1 nM ou menos, ou 0.83 nM ou menos, como medido por um ensaio SPR usando o polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, por exemplo, como descrito acima. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno liga o polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 3,5 nM ou menos, 1,5 nM ou menos, ou 1,0 nM ou menos, como medido por um ensaio SPR usando o polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30, por exemplo, como descrito acima. Como demonstrado neste documento, em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção pode ter uma ou mais das propriedades de ligação exemplificativas descritas neste documento. Em algumas modalidades, a KD é medida a 4°C ou 25°C.
[00284] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação monoespecífica da presente invenção possui uma ou mais das seguintes características: liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada com uma KD de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1,5 nM ou menos, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada com uma KD de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, 1 nM ou menos, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, 1 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105) como uma proteína purificada, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105)
expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; induz apoptose ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de uma célula expressando CD38 em sua superfície celular; e tem uma ou mais mutações (por exemplo, em uma região Fc) resultando em ligação reduzida a FcRI e/ou FcRII, em comparação com a mesma proteína de ligação sem as uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, humano ou de macaco cinomolgo) expresso na superfície de uma célula com um EC50 de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, humano ou de macaco cinomolgo) como uma proteína purificada com um EC50 de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos, como análise por ELISA. Em algumas modalidades, a KD é medida a 4°C ou 25°C.
[00285] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção possui uma ou mais das seguintes características: induz proliferação de células T (por exemplo, célula T CD4+ e/ou CD8+); induz expressão de células T (por exemplo, célula T CD4+ e/ou CD8+) de Bcl-xL; induz apoptose de células CD38+ (por exemplo, como medido por manchamento com Anexina V e/ou absorção de iodeto de propídio); liga-se a CD38 expresso na superfície de uma célula e um ou mais antígeno(s) alvo de célula T expresso(s) na superfície de uma célula T; liga-se a CD38 expresso na superfície de uma célula, CD28 expresso na superfície de uma célula T, e CD3 expresso na superfície de uma célula T; estimula ativação do receptor de célula T (por exemplo, como medido por expressão de CD69); induz coestimulação de sinalização de receptor de célula T (por exemplo,
como mediado por CD28); tem uma ou mais mutações (por exemplo, em uma região Fc) resultando em indução reduzida de liberação de citocina (por exemplo, IFN-, IL-2 e/ou TNF-α) por PBMCs, em comparação com a mesma proteína de ligação sem as uma ou mais mutações; induz liberação de citocina (por exemplo, IFN- e/ou IL-6) por PBMCs na presença de uma célula alvo CD38+ (por exemplo, como medido por imunoensaio); liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) como uma proteína purificada com uma KD de 1,5 nM ou menos, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 12 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) como uma proteína purificada com uma KD de 3,5 nM ou menos, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30) expresso na superfície de uma célula com uma KD aparente de 7,5 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105) como uma proteína purificada, como análise por SPR ou ELISA; liga-se ao domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105) expresso na superfície de uma célula, como análise por citometria de fluxo; induz apoptose ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) de uma célula expressando CD38 em sua superfície celular; e tem uma ou mais mutações (por exemplo, em uma região Fc) resultando em ligação reduzida a FcRI e/ou FcRII, em comparação com a mesma proteína de ligação sem as uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, humano ou de macaco cinomolgo) expresso na superfície de uma célula com um EC50 de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos, como análise por citometria de fluxo. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, humano ou de macaco cinomolgo) como uma proteína purificada com um EC50 de 20 nM ou menos, 15 nM ou menos, 12 nM ou menos, 10 nM ou menos, 5 nM ou menos, 2 nM ou menos, ou 1 nM ou menos, como análise por ELISA. Ácidos nucleicos
[00286] Metodologias de DNA recombinante padrão são usadas para construer os polinucleotídeos que codificam os polipeptídeos que formam as proteínas de ligação, incorporam esses polinucleotídeos em vetores de expressão recombinantes, e introduzem tais vetores em células hospedeiras. Ver, por exemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3ª ed.). Reações enzimáticas e técnicas de purificação podem ser realizadas de acordo com especificações do fabricante, como comumente realizado na técnica, ou como descrito neste documento. A menos que definições específicas sejam providas, a nomenclatura usada em conexão com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de, química analítica, química orgânica sintética e química medicinal e farmacêutica descritas neste documento são aquelas conhecidas e comumente usadas na técnica. Da mesma forma, técnicas convencionais podem ser usadas para sínteses químicas, análises químicas, preparação farmacêutica, formulação, entrega e tratamento de pacientes.
[00287] Outros aspectos da presente invenção referem-se a moléculas de ácido nucleico isoladas compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando qualquer uma das proteínas de ligação descritas neste documento. Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucleico isoladas compreendem uma sequência que é pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idêntica às SEQ ID NOs: 60-83 e/ou mostradas na Tabela J.
[00288] Determinados aspectos da presente invenção referem-se a kits de polinucleotídeos. Em algumas modalidades, um ou mais dos polinucleotídeos é um vetor (por exemplo, um vetor de expressão). Os kits podem encontrar uso, entre outros, na produção de uma ou mais das proteínas de ligação descritas neste documento, por exemplo, uma proteína de ligação triespecífica da presente invenção.
Em algumas modalidades, o kit compreende um, dois, três ou quatro polinucleotídeos mostrados na Tabela J (por exemplo, de mAb2xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, mAb2xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG4 FALA, mAb6xCD28supxCD3mid IgG1LALA P329A, ou mAb6xCD28supxCD3mid IgG1 NNSA). Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 72, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 74, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 77, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 79, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75. Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 72, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 80, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81. Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 82, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81. Em algumas modalidades, um kit de polinucleotídeos compreende: um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 83, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81.
[00289] Em algumas modalidades, o ácido nucleico isolado é operativamente ligado a um promotor heterólogo para direcionar a transcrição da sequência de ácido nucleico codificando proteína de ligação. Um promotor pode se referir a sequências de controle de ácido nucleico que direcionam a transcrição de um ácido nucleico. Uma primeira sequência de ácido nucleico é operativamente ligada a uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico é colocada em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Por exemplo, um promotor é operativamente ligado a uma sequência de codificação de uma proteína de ligação se o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Exemplos de promotores podem incluir, mas sem limitação, promotores obtidos a partir de genomas de vírus (tais como vírus do polioma, vírus da varíola), adenovírus (tais como o adenovírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, citomegalovírus, retrovírus, vírus da hepatite B, vírus de símio 40 (SV40) e similares), de promotores eucarióticos heterólogos (tais como o promotor de actina, um promotor de imunoglobulina, de promotores de choque térmico etc.), o promotor de CAG (Niwa et al.., Gene 108(2):193-9, 1991), o promotor de fosfoglicerato quinase (PGK), um promotor induzível por tetraciclina (Masui et al., Nucleic Acid Res. 33:e43, 2005), o sistema lac, o sistema trp, o sistema tac, o sistema trc, as principais regiões operadoras e promotoras de fago lambda, o promotor para 3-fosfoglicerato quinase, os promotores de fosfatase ácida da levedura, e o promotor dos fatores de alfa-correspondência de levedura. Os polinucleotídeos que codificam proteínas de ligação da presente invenção podem estar sob o controle de um promotor constitutivo, um promotor induzível ou qualquer outro promotor adequado descrito neste documento ou outro promotor adequado que será prontamente reconhecido por um versado na técnica.
[00290] Em algumas estatísticas, o ácido nucleico isolado é incorporado em um vetor. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão. Vetores de expressão podem incluir uma ou mais sequências reguladoras operacionalmente ligadas ao polinucleotídeo a ser expresso. O termo "sequência reguladora" inclui promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). Exemplos de intensificadores adequados podem incluir, mas sem limitação, sequências intensificadoras de genes de mamífero (tais como globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, insulina e similares), e sequências intensificadoras de um vírus de célula eucariótica (tal como intensificador SV40 no lado tardio da origem da replicação (pb 100-270), o intensificador de promotor precoce de citomegalovírus, o intensificador de polioma no lado tardio da origem de replicação, intensificadores de adenovírus e semelhantes). Exemplos de vetores adequados podem incluir, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, epissomas, transposons e vetores virais (por exemplo, adenovirais, vírus vaccinia, vírus Síndbis, sarampo, herpes viral, lentivirais, retrovirais, vetores virais adeno-associados etc.). Vetores de expressão podem ser usados para transfectar células hospedeiras, tais como, por exemplo, células bacterianas, células de leveduras, células de insetos e células de mamíferos. Vetores de DNA virais e de plasmídeo biologicamente funcionais capazes de expressão e replicação em um hospedeiro são conhecidos na técnica, e podem ser usados para transfectar qualquer célula de interesse.
[00291] Outros aspectos da presente invenção referem-se a um sistema de vetor compreendendo um ou mais vetores codificando uma primeira, segunda, terceira e quarta cadeias de polipeptídeo de qualquer uma das proteínas de ligação descritas neste documento. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor codificando a primeira cadeia de polipeptídeo da proteína de ligação, um segundo vetor codificando a segunda cadeia de polipeptídeo da proteína de ligação, um terceiro vetor codificando a terceira cadeia de polipeptídeo da proteína de ligação, e um quarto vetor codificando a quarta cadeia de polipeptídeo da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor codificando as primeira e segunda cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação, e um segundo vetor codificando as terceira e quarta cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor codificando as primeira e terceira cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação, e um segundo vetor codificando as segunda e quarta cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor codificando as primeira e quarta cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação, e um segundo vetor codificando a segunda e terceira cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação. Em algumas modalidades, o sistema de vetor compreende um primeiro vetor codificando as primeira, segunda, terceira e quarta cadeias de polipeptídeo da proteína de ligação. Os um ou mais vetores do sistema de vetor podem ser qualquer um dos vetores descritos neste documento. Em algumas modalidades, os um ou mais vetores são vetores de expressão. Células Hospedeiras Isoladas
[00292] Outros aspectos da presente invenção referem-se a uma célula hospedeira isolada compreendendo um ou mais polinucleotídeos isolados, kits de polinucleotídeo, vetores e/ou sistemas de vetor descritos neste documento. Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula bacteriana (por exemplo, uma célula de E. coli). Em algumas categorias, a célula hospedeira é uma célula de levedura (por exemplo, uma célula de S. cerevisiae). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de inseto. Exemplos de células hospedeiras de insetos podem incluir, por exemplo, células de Drosophila (por exemplo, células S2), células de Trichoplusia ni (por exemplo, células High Five™) e células de Spodoptera frugiperda (por exemplo, células Sf21 ou Sf9). Em algumas modalidades, a célula hospedeira é uma célula de mamífero. Exemplos de células hospedeiras de mamíferos podem incluir, por exemplo, células renais embrionárias humanas (por exemplo, 293 ou 293 células subclonadas para crescimento em cultura em suspensão), células Expi293TM, células CHO, células renais de hamster bebê (por exemplo, BHK, ATCC CCL 10), células de sertoli de camundongo (por exemplo, células TM4), células renais de macaco (por exemplo, CV1 ATCC CCL 70), células renais de macaco verde africano (por exemplo, VERO-76, ATCC CRL- 1587), células de carcinoma cervical humano (por exemplo, HELA, ATCC CCL 2), células de rim canino (por exemplo, MDCK, ATCC CCL 34), células de fígado de rato - búfalo (por exemplo, BRL 3A, ATCC CRL 1442), células de pulmão humano (por exemplo, W138, ATCC CCL 75), células hepáticas humanas (por exemplo, Hep G2, HB 8065), células tumorais mamárias de ratos (por exemplo, MMT 060562, ATCC CCL51),
células TRI, células MRC 5, células FS4, uma linhagem de hepatoma humano (por exemplo, Hep G2) e células de mieloma (por exemplo, células NS0 e Sp2/0).
[00293] Outros aspectos da presente invenção referem-se a um método de produção de qualquer uma das proteínas de ligação descritas neste documento. Em algumas modalidades, o método inclui a) cultivar uma célula hospedada (por exemplo, qualquer uma das células hospedeiras descritas neste documento) compreendendo um ácido nucleico isolado, vetor e/ou sistema de vetor (por exemplo, qualquer um dos ácidos nucleicos isolados, vetores e/ou sistemas de vetores descritos neste documento) em condições em que a célula hospedeira expressa a proteína de ligação; e b) isolar a proteína de ligação da célula hospedeira. Métodos de cultivar células hospedeiras sob condições para expressar uma proteína são bem conhecidos por um versado na técnica. Métodos de isolamento de proteínas de células hospedeiras cultivadas são bem conhecidos dos versados na técnica, incluindo, por exemplo, por cromatografia de afinidade (por exemplo, cromatografia de afinidade em duas etapas compreendendo cromatografia de afinidade com Proteína A seguida por cromatografia por exclusão de tamanho).
[00294] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é purificada por cromatografia de afinidade com Proteína A, cromatografia de afinidade de cadeia leve kapa (por exemplo, usando uma resina KapaSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare), e opcionalmente cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é purificada por cromatografia de afinidade com Proteína A, cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare), e opcionalmente cromatografia de afinidade de cadeia leve kapa (por exemplo, usando uma resina KapaSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare). Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende duas regiões Fc, cada um compreendendo um domínio CH3, e apenas um dos domínios CH3 compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 435 e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são H435R e Y436F.
Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é purificada por cromatografia de afinidade com Proteína A, em seguida, cromatografia de afinidade de cadeia leve kapa (por exemplo, usando uma resina KapaSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare), em seguida, opcionalmente cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare) em sequência.
Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é purificada por cromatografia de afinidade com Proteína A, em seguida, cromatografia de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, usando uma resina LambdaFabSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare), em seguida, opcionalmente cromatografia de afinidade de cadeia leve kapa (por exemplo, usando uma resina KapaSelect de acordo com instruções do fabricante; GE Healthcare) em sequência.
Por exemplo, em algumas modalidades, a proteína de ligação é contactada com Proteína A, eluída da Proteína A sob condições adequadas para isolar a proteína de ligação de proteínas de ligação compreendendo 0 ou 2 domínios CH3 compreendendo as substituições de aminoácido H435R e Y436F, contactada com um meio de afinidade de cadeia leve kapa (por exemplo, como usado na resina KapaSelect; GE Healthcare), e eluída do meio de afinidade de cadeia leve kapa sob condições adequadas para isolar a proteína de ligação de proteínas de ligação compreendendo apenas domínios lambda CL (por exemplo, de acordo com instruções do fabricante). Condições adequadas para a eluição de Proteína A são conhecidos na técnica, incluindo sem limitação, um gradiente de eluição em etapas de pH 4,5-2,8. Em algumas modalidades, Proteína A ou uma variante de Proteína A útil para purificação de proteína é usada.
Em algumas modalidades, a Proteína A é anexada a um substrato ou resina, por exemplo, como parte de um meio de cromatografia.
Em algumas modalidades, após eluição do meio de afinidade de cadeia leve kapa, a proteína de ligação é contactada com um meio de afinidade de cadeia leve lambda (por exemplo, como usado na resina LambdaFabSelect; GE Healthcare), e eluída do meio de afinidade de cadeia leve lambda sob condições adequadas para isolar a proteína de ligação de proteínas de ligação compreendendo apenas domínios kapa CL (por exemplo, de acordo com instruções do fabricante). Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é detectada usando cromatografia HIC.
Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende: uma primeira cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio lambda CL; um domínio CH3 de uma segunda cadeia de polipeptídeo que compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S354C e T366W; um domínio CH3 de uma terceira cadeia de polipeptídeo que compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 349, 366, 368, 407, 435, e 436 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A, Y407V, H435R e Y436F; e uma quarta cadeia de polipeptídeo que compreende um domínio kapa CL. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é produzida por uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é purificada de um meio de cultura celular ou extrato de célula hospedeira. Em algumas modalidades, as proteínas de ligação são secretadas por uma célula hospedeira ou produzidas e extraídas de uma célula hospedeira (por exemplo, antes de serem contactadas com a Proteína A). Em algumas modalidades, a proteína de ligação está em um meio de cultura celular ou extrato de célula hospedeira quando contactada com a Proteína A. Em algumas modalidades, a proteína de ligação é purificada a partir de outras proteínas de ligação, polipeptídeos, e/ou outros componentes celulares. III. Proteínas de Ligação Triespecíficas
[00295] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da descrição é uma proteína de ligação triespecífica e/ou trivalente compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam três sítios de ligação a antígeno que ligam um ou mais (por exemplo, três) alvos de antígeno ou proteínas alvo diferentes. Em algumas modalidades, uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que:
VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina; dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada.
Em algumas modalidades, a primeira cadeia de polipeptídeo e a segunda cadeia de polipeptídeo têm uma orientação cruzada que forma dois sítios de ligação a antígeno distintos.
Como descrito acima, a segunda e terceira cadeias de polipeptídeo incluem uma região Fc (por exemplo, compreendendo os domínios dobradiça-CH2-CH3). Em algumas modalidades, uma ou ambas as regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236. Em algumas modalidades, as regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana compreendendo mutações de aminoácido em substituições correspondentes às posições 228, 233-236 e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as mutações de aminoácido são S228P; E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236; e/ou R409K. Em algumas modalidades, uma ou ambas as regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235, e/ou 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são L234A, L235A, e/ou P329A. Em algumas modalidades, as regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299, e/ou 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são S298N, T299A, e/ou Y300S.
[00296] Em algumas modalidades, a proteína de ligação da descrição é uma proteína de ligação triespecífica e/ou trivalente compreendendo quatro cadeias de polipeptídeo que formam três sítios de ligação a antígeno que ligam um ou mais (por exemplo, três) alvos de antígeno ou proteínas alvo diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos um dos sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 (por exemplo, o domínio extracelular de polipeptídeo CD38 humano e/ou de macaco cinomolgos). Em algumas modalidades, uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido;
e em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada. Em algumas modalidades, a segunda e a terceira cadeia de polipeptídeo ainda compreendem uma região Fc ligada a CH1, as regiões Fc compreendendo uma região de dobradiça de imunoglobulina e domínios constantes de cadeia pesada de imunoglobulina CH2 e CH3. Em algumas modalidades, uma ou ambas as regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236. Em algumas modalidades, as regiões Fc são regiões Fc de IgG4 humana compreendendo mutações de aminoácido em substituições correspondentes às posições 228, 233-236, e/ou 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as mutações de aminoácido são S228P; E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236; e/ou R409K. Em algumas modalidades, uma ou ambas as regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana compreendendo uma ou mais substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235, e/ou 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são L234A, L235A, e/ou P329A. Em algumas modalidades, as regiões Fc são regiões Fc de IgG1 humana compreendendo substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299, e/ou 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácido são S298N, T299A, e/ou Y300S.
[00297] Em algumas modalidades, o VH1 e VL1 formam um par de ligação e formam um primeiro sítio de ligação a antígeno. Em algumas modalidades, o VH2 e VL2 formam um par de ligação e formam um segundo sítio de ligação a antígeno.
Em algumas modalidades, o VH3 e VL3 formam um par de ligação e formam um terceiro sítio de ligação a antígeno.
As proteínas de ligação podem também ser usadas para ativação celular, direcionamento tumoral, neutralização de atividades de citocina, neutralização de infecção viral, combinação de múltiplos eventos de sinalização, para tratar câncer, artrite e/ou distúrbios inflamatórios.
Por exemplo, em algumas modalidades, uma proteína de ligação especificamente liga um, dois ou três alvos de antígeno selecionados de A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (também conhecido como VTCN1), B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (também conhecido como MCP-1), CCL3 (também conhecido como MIP-1a), CCL4 (também conhecido como MIP-1b), CCL5 (também conhecido como RANTES), CCL7 (também conhecido como MCP-3), CCL8 (também conhecido como mcp-2), CCL11 (também conhecido como eotaxina), CCL15 (também conhecido como MIP-1d), CCL17 (também conhecido como TARC), CCL19 (também conhecido como MIP-3b), CCL20 (também conhecido como MIP-3a), CCL21 (também conhecido como MIP-2), CCL24 (também conhecido como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (também conhecido como TECK), CCL26 (também conhecido como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23 (também conhecido como FCER2, um receptor para IgE), CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (também conhecido como B7-1), CD86 (também conhecido como B7-2), CD122, CD137 (também conhecido como 41BB), CD137L, CD152 (também conhecido como CTLA4), CD154 (também conhecido como CD40L), CD160, CD272, CD273 (também conhecido como PDL2), CD274 (também conhecido como PDL1), CD275 (também conhecido como B7H2), CD276 (também conhecido como B7H3), CD278 (também conhecido como ICOS), CD279 (também conhecido como PD-1), CDH1 (também conhecido como E-caderina), quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (também conhecido como M-CSF), CSF-2 (também conhecido como GM-CSF), CSF-3 (também conhecido como GCSF), CX3CL1 (também conhecido como SCYD1), CXCL12 (também conhecido como SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (também conhecido como um receptor para IL25), IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (também conhecido como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (também conhecido como um receptor para IL33), STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (também conhecido como um correceptor para IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, e XCR1 (também conhecido como GPR5/CCXCR1). Em algumas modalidades, um ou mais dos alvos de antígeno acima são alvos de antígeno humanos.
[00298] Em algumas modalidades, um dos três sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 (por exemplo, um polipeptídeo CD3 humano), um dos três sítios de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 (por exemplo, um polipeptídeo CD28 humano), e um dos três sítios de ligação a antígeno liga um terceiro polipeptídeo. Em algumas modalidades, o sítio de ligação a antígeno que especificamente liga um alvo de antígeno que não CD3 ou CD28 liga um alvo de antígeno selecionado de A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4 (também conhecido como VTCN1),
B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2 (também conhecido como MCP-1), CCL3 (também conhecido como MIP-1a), CCL4 (também conhecido como MIP-1b), CCL5 (também conhecido como RANTES), CCL7 (também conhecido como MCP-3), CCL8 (também conhecido como mcp-2), CCL11 (também conhecido como eotaxina), CCL15 (também conhecido como MIP-1d), CCL17 (também conhecido como TARC), CCL19 (também conhecido como MIP-3b), CCL20 (também conhecido como MIP-3a), CCL21 (também conhecido como MIP-2), CCL24 (também conhecido como MPIF-2/eotaxina-2), CCL25 (também conhecido como TECK), CCL26 (também conhecido como eotaxina-3), CCR3, CCR4, CD19, CD20, CD23 (também conhecido como FCER2, um receptor para IgE), CD24, CD27, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80 (também conhecido como B7-1), CD86 (também conhecido como B7-2), CD122, CD137 (também conhecido como 41BB), CD137L, CD152 (também conhecido como CTLA4), CD154 (também conhecido como CD40L), CD160, CD272, CD273 (também conhecido como PDL2), CD274 (também conhecido como PDL1), CD275 (também conhecido como B7H2), CD276 (também conhecido como B7H3), CD278 (também conhecido como ICOS), CD279 (também conhecido como PD-1), CDH1 (também conhecido como E-caderina), quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1 (também conhecido como M-CSF), CSF-2 (também conhecido como GM-CSF), CSF-3 (também conhecido como GCSF), CX3CL1 (também conhecido como SCYD1), CXCL12 (também conhecido como SDF1), CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb (também conhecido como um receptor para IL25), IL18, IL22,
IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4 (também conhecido como b4 integrina), ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase-1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2 (também conhecido como um receptor para IL33), STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP (também conhecido como um correceptor para IL7Ra), TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM, e XCR1 (também conhecido como GPR5/CCXCR1). Em algumas modalidades, um ou mais dos alvos de antígeno acima são alvos de antígeno humanos.
[00299] Em qualquer uma das proteínas de ligação triespecíficas descritas acima, qualquer ligante ou combinação de ligantes descrito neste documento pode ser usado. Por exemplo, em algumas modalidades, pelo menos um de L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácidos de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3 ou L4 têm, cada um independentemente, pelo menos um aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, têm zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59). Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO: 57), L3 compreende a sequência S, e L4 compreende a sequência RT. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L2 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L3 tem 0 aminoácido de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L2 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L3 tem 0 aminoácido de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. Em algumas modalidades, L1 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), L2 tem 0 aminoácido de comprimento, L3 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), e L4 tem 0 aminoácido de comprimento. IV. Usos para Proteínas de Ligação
[00300] As proteínas de ligação podem ser usadas em qualquer método de ensaio conhecido, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação para a detecção e quantificação de um ou mais antígenos alvo. As proteínas de ligação irão ligar os um ou mais antígenos alvo com uma afinidade que é apropriada para o método de ensaio que está sendo usado.
[00301] Para aplicações de diagnóstico, em determinadas modalidades, as proteínas de ligação podem ser rotuladas com uma porção detectável. A porção detectável pode ser qualquer uma que seja capaz de produzir, direta ou indiretamente, um sinal detectável. Por exemplo, a porção detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14 32 35 125 99 111 67 C, P, S, I, Tc, In ou Ga; um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina ou luciferina; ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, β- galactosidase, ou peroxidase de rábano silvestre.
[00302] As proteínas de ligação também são úteis para imagens in vivo. Uma proteína de ligação rotulada com uma porção detectável pode ser administrada a um animal, de preferência na corrente sanguínea, e a presença e localização do anticorpo rotulado no hospedeiro podem ser analisadas. A proteína de ligação pode ser rotulada com qualquer porção que seja detectável em um animal, seja por ressonância magnética nuclear, radiologia ou outro meio de detecção conhecido na técnica.
[00303] Para aplicações clínicas ou de pesquisa, em determinadas modalidades, as proteínas de ligação podem ser conjugadas a um agente citotóxico. Uma variedade de anticorpos acoplados a agentes citotóxicos (isto é, conjugados anticorpo-droga) têm sido usada para direcionar cargas úteis citotóxicas a células tumorais específicas. Agentes citotóxicos e ligantes que conjugam os agentes a um anticorpo são conhecidos na técnica; ver, por exemplo, Parslow, A.C. et al. (2016) Biomedicines 4:14 e Kalim, M. et al. (2017) Drug Des. Devel. Ther. 11: 2265-2276.
[00304] A descrição também se refere a um kit que compreende uma proteína de ligação e outros reagentes úteis para detectar níveis de antígeno alvo em amostras biológicas. Esses reagentes podem incluir um rótulo detectável, soro de bloqueeio, amostras de controle positivo e negativo e reagentes de detecção. Em algumas modalidades, o kit compreende uma composição compreendendo qualquer proteína de ligação, polinucleotídeo, vetor, sistema de vetor e/ou célula hospedeira descrita neste documento. Em algumas modalidades, o kit compreende um recipiente e um rótulo ou bula associado ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas de solução IV etc. Os recipientes podem ser constituídos por uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si só combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar uma condição e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica). Em algumas modalidades, o rótulo ou bula indica que a composição é usada para prevenir, diagnosticar e/ou tratar a condição de escolha. Alternativamente ou adicionalmente, o artigo de fabricação ou kit ainda pode compreender um segundo (ou terceiro) recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como água bacteriostática para injeção (BWFI), solução salina tamponada com fosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[00305] Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é administrada a um paciente em necessidade da mesma para o tratamento ou prevenção de câncer. Em algumas modalidades, a presente invençãopresente invenção refere-se a um método de prevenir e/ou tratar um distúrbio ou doença proliferativa (por exemplo, câncer). Em algumas modalidades, o método compreende administrar a um paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma das proteínas de ligação, ou composições farmacêuticas relacionadas às mesmas, descritas neste documento. Em algumas modalidades, a presente invençãopresente invenção refere-se ao uso de pelo menos uma das proteínas de ligação, ou composições farmacêuticas relacionadas às mesmas, descritas neste documento para prevenir e/ou tratar um distúrbio ou doença proliferativa (por exemplo, câncer) em um paciente em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, a presente invençãopresente invenção refere-se a pelo menos uma das proteínas de ligação, ou composições farmacêuticas relacionadas às mesmas, descritas neste documento para uso na fabricação de um medicamento para prevenir e/ou tratar um distúrbio ou doença proliferativa (por exemplo, câncer) em um paciente em necessidade do mesmo. Em algumas modalidades, o paciente é um ser humano. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que liga uma proteína de superfície de célula T e outro sítio de ligação a antígeno que liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano, por exemplo, como descrito no section II acima. Em algumas modalidades, a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano, um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD28 humano, e um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD3 humano.
[00306] Em algumas modalidades, as células do câncer expressam um polipeptídeo de isoforma A de CD38 humano em sua superfície celular (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1). Em algumas modalidades, as células do câncer expressam um polipeptídeo de isoforma E de CD38 humano em sua superfície celular (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105). Em algumas modalidades, o paciente é selecionado para tratamento com base em que as células do câncer expressam um polipeptídeo de isoforma E de CD38 humano em sua superfície celular (por exemplo, compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105). Em algumas modalidades, as células de câncer expressam CD38 e CD28. Em algumas modalidades, as células de câncer expressam CD38 e não expressam CD28.
[00307] Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide aguda, linfoma, câncer mama, tal como câncer de mama Her2+, câncer de próstata, linfoma de células B de centro germinal ou leucemia linfoblástica aguda de células B. Em determinadas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo. Em determinadas modalidades, o câncer é leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL), ou um linfoma de células B.
[00308] Em determinadas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo. Anticorpos anti-CD38 foram testados para o tratamento de mieloma múltiplo, tais como daratumumab e isatuximabe. No entanto, embora o mieloma múltiplo seja considerado tratável, a recidiva é inevitável em quase todos os pacientes, levando ao desenvolvimento de doença refratária ao tratamento. Em algumas modalidades, o câncer é mieloma múltiplo recorrente ou refratário. Em algumas modalidades, o paciente foi tratado com um tratamento prévio para mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, uma proteína de ligação da presente invenção é administrada ao paciente como tratamento de 1ª, 2ª ou 3ª linha para mieloma múltiplo. Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que uma proteína de ligação anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3 da presente invenção possa ser útil no tratamento de mieloma múltiplo, por exemplo, recrutando células T para células tumorais através de anti-CD38 (ou anti-CD28/anti-CD38), ativação de células envolvidas através de anti- CD3/anti-CD28, e/ou extermínio de células tumorais através de mecanismos baseados em perforina/granzima. O CD28 foi relatado como um novo marcador de câncer para mieloma múltiplo. Ver Nair, J.R. et al. (2011) J. Immunol. 187:1243-1253.
[00309] Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada (ou deve ser administrada) em combinação com uma ou mais terapias anticâncer (por exemplo, qualquer terapia anticâncer conhecida na técnica, tal como uma terapia ou agente quimioterápico). Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada (ou deve ser administrada) antes das uma ou mais terapias anticâncer. Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada (ou deve ser administrada) simultaneamente com as uma ou mais terapias anticâncer. Em algumas modalidades, a pelo menos uma proteína de ligação é administrada (ou deve ser administrada) após as uma ou mais terapias antirretrovirais. V. Composições Terapêuticas de Proteína de Ligação e Administração das Mesmas
[00310] As composições terapêuticas ou farmacêuticas compreendendo proteínas de ligação estão dentro do escopo da descrição. Essas composições terapêuticas ou farmacêuticas podem compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma proteína de ligação, ou conjugado de proteína de ligação-droga, em mistura com um agente de formulação farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitável selecionado para adequação ao modo de administração.
[00311] Os materiais de formulação aceitáveis são preferencialmente não-tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações usadas.
[00312] A composição farmacêutica pode conter materiais de formulação para modificar, manter ou conservar, por exemplo, o pH, osmolaridade, viscosidade, clareza, cor, isotonicidade, odor, esterilidade, estabilidade, taxa de dissolução ou liberação, adsorção ou penetração da composição. Materiais de formulação adequados incluem, mas sem limitação, aminoácidos (tais como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina), antimicrobianos, antioxidantes (tais como ácido ascórbico, sulfito de sódio ou hidrogenossulfito de sódio), tampões (tais como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos ou outros ácidos orgânicos), agentes de volume (tais como manitol ou glicina), agentes quelantes (tais como ácido etilenodiamina tetra-acético (EDTA)), agentes complexantes (tais como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina ou hidroxipropil-beta-ciclodextrina), excipientes, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos (tais como glicose, manose ou dextrinas), proteínas (tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas), agentes corantes, aromatizantes e diluentes, agentes emulsificantes, polímeros hidrofílicos (tais como polivinilpirrolidona), polipeptídeos de baixo peso molecular, contraíons formadores de sal (tais como sódio), conservantes (tais como cloreto de benzalcônio, ácido benzóico, ácido salicílico, timerosal, álcool fenetílico, metilparabeno, propilparabeno, clorexidina, ácido sórbico ou peróxido de hidrogênio), solventes (tais como glicerina, propileno glicol ou polietileno glicol), álcoois de açúcar (tais como manitol ou sorbitol), agentes de suspensão, agentes umectantes ou tensoativos (tais como pluronics; PEG; ésteres de sorbitano; polissorbatos, tais como polissorbato 20 ou polissorbato 80; triton; trometamina; lecitina; colesterol ou tiloxapal), agentes de aumento de estabilidade (tais como sacarose ou sorbitol), agentes de aumento de tonicidade (tais como halogenetos de metais alcalinos - de preferência cloreto de sódio ou potássio - ou manitol sorbitol), veículos de entrega, diluentes, excipientes e/ou adjuvantes farmacêuticos (ver, por exemplo, Remington’s Pharmaceutical Sciences (18ª Ed., AR Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), e edições subsequentes, incorporados neste documento por referência para qualquer finalidade).
[00313] A composição farmacêutica ideal será determinada por um versado na técnica, dependendo, por exemplo, da via de administração pretendida, formato de entrega e dosagem desejada. Tais composições podem influenciar o estado físico, a estabilidade, a taxa de liberação in vivo e a taxa de depuração da proteína de ligação in vivo.
[00314] O veículo ou portador primário em uma composição farmacêutica pode ser aquoso ou não aquoso na natureza. Por exemplo, um veículo ou portador adequado para injeção pode ser água, solução salina fisiológica ou líquido cefalorraquidiano artificial, possivelmente suplementado com outros materiais comuns em composições para administração parenteral. Solução salina tamponada neutra ou solução salina misturada com albumina sérica são ainda veículos exemplificativos. Outras composições farmacêuticas exemplificativas compreendem tampão Tris de cerca de pH 7,0-8,5 ou o tampão de acetato de cerca de pH de 4,0-5,5, que ainda podem as quais ainda podem incluir sorbitol ou um substituto adequado. Em uma modalidade da descrição, as composições de proteína de ligação podem ser preparadas para armazenamento por mistura da composição selecionada tendo o grau de pureza desejado com agentes de formulação opcionais na forma de um bolo liofilizado ou uma solução aquosa. Além disso, a proteína de ligação pode ser formulada como um liofilizado usando excipientes apropriados, tais como sacarose.
[00315] As composições farmacêuticas da descrição podem ser selecionadas para entrega parenteral ou subcutâneo. Alternativamente, as composições podem ser selecionadas para inalação ou entrega através do trato digestivo, tal como oralmente. A preparação de tais composições farmaceuticamente aceitáveis está dentro habilidade da técnica.
[00316] Os componentes da formulação estão presentes em concentrações que são aceitáveis para o sítio de administração. Por exemplo, tampões são usados para manter a composição em pH fisiológico ou em pH ligeiramente mais baixo, geralmente dentro de uma faixa de pH de cerca de 5 a cerca de 8.
[00317] Quando a administração parenteral é contemplada, as composições terapêuticas para uso podem ser na forma de uma solução aquosa isenta de pirogênio, parenteralmente aceitável, compreendendo a proteína de ligação desejada em um veículo farmaceuticamente aceitável. Um veículo particularmente adequado para injeção parenteral é água destilada estéril, na qual uma proteína de ligação é formulada como uma solução isotônica estéril, adequadamente preservada. Ainda outra preparação pode envolver a formulação da molécula desejada com um agente, tal como microesferas injetáveis, partículas biodegradáveis, compostos poliméricos (tais como ácido poliláctico ou ácido poliglicólico), esferas ou lipossomas, que provê a liberação controlada ou sustentada do produto que pode, então, ser entregue através de uma injeção de depósito. Ácido hialurônico também pode ser usado, e isso pode ter o efeito de promover duração sustentada na circulação. Outros meios adequados para a introdução da molécula desejada incluem dispositivos de entrega de droga implantáveis.
[00318] Em uma modalidade, uma composição farmacêutica pode ser formulada para inalação. Por exemplo, uma proteína de ligação pode ser formulada como um pó seco para inalação. Soluções de inalação de proteínas de ligação também podem ser formuladas com um propulsor para a entrega de aerossóis. Ainda em outra modalidade, as soluções podem ser nebulizadas.
[00319] Contempla-se também que determinadas formulações podem ser administradas oralmente. Em uma modalidade da descrição, as proteínas de ligação que são administradas dessa maneira podem ser formuladas com ou sem os veículos habitualmente usados na composição de formas de dosagem sólidas, tais como comprimidos e cápsulas. Por exemplo, uma cápsula pode ser projetada para liberar a porção ativa da formulação no ponto do trato gastrointestinal quando a biodisponibilidade é maximizada e a degradação pré-sistêmica é minimizada. Agentes adicionais podem ser incluídos para facilitar a absorção da proteína de ligação. Diluentes, aromatizantes, ceras de baixo ponto de fusão, óleos vegetais, lubrificantes, agentes de suspensão, agentes de desintegração de comprimidos e aglutinantes também podem ser usados.
[00320] Outra composição farmacêutica pode envolver uma quantidade eficaz de proteínas de ligação em uma mistura com excipientes não tóxicos que são adequados para a fabricação de comprimidos. Dissolvendo os comprimidos em água estéril, ou outro veículo apropriado, as soluções podem ser preparadas na forma de dose unitária. Excipientes adequados incluem, mas sem limitação, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato ou bicarbonato de sódio, lactose ou fosfato de cálcio; agentes de ligação, tais como amido, gelatina ou acácia; agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco.
[00321] Composições farmacêuticas adicionais da descrição serão evidentes para os versados na técnica, incluindo formulações envolvendo proteínas de ligação em formulações de entrega controlada ou sustentada. Técnicas para formular uma variedade de outros meios de entrega controlada ou sustentada, tais como veículos lipossômicos, micropartículas biodegradáveis ou esferas porosas e injeções de depósito, também são conhecidas pelos versados na técnica. Exemplos adicionais de preparações de liberação sustentada podem incluir matrizes poliméricas semipermeáveis na forma de artigos moldados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Matrizes de liberação sustentada podem incluir poliésteres, hidrogéis, polilactidas, copolímeros de ácido L-glutâmico e gama-etil-L-glutamato, poli(2- hidroxietil-metacrilato), etileno vinil acetato ou ácido poli-D(-)-3- hidroxibutírico. As composições de liberação sustentada também podem incluir lipossomos, que podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos na técnica.
[00322] As composições farmacêuticas a serem usadas para administração in vivo normalmente devem ser estéreis. Isso pode ser realizado por filtração através de membranas de filtração estéreis. Quando a composição é liofilizada, a esterilização usando esse método pode ser realizada antes ou após a liofilização e reconstituição. A composição para administração parenteral pode ser armazenada em forma liofilizada ou em solução. Além disso, as composições parentéricas geralmente são colocadas em um recipiente tendo uma porta de acesso estéril, por exemplo, um saco ou frasco de solução intravenosa com uma tampa perfurável por uma agulha de injeção hipodérmica.
[00323] Uma vez que a composição farmacêutica tenha sido formulada, ela pode ser armazenada em frascos estéreis como solução, suspensão, gel, emulsão, sólido ou como um pó desidratado ou liofilizado. Tais formulações podem ser armazenadas em uma forma pronta para uso ou em uma forma (por exemplo, liofilizada) que requer reconstituição antes da administração.
[00324] A descrição também inclui kits para produzir uma unidade de administração de dose única. Os kits podem, cada um, conter um primeiro recipiente tendo uma proteína seca e um segundo recipiente tendo uma formulação aquosa. Também estão incluídos no escopo desta descrição kits que contêm seringas pré-cheias multicâmara ou de câmara única (por exemplo, seringas líquidas e lio-seringas).
[00325] A quantidade eficaz de uma composição farmacêutica de proteína de ligação a ser usada terapeuticamente dependerá, por exemplo, do contexto e objetivos terapêuticos. Portanto, um versado na técnica apreciará que os níveis de dosagem apropriados para tratamento variarão dependendo, em parte, da molécula entregue, da indicação para a qual a proteína de ligação está sendo usada, da via de administração e do tamanho (peso corporal, superfície corporal ou tamanho do órgão) e condição (idade e saúde geral) do paciente. PO conseguinte, o médico pode titular a dosagem e modificar a via de administração para obter o efeito terapêutico ideal.
[00326] A frequência de dosagem dependerá dos parâmetros farmacocinéticos da proteína de ligação na formulação que está sendo usada. Tipicamente, um médico administrará a composição até que uma dosagem seja alcançada e atinja o efeito desejado. A composição pode, portanto, ser administrada como uma dose única, como duas ou mais doses (que podem ou não conter a mesma quantidade da molécula desejada) ao longo do tempo, ou como uma infusão contínua através de um dispositivo de implante ou cateter. Refinamento adicional da dosagem apropriada é feito rotineiramente por aqueles versados na técnica e está dentro do âmbito de tarefas rotineiramente realizadas por eles. Dosagens apropriadas podem ser verificadas através do uso de dados de dose-resposta apropriados.
[00327] A via de administração da composição farmacêutica é de acordo com métodos conhecidos, por exemplo, oralmente; através de injeção por via intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparênquima), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intra-arterial, intraportal ou intralesional; por sistemas de liberação sustentada; ou por dispositivos de implante. Quando desejado, as composições podem ser administradas por injeção em bolus ou continuamente por infusão ou por dispositivo de implante.
[00328] A composição também pode ser administrada localmente através do implante de uma membrana, esponja ou outro material apropriado no qual a molécula desejada tenha sido absorvida ou encapsulada. Quando um dispositivo de implante é usado, o dispositivo pode ser implantado em qualquer tecido ou órgão adequado, e a entrega da molécula desejada pode ser realizada por difusão, bolus de liberação programada ou administração contínua.
EXEMPLOS
[00329] Os exemplos que seguem são ilustrativos de modalidades específicas da descrição, e vários usos das mesmas. São apresentados apenas para fins explicativos, e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de forma alguma.
[00330] A terminologia a seguir pode ser usada de forma intercambiável nos Exemplos e Desenhos neste documento para se referir a anticorpos ou domínios de ligação a antígeno anti-CD38 específicos:
antiCD38_C2-CD38-1: mAb1 antiCD38_C2-CD38-1_VH1-VL1 ou CD38VH1: mAb2 antiCD38_C2-CD38-1_VH3-VL3: mAb3 antiCD38_C2-CD38-1_VH5-VL3: mAb4 antiCD38_C2-CD38-1_VH6-VL3: mAb5 antiCD38_1370 ou CD38HHY1370: mAb6 antiCD38_SB19 ou isatuximab: mAb7. Exemplo 1: Geração e Caracterização de Anticorpos anti-CD38 Monoclonais
[00331] Os exemplos que seguem descrevem a geração e caracterização de anticorpos anti-CD38 monoclonais. Vantajosamente, os anticorpos providos neste documento reagem de forma cruzada com proteínas CD38 humanas e de macaco, provendo assim moléculas que podem ser usadas para estudos clínicos e de segurança. Esses anticorpos são também capazes de exterminar células CD38+ por apoptose e citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC).
[00332] Este Exemplo descreve um fluxo de trabalho eficiente para gerar anticorpos monoclonais reativos de forma cruzada e específicos de CD38 de células B de murino únicas. Materiais e Métodos Generação de anticorpos monoclonais
[00333] Anticorpos para CD38 humano foram gerados usando o domínio extracellular de CD38 humano R45-I300 (SEQ ID NO: 1). Ver Q. Liu, I. Krilksunov, R. Graeff, C. Munshi, H.C. Lee, e Q. Hao 2005 Structure 13::1331-1339. O imunogênio foi administrado diretamente, com um adjuvante para estimular a resposta imune, tanto a camundongos BalbC normais quanto a camundongos Trianni™ transgênicos (Trianni, São Francisco, CA), compreendendo o DNA codificador de regiões variáveis de cadeia leve kapa e pesada de imunoglobulina humana.
[00334] Várias proteínas CD38 recombinantes derivadas da isoforma A com diferentes mutações de ponto e etiqueta foram usadas (SEQ ID NOs: 2, 3, 4 e 28), e uma versão marcada da isoforma E de CD38 (SEQ ID NO: 105) abrangendo o domínio extracelular de CD38 de R45-P203. As proteínas foram produzidas por expressão transiente em células de mamíferos. As sequências de DNA codificadoras foram clonadas em plasmídeos de expressão de mamíferos sob sinais de polyA SV40 e intensificador/promotor de CMV. Células HEK293 (Invitrogen; #K9000- 10) foram transfectadas transientemente com os plasmídeos de expressão usando o Sistema de Expressão FreeStyle™ MAX 293 de acordo com as instruções do fabricante. Imunização de camundongos e seleção única de células B
[00335] Anticorpos anti-CD38 também foram isolados diretamente de células B positivas para antígeno sem fusão a células de mieloma. Usando esse método, foram obtidos vários anticorpos anti-CD38, tais como mAb1 (ver SEQ ID NOs: 5 e 6 para sequências VH e VL, respectivamente, e SEQ ID NOs: 7 e 8 para sequências de cadeia pesada e cadeia leve, respectivamente). Resumidamente, camundongos BALB/c fêmeas com 6-8 semanas de idade (S082342; Charles River Labs, Bar Harbor, ME) receberam, cada um, três rodadas de imunização ao longo de um curso de 41 dias usando o método clássico como descrito por A. Wennerberg et al. (1993 Am. J. Pathol. 143:1050-1054). O antígeno foi administrado intraperitonealmente ao sítio ventral de camundongos. Três dias após a última injeção, os camundongos foram sacrificados e os baços foram isolados assepticamente e lavados com meio RPMI fresco. Os linfócitos foram liberados do baço e a suspensão unicelular foi lavada duas vezes com meio RPMI antes de ser classificada usando uma estratégia de classificação de quatro cores, incluindo um painel de anticorpos fluorescentes e proteínas CD38 humanas e de macaco duplas e, em seguida, foram separados usando classificação celular por citometria de fluxo para isolar células B específicas de IgG-CD38 reativas cruzadas humanas/de macaco. As células únicas foram diretamente classificadas em tubos de PCR para amplificar o par cognato de genes VH e VL por RT-PCR (T. Tiller, C. Busse and H. Wardemann 2009 J. Immunol. Methods 350:183-193). O DNA resultante foi sequenciado.
[00336] O DNA resultante foi clonado em um vetor de expressão de mamífero que codifica, respectivamente, os domínios de IgG1 humana ou Ck humano para expressão transiente em células HEK293 usando Sistema de Expressão FreeStyle™ MAX 293, de acordo com as instruções do fabricante. Os lotes foram purificados por cromatografia de afinidade com Proteína A (MabSelect, GE Heathcare). O eluato foi dialisado contra PBS antes daefiltração estéril e armazenamento a 4ºC. Geração de anticorpos por imunização em camundongos transgênicos de imunoglobulina humana e seleção usando tecnologia de hibridoma
[00337] As imunizações, a fusão e a triagem foram realizadas usando células de mieloma P3X63-Ag8.653 com o domínio extracelular de CD38 humano, como descrito em Kilpatrick et al. 1997 Hybridoma 16:381389. Usando o método RIMMS descrito por Kilpatrick et al., camundongos TrianniTM trangênicos, fêmea de 6-8 semanas de idade compreendendo o DNA codificando regiões variáveis de cadeia leve kapa e pesada de imunoglobulina humana receberam quatro rodadas de imunização ao longo de 14 dias em intervalos de 3-4 dias. A proteína CD38 emulsificada em adjuvante de RIBI (Sigma #T2684) foi administrada por via subcutânea a seis sítios proximais aos linfonodos de drenagem, ao longo das costas dos camundongos e a seis sítios justapostos ao longo do abdômen. Quatro dias após a última injeção, os camundongos foram sacrificados. Linfonodos poplíteos bilaterais, inguinais superficiais, axilares e branquiais foram isolados assepticamente e lavados com meio RPMI fresco. Os linfócitos foram liberados dos linfonodos e a suspensão unicelular foi lavada duas vezes com meio RPMI antes de ser fundida com células de mieloma P3X63- AG8.653 usando polietileno glicol. Após a fusão, a mistura celular foi incubada em uma incubadora a 37ºC por 16-24 horas. A preparação celular resultante foi transferida para meio semissólido seletivo e plaqueada assepticamente em placas de Petri de 100 mm e incubadas a 37ºC. Dez dias após o início da seleção, as placas foram examinadas quanto ao crescimento de hibridomas, e as colônias visíveis foram coletadas e colocadas em placas de 96 cavidades contendo 200 μL de meio de crescimento. As placas de 96 cavidades foram mantidas em uma incubadora a 37ºC por 2 a 4 dias. Usando essa técnica, e o imunógeno descrito acima, vários anticorpos quiméricos anti-CD38 foram obtidos, tais como mAb 6 (ver SEQ ID NOs: 9 e 10 para sequências VH e VL, respectivamente, e SEQ ID NOs: 11 e 12 para sequências de cadeia leve e cadeia pesada, respectivamente. As sequências VH e VL foram recuperadas por RT-PCR e mAb 6 foi produzido por expressão transiente como descrito acima. Afinidade de ligação a domínios extracelulares de CD38 solúvel
[00338] As propriedades de ligação dos mAbs anti-huCD38 foram avaliadas usando um BIAcore 2000 (BIAcore Inc., Uppsala, NJ). Resumidamente, um chip biossensor CM5 BIAcore foi encaixado no instrumento e ativado com 250µl de NHS/EDC 1:1 à temperatura ambiente. Uma IgG1 Fc anti-humano de camundongo (GE Healthcare #BR-1008-39) (13,5 µg/ml em tampão de acetato a 0,05M, pH5) foi imobilizada nos chips ativados em células de fluxo 1. A imobilização foi realizada a uma taxa de fluxo de 5 µl/min. O chip foi, em seguida, bloqueado por injeção de 55 µl de etanolamina-HCl, pH 8,5, seguido por cinco lavagens com NaOH a 50 mM, NaCl a 1 M. Para medir a ligação de mAbs anti-CD38 à proteína CD38 humana ou à proteína CD38 de cino, anticorpos foram usados a 2 µg/ml em tampão de corrida BIAcore (HBS-EP). Antígenos (CD38-histag humano (ID2) ou CD38-histag de cino (ID3)) foram injetados de 3 a 1000 nM. Após a conclusão da fase de injeção, a dissociação foi monitorada em um tampão de corrida BIAcore na mesma taxa de fluxo por 360 segundos. A superfície foi regenerada entre injeções usando 30 µl de NaOH a 50 mM-NaCl a 1 M. Sensorgramas individuais foram analisados usando o software BIAsimulation. Afinidade de ligação a células pré-B de expressão de CD38 humanas
[00339] A ligação de anticorpos anti-CD38 a CD38 expresso na superfície de cérlulas preB::300,19 de murino recombinantes foi determinada por citometria de fluxo. A linhagem celular recombinante foi descrita por J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. Células de expressão de CD38 preB::300,19 de murino foram revestidas a 40.000 células/cavidade em placa High Bind de 96 cavidades (MSD L15XB-3) e 100 µl/cavidade de anticorpos anti-CD38 foram adicionados por 45 minutos a 4ºC e lavados três vezes com PBS 1% BSA. 100 µl/cavidade de IgG anti-humana de cabra conjugada com Alexa488 (Jackson ImmunoResearch; #109-545-098) foram adicionados por 45 minutos a 4ºC e lavados três vezes com PBS 1% BSA. A ligação de anticorpo foi avaliada após centrifugação e ressuspensão de células por adição de 200 µl/cavidade de PBS 1% de BSA e lida usando o Sistema de Citometria de Fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. Os valores aparentes de KD e EC50 foram estimados usando o software BIOST@T-BINDING e BIOST@T-SPEED, respectivamente. Resultados
[00340] A ligação de mAb1 recém-isolado a células SU-DHL-8 ou MOLP-8 humanas foi comparada com a de isatuximab usando citometria de fluxo (Figura 1A). Ambos os anticorpos apresentaram ligação de alta afinidade a ambas as linhagens celulares. No entanto,
apenas mAb1 foi capaz de se ligar a células expressando CD38 de macaco cinomolgo na sua superfície (Figura 1B).
[00341] A ligação a domínios extracelulares solúveis de polipeptídeos CD38 humanos e de macaco cinomolgo foi examinada para anticorpos recém-isolados mAb1 e mAb6 usando ressonância de plasmons de superfície (SPR). Os resultados de SPR estão resumidos na Tabela A. Tabela A. Afinidade de ligação de anticorpos ao domínio extracelular solúvel de hCD38 e cCD38 como determinado por ensaio SPR. hCD38-his (SEQ ID NO: 2) cCD38-his (SEQ ID NO: 4) Kd (s-1) KD (M) Kd (s-1) KD (M) mAb1 2,66E-04 3,36E-10 9,85E-05 3,90E-10 mAb6 2,03E-04 1,44E-09 1,90E-04 1,38E-09
[00342] Citometria de fluxo também foi usada para examinar a ligação de anticorpos anti-CD38 mAb1 e mAb6 a células pré-B de murino que expressam polipeptídeo CD38 humano ou de macaco cinomolgo na sua superfície celular. Os resultados são mostrados na Tabela B. Ambos os anticorpos testados mostraram alta afinidade de ligação a células expressando huCD38 ou cCD38 preB::300,19. Tabela B. Afinidade de ligação de antibodies to hCD38 ou cCD38 expresso por murine preB::300,10 células como determinadas por citometria de fluxo. FACS de KD Aparente (M) células expressando hCD38 células expressando cCD38 mAb1 2,80E-10 2,20E-10 mAb6 2,07E-09 1,14E-09
[00343] Esses resultados demonstram a geração de anticorpos que se ligam com alta afinidade a polipeptídeos CD38 humanos e de cinomolgo. Esses anticorpos, diferentemente de outros anticorpos anti-
CD38, reagem de forma cruzada com polipeptídeos CD38 humanos e de cinomolgo em forma extracelular solúvel ou expressos na superfície de células de mamíferos. Exemplo 2: Projeto in silico de variantes anti-CD38 humanizadas
[00344] Este Exemplo descreve a humanização de anticorpos gerados no Exemplo 1.
[00345] As sequências de domínios variáveis mAb1 foram analisadas in-silico. O sistema de informação International ImMunoGeneTics para definição de imunoglobulinas (IMGT) foi usado para identificar regiões de determinação de complementaridade (CDRs).
[00346] Primeiramente, em paralelo, foram realizadas pesquisas para identificar a combinação de sequência de proteína de linha germinativa humana e linha germinativa de camundongo mais próxima para cada cadeia variável. Isso foi realizado com a uso de uma pesquisa de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) em bancos de dados de sequência de proteína de linha germinativa humana e de camundongo; para cada cadeia anticorpo, foram encontradas as sequências de proteína humana e de camundongo V e J mais próximas. A qualificação dessa alta identidade de sequência de proteína foi medida pela porcentagem de identidade da região V. Os resultados das pesquisas para cadeia leve e pesada de mAb1 são apresentadas nas Tabelas C e D, respectivamente. Tabela C. Sequência de proteína de linha germinativa humana e de camundongo (V&J) mais próxima da cadeia leve variável de mAb1. Identidade de Espécie Alelo V Sequência da Alelo J Região V (%) IGKJ1*01 [Homo sapiens] IGKV4-1*01 (imgt) (imgt) Melhores Linhas 66,34 % Funcional Germinativas Funcionais Funcional
IGKJ1*01 [Mus musculus] IGKV3-10*01 (imgt) (imgt) 96,97 % Melhores Linhas Funcional Funcional Germinativas Funcionais Tabela D. Sequência de proteína de linha germinativahumana e de camundongo (V&J) mais próxima da cadeia leve variável de mAb1. Identidade de Espécie Alelo V Sequência da Alelo J Região V (%) [Homo sapiens] IGHV1-3*01 (imgt) IGHJ4*01 (imgt) Melhores Linhas 69,39 % Funcional Funcional Germinativas Funcionais IGHV1-12*01 [Mus musculus] IGHJ3*01 (imgt) (imgt) 87,76 % Melhores Linhas Funcional Funcional Germinativas Funcionais
[00347] Em seguida, as sequências de domínio variável de mAb1 foram analisadas quanto a passivos de sequência, tais como desamidação clivagem ácida, oxidação ou sítios de formação de iso- aspartato. A estrutura de mAb1 foi analisada por modelagem 3D por homologia, a fim de definir como os resíduos de aminoácido interagem de forma intra- ou intermolecular. Essa etapa levou à identificação de um grupo de resíduos de aminoácido que são estruturalmente importantes para funcionalidades de mAb1, tais como conformação de CDRs e ligação de antígeno. Esses resíduos de aminoácido foram selecionados para estar presentes em sequências variáveis de mAb1 humanizado.
[00348] As CDRs de mAb1 de murino parental foram enxertadas nas estruturas de quadro relevantes. Com base nas análises acima, o IGKV3-20*02 humano acoplado com IGKJ1*01 e IGHV1-3*01 humano acoplado com IGHJ4*01 foram selecionados para ser a base da humanização cadeia leve variável e de cadeia pesada variável de mAb1, respectivamente. A cadeia leve de mAb1 apresentou 64,52% de identidade na região V com a linhagem germinativa de IGKV3-20*02 humana selecionada. A cadeia pesada de mAb1 apresentou 69,39% de identidade na região V com a linhagem germinativa de IGHV1-3*01 humana selecionada. Durante o processo de humanização, as CDRs de mAb1 de murino parentais foram transplantadas entre estruturas de quadro da linhagem germinativa selecionada, a fim de recompor sequências variáveis de anticorpo padrão. Atenção foi dada ao grupo previamente identificado de resíduos de aminoácido de mAb1, que são estruturalmente importantes para suas funcionalidades, como observado acima. Se necessário, os resíduos de aminoácidos foram substituídos nas sequências recém-criadas por seu resíduo de mAb1 correspondente exato. Isso corresponde a uma etapa de mutação reversa para incorporar resíduos de aminoácido da sequência parenteral adequada. Algumas mutações de CDR foram incorporadas para humanizar e evitar passivos de sequência nas CDRs parentais. As sequências variáveis leves e pesadas recém-criadas foram usadas para gerar modelos de homologia 3D da região variável humanizada de mAb1. Os modelos 3D foram construídos usando a suíte Model Antibody Framework do BIOVIA Discovery Studio.
[00349] Com base na abordagem de enxerto de CDR, duas variantes para a cadeia leve variável (VL1 e VL3) e quatro variantes para a cadeia pesada variável (VH1, VH3, VH5 e VH6) foram geradas. A combinação particular de resíduos de aminoácido que variam entre sequências leves e p0esadas variáveis de mAb1 e suas versões humanizadas são apresentadas nas Tabelas E e Tabela F, respectivamente. Tabela E. Diferenças de sequência entre a cadeia leve variável de mAb1 e variantes humanizadas.
Regiões de Ig VL de mAb1 VL1 humanizada VL3 humanizada (IMGT) parental S10 T T FR1 A12 S S V13 L L
L15 P P Q17 E E E27 Q E CDR1 D30 S D N34 Q N FR2 K49 R R CDR2 L54 G L N57 S S L58 R R E59 A A S60 T T V62 I I R72 G G FR3 D80 S S V82 L L A84 P P D85 E E A87 F F T89 V V
Tabela F.
Diferenças de sequência entre a cadeia pesada variável de mAb1 e variantes humanizadas.
Regiões VH de VH1 VH3 VH5 VH6 de Ig mAb1 humanizada humanizada humanizada humanizada (IMGT) parental Q5 V V V V L11 V V V V FR1 R13 K K K K S14 P P S P M20 V V V M F32 Y F F F CDR1 N33 A N N N T40 A A A A FR2 G44 R R G R CDR2 N55 Q N N N K65 Q Q Q Q K67 R R R R FR3 S76 A A A A Q82 E E E E
I83 L L I I T87 R R R R S91 T T T T
[00350] A variante VL1 humanizada com SEQ ID NO: 14 exibe um total de 22 mutações (18 em FRs e 4 em CDRs) em comparação com a VL parental de sequência de mAb1 com SEQ ID NO: 6. Essa variante derivada de estruturas de quadro de linhagens germinativas humanas IGKV3-20*02 acopladas com IGKJ1*01 com 8 mutações reversas realizadas devido ao risco de impacto negativo na estrutura de mAb, conformação de CDRs e, portanto, na ligação ao seu alvo. Quatro posições das CDRs parentais foram alteradas para aumentar a taxa de humanização ou evitar passivos de sequência.
[00351] A variante VL3 humanizada com SEQ ID NO: 18 exibe um total de 18 mutações (18 em FRs) em comparação com a VL parental de sequência de mAb1 com SEQ ID NO: 6. Essa variante derivada de estruturas de quadro de linhagens germinativas humanas IGKV3-20*02 acopladas com IGKJ1*01 com 8 mutações reversas realizadas devido ao risco de impacto negativo na estrutura do mAb, conformação de CDRs e, portanto, na ligação ao seu alvo.
[00352] A variante VH1 humanizada com SEQ ID NO: 13 exibe um total de 17 mutações (14 em FRs e 3 em CDRs) em comparação com a VH parental de sequência de mAb1 com SEQ ID NO: 5. Essa variante derivada de estruturas de quadro de linhagens germinativas humanas IGHV1-3*01 acopladas com IGHJ4*01 com 11 mutações reversas realizadas devido ao risco de impacto negativo na estrutura do mAb, conformação das CDRs e, portanto, na ligação ao seu alvo. Três posições das CDRs parentais foram alteradas para aumentar a taxa de humanização ou evitar passivos de sequência.
[00353] A variante VH3 humanizada com a SEQ ID NO: 17 exibe um total de 14 mutações (14 em FRs) em comparação com a VH parental de sequência de mAb1 com a SEQ ID NO: 5. Essa variante derivada de estruturas de quadro de linhagens germinativas humanas IGHV1-3*01 acopladas com IGHJ4*01 com 11 mutações reversas realizadas devido ao risco de impacto negativo na estrutura de mAb, conformação de CDRs e, portanto, na ligação ao seu alvo.
[00354] A variante VH5 humanizada com a SEQ ID NO: 21 exibe um total de 11 mutações (11 em FRs) em comparação com a VH parental de sequência de mAb1 com a SEQ ID NO: 5. Essa variante derivada de estruturas de quadro de linhas germinativas humanas IGHV1-3*01 acopladas com IGHJ4*01 com 14 mutações reversas realizadas devido ao risco de impacto negativo na estrutura do mAb, conformação de CDRs e, portanto, na ligação ao seu alvo.
[00355] A variante VH6 humanizada com SEQ ID NO: 23 exibe um total de 12 mutações (12 em FRs) em comparação com a VH parental de sequência de mAb1 com SEQ ID NO: 5. Essa variante derivada de estruturas de quadro de linhagens germinativas humanas IGHV1-3*01 acopladas com IGHJ4*01 com 13 mutações reversas realizadas devido ao risco de impacto negativo na estrutura do mAb, conformação de CDRs e, portanto, na ligação ao seu alvo.
[00356] As sequências variáveis humanizadas leves e pesadas resultantes foram analisadas quanto à similaridade de sequência com o banco de dados Immune Epitope Data Base (IEDB) ((PLos Biol (2005) 3 (3)e91) www.iedb.org) para garantir que nenhuma das sequências continha qualquer epítopo de célula B ou T conhecido listado.
[00357] As sequências variáveis de aminoácido completas de domínios variáveis leves e pesados humanizados e de mAb1 são apresentadas na Tabela G. Esses domínios variáveis leves e pesados humanizados foram combinados para gerar várias versões humanizadas de domínios variáveis parentais de mAb1. Os domínios variáveis de mAb2 correspondem à associação de VH1 humanizado combinado com VL1 humanizado. Os domínios variáveis de mAb3 correspondem à associação de VH3 humanizado combinado com VL3 humanizado. Os domínios variáveis de mAb4 correspondem à associação de VH5 humanizado combinado com VL3 humanizado. Os domínios variáveis de mAb5 correspondem à associação de VH6 humanizado combinado com VL3 humanizado. As proteínas de ligação triespecíficas mostradas na Tabela G são descritas mais detalhadamente no Exemplo 4.
[00358] As sequências de DNA codificadoras correspondentes das variantes de VH e VL humanizadas descritas acima foram clonadas em um vetor de expressão de mamífero codificando respectivamente os domínios de IgG1 humano ou Ck humano para expressão transiente e purificação como descrito no Exemplo 1. As sequências de aminoácido das variantes anti-CD38 humanizadas de comprimento total derivadas de mAb1 são listadas como mAb2 (cadeia pesada: HC1, SEQ ID NO: 15; cadeia leve: LC1, SEQ ID NO: 16), mAb3 (cadeia pesada: HC3, SEQ ID NO: 19; cadeia leve: LC3, SEQ ID NO: 20), mAb4 (cadeia pesada: HC5, SEQ ID NO: 22; cadeia leve: LC3, SEQ ID NO: 20), e mAb5 (cadeia pesada: HC6, SEQ ID NO: 24; cadeia leve: LC3, SEQ ID NO: 20). Exemplo 3: Reatividade cruzada e indução de apoptose de anticorpos anti-CD38
[00359] As variantes anti-CD38 humanizadas geradas no Exemplo 2 foram posteriormente caracterizadas para ligação a polipeptídeos CD38 humano e de cinomolgo e indução de apoptose. Materiais e Métodos Ensaio de Indução de Apoptose
[00360] As células foram incubadas a 2 x 10 5 células/ml em meio completo (RPMI-1640, 10% FBS, 2mM de L-glutamina) com 1,5 μg/ml (10 nM) de anticorpos indicados por 20 horas a 37ºC com 5% de CO2. As células foram manchadas com Anexina V-FITC de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies). As amostras foram analisadas por citometria de fluxo em um citômetro de fluxo BD FACSAria™ com o software BD FACSDiva para controle de aquisição e análise de dados (ambos BD Biosciences). Resultados
[00361] As propriedades de ligação de anticorpos CD38 anti- humanos selecionados produzidos como descritos acima foram examinados (Figuras 2A-2H). A ligação de anticorpos a CD38 humano solúvel e CD38 de macaco cinomolgo foi examinada usando ELISA e SPR. Os dados de ELISA foram usados para determinar o EC50 de ligação de anticorpo a CD38 humano e de macaco para anticorpos anti- CD38 humanizados mAb2 (Figura 2A), mAb3 (Figura 2C), mAb4, mAb5 (Figura 2E) e anticorpo anti-CD38 humano mAb6 (Figura 2I).
[00362] A ligação das variantes anti-CD38 humanizadas ou mAb anti-CD38 humano a CD38 também foi avaliada usando o ensaio SPR descrito acima. Os dados de SPR foram usados para determinar a KD e Koff de ligação de anticorpo CD38 humano e de macaco cinomolgo para anticorpos anti-CD38 humanizados mAb2 (Figura 2B), mAb3 (Figura 2D), mAb4, mAb5 (Figura 2F) e anticorpo anti-CD38 humano mAb6 (Figura 2H). Os dados de ligação estão resumidos na Tabela K e mostram que todos os mAbs anti-CD38 se ligam a CD38 com características de ligação semelhantes. Tabela K. Afinidade de ligação de mAbs anti-CD38 ao domínio extracelular solúvel de CD38 humano e CD38 de cinomolgo como determinado por ensaio de ressonância de plasmons de superfície. hCD38-his (SEQ ID NO: 2) cCD38-his (SEQ ID NO: 4) Kd (s-1) KD (M) Kd (s-1) KD (M) mAb1 2,66E-04 3,36E-10 9,85E-05 3,90E-10 mAb2 3,90E-04 3,32E-10 7,84E-04 3,44E-09 mAb3 2,83E-04 4,83E-10 1,29E-04 7,10E-10 mAb4 5,29E-04 8,22E-10 2,01E-04 1,14E-09 mAb5 3,33E-04 3,12E-10 1,25E-04 5,63E-10 mAb6 2,03E-04 1,44E-09 1,90E-04 1,38E-09
[00363] A capacidade das variantes anti-CD38 humanizadas de se ligarem a células expressando CD38 foi avaliada usando o ensaio de ligação baseado em FACS descrito acima. Os dados de FACS foram usados para determinar o EC50 de ligação de anticorpo a CD38 humano e de macaco cinomolgo para anticorpos anti-CD38 humanizados mAb2 (Figura 2A), mAb3 (Figura 2C), mAb4, mAb5 (Figura 2E) e anticorpo anti-CD38 humano mAb6 (Figura 2G). Os dados de ligação, apresentados na Tabela L, mostram que todas as variantes anti-CD38 humanizadas apresentaram afinidades de ligação semelhantes para CD38 de superfície celular. Tabela L. Afinidade de ligação de anti-CD38 mAbs a CD38 expressando murine preB::300,19 cells. FACS de KD Aparente (M) células expressando hCD38 células expressando cCD38 mAb1 2,80E-10 2,20E-10 mAb2 3,30E-10 7,50E-10 mAb3 7,80E-10 1,31E-09 mAb4 5,50E-10 1,15E-09 mAb5 6,80E-10 1,07E-09 mAb6 2,07E-09 1,14E-09
[00364] Os dados de ligação dos três ensaios estão resumidos na Figura 2I, juntamente com a identidade de sequência dos domínios VL e VH para regiões V humanas.
[00365] A capacidade do anticorpo mAb1 parental e mAb7 para induzir apoptose foi examinada em seguida. Ambos os anticorpos aumentaram o manchamento com Anexina V e absorção de iodeto de propídio (PI). 40% das células se tornaram duplamente positivas para Anexina V e PI após o tratamento com mAb7, enquanto 60% das células tratadas com mAb1 foram duplamente positivas. Ambos os anticorpos apresentaram efeito apoptótico dependente de concentração nas células SU-DHL-8 (Figura 2J). Da mesma forma, ambos os anticorpos promoveram atividade de ADCC contra células SU-DHL-8 na presença de células NK92 (Figura 2K), levando a até 60% de citotoxicidade e um IC50 de 4-6pM após 4 horas a 37ºC (Figura 2L).
[00366] Uma isoforma E de CD38 foi identificada in silico e validada no nível de transcrição de células NK, PBMCs e BMMCs a partir de linhagens celulares de câncer e pacientes com mieloma múltiplo (MOLP-8, CU1702 e CU2332). A isoforma E de CD38 foi evidenciada por uma triagem de banco de dados de sequência nucleica usando programa BLASTN 2.2.26 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller e David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search progrmas", Nucleic Acid Res. 25:3389-3402) em banco de dados de transcritos Human RefSeq, versão 20131216. O programa BLASTN foi aplicado sem mascarar regiões de baixa complexidade de sequência e considerando pelo menos: 98,5% de identidade com sequência nucleica de isoforma A de CD38 humano em uma extensão mínima de 100 resíduos de ácido nucleico. As sequências destacadas dessa triagem foram realinhadas com o locus do gene CD38 para serem validadas como sendo as formas transcricionais de gene CD38 humano (mesma estrutura genômica de íntron-exon). A sequência nucleica de isoforma E de CD38 foi uma das sequências validadas como sendo formas transcricionais do gene CD38 humano.
[00367] A capacidade de anticorpos anti-CD38 de se ligar a ambas isoformas A e E de CD38 humano também foi examinada. Para avaliar a ligação à isoforma A e isoforma E de CD38, um ensaio imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA) foi realizado usando proteínas de isoforma A e isoforma E (preparadas como descrito no Exemplo 1) como antígeno captador. Placas de 96 cavidades foram revestidas com qualquer isoforma a 0,5 µg/cavidade em PBS e 100 µl/cavidade de anticorpos foram adicionados à placa. A placa foi incubada a 37ºC por 1h e lavada cinco vezes com PBS contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T). Em seguida, 100 µl de uma diluição 1:25.000 de IgG anti-humana, conjugada com peroxidase de rábano silvestre, (Jackson Ref: 109-035-098) foram adicionados a cada cavidade. Após incubação a 37ºC por 1 h no escuro, as placas foram lavadas com PBS- T cinco vezes. A ligação de anticorpo foi visualizada por adição de tampão TMB-H2O2 e leitura a um comprimento de onda de 450 nM. Os valores de EC50 foram estimados usando software BIOST@T-SPEED.
[00368] A afinidade de ligação de vários anticorpos à isoforma A (SEQ ID NO: 1) e isoforma E (SEQ ID NO: 105) de CD38 foi determinada, como mostrado na Tabela L2. A Tabela M fornece uma comparação das propriedades de ligação para vários anticorpos anti- CD38. Tabela L2. Afinidade de ligação de anticorpos anti-CD38 para isoformas A e E de CD38, com base em EC50 como determinado por ELISA. Anticorpo EC50 de isoforma A de EC50 de isoforma E de CD38 (nM) CD38 (nM) mAb1 0,11 (CV 9 %) 0,08 (CV 7%) mAb2 0,14 (CV 13%) 0,10 (CV 12%) mAb6 0,47 (CV 3,7%) 0,32 (CV 5%) mAb7 0,10 (CV 7,1%) Nenhuma ligação Tabela M. Características de ligação de vários anticorpos anti-CD38. Anti-CD38 H11 (Santa Daratumumab mAb7 mAb1 mAb6 Cruz) Ligação à isoforma A de + + + + + huCD38 Ligação à isoforma E de + - - + + huCD38 Ligação a + - - + + CD38 de cino
[00369] Em conclusão, ambos mAb7 e mAb1 induzem apoptose semelhante em células de mieloma múltiplo humano MOLP-8, efeito apoptótico dependente de concentração semelhante contra células SU- DHL-8, e atividade ADCC dependente de concentração semelhante contra células SU-DHL-8. No entanto, apenas mAb1 ligou-se a ambos CD38 humano e de macaco cinomolgo com afinidade subnanomolar e ligou-se a isoformas A e E de CD38.
[00370] A capacidade das variantes anti-CD38 humanizadas para induzir apoptose também foi avaliada por classificador de células ativadas por fluorescência (FACS), como descrito acima. Vários anticorpos anti-CD38 com várias propriedades funcionais foram identificados anteriormente, enquanto alguns deles podem mediar o extermínio in vitro de linhagens de células CD38+ através de impacto direto na proliferação ou apoptose celular. Os resultados de ensaios de indução de apoptose são como mostrados na Figura 2M. Todos os anticorpos gerados nos Exemplos 1 e 2 foram capazes de induzir apoptose, exceto mAb6. Anticorpos anti-CD38 mAb2, mAb3, mAb4 e mAb5 levaram a uma indução de apoptose dependente de dose em células de linfoma SU-DHL-8; IC50 para cada anticorpo é fornecido nas Figuras 2N-2Q. Exemplo 4: Geração de proteínas de ligação anti-CD38 triespecíficas
[00371] Em seguida, as propriedades de ligação dos domínios de ligação a antígeno de anticorpos anti-CD38 selecionados descritos nos Exemplos 1-3 foram analisadas no formato triespecífico mostrado na Figura 3A.
[00372] Os domínios de ligação a antígeno anti-CD38 foram testados no formato triespecífico (anti-CD38xanti-CD28xanti-CD3) quanto à capacidade de ligar CD38 quando outros domínios de ligação a antígeno estão ligados a seus ligandos cognatos usando SPR. O ensaio de ligação de ligando sequencial é mostrado na Figura 3B. Para ligação sequencial dos três antígenos a cada Ab triespecífico, a concentração de saturação (> 10 KD) de cada antígeno foi injetada por 8 minutos, seguidos por 5 minutos de dissociação. O regenerado de superfície foi conduzido por injeção de 10 mM de Glicina-HCl pH 2,5 por 60 s a 30 µl/min. Os dados foram ajustados com o modelo de ligação cinética 1:1 e analisados usando Biacore S200 Evaluation Software v 1.0. A constante de dissociação de equilíbrio (KD) foi calculada usando a constante de taxa de associação (kon) e a constante de taxa de dissociação (koff).
[00373] Como mostrado na Figura 3C, esse ensaio baseado em SPR mostrou que as proteínas de ligação triespecíficas foram capazes de se ligar a CD38, independentemente de os domínios de ligação a antígeno CD3 e/ou CD28 também estarem ligados a seu antígeno cognato. Os resultados de um ensaio de ligação sequencial exemplificativo são mostrados na Figura 4. Parâmetros cinéticos como medidos por SPR são fornecidos na Tabela M2. Tabela M2. Ligação de proteínbas de ligação anti-CD38xanti- CD28xanti-CD3 triespecíficas a 1, 2 ou 3 antígenos cognatos. Estado de proteína de ligação ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (M) antes da ligação de CD38 Sem pré-ligação 9,02E+05 1,42E-03 1,57E-09 CD3 pré-ligado 8,35E+05 1,24E-03 1,48E-09 CD28 pré-ligado 7,39E+05 1,32E-03 1,79E-09 CD3 pré-ligado, em seguida, CD28 8,18E+05 1,23E-03 1,50E-09 CD28 pré-ligado, em seguida, CD3 8,37E+05 1,23E-03 1,47E-09
[00374] Esses resultados demonstram que todos os três alvos podem se ligar às proteínas de ligação triespecíficas simultaneamente. Pré-ligação das proteínas de ligação triespecíficas com CD28, CD3 ou ambos (em qualquer ordem) não alterou a cinética de ligação ou a afinidade de ligação para CD38.
[00375] Em seguida, cada domínio de ligação a antígeno da proteína de ligação triespecífica CD38SB19xCD28supxCD3mid foi avaliado por SPR quanto à capacidade de ligar antígeno cognato com e sem os outros dois domínios de ligação a antígeno em saturação. As Tabelas M3 e M4 mostram os resultados desses ensaios. Tabela M3. Ligação alvo sem outros alvos presentes Alvo ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (M) CD38 8,04E+05 1,41E-03 1,75E-09 CD28 1,16E+05 3,14E-04 2,71E-09 CD3 2,90E+04 6,73E-04 2,32E-08 Tabela M4. Ligação alvo com outros alvos em saturação Alvo ka (M-1s-1) kd (s-1) KD (M) CD38 5,93E+05 1,44E-03 2,42E-09 CD28 1,05E+05 3,96E-04 3,77E-09 CD3 1,27E+05 2,36E-03 1,86E-08
[00376] Como demonstrado nas Tabelas M3 e M4, o fato de ter dois alvos saturados por pré-ligação com antígeno não impactou a cinética ou afinidade de ligação do terceiro alvo para CD38 ou CD28. No caso de ligação a CD3, o CD38 e/ou CD28 pré-ligado resultou em cinética mais rápida (impacto de aproximadamente 4 vezes nos valores de k on e koff).
[00377] Os domínios de ligação a antígeno anti-CD38 foram testado em formato triespecífico com dois domínios de ligação a antígeno anti- CD28 (superagonista, "sup", e agonista convencional, "cvn") e dois domínios de ligação a antígeno anti-CD3 ("médio" e "baixo"). As sequências de domínio variável para esses domínios de ligação a antígeno são fornecidas como segue: anti-CD28sup: SEQ ID NO: 49 (VH) e SEQ ID NO: 50 (VL); anti-CD28cvn: SEQ ID NO: 51 (VH) e SEQ ID NO: 52 (VL); anti-CD3mid: SEQ ID NO: 53 (VH) e SEQ ID NO: 54 (VL); anti- CD3low: SEQ ID NO: 84 (VH) e SEQ ID NO: 85 (VL). Os resultados dos ensaios de SPR avaliando a ligação de proteínas de de ligação triespecíficas são mostrados na Figura 5. Três domínios de ligação anti- CD38 tinham aproximadamente a mesma afinidade de ligação no formato de proteína de ligação triespecífica que em um formato monoespecífico. Ambos os domínios de ligação CD3 tinham aproximadamente a mesma afinidade de ligação nos formatos mono-, bi- e triespecífico. Os domínios de ligação CD28 devem ter uma afinidade de ligação um pouco mais baixa (mas ainda nanomolar) no formato bi- ou triespecífico, em comparação com o monoespecífico. Quando os outros dois domínios de ligação a antígeno foram saturados, os domínios de ligação anti-CD38SB19 e anti-CD28sup tiveram afinidades de ligação semelhantes, em comparação com quando os outros dois domínios de ligação a antígenos não estão ligados a antígeno. No entanto, o domínio de ligação anti-CD3mid mostrou cinética mais rápida quando os outros dois domínios de ligação a antígeno foram saturados. Esses resultados demonstram que domínios de ligação anti-CD38, anti- CD28 e anti-CD3 são compatíveis para uso com o formato de proteína de ligação triespecífica.
[00378] Os domínios de ligação a antígeno anti-CD38 gerados neste documento também foram comparados com o domínio de ligação anti- CD38 existente de mAb7 (ver SEQ ID NO: 47 para sequências VH e SEQ ID NO: 48 para sequências VL, respectivamente). A ligação de moléculas triespecíficas a CD38 expresso na superfície de células preB::300,19 de murino recombinantes foi determinada por citometria de fluxo e os anticorpos monovalentes anti-CD38 correspondentes foram testados em paralelo. A linhagem celular recombinante foi descrita por J. Deckket et al. 2014 Clin. Cancer Res 20:4574-4583. Células expressando CD38 preB::300,19 de de murino foram revestidas a 40.000 células/cavidade em placa de Alta Ligação de 96 cavidades (MSD L15XB-3) e 100 µl/cavidade de moléculas triespecíficas foram adicionados por 45 minutos a 4ºC e lavados três vezes com PBS 1% de BSA. 100 µl/cavidade de IgG anti-humana de cabra conjugada com Alexa488 (Jackson ImmunoResearch; #109-545-098) foram adicionados por 45 minutos a 4ºC e lavados três vezes com PBS 1% BSA. A ligação de anticorpo foi avaliada após centrifugação e ressuspensão de células por adição de 200 µl/cavidade de PBS 1% BSA e leitura usando o sistema de citometria de fluxo Guava® easyCyte™ 8HT. Os valores EC50 e KD aparente foram estimados usando o software BIOST@T-BINDING e BIOST@T-SPEED, respectivamente.
[00379] Citometria de fluxo foi usada como descrito acima para examinar a ligação de mAb7 ou da proteína de ligação triespecífica com domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb7 a células pré-B de murino expressando polipeptídeo CD38 humano ou de macaco cinomolgo em sua própria superfície celular. Como mostrado na Figura 6A, a proteína de ligação triespecífica CD38xCD28supxCD3mid com o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb7 ligado a células expressando CD38 humano (esquerda superior) com afinidade aparente 8 vezes menor do que o anticorpo monoespecífico mAb7 (direita superior). Nem o anticorpo monoespecífico mAb7 (direita inferior) nem a proteína de ligação triespecifica com o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb7 (esquerda inferior) ligou-se a células expressando CD38 de cinomolgo.
[00380] O domínio de ligação do anticorpo anti-CD38 humanizado mAb2 também foi testado em formatos triespecíficos para ligação a células expressando polipeptídeos CD38 humanos ou de cinomolgo. Como mostrado nas Figuras 6B-6D, e ao contrário de mAb7, proteínas de ligação triespecíficas CD38xCD28supxCD3mid e CD38xCD28cvnxCD3mid com domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb2, bem como o anticorpo monoespecífico de mAb2, foram capazes de se ligar a ambos os polipeptídeos CD38 humano e de cinomolgo. A proteína de ligação triespecífica CD38xCD28cvnxCD3mid com o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb2 ligado a células expressando CD38 humano com afinidade aparente 9 vezes menor que o anticorpo parental mAb2 (comparar Figura 6C superior com a Figura 6D superior). A proteína de ligação triespecífica CD38xCD28cvnxCD3mid com o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb2 ligado a células expressando CD38 de cinomolgo com afinidade aparente 7,5 vezes menor que o anticorpo parental mAb2 (comparar Figura 6C inferior com a Figura 6D inferior). A proteína de ligação triespecífica CD38xCD28supxCD3mid com o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb2 ligado a células expressando CD38 humano com uma afinidade aparente 2,5 vezes menor que a proteína de ligação triespecífica CD38xCD28cvnxCD3mid com o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb2 (comparar Figura 6C superior com Figura 6B superior).
[00381] O domínio de ligação de anticorpo anti-CD38 humanizado mAb6 também foi comparado com o anticorpo monoespecífico mAb6 para ligação a células expressando polipeptídeos CD38 humanos ou de cinomolgo. Embora o anticorpo monoespecífico mAb6 ligado a células expressando polipeptídeos CD38 humano (direita superior) ou de macaco cinomolgo (direita inferior) na faixa de nM (Figura 6E), a proteína de ligação triespecífica CD38xCD28supxCD3mid com o domínio de ligação a antígeno anti-CD38 de mAb6 ligado a células expressando polipeptídeos CD38 humano (esquerda superior) ou de macaco cinomolgo (esquerda inferior) sem saturação.
[00382] Em conclusão, descobriu-se que a afinidade para ligação de proteína de ligação triespecífica CD38SB19xCD28supxCD3mid a CD38 humano está no mesmo intervalo, seja examinando a ligação a CD38 recombinante humano por SPR ou a CD38 humano expresso em uma superfície celular por citometria de fluxo (Figura 6F). Da mesma forma,
a afinidade de proteínas de ligação triespecíficas CD38VH1xCD28supxCD3mid/low (domínio de ligação anti-CD38 de mAb2) e CD38VH1xCD28cvnxCD3mid/low (domínio de ligação anti-CD38 de mAb2) para ligação a CD38 humano também está na mesma faixa em ambos os ensaios. Para CD38HHY1370xCD28supxCD3mid (domínio de ligação anti- CD38 de mAb6), a KD para ligar CD38 humano foi determinada por SPR como 1 nM, enquanto nenhum valor preciso de EC50 pôde ser estimado por citometria de fluxo. Um resumo de valores KD aparente (obtidos por análises FACS) de proteínas de ligação triespecíficas com vários domínios de ligação anti-CD38 é fornecido na Tabela M5. Tabela M5. Resumo de valores de KDaparente obtidos por ensaios de citometria de fluxo FACS de KD aparente (M) células expressando hCD38 células expressando cCD38 Triespecífica com 4,4 nM 7,5 nM mAb2 antiCD38 Triespecífica com Sem saturação Sem saturação mAb6 antiCD38 Triespecífica com 4 nM Sem ligação mAb7 antiCD38 mAb2 0,5 nM 1 nM mAb6 11,2 nM 6,6 nM mAb7 0,5 nM Sem ligação
[00383] Como esperado, a proteína de ligação triespecífica ΔCD38xCD28supxCD3mid sem o domínio de ligação anti-CD38 não se ligou a células que expressam polipeptídeos CD38 humanos ou de macaco cinomolgo (Figura 6G). Isso indica que a ligação observada neste ensaio foi específica para os domínios de ligação a antígeno
CD38. Exemplo 5: Caracterização in vitro e in vivo de proteínas de ligação triespecíficas contendo mAb2 anti-CD38 e mAb6 anti-CD38
[00384] O Exemplo a seguir descreve experimentos que caracterizam a estabilidade, propriedades de ligação e atividades de novos acopladores de células T que contêm domínios variáveis derivados dos anticorpos mAb2 e mAb6. Anticorpos anti-CD38 x CD28 x CD3 adicionais foram gerados compreendendo variantes dos braços anti-CD38, CD3 e CD28 das proteínas de ligação triespecíficas. Os novos anticorpos anti-CD38/CD3/CD28 diferem em: 1) domínio de ligação anti-CD38 (mAb2 ou mAb6); 2) domínio de ligação anti-CD3 (CD3high ou CD3low; ver SEQ ID NOs: 84 e 85 para sequências VH e VL anti-CD3low, respectivamente); 3) Domínio de ligação anti-CD28 (CD28sup ou CD28cvn). Dentro das combinações possíveis, uma coleção do anti-CD38 x CD28 x CD3 foi projetada, produzida e subsequentemente testada para várias funções. Materiais e Métodos Produção e purificação de proteínas de ligação triespecíficas
[00385] Proteínas de ligação triespecíficas foram produzidas por transfecção transiente de 4 plasmídeos de expressão em células Expi293 usando o Kit de Transfecção ExpiFectamine™ 293 (Thermo Fisher Scientific) de acordo com o protocolo do fabricante. Em suma, 25% (p/p) de cada plasmídeo foram diluídos em Opti-MEM, misturados com reagente ExpiFectamine pré-diluído por 20-30 minutos em temperatura ambiente (RT), e adicionados a células Expi293 (2,5x10 6 células/ml). Uma otimização de transfecção para determinar a melhor proporção de plasmídeos foi geralmente usada para produzir a proteína de ligação triespecífica com bom rendimento e pureza.
[00386] 4-5 dias após a transfecção, o sobrenadante de células transfectadas foi coletado e filtrado através de uma unidade de filtro de
0,45 µm (Nalgene). A proteína de ligação triespecífica no sobrenadante foi purificada usando um procedimento de 3 etapas. Primeiramente, purificação por afinidade com Proteína A foi usada, e o Ab ligado foi eluído usando o "Tampão de Eluição de IgG" (Thermo Fisher Scientific). Em segundo lugar, o produto foi dialisado contra PBS (pH 7,4) durante a noite com 2 mudanças no tampão PBS. Qualquer precipitado foi limpo por filtração através de uma unidade de filtro de 0,45 µm (Nalgene) antes da etapa seguintes. Em terceiro lugar, purificação por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) (Hiload 16/600 Superdex 200pg, ou Hiload 26/600 Superdex 200pg, GE Healthcare) foi usada para remover agregados e diferentes espécies na preparação. As frações foram analisadas em SDS-PAGE reduzido e não reduzido para identificar as frações que continham a proteína de ligação triespecífica monomérica antes de combiná-las. O anticorpo purificado pode ser dividido em alíquotas e armazenado a -80ºC a longo prazo. Ensaios ELISA
[00387] As propriedades de ligação dos anticorpos purificados foram analisadas usando os métodos ELISA ou SPR. Para ELISA, antígenos correspondentes para cada sítio de ligação na proteína de ligação triespecífica foram usados para revestir uma placa Imuno de 96 cavidades (Nunc 439454, Thermo Fisher Scientific) durante a noite a 4ºC usando 2 µg/ml de cada antígeno em PBS (pH 7,4). A placa revestida foi bloqueada usando 5% de leite desnatado + 2% de BSA em PBS por uma hora à temperatura ambiente, seguida de lavagem com PBS+0,25% de Tween 20 três vezes (Aqua Max 400, Molecular Devices). Diluição em série de anticorpos (Abs de controle e triespecífico) foi preparada e adicionada às placas de ELISA (100 µl/cavidade em duplicata), incubada à temperatura ambiente por uma hora, seguida de lavagem 5 vezes com PBS+0,25% de Tween 20.
[00388] Após a lavagem, Fab anti-humano secundário conjugado com HRP (1:5000, Cat. No. 109-035-097, Jackson ImmunoResearch Inc) foi adicionado a cada cavidade e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos. Após lavagem 5 vezes com PBS+0,25% de Tween 20, 100 µl de Substrato Peroxidase TMB Microwell (KPL, Gaithersburg, MD, EUA) foram adicionados a cada cavidade. A reação foi encerrada por adição de 50 µL de H 2SO4 1M e OD450 foi medido usando SpectraMax M5 (Molecular Devices) e analisado usando o software SoftMax Pro6.3 (Molecular Devices). Os dados finais foram transferidos para o software GraphPad Prism (GraphPad Software, CA, EUA), e plotados como mostrado. O EC50 foi calculado usando o mesmo software.
[00389] Ensaio ELISA foi usado para determinar uma ligação de anticorpos triespecíficos anti-CD38xCD28xCD3 ou anticorpo de controle de isótipo (IgG4 humana) a CD3 humano (Cambridge Biologics LLC Cat #03-01-0051), CD28 (Cambridge Biologics LLC Cat #03-01- 0303), e CD38 (Cambridge Biologics LLC Cat #03-01-0369). Os anticorpos ligados foram detectados usando um anticorpo secundário anti-Fab conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson ImmunoResearch Inc #109-035-097). Ensaio de Extermínio Celular In Vitro
[00390] PBMCs humanas purificadas foram usadas para ensaios de extermínio in vitro contra várias células de câncer usando diferentes proteínas de ligação triespecíficas. Em suma, o ensaio de extermínio foi configurado em placa com fundo em V de 96 cavidades. Para cada placa, 40 ml de PBMCs de cada doador foram plaqueadas a 2x10^6 células/ml, e 30 ml de células alvo rotuladas com PKH26 (Sigma #MINI26) a 2,5x10^5 células/ml (4µl de corante para manchar até 1x10^7 células) foram preparados. As primeiras proteínas de teste de 20 µl/cavidade em várias concentrações ou PMA foram adicionadas a cada cavidade, seguido por adição de 80 µl/cavidade de células alvo rotuladas em cada cavidade (2x10^4 células/cavidade). 100 µl de PBMC foram adicionados a cada cavidade, atingindo E:T=10:1 cavidade (2x10^5 células/cavidade), e incubados por 24 horas em incubadora de CO2 a 5% a 37ºC. As células foram centrifugadas e o sobrenadante foi coletado para medir a liberação de citocina ou descartado. As células foram manchadas com tampão de coloração de células mortas violeta fixável Vivid LIVE/DEAD™ (Life Technology #L34955) (o tampão de coloração foi preparado por adição de 60 µl de reagente Vivid em 60 ml de PBS). As células foram ressuspensas em 100 µl de tampão de coloração por incubação por 15 min à RT no escuro. Após a lavagem das células com 1xPBS, as células foram ressuspensas em 200µl de PBS com 0,5% de paraformaldeído, e células de câncer PKH26+Vivid+ foram coletadas por citômetro de fluxo Fortessa (Beckton Dickinson, San Jose, CA), seguido por análise usando o software Flowjo. A porcentagem de extermínio é calculada como extermínio específico- extermínio espontâneo/células totais e plotada como mostrado. Ensaio de Liberação de Citocina
[00391] Para medir as concentrações de citocina inflamatória nos ensaios de ativação in vitro, ensaios de extermínio in vitro, ensaios de ativação in vivo em células do cordão umbilical CD34+ de camundongos NSG humanizados, e o estudo de toxicidade, o sobrenadante de cultura celular foi coletado e as amostras de soro foram diluídas de acordo com o protocolo do fabricante usando o kit 13-plex de Células T Humanas de Alta Sensibilidade Milliplex (EMD Millipore). Esses foram posteriormente analisados por EMD Millipore MAGPIX® System e software MILLIPLEX® Analyst 5.1. Modelos de camundongo in vivo e estudos de eficácia
[00392] Camundongos NSG enxertados com células-tronco hematopoéticas CD34+ humanas (hu-CD34) foram usados como modelo de camundongo in vivo. Esses camundongos desenvolvem células imune humanas de múltiplas linhagens, e são uma plataforma validada para estudos de eficácia em imuno-oncologia (ver, por exemplo, Shultz, L.D. et al. (2014) Cold Spring Harb. Protoc. 2014:694- 708). Os camundongos NSG Hu-CD34+ são produzidos por injeção de células-tronco hematopoiéticas CD34+, mostrando um enxerto multilinhagem eficaz de populações de células imunes humanas incluindo células T, células B e algumas outras populações (McDermott, SP et al. (2010) Blood 116:193- 200). A hematopoiese multilinhagem ocorre dentro de 12 semanas. O enxerto é estável por mais de um ano sem doença do enxerto versus hospedeiro.
[00393] Para o estudo de eficácia usando camundongos NSG hu- CD34, os camundongos foram adquiridos do The Jackson Laboratory (Maine, EUA), e as populações de células humanas foram validadas antes do uso. Em geral, 5x106 células tumorais misturadas em Matrigel (BD Biosciences) (50% v/v) foram usadas para inocular tumor em cada camundongo. Quando o tamanho do tumor atingiu a faixa de 100-150 mm3, os camundongos foram selecionados e randomizados em cada grupo para estudo. Os anticorpos foram administrados por via intravenosa em doses dadas 3 vezes por semana. O peso corporal foi monitorado 1-3 vezes por semana. O tamanho do tumor foi medido por medições de tumor com paquímetro 1-3 vezes/semana. Todos os camundongos foram extintos quando o tamanho do tumor atingiu 1.500 mm3, ou 24 horas após a última dose. Amostras de sangue terminal (0,3 ml) foram coletadas em tubos separadores de soro, misturadas invertendo suavemente cinco vezes e colocadas em um suporte para tubos. Os tumores terminais também foram coletados e pesados antes de serem fixados para análise imuno-histoquímica.
[00394] Camundongos NSG humanizados com PBMC humana (hu- PBMC) foram usados como outro modelo de camundongo in vivo. Esses camundongos são produzidos por injeção de PBMC humana purificada de doadores saudáveis, que apresentam a taxa de enxerto mais rápida usando células mononucleares de sangue periférico adulto e permitem estudos de curto prazo que exigem uma função de células T e células NK de memória e efetora forte, além de serem adequados para estudo de eficácia de curto prazo (3-4 semanas) devido à doença do enxerto versus hospedeiro.
[00395] Para o estudo de eficácia usando camundongos NSG hu- PBMC, camundongos NSG de 8 a 10 semanas de idade (Cat. No: 005557, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) foram adquiridos do The Jackson Laboratory (Maine, EUA). Cada camundongo foi inoculado com 5x106 células tumorais misturadas em Matrigel (BD Biosciences) (50% v/v) por via subcutânea. Quando o tamanho do tumor atingiu a faixa de 50-100 mm3, 10x106 PBMCs humanas de doadores saudáveis foram reconstituídas para cada camundongo por via intraperitoneal (IP). A reconstituição de células humanas foi validada no dia seguinte. Quando o tamanho do tumor atingiu a faixa de 100-150 mm3, os camundongos foram selecionados e randomizados em grupo cada para estudo. Os anticorpos foram administrados por via intravenosa em doses dadas 3 vezes por semana. O peso corporal foi monitorado 1-3 vezes por semana. O tamanho do tumor foi medido por medições de tumor por paquímetro 1-3 vezes/semana. Todos os camundongos foram extintos quando o tamanho do tumor atingiu 1.500 mm3 ou 24 horas após a última dose. Amostras de sangue terminal (0,3 ml) foram coletadas em tubos separadores de soro, misturadas invertendo suavemente cinco vezes e colocadas em um suporte para tubos. Os tumores terminais também foram coletados e pesados antes de serem fixados para análise imuno-histoquímica.
[00396] Para o modelo disseminado de camundongo NSG hu-PMBC, foram injetadas 1-5x106 células em cada camundongo por via intravenosa no dia 0. No dia 3, imagem por luminância da linha de base foi tomada para randomização. No dia 4, 10x106 PBMCs humanas de doadores saudáveis foram reconstituídas para cada camundongo por via intraperitoneal (IP). Os camundongos foram tratados semanalmente nos dias 5, 12, 19 usando doses indicadas. Imagem corporal por luminância semanal foi obtida nos dias 10, 17, 24 para monitorar o volume do tumor em cada animal. Ao término do estudo, sangue, baço, osso e medula óssea foram coletados para estudo histopatológico. Resultados
[00397] A capacidade dos anticorpos de ligar todos os três antígenos alvo foi testada por ensaio ELISA. CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28supxCD3low IgG4, CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4, CD38VH1xCD28cvnxCD3low IgG4 mostraram afinidade de ligação similar para CD3 e CD38 humano e de macaco, mas afinidade de ligação variável para CD28 (humano e de macaco têm domínio extracelular idêntico) com CD28sup mostrando melhor afinidade (Figura 7A). Variante FALA IgG4 e variantes LALA P329A e NNAS de IgG1 CD38VH1xCD28supxCD3mid e CD38HHY1370xCD28supxCD3mid todas mostraram ligação similar a CD3, CD28 e CD38 humano (Figura 7B).
[00398] Em seguida, variantes da proteína de ligação anti- CD38xCD3xCD28 triespecífica foram testadas quanto à sua capacidade de induzir a ativação de células T e extermínio de células tumorais mediado por anticorpo (Figuras 8A- 8D). A Figura 8A mostra as atividades de extermínio in vitro de IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid, IgG4 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid, IgG4 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid, IgG4 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid, contra linhagem celular de mieloma múltiplo humano RPMI-8226 usando PBMC de 3 doadores diferentes a E:T=10. O EC50 da atividade de extermínio foi calculado e resumido na Tabela N. Ambas as proteínas de ligação triespecíficas anti- CD38xCD3xCD28 contendo CD28sup mostraram melhores atividades de extermínio. As atividades de extermínio in vitro dessas moléculas foram também examinadas usando NCI-H929 (Figura 8B), KMS-26 (Figura
8C), e linhagens celulares KMS-11 (Figura 8D).
[00399] Proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38xanti-CD3xanti- CD28 com variantes LALA P329A e NNAS de IgG1, ou variante FALA de IgG4, também apresentaram extermínio in vitro de células KMS-11 (Figura 8E) e U266 (Figura 8F) de mieloma múltiplo. O EC50 para cada anticorpo contra cada linhagem celular foi calculado e resumido na Tabela Q2 (KMS-11) e Q3 (U266).
[00400] As Figuras 9A, 9B & 10 mostram o perfil de ativação de células T in vitro da IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid e IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3low. Ambos os anticorpos mostraram atividades de ativação similares para células T CD4 e CD8. O EC50 para cada anticorpo contra cada linhagem celular foi calculado e resumido na Tabela N (RPMI-8226), Tabela O (NCI-H929), Tabela P (KMS-26) e Tabela Q (KMS-11). Tabela N: Extermínio específico mediado por anticorpo de células RPMI8266 CD38+ por PBMCs de diferentes doadores Anticorpo EC50 (ng/ml) Doador Doador Doador #65 #67 #68 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 5,30 1,95 3,3 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4 2,24 3,42 3,4 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4 8,31 29,52 46,8 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4 4,62 8,98 16,5 Tabela O: Extermínio específico mediado por anticorpo de células NCI- H929 CD38+ por PBMCs de diferentes doadores EC50 (ng/ml) Doador Doador Doador #68 #65 #67 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 0,51 0,48 0,9 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4 0,94 1,84 2,5
CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4 3,70 9,47 10,4 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4 2,31 6,39 7,2
Tabela P: Extermínio específico mediado por anticorpo de células KMS- 26 CD38+ por PBMCs de diferentes doadores EC50 (ng/ml) Doador Doador Doador #65 #67 #68 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 1,03 0,91 1,3 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4 3,95 5,06 5,3 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4 10,73 28,17 22,4 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4 15,84 32,10 25,7
Tabela Q: Extermínio específico mediado por anticorpo de células KMS- 11 CD38+ por PBMCs de diferentes doadores EC50 (ng/ml) Doador Doador Doador #65 #67 #68 CD38VH1xCD28supxCD3mid IgG4 3,05 3,40 14,7 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid IgG4 4,17 7,74 25,1 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid IgG4 18,14 98,83 566,8 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid IgG4 16,30 27,63 139,2
Tabela Q2: Extermínio específico mediado por anticorpo de células KMS-11 CD38+ por PBMCs de diferentes doadores (Fcs de variante IgG1/4)
EC50 CD38VH CD38VH1 CD38VH1 CD38hhy13 CD38hhy1370 CD38hhy13 (pM) 1xCD28 xCD28su xCD28su 70xCD28su xCD28supx 70xCD28s (KMS11) supxCD pxCD3mi pxCD3mi pxCD3mi CD3mi upxCD3mi 3mid d d IgG4 IgG1 IgG1 IgG4 IgG1 IgG1 FALA LALA NNAS FALA LALA NNAS P329A P329A KP50901 3,879 4,375 4,411 7,731 9,311 17,71 KP50904 4,379 6,739 8,644 19,01 18,88 24,39 Tabela Q3: Extermínio específico mediado por anticorpo de células U266 CD38+ por PBMCs de diferentes doadores (Fcs de variante IgG1/4) EC50 CD38VH1 CD38V CD38VH1 CD38hhy1 CD38hhy137 CD38hhy137 (pM) xCD28s H1xCD xCD28s 370xCD2 0xCD28sup 0xCD28sup (U266) upxCD3 28supx upxCD3 8supxCD xCD3mi xCD3mi mid IgG4 CD3mid mid 3mi IgG1 IgG1 FALA IgG1 IgG1 IgG4 LALA NNAS LALA NNAS FALA P329A P329A KP50901 1,879 1,031 1,150 2,691 1,597 2,816 KP50904 0,8657 3,570 2,018 2,112 0,8375 3,527
[00401] A produção de citocina induzida pelas variantes de proteína de ligação triespecíficas também foi examinada (Figuras 11A e 11B), usando o método usado em Stebbings, R. et al. (2007) (J. Immunol. 179:3325-3331) por revestimento da placa com anticorpos indicados, seguido de incubação com PBMC humana por 24 horas, usando 2 concentrações dos anticorpos de teste (5 µg/ml e 25 ng/ml). Os sobrenadantes de cultura de 24 horas foram coletados e usados para medir a concentração de IL2, IL6, IL10, IL12 e TNF-α, IFN-γ nos sobrenadantes, como descrito acima. IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid, IgG4 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid, IgG4 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid,
IgG4 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid todas estimularam a produção de nível significativo de IL2, TNF-α e IFN-γ a 5 µg/ml, mas falharam em induzir nível mensurável de qualquer citocina a 25 ng/ml, uma dose mostrando eficácia in vivo em 2 modelos de camundongo NSG humanizado.
[00402] A atividade antitumoral foi testada em modelos de camundongo in vivo para as variantes de proteínas de ligação triespecíficas (Figuras 12A-13F), como descrito acima. As Figuras 12A- 12E mostram os resultados do estudo de eficácia in vivo usando o modelo de camundongo NSG enxertado com células-tronco hematopoiéticas CD34+ humanas (hu-CD34) implantado com linhagem celular MM humana RPMI-8226. IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid e anticorpos biespecíficos CD38xCD3 de controle com marcador de referência foram usados para tratar camundongos portadores de tumor nas doses indicadas 3QW (total de 6 doses). O peso corporal e o crescimento tumoral de cada camundongo foram medidos e plotados (Figuras 12A e 12E). Curva média de crescimento tumoral (Figura 12D), volume tumoral no dia 18 (Figura 12B) e peso do tumor terminal D19 (Figura 12C) para cada grupo também foram plotados. Todos os grupos tratados com IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid não apenas demonstraram eficácia estatística em comparação com controle de PBS, mas também demonstraram estatisticamente melhor eficácia na dose de 1 µg/kg em comparação com anticorpo biespecífico CD38xCD3 de controle.
[00403] As Figuras 13A-13F mostram os resultados do estudo de eficácia in vivo usando o modelo de camundongo NSG humanizado com PBMC humana implantado com linhagem celular MM humana RPMI-
8226. IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid e anticorpos biespecíficos CD38xCD3 de controle de referência foram usados para tratar camundongos portadores de tumor nas doses indicadas 3QW (total de
8 doses). O crescimento tumoral para cada camundongo foi medido e plotado (Figura 13A). Curva de crescimento tumoral médio (Figura 13F), volume tumoral no dia 4 (dia do início do tratamento; Figura 13B), volume tumoral no dia 21 (dia do último tratamento; Figura 13C), volume tumoral médio no dia 21 (Figura 13D) e peso tumoral terminal no dia 22 (Figura 13E) para cada grupo também foram plotados. Todos os grupos tratados com IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid não apenas demonstraram eficácia estatística em comparação com o controle de PBS, mas também demonstraram eficácia estatisticamente melhor em doses múltiplas em comparação com o anticorpo biespecífico CD38xCD3 de controle, indicando atividade antitumoral in vivo superior pelo anticorpo anti-CD38/CD3/CD28 triespecífico.
[00404] O anticorpo biespecífico CD38xCD3 de controle de referência compreende as seguintes sequências:
[00405] SEQ ID NO 108: cadeia pesada 1 de referência (liga CD38)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSYSWMNWVRQAPGKGL EWVSEINPQSSTINYATSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAV YYCARYGNWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVT VPSSSLGTQTYICNVNHKPSDTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPPV AGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGV EVHNAKTKPREEEYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAL PAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCDVSGFYPS DIAVEWESDGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWEQGD VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00406] SEQ ID NO 109: cadeia pesada 2 de referência (liga CD3)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMNWVRQAPGKGL EWVGRIRSKYNNYATYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCVRHGNFGDSYVSWFAYWGQGTLVTVSSGKPGSGKPGSGK PGSGKPGSQAVVTQEPSLTVSPGGTVTLTCGSSTGAVTTSNYANWV QQKPGKSPRGLIGGTNKRAPGVPARFSGSLLGGKAALTISGAQPEDE ADYYCALWYSNHWVFGGGTKLTVLEPKSSDKTHTCPPCPAPPVAGP SVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVKHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREQMTKNQVKLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[00407] SEQ ID NO 110: cadeia leve de referência (liga CD38)
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNVDTWVAWYQQKPGQSPKA LIYSASYRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYDSY PLTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK
HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC Exemplo 6: Estudo de escalonamento de dose com proteínas de ligação triespecíficas contendo mAb2 e mAb6 anti-CD38 Materiais e Métodos
[00408] Todos os estudos de NHP foram realizados por Covance (Princeton, Nova Jersey, EUA) de acordo com o protocolo Covance ICUCA. Macacos cinomolgos machos sem tratamento prévio com proteína ou sem tratamento prévio com proteína e droga foram usados em todos os estudos. Com base no projeto do estudo, os macacos foram selecionados e agrupados para cada proteína de ligação triespecífica. O anticorpo foi administrado por infusão intravenosa por 1 hora através da veia safena. Doses crescentes foram administradas em dias consecutivos para doses baixas (<10 µg/kg), mas com intervalo de 1-2 dias para doses mais altas (> 10 µg/kg) para fins de observação. Amostras de sangue foram coletadas a 0 hora (apenas no dia 1), 0,5 hora (infusão intermediária), 1 e 6 horas após o início da infusão para todos os animais após cada dose, como especificado. Amostras de sangue adicionais não programadas foram coletadas a critério do diretor do estudo, patologista e/ou veterinário clínico. Todos os animais foram devolvidos à colônia no dia 60. PBMC e soro das amostras de sangue foram preparados usando métodos padrão, e conservados para análises futuras.
[00409] Sangue de primatas não humanos tratados foi manchado com anticorpos conjugados fluorescentemente contra marcadores de células T e IgG humana, fragmento Fcγ e analisado em um citômetro de fluxo. Resultados
[00410] Um estudo de toxicidade por escalonamento de dose usando proteínas de ligação triespecíficas de IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid contendo mAb2, IgG4 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid contendo mAb6, IgG4 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid contendo mAb2, e IgG4 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid contendo mAb6 foi realizado em primatas não humanos. Todos os três domínios de ligação em 4 proteínas de ligação são reativos de forma cruzada com polipeptídeos CD38/CD3/CD28 de cinomolgo. O estudo foi desenvolvido para avaliar o perfil de toxicidade potencial do molecular. Foram coletadas amostras de sangue para isolamentos de soro e PBMC. Populações de células T circulantes foram investigadas após cada dose (Figuras 14E-14H), juntamente com a ativação da subpopulação de células T (CD69+) (Figuras 14A-14D). A porcentagem de células T CD4 e CD8 em circulação foi reduzida com o escalonamento de dose. Ativação de células T CD4 e CD8 foi proeminente a partir de doses de 2,5 µg/kg, sugerindo uma capacidade de ativação potente para as moléculas contendo mAb2 e mAb6. Uma exclusão significativa de células T circulantes foi observada com todas as proteínas a 12,5 µg/kg (Figuras 14I-14L), correlacionando-se novamente com a potência. A depleção de células T circulantes foi bastante transiente, retornando ao nível de pré- tratamento após 24-48 horas (Figuras 14M-14P). O nível sérico de várias citocinas também foi medido. Liberação significativa de IL-6 e IL- 10 foi observada a 12,5 µg/kg com todas as moléculas, que foram bastante transientes, retornando à linha de base às 24 horas (Figura 14U).
[00411] IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid (Figura 14V) e IgG4 CD38VH1xCD28cvnxCD3mid (Figura 14W) ambas induziram a depleção de células T no sangue em doses mais altas. Da mesma forma, IgG4 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid (Figura 14X) e IgG4 CD38hhy1370xCD28cvnxCD3mid (Figura 14Y) também induziram a depleção de células T no sangue em doses mais altas. No entanto, células T começaram a reaparecer no sangue 24 horas após tratamento com qualquer uma das quatro proteínas de ligação triespecíficas (Figuras 14Z-14AC). As Figuras 14AD & 14AE mostram a quantidade de IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid ligada a células T CD4+ após a administração de uma dose de 100µg/kg. As Figuras 14AF & 14AG mostram a quantidade de IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid ligada a células T CD8+ após a administração de uma dose de 100µg/kg. Esses dados claramente demonstraram que IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid de Ab triespecífico pode se ligar a células T in vivo com tempo prolongado (48-72 horas). Exemplo 7: Otimização de farmacocinética/farmacodinâmica por variantes Fc Materiais e Métodos
[00412] Fcγ RI humano recombinante marcado por 6-His C-terminal (R&D Systems #1257-FC-050), Fcγ RIIA humano recombinante marcado por 10-His C-terminal (R&D Systems #1330-CD-050/CF) e FcγRIII humano recombinante marcado por HPC4 C-terminal (V158 ou F158) foram capturados em um chip Biacore. Anticorpos a 200, 100 e 50 nM foram injetados por 2 min, seguidos por 2 min de dissociação em HBS-P+, 2mM de tampão de CaCl2 pH 7,4 a 30μL/min de taxa de vazão usando Biacore 200. Foi mostrada curva de ligação a 200 nM.
[00413] Ensaio ELISA usando o Receptor Fc Neonatal (FcRn) humano recombinante marcado com HPC4 C-terminal foi usado para medir as propriedades de ligação das proteínas de ligação triespecíficas com diferentes modificações de Fc. Em suma, foi usado o Receptor Fc Neonatal (FcRn) humano recombinante para revestir a placa de ELISA (Nunc 80040LE) (2 µg/ml em PBS) durante a noite. Proteínas de ligação triespecíficas diluídas em série com diferentes modificações de Fc foram adicionadas a cada cavidade e incubadas à temperatura ambiente por uma hora, seguidas por lavagem e incubação com anticorpo secundário de IgG anti-humano marcado com HRP. Resultados
[00414] Variantes de proteínas de ligação triespecíficas descritas acima foram analisadas a seguir para ligação a vários receptores Fc, a fim de otimizar a farmacocinética (PK)/farmacodinâmica (PD).
[00415] Variantes de Fc humanas foram caracterizadas para ligação a FcγR I (Figura 15A), FcγR IIa (Figura 15B) e FcγR IIIb/c (Figura 15C) como descrito acima. As variantes testadas foram IgG1 humana, IgG4 humana e IgG4 humana com mutações FALA (F234A e L235A de acordo com o índice UE) com uma proteína de ligação triespecífica de controle.
[00416] Como mostrado nas Figuras 15A-15C, IgG1 e IgG4 do tipo selvagem foram capazes de ligaro FcγR I e FcγR IIa, mas não FcγR IIIb/c, como relatado anteriormente. Mutações de IgG4 FALA eliminaram a ligação de FcγR I e FcγR IIa. Sem desejar estar vinculado à teoria, acredita-se que eliminar a ligação de FcγR I e FcγR IIa pode melhorar a PK/PD ao remover agrupamentos indesejados através de interações Fc/FcγR.
[00417] Em seguida, a variante IgG4 FALA foi examinada para ligar FcRn. A variante, bem como IgG4 do tipo selvagem, ligou-se a FcRn
(Figura 16). Esses resultados demonstram que as mutações de IgG4 FALA não afetam as interações entre IgG4 Fc e FcRn, implicando um impacto mínimo na meia-vida da proteína de ligação.
[00418] Os parâmetros PK de IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid, IgG4 FALA CD38VH1xCD28supxCD3mid, IgG1 LALA P329A CD38VH1xCD28supxCD3mid, e IgG4 FALA CD38HHY1370xCD28supxCD3mid, como determinado em camundongos NSG, estão resumidos na Figura
17. As modificações em Fc de IgG4 demonstraram melhorar significativamente a meia-vida e AUC em camundongos NSG eliminando a ligação a FcγRI específico de NSG, que é abundante em macrófagos. Exemplo 8: Ativação in vitro e eficácia antitumoral in vivo de proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38 Materiais e Métodos Liberação de citocina de PBMCs humanas
[00419] PMBCs humanas foram incubadas com 100pM de proteínas de ligação por 24 horas. Os sobrenadantes foram coletados e as citocinas foram medidas por Luminex usando placas Drop Array (em triplicata). Para experimentos usando células alvo tumorais, as PMBCs humana foram incubadas com 100pM de anticorpos e com ou sem células alvo RPMI-8226 na proporção 10:1 E:T por 24 horas. Os sobrenadantes foram coletados após as PMBCs serem incubadas com proteínas triespecíficas, e foram analisados para citocinas com o kit MILLIPLEX®MAP e analisados em um sistema MAGPIX®. Ensaio Bcl-xL
[00420] As células T de PBMC (magnéticas) classificadas negativamente foram incubadas com 100 nM de Abs ligados por placa por 1 dia. As células T foram, em seguida, lavadas e machadas com anticorpos conjugados fluorescentemente, específicos para marcadores de células T e Bcl-xL, e analisadas em um citômetro de fluxo.
Proliferação de células T
[00421] As células T de PBMC classificadas negativamente (separação celular por esferas magnéticas) foram incubadas com Abs ligado à placa (100 nM) por 1 a 6 dias. O total de células foi contado por citometria de fluxo usando esferas nos dias específicos após o início da incubação. A alteração de dobra foi calculada a partir das contagens de célula do Dia 0 (500 células/ul). Resultados de 3 doadores de PBMC. Expressão de IL-2
[00422] Células Jukart IL2-luc2P GloResponse™ foram incubadas com proteínas triespecíficas por 6 horas, em seguida, sistema de ensaio de luciferase Bio-Glo™ foi usado para detectar expressão do gene repórter de luciferase. Ativação de BMC in vitro
[00423] A ativação (CD69+) de células PBMC humanas tratadas com anticorpos triespecíficos anti-CD38xCD28xCD3 ou proteína de ligação a IgG4 de controle foi determinada. Eficácia in vivo em modelo de tumor disseminado
[00424] Para o modelo de camundongo NSG hu-PMBC disseminado, 1-5x106 células foram injetadas em cada camundongo por via intravenosa no dia 0. No dia 3, imagem de luminância da linha de base foi tomada para randomização. No dia 4, 10x106 PBMCs humanas de doadores saudáveis foram reconstituídas para cada camundongo por via intraperitoneal (IP). Os camundongos foram tratados semanalmente no dia 5, 12, 19 usando doses indicadas. Imagem corporal por luminância semanal foi obtida nos dias 10, 17, 24 para monitorar o volume tumoral em cada animal. Ao término do estudo, sangue, baço, osso e medula óssea foram coletados para estudo histopatológico. Resultados
[00425] As proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38xanti- CD28xanti-CD3 contendo mAb2 com a região Fc de variante FALA IgG4 causam níveis marcadamente reduzidos de liberação não específica de IFN-γ em PBMCs humanas, em comparação com proteínas de ligação similares com regiões Fc do tipo selvagem (Figura 18A). Resultados semelhantes foram observados com a liberação de IL-2 (Figura 18B) e TNF-α (Figura 18C). É importante ressaltar que a liberação de citocina foi significativamente menor para essas proteínas de ligação triespecíficas de variantes de Fc do que para o anticorpo biespecífico anti-CD38xanti-CD3 de referência. Esses resultados implicam um melhor perfil de segurança de proteínas de ligação triespecíficas com variantes Fc devido a uma redução na liberação de citocina não específica.
[00426] Variantes Fc de IgG1 e IgG4 de ambos CD38VH1xCD28supxCD3mid contendo mAb2 e CD38HH71370xCD28supxCD3mid contendo mAb6 também levaram à ativação in vitro de PBMCs humanas (Figura 18D).
[00427] Coestimulação imune por ligação de CD28 é necessária para a sobrevivência e proliferação de células T; sinalização de TCR por si só não resulta em proliferação de células T (Sharmee and Allison (2015) Science 348:56-61). A proteína de ligação triespecífica CD38VH1xCD28supxCD3mid levou à indução de Bcl-xL em ambas as células T CD4+ e CD8+, enquanto a remoção dos domínios de ligação a antígeno CD28 ou CD3 eliminou esse efeito (Figuras 19A e 19B). Esses resultados demonstram, como esperado, que ambos os braços de ligação CD3 e CD28 são necessários para a indução de Bcl-xL em células T pelas proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38, entregando assim um sinal pró-sobrevivência às células T. O braço anti- CD28 da proteína de ligação triespecífica é crítico para a sobrerregulação de Bcl-xL pró-sobrevivência nas células T. Quando comparada com um anticorpo biespecífico anti-CD38xanti-CD3 de referência, a proteína de ligação triespecífica CD38VH1xCD28xCD3 levou a uma maior sobrerregulação de Bcl-xL em células T CD4+ CD8+ (Figuras 19C e 19D).
[00428] Para determinar o acionador primário de ativação de células T por proteínas de ligação triespecíficas CD38VH1xCD28supxCD3mid, a expressão de IL-2 em linhagem Jukart repórter de células T Jurkat contendo promotor de IL2 humano acionando o repórter de luciferase foi usada para medir a ativação. Mutação nocaute do domínio de ligação anti-CD3 levou à eliminação de ativação de células T, demonstrando que a ativação de células T é o efeito específico da ligação de CD3 (Figura 19E). Esses resultados mostram que anti-CD3 é o acionador primário de ativação de células T pelas proteínas de ligação triespecíficas, e que anti-CD28 também contribui significativamente para o sinal de ativação de células T. O acionador primário de liberação de citocina também foi examinado usando PBMCs humanas (Figura 19F). Ao examinar a liberação de TNF, IFNg, IL-2, IL-6 e IL-10, descobriu-se que CD3 é o determinante primário de liberação de citocina. Descobriu-se que CD28 tem a menor contribuição. Descobriu- se também que proteínas de ligação triespecíficas com anti-CD38VH1 induzem menos liberação de citocina do que o comparador de referência.
[00429] A proliferação de células T também foi examinada. A ativação de células T usando proteína de ligação triespecífica anti- CD38xanti-CD28xanti-CD3 com Fc de variante FALA IgG4 levou a uma proliferação maior do que a referência ou controle de isótipo (Figura 19G). Essa ativação foi reduzida mediante mutação dos domínios de ligação a antígeno anti-CD28 ou anti-CD3 (Figura 20).
[00430] O modelo de camundongo NSG humanizado foi usado em seguida para experimentos de crescimento tumoral sólido in vivo. Os camundongos foram implantados na semana 6-8 com células de mieloma humano RPMI8226. Na semana 9, PBMCs humanas foram introduzidas por injeção ip, hPBMCs foram reconstituídas, e terapia antitumoral foi administrada nas semanas 10-13. 56 camundongos NSG fêmeas humanizados com PBMC foram implantados com 5 milhões de células RPMI8226 em 50% de matrigel, e os camundongos foram selecionados e randomizados para o estudo no dia 5 ou 6 pós-implante. Esse modelo serve como um modelo tumoral in vivo em camundongos com células T humanas maduras.
[00431] Proteínas de ligação triespecíficas também foram testadas em um modelo de camundongo NSG de crescimento tumoral disseminado, usando células de mieloma humano NCI-H929-Luc e analisando o crescimento tumoral por bioluminescência. Proteína de ligação triespecífica CD38VH1xCD28supxCD3mid com variante de Fc FALA IgG4 mostrou uma eficácia antitumoral dependente de dose estatisticamente significativa neste modelo tumoral disseminado a 30 µg/kg (Figura 21). A proteína de ligação triespecífica CD38HHY1370xCD28supxCD3mid para a variante de Fc FALA IgG4 também apresentou eficácia antitumoral dependente de dose estatisticamente significativa neste modelo tumoral disseminado a 30 µg/kg e 10 µg/kg (Figura 22).
[00432] Proteínas de ligação triespecíficas de FALA IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid contendo mAb2 e FALA IgG4 CD38hhy1370xCD28supxCD3mid contendo mAb6 apresentaram atividades potentes de extermínio de tumores in vitro contra células de mieloma NCI-H929-Luc usando PBMCs humanas de dois camundongos NSG humanizados doadores (Figuras 23A e 23C). A proteína de ligação triespecífica FALA IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid apresentou atividade tumoral in vivo superior, em comparação com o anticorpo biespecífico de referência, no modelo tumoral disseminado (Figura 23C). Os valores de p de comparação com o controle de veículo (PBS) foram determinados da seguinte forma: FALA IgG4 CD38VH1xCD28supxCD3mid:
p=0,0023; FALA IgG4 CD38HHY1370xCD28supxCD3mid: p=0,0088; Fab- scFv-Fc CD38xCD3 biespecifico de referência: p=0,6045.
[00433] Considerados em conjunto, esses resultados demonstram um melhor candidato anti-CD38 com região Fc variante que apresenta meia-vida aumentada, liberação de citocina não específica reduzida e maior eficácia antitumoral in vivo. Exemplo 9: Caracterização adicional de proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38
[00434] Dois sinais são necessários para estimular células T para função efetora ideal e proliferação sustentada. A ativação mediada pelo complexo (TCR)-CD3 de receptor de células T induz ativação transcricional levando à secreção de citocina. O envolvimento de uma segunda proteína de membrana de superfície, CD28, estimula uma via alternativa de transdução de sinal e inibe a morte celular programada (Esensten JH, Helou YA, et al. Immunity 44:973-88(2016); Hui E, Cheung J, et al. Science 355:1428-1433(2017)). Na ausência de um segundo sinal, a estimulação de células T por CD3 sozinha normalmente leva à morte celular induzida por ativação (Chai JG, Lechler RI. Int Immunol. 9:935-44(1997)). Hipotetizou-se que a proliferação de células T poderia ser aumentada combinando especificidades contra esses dois alvos diferentes.
[00435] A Figura 24A mostra um ensaio de repórter de luciferase que foi conduzido usando células Jurkat IL2-luc2P GloResponse™ (Promega) após estimulação por CD38VH1/CD28supxCD3mid e seus mutantes KO triplo e KO de sítio de ligação individual e concentração de 10 nM. Esses dados ilustram a contribuição de CD28 para a estimulação de células T (por exemplo, sinalização NFAT).
[00436] Usando o formato de Ab biespecífico duplo variável cruzado (CODV) (Steinmetz A, et al. MAbs 8:867-878(2016)), combinações de Fv’s de α-CD3ε (sinal 1) e α-CD28 (sinal 2) foram avaliados para determinar se o envolvimento duplo dessas moléculas de superfície celular pode estimular e sustentar a ativação de células T (Figura 24B). Um Ab anti-CD3ε de afinidade média (KD ~ 20 nM) foi usado para evitar a estimulação do receptor de células T de alta afinidade que causa liberação de citocina de alto nível e aumenta o risco de síndrome de liberação de citocina. Esse agonista de CD3 foi testado em ambas as posições do braço duplo em combinação com um Ab CD28 superagonista que demonstrou anteriormente suportar a proliferação de células T (Waibler Z, Sender LY, et al. PLoS One 3:e1708(2008)). Esses anticorpos monovalentes bioespecíficos foram incubados com PBMCs humanas in vitro, e a estimulação de células T foi medida por secreção de interferon-γ e IL-2. Embora ambas as orientações estivessem ativas, a liberação ideal dessas citocinas foi observada com CD3 na posição proximal e CD28 na posição distal (Figura 24B). Esse braço duplo foi, então, selecionado para o emparelhamento com um anticorpo anti- CD38 no formato de Ab triespecífico (Xu L, Pegu A, et al. Science 358:85–90(2017)).
[00437] A Figura 25 mostra que a sobrerregulação do membro Bcl- xL da família Bcl-2 em células T primárias induzida por CD38VH1/CD28supxCD3mid é dependente de CD28. Esses dados ilustram a contribuição de CD28 para a sobrevivência de células T.
[00438] A Figura 26 mostra que o anti-CD28 no Ab triespecífico forneceu sinalização secundária essencial para suportar a proliferação de células T primárias in vitro. Esses dados ilustram a contribuição de CD28 para a proliferação da célula T.
[00439] Considerados juntos, esses dados mostram que o anti- CD28sup no anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28supxCD3mid provê funcionalidades significativas na ativação, sobrevivência e proliferação de células T in vitro.
[00440] A Figura 27 mostra a configuração do anticorpo triespecífico,
codificada pelo anticorpo de origem. Também é mostrado um modelo de estrutura do Ab triespecífico CD38VH1/CD28supxCD3mid obtido com base em estruturas de cristal de VH1 Fab anti-CD38 e CODV Fab CD28sup/CD3sup/CD3mid (direita).
[00441] As Figuras 28A e 28B mostram que células de mieloma múltiplo (MM) com alta (RPMI-8226; Figura 28A) e baixa (KMS-11; Figura 28B) expressão de superfície de CD38 foram lisadas de forma eficiente por PBMCs humanas (E:T=10:1) incubadas com várias concentrações do Ab triespecífico. A contribuição para a atividade de extermínio por cada sítio de ligação foi demonstrada por mutações KO de sítio de ligação. Esses dados demonstram que o anticorpo triespecífico CD38 lisou células MM humanas através do reconhecimento de ambos CD38 e CD28. O CD28 expresso em células de mieloma múltiplo forneceu um alvo secundário pelo anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA, aumentando significativamente sua atividade de extermínio.
[00442] Aa Figuras 29A-29C mostram que o mutante anti-CD28supKO do Ab triespecífico apresentou atividade antitumoral marcadamente reduzida contra células MM CD38high, CD38mid e CD38low in vitro. São mostrados ensaios usando células RPMI-8226 (Figura 29A), U266 (Figura 29B) ou KMS-11 (Figura 29C). A expressão de CD28 em células MM aumentou sua suscetibilidade à citólise mediada pelo anticorpo triespecífica CD38.
[00443] A Figura 30 mostra os resultados de um estudo de eficácia in vivo em um modelo de linhagem celular de mieloma múltiplo humano disseminado usando um camundongo NSG reconstituído com células T primárias humanas amplificadas in vitro. A redução de carga tumoral em grupos de tratamento com anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA foi dependente de dose e estatisticamente diferente. Assim, o anticorpo triespecífico CD38 conferiu proteção contra o crescimento de tumor de células MM humanas disseminado in vivo.
[00444] Um estudo microscópico ainda demonstrou o extermínio de células de câncer por células T humanas primárias mediado pelo anticorpo triespecífico in vitro. As Figuras 31A e 31B mostram imagens microscópicas demonstrando RPMI-8226 (células MM humanas, rotuladas com corante CellTracker Deep Red) lisadas por PBMCs humanas mediadas por anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA. A Figura 31A mostra o controle, enquanto a Figura 31B mostra a lise mediada por anticorpo triespecífico CD38VH1/CD28supxCD3mid_FALA. A proporção 10:1 E:T foi usada com incubação por 24 horas. A exposição a Ab de controle de mutante nulo triplo induziu alterações mínimas na viabilidade de células tumorais ao longo de 24 horas (Figura 31A). Em contrapartida, a incubação com o Ab triespecífico CD38 ativo induziu agrupamento substancial de células T ao redor de células tumorais, levando à sua lise quase completa (Figura 31B). Esses dados demonstram que anticorpo triespecífico CD38/CD3xCD28 mediou a citólise de células de mieloma por células T. Exemplo 10: Modificação de sítios de ligação a receptor Fc na região Fc de IgG4 de proteínas de ligação triespecíficas anti-CD38 reduz inflamação não específica
[00445] A região Fc de anticorpos se liga a receptores celulares em monócitos e células NK que induzem inflamação não específica, o que poderia predispor os indivíduos do tratamento à síndrome de liberação de citocina. O papel dos receptores Fc na estimulação da liberação de citocina foi examinado por testes de mutantes que eliminaram a ligação de FcγI, FcγIIa, b e FcγIII. Para esse fim, um isótipo de IgG4 que não fixa o complemento foi usado.
[00446] A ligação no ensaio de ressonância de plasmons de superfície (SPR) usando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor; Piscataway, NJ) foi usada para medir a afinidade das variantes Fc de IgG4 especificadas para receptores Fc humanos indicados imobilizados no chip. Variantes Fc de IgG4 foram usadas a 150 nM. A ligação a FcRn humano foi realizada usando ELISA por revestimento do antígeno de FcRn humano na placa.
[00447] Uma mutação ("FALA") na região Fc que foi descrita anteriormente (Alegre ML, Peterson LJ, et al. Transplantation 57:1537- 43(1994); ver também Exemplos 7-9) eliminou a ligação a todos os receptores Fc (Figuras 32 e 33). Quando testado para liberação não específica de citocina, anulou a liberação de IFN-γ em PBMC não estimulada, permitindo a estimulação máxima na presença de alvos tumorais que expressaram CD38 (Figura 34, esquerda vs. direita, FALA). Esse mutante Fc reteve sua atividade citolítica nos alvos tumorais de mieloma comparáveis ao controle Fc de tipo selvagem em células expressando diferentes níveis de CD38 (Figura 35). Da mesma forma, outra região Fc de IgG4 mutada ("PVA", ver Figura 32) que eliminou a ligação a receptores Fc (Figura 33) também anulou a liberação de IFN-γ em PBMC não estimulada, permitindo a estimulação máxima na presença de alvos tumorais que expressaram CD38 (Figura 34, esquerda vs. direita, PVA) e manteve sua atividade citolítica nos alvos tumorais de mieloma comparáveis ao controle Fc do tipo selvagem em células expressando diferentes níveis de CD38 (Figura 35). Exemplo 11: Contribuição de anti-CD38 e anti-CD28 para a atividade citolítica de proteínas de ligação triespecíficas
[00448] Mutantes de Ab triespecíficos para cada sítio de ligação ou combinação de sítios de ligação foram gerados e testados quanto à sua atividade citolítica contra linhagens celulares de mieloma múltiplo com alta (RPMI-8226) ou baixa (KMS-11) expressão de superfície de CD38 e CD28.
[00449] Como mostrado acima nas Figuras 28A e 28B, a mutação de ligação específica de CD3 anulou a citólise, enquanto mutações nulas anti-CD38 e CD28 reduziram significativamente o extermínio, mas alguma função residual foi mantida, indicando que ambos os anti-CD38 e CD28 contribuíram para o extermínio de células tumorais.
[00450] Em comparação com daratumumab (o anticorpo monoclonal α-CD38 aprovado para o tratamento de mieloma múltiplo; ver McKeage K. Drugs. 76:275-81(2016)), o Ab triespecífico mostrou notável potência de extermínio de 3-4 log in vitro em relação a diferentes linhagens de células expressando CD38, incluindo células de mieloma múltiplo CD38high e CD38low (Figura 36). Exemplo 12: Ab CD38/CD3xCD28 estimula CD4 e CD8 de memória central, Th1 e respostas específicas de antígeno
[00451] Para determinar se Ab triespecífico CD38/CD3xCD28 poderia melhorar a função imune celular, o fenótipo de células T expandidas in vitro foi avaliado. Materiais e Métodos
[00452] Células mononucleares de sangue periférico foram isoladas do sangue de doadores humanos saudáveis coletados por Research Blood Components, LLC (Boston, MA). As PBMCs foram adicionadas a placas revestidas com anticorpo (350 ng/cavidade) (5 x 105 células/ml), como descrito anteriormente acima, e incubadas a 37ºC por 3 e 7 dias. As células foram coletadas em momentos específicos e analisadas por citometria de fluxo para subconjuntos de células T: sem tratamento (CCR7+ CD45RO-), Tcm (CCR7+ CD45RO+), Tem (CCR7- CD45RO+), Tregs (CD4+ Foxp3+ CD25hi). As células foram também tratadas com monensina (GolgiStop) (BD Biosciences, CA) por pelo menos 6 horas antes da coloração de fluxo para determinar a expressão de citocina intracelular: Th1 (CD4 + IFN-γ+), Th2 (CD4+ IL-4+) e Th17 (CD4+ IL- 17+). Células T CD8+ específicas de CMV pp65 foram detectadas usando pentâmero conjugado fluorescente restrito a HLA de doadores de PBMC (A*02:01/NLVPMVATV) (ProImmune, Oxford, Reino Unido). A PBMC foi obtida de HemaCare (Van Nuys, CA) de doadores com populações positivas para CMV conhecidas e tipos de HLA. A PMBC de doadores negativos para o tipo de HLA restritivo foi usada como controle negativo. A coloração foi realizada como o protocolo do fabricante. Resultados
[00453] PBMCs humanas foram incubadas por 7 dias com um Ab triespecífico ou controle negativo mutante triplo na ausência de citocinas. A análise dos subconjuntos de CD4 revelou a maior proliferação no conjunto de memória central, com um aumento menor nas células efetoras de memória (Figura 37A). A análise do subconjunto de CD4 também revelou a maior proliferação de células Th1 (>6 vezes) em comparação com células Th2 ou Th17 (Figura 37B). No subconjunto de CD8, houve um aumento de >150 vezes no subconjunto de CD8 de memória central no dia 7, com um aumento menor nas células efetoras de memória (Figura 37C). É importante ressaltar que respostas de CD8 específicas de antígeno preexistentes a CMV, direcionadas ao epítopo pp65 em doadores soropositivos para HLA-A2, usando coloração por tetrâmero (Gratama JW, van Esser JW, et al. Blood 98:1358- 1364(2001)), aumentaram >44 vezes na presença do triespecífico CD38 em comparação com o controle negativo (Figura 37D).
[00454] Tomados em conjunto, esses dados indicam que Ab triespecífico de CD38 estimula a função Th1 específica e as respostas protetoras de células T de memória CD8 que provavelmente aumentam a imunidade antitumoral in vivo. Exemplo 13: CD28 em células de mieloma múltiplo aumenta reconhecimento e citólise de células T Materiais e Métodos Citometria de fluxo
[00455] Os níveis de CD28 e CD38 nas linhagens celulares tumorais indicadas foram determinados por citometria de fluxo usando o kit QIFI (Dako, Dinamarca, cat. #K007811) como descrito (S4). Em suma, CD38 anti-humano de camundongo (clone AT13/5, IgG1 de camundongo, Santa Cruz Biotech, cat # 59028) e CD28 anti-humano (clone CD28.2, IgG1 de camundongo, k, BioLegend, cat # 3029123) foram usados como anticorpos primários (a 10 µg/ml) para a detecção de CD38 e CD28 de superfície em linhagens celulares usando o protocolo do fabricante. As densidades de superfície foram calculadas usando os padrões de calibração do kit QIFI e a formulação fornecida pelo kit. Geração de linhagens celulares de mieloma múltiplo humano KO CD28 usando nocaute mediado por CRISPR
[00456] Para a linhagem celular KMS-11, o nocaute de CD28 foi executado usando o kit de nocaute humano de CD28 CRISPR (Origene). O kit contém um vetor doador com um cassete funcional de GFP-puromicina e dois vetores Cas-9 distintos, cada um com RNA guia predefinido diferente (gRNA 1: TACCTGTTACTTGAATTGAA (SEQ ID NO: 117) e gRNA 2: ATTTTTTGAGGTCTTCCAAT (SEQ ID NO: 118) direcionado a exon 1 e íntron 1 de CD28, respectivamente). As células foram semeadas em uma placa de 6 cavidades em uma densidade de 3,105 células/cavidade em Meio RPMI 1640 GlutaMAX suplementado com 10% de FBS e co-transfectado após 24 horas com todos os três segundos usando Reagente de Transfecção Lipofectamine™ 3000 (ThermoFisher Scientific) com as instruções do fabricante. Puromicina foi adicionada 48 horas após a transfecção em uma concentração final de 0,5 µg/ml. A eficiência de transfecção foi de 30% quando usando 6,25 µl/cavidade de Lipofectamine™ 3000, 1,25 µg de cada vetor Cas- 9/gRNA e 2,5 µg do vetor doador de GFP-puromicina. Nocaute de CD28 na linhagem celular RPMI 8226 foi executado usando o conjunto de lentivírus All-in-One de CD28 sgRNA CRISPR (Applied Biological
Materiais Inc.). Consiste em um conjunto de 3 vetores all-in-one lentivirais que expressam o gene Cas9, um gene de resistência à Puromicina e um sgRNA diferente (sgRNA 1: ATTGTCGTACGCTACAAGCA (SEQ ID NO: 119) direcionado a exon 2 de CD28 e sgRNA 2: CAAAAGGGCTTAGAAGGTCC (SEQ ID NO: 120) e sgRNA 3: CTATAGCTTGCTAGTAACAG (SEQ ID NO: 121) direcionados a exon 3 de CD28). As células foram infectadas usando um protocolo de espinoculação com 2.105 células misturadas com partículas lentivirais (10UI/célula), 8 µg/ml de polibeno e 1:100 Intensificador de Transdução ViralPlus (Applied Biological Materiais Inc.). A mistura foi pré-incubada por 20 minutos em temperatura ambiente, em seguida, centrifugada por 30 minutos a 32ºC e 800 × g e semeada em placa de 12 cavidades.
Puromicina foi adicionada 48 horas após a infecção em uma concentração final de 0,25 µg/ml.
Ambas as linhagens celulares foram passadas pelo menos 5 vezes (ou até a viabilidade celular se tornar estável) antes de confirmar o knockdown de CD28 no nível de proteína por citometria de fluxo (anticorpo CD28 PE Clone 28,2- BioLegend). As células CD28 negativas foram, então, classificadas em um classificador de células Sony SH800S e cultivadas em meio suplementado com 0,25 µg/ml ou 0,5 µg/ml de puromicina, 100 unidades/ml de penicilina e 100 µg/ml de estreptomicina (ThermoFisher Scientific). As células foram, então, clonadas por diluição limitante e nocaute de CD28 foi validado por citometria de fluxo e por PCR e sequenciamento de Sanger usando os iniciadores dianteiros e reversos listados abaixo.
Tabela R. Lista de iniciadores dianteiros e reversos. Tamanho Linhagem Amplicon Iniciadores de Comentários Celular Amplicon F:
CACAACCTGTCCCCA TCCTATGAA (SEQ ID Valida a inserção CD28_GFP NO: 122) do cassete GFP- KMS-11 1475 bp _left R: puromicina (lado AAGCTGCCATCCAGA esquerdo) TCGTTATCG (SEQ ID NO: 123) F:
CCAAATTAAGGGCCA GCTCATTCC (SEQ ID Valida a inserção CD28_PUR NO: 124) do cassete GFP- 1233 bp O_right R: puromicina (lado ACCTGTACATCCTTG direito) GGCAAATCC (SEQ ID NO: 125) Região circundante à F: junção exon1- GTCAGGATGCCTTGT íntron1 de CD28 GGTTTGAGT (SEQ ID correspondente CD28_Exo NO: 126) Variável; ao sítio de n_1 R: WT=720 inserção do CAGAGCTTCCAGAG cassete GFP- CCAATCTAC (SEQ ID puromicina e/ou NO: 127) indels após clivagem de
CRISPR F: CCATGTACTGCCTTC Região TGGGTGAAA circundanete ao (SEQ ID NO: 128) Variável; éxon 2 de CD28 RPMI 8226 Exon_2 R: WT=682 bp correspondente a CCACTGACCACAACC sítios de clivagem CAGTTTT de CRISPR (SEQ ID NO: 129) F: AGGCCATTGGAAGTC Região ACCGTTT circundanete ao (SEQ ID NO: 130) Variável; éxon 3 de CD28 Exon_3 R: WT=816 bp correspondente a GCCAACATTGTCCAT sítios de clivagem TGGCTTCAG de CRISPR (SEQ ID NO: 131) Resultados
[00457] O CD28 foi incorporado ao Ab triespecífico para melhorar a proliferação e sobrevivência de células T; no entanto, quando os marcadores de superfície celular foram avaliados em células de mieloma múltiplo, foi encontrada uma maioria de linhagens celulares (>95%) que expressam a glicoproteína CD28 (Tabela S).
Tabela S. Expressão de superfície celular de CD28 e CD38 em linhagens celulares de mieloma múltiplo humano. Linhagem celular CD28 CD38 JJN3 1.040 50 KMS-11 (p17) 35.345 2.845 U266 170.525 13.825 L-363 9.145 17.500 MM.1S 56.560 44.535 MM.1R 66.220 49.160 KMS-12BM 0 62.845 RPMI 8226 83.915 136.255 NCI-H929 22.065 153.620 LP-1 7.420 372.835 U266-CD38++ 126.465 633.805 JJN3-CD38 0 714.805 MOLP-8 245 885.030 NCI-H929-CD38++ 22.935 981310 RPMI 8226-CD38++ 86.320 1419.120
[00458] Foi relatado que a expressão de CD28, embora ausente em células plasmáticas normais (Almeida J, et al. British J. of Haematol. 107:121-131(1999)), pode ser detectada em células plasmáticas de mieloma primário em aproximadamente um terço de pacientes recém- diagnosticados (Mateo G, et al. Clin. Cancer Res. 11:3661–3667(2005)). Além disso, aumenta a frequência durante a progressão do mieloma e se correlaciona com mau prognóstico e características agressivas do mieloma (Robillard N, Jego G, et al. Clin Cancer Res. 4:1521-6(1998); Nair JR, Carlson LM, et al. J. Immunol. 187:1243-53(2011)).
[00459] Para determinar se a expressão de CD28 em células alvo poderia melhorar o reconhecimento e lise de células T, a atividade da Abs triespecíficos do tipo selvagem vs. nulos CD28 em três linhagens independentes de mieloma com diferentes graus de expressão de CD38 e CD28 foi comparada. Como observado acima no Exemplo 9 e mostrado nas Figuras 29A-29C, a citólise foi observada em todas as três linhagens, independentemente do nível de expressão de CD28 pelo Ab triespecífico CD38; no entanto, em todas as linhagens celulares, a atividade citolítica do Ab específico nulo CD28 foi reduzida em 30-100 vezes, com a diminuição mais substancial na linhagem celular KMS-11, que apresentou a menor expressão de CD38 (cf. WT vs. ΔCD28, Figura 29C vs. Figura 29A ou Figura 29B).
[00460] A contribuição de CD28 para reconhecimento e lise de células tumorais foi ainda confirmada usando o nocaute de CD28 mediado por CRISPR na célula alvo de mieloma. A expressão de CD28 foi indetectável em células KMS-11 CD28KO em comparação com a linhagem parental (Figura 38, painel superior, direita vs. esquerda). A sensibilidade das células KMS-11 CD28KO à citólise de células T foi concomitantemente reduzida em 10-100 vezes (Figura 38, painel inferior, esquerda). Consistente com esse efeito, não foi observada diferença na citólise com triespecífico de CD38 em comparação com o triespecífico mutante nulo CD28 nas células alvo KO de CD38 (Figura 38, painel inferior, direita). Exemplo 14: Citólise do Ab triespecífico CD38 contra linhagens celulares de câncer hematológico CD 38+
[00461] Os exemplos acima demonstram anticorpos anti- CD38/CD3/CD28 triespecíficos que promovem a citólise de múltiplas células de mieloma. A capacidade desses anticorpos para promover a citólise de outras linhagens celulares de câncer foi testada.
[00462] Como mostrado na Figura 39, Ab mutante FALA triespecífico
CD38/CD28xCD3 possui atividade citolítica direcionada a linhagens CD38+CD28-, incluindo leucemia mielocítica aguda (AML(KG-1)), um linfoma de células B (OCI-Ly19), leucemia linfocítica T aguda (ALL (KOPN8)) e linfoma linfocítico crônico (CLL(Z-138)). Isso demonstra que anticorpos anti-CD38/CD3/CD28 triespecíficos possuem atividade contra outras linhagens celulares de câncer hematológico CD38+, incluindo aquelas que são CD28-. Exemplo 15: A ativação in vitro de PBMC humana por superagonista α- CD28 requer bivalência do anticorpo
[00463] A ativação in vitro de PBMC humana por TGN1412 (TGN), braço de ligação único TGN1412 (TGNslg) e braço de ligação único anti- CD28sup (CD28supslg) foi realizada como descrito (Findlay L, Eastwood D, et al. J Immunol Methods 352:1-12 (2010)). 105 PBMCs humanas foram semeadas em placas de 96 cavidades de polipropileno revestidas a seco com anticorpos indicados (1 ug/cavidade) por 24 horas, como descrito anteriormente. Citocinas como IFN-γ, TNF-α e IL2 no sobrenadante foram medidas por Luminex como descrito no Exemplo 8.
[00464] A inclusão de uma única especificidade do superagonista de CD28 também reduziu a liberação não específica de citocina observada com o mAb superagonista de CD28 (Figura 40) anteriormente associada a seus efeitos adversos como uma IgG nativa em seres humanos (Suntharalingam G, Perry MR, et al, N. Engl J. Med. 355:1018- 1028(2006)). Em vez disso, a coestimulação pelo Ab triespecífico aumentou a potência e a sobrevivência de células T que lisam e protegem contra tumores. O mais interessante é que o Ab triespecífico de CD38 preferencialmente amplifica populações de células Th1 e Tcm in vitro, exibindo uma característica importante que difere dos Abs monoclonais de agonista α-CD3 ou superagonista α-CD28 usados para propagar Treg para induzir tolerância (Penaranda C1, Tang Q, Bluestone JA. J Immunol. 187:2015-22.(2011); Tabares P, Berr S, et al.
Eur J Immunol. 44:1225-36(2014)).
[00465] Tomados em conjunto, os dados apresentados nos Exemplos 1-15 demonstram anticorpos anti-CD38/CD3/CD28 triespecíficos que estimulam uma imunidade antitumoral potente ao envolver dois receptores de sinalização de células T e melhorar o reconhecimento de células alvo. A ligação de CD3 e CD28 desencadeou a sinalização do receptor de células T que sobrerregulou Bcl-xl e inibiu a apoptose de células T, aumentando a função efetora e a sobrevivência de células T. O terceiro braço do Ab triespecífico interagiu com CD38, que é altamente expresso em células de mieloma múltiplo. Coincidentemente, CD28 também é expresso em células da maioria dos mielomas; portanto, o Ab triespecífico melhorou o direcionamento, ao mesmo tempo, melhorou a ativação de células T e citólise. O anticorpo triespecífico otimizado anticorpo lisou células de mieloma de forma >1000 vezes eficaz do que daratumumab, um terapêutico de mAb anti- CD38, e apresentou atividade antitumoral potente in vivo em um modelo de camundongo humanizado.
[00466] Embora a descrição inclua várias modalidades, entende-se que variações e modificações ocorrerão para os versados na técnica. Portanto, pretende-se que as reivindicações anexas abranjam todas essas variações equivalentes que se enquadram no escopo da descrição. Além disso, os títulos das seções usados neste documento são apenas para fins organizacionais, e são não considerados limitantes do objeto descrito.
[00467] Cada modalidade descrita neste documento pode ser combinada com qualquer outra modalidade ou modalidades, a menos que seja claramente indicado o contrário. Em particular, qualquer característica ou modalidade indicada como preferida ou vantajosa pode ser combinada com qualquer outra característica/características ou modalidade/modalidades indicada como preferida ou vantajosa, a menos que seja claramente indicado o contrário.
[00468] Todas as referências citadas neste pedido são expressamente incorporadas por referência neste documento.

Claims (92)

REIVINDICAÇÕES
1. Proteína de ligação compreendendo um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
2. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID
NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
3. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-H1—FR2—CDR- H2—FR3—CDR-H3—FR4; em que FR1 compreende a sequência QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 87), ou QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO: 88); em que FR2 compreende a sequência MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO: 90) ou MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO: 91); em que FR3 compreende a sequência NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 93) ou NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 94); e em que FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 96).
4. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6.
5. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 7 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 8.
6. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18.
7. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 6,
caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20.
8. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18.
9. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 22 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20.
10. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23, e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18.
11. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 24 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20.
12. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33); e
(b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
13. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 12, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência, do terminal N ao terminal C, FR1—CDR-H1—FR2—CDR- H2—FR3—CDR-H3—FR4; em que FR1 compreende a sequência QVQLVQSGAEVVKPGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 86), QVQLVQSGAEVVKSGASVKVSCKAS (SEQ ID NO: 87), ou QVQLVQSGAEVVKPGASVKMSCKAS (SEQ ID NO: 88); em que FR2 compreende a sequência MHWVKEAPGQRLEWIGY (SEQ ID NO: 90) ou MHWVKEAPGQGLEWIGY (SEQ ID NO: 91); em que FR3 compreende a sequência NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMELSSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 93) ou NYNQKFQGRATLTADTSASTAYMEISSLRSEDTAVYFC (SEQ ID NO: 94); e em que FR4 compreende a sequência WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 96).
14. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 12, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
15. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 15 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 16.
16. Proteína de ligação compreendendo um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno compreende: (a) um domínio variável de cadeia pesada de anticorpo (VH) compreendendo uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR- H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43); e (b) um domínio variável de cadeia leve de anticorpo (VL) compreendendo uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46).
17. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que o domínio VH compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e o domínio VL compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
18. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 e uma cadeia leve de anticorpo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 12.
19. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo.
20. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.
21. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno liga o polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 2,1 nM ou menos.
22. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 de isoforma E humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 105.
23. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30.
24. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o sítio de ligação a antígeno liga o polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30 com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de 1,3 nM ou menos.
25. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo quimérico ou humanizado.
26. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 24, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo humano.
27. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é um anticorpo monoclonal.
28. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende uma ou mais cadeias pesada de anticorpo de comprimento total compreendendo uma região Fc.
29. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc humana compreendendo uma ou mais mutações que reduzem ou eliminam função efetora e/ou ligação a receptor Fc da região Fc.
30. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc de IgG1 humana.
31. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a região Fc de IgG1 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A, L235A e P329A.
32. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 30, caracterizada pelo fato de que a região Fc de IgG1 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299 e 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S298N, T299A e Y300S.
33. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma região Fc de IgG4 humana.
34. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de que a região Fc de IgG4 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P e R409K.
35. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que a região Fc de IgG4 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A e L235A.
36. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizada pelo fato de que a região Fc de IgG4 humana compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236.
37. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende um fragmento F(ab), F(ab’)2, Fab’-SH, Fv ou scFv de anticorpo.
38. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 34, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é conjugada a um rótulo ou agente citotóxico.
39. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é uma proteína de ligação biespecífica compreendendo o primeiro sítio de ligação a antígeno que liga o polipeptídeo CD38 e um segundo sítio de ligação a antígeno.
40. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação é uma proteína de ligação triespecífica compreendendo o primeiro sítio de ligação a antígeno que liga o polipeptídeo CD38, um segundo sítio de ligação a antígeno, e um terceiro sítio de ligação a antígeno.
41. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 40, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano, e em que o segundo e terceiro sítios de ligação a antígeno ligam, cada um, uma proteína de superfície de célula T.
42. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 41, caracterizada pelo fato de que o primeiro sítio de ligação a antígeno liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano, e em que (a) o segundo sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 humano, e o terceiro sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 humano, ou (b) o segundo sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD3 humano, e o terceiro sítio de ligação a antígeno liga um polipeptídeo CD28 humano.
43. Proteína de ligação compreendendo três sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma ou mais proteínas alvo, caracterizada pelo fato de que pelo menos um dos três sítios de ligação a antígeno reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo.
44. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação reage de maneira cruzada com um polipeptídeo CD38 humano compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 105.
45. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação reage de maneira cruzada com um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 30.
46. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 45, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo e dois sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma proteína de superfície de célula T.
47. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que reage de maneira cruzada com um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano e um domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 de macaco cinomolgo, um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD28 humano, e um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD3 humano.
48. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam os três sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina; dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada, e em que: (a) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO:
35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); (b) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); ou (c) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31) ou GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32) ou IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34) ou QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR- L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35) ou GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
49. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 48,
caracterizada pelo fato de que (a) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); (b) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); (c) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ
ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); (d) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); (e) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); ou (h) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR-
H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36).
50. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 49, caracterizada pelo fato de que (a) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSFN (SEQ ID NO: 31), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGNGGT (SEQ ID NO: 32), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de ESVDSYGNGF (SEQ ID NO: 34), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de LAS (SEQ ID NO: 35), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID NO: 36); ou (b) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GYTFTSYA (SEQ ID NO: 37), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IYPGQGGT (SEQ ID NO: 38), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARTGGLRRAYFTY (SEQ ID NO: 33), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QSVSSYGQGF (SEQ ID NO: 39), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de GAS (SEQ ID NO: 40), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de QQNKEDPWT (SEQ ID
NO: 36).
51. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 50, caracterizada pelo fato de que (a) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 6; (b) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 17, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; (c) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; (d) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 23, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 18; ou (e) o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14.
52. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 43 a 47, caracterizada pelo fato de que a proteína de ligação compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam os três sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III]
e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina; dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada, e em que:
(a) o domínio VH1 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL1 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46); (b) o domínio VH2 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL2 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46); ou (c) o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR- H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46).
53. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 52, caracterizada pelo fato de que o domínio VH3 compreende uma sequência CDR-H1 compreendendo a sequência de aminoácido de GFTFSSYG (SEQ ID NO: 41), uma sequência CDR-H2 compreendendo a sequência de aminoácido de IWYDGSNK (SEQ ID NO: 42), e uma sequência CDR-H3 compreendendo a sequência de aminoácido de ARMFRGAFDY (SEQ ID NO: 43), e o domínio VL3 compreende uma sequência CDR-L1 compreendendo a sequência de aminoácido de QGIRND (SEQ ID NO: 44), uma sequência CDR-L2 compreendendo a sequência de aminoácido de AAS (SEQ ID NO: 45), e uma sequência CDR-L3 compreendendo a sequência de aminoácido de LQDYIYYPT (SEQ ID NO: 46).
54. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 53, caracterizada pelo fato de que o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
55. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 54, caracterizada pelo fato de que (a) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54; (b) o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54; (c) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54; (d) o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54; (e) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85; (f) o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85; (g) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85; ou (h) o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 51, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 52, o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 84, e o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 85.
56. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de que (a) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 13, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 14; ou (b) o domínio VH1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 49, o domínio VL1 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 50, o domínio VH2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 53, o domínio VL2 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 54, o domínio VH3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, e o domínio VL3 compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 10.
57. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizada pelo fato de que pelo menos um de L1, L2, L3 ou L4 tem independentemente 0 aminoácidos de comprimento.
58. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizada pelo fato de que L1, L2, L3 ou L4 têm, cada um independentemente, pelo menos um aminoácido de comprimento.
59. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizada pelo fato de que (a) L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, têm zero aminoácido de comprimento ou compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID
NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59); ou (b) L1, L2, L3 e L4, cada um independentemente, compreendem uma sequência selecionada do grupo que consiste em GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), S, RT, TKGPS (SEQ ID NO: 57), GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), e GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59).
60. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 56, caracterizada pelo fato de que (a) L1 compreende a sequência GQPKAAP (SEQ ID NO: 58), L2 compreende a sequência TKGPS (SEQ ID NO: 57), L3 compreende a sequência S, e L4 compreende a sequência RT; (b) L1 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L2 compreende a sequência GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 55), L3 tem 0 aminoácidos de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento; (c) L1 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L2 compreende a sequência GGSGSSGSGG (SEQ ID NO: 59), L3 tem 0 aminoácidos de comprimento, e L4 tem 0 aminoácido de comprimento; ou (d) L1 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), L2 tem 0 aminoácidos de comprimento, L3 compreende a sequência GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 56), e L4 tem 0 aminoácido de comprimento.
61. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 60, caracterizada pelo fato de que os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234 e 235 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são F234A e L235A.
62. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 60, caracterizada pelo fato de que os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236.
63. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 62, caracterizada pelo fato de que os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 228 e 409 de IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S228P e R409K.
64. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 60, caracterizada pelo fato de que os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 234, 235 e 329 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são L234A, L235A e P329A.
65. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 60, caracterizada pelo fato de que os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299 e 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S298N, T299A e Y300S.
66. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 65, caracterizada pelo fato de que o domínio dobradiça-CH2-CH3 da segunda cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A e Y407V; e em que o domínio dobradiça-CH2-CH3 da terceira cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S354C e T366W.
67. Proteína de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 48 a 65, caracterizada pelo fato de que o domínio dobradiça-CH2-CH3 da segunda cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 354 e 366 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S354C e T366W; e em que o domínio dobradiça-CH2-CH3 da terceira cadeia de polipeptídeo compreende substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 349, 366, 368 e 407 de IgG1 ou IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são Y349C, T366S, L368A e Y407V.
68. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 48 ou 52, caracterizada pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 62, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63.
69. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 48 ou 52, caracterizada pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 65, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63.
70. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 48 ou 52, caracterizada pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 67, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 63.
71. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 48 ou 52, caracterizada pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 60, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 68, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
72. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 48 ou 52, caracterizada pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 64, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 70, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
73. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 48 ou 52, caracterizada pelo fato de que a primeira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 61, a segunda cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 66, a terceira cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 71, e a quarta cadeia de polipeptídeo compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 69.
74. Proteína de ligação, caracterizada pelo fato de que compreende três sítios de ligação a antígeno que ligam, cada um, uma ou mais proteínas alvo, em que a proteína de ligação compreende quatro cadeias de polipeptídeo que formam os três sítios de ligação a antígeno, em que uma primeira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL2-L1-VL1-L2-CL [I] e uma segunda cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH1-L3-VH2-L4-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [II] e uma terceira cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VH3-CH1-dobradiça-CH2-CH3 [III] e uma quarta cadeia de polipeptídeo compreende uma estrutura representada pela fórmula: VL3-CL [IV] em que: VL1 é um primeiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL2 é um segundo domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina; VL3 é um terceiro domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina;
VH1 é um primeiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH2 é um segundo domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; VH3 é um terceiro domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina; CL é um domínio constante de cadeia leve de imunoglobulina; CH1 é um domínio constante de cadeia pesada CH1 de imunoglobulina; CH2 é um domínio constante de cadeia pesada CH2 de imunoglobulina; CH3 é um domínio constante de cadeia pesada CH3 de imunoglobulina; dobradiça é uma região de dobradiça de imunoglobulina conectando os domínios CH1 e CH2; e L1, L2, L3 e L4 são ligantes de aminoácido; em que o polipeptídeo de fórmula I e o polipeptídeo de fórmula II formam um par cruzado de cadeia leve-cadeia pesada; e em que: (a) os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios dobradiça-CH2-CH3 de IgG1 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 298, 299 e 300 de IgG1 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são S298N, T299A e Y300S; ou (b) os domínios dobradiça-CH2-CH3 da segunda e terceira cadeias de polipeptídeo são domínios CH3 de IgG4 humana, e em que os domínios dobradiça-CH2-CH3 compreendem, cada um, substituições de aminoácido em posições correspondentes às posições 233-236 de
IgG4 humana de acordo com o índice UE, em que as substituições de aminoácido são E233P, F234V, L235A, e uma exclusão em 236.
75. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que pelo menos um par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD38.
76. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que um, dois ou três pares de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 formam um sítio de ligação a antígeno que liga um alvo de antígeno selecionado do grupo que consiste em A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase- 1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM e XCR1.
77. Proteína de ligação, de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que um primeiro par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD3 humano, um segundo par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um polipeptídeo CD28 humano, e um terceiro par de VH1 e VL1, VH2 e VL2, e VH3 e VL3 forma um sítio de ligação a antígeno que liga um alvo de antígeno humano selecionado do grupo que consiste em A2AR, APRIL, ATPDase, BAFF, BAFFR, BCMA, BlyS, BTK, BTLA, B7DC, B7H1, B7H4, B7H5, B7H6, B7H7, B7RP1, B7-4, C3, C5, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL11, CCL15, CCL17, CCL19, CCL20, CCL21, CCL24, CCL25, CCL26, CCR3, CCR4, CD3, CD19, CD20, CD23, CD24, CD27, CD28, CD38, CD39, CD40, CD70, CD80, CD86, CD122, CD137, CD137L, CD152, CD154, CD160, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD278, CD279, CDH1, quitinase, CLEC9, CLEC91, CRTH2, CSF-1, CSF-2, CSF-3, CX3CL1, CXCL12, CXCL13, CXCR3, DNGR-1, ectonucleosídeo trifosfato difosfohidrolase 1, EGFR, ENTPD1, FCER1A, FCER1, FLAP, FOLH1, Gi24, GITR, GITRL, GM-CSF, Her2, HHLA2, HMGB1, HVEM, ICOSLG, IDO, IFNα, IgE, IGF1R, IL2Rbeta, IL1, IL1A, IL1B, IL1F10, IL2, IL4, IL4Ra, IL5, IL5R, IL6, IL7, IL7Ra, IL8, IL9, IL9R, IL10, rhIL10, IL12, IL13, IL13Ra1, IL13Ra2, IL15, IL17, IL17Rb, IL18, IL22, IL23, IL25, IL27, IL33, IL35, ITGB4, ITK, KIR, LAG3, LAMP1, leptina, LPFS2, MHC classe II, NCR3LG1, NKG2D, NTPDase- 1, OX40, OX40L, PD-1H, receptor de plaquetas, PROM1, S152, SISP1, SLC, SPG64, ST2, STEAP2, Syk quinase, TACI, TDO, T14, TIGIT, TIM3, TLR, TLR2, TLR4, TLR5, TLR9, TMEF1, TNFa, TNFRSF7, Tp55, TREM1, TSLP, TSLPR, TWEAK, VEGF, VISTA, Vstm3, WUCAM e XCR1.
78. Kit de polinucleotídeos, caracterizado pelo fato de que compreende:
(a) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 72, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 74, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75; (b) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 77, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75; (c) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 79, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 75; (d) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 72, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 80, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81; (e) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 76, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 82, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81; ou (f) um primeiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 73, um segundo polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 78, um terceiro polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 83, e um quarto polinucleotídeo compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 81.
79. Polinucleotídeo, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína de ligação, como definida qualquer uma das reivindicações 1 a 77.
80. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 79.
81. Célula hospedeira, caracterizada pelo fato de que compreende o kit de polinucleotídeos, como definido na reivindicação 78, o polinucleotíde, como definido na reivindicação 79, ou o vetor, como definido na reivindicação 80.
82. Método de produzir uma proteína de ligação, o método caracterizado pelo fato de que compreende cultivar a célula hospedeira, como definida na reivindicação 81, tal que a proteína de ligação seja produzida.
83. Método, de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que ainda compreendendo recuperar a proteína de ligação da célula hospedeira.
84. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 77, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
85. Método de prevenir e/ou tratar câncer em um paciente, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos uma proteína de ligação, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 73, ou a composição farmacêutica, como definida na reivindicação 84.
86. Método, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação compreende um sítio de ligação a antígeno que liga uma proteína de superfície de célula T e outro sítio de ligação a antígeno que liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que a proteína de ligação é uma proteína de ligação triespecífica compreendendo um primeiro sítio de ligação a antígeno que liga CD3, um segundo sítio de ligação a antígeno que liga CD28, e um terceiro sítio de ligação a antígeno que liga o domínio extracelular de um polipeptídeo CD38 humano.
88. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 87, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma proteína de ligação é coadministrada com um agente quimioterápico.
89. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 88, caracterizado pelo fato de que o câncer é mieloma múltiplo.
90. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 88, caracterizado pelo fato de que o câncer é leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia linfocítica crônica (CLL) ou um linfoma de células B.
91. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 90, caracterizado pelo fato de que o paciente é um ser humano.
92. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 91, caracterizado pelo fato de que o paciente é selecionado para tratamento porque as células do câncer expressam um polipeptídeo de isoforma E de CD38 humano em sua superfície celular.
BR112020007002-5A 2017-10-10 2018-10-09 anticorpos anti-cd38 e métodos de uso BR112020007002A2 (pt)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762570655P 2017-10-10 2017-10-10
US62/570,655 2017-10-10
US201762570660P 2017-10-11 2017-10-11
US62/570,660 2017-10-11
US201862676221P 2018-05-24 2018-05-24
US62/676,221 2018-05-24
EP18187186 2018-08-03
EP18187186.4 2018-08-03
PCT/US2018/055084 WO2019074973A2 (en) 2017-10-10 2018-10-09 ANTI-CD38 ANTIBODIES AND METHODS OF USE

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112020007002A2 true BR112020007002A2 (pt) 2020-11-17

Family

ID=63963620

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112020007002-5A BR112020007002A2 (pt) 2017-10-10 2018-10-09 anticorpos anti-cd38 e métodos de uso

Country Status (17)

Country Link
US (3) US11186649B2 (pt)
EP (2) EP3694882A2 (pt)
JP (3) JP7036909B2 (pt)
KR (1) KR20200061402A (pt)
CN (2) CN111788225A (pt)
AR (1) AR116718A1 (pt)
AU (1) AU2018348093A1 (pt)
BR (1) BR112020007002A2 (pt)
CA (1) CA3078800A1 (pt)
IL (1) IL273871A (pt)
MA (1) MA50359A (pt)
MX (1) MX2020004129A (pt)
PH (1) PH12020550408A1 (pt)
SG (1) SG11202003212PA (pt)
TW (2) TW202342544A (pt)
UY (1) UY37928A (pt)
WO (1) WO2019074973A2 (pt)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1914242A1 (en) * 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
TWI803876B (zh) * 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
KR102211837B1 (ko) 2013-01-14 2021-02-03 젠코어 인코포레이티드 신규한 이형이량체 단백질
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP3223845B1 (en) 2014-11-26 2021-05-19 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cd20
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
CN116675776A (zh) 2015-10-25 2023-09-01 赛诺菲 用于预防或治疗hiv感染的三特异性和/或三价结合蛋白
MY192090A (en) 2016-04-13 2022-07-26 Sanofi Sa Trispecific and/or trivalent binding proteins
CR20180539A (es) 2016-04-13 2019-02-15 Sanofi Sa Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes
SG11201912774RA (en) 2017-06-20 2020-01-30 Teneobio Inc Anti-bcma heavy chain-only antibodies
JP7036909B2 (ja) 2017-10-10 2022-03-15 サノフイ 抗ｃｄ３８抗体および使用方法
KR20210005169A (ko) 2018-04-25 2021-01-13 프로메테우스 바이오사이언시즈, 인크. 최적화된 항tl1a 항체
CN113166254A (zh) 2018-10-09 2021-07-23 赛诺菲 三特异性抗cd38、抗cd28和抗cd3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法
JP2022527994A (ja) * 2019-04-09 2022-06-07 サノフイ 三重特異性結合性タンパク質、方法、およびその使用
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
WO2021003074A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Crystal Bioscience Inc. Anti-cd38 antibody and methods of use thereof
EP4048309A4 (en) 2019-10-24 2024-02-21 Prometheus Biosciences Inc HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST TNF-LIKE LIGAND 1A (TL1A) AND THEIR USES
EP4048690A1 (en) 2019-10-25 2022-08-31 Sanofi Methods for analyzing chain mispairing in multispecific binding proteins
CN112876563B (zh) * 2019-11-29 2022-08-16 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 药物组合物及其制备方法和应用
EP4186564A1 (en) 2020-04-29 2023-05-31 Teneoone, Inc. Multispecific heavy chain antibodies with modified heavy chain constant regions
UY39191A (es) * 2020-04-29 2021-11-30 Teneobio Inc Anticuerpos de cadena pesada multiespecíficos con regiones constantes de cadena pesada modificadas
US11919956B2 (en) 2020-05-14 2024-03-05 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (PSMA) and CD3
KR102607909B1 (ko) * 2020-08-19 2023-12-01 젠코어 인코포레이티드 항-cd28 조성물
IL301037A (en) 2020-09-18 2023-05-01 Regeneron Pharma Antigen binding molecules that bind CD38 and/or CD28 and uses thereof
WO2022192403A1 (en) 2021-03-09 2022-09-15 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind cd3 and cldn6
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
CN117642427A (zh) * 2021-07-14 2024-03-01 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合cd38、bcma和cd3的抗原结合分子及其医药用途
AU2022323166A1 (en) * 2021-08-02 2024-02-29 Hangzhou Unogen Biotech, Ltd Anti-cd38 antibodies, anti-cd3 antibodies, and bispecific antibodies, and uses thereof
AU2022330406A1 (en) * 2021-08-20 2024-03-07 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor–expressing cells
WO2023246911A1 (zh) * 2022-06-24 2023-12-28 北京可瑞生物科技有限公司 基于t细胞受体的双特异性多肽分子及其用途

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0308936B1 (en) 1987-09-23 1994-07-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibody heteroconjugates for the killing of HIV-infected cells
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
US20050163782A1 (en) * 2003-06-27 2005-07-28 Biogen Idec Ma Inc. Modified binding molecules comprising connecting peptides
ES2541489T3 (es) 2004-02-06 2015-07-21 Morphosys Ag Anticuerpos humanos anti-CD38 y usos para ellos
US9200061B2 (en) * 2004-02-06 2015-12-01 Morpho Sys AG Generation and profiling of fully human HuCAL gold®-derived therapeutic antibodies specific for human CD3i
CN100376599C (zh) 2004-04-01 2008-03-26 北京安波特基因工程技术有限公司 基因工程重组抗cea抗cd3抗cd28线性单链三特异抗体
ME03528B (me) * 2005-03-23 2020-04-20 Genmab As Antitijela protiv cd38 za liječenje multiplog mijeloma
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
TW201008580A (en) 2008-06-03 2010-03-01 Abbott Lab Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CN103403026B (zh) 2009-09-25 2016-05-11 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1中和抗体及其用途
RS59769B1 (sr) 2010-06-09 2020-02-28 Genmab As Antitela protiv humanog cd38
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
TWI803876B (zh) 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
WO2012154312A1 (en) 2011-05-09 2012-11-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 and their use
EP3865507A1 (en) 2011-05-17 2021-08-18 The Rockefeller University Human immunodeficiency virus neutralizing antibodies and methods of use thereof
CN104080805B (zh) 2011-11-07 2017-02-22 美国政府健康及人类服务部 gp41中和性抗体及其用途
US9695230B2 (en) 2011-12-08 2017-07-04 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Broadly neutralizing HIV-1 VRC07 antibodies that bind to the CD4-binding site of the envelope protein
WO2013163427A1 (en) 2012-04-25 2013-10-31 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Antibodies to treat hiv-1 infection
CN104955847A (zh) 2012-12-04 2015-09-30 马里兰州大学(巴尔的摩) HIV-1 Env结合抗体、融合蛋白及其使用方法
US20140213772A1 (en) 2012-12-28 2014-07-31 Abbvie, Inc. Cross-over dual variable domain immunoglobulin constructs
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2948475A2 (en) 2013-01-23 2015-12-02 AbbVie Inc. Methods and compositions for modulating an immune response
TW201446800A (zh) 2013-03-15 2014-12-16 Abbvie Inc 針對ＴＮＦα之雙特異性結合蛋白
EP3176185A1 (en) 2013-11-04 2017-06-07 Glenmark Pharmaceuticals S.A. Production of t cell retargeting hetero-dimeric immunoglobulins
KR20230022270A (ko) 2014-03-28 2023-02-14 젠코어 인코포레이티드 Cd38 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체
CA2996848C (en) 2014-09-04 2021-01-05 Stemcell Technologies Inc. Soluble antibody complexes for t cell or nk cell activation and expansion
TW202130662A (zh) 2015-01-23 2021-08-16 法商賽諾菲公司 特異性結合ｃｄ３及／或ｃｄ１２３之抗—ｃｄ３抗體，抗—ｃｄ１２３抗體及雙特異性抗體
US10654943B2 (en) 2015-06-02 2020-05-19 The Rockefeller University Tri-specific antibodies for HIV therapy
CN116675776A (zh) 2015-10-25 2023-09-01 赛诺菲 用于预防或治疗hiv感染的三特异性和/或三价结合蛋白
CN105837688B (zh) * 2015-11-20 2019-02-26 北京大学深圳研究生院 单域抗体及其编码基因，免疫毒素及其编码基因、制备方法、表达载体、应用，及宿主细胞
CR20180539A (es) 2016-04-13 2019-02-15 Sanofi Sa Proteínas de unión triespecíficas y/o trivalentes
US20230242876A1 (en) 2016-12-30 2023-08-03 Shanghai Sinobio Biotech Co., Ltd. Bifunctional molecule and use thereof
US10626169B2 (en) 2017-02-17 2020-04-21 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
JP7036909B2 (ja) * 2017-10-10 2022-03-15 サノフイ 抗ｃｄ３８抗体および使用方法
CN113166254A (zh) 2018-10-09 2021-07-23 赛诺菲 三特异性抗cd38、抗cd28和抗cd3结合蛋白和用于治疗病毒感染的使用方法
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US20220275102A1 (en) 2022-09-01
AR116718A1 (es) 2021-06-09
AU2018348093A1 (en) 2020-05-28
EP4249068A3 (en) 2023-11-22
KR20200061402A (ko) 2020-06-02
TW202342544A (zh) 2023-11-01
JP2022071087A (ja) 2022-05-13
PH12020550408A1 (en) 2021-04-12
CA3078800A1 (en) 2019-04-18
CN117964758A (zh) 2024-05-03
JP7036909B2 (ja) 2022-03-15
RU2020115450A (ru) 2021-11-15
US20220041746A1 (en) 2022-02-10
JP2020536543A (ja) 2020-12-17
MA50359A (fr) 2020-08-19
SG11202003212PA (en) 2020-05-28
WO2019074973A3 (en) 2019-06-13
JP7387780B2 (ja) 2023-11-28
US11365261B2 (en) 2022-06-21
US11186649B2 (en) 2021-11-30
EP4249068A2 (en) 2023-09-27
JP2024020377A (ja) 2024-02-14
WO2019074973A2 (en) 2019-04-18
MX2020004129A (es) 2020-08-20
UY37928A (es) 2019-05-31
IL273871A (en) 2020-05-31
TW201930338A (zh) 2019-08-01
TWI821202B (zh) 2023-11-11
US20190106504A1 (en) 2019-04-11
EP3694882A2 (en) 2020-08-19
CN111788225A (zh) 2020-10-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7387780B2 (ja) 抗ｃｄ３８抗体および使用方法
US11192960B2 (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
JP6703520B2 (ja) Ｃｄ３イプシロンおよびｂｃｍａに対する二特異性抗体
CN112384534A (zh) 用于增强nk细胞对靶细胞的杀死的组合物和方法
JP7401166B2 (ja) 抗ｂｔｎ３ａ抗体及びがん又は感染性障害の処置におけるその使用
TW202005984A (zh) 結合pd-l1及cd137的抗體分子
US11932704B2 (en) Trispecific and/or trivalent binding proteins
JP2023534008A (ja) Ｔｉｇｉｔとｃｄ１１２ｒ遮断
CN114302733A (zh) 抗纽约食管鳞状细胞癌1(ny-eso-1)抗原结合蛋白及其使用方法
CN114867751A (zh) 4-1bb和ox40结合蛋白及相关组合物和方法、抗-4-1bb抗体、抗-ox40抗体
RU2812910C2 (ru) Антитела к cd38 и комбинации с антителами к cd3 и cd28
US20240132615A1 (en) CD3/BCMA/CD38 Trispecific Antibodies
TW202400660A (zh) Cd3/bcma/cd38 三特異性抗體

Legal Events

Date Code Title Description
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]