JP2023534008A - Ｔｉｇｉｔとｃｄ１１２ｒ遮断 - Google Patents

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Abstract

本明細書では、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質、ＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質、及びこれらの組み合わせが提供される。また、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質及びＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質を含み、任意選択によりＰＤ－１結合タンパク質をさらに含む組成物が提供される。関連するコンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞及びキットがさらに提供される。さらに、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質、ＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質、又はこれらの組み合わせを含み、任意選択によりさらにＰＤ－１抗原結合タンパク質、又はコンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、若しくは宿主細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、若しくは賦形剤を含む医薬組成物、並びにそれを必要とする対象を治療する方法が提供される。

Description

関連出願の相互参照
２０２０年７月１５日に出願された米国仮特許出願第６３／０５２，０１１号明細書及び２０２１年６月１８日に出願された米国仮特許出願第６３／２１２，３１５号明細書の３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益が本明細書により主張されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
電子的に提出された材料の参照による組み込み
本明細書と同時に提出され、以下の通り特定されたコンピュータ可読のヌクレオチド／アミノ酸配列表は、その全体が参照により組み込まれる：２０２１年６月２８日作成の「Ａ－２４４３－ＷＯ－ＰＣＴ＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名称の５．２２ＭＢ ＡＳＣＩＩ（Ｔｅｘｔ）ファイル。
ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１軸は、癌におけるＴ細胞免疫応答の抑制に関与する。この経路のアンタゴニストは、多くの固形腫瘍適応症で臨床的に検証されている。ニボルマブ及びペムブロリズマブはＰＤ－１経路を標的とする２つのそのような阻害剤であり、それぞれ、転移性黒色腫の治療用として、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。最近、研究者らは、他の腫瘍タイプの場合におけるチェックポイント阻害のパラダイムを試験した。いくらかの進歩がみられるものの、チェックポイント阻害療法は依然として他の癌治療選択肢の影に隠れている。
他の薬剤と組み合わせたチェックポイント阻害剤の研究が進行中であるか、又は最近完了している。例えば、ＣＴＬＡ－４受容体の遮断抗体であるニボルマブ及びイピリムマブの併用が、切除不能なＩＩＩ期又はＩＶ期の黒色腫患者を対象とした第ＩＩＩ相臨床試験で試験された。この研究では、ニボルマブとイピリムマブの併用を受けた患者の中で完全奏効を達成した患者の割合が最も高く、一方の薬物を単独で受けた群の患者が示したアウトカムを超えた。しかしながら、ＣＴＬＡ－４及びＰＤ－１チェックポイント受容体を遮断する免疫療法に対する応答は普遍的ではなく、腫瘍が応答を回避する多くの機構が確認されている。全体的な有効性を増強し、腫瘍耐性を制限するためのアプローチとして、複数の経路を標的とする併用療法は、次のステップの理論的根拠を表している。
複数のチェックポイント阻害経路を標的とする安全且つ有効な併用療法が必要とされている。
本明細書においては、原発性ヒト腫瘍組織における活性化ヒトＴ細胞及びＴＩＬ（腫瘍浸潤白血球）上のＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒの誘導を示すデータ、並びに腫瘍細胞上のＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒ（ＣＤ１５５及びＣＤ１１２）のリガンドの高い共発現レベルを支持するデータが提示される。本明細書に提供されるデータは、ＴＩＧＩＴ又はＣＤ１１２Ｒとそのリガンドとの単一の相互作用を遮断することにより、初代ヒトＴ細胞活性が増強される一方、両受容体（ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒ）のそれぞれのリガンドへの結合を同時に遮断することにより、初代ヒトＴ細胞活性が大幅に増強されることを支持する。データはさらに、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒの相互作用の遮断に加えて、ＰＤ－１とそのリガンドが関与するさらなる第３の相互作用の遮断が、全体的な初代ヒトＴ細胞活性を大きく増加させることを支持する。３つの全ての分子（ＰＤ－１、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ）の遮断によって達成される活性の増加は、単一の遮断（ＴＩＧＩＴのみ又はＣＤ１１２Ｒのみ）及び二重遮断（ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒの両方、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１の両方、又はＣＤ１１２Ｒ及びＰＤ－１の両方の遮断）によって達成される活性の増加を超える。
したがって、本開示は、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質（例えば、抗体及びその抗原結合断片）、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質（例えば、抗体及びその抗原結合断片）、及びこれらの組み合わせを提供する。さらに、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質、及びＰＤ－１抗原結合タンパク質を含む組成物が、本開示によって提供される。特定の実施形態では、組成物は、ＴＩＧＩＴ抗体若しくはそのＴＩＧＩＴ結合断片、及び／又はＣＤ１１２Ｒ抗体若しくはそのＣＤ１１２Ｒ結合断片、及び／又はＰＤ－１抗体若しくはそのＰＤ－１結合断片を含む。好ましい実施形態では、組成物は、ＴＩＧＩＴ抗体及びＣＤ１１２Ｒ抗体を含む。関連するコンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、宿主細胞及びキットが本明細書において提供される。
本開示はまた、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質、又はこれらの組み合わせを含み、任意選択により、さらにＰＤ－１抗原結合タンパク質、又はコンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター若しくは宿主細胞、及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。好ましい実施形態では、医薬組成物は、１：１の比のＴＩＧＩＴ抗体及びＣＤ１１２Ｒ抗体を含む。
抗原結合タンパク質を作製する方法が提供される。また、治療を必要とする対象を治療する方法であって、本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む方法が提供される。
図１Ａは、示された腫瘍指標の細胞の共発現プロファイルを示す一連のプロットである。上の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。下の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーのリガンドの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。 図１Ａは、示された腫瘍指標の細胞の共発現プロファイルを示す一連のプロットである。上の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。下の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーのリガンドの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。 図１Ａは、示された腫瘍指標の細胞の共発現プロファイルを示す一連のプロットである。上の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。下の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーのリガンドの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。 図１Ａは、示された腫瘍指標の細胞の共発現プロファイルを示す一連のプロットである。上の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。下の行には、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーのリガンドの互いの及びＰＤ－１との共発現が示されている。 図１Ｂは、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ２２６、又はＰＤ－１の発現を示す一連のプロットである（単一細胞ＲＮＡ配列データに基づくデータ）。 図１Ｃは、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、及びＰＤ－１の共発現を示す一連のＦＡＣＳプロットである。 図１Ｄは、腫瘍浸潤Ｔ／ＮＫ細胞におけるＣＤ１１２Ｒ、ＴＩＧＩＴ、又はＰＤ－１の発現に陽性のＣＤ４ Ｔ細胞、ＣＤ８ Ｔ細胞、又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の％を列挙した表である。 図１Ｅは、腫瘍対ＰＢＭＣにおけるＥｐｃａｍ、ＣＤ４５、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＣＤ１１ｃ、及びＣＤ１１ｂの発現を示す一連のプロットである。ＣＤ１１２及びＣＤ１５５発現又はＣＤ１１ｃ及びＣＤ１１ｂ発現を、Ｅｐｃａｍ＋、ＣＤ４５＋Ｅｐｃａｍ＋、又はＣＤ４５＋Ｅｐｃａｍ－集団で評価した。 図２Ａは、Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）の図である。アッセイシステムは、ＣＤ１１２及びＣＤ３エンゲージャーを安定に発現する改変ＣＨＯ細胞、並びにＣＤ３／ＣＤ２８抗体で予め活性化された精製ヒトｐａｎ Ｔ細胞を使用する。Ｔ細胞表面に発現したＣＤ１１２ＲがＣＨＯ細胞表面に発現したＣＤ１１２に結合すると、ＩＬ－２の放出が抑制されると予想される。図２Ｂは、活性化されていないＴ細胞（左）と比較した活性化されたＴ細胞（右）のＣＤ１１２Ｒ発現の増加を示すグラフである。ＣＤ１１２Ｒ染色プロファイルをアイソタイプ対照に対して示す。 図２Ｃは、ツール抗体（ＰＬ－５２５７５、ＰＬ－５２５７６、及びＰＬ－５２５７７）又はヒト若しくはマウスＩｇＧ対応対照抗体（それぞれ、ＨｕＩｇＧアイソタイプ及びＭｕＩｇＧアイソタイプ）の濃度の関数としてプロットされた、ヒトＣＤ１１２Ｒを発現するＣＨＯ細胞への抗体又はリガンド間の結合（ＧｅｏＭｅａｎ倍率によって表される）を示すグラフである。ＣＤ１１２リガンドの結合も示す。図２Ｄは、ツール抗体（ＰＬ－５２５７５、ＰＬ－５２５７６、及びＰＬ－５２５７７）又はヒト若しくはマウスＩｇＧ対応対照抗体（それぞれ、ＨｕＩｇＧアイソタイプ及びＭｕＩｇＧアイソタイプ）の濃度の関数としてプロットされた、ＣＨＯ細胞上に発現したリガンドとヒトＣＤ１１２Ｒとの間の結合の計算された阻害％を示すグラフである。 図２Ｅは、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）又はＣＤ１１２をコードするベクター（ＣＤ１１２）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞との相互作用の際の、ツール抗体（ＰＬ－５２５７５、ＰＬ－５２５７６、及びＰＬ－５２５７７）又はヒト若しくはマウスＩｇＧ対応対照抗体（それぞれＨｕＩｇＧアイソタイプ及びＭｕＩｇＧアイソタイプ）の濃度の関数としてプロットされたＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）のグラフである。各ツール抗体のＥＣ５０をＸ軸の下の表に示す。 図２Ｆは、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ－ＣＨＯ）又はＣＤ１１２をコードするベクター（ＣＤ１１２－ＣＨＯ）でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞とＴ細胞を共培養するアッセイにおける、ＣＤ２２６抗体又はアイソタイプ対応対照抗体の濃度の関数としてプロットされたＩＬ－２濃度（ｐｇ／ｍＬ）のグラフである。一例で、抗体を含まないＴ細胞が示されている。 図３は、抗ＣＤ１１２Ｒアンタゴニスト抗体を発見するために利用されるスクリーニングカスケードの概略図である。 図４Ａは、Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）の概略図である。ＣＤ３エンゲージャー及びＣＤ１１２を発現するＣＨＯ細胞を、抗体又は対照の存在下で、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼコンストラクト及びＣＤ１１２Ｒを発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞と共培養する。 図４Ｂは、収穫物６～９についてプロットしたルシフェラーゼ活性の誘導倍率のグラフである。図４Ｃは、３５０ヒットのパネル及び陽性結合剤についてプロットした初代ｃｙｎｏ Ｔ細胞に対する結合活性のグラフである。 図５Ａは収穫物１～３の特性を列挙する表であり、図５Ｂは、収穫物６～９の特性を列挙する表である。 図６は、任意のカットオフ閾値として１００ｐＭのＫｄを有するＣＤ１１２Ｒ抗体についての相対的結合活性のグラフである。 図７Ａは、抗体の配列多様性を示すクラッディング結果のグラフである。 図７Ｂは、示された抗体の例示的なＥＣ５０値、並びに生殖系列及びＨＣ ＣＤＲ３の配列情報を列挙する表である。 図８は、示された抗体又はツール抗体（ＰＬ－５２５７５、ＰＬ－５２５７７）によって達成された結合の阻害率％のグラフである。無関係のマウス及びヒト抗体を対照として使用する。Ｘ軸の下の表は、各ツール抗体についてのＥＣ５０値及び最大阻害率％を列挙する。 図９Ａは、３つのシナリオに対する競合アッセイの異なる段階の間のシグナル：Ａ２、Ｂ２及びＦ２のグラフであり、Ａ２は、２つの異なる抗体を用いて、第２の抗体が第１の抗体とリガンドへの結合で競合するかどうかを決定する場合である。Ｂ２は、アッセイ全体を通して同じ抗体が使用される場合である。Ｆ２は、無関係な対照抗体が使用される場合である。図９Ｂは、競合アッセイによって決定される、リガンドへの結合について互いに競合する抗体（Ｂｉｎ Ａ）を列挙する表である。培養されたヒトＴ細胞及びｃｙｎｏＰＢＭＣを、３μｇ／ｍＬ（ヒトＴ細胞を用いたアッセイ）又は５μｇ／ｍＬ（ｃｙｎｏＰＢＭＣを用いたアッセイ）で開始する様々な濃度の抗体と共にインキュベートした。抗体を、最小濃度０．００１μｇ／ｍＬ（ヒトＴ細胞を用いたアッセイにおいて）及び０．００２μｇ／ｍＬ（カニクイザルＰＢＭＣを用いたアッセイにおいて）について１／３で滴定した。ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用してＧｅｏＭｅａｎｓを得、Ｓｃｒｅｅｎｅｒを使用して、アイソタイプ対照、滴定曲線及びＥＣ５０値に対する倍率を決定した。 図１０Ａ及び１０Ｂは、示された抗体の濃度の関数としてプロットされたアイソタイプ対照に対する倍率のグラフである。ｃｙｎｏＰＢＭＣ及びヒトＴ細胞を用いたアッセイの結果を、それぞれ図１０Ａ及び１０Ｂに示す。図１０Ａ及び１０Ｂのグラフは、示された抗体のｌｏｇ濃度の関数としてプロットされたアイソタイプ対照シグナルに対する倍率をプロットする。 図１１Ａは、示された抗体の濃度の関数としてプロットされたＮＦＡＴルシフェラーゼ活性のグラフである。図１１Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ ＲＧＡにおいて決定された抗体のＥＣ５０を列挙する表である。 図１２Ａは、ツールＴＩＧＩＴ抗体濃度の関数としてプロットされたＣＤ１５５－ＦｃへのＴＩＧＩＴの結合の阻害％のグラフである。図１２Ｂは、抗体濃度の関数としてのＣＤ１１２－Ｆｃへの結合の阻害％のグラフである。 図１２Ｃは、ツールＴＩＧＩＴ抗体の活性を試験するための細胞アッセイの説明図である。図１２Ｄは、抗体なしでの、図１２Ｃの異なる細胞へのＣＤ２２６－Ｆｃの結合のグラフである。図１２Ｅは、示された濃度のツール抗体又は対照抗体の存在下でのＣＤ２２６－Ｆｃの結合のグラフである。 図１２Ｆは、示された濃度のツール抗体又は対照抗体の存在下でＴ細胞によって作製されたＩＦＮγの濃度のグラフである。図１２Ｇは、示された濃度のツール抗体又は対照抗体の存在下で誘導されたＮＦＡＴルシフェラーゼ活性の濃度のグラフである。 図１２Ｈは、示された濃度のツール抗体又は対照抗体の存在下での結合のグラフである。１Ｆ４は、１０Ａ７及びＭＢＳＡ４３のようなツール抗体である。図１２Ｉは、アイソタイプ対照と比較した、予め活性化された初代ｃｙｎｏ Ｔ細胞に対する示された抗体の結合活性を示す一連のプロットである。 図１３は、抗ＴＩＧＩＴ抗体を発見するために利用されたスクリーニングアッセイの概略図である。 図１４Ａは、Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）の概略図である。ＣＤ３エンゲージャー及びＣＤ１５５を発現するＣＨＯ細胞を、抗体又は対照の存在下で、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼコンストラクト及びＴＩＧＩＴを発現するＪｕｒｋａｔＴ細胞と共培養する。 図１４Ｂは、示されたＴＩＧＩＴ抗体又はツール抗体（ＭＢＳＡ４３）又は対照抗体（ヒトＩｇＧ４アイソタイプ対照、ヒトＩｇＧ２アイソタイプ対照、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照）の存在下で誘導されたＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ活性のグラフである。 図１４Ｃは、示されたＴＩＧＩＴ抗体又はツール抗体（ＭＢＳＡ４３）又は対照抗体（ヒトＩｇＧアイソタイプ対照、マウスＩｇＧ１アイソタイプ対照）の存在下でＴ細胞によって作製されたＩＦＮγのグラフである。 図１５は、示されたＴＩＧＩＴ抗体（ＡＢ１又はＡＢ２）又はツール抗体（ＭＢＳＡ４３）の存在下、ＩＬ－２－ルシフェラーゼレポートコンストラクト及びＴＩＧＩＴをトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞によって誘導されたルシフェラーゼ活性のグラフである。１セットの細胞を操作して、ＣＤ２２６発現をノックアウトした（ＣＤ２２６ＫＯ）。 図１６Ａは、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２２６及びＣＤ１１２Ｒを発現するＴ細胞及びＣＤ１５５、ＣＤ１１２及びｓｃＦＶ抗ＣＤ３を発現するＣＨＯ細胞を用いたＩＦＮγ放出アッセイの概略図である。図１６Ｂは、示された抗体の組み合わせの存在下で放出されたＩＦＮγのグラフである。ＨｕＩｇＧ１及びｍＩｇＧ１は、アイソタイプ対応対照抗体である。ツールＣＤ１１２Ｒ抗体には、ＰＬ－５２５７７が含まれる。 図１７Ａ～１７Ｃの各々は、２又は３種の抗体又は単一抗体の示された組み合わせの存在下で放出されたＩＦＮγのグラフである。３×＝抗ＰＤ－１、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ。 図１７Ａ～１７Ｃの各々は、２又は３種の抗体又は単一抗体の示された組み合わせの存在下で放出されたＩＦＮγのグラフである。３×＝抗ＰＤ－１、抗ＴＩＧＩＴ及び抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ。図１７Ｄは、示された抗体の組み合わせ又は単一抗体についてのＩＦＮγ放出アッセイの予測結果対実測結果のグラフである。 図１７Ｅは、ヒト腫瘍組織由来細胞アッセイにおける、２若しくは３種の抗体又は単一抗体の示された組み合わせの存在下で放出されたＩＦＮγのグラフである。３日目及び６日目に収集された上清のＩＦＮγ濃度の比較を示す。図１７Ｆは、ＰＢＭＣ又は腫瘍細胞中のＣＤ４ Ｔ細胞における示された分子の発現に陽性の細胞の％のグラフである。図１７Ｇは、ＰＢＭＣ又は腫瘍細胞中のＣＤ８ Ｔ細胞における示された分子の発現に陽性の細胞の％のグラフである。 図１７Ｈは、腫瘍組織由来細胞培養の６日目におけるＰＤ－１の発現に陽性の細胞の％のグラフであり、細胞は抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体又はアイソタイプ対照抗体で処理した。図１７Ｉは、腫瘍組織由来細胞培養の６日目におけるＴＩＧＩＴの発現に陽性の細胞の％のグラフであり、細胞は抗ＰＤ－１抗体、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体又はアイソタイプ対照抗体で処理した。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１８は、本明細書で参照される表２～５及び１２～１９を集めたものである。 図１９Ａ及び１９Ｂの各々は、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（２４Ｆ１）、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（４３Ｂ７．００２．０１５）及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂを示したように様々な比で含む製剤で刺激した際に細胞傷害性Ｔリンパ球によって産生されるＩＦＮ－γの量（ｐｇ／ｍＬ）のグラフである。図１９Ａ及び１９Ｂにおける製剤の総抗体濃度は、それぞれ１．５ｎＭ及び３０ｎＭである。 図２０Ａ～２０Ｃは、ＦＡＣＳ分析によって決定された、エクスビボ初代ヒト腫瘍組織及び対応血液によるＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、並びにリガンドＣＤ１５５、ＣＤ１１２及びＰＤＬ１の発現に関するグラフである。腫瘍組織由来のＣＤ４５＋免疫細胞中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ３－ＣＤ５６＋ＮＫ細胞上のＴＩＧＩＴ＋細胞及びＣＤ１１２Ｒ＋細胞の割合を図２０Ａにグラフ化し、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又は血液中の組み合わせたＴ／ＮＫによって発現したＴＩＧＩＴ＋細胞及びＣＤ１１２Ｒ＋細胞の割合を図２０Ｂに示す。試料のサブセットのリガンド発現を分析し、ＥｐｃａｍＨＩ腫瘍細胞におけるＣＤ１５５－、ＣＤ１１２－、及びＰＤ－Ｌ１陽性細胞の割合を図２０Ｃに示す。接続線は、個々のドナーからの値を示す。これらのデータは、４つの適応症（ＰＡＮＣ、ＣＲＣ、ＧＩＳＴ、及びＴＮＢＣ）の腫瘍組織からの結果をまとめて示したものである。 図２１は、雄のカニクイザルへのＩＶ投与後の時間の関数としてプロットした平均血清中ｍＡｂ濃度のグラフである。円で示した線は第１群動物の抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの平均血清濃度をプロットし、四角で示した線は第１群動物の抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂの平均血清濃度をプロットし、三角（上向き）で示した線は第２群動物の抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの平均血清濃度をプロットし、三角（下向き）で示した線は、第３群動物の抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂの平均血清濃度をプロットする。 図２２Ａ～２２Ｄは、ＣＤ１１２Ｒ＋ＴＩＧＩＴ遮断が腫瘍細胞に対するヒト初代ＮＫ細胞活性を相加的に増強することを示している。図２２Ａは、標的がＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、ＰＤ－１又はＣＤ９６である標的陽性ＮＫ細胞％のグラフであり、精製ヒトＮＫ細胞がＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒと高レベルで発現し、ＰＤ－１及びＣＤ９６を低レベルで発現することを示す。図２２Ｂは、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、又はＰＤＬ１を発現するリガンド陽性細胞％のグラフであり、アッセイにおいて使用される標的腫瘍細胞（ＳＫＢＲ３腫瘍細胞株）が、ＣＤ１５５及びＣＤ１１２を高レベルで発現し、ＰＤ－Ｌ１を低レベルで発現することを示す。図２２Ｃは、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体、又は抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ、又は抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、及び抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ（３×）によって刺激された精製ヒトＮＫ細胞による腫瘍細胞死滅の（アイソタイプ対照抗体に対する）程度のグラフである。図２２Ｄは、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体、又は抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ、又は抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、及び抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ（３×）を含む示された抗体混合物によって刺激されたＩＦＮγ産生の（アイソタイプ対照抗体に対する）程度のグラフである。図２２Ｃ及び２２Ｄは、ＴＩＧＩＴ又はＣＤ１１２Ｒの個々の遮断が、アイソタイプ（ＨｕＩｇＧ１）又はＰＤ－１抗体処理細胞と比較してＮＫ細胞活性を増強したが、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒの両方の遮断は１６時間で腫瘍細胞死滅及びＩＦＮｇ産生の両方を相加的に増強したことを示している。ＮＫ細胞活性を、アイソタイプ対照に対する倍率変化として示す。各ｍＡｂは１０μｇ／ｍＬで添加した。解離したエクスビボ腫瘍組織から作製した単一細胞懸濁液を、抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体、又は抗ＴＩＧＩＴ抗体と抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ、又は抗ＰＤ－１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、及び抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の組み合わせ（それぞれ１０μｇ／ｍＬ）を含む示された抗体混合物の存在下で培養し、３日目に上清中のＩＦＮｇレベルによってＴ／ＮＫ細胞活性を測定した。 同上。 図２３は、解離したエクスビボ腫瘍組織における一次ＴＩＬ応答における（アイソタイプ対照抗体に対する）増加のグラフであり、１：１：１の比のＣＤ１１２Ｒ＋ＴＩＧＩＴ＋ＰＤ－１を標的とする３つ全ての抗体を含む混合物が最も高いＴＩＬ応答を刺激することを示している。５つの異なる組織からの平均値及びＳＥＭを示すエラーバーをこのグラフに示す。 図２４Ａ～２４Ｃは、いくつかの異なるマウス腫瘍モデルにおける経時的な腫瘍増殖応答のグラフを示す。図２４Ａは、ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける腫瘍増殖を示し、腫瘍体積が、アイソタイプ対照又は抗ＰＤ１抗体で処置された野生型（ＷＴ）マウス、ＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２Ｒ ＫＯ（二重ＫＯ）マウス、ＣＤ１１２Ｒ ＫＯマウス、又はＴＩＧＩＴ ＫＯマウスにおける腫瘍移植後の日数の関数としてプロットされている。番号付きの群は、（１）アイソタイプ対照抗体で処置されたＷＴマウス、（２）アイソタイプ対照抗体で処置されたＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２Ｒ ＫＯマウス、（３）抗ＰＤ－１抗体で処置されたＷＴマウス、（４）抗ＰＤ－１抗体で処置されたＣＤ１１２Ｒ ＫＯマウス、（５）抗ＰＤ－１抗体で処置されたＴＩＧＩＴ ＫＯマウス、及び（６）抗ＰＤ－１抗体で処置されたＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２Ｒ ＫＯマウスに対応する。図２４Ｂは、Ｂ１６Ｆ１０同系腫瘍モデルにおける腫瘍体積のグラフであり、群番号は、（１）アイソタイプ対照抗体で処置されたＷＴマウス、（２）抗ＰＤ－１抗体で処置されたＷＴマウス、（３）アイソタイプ対照抗体で処置されたＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２Ｒ ＫＯ（ｄＫＯ）マウス、及び（４）抗ＰＤ－１抗体で処置されたＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２Ｒ ＫＯ（ｄＫＯ）マウスに対応する。図２４Ｃは、（１）アイソタイプ対照抗体、（２）抗ＰＤ－１抗体、（３）抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ及び抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂを含む組み合わせ製剤、並びに（４）抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ及び抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂを含む組み合わせ製剤で処置した異種移植モデルにおいて、経時的に測定された腫瘍体積のグラフである。 同上。 図２５Ａ～２５Ｄの各々は、ＳＥＣによって測定された、－３０℃（図２５Ａ）、４℃（図２５Ｂ）、２５℃（図２５Ｃ）及び４０℃（図２５Ｄ）で保存後の、（１）抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（ＣＤ１１２Ｒ）、（２）抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（ＴＩＧＩＴ－１０）、（３）別の抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（ＴＩＧＩＴ－１２）、（４）抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ－１０ｍＡｂの両方、並びに（５）抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ－１２の両方を含む製剤において測定された、時間（週）の関数としてプロットされた高分子量（ＨＭＷ）種％のグラフである。 図２５Ａ～２５Ｄの各々は、ＳＥＣによって測定された、－３０℃（図２５Ａ）、４℃（図２５Ｂ）、２５℃（図２５Ｃ）及び４０℃（図２５Ｄ）で保存後の、（１）抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（ＣＤ１１２Ｒ）、（２）抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（ＴＩＧＩＴ－１０）、（３）別の抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（ＴＩＧＩＴ－１２）、（４）抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ－１０ｍＡｂの両方、並びに（５）抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ－１２の両方を含む製剤において測定された、時間（週）の関数としてプロットされた高分子量（ＨＭＷ）種％のグラフである。 図２５ＥＦである。 図２５ＧＨである。 図２６は、７０ｍｇ／ｍＬ若しくは１４０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ、ＴＩＧＩＴ－１０若しくはＴＩＧＩＴ－１２を含む製剤、又は１：１の比で抗ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ－１０の両方を含むか、若しくは１：１の比で抗ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ－１２の両方を含む製剤のＬＭＷ＋ＨＭＷピーク％を列挙した表である。 図２７は、７０ｍｇ／ｍＬ若しくは１４０ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ、ＴＩＧＩＴ－１０若しくはＴＩＧＩＴ－１２を含む製剤、又は１：１の比で抗ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ－１０の両方を含むか、若しくは１：１の比で抗ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ－１２の両方を含む製剤の粘度（ｃＰ）のグラフである。
ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒ（ＰＶＲＩＧとしても知られる）は、細胞外領域に免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む受容体のファミリーに属する。これらの受容体は、またＩｇドメインを含有するリガンドと相互作用する。各受容体がファミリー中の複数のリガンドと相互作用することができるという証拠があるが、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５及びＣＤ１１２Ｒ－ＣＤ１１２は親和性測定による順位に基づく一次受容体－リガンド対合を表す。別のファミリーメンバーであるＣＤ２２６は、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５の両方と、いずれもＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５及びＣＤ１１２Ｒ－ＣＤ１１２の親和性よりも弱い親和性で、相互作用することができる。ＣＤ２２６の結合は、腫瘍細胞に対するＴ／ＮＫ細胞応答の文脈においては、Ｔ／ＮＫ細胞活性を特異的に増強する。この「共刺激」シグナルは、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒが高レベルで共発現される場合に阻害されると考えられるが、その理由は１）ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２ＲがいずれもＣＤ２２６よりも高い親和性でリガンドに結合し、リガンドの接近性を効果的に制限し、また２）ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒ細胞内ドメインは、阻害シグナルを生成すると考えられるＩＴＩＭ又はＩＴＩＭ様ドメインを含有するが、そのようなシグナルの性質はＴ細胞においては広範に特徴付けられていないからである。
ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒの主要なリガンドであるＣＤ１５５及びＣＤ１１２の転写物は、広範囲にわたる組織及び細胞型に存在する。これは、その発現がより限局的な、抗原提示細胞及び腫瘍細胞に優先的に発現するＰＤ－Ｌ１とは対照的である。これらのリガンドは、異なるタイプの刺激によって誘導されることが示されており、一方、ＰＤ－Ｌ１は、ＩＦＮγへの曝露によってアップレギュレートされ、ＣＤ１５５及びＣＤ１１２はこのサイトカインに曝露されても制御されず、代わりに、ＤＮＡ損傷、ウイルス感染及び活性酸素種（ＲＯＳ）に応答してアップレギュレートされる。したがって、リガンド誘導応答はさらに、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒが関与する経路とＰＤ－１が関与する経路とを区別する。
本開示は、ＴＩＧＩＴに結合する抗原結合タンパク質、例えば、抗体及びその抗原結合断片、例えば、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質（本明細書ではＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質とも呼ばれる）を提供する。好ましい実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体（例えば、ＴＩＧＩＴ抗体、α－ＴＩＧＩＴ抗体）である。
本開示はさらに、ＣＤ１１２Ｒに結合する抗原結合タンパク質、例えば、本明細書においてＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質とも呼ばれるＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質を提供する。好ましい実施形態、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、ＣＤ１１２Ｒに特異的に結合する抗体（例えば、ＣＤ１１２Ｒ抗体、α－ＣＤ１１２Ｒ抗体）である。
結合特性
例示的な実施形態では、本開示のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＴＩＧＩＴに結合する結合強度は、その親和性の観点で記載される。例示的な態様では、本開示のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＴＩＧＩＴに対する結合強度は、ＫＤの観点で記載される。同様に、本開示のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＣＤ１１２Ｒに結合する結合強度は、その親和性の観点で記載され、例示的な態様では、本開示のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＣＤ１１２Ｒに対する結合強度は、ＫＤの観点で記載される。ＫＤは、平衡解離定数、抗原結合タンパク質とその標的又は抗原との間のｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である。ＫＤは、親和性に反比例する。ＫＤ値は抗原結合タンパク質の濃度に関連し、したがって、ＫＤ値が低いほど、抗原結合タンパク質の親和性が高い。例示的な態様では、本明細書で提供されるＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質及びＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＫＤは、マイクロモル、ナノモル、ピコモル又はフェムトモルである。例示的な態様では、本明細書で提供されるＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質又はＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＫＤは、約１０－４～１０－６Ｍ、又は１０－７～１０－９Ｍ、又は１０－１０～１０－１２Ｍ、又は１０－１３～１０－１５の範囲内である。任意選択により、本明細書で提供されるＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質又はＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＫＤは、約１０－１２～１０－８Ｍ、任意選択により１０－１１～１０－１０Ｍの範囲内である。
様々な態様において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ヒトＴＩＧＩＴに結合する。ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号１として提供される。特に、配列番号１のアミノ酸１～２１はシグナルペプチドを表し、配列番号１のアミノ酸２２～２４４は成熟ヒトＴＩＧＩＴアミノ酸配列を表す。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約５０ｎＭ以下（例えば、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、又は約１０ｎＭ以下）のＫＤでヒトＴＩＧＩＴに結合する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、又は約１ｎＭ以下のＫＤでヒトＴＩＧＩＴに結合する。様々な態様において、ヒトＴＩＧＩＴに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、１ｎＭ未満、例えば、０．７５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、又は０．２５ｎＭ未満である。任意選択により、ヒトＴＩＧＩＴに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、約０．００１ｎＭ以上又は約０．０１ｎＭ以上で且つ０．５ｎＭ未満である。様々な態様において、ヒトＴＩＧＩＴに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、約０．０１ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０２ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０３ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０４ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０６ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０７ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０８ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０９ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．１ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．２ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．３ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．４ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．３ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．２ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０９ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０８ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０７ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０６ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０４ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０３ｎＭ、又は約０．０１ｎＭ～約０．０２ｎＭである。様々な態様において、抗原結合タンパク質はまた、カニクイザル（ｃｙｎｏ）ＴＩＧＩＴに結合する。ｃｙｎｏＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号２０２４として提供される。特に、配列番号２０２４のアミノ酸１～２１はシグナルペプチドを表し、配列番号２０２４のアミノ酸２２～２４５は成熟ｃｙｎｏＴＩＧＩＴタンパク質を表す。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約１ｎＭ～約２５ｎＭ、例えば、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、又は約５ｎＭ～約１５ｎＭのＫＤでカニクイザルＴＩＧＩＴに結合する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約８ｎＭ～約１４ｎＭのＫＤでｃｙｎｏＴＩＧＩＴに結合する。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトＴＩＧＩＴ及びｃｙｎｏＴＩＧＩＴの両方に高い親和性で結合する。任意選択により、ヒトＴＩＧＩＴに対する抗原結合タンパク質のＫＤは約０．０１ｎＭ及び０．５ｎＭ未満であり、ｃｙｎｏＴＩＧＩＴに対する抗原結合タンパク質のＫＤは約８ｎＭ～約１４ｎＭである。例示的な例において、ヒトＴＩＧＩＴに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、ｃｙｎｏＴＩＧＩＴに対する抗原結合タンパク質のＫＤの約１００倍、約５０倍、約２５倍、約１０倍、約５倍、又は約２倍以下である。様々な態様において、ヒトＴＩＧＩＴを発現するヒトＴ細胞に対するＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＥＣ５０値は、ｃｙｎｏＴＩＧＩＴを発現するｃｙｎｏＰＢＭＣに対するＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＥＣ５０値の約１００倍、約５０倍、約２５倍、約１０倍、約５倍、又は約２倍以下である。
様々な例において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ヒトＣＤ１１２Ｒに結合する。ヒトＣＤ１１２Ｒのアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号３として提供される。特に、配列番号３のアミノ酸５３は、細胞外ドメインの最初のアミノ酸を表す。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＣＤ１１２Ｒ及びｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒの両方に高い親和性で結合する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約５０ｎＭ以下（例えば、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、又は約１０ｎＭ以下）のＫＤでヒトＣＤ１１２Ｒに結合する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約５ｎＭ以下、約４ｎＭ以下、約３ｎＭ以下、約２ｎＭ以下、又は約１ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＤ１１２Ｒに結合する。様々な態様において、ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、１ｎＭ未満、例えば、０．７５ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、又は０．２５ｎＭ未満である。任意選択により、ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、約０．００１ｎＭ以上又は約０．０１ｎＭ以上で且つ３ｎＭ未満である。様々な態様において、ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、約０．０１ｎＭ～約５ｎｍ、約０．０５ｎＭ～約５ｎｍ、約０．１０ｎＭ～約５ｎｍ、約０．５ｎＭ～約５ｎｍ、約１ｎＭ～約５ｎｍ、約２ｎＭ～約５ｎｍ、約３ｎＭ～約５ｎｍ、約４ｎＭ～約５ｎｍ、約０．０１ｎＭ～約４ｎｍ、約０．０１ｎＭ～約３ｎｍ、約０．０１ｎＭ～約２ｎｍ、約０．０１ｎＭ～約１ｎｍ、約０．０１ｎＭ～約０．５ｎｍ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎｍ、又は約０．０１ｎＭ～約０．０５ｎｍである。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、ｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに結合する。ｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒのアミノ酸配列は、本明細書において、配列番号２０２２として提供され、そのうちのアミノ酸５３は細胞外ドメインの最初のアミノ酸である。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約１ｎＭ～約２５ｎＭ、例えば、約５ｎＭ～約２０ｎＭ、又は約５ｎＭ～約１５ｎＭのＫＤでカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１１２Ｒに結合する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、約０．０５ｎＭ～約０．１５ｎＭのＫＤでｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに結合する。任意選択により、ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗原結合タンパク質のＫＤは約０．０１ｎＭ及び５ｎＭ未満であり、ｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに対する抗原結合タンパク質のＫＤは約０．０５ｎＭ～約０．１５ｎＭである。
例示的な例において、ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗原結合タンパク質のＫＤは、ｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに対する抗原結合タンパク質のＫＤの約１００倍、約５０倍、約２５倍、約１０倍、約５倍、又は約２倍以下である。様々な態様において、ヒトＣＤ１１２Ｒを発現するヒトＴ細胞に対するＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＥＣ５０値は、ｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒを発現するｃｙｎｏＰＢＭＣに対するＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＥＣ５０値の約１００倍、約５０倍、約２５倍、約１０倍、約５倍、又は約２倍以下である。
例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、その標的（ＴＩＧＩＴ又はＣＤ１１２Ｒ）に対する結合親和性を示し、この親和性はＴＩＧＩＴとＣＤ１５５、ＴＩＧＩＴとＣＤ１１２、又はＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２との間の天然の相互作用の結合親和性と比較して上昇している。結合親和性の上昇は、ヒトＴＩＧＩＴのそのリガンド（ＣＤ１５５）に対する結合親和性と比較して、又はヒトＣＤ１１２Ｒのそのリガンド（ＣＤ１１２）に対する結合親和性と比較して、少なくとも又は約５％の上昇、少なくとも又は約１０％の上昇、少なくとも又は約１５％の上昇、少なくとも又は約２０％の上昇、少なくとも又は約２５％の上昇、少なくとも又は約３０％の上昇、少なくとも又は約３５％の上昇、少なくとも又は約４０％の上昇、少なくとも又は約４５％の上昇、少なくとも又は約５０％の上昇、少なくとも又は約５５％の上昇、少なくとも又は約６０％の上昇、少なくとも又は約６５％の上昇、少なくとも又は約７０％の上昇、少なくとも又は約７５％の上昇、少なくとも又は約８０％の上昇、少なくとも又は約８５％の上昇、少なくとも又は約９０％の上昇、少なくとも又は約９５％の上昇であり得る。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、ヒトＴＩＧＩＴのヒトＣＤ１５５に対する結合親和性と比較して、又はヒトＣＤ１１２ＲのヒトＣＤ１１２に対する結合親和性と比較して、約２倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、５０倍、５５倍、６０倍、６５倍、７０倍、７５倍、８０倍、８５倍、９０倍、９５倍、１００倍、１０５倍、１１０倍、１１５倍、１２０倍、１２５倍、１３０倍、１３５倍、１４０倍、１４５倍、１５０倍、１７５倍、２００倍、２２５倍、２５０倍、２７５倍、３００倍、３２５倍、３５０倍、３７５倍、４００倍、４２５倍、４５０倍、４７５倍、５００倍、５２５倍、５５０倍、５７５倍、６００倍、６２５倍、６５０倍、６７５倍、７００倍、７２５倍、７５０倍、７７５倍、８００倍、８２５倍、８５０倍、８７５倍、９００倍、９２５倍、９５０倍、９７５倍、１０００倍以上のその標的（ＴＩＧＩＴ又はＣＤ１１２Ｒ）に対する結合性親和性の上昇を示す。
競合アッセイ
様々な実施形態において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ヒトＴＩＧＩＴと参照抗体との間の結合相互作用を阻害する。この参照抗体は、ＴＩＧＩＴに結合することが知られているが、本開示の抗原結合タンパク質ではない。様々な例において、本開示のＴＩＧＩＴ結合タンパク質は、ヒトＴＩＧＩＴへの結合で参照抗体と競合し、それにより、インビトロ競合結合アッセイによって決定される、参照抗体に結合するヒトＴＩＧＩＴの量を減少させる。様々な態様において、本開示の抗原結合性タンパク質は、ヒトＴＩＧＩＴと参照抗体との結合性相互作用を阻害し、その阻害はＩＣ５０によって特徴付けられる。様々な態様において、抗原結合性タンパク質は、ヒトＴＩＧＩＴと参照抗体との結合性相互作用の阻害に関して約２５０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様において、抗原結合性タンパク質は、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、又は約１０ｎｍ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様において、抗原結合性タンパク質は、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、又は約０．１ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な例において、本開示の抗原結合性タンパク質は、ヒトＴＩＧＩＴへの結合に関して参照抗体と競合し、それによって、ＦＡＣＳに基づくアッセイによって決定される、参照抗体に結合するヒトＴＩＧＩＴの量が低減される。そのアッセイでは、参照抗体のＦｃに結合するフルオロフォア結合型二次抗体の蛍光が、本開示の抗原結合性タンパク質の特定の量の非存在下又は存在下で測定される。様々な態様において、ＦＡＣＳに基づくアッセイは、参照抗体、フルオロフォア結合型二次抗体、及びＴＩＧＩＴを発現する細胞を用いて行われる。様々な態様において、細胞を遺伝子操作して、ＴＩＧＩＴを過剰発現させる。いくつかの態様では、その細胞は、ＴＩＧＩＴを発現するようにウイルスベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。別の態様では、その細胞は内因的にＴＩＧＩＴを発現する。ＦＡＣＳに基づくアッセイを行う前に、いくつかの態様では、ＴＩＧＩＴを内因的に発現する細胞が、低ＴＩＧＩＴ発現細胞又は高ＴＩＧＩＴ発現細胞として予め決定される。
例示的な態様では、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ヒトＴＩＧＩＴとその天然リガンド、例えば、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２との間の結合相互作用を阻害する。様々な例において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ＦＡＣＳベースの受容体－リガンド競合結合アッセイ、例えば、本明細書の実施例５に記載されるアッセイによって決定される、ヒトＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の結合相互作用を阻害する。様々な態様において、ヒトＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の結合相互作用の８０％超（例えば、８５％超、９０％超）が本開示の抗原結合タンパク質、例えば、抗体の存在下で阻害される。任意選択により、ＦＡＣＳベースの受容体－リガンド競合結合アッセイ、例えば、本明細書の実施例５に記載されるアッセイによって決定される、ヒトＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の結合相互作用の９５％超（例えば、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、又は略１００％）が、本開示の抗原結合タンパク質、例えば、抗体の存在下で阻害される。
様々な実施形態において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ヒトＣＤ１１２Ｒと参照抗体との間の結合相互作用を阻害する。この参照抗体は、ＣＤ１１２Ｒに結合することが知られているが、本開示の抗原結合タンパク質ではない。様々な例において、本開示のＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質は、ヒトＣＤ１１２Ｒへの結合で参照抗体と競合し、それにより、インビトロ競合結合アッセイによって決定される、参照抗体に結合するヒトＣＤ１１２Ｒの量を減少させる。様々な態様において、本開示の抗原結合性タンパク質は、ヒトＣＤ１１２Ｒと参照抗体との結合性相互作用を阻害し、その阻害はＩＣ５０によって特徴付けられる。様々な態様において、抗原結合性タンパク質は、ヒトＣＤ１１２Ｒと参照抗体との結合性相互作用の阻害に関して２５０ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様において、抗原結合性タンパク質は、約２００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約９０ｎｍ未満、約８０ｎｍ未満、約７０ｎｍ未満、約６０ｎｍ未満、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、又は約１０ｎｍ未満のＩＣ５０を示す。様々な態様において、抗原結合性タンパク質は、約９ｎＭ未満、約８ｎＭ未満、約７ｎＭ未満、約６ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約４ｎＭ未満、約３ｎＭ未満、約２ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．５ｎＭ未満、又は約０．１ｎＭ未満のＩＣ５０を示す。任意選択により、抗原結合タンパク質は、約０．０５ｎＭ～約０．５ｎＭ（例えば、約０．０６ｎＭ、約０．０７ｎＭ、約０．０８ｎＭ、約０．０９ｎＭ、約０．１ｎＭ、約０．２ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．５ｎＭ）のＩＣ５０を示す。様々な例において、本開示の抗原結合性タンパク質は、ヒトＣＤ１１２Ｒへの結合に関して参照抗体と競合し、それによって、ＦＡＣＳに基づくアッセイによって決定される、参照抗体に結合するヒトＣＤ１１２Ｒの量が低減される。そのアッセイでは、参照抗体のＦｃに結合するフルオロフォア結合型二次抗体の蛍光が、本開示の抗原結合性タンパク質の特定の量の非存在下又は存在下で測定される。様々な態様において、ＦＡＣＳに基づくアッセイは、参照抗体、フルオロフォア結合型二次抗体、及びＣＤ１１２Ｒを発現する細胞を用いて行われる。様々な態様において、細胞を遺伝子操作して、ＣＤ１１２Ｒを過剰発現させる。いくつかの態様では、その細胞は、ＣＤ１１２Ｒを発現するようにウイルスベクターで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。別の態様では、その細胞は内因的にＣＤ１１２Ｒを発現する。ＦＡＣＳに基づくアッセイを行う前に、いくつかの態様では、ＣＤ１１２Ｒを内因的に発現する細胞が、低ＣＤ１１２Ｒ発現細胞又は高ＣＤ１１２Ｒ発現細胞として予め決定される。
例示的な態様では、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ヒトＣＤ１１２Ｒとその天然リガンド、例えば、ＣＤ１１２との間の結合相互作用を阻害する。様々な例において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、ＦＡＣＳベースの受容体－リガンド競合結合アッセイ、例えば、本明細書の実施例３に記載されるアッセイによって決定される、ヒトＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２との間の結合相互作用を阻害する。様々な態様において、ヒトＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２との間の結合相互作用の９０％超が、本開示の抗原結合タンパク質、例えば、抗体の存在下で阻害される。任意選択により、ＦＡＣＳベースの受容体－リガンド競合結合アッセイ、例えば、本明細書の実施例３に記載されるアッセイによって決定される、ヒトＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２との間の結合相互作用の９５％超（例えば、９６％超、９７％超、９８％超、９９％超、又は略１００％）が、本開示の抗原結合タンパク質、例えば、抗体の存在下で阻害される。
他の結合アッセイ、例えば、抗原又はそのエピトープへの結合に関して別の抗原結合タンパク質と競合する抗体の能力を試験する競合的結合アッセイ又は競合アッセイは、当該技術分野において知られている。例えば、Ｔｒｉｋｈａ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ １１０：３２６－３３５（２００４）；Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ９８（１１）：１０８５－１０９１（１９９８）；米国特許出願公開第２０１４／０１７８９０５号明細書、Ｃｈａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ ４６：１６８－１７１（２０１７）；Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ５２５：８９－９１（２０１７）；Ｇｏｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ２９（２）：２５０－２５３（２０１７）；Ｈｕｎｔｅｒ ａｎｄ Ｃｏｃｈｒａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２５０：２１－４４（２０１６）；Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ． ２０１２ Ｍａｙ １［Ｕｐｄａｔｅｄ ２０１９ Ｊｕｌ ８］を参照されたい。Ｉｎ：Ｓｉｔｔａｍｐａｌａｍ ＧＳ，Ｇｒｏｓｓｍａｎ Ａ，Ｂｒｉｍａｃｏｍｂｅ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ． Ａｓｓａｙ Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｍａｎｕａｌ［インターネット］。Ｂｅｔｈｅｓｄａ（ＭＤ）：Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ ＆ Ｃｏｍｐａｎｙ ａｎｄ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｄｖａｎｃｉｎｇ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；２００４－。
入手先：ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｏｏｋｓ／ＮＢＫ９２４３４／；Ｃｌａｒｋｅ，Ｗｉｌｌｉａｍ，“Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ”，Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｖｏｌｕｍｅ ５，ｐａｇｅｓ ９５－１１２（２００４）、及びＧｏｏｌｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｅｔ Ｄｉａｇｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２９（２）：２５０－２５３（２０１７）。また、２つの抗体を比較する他の方法も当該技術分野で知られており、これには、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）が含まれる。ＳＰＲを使用して抗体及び第２の抗体の結合定数を決定することができ、２つの結合定数が比較され得る。
阻害及び拮抗作用
様々な例において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、その標的又は抗原に結合し、この標的又は抗原とその天然リガンド又は結合パートナーとの間の結合相互作用を阻害する。例示的な態様では、本開示のＴＩＧＩＴ結合タンパク質がＴＩＧＩＴに結合し、それによって、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の結合相互作用を阻害する。例示的な例では、それに代えて、又は加えて、本開示のＴＩＧＩＴ結合タンパク質は、ＴＩＧＩＴと他のリガンド（例えば、ＣＤ１１２）との間の結合相互作用を阻害する。例示的な態様では、本開示のＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質がＣＤ１１２Ｒに結合し、それによって、ＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２との間の結合相互作用を阻害する。例示的な例では、それに代えて、又は加えて、本開示のＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質は、ＣＤ１１２Ｒと他のリガンド（例えば、ＣＤ９６、ＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ）との間の結合相互作用を阻害する。様々な態様において、抗原結合タンパク質、例えば、抗体は、標的又は抗原の生物学的活性を阻害するアンタゴニストである。様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質は、ＣＤ１１２Ｒに結合し、ＣＤ１１２がＣＤ１１２Ｒに結合すると活性化されるシグナル伝達経路を阻害する。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質は、ＴＩＧＩＴに結合し、ＣＤ１５５がＴＩＧＩＴに結合すると活性化されるシグナル伝達経路を阻害する。ＴＩＧＩＴへＴＩＧＩＴ結合タンパク質が結合すると、又はＣＤ１１２ＲへＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質が結合すると、さらなるシグナル伝達経路が阻害され得る。
抗原結合タンパク質、例えば抗体により提供される低減又は阻害は、１００％の又は完全な阻害若しくは抑止又は低減ではないことがあり得る。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する低減又は阻害の様々な程度が存在する。この点において、抗原結合タンパク質は、ＴＩＧＩＴ及び／又はＣＤ１１２Ｒタンパク質を任意の量又はレベルまで阻害し得る。例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質によって提供される低減又は阻害は、少なくとも又は約１０％の低減又は阻害（例えば、少なくとも又は約２０％の低減又は阻害、少なくとも又は約３０％の低減又は阻害、少なくとも又は約４０％の低減又は阻害、少なくとも又は約５０％の低減又は阻害、少なくとも又は約６０％の低減又は阻害、少なくとも又は約７０％の低減又は阻害、少なくとも又は約８０％の低減又は阻害、少なくとも又は約９０％の低減又は阻害、少なくとも又は約９５％の低減又は阻害、少なくとも又は約９８％の低減又は阻害）である。
例示的な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、ＣＤ１１２のＣＤ１１２Ｒへの結合又はＴＩＧＩＴのＣＤ１５５への結合を阻害する。例示的な態様では、阻害は、特異的な生物学的又は生化学的機能の阻害における抗原結合タンパク質の有効性の尺度である半数最大阻害濃度（ＩＣ５０）に関して特徴付けられ得る。
本開示の抗原結合タンパク質の阻害活性又はアンタゴニスト活性の測定に好適な方法は、当該技術分野で知られている。例示的な例では、抗原結合タンパク質のアンタゴニスト活性又は阻害活性は、ＣＤ１１２ＲのＣＤ１１２への及び／又はＴＩＧＩＴのＣＤ１５５への同時結合、並びにＴ細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の活性化がＴＣＲ媒介応答を不活性化又は遮断する阻害シグナルを産生し、したがって、ＴＣＲライゲーションの際にＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２の間の及び／又はＴＩＧＩＴとＣＤ１５５との間の相互作用を遮断することが、ＴＣＲサブユニットのリン酸化、ＴＣＲへのＺａｐ７０の動員、ＬＡＴ及び／又はＳＬＰ－７６リン酸化、小胞体（ＥＲ）からのカルシウム動員又はカルシウム放出、ＰＬＣ－γの活性化、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びイノシトール三リン酸（ＩＰ３）の産生、プロテインキナーゼＣの活性化、ＭＡＲＰＫ／Ｅｒｋシグナル伝達、ＮＦ－κＢ活性化、ＮＦＡＴ活性化、ＩＬ－２プロモーターの活性化、ＩＬ－２産生、ＩＦＮ－ガンマ産生、Ｔ細胞増殖などの１つ以上を含むＴＣＲ媒介活性につながると仮定すると、ＴＣＲ活性化レベルを測定することによってアッセイし得る。例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｇａｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５９１－６１９（２００９）を参照されたい。したがって、様々な例において、本開示の抗原結合タンパク質の阻害活性又はアンタゴニスト活性は、例えば、ＩＬ－２産生、ＩＦＮ－ガンマ産生並びに／又はＮＦ－κＢ及び／若しくはＮＦＡＴの活性化を測定することによってアッセイし得る。様々な態様において、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いたルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイが使用され、このアッセイでは、ＴＣＲ活性化の際、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質及び／又はＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質の存在下で、ルシフェラーゼ活性が測定される。ＴＩＧＩＴ結合タンパク質及び／又はＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質の存在下では、ルシフェラーゼ活性は、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質及び／又はＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質の非存在下で観察されるルシフェラーゼ活性よりも高いと予想される。Ｊｕｒｋａｔ ＲＧＡは本明細書の実施例に記載されている（例えば、実施例３及び実施例５を参照されたい）。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質及び／又はＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質のアンタゴニスト活性は、受容体－リガンド結合アッセイ又はＪｕｒｋａｔ ＲＧＡによって測定され得る。様々な態様において、本開示の抗原結合タンパク質のアンタゴニスト活性又は阻害活性は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＧＡによって測定され得、活性はＥＣ５０として表される。様々な例において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質又はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＥＣ５０は、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約９ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約８ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約７ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約６ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約４ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約３ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約２ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭ、約８ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約９ｎＭ～約１０ｎＭである。任意選択により、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＧＡにおいて、上記のような、且つ／又は図７Ｂ若しくは表２～５に記載のようなＥＣ５０を示す。任意選択により、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＧＡにおいて、上記のような、且つ／又は表１３～１５に記載のようなＥＣ５０を示す。
ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、例示的な態様では、約１０ｎＭ未満、任意選択により５ｎＭ未満である。例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満である。例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、約０．５ｎＭ～約２ｎＭである。様々な例において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約９ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約８ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約７ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約６ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約４ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約３ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約２ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭ、約８ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約９ｎＭ～約１０ｎＭである。様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、受容体－リガンド結合アッセイによって決定される、ＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２との間の結合相互作用の阻害におけるＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質の有効性の尺度である。例えば、実施例３を参照されたい。
ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、例示的な態様では、約１０ｎＭ未満、任意選択により５ｎＭ未満である。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、２ｎＭ未満、又は１ｎＭ未満である。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、約０．５ｎＭ～約２ｎＭである。様々な例において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、約０．０１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約９ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約８ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約７ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約６ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約４ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約３ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約２ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．５ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．１ｎＭ、約０．０１ｎＭ～約０．０５ｎＭ、約０．０５ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．１ｎＭ～約１０ｎＭ、約０．５ｎＭ～約１０ｎＭ、約１ｎＭ～約１０ｎＭ、約２ｎＭ～約１０ｎＭ、約３ｎＭ～約１０ｎＭ、約４ｎＭ～約１０ｎＭ、約５ｎＭ～約１０ｎＭ、約６ｎＭ～約１０ｎＭ、約７ｎＭ～約１０ｎＭ、約８ｎＭ～約１０ｎＭ、又は約９ｎＭ～約１０ｎＭである。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＩＣ５０は、受容体－リガンド結合アッセイによって決定される、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５又はＣＤ１１２との間の結合相互作用の阻害におけるＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質の有効性の尺度である。例えば、実施例５を参照されたい。
抗原結合タンパク質の型
本開示の抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られる抗原結合タンパク質の多くの形態の任意の形態をとることができる。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、抗体若しくは免疫グロブリン、又はその抗原結合抗体断片、或いは抗体タンパク質生成物である。
集合的に、抗体は、免疫グロブリンとして知られる血漿タンパク質のファミリーを形成し、免疫グロブリンドメインを含む。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈｅｄ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，１９９９。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、重鎖及び軽鎖を含み、且つ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン型を有するタンパク質を指す。例えば、抗体は、同一のポリペプチド鎖の対が２つある「Ｙ字型」構造であり、各対が１つの「軽」鎖（通常、分子量が約２５ｋＤａである）及び１つの「重」鎖（通常、分子量が約５０～７０ｋＤａである）を有する、ＩｇＧであり得る。抗体は、可変領域及び定常領域を有する。ＩｇＧ型において、可変領域は、一般に、約１００～１１０又はそれを超えるアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体と実質的に異なる。定常領域は、抗体が免疫系の細胞及び分子を動員することを可能にする。可変領域は、各軽鎖及び重鎖のＮ末端領域から作られ、一方、定常領域は、重鎖及び軽鎖のそれぞれのＣ末端部分から作られている。（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９））。
抗体のＣＤＲの一般的な構造及び性質が当技術分野において記述されている。簡潔に言えば、抗体の骨格において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、そこで抗原結合及び抗原認識に大きい役割を果たす領域を構成している。可変領域は、典型的には、少なくとも３個の重鎖ＣＤＲ又は軽鎖ＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照されたい）、それらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７、前掲も参照されたい）内にある。
抗体は、当該技術分野において知られるいかなる定常領域も含み得る。ヒト軽鎖は、カッパ軽鎖及びラムダ軽鎖に分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ又はイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧは、以下に限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、以下に限定されないが、ＩｇＭ１及びＩｇＭ２を含む、サブクラスを有する。本開示の実施形態は、抗体のこのようなクラス又はアイソタイプの全てを含む。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域、例えばヒトカッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型重鎖定常領域、例えばヒトアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型又はミュー型重鎖定常領域であり得る。したがって、例示的な実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つを含むアイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体である。
抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗体は、哺乳動物、例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ、ニワトリ、ハムスター、ヒトなどにより産生された天然起源の抗体に実質的に類似する配列を含む。この点において、抗体は、哺乳動物抗体、例えば、マウス抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ヒト抗体などと見なされ得る。特定の態様では、抗体は、ヒト抗体である。特定の態様では、抗体は、キメラ抗体又はヒト化抗体である。用語「キメラ抗体」は、２つ以上の異なる抗体由来のドメインを含む抗体を指す。キメラ抗体は、例えば、ある種由来の定常ドメインと、別の種由来の可変ドメインとを含み得るか、又はより一般的には少なくとも２つの種由来のアミノ酸配列のストレッチを含み得る。キメラ抗体はまた、同一種内の２つ以上の異なる抗体のドメインを含み得る。用語「ヒト化」は、抗体に関して使用される場合、元の源の抗体よりも真のヒト抗体に類似する構造及び免疫機能を有するように改変されている、非ヒト源由来の少なくともＣＤＲ領域を有する抗体を指す。例えば、ヒト化は、マウス抗体などの非ヒト抗体からヒト抗体へのＣＤＲの移植を含み得る。ヒト化はまた、非ヒト配列をヒト配列にさらに類似させるために選択アミノ酸置換を含み得る。
抗体は、例えばパパイン及びペプシンなどの酵素により切断して断片にし得る。パパインは、抗体を切断して、２個のＦａｂ断片及び１個のＦｃ断片を生じる。ペプシンは、抗体を切断して、Ｆ（ａｂ’）２断片及びｐＦｃ’断片を生じる。本開示の例示的態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、抗原結合抗体断片を含む。本明細書で使用される場合、用語「抗原結合抗体断片」は、抗体の抗原に結合し得る抗体分子の部分を指し、「抗原結合断片」又は「抗原結合部分」としても知られている。例示的な例では、抗原結合抗体断片は、Ｆａｂ断片又はＦ（ａｂ’）２断片である。
抗体の構造は、広い範囲の代替形式を作り出すために利用されており、その代替形式は、少なくとも約１２～１５０ｋＤａの分子量範囲にわたり、単量体（ｎ＝１）から二量体（ｎ＝２）、三量体（ｎ＝３）、四量体（ｎ＝４）及び潜在的にさらに高い結合価（ｎ）範囲を有し、このような代替形式は、本明細書では「抗体タンパク質生成物」と称する。抗体タンパク質生成物には、完全な抗体構造に基づくもの及び完全な抗原結合能を保持する抗体フラグメントを模倣するもの、例えばｓｃＦｖ、Ｆａｂ及びＶＨＨ／ＶＨ（以下に考察する）が含まれる。完全な抗原結合性部位を保持する最小の抗原結合性抗体断片は、全体が可変（Ｖ）領域からなるＦｖ断片である。可溶性で柔軟なアミノ酸ペプチドリンカーを使用して、Ｖ領域をｓｃＦｖ（単鎖可変断片）断片に連結させて分子を安定化させるか、又は定常（Ｃ）ドメインをＶ領域に加えて、Ｆａｂ断片［断片、抗原結合性］を生成する。ｓｃＦｖ断片及びＦａｂ断片はいずれも、宿主細胞、例えば原核生物宿主細胞中で容易に産生させることができる。他の抗体タンパク質生成物としては、ジスルフィド結合安定化ｓｃＦｖ（ｄｓ－ｓｃＦｖ）、単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）並びにオリゴマー化ドメインに連結されたｓｃＦｖからなる異なる型を含む、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディ、又はミニボディ（ミニＡｂ）のような二量体抗体型及び多量体抗体型が挙げられる。最小の断片は、ラクダ科動物重鎖Ａｂ及び単一ドメインＡｂ（ｓｄＡｂ）のＶＨＨ／ＶＨである。新規の抗体型を作製するために最も頻繁に使用される構築ブロックは、約１５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーにより連結された重鎖及び軽鎖由来のＶドメイン（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）を含む単鎖可変（Ｖ）－ドメイン抗体断片（ｓｃＦｖ）である。ペプチボディ又はペプチド－Ｆｃ融合体は、さらに別の抗体タンパク質生成物である。ペプチボディの構造は、Ｆｃドメインにグラフトされた生物学的に活性なペプチドからなる。ペプチボディは、当該技術分野で十分に説明されている。例えば、Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４（５）：５８６－５９１（２０１２）を参照されたい。
他の抗体タンパク質生成物としては、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二重又は三重特異性抗体などが挙げられる。二重特異性抗体は、５つの主要なクラス：ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲートに分類することができる。例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ６７（２）Ｐａｒｔ Ａ：９７－１０６（２０１５）を参照されたい。
例示的な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、これらの抗体タンパク質生成物のいずれか１つを含む。例示的な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ／ＶＨ、Ｆｖ断片、ｄｓ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦａｂ、二量体抗体、多量体抗体（例えば、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ）、ミニＡｂ、ラクダ科動物の重鎖抗体のペプチボディＶＨＨ／ＶＨ、ｓｄＡｂ、ダイアボディ；トリアボディ；テトラボディ；二重特異性又は三重特異性抗体、ＢｓＩｇＧ、付加ＩｇＧ（ａｐｐｅｎｄｅｄ ＩｇＧ）、ＢｓＡｂ断片、二重特異性融合タンパク質及びＢｓＡｂコンジュゲートのいずれか１つを含む。
例示的な例では、本開示の抗原結合タンパク質は、単量体形態、ポリマー形態、オリゴマー形態、又は多量体形態の抗体タンパク質生成物を含む。抗体が２つ以上の個別の抗原結合領域断片を含む特定の実施形態では、抗体は、抗体により認識され、結合される個別のエピトープの数によって、二重特異性、三重特異性若しくは多重特異性、又は二価、三価若しくは多価と見なされる。例示的な態様では、本開示の抗原結合タンパク質は、２つのｓｃＦｖを含む二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）であり、ｓｃＦｖの１つはＴＩＧＩＴに結合し、１つはＣＤ１１２Ｒに結合する。様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒに結合するｓｃＦｖは、２９Ｅ１０、２４Ｆ１又は１１Ｅ４の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。様々な態様において、ＴＩＧＩＴに結合するｓｃＦｖは、４３Ｂ７．００２．０１５、６６Ｈ９．００９、又は５８Ａ７．００２．００８の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。例示的な例では、各ｓｃＦｖは、重鎖及び／又は軽鎖に、任意選択により、ＩｇＧ重鎖及び／又はＩｇＧ軽鎖に連結される。
抗原結合タンパク質の構造
例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、（ａ）表Ａ１に記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つのアミノ酸）のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）表Ａ１に記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、或いは（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの組み合わせを含む。
例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質（例えば、抗体、又はその抗原結合断片）は、表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１つ又は２つを含む。例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１つ又は２つを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗体結合タンパクは、そのような３つのＣＤＲ全てを含む。例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ａ１の単一行の配列番号で示されるアミノ酸配列のうちの３つ、４つ、５つ、又は６つ全てを含む。 例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ａ１の単一行の配列番号で示されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれ、並びに表Ａ１の同じ単一行又は別の単一行の配列番号によって示されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１又は２つを含む。例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ａ１の単一行の配列番号で示されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれ、並びに表Ａ１の同じ単一行又は別の単一行の配列番号によって示されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１又は２つを含む。例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ａ１の単一行に列挙される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１３～１８、（ｂ）配列番号２３～２８、（ｃ）配列番号３３～３８、（ｄ）配列番号４３～４８、（ｅ）配列番号５３～５８、（ｆ）配列番号６３～６８、（ｇ）配列番号７３～７８、（ｈ）配列番号８３～８８、（ｉ）配列番号９３～９８、（ｊ）配列番号１０３～１０８、（ｋ）配列番号２３３～２３８、（ｌ）配列番号１９７３～１９７８、（ｍ）配列番号１９８３～１９８８、（ｎ）配列番号１９９３～１９９８、及び（ｏ）配列番号２００３～２００８からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、上記の６つのＣＤＲアミノ酸配列、及び配列番号２０１９又は配列番号２０２０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
例示的な例では、表Ａ１のアミノ酸配列は、少なくとも、１つ以上（例えば、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の介在アミノ酸、例えば、フレームワーク残基によって分離されている。例示的な例では、ＬＣ ＣＤＲ１及びＬＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１０～約２０のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３の配列の間に約２５～約４０のアミノ酸がある。例示的な例では、ＬＣ ＣＤＲ１及びＬＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１４～約１６のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３の配列の間に約３０～約３５のアミノ酸がある。例示的な例では、ＨＣ ＣＤＲ１及びＨＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１０～約２０のアミノ酸があり、ＨＬＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３の配列の間に約２５～約４０のアミノ酸がある。例示的な例では、ＨＣ ＣＤＲ１及びＨＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１４～約１６のアミノ酸があり、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３の配列の間に約３０～約３５のアミノ酸がある。例示的な態様では、介在アミノ酸は、フレームワーク領域を含む。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、（ａ）表Ａ２に記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸（例えば、１つ、２つ、３つ、４つのアミノ酸）のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）表Ａ２に記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、或いは（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの組み合わせを含む。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質（例えば、抗体、又はその抗原結合断片）は、表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１つ又は２つを含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、並びに表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１つ又は２つを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗体結合タンパクは、そのような３つのＣＤＲ全てを含む。例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２の単一の行の配列番号で示されるアミノ酸配列のうちの３つ、４つ、５つ、又は６つ全てを含む。 例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２の単一行の配列番号で示されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれ、並びに表Ａ２の同じ単一行又は別の単一行の配列番号によって示されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１又は２つを含む。例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２の単一行の配列番号で示されるＨＣ ＣＤＲアミノ酸配列のそれぞれ、並びに表Ａ２の同じ単一行又は別の単一行の配列番号によって示されるＬＣ ＣＤＲアミノ酸配列の少なくとも１又は２つを含む。例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２の単一行に列挙される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１１３～１１８、（ｂ）配列番号１２３～１２８、（ｃ）配列番号１３３～１３８、（ｄ）配列番号１４３～１４８、（ｅ）配列番号１５３～１５８、（ｆ）配列番号１６３～１６８、（ｇ）配列番号１７３～１７８、（ｈ）配列番号１８３～１８８、（ｉ）配列番号１９３～１９８、（ｊ）配列番号２０３～２０８、（ｋ）配列番号２１３～２１８、（ｌ）配列番号２２３～２２８、及び（ｍ）配列番号２０１３～２０１８から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、上記の６つのＣＤＲアミノ酸配列、及び配列番号２０１９又は配列番号２０２０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
例示的な例では、表Ａ２のアミノ酸配列は、少なくとも、１つ以上（例えば、少なくとも、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又はそれ以上）の介在アミノ酸、例えば、フレームワーク残基によって分離されている。例示的な例では、ＬＣ ＣＤＲ１及びＬＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１０～約２０のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３の配列の間に約２５～約４０のアミノ酸がある。例示的な例では、ＬＣ ＣＤＲ１及びＬＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１４～約１６のアミノ酸があり、ＬＣ ＣＤＲ２及びＬＣ ＣＤＲ３の配列の間に約３０～約３５のアミノ酸がある。例示的な例では、ＨＣ ＣＤＲ１及びＨＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１０～約２０のアミノ酸があり、ＨＬＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３の配列の間に約２５～約４０のアミノ酸がある。例示的な例では、ＨＣ ＣＤＲ１及びＨＣ ＣＤＲ２の配列の間に約１４～約１６のアミノ酸があり、ＨＣ ＣＤＲ２及びＨＣ ＣＤＲ３の配列の間に約３０～約３５のアミノ酸がある。例示的な態様では、介在アミノ酸は、フレームワーク領域を含む。
例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、表Ｂ１の単一行に列挙されたＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域のアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）配列番号１１～１２、（ｂ）配列番号２１～２２、（ｃ）配列番号３１～３２、（ｄ）配列番号４１～４２、（ｅ）配列番号５１～５２、（ｆ）配列番号６１～６２、（ｇ）配列番号７１～７２、（ｈ）配列番号８１～８２、（ｉ）配列番号９１～９２、（ｊ）配列番号１０１～１０２、（ｋ）配列番号２３１～２３２、（ｌ）配列番号１９７１～１９７２、（ｍ）配列番号１９８１～１９８２、（ｎ）配列番号１９９１～１９９２、又は（ｏ）配列番号２００１～２００２。例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、上記のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域のアミノ酸配列の対と、配列番号２０１９又は配列番号２０２０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを含む。例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ｂ１の単一行に列挙された完全長（ＦＬ）ＨＣ及びＦＬ ＬＣのアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）配列番号９～１０、（ｂ）配列番号１９～２０、（ｃ）配列番号２９～３０、（ｄ）配列番号３９～４０、（ｅ）配列番号４９～５０、（ｆ）配列番号５９～６０、（ｇ）配列番号６９～７０、（ｈ）配列番号７９～８０、（ｉ）配列番号８９～９０、（ｊ）配列番号９９～１００、（ｋ）配列番号２２９～２３０、（ｌ）配列番号１９６９～１９７０、（ｍ）配列番号１９７９～１９８０、（ｎ）配列番号１９８９～１９９０、又は（ｏ）配列番号１９９９～２０００。
例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、表Ｂ２の単一行に列挙されたＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域のアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）配列番号１１１～１１２、（ｂ）配列番号１２１～１２２、（ｃ）配列番号１３１～１３２、（ｄ）配列番号１４１～１４２、（ｅ）配列番号１５１～１５２、（ｆ）配列番号１６１～１６２、（ｇ）配列番号１７１～１７２、（ｈ）配列番号１８１～１８２、（ｉ）配列番号１９１～１９２、（ｊ）配列番号２０１～２０２、（ｋ）配列番号２１１～２１２、（ｌ）配列番号２２１～２２２、又は（ｍ）配列番号２０１１～２０１２。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、上記のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域のアミノ酸配列の対と、配列番号２０１９又は配列番号２０２０のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域とを含む。例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ｂ２の単一行に列挙された完全長（ＦＬ）ＨＣ及びＦＬ ＬＣのアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）配列番号１０９～１１０、（ｂ）配列番号１１９～１２０、（ｃ）配列番号１２９～１３０、（ｄ）配列番号１３９～１４０、（ｅ）配列番号１４９～１５０、（ｆ）配列番号１５９～１６０、（ｇ）配列番号１６９～１７０、（ｈ）配列番号１７９～１８０、（ｉ）配列番号１８９～１９０、（ｊ）配列番号１９９～２００、（ｋ）配列番号２０９～２１０、（ｌ）配列番号２１９～２２０、又は（ｍ）配列番号２００９～２０１０。
例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質又はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、上記のアミノ酸配列に類似するアミノ酸配列を含むが、抗原結合タンパク質はその生物学的機能、例えば、その標的若しくは抗原、例えば、ヒトＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ１１２Ｒに結合する能力、又はＴＩＧＩＴとその結合パートナーであるＣＤ１５５との相互作用、若しくはＣＤ１１２Ｒとその結合パートナーであるＣＤ１１２との相互作用に起因するシグナル伝達を減少、遮断、阻害、抑止若しくは妨害する能力を実質的に保持している。
例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、表Ａ１又は表Ｂ１に記載されるアミノ酸配列を有する親アミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のアミノ酸のみが異なるアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２又は表Ｂ２に記載されるアミノ酸配列を有する親アミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のアミノ酸のみが異なるアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、抗原結合タンパク質（例えば、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質又はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質）は親配列のバリアント配列を含み、このバリアント配列は親配列と比較して、１つ又は２つのアミノ酸のみ異なる。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、ＣＤＲの外側に存在する１つ以上のアミノ酸置換を含み、例えば、この１つ以上のアミノ酸置換は重鎖又は軽鎖のフレームワーク領域内に存在する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換を含むが、抗原結合タンパク質は６つのＣＤＲのアミノ酸配列を保持する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、親配列と比較して、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上の保存的アミノ酸置換のみを有するアミノ酸配列を含む。本明細書で使用される場合、用語「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸の、類似した特性（例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香性）を有する別のアミノ酸による置換を指し、下記の５つの群の中の１つにおける交換が挙げられる：
Ｉ．脂肪族の、無極性の又は微極性の小さな残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；
ＩＩ．極性の負に帯電した残基、並びにそれらのアミド及びエステル：Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、システイン酸及びホモシステイン酸；
ＩＩＩ．極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ；オルニチン（Ｏｒｎ）
ＩＶ．脂肪族で無極性の大きな残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ホモシステイン
Ｖ．大きな芳香族の残基：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、アセチルフェニルアラニン。
例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、親アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、アミノ酸置換は非保存的アミノ酸置換である。本明細書で使用される場合、用語「非保存的アミノ酸置換」は、本明細書では、あるアミノ酸の、異なる特性（例えば、サイズ、電荷、疎水性、親水性、及び／又は芳香性）を有する別のアミノ酸による置換と定義され、上記５つの群以外の交換が挙げられる。
例示的な態様では、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、親アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、置換アミノ酸置換は天然に存在するアミノ酸である。「天然に存在するアミノ酸」又は「標準アミノ酸（ｓｔａｎｄａｒｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」又は「標準アミノ酸（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）」とは、普遍的遺伝コードのコドンによって直接コードされる、真核生物に見られる２０のアルファアミノ酸（Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）のうちの１つを意味する。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、親アミノ酸配列に対して少なくとも１つのアミノ酸置換を含んだアミノ酸配列を含み、置換アミノ酸は非標準アミノ酸であるか、又は翻訳の際にタンパク質に組み込まれないアミノ酸である。非標準アミノ酸としては、セレノシステイン、ピロリシン、オルニチン、ノルロイシン、β－アミノ酸（例えば、β－アラニン、β－アミノイソ酪酸、β－フェニルアラニン、β－ホモフェニルアラニン、β－グルタミン酸、β－グルタミン、β－ホモトリプトファン、β－ロイシン、β－リシン）、ホモ－アミノ酸（例えば、ホモフェニルアラニン、ホモセリン、ホモアルギニン、モノシステイン、ホモシステイン）、Ｎ－メチルアミノ酸（例えば、Ｌ－アブリン、Ｎ－メチル－アラニン、Ｎ－メチル－イソロイシン、Ｎ－メチル－ロイシン）、２－アミノカプリル酸、７－アミノセファロスポラニン酸、４－アミノ桂皮酸、アルファ－アミノシクロヘキサンプロピオン酸、アミノ－（４－ヒドロキシフェニル）酢酸、４－アミノ－ニコチン酸、３－アミノフェニル酢酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、親アミノ酸配列に対して約３０％以上、約５０％以上、又は約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、親アミノ酸配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、親アミノ酸配列の全長に沿って、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、親アミノ酸配列の全長に沿って、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、表Ｂ１に列挙されるＨＣ可変領域アミノ酸配列のバリアント配列、又は表Ｂ１に列挙されるＬＣ可変領域アミノ酸配列のバリアント配列を含み、このバリアント配列は、表Ｂ１の配列と、わずか１～１２（例えば、１～１１、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１若しくは２）のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性）を有する。様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ｂ１に列挙されるＦＬ ＨＣアミノ酸配列のバリアント配列、又は表Ｂ１に列挙されるＦＬ ＬＣアミノ酸配列のバリアント配列を含み、このバリアント配列は、表Ｂ１の配列と、わずか１～４６のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性）を有する。例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ｃ１の単一行に列挙されたＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域のアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）配列番号２４１及び２４２のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｂ）配列番号２４７及び２４８のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｃ）配列番号２４９及び２５０のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｄ）配列番号２５１及び２５２のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；又は（ｅ）配列番号２６３及び２６４のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸。例示的な態様では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、配列番号２４２、配列番号２４８、配列番号２５０、配列番号２５２、若しくは配列番号２６４の最初の１０５個、最初の１０６個、最初の１０７個、最初の１０８個、最初の１０９個、最初の１１０個、最初の１１１個、最初の１１２個、最初の１１３個、最初の１１４個、若しくは最初の１１５個のアミノ酸を含み、且つ／又は配列番号２４１、配列番号２４７、配列番号２４９、配列番号２５１、若しくは配列番号２６３の最初の１１５個、最初の１１６個、最初の１１７個、最初の１１８個、最初の１１９個、最初の１２０個、最初の１２１個、最初の１２２個、最初の１２３個、最初の１２４個、最初の１２５個、最初の１２６個、若しくは最初の１２７個のアミノ酸を含む。配列番号２５１又は配列番号２６３を含むｖｈＣＤＲ２、例示的な実施形態では、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ｃ１の単一行に列挙された完全長（ＦＬ）ＨＣ及びＦＬ ＬＣのアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）配列番号２４１～２４２；（ｂ）配列番号２４７～２４８；（ｃ）配列番号２４９～２５０；（ｄ）配列番号２５１～２５２；若しくは（ｅ）配列番号２６３～２６４。様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ｃ１の「改変＊」の列に列挙された奇数の配列番号を有するＦＬ ＬＣアミノ酸配列、及びＦＬ ＬＣ配列番号よりも１大きい配列番号を有するＦＬ ＨＣアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ｃ１の配列番号のいずれか１つの配列の少なくとも一部を含み、その一部は、アミノ酸配列の最初の１００個のアミノ酸、アミノ酸配列の最初の１０５個のアミノ酸、アミノ酸配列の最初の１１０個のアミノ酸、アミノ酸配列の最初の１１５個のアミノ酸、又はアミノ酸配列の最初の１２０個のアミノ酸を含む。様々な例において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ｃ１のアミノ酸配列のＣＤＲの少なくとも２、３、４、５、又は６つを含む。所与の抗体ＨＣ又はＬＣのＣＤＲは、当該技術分野で知られる任意の１つ以上の方法によって決定され得る。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７（１９８７）；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８（１９９７）；Ａｂｈｉｎａｎｄａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４５：３８３２－３８３９（２００８）；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ ７：１３２－１３６（１９９９）；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７（２００３）；及びＨｏｎｅｇｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３０９：６５７－６７０（２００１）を参照されたい。
様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、表Ｂ２に列挙されるＨＣ可変領域アミノ酸配列のバリアント配列、又は表Ｂ２に列挙されるＬＣ可変領域アミノ酸配列のバリアント配列を含み、これらのバリアント配列は、表Ｂ２の配列と、わずか１～１２のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性）を有する。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ｂ２に列挙されるＦＬ ＨＣアミノ酸配列のバリアント配列、又は表Ｂ２に列挙されるＦＬ ＬＣアミノ酸配列のバリアント配列を含み、このバリアント配列は、表Ｂ２の配列と、わずか１～４６のアミノ酸が異なるか、又は少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性）を有する。例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ｃ２の単一行に列挙されたＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域のアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）（ａ）配列番号２３９及び２４０のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｂ）配列番号２４３及び２４４のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｃ）配列番号２４５及び２４６のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｄ）配列番号２５３及び２５４のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｅ）配列番号２５５及び２５６のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｆ）配列番号２５７及び２５８のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸；（ｇ）配列番号２５９及び２６０のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸、又は（ｈ）配列番号２６１及び２６２のそれぞれの最初の１００個のアミノ酸。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、配列番号２４０、配列番号２４４、配列番号２４６、配列番号２５４、配列番号２５６，配列番号２５８、配列番号２６０，若しくは配列番号２６２の最初の１０５個、最初の１０６個、最初の１０７個、最初の１０８個、最初の１０９個、最初の１１０個、最初の１１１個、最初の１１２個、最初の１１３個、最初の１１４個、若しくは最初の１１５個のアミノ酸を含み、且つ／又は配列番号２３９、配列番号２４３、配列番号２４５、配列番号２５３、配列番号２５５、配列番号２５７、配列番号２５９、若しくは配列番号２６１の最初の１１５個、最初の１１６個、最初の１１７個、最初の１１８個、最初の１１９個、最初の１２０個、最初の１２１個、最初の１２２個、最初の１２３個、最初の１２４個、最初の１２５個、最初の１２６個、若しくは最初の１２７個のアミノ酸を含む。例示的な実施形態では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ｃ２の単一行に列挙された完全長（ＦＬ）ＨＣ及びＦＬ ＬＣのアミノ酸配列の対を含むか、又は以下のアミノ酸配列の対の１つを含む：（ａ）配列番号２３９～２４０；（ｂ）配列番号２４３～２４４；（ｃ）配列番号２４５～２４６；（ｄ）配列番号２５３～２５４；（ｅ）配列番号２５５～２５６；（ｆ）配列番号２５７～２５８；（ｇ）配列番号２５９～２６０、若しくは（ｈ）配列番号２６１～２６２。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ｃ２の「改変＊」の列に列挙された奇数の配列番号を有するＦＬ ＬＣアミノ酸配列、及びＦＬ ＬＣ配列番号よりも１大きい配列番号を有するＦＬ ＨＣアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ｃ２の配列番号のいずれか１つの配列の少なくとも一部を含み、その一部は、アミノ酸配列の最初の１００個のアミノ酸、アミノ酸配列の最初の１０５個のアミノ酸、アミノ酸配列の最初の１１０個のアミノ酸、アミノ酸配列の最初の１１５個のアミノ酸、又はアミノ酸配列の最初の１２０個のアミノ酸を含む。様々な例において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ｃ２のアミノ酸配列のＣＤＲの少なくとも２、３、４、５、又は６つを含む。所与の抗体ＨＣ又はＬＣのＣＤＲは、当該技術分野で知られる任意の１つ以上の方法によって決定され得る。
様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその抗原結合断片）は、抗体、抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ）、又は抗体タンパク質生成物、例えば、ｓｃＦｖを含む。様々な態様において、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を含む二価である。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、抗体、抗体の抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ）、又は抗体タンパク質生成物、例えば、ｓｃＦｖを含む。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合部位を含む二価である。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１９２若しくは配列番号２２２、又は配列番号２４０の最初の１０５～１１５個のアミノ酸に高度に類似するＬＣ可変領域アミノ酸配列（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））を含み、このＬＣ可変領域アミノ酸配列は、１位にグルタミン酸（Ｇｌｕ１）若しくはその保存的アミノ酸置換、２７位にグルタミン（Ｇｌｎ２７）若しくはその保存的アミノ酸置換、２８位にセリン（Ｓｅｒ２８）若しくはその保存的アミノ酸置換、９１位にセリン（Ｓｅｒ９１）若しくはその保存的アミノ酸置換、９２位にセリン（Ｓｅｒ９２）若しくはその保存的アミノ酸置換、９３位にセリン（Ｓｅｒ９３）若しくはその保存的アミノ酸置換、９４位にロイシン（Ｌｅｕ９４）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ２８若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｇｌｕ１又はその保存的アミノ酸置換を含むＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｓｅｒ９１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成する、Ｇｌｎ２７又はその保存的アミノ酸置換を含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１９１若しくは配列番号２２１、又は配列番号２３９の最初の１１５～１２７のアミノ酸に高度に類似し（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））、３２位にバリン（Ｖａｌ３２）若しくはその保存的アミノ酸置換、３３位にチロシン（Ｔｙｒ３３）若しくはその保存的アミノ酸置換、５２位にチロシン（Ｔｙｒ５２）若しくはその保存的アミノ酸置換、５４位にチロシン（Ｔｙｒ５４）若しくはその保存的アミノ酸置換、５５位にチロシン（Ｔｙｒ５５）若しくはその保存的アミノ酸置換、５６位にセリン（Ｓｅｒ５６）若しくはその保存的アミノ酸置換、５７位にグリシン（Ｇｌｙ５７）若しくはその保存的アミノ酸置換、５８位にグリシン（Ｇｌｙ５８）若しくはその保存的アミノ酸置換、５９位にトレオニン（Ｔｈｒ５９）若しくはその保存的アミノ酸置換、６０位にチロシン（Ｔｙｒ６０）若しくはその保存的アミノ酸置換、６３位にプロリン（Ｐｒｏ６３）若しくはその保存的アミノ酸置換、６６位にアルギニン（Ａｒｇ６６）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０２位にイソロイシン（Ｉｌｅ１０２）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０４位にアラニン（Ａｌａ１０４）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０７位にグリシン（Ｇｌｙ１０７）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０８位にチロシン（Ｔｙｒ１０８）若しくはその保存的アミノ酸置換１０９位にフェニルアラニン（Ｐｈｅ１０９）若しくはその保存的アミノ酸置換、１１０位にチロシン（Ｔｙｒ１１０）若しくはその保存的アミノ酸置換、１１１位にチロシン（Ｔｙｒ１１１）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｖａｌ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｒｇ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｉｌｅ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１０９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１１若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。様々な態様において、Ｔｙｒ５２、Ｓｅｒ５６、Ｔｈｒ５９、Ｐｈｅ１０９、Ｔｙｒ５５、Ｔｙｒ６０、又はこれらの保存的アミノ酸置換のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成する。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と塩橋を形成する、Ａｒｇ６６又はその保存的アミノ酸置換を含むＨＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な態様において、Ｔｙｒ５２及びＴｈｒ５９は、ＴＩＧＩＴの同じアミノ酸と水素結合を形成する。様々な例において、Ｓｅｒ５６は、ＴＩＧＩＴの２つの異なるアミノ酸と水素結合を形成する。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１２２若しくは２１２若しくは２０１２、又は配列番号２４６の最初の１０５～１１５アミノ酸に高度に類似し（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））、１位にグルタミン酸（Ｇｌｕ１）若しくはその保存的アミノ酸置換、２位にイソロイシン（Ｉｌｅ２）若しくはその保存的アミノ酸置換、２７位にグルタミン（Ｇｌｎ２７）若しくはその保存的アミノ酸置換、２８位にセリン（Ｓｅｒ２８）若しくはその保存的アミノ酸置換、２９位にバリン（Ｖａｌ２９）若しくはその保存的アミノ酸置換、３０位にセリン（Ｓｅｒ３０）若しくはその保存的アミノ酸置換、３１位にセリン（Ｓｅｒ３１）、３２位にトレオニン（Ｔｈｒ３２）若しくはその保存的アミノ酸置換、３３位にチロシン（Ｔｙｒ３３）若しくはその保存的アミノ酸置換、６８位にセリン（Ｓｅｒ６８）若しくはその保存的アミノ酸置換、６９位にグリシン（Ｇｌｙ６９）若しくはその保存的アミノ酸置換、９２位にチロシン（Ｔｙｒ９２）若しくはその保存的アミノ酸置換、９３位にアスパラギン酸（Ａｓｐ９３）若しくはその保存的アミノ酸置換、９４位にバリン（Ｖａｌ９４）若しくはその保存的アミノ酸置換、９５位にセリン（Ｓｅｒ９５）若しくはその保存的アミノ酸置換、９６位にプロリン（Ｐｒｏ９６）若しくはその保存的アミノ酸置換、９７位にトリプトファン（Ｔｒｐ９７）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ２８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ２９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｇｌｕ１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｉｌｅ２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ６８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ６９若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｙｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｐ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ９６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ９７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ａｓｐ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｙ３３若しくはその保存的アミノ酸置換（これらのそれぞれはＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成する）を含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と塩橋を形成する、Ａｓｐ９３又はその保存的アミノ酸置換を含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１２１若しくは配列番号２１１、又は配列番号２４５の最初の１１５～１２７のアミノ酸に高度に類似し（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））、３２位にグリシン（Ｇｌｙ３２）若しくはその保存的アミノ酸置換、３５位にチロシン（Ｔｙｒ３５）若しくはその保存的アミノ酸置換、５２位にチロシン（Ｔｙｒ５２）若しくはその保存的アミノ酸置換、５４位にチロシン（Ｔｙｒ５４）若しくはその保存的アミノ酸置換、５５位にチロシン（Ｔｙｒ５５）若しくはその保存的アミノ酸置換、５６位にセリン（Ｓｅｒ５６）若しくはその保存的アミノ酸置換、５８位にセリン（Ｓｅｒ５８）若しくはその保存的アミノ酸置換、５９位にトレオニン（Ｔｈｒ５９）若しくはその保存的アミノ酸置換、６０位にフェニルアラニン（Ｐｈｅ６０）若しくはその保存的アミノ酸置換、６３位にプロリン（Ｐｒｏ６３）若しくはその保存的アミノ酸置換、６６位にリシン（Ｌｙｓ６６）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０２位にアルギニン（Ａｒｇ１０２）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０４位にアスパラギン（Ａｓｎ１０４）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０５位にトリプトファン（Ｔｒｐ１０５）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０６位にアスパラギン（Ａｓｎ１０６）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０７位にチロシン（Ｔｙｒ１０７）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｇｌｙ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３５若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｙｓ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ａｒｇ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｎ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ１０５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｎ１０６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。様々な態様において、Ｓｅｒ５８、Ａｓｎ１０６、Ｔｙｒ１０７、Ｔｙｒ３５、Ａｒｇ１０２、及びＳｅｒ５６、又はこれらの保存的アミノ酸置換のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成する。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１６２、又は配列番号２６２の最初の１０５～１１５個のアミノ酸に高度に類似し（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））、３０位にアルギニン（Ａｒｇ３０）若しくはその保存的アミノ酸置換、３１位にアルギニン（Ａｒｇ３１）若しくはその保存的アミノ酸置換、３２位にチロシン（Ｔｙｒ３２）若しくはその保存的アミノ酸置換、９１位にセリン（Ｓｅｒ９１）若しくはその保存的アミノ酸置換、９２位にチロシン（Ｔｙｒ９２）若しくはその保存的アミノ酸置換、９３位にセリン（Ｓｅｒ９３）若しくはその保存的アミノ酸置換、９４位にトレオニン（Ｔｈｒ９４）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ａｒｇ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｒｇ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｓｅｒ９１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｙｒ３２、Ｔｙｒ９２、Ｔｈｒ９４、Ａｒｇ３０、Ａｒｇ３１、又はこれらの保存的アミノ酸置換（これらのそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成する）を含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と塩橋を形成する、Ａｒｇ３０又はその保存的アミノ酸置換を含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１６１、又は配列番号２６１の最初の１１５～１２７のアミノ酸に高度に類似し（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））、３０位にトレオニン（Ｔｈｒ３０）若しくはその保存的アミノ酸置換、３１位にグリシン（Ｇｌｙ３１）若しくはその保存的アミノ酸置換、３２位にチロシン（Ｔｙｒ３２）若しくはその保存的アミノ酸置換、３３位にチロシン（Ｔｙｒ３３）若しくはその保存的アミノ酸置換、４７位にトリプトファン（Ｔｒｐ４７）若しくはその保存的アミノ酸置換、５０位にトリプトファン（Ｔｒｐ５０）若しくは保存的アミノ酸、５２位にセリン（Ｓｅｒ５２）若しくはその保存的アミノ酸置換、５４位にトレオニン（Ｔｈｒ５４）若しくはその保存的アミノ酸置換、５５位にセリン（Ｓｅｒ５５）若しくはその保存的アミノ酸置換、５７位にアラニン（Ａｌａ５７）若しくはその保存的アミノ酸置換、５８位にトレオニン（Ｔｈｒ５８）若しくはその保存的アミノ酸置換、５９位にグリシン（Ｇｌｙ５９）若しくはその保存的アミノ酸置換、６０位にチロシン（Ｔｙｒ６０）若しくはその保存的アミノ酸置換、６５位にグルタミン（Ｇｌｎ６５若しくはその保存的アミノ酸置換、１０１位にアスパラギン（Ａｓｎ１０１）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０２位にセリン（Ｓｅｒ１０２）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０３位にバリン（Ｖａｌ１０３）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０４位にロイシン（Ｌｅｕ１０４）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０５位にチロシン（Ｔｙｒ１０５）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０６位にチロシン（Ｔｙｒ１０６）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０７位にチロシン（Ｔｙｒ１０７）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はそれらの任意の組み合わせを含むＨＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｈｒ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｒｐ４７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ５０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｎ６５若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ａｓｎ１０１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ１０３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。様々な態様において、Ｌｅｕ１０４、Ｔｙｒ３３、Ａｓｎ１０１、Ｔｙｒ１０７、Ｔｙｒ６０、Ｓｅｒ５５、Ｓｅｒ５２、又はこれらの保存的アミノ酸置換のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成する。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１３２、又は配列番号２５４の最初の１０５～１１５個のアミノ酸に高度に類似し（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））、２７位にグルタミン酸（Ｇｌｕ２７）若しくはその保存的アミノ酸置換、３０位にロイシン（Ｌｅｕ３０）若しくはその保存的アミノ酸置換、３２位にセリン（Ｓｅｒ３２）若しくはその保存的アミノ酸置換、９６位にセリン（Ｓｅｒ９６）若しくはその保存的アミノ酸置換、９７位にイソロイシン（Ｉｌｅ９７）若しくはその保存的アミノ酸置換、９８位にグルタミン（Ｇｌｎ９８）若しくはその保存的アミノ酸置換、９９位にロイシン（Ｌｅｕ９９）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｓｅｒ９６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｉｌｅ９７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｎ９８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ９９若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｓｅｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、及び／又はＧｌｎ９８若しくはその保存的アミノ酸置換（これらのそれぞれはＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成している）を含むＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基は、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。
例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、配列番号１３１、又は配列番号２５３の最初の１１５～１２７個のアミノ酸に高度に類似し（例えば、少なくとも又は約７０％の配列同一性（例えば、少なくとも又は約８０％の配列同一性、少なくとも又は約９０％の配列同一性、少なくとも又は約９５％の配列同一性））、３３位にアスパラギン酸（Ａｓｐ３３）若しくはその保存的アミノ酸置換、５２位にチロシン（Ｔｙｒ５２）若しくはその保存的アミノ酸置換、５４位にチロシン（Ｔｙｒ５４）若しくはその保存的アミノ酸置換、５５位にチロシン（Ｔｙｒ５５）若しくはその保存的アミノ酸置換、５６位にセリン（Ｓｅｒ５６）若しくはその保存的アミノ酸置換、５７位にグリシン（Ｇｌｙ５７）若しくはその保存的アミノ酸置換、５８位にグリシン（Ｇｌｙ５８）若しくはその保存的アミノ酸置換、５９位にトレオニン（Ｔｈｒ５９）若しくはその保存的アミノ酸置換、６０位にチロシン（Ｔｙｒ６０）若しくはその保存的アミノ酸置換、６３位にプロリン（Ｐｒｏ６３）若しくはその保存的アミノ酸置換、６６位にリシン（Ｌｙｓ６６）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０２位にイソロイシン（Ｉｌｅ１０２）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０４位にアラニン（Ａｌａ１０４）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０７位にグリシン（Ｇｌｙ１０７）若しくはその保存的アミノ酸置換、１０８位にチロシン（Ｔｙｒ１０８）若しくはその保存的アミノ酸置換１０９位にフェニルアラニン（Ｐｈｅ１０９）若しくはその保存的アミノ酸置換、１１０位にチロシン（Ｔｙｒ１１０）若しくはその保存的アミノ酸置換、１１１位にチロシン（Ｔｙｒ１１１）若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ可変領域アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ａｓｐ３３又はその保存的アミノ酸置換を含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｙｓ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＩＧＩＴ抗体は、Ｉｌｅ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１０９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１１１若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。様々な態様において、Ｔｙｒ５２、Ｓｅｒ５６、Ｔｈｒ５９、Ｔｙｒ６０、Ｐｈｅ１０９、Ｔｙｒ５４、Ｔｙｒ５５、Ｌｙｓ６６、又はこれらの保存的アミノ酸置換のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸と水素結合を形成する。様々な態様において、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、例えば、ＴＩＧＩＴ抗体が、ＴＩＧＩＴに結合する場合、上で名付けたアミノ酸残基のそれぞれは、ＴＩＧＩＴのアミノ酸から約３オングストローム～約４オングストロームの所に位置する。
例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるように、一組の電荷対変異を含む重鎖アミノ酸配列を含む。特定の態様では、重鎖アミノ酸配列は、Ｖ１、Ｖ１０３、及びＶ１３１電荷対変異から選択される電荷対変異を含む。
さらなる例示的な態様では、抗原結合タンパク質は、半減期／安定性を改善するために、又は抗体を発現／製造可能性により適したものにするために、天然に存在する対応物と比較して１つ以上のアミノ酸の改変を含む。例示的な例では、抗原結合タンパク質は、ＦｃとＦｃ受容体との間の相互作用を阻止又は低減するように設計される。例示的な例において、抗原結合タンパク質は、Ｆｃγ受容体と相互作用する能力を欠く定常領域を含む安定エフェクター機能不全（ＳＥＦＬ）抗体である。ＳＥＦＬ抗体は当該技術分野で知られている。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２９２：１８７６－１８８３（２０１６）；及びＪａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２９２：１８６５－１８７５（２０１７）を参照されたい。例示的な態様では、ＳＥＦＬ抗体は、ＥＵシステムにより番号付けされた、以下の変異の１つ以上を含む：Ｌ２４２Ｃ、Ａ２８７Ｃ、Ｒ２９２Ｃ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０２Ｃ、Ｌ３０６Ｃ及び／又はＫ３３４Ｃ。例示的な態様では、ＳＥＦＬ抗体はＮ２９７Ｇを含む。例示的な態様では、ＳＥＦＬ抗体は、Ａ２８７Ｃ、Ｎ２９７Ｇ、及びＬ３０６Ｃを含む。他の例示的な態様では、ＳＥＦＬ抗体は、Ｒ２９２Ｃ、Ｎ２９７Ｇ、及びＶ３０２Ｃ（すなわち、ＳＥＦＬ２－２）を含む。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、配列番号２０１９のアミノ酸配列、任意選択により配列番号２０２０を含む重鎖を含む。
様々な態様において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ１、ＶＨ３又はＶＨ４ファミリーのＶ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＤ１、Ｄ３、Ｄ５、Ｄ６又はＤ７ファミリーのＤ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な態様において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＪＨ４又はＪＨ６ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。任意選択により、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ３ファミリーのＶ遺伝子セグメント、及び遺伝子セグメントのＤ１、Ｄ３若しくはＤ６ファミリーのＤ遺伝子セグメント、及び／又は遺伝子セグメントのＪＨ４若しくはＪＨ６ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な例において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ３ファミリーのＶ遺伝子セグメント、遺伝子セグメントのＤ１ファミリーのＤ遺伝子セグメント、及び遺伝子セグメントのＪＨ６ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な例において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ３ファミリーのＶ遺伝子セグメント、遺伝子セグメントのＤ３ファミリーのＤ遺伝子セグメント、及び遺伝子セグメントのＪＨ６ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な例において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ３ファミリーのＶ遺伝子セグメント、遺伝子セグメントのＤ６ファミリーのＤ遺伝子セグメント、及び遺伝子セグメントのＪＨ６ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な例において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ１ファミリーのＶ遺伝子セグメント、遺伝子セグメントのＤ５ファミリーのＤ遺伝子セグメント、及び遺伝子セグメントのＪＨ６ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な例において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ４ファミリーのＶ遺伝子セグメント、遺伝子セグメントのＤ７ファミリーのＤ遺伝子セグメント、及び遺伝子セグメントのＪＨ６ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。様々な例において、抗原結合タンパク質は、遺伝子セグメントのＶＨ３ファミリーのＶ遺伝子セグメント、遺伝子セグメントのＤ１ファミリーのＤ遺伝子セグメント、及び遺伝子セグメントのＪＨ４ファミリーのＪ遺伝子セグメントによってコードされるＨＣ可変領域を含む抗体である。
ポリペプチド
表Ａ１若しくは表Ａ２若しくは表Ｂ１若しくは表Ｂ２若しくは表Ｃ１若しくは表Ｃ２の１つ以上のアミノ酸配列を含むか、実質的にそれからなるか、又はそれからなるポリペプチドが、本明細書において提供される。様々な態様において、ポリペプチドは、介在アミノ酸を有する表Ａ１又は表Ａ２のＣＤＲのうちの６つを含む。様々な態様において、ポリペプチドは、表Ｂ１又は表Ｂ２のＨＣ可変アミノ酸配列又はＬＣ可変アミノ酸配列のうちの１つのみを含む。様々な態様において、ポリペプチドは、１つの配列として融合された表Ｂ１又は表Ｂ２のＨＣ可変アミノ酸配列及びＬＣ可変アミノ酸配列の両方を含み、ここで、任意選択により、ＨＣ可変アミノ酸配列及びＬＣ可変アミノ酸配列は、リンカー配列によって連結される。様々な例において、ポリペプチドは、ＨＣ可変領域配列の２つのコピー及びＬＣ可変領域配列の２つのコピーを含み、これらは、任意選択により、リンカー配列と連結される。いくつかの態様では、ポリペプチドは、ｓｃＦｖ１、ｓｃＦｖ２又は（ｓｃＦｖ）２のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ポリペプチドは、ダイアボディ、トリアボディ、単一ドメイン抗体、単一可変ドメイン、タンデムｓｃＦｖ、ｔａｓｃＦｖなどのアミノ酸配列を含む。様々な態様において、ポリペプチドは、表Ｂ１又は表Ｂ２又は表Ｃ１又は表Ｃ２のＦＬ ＨＣアミノ酸配列又はＦＬ ＬＣアミノ酸配列のうちの１つのみを含む。様々な態様において、ポリペプチドは、１つの配列として融合された表Ｂ１又は表Ｂ２又は表Ｃ１又は表Ｃ２のＦＬ ＨＣアミノ酸配列及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列の両方を含み、任意選択により、ＦＬ ＨＣ及びＦＬ ＬＣは、リンカー配列によって連結される。例示的な態様では、ポリペプチドは、表Ａ１又は表Ａ２又は表Ｂ１又は表Ｂ２又は表Ｃ１又は表Ｃ２のアミノ酸配列を含む親配列のバリアント配列を含む。様々な態様において、ポリペプチドは、親配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上のアミノ酸のみが異なるアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ポリペプチドは、親配列と比較して、１つ又は２つのアミノ酸のみが異なるバリアント配列を含む。例示的な態様では、ポリペプチドは、上記のアミノ酸配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の保存的アミノ酸置換のみを有するバリアント配列を含む。
例示的な態様では、ポリペプチドは、親アミノ酸配列に対して約３０％以上、約５０％以上、又は約７０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ポリペプチドは、親配列に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ポリペプチドは、親配列の全長に沿って、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例示的な態様では、ポリペプチドは、親配列の全長に沿って、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本開示の代替又は追加の実施形態では、ポリペプチドは、本明細書にさらに記載されるように、脂質付加（例えば、ミリストイル化、パルミトイル化）、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、アシル化、アセチル化、環化、若しくは酸付加塩への変換、及び／又は任意選択で、二量体化若しくは重合、若しくはコンジュゲート化される。
本明細書では、本開示のポリペプチドを模倣するように設計されたペプチド模倣体が提供される。ペプチド模倣体は、本開示のポリペプチドと構造が実質的に類似しているが、少なくとも１つの構造的差異を有する。例えば、ペプチド模倣体は、１つ以上のペプチド結合を置換する際に１つ以上の結合を有するペプトイドである。例示的な例において、ペプトイドは、ペプチドにおけるようなα－炭素の代わりに、ペプチド骨格の窒素に連結された側鎖を含む。いくつかの態様では、本開示のペプトイドは、ペプチド及びタンパク質中の二次構要素の多くに関与するアミド水素を欠く。例えば、Ｒｅｙｎａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ８９（２０）：９３６７－９３７１（１９９２）を参照されたい。
ペプチド模倣体、及びその作製方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ １ａｎｄ２、ｅｄ．，Ａｂｅｌｌ，Ａ．，ＪＡＩ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｇｒｅｅｎｗｉｃｈ，ＣＴ，２００６を参照されたい。いくつかの態様では、ペプチド模倣体は、Ｄ－異性体アミノ酸を含むＤ－ペプチドのペプチド模倣体である。いくつかの態様では、ペプチド模倣体は、アミノ酸の側鎖がペプチド骨格のアルファ窒素原子に結合しているペプトイドである。ペプトイドを作製する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＣＳ １１４（２６）：１０６４６－１０６４７（１９９２）及びＤｅｓｉｇｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｐｅｐｔｏｉｄｓ，Ｆｏｗｌｅｒ，Ｓａｒａｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ－Ｍａｄｉｓｏｎ，２００８を参照されたい。いくつかの態様では、ペプチド模倣体は、アルファ炭素ではなくβ炭素に結合したアミノ基を有するβアミノ酸を含むβ－ペプチドである。β－ペプチドを作製する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｓｅｅｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ Ｃｈｉｍｉｃａ Ａｃｔａ７９（４）：９１３－９４１（１９９６）を参照されたい。
アプタマー
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、アプタマーである。コンビナトリアル科学の分野における最近の進歩は、所与の標的に対して高い親和性及び特異性を有する短いポリマー配列（例えば、オリゴ核酸又はペプチド分子）を同定した。例えば、ＳＥＬＥＸ技術は、哺乳動物抗体に匹敵する結合特性を有するＤＮＡ及びＲＮＡアプタマーを同定するために使用されており、免疫学の分野では、無数の化合物に結合する抗体又は抗体断片が生成及び単離されており、また非常に好ましい結合特性を有する新規ペプチド配列を発見するためにファージディスプレイが利用されている。これらの分子進化技術の成功に基づいて、任意の標的分子に結合する分子を作製し得ることは確かである。以下の例のように、ループ構造が所望の結合属性を提供することに多くの場合関与している：相補的塩基対形成を伴わない短い領域から作製されたヘアピンループをしばしば利用するアプタマー、ループ状超可変領域のコンビナトリアル配列を利用する天然由来の抗体、及び線状ペプチドファージディスプレイ結果と比較して改善された結果を示した環状ペプチドを利用する新規ファージディスプレイライブラリー。したがって、コンビナトリアル分子進化技術によって高親和性リガンドを作製し、同定することができることを示唆する十分な証拠が得られている。本開示では、分子進化技術を使用して、ＴＩＧＩＴとＣＤ１５５又はＣＤ１１２ＲとＣＤ１１２との間の結合相互作用を阻害するＴＩＧＩＴ又はＣＤ１１２Ｒに特異的な化合物を単離することができる。アプタマーの詳細については、一般に、Ｇｏｌｄ，Ｌ．，Ｓｉｎｇｅｒ，Ｂ．，Ｈｅ，Ｙ．Ｙ．，Ｂｒｏｄｙ． Ｅ．，”Ａｐｔａｍｅｒｓ Ａｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７４：５－１３（２０００）を参照されたい。アプタマーを生成するための関連技術は、米国特許第 ６，６９９，８４３号明細書に見出すことができ、この文献は参照によりその全体が組み込まれる。
コンジュゲート
本開示はまた、異種部分に連結された本開示の抗原結合タンパク質の１つ又は複数を含むコンジュゲートを提供する。本明細書で使用される場合、用語「異種部分」は、用語「コンジュゲート部分」と同義であり、本明細書に記載の抗原結合タンパク質とは異なる任意の分子（化学的又は生化学的、天然起源又は非コード化）を指す。本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれかに連結され得る例示的なコンジュゲート部分としては、以下に限定されないが、異種ペプチド若しくはポリペプチド、標的化剤、放射性同位体、フルオロフォア若しくは酵素標識などの診断標識、水溶性ポリマーを含むポリマー、又は他の治療薬若しくは診断薬が挙げられる。いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の１つ以上と、ペプチド（本明細書に記載の抗原結合タンパク質とは異なる）、ポリペプチド、核酸分子、別の抗体又はその断片、ポリマー、量子ドット、小分子、毒素、診断薬、炭水化物、アミノ酸の１つ以上とを含む。
例示的な実施形態では、本開示のコンジュゲートは、本明細書に記載の抗原結合タンパク質と、ポリペプチド（例えば、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のいずれかとは異なるポリペプチド）である異種部分とを含み、コンジュゲートは、融合ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又はキメラタンパク質若しくはキメラポリペプチドである。そのようなコンジュゲートのさらなる説明は、本明細書において「融合タンパク質」の下で提供される。
いくつかの実施形態では、異種部分は、非共有結合又は共有結合によって、本開示の抗原結合タンパク質に結合される。例示的な態様では、抗原結合タンパク質と異種部分との間の結合は、共有化学結合、例えば、ペプチド結合、ジスルフィド結合などによって、又は物理的な力、例えば、静電、水素、イオン、ファンデルワールス、又は疎水性若しくは親水性相互作用によって達成される。例えば、ビオチン－アビジン、リガンド／受容体、酵素／基質、核酸／核酸結合タンパク質、脂質／脂質結合タンパク質、細胞接着分子パートナー；又は互いに親和性を有する任意の結合パートナー若しくはその断片を含む、様々な非共有結合系を使用することができる。
例示的な実施形態における抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の標的アミノ酸残基を、これらの標的アミノ酸の選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって、直接共有結合を介してコンジュゲート部分に連結される。抗原結合タンパク質又はコンジュゲート部分上の反応性基としては、例えば、アルデヒド、アミノ、エステル、チオール、α－ハロアセチル、マレイミド又はヒドラジノ基が挙げられる。誘導体化剤としては、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介するコンジュゲーション）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸又は当該技術分野で知られた他の薬剤が挙げられる。或いは、コンジュゲート部分は、多糖又はポリペプチド担体などの中間担体を介して間接的に抗原結合タンパク質に連結することができる。多糖担体の例としては、アミノデキストランが挙げられる。好適なポリペプチド担体の例としては、ポリリシン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、これらのコポリマー、及びこれらのアミノ酸と得られる担持担体に望ましい溶解特性を付与する他のもの、例えばセリンとの混合ポリマーが挙げられる。
システイニル残基は、最も一般的には、α－ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、アルファ－ブロモ－β－（５－イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ－アルキルマレイミド、３－ニトロ－２－ピリジルジスルフィド、メチル２－ピリジルジスルフィド、ｐ－クロロメルクリ安息香酸、２－クロロメルクリ－４－ニトロフェノール、又はクロロ－７－ニトロベンゾ－２－オキサ－１，３－ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５～７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化され、なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ－ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり、この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ－アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ－メチルイソ尿素、２，４－ペンタンジオン、及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
アルギニル残基は、１つ又は複数の従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３－ブタンジオン、１，２－シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応により修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リシンの基及びアルギニンイプシロン－アミノ基と反応し得る。
チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ－アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ－アセチルチロシル種及び３－ニトロ誘導体を形成する。
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’－Ｎ＝Ｃ＝Ｎ－Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、任意選択的に異なるアルキル基、例えば１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリニル－４－エチル）カルボジイミド又は１－エチル－３－（４－アゾニア－４，４－ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
他の修飾としては、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル残基又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン側鎖、アルギニン側鎖、及びヒスチジン側鎖のアルファ－アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９－８６（１９８３）），アスパラギン又はグルタミンの脱アミド化、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び／又はＣ末端カルボン酸基のアミド化若しくはエステル化が挙げられる。
別のタイプの共有結合修飾は、グリコシドを抗原結合タンパク質に化学的に又は酵素によりカップリングすることを含む。糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、トレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ ａｎｄ Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９－３０６（１９８１）に記載されている。
例示的な態様では、異種部分は、リンカーを介して本開示の抗原結合タンパク質に結合される。いくつかの態様では、リンカーは、１～約６０個、又は１～３０個若しくはそれ以上、２～５個、２～１０個、５～１０個、又は１０～２０個原子長の原子の鎖を含む。いくつかの実施形態では、鎖原子は全て炭素原子である。いくつかの実施形態では、リンカーの骨格中の鎖原子は、Ｃ、Ｏ、Ｎ、及びＳからなる群から選択される。鎖原子及びリンカーは、より可溶性のコンジュゲートを提供するために、それらの予想される溶解度（親水性）によって選択され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、標的の組織又は器官又は細胞において見出される酵素又は他の触媒又は加水分解条件による切断を受ける官能基を提供する。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、立体障害の可能性を低減するのに十分な長さである。リンカーが共有結合又はペプチジル結合であり、コンジュゲートがポリペプチドである場合、コンジュゲート全体は融合タンパク質であり得る。そのようなペプチジルリンカーは、任意の長さであってよい。例示的なペプチジルリンカーは、長さが約１～５０アミノ酸、５～５０アミノ酸、３～５アミノ酸、５～１０アミノ酸、５～１５アミノ酸、又は１０～３０アミノ酸長であり、可撓性又は剛性である。例示的な態様では、リンカーは、約２～約２０個のアミノ酸を含むペプチドである。例示的な態様では、リンカーは、約２～約１５個のアミノ酸、約２～約１０個のアミノ酸、又は約２～約５個のアミノ酸を含むペプチドである。好適なペプチドリンカーは、当該技術分野で知られている。例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６５（１０）：１３５７－１３６９（２０１３）；Ａｒａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ Ｄｅｓ Ｓｅｌ １４（８）：５２９－５３２（２００１）；及びＷｒｉｇｇｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ８０（６）：７３６－７４６（２００５）を参照されたい。様々な態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳ（配列番号２０２１）を含むペプチドである。
融合タンパク質
例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質のいずれとも異なるポリペプチドに連結され、コンジュゲートは、融合ポリペプチド若しくは融合タンパク質、又はキメラタンパク質若しくはキメラポリペプチドである。したがって、本開示は、本開示の抗原結合タンパク質及び異種ポリペプチド又はペプチドを含む融合ポリペプチド又は融合タンパク質を提供する。例示的な態様では、本開示の融合タンパク質は、ＬＣ可変アミノ酸配列に融合されたＨＣ可変アミノ酸配列又はＦＬ ＬＣ配列に融合されたＦＬ ＨＣ配列を含む。様々な態様において、融合タンパク質は、ＨＣ可変アミノ酸配列とＬＣ可変アミノ酸配列との間、又はＦＬ ＨＣ配列とＦＬ ＬＣ配列との間にペプチドリンカーを含む
核酸
本開示はさらに、本開示の抗原結合タンパク質又はポリペプチド又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。「核酸」は、本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」を含み、一般にＤＮＡ若しくはＲＮＡのポリマー又はその修飾形態を意味し、これは、一本鎖又は二本鎖であり得、合成されるか又は天然起源から獲得され（例えば、単離及び／又は精製され）され得、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含有し得、また、非修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド間で見られるホスホジエステルの代わりに、例えばホスホロアミダート結合又はホスホロチオエート結合などの天然、非天然又は改変ヌクレオチド間結合を含有し得る。核酸は、本開示の抗原結合タンパク質又はポリペプチドのいずれかをコードする任意のヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの実施形態では、核酸は、挿入、欠失、反転、及び／又は置換を全く含まない。他の実施形態では、核酸は、１つ以上の挿入、欠失、反転、及び／又は置換を含む。
いくつかの態様では、本開示の核酸は組換え体である。本明細書で使用される場合、用語「組換え体」は、（ｉ）天然又は合成核酸セグメントを、生細胞中で複製することができる核酸分子に連結することによって生細胞外で構築される分子、又は（ｉｉ）上記（ｉ）に記載されるものの複製から生じる分子を指す。本明細書の目的のために、複製は、インビトロ複製又はインビボ複製であり得る。
いくつかの態様での核酸は、当該技術分野で知られる手順を使用して、化学合成及び／又は酵素によるライゲーション反応に基づいて構築される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）を参照されたい。例えば、核酸は、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性が向上するように又はハイブリッド形成時に形成される二本鎖の物理的安定性が向上するように設計された様々に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチド）を使用して化学的に合成することができる。核酸を生成させるために使用し得る修飾ヌクレオチドの例としては、以下に限定されないが、５－フルオロウラシル、５－ブロモウラシル、５－クロロウラシル、５－ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４－アセチルシトシン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ－Ｄ－ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデニン、１－メチルグアニン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアニン、２－メチルアデニン、２－メチルグアニン、３－メチルシトシン、５－メチルシトシン、Ｎ－置換アデニン、７－メチルグアニン、５－メチルアンモメチルウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオウラシル、ベータ－Ｄ－マンノシルケオシン、５’－メトキシカルボキシメチルウラシル、５－メトキシウラシル、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデニン、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトシン、シュードウラシル、ケオシン、２－チオシトシン、５－メチル－２－チオウラシル、２－チオウラシル、４－チオウラシル、５－メチルウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、３－（３－アミノ－３－Ｎ－２－カルボキシプロピル）ウラシル、及び２，６－ジアミノプリンが挙げられる。或いは、本開示の核酸の１つ以上は、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ（Ｆｏｒｔ Ｃｏｌｌｉｎｓ、ＣＯ）及びＳｙｎｔｈｅｇｅｎ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）などの会社から購入することができる。
様々な態様において、核酸は、本開示の抗原結合タンパク質又はポリペプチド又は融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、核酸は、表Ａ１又は表Ａ２又は表Ｂ１又は表Ｂ２又は表Ｃ１又は表Ｃ２に列挙される配列番号を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、ヌクレオチド配列は、介在アミノ酸を有する表Ａ１又は表Ａ２のＣＤＲのうちの６つを含むアミノ酸配列をコードする。様々な態様において、ヌクレオチド配列は、表Ｂ１又は表Ｂ２のＨＣ可変又はＬＣ可変アミノ酸配列のうちの１つのみをコードする。様々な態様において、ヌクレオチド配列は、１つの配列として融合された表Ｂ１又は表Ｂ２のＨＣ可変アミノ酸配列及びＬＣ可変アミノ酸配列の両方をコードし、ここで、任意選択により、ＨＣ可変アミノ酸配列及びＬＣ可変アミノ酸配列は、リンカー配列によって連結されている。様々な例において、ヌクレオチド配列は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする。様々な態様において、ヌクレオチド配列は、表Ｂ１又は表Ｂ２又は表Ｃ１又は表Ｃ２のＦＬ ＨＣ又はＦＬ ＬＣアミノ酸配列のうちの１つのみをコードする。様々な態様において、ヌクレオチド配列は、１つの配列として融合された表Ｂ１又は表Ｂ２又は表Ｃ１又は表Ｃ２のＦＬ ＨＣアミノ酸配列及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列の両方のアミノ酸配列を含み、ここで、任意選択により、ＦＬ ＨＣ及びＦＬ ＬＣは、リンカー配列によって連結されている。例示的な態様では、ヌクレオチド配列は、表Ａ１又は表Ａ２又は表Ｂ１又は表Ｂ２又は表Ｃ１又は表Ｃ２のアミノ酸配列を含む親配列のバリアント配列をコードする。様々な態様において、ヌクレオチド配列は、親配列に対して１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上のアミノ酸のみが異なるアミノ酸配列をコードする。例示的な態様では、ヌクレオチド配列は、親配列と比較して、１つ又は２つのアミノ酸のみが異なるバリアント配列をコードする。例示的な態様では、ヌクレオチド配列は、上記のアミノ酸配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又はそれ以上の保存的アミノ酸置換のみを有するバリアント配列をコードする。例示的な態様では、核酸は、表Ｄに示すように、配列番号２０３７～２０９２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。様々な例において、配列番号２０３７～２０９２いずれか１つのヌクレオチド配列は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、本開示の核酸は、シグナル配列をコードするヌクレオチド配列を含まない、配列番号２０３７～２０９２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。様々な態様において、核酸は、配列番号２０３７～２０９２のいずれか１つの最初の６０、６３、６６、又は６９の核酸を含まない、配列番号２０３７～２０９２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
ベクター
いくつかの態様では、本開示の核酸はベクターに組み込まれる。これに関して、本開示は、本開示の核酸のいずれかを含むベクターを提供する。例示的な態様では、ベクターは組換え発現ベクターである。本明細書の目的のためには、用語「組換え発現ベクター」は、コンストラクトがｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む場合、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドの発現を可能にする遺伝子改変オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドコンストラクトを意味し、ベクターは、細胞内で発現されるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドを有するのに十分な条件下で細胞と接触される。本開示のベクターは、全体として天然には存在しない。しかしながら、ベクターの一部は、天然に存在することができる。本開示のベクターは、任意のタイプのヌクレオチド（例えばＤＮＡ及びＲＮＡを含むが、これらに限定されない）を含むことができ、これは一本鎖又は二本鎖であり得、合成又は天然源から部分的に得られ得、また、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含有し得る。ベクターは、天然に存在する若しくは天然に存在しないヌクレオチド間結合、又は両方のタイプの結合を含むことができる。いくつかの態様では、改変されたヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチド間結合は、ベクターの転写又は複製を妨げない。
本開示のベクターは、任意の好適なベクターであり得、任意の適切な宿主を形質転換又はトランスフェクトするために使用され得る。好適なベクターとしては、増殖及び拡大のために、又は発現のために、又はその両方のために設計されたもの、例えば、プラスミド及びウイルスが挙げられる。ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＬａＪｏＩＩａ、ＣＡ）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）からなる群から選択することができる。λＧＴＩＯ、λＧＴｌ１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４、及びλＮＭｌ１４９などのバクテリオファージベクターもまた使用することができる。植物発現ベクターの例としては、ｐＢＩＯｌ、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。動物発現ベクターの例としては、ｐＥＵＫ－Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。いくつかの態様では、ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターである。
本開示のベクターは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（前出）、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（前出）ａに記載されている標準的な組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる。環状又は直鎖状である発現ベクターのコンストラクトは、原核又は真核宿主細胞において機能的な複製系を含むように調製することができる。複製系は、例えば、ＣｏＩＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｉｌｌｏｍａ ｖｉｒｕｓ）などに由来し得る。
いくつかの態様では、ベクターは、ベクターが導入される宿主（例えば、細菌、真菌、植物、又は動物）のタイプに特異的であり、必要に応じて、ベクターがＤＮＡベースであるかＲＮＡベースであるかどうかを考慮して、転写及び翻訳の開始及び終止コドンなどの調節配列を含む。
ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする１つ又は複数のマーカー遺伝子を含むことができる。マーカー遺伝子には、殺生物剤耐性、例えば、抗生物質、重金属などに対する耐性、栄養要求性宿主における原栄養性を提供する相補性などが含まれる。本開示の発現ベクターに好適なマーカー遺伝子としては、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
ベクターは、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（その機能的部分及び機能的変異体を含む）、又は抗原結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に相補的であるか又はハイブリダイズするヌクレオチド配列に作動可能に連結された天然又は規範的プロモーターを含むことができる。プロモーター、例えば、強い、弱い、誘導性、組織特異的及び発生特異的なプロモーターの選択は、当業者の技能の範囲内である。同様に、ヌクレオチド配列とプロモーターとの組み合わせも、当業者の技能の範囲内である。プロモーターは、非ウイルスプロモーター又はウイルスプロモーター、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＲＳＶプロモーター、及びマウス幹細胞ウイルスの長末端反復中に見出されるプロモーターであり得る。
いくつかの態様において、ベクターは、抗体軽鎖、抗体重鎖、又は抗体軽鎖及び重鎖をコードする。抗体軽鎖をコードするベクターは、抗体重鎖をコードするベクターをさらに含む細胞において発現する場合、本発明の抗体を産生するために有用であり得る。同様に、抗体重鎖をコードするベクターは、抗体軽鎖をコードするベクターをさらに含む細胞において発現する場合、本発明の抗体を産生するために有用であり得る。したがって、軽鎖及び重鎖の両方が単一のベクター上にコードされ得るが、特定の実施形態ではベクターは軽鎖をコードするが、重鎖をコードしない。他の実施形態では、ベクターは重鎖をコードするが、軽鎖をコードしない。
様々な態様において、本発明のベクターは、ＨＣ可変領域又は完全長ＨＣをコードするヌクレオチド配列、及びＬＣ可変領域又は完全長ＬＣをコードするヌクレオチド配列を含む。代替の態様では、本開示のベクターは、表Ｂ１、Ｃ１、Ｂ２若しくはＣ２に記載されるＨＣ可変領域若しくは完全長ＨＣをコードするヌクレオチド配列、又は表Ｂ１、Ｃ１、Ｂ２若しくはＣ２に記載されるＬＣ可変領域若しくは完全長ＬＣをコードするヌクレオチド配列を含む。
宿主細胞
本明細書では、本開示の１つ又は複数の核酸又はベクターを含む宿主細胞が提供される。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本明細書に開示されるベクターを含有することができ、且つ核酸（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質）によってコードされる発現産物を産生することができる任意のタイプの細胞を指す。いくつかの態様における宿主細胞は、接着細胞又は懸濁細胞、すなわち、懸濁液中で増殖する細胞である。例示的な態様における宿主細胞は、培養細胞又は初代細胞、すなわち、生物から直接単離されたものである。宿主細胞は、任意の細胞型のものであり得、任意の型の組織に由来し得、任意の発達段階のものであり得る。
例示的な態様では、細胞は、真核細胞であり、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生生物細胞、藻類細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような宿主細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照されたい。例示的な態様では、真核細胞は哺乳動物細胞である。例示的な態様では、哺乳動物細胞は非ヒト哺乳動物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びその誘導体（例えば、ＣＨＯ－Ｋ１、ＣＨＯ ｐｒｏ－３、ＣＳ９）、マウス骨髄腫細胞（例えば，ＮＳ０、ＧＳ－ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）活性を欠くように操作された細胞（例えばＤＵＫＸ－Ｘ１１、ＤＧ４４）、ヒト胚性腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞又はその誘導体（例えば，ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３－ＥＢＮＡ）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば，ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば，ＨｅＬａ）、ヒト骨の骨肉腫上皮細胞Ｕ２－ＯＳ、腺癌ヒト肺胞基底上皮細胞Ａ５４９、ヒト線維肉腫細胞ＨＴ１０８０、マウス脳腫瘍細胞ＣＡＤ、胚性癌腫細胞Ｐ１９、マウス胚性繊維芽細胞ＮＩＨ ３Ｔ３、マウス繊維芽細胞Ｌ９２９、マウス神経芽腫細胞Ｎ２ａ、ヒト乳癌細胞ＭＣＦ－７、網膜芽腫細胞Ｙ７９、ヒト網膜芽腫細胞ＳＯ－Ｒｂ５０、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２、マウスＢ骨髄腫細胞Ｊ５５８Ｌ，又は新生児ハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（Ｇａｉｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ．２００７；Ｋｈａｎ，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ ３（２）：２５７－２６３（２０１３））である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＳ９（ＣＨＯ細胞株）である。
ベクターを増幅又は複製する目的のために、宿主細胞は、いくつかの態様において、原核細胞、例えば、細菌細胞である。
本明細書に記載の少なくとも１種の宿主細胞を含む細胞の集団もまた、本開示によって提供される。いくつかの態様における細胞の集団は、ベクターを全く含まない少なくとも１種の他の細胞に加えて、記載されるベクターを含む宿主細胞を含む、異種集団である。或いは、いくつかの態様では、細胞の集団は、実質的に均質な集団であり、その集団はベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、実質的にそれからなる）。いくつかの態様における集団は、集団の全ての細胞がベクターを含むように、集団の全ての細胞がベクターを含む単一の宿主細胞のクローンである細胞のクローン集団である。本開示の例示的な実施形態では、細胞集団は、本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。
本開示の様々な態様において、宿主細胞は、表Ｂ１、Ｃ１、Ｂ２若しくはＣ２に記載されるＨＣ可変領域若しくは完全長ＨＣをコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクターと、又は表Ｂ１、Ｃ１、Ｂ２若しくはＣ２に記載されるＬＣ可変領域若しくは完全長ＬＣをコードするヌクレオチド配列を含む第２のベクターとを含む。
医薬組成物
本開示の抗原結合タンパク質（例えば、ＴＩＧＩＴ結合タンパク質、ＣＤ１１２Ｒ結合タンパク質）、ポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、コンジュゲート、本開示の融合タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む組成物が、本明細書において提供される。いくつかの態様における組成物は、本開示の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、若しくは宿主細胞、又はこれらの組み合わせを、単離及び／又は精製された形態で含む。いくつかの態様では、組成物は、本開示の結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞の単一のタイプ（例えば、構造）を含むか、又は本開示の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞の２つ以上の異なるタイプ（例えば、異なる構造）の組み合わせを含む。
例示的な態様では、組成物は、抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞の化学物理学的特徴を、例えば、特定の温度（例えば、室温）での安定化、貯蔵寿命の増加、分解（例えば、酸化プロテアーゼ媒介分解）の減少、抗原結合タンパク質の半減期の増加などによって増強する薬剤を含む。いくつかの態様では、組成物は、異種部分又はコンジュゲート部分として、本明細書に開示される薬剤のいずれかを、任意選択により、本開示の抗原結合タンパク質又はポリペプチドとの混合物中に、含む。
本開示の例示的な態様では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞（以下、「活性薬剤」と称する）は、薬学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤とともに、活性薬剤を含む医薬組成物に製剤化される。この点に関して、本開示は、対象、例えば哺乳動物への投与が意図される、活性薬剤を含む医薬組成物を提供する。
いくつかの実施形態では、活性薬剤は、患者への投与に好適な純度レベルで医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、活性薬剤は、少なくとも約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の純度レベル、及び薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を有する。いくつかの実施形態では、この組成物は、約０．００１～約３０．０ｍｇ／ｍｌの濃度で界面活性剤を含む。
例示的な態様では、本医薬組成物は、薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」という用語には、標準的な医薬担体、例えば、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水又は水／油エマルションなどのエマルション、及び様々なタイプの湿潤剤のいずれかが含まれる。この用語はまた、米国連邦政府の規制当局により承認されるか又はヒトを含む動物での使用に対する米国薬局方に列挙される薬剤のいずれかも包含する。
本医薬組成物は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアゾール噴射剤、排気剤、アルカリ化剤、固結防止剤、抗凝固剤、抗菌性保存剤、抗酸化剤、防腐剤、基剤、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、界面活性剤、希釈剤、消毒剤、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、色素、軟化剤、乳化剤、エマルション安定化剤、充填剤、膜形成剤、風味増強剤、香味剤、流動促進剤、ゲル化剤、造粒剤、保水剤、滑沢剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏剤、油性ビヒクル、有機基剤、香錠基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、保存剤、金属イオン封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶媒、安定化剤、坐剤基剤、表面活性剤、界面活性物質、懸濁化剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、等張化剤、毒性剤、粘度上昇剤、吸水剤、水混和性共溶媒、硬水軟化剤、又は湿潤剤を含む任意の薬学的に許容される成分を含むことができる。例えば、ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）を参照されたい。この文献は、その全体が参照により援用される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）、この文献は、その全体が参照により援用される。
例示的な態様では、本医薬組成物は、使用される投与量及び濃度で受容者にとって無毒性の製剤材料を含む。特定の実施形態では、活性剤、及び１種又は複数種の薬学的に許容される塩、ポリオール、界面活性物質、浸透圧平衡剤、等張化剤、抗酸化剤、抗生物質、抗真菌剤、増量剤、凍結乾燥保護剤、消泡剤、キレート剤、保存剤、着色料、鎮痛剤、又は追加の医薬剤を含む医薬組成物。例示的な態様では、本医薬組成物は、任意選択により、１種以上の賦形剤、例えば、以下に限定されないが、薬学的に許容される塩、浸透圧バランス剤（等張化剤）、抗酸化剤；抗生物質、抗真菌剤、増量剤、凍結乾燥保護剤、消泡剤；キレート剤、保存剤、着色剤、及び鎮痛剤に加えて、１種以上のポリオール及び／又は１種以上の界面活性物質を含む。
特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、容積モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着性、又は浸透性を変更、維持又は保存するための製剤材料を含有することができる。このような実施形態において、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシンなど）；抗菌剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝液（ホウ酸、重炭酸、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、クエン酸、リン酸又は他の有機酸など）；増量剤（マンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；二糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウムクロリド、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁化剤；界面活性物質又は湿潤剤（ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０などのポリソルベート、ポリソルバトク（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｃ）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール）；安定化促進剤；等張性促進剤（アルカリ金属ハロゲン化物など、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤及び／或いは医薬アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８”Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
医薬組成物は、生理学的に適合性のあるｐＨを実現するように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、例えば、約４若しくは約５～約８．０、又は約４．５～約７．５、又は約５．０～約７．５とすることができる。
投与経路
本開示に関して、活性薬剤又はそれを含む医薬組成物は、任意の好適な投与経路によって対象に投与することができる。例えば、活性薬剤は、非経口、経鼻、経口、経肺、局所、経腟又は経直腸投与によって対象に投与することができる。投与経路に関する以下の記載は、単に例示的な実施形態を説明するために提供されるものであり、決して範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び対象の受容者の血液と製剤とを等張にする溶質を含有し得る、水性及び非水性の、等張滅菌注射用溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存剤を含み得る、水性及び非水性の、滅菌懸濁液が挙げられる。「非経口」という用語は、消化管を介するのではなく、皮下、筋肉内、脊髄内、又は静脈内などの他の何らかの経路を介することを意味する。本開示の活性薬剤は、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、エタノール又はヘキサデシルアルコールなどのアルコール、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのグリコール、ジメチルスルホキシド、グリセロール、２，２－ジメチル－ｌ５３－ジオキソラン－４－メタノールなどのケタール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステル若しくはグリセリド、又はセッケン若しくは界面活性剤など、薬学的に許容される界面活性物質を添加した、又は添加しないアセチル化脂肪酸グリセリド、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、若しくはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤、又は乳化剤及び他の医薬アジュバントを含む、滅菌液体又は液体混合物などの、医薬担体中の生理学的に許容される希釈剤とともに投与することができる。
非経口製剤に使用することができる油としては、石油、動物油、植物油、又は合成油が挙げられる。油の具体的な例としては、ピーナッツ油、ダイズ油、ゴマ油、綿実油、トウモロコシ油、オリーブ油、ワセリン及び鉱物油が挙げられる。非経口製剤に使用するための好適な脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸及びイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
非経口製剤に使用するための好適なセッケンとしては、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩、及びトリエタノールアミン塩が挙げられ、好適な界面活性剤としては、（ａ）カチオン性界面活性剤、例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハロゲン化物、及びアルキルピリジニウムハロゲン化物など、（ｂ）アニオン性界面活性剤、例えば、アルキル、アリール、及びオレフィンの各スルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリドの、各硫酸塩及び各スルホコハク酸塩など、（ｃ）非イオン性界面活性剤、例えば、脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマーなど、（ｄ）両性界面活性剤、例えば、アルキル－β－アミノプロピオネート、及び２－アルキル－イミダゾリン第四級アンモニウム塩など、並びに（ｅ）これらの混合物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、非経口製剤は、溶液中に約０．５重量％～約２５重量％の本開示の活性薬剤を含有する。保存剤及び緩衝剤を使用してもよい。注射部位での刺激を最小化又は除去するために、このような組成物は、約１２～約１７の親水性－親油性バランス（ＨＬＢ）を有する１種以上の非イオン性界面活性物質を含有し得る。このような製剤中の界面活性物質の量は、通常、約５重量％～約１５重量％の範囲である。好適な界面活性物質としては、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、及びプロピレンオキシドとプロピレングリコールとの縮合によって形成される疎水性塩基を有するエチレンオキシドの高分子量付加物が挙げられる。いくつかの態様では、非経口製剤は、アンプル及びバイアルなどの、単位用量又は複数回用量の密封容器に入れて提供され、使用の直前に注射用の滅菌液体添加剤、例えば水を添加することのみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管することができる。いくつかの態様では、即時調合される注射用溶液及び懸濁液は、以前に記載された種類の滅菌の散剤、顆粒剤、及び錠剤から調製される。
注射用製剤は、本開示によるものとする。注射用組成物用に有効な医薬担体の要件は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６）を参照されたい）。
投与量
本開示の活性薬剤は、本明細書に記載されるように、ＴＩＧＩＴのＣＤ１５５への結合又はＣＤ１１２ＲのＣＤ１１２への結合によって始まる生物活性を阻害する方法に有用であると考えられ、したがって、免疫反応、例えばＴ細胞媒介免疫反応を増大させる方法、及び１つ以上の疾患、例えば癌を治療又は予防する方法に有用であると考えられる。本開示の目的のため、投与される活性薬剤の量又は用量は、対象又は動物において、妥当な期間にわたり、効果、例えば治療的又は予防的反応を生じさせるのに十分であるべきである。例えば、活性薬剤の用量は、投与時から約１～４時間、１～４日、又は１～４週若しくはそれ以上、例えば５～２０週若しくはそれ以上の期間において、本明細書に記載されるように癌を治療するのに十分であるべきである。特定の実施形態では、その期間は、さらに長くなる可能性がある。用量は、特定の活性薬剤の有効性及び動物（例えば、ヒト）の状態並びに治療される動物（例えば、ヒト）の体重によって決定される。
投与される用量を決定するためのアッセイは、当該技術分野において数多く知られている。本明細書の目的のために、各群に異なる用量の活性薬剤が与えられる哺乳動物の群間で、本開示の活性薬剤の所与の容量を哺乳動物に投与した場合に、癌が治療される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳動物に投与する開始用量を決定することが可能である。ある特定の用量を投与した場合に癌が治療される程度は、例えば、活性薬剤の細胞毒性、又はマウス異種移植モデルにおいて活性薬剤で達成される腫瘍退縮の程度によって表わすことができる。抗原結合タンパク質の細胞毒性を測定する方法、及び腫瘍退縮をアッセイする方法は、当該技術分野において知られている。簡潔に記載すると、インビボ腫瘍退縮をアッセイするために、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に懸濁されたヒト腫瘍細胞をマウスの右側腹部に皮下移植することによって腫瘍異種移植片を確立することができる。腫瘍は、デジタルキャリパーを使用して測定することができる。腫瘍体積Ｖ（ｍｍ３）は、式Ｖ＝（π／６）ＬＳ２（式中、Ｌは最大表面径であり、Ｓは最小表面径である）を用いて計算することができる。例えば、Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ９（４）：３７４０－３７５２（２０１５）を参照されたい。
本開示の活性薬剤の用量は、本開示の特定の活性薬剤の投与に伴い得る有害な副作用の存在、性質及び程度によっても決定される。通常、主治医は、年齢、体重、全身の健康状態、食事、性別、投与される本開示の活性薬剤、投与経路及び治療される病態の重症度などの種々の要因を考慮して、個々の各患者を治療する本開示の活性薬剤の投与量を決定する。一例として（本開示を限定することを意図しない）、本開示の活性薬剤の用量は、治療対象の体重１ｋｇ当たり約０．０００１～約１ｇ／日、体重１ｋｇ当たり約０．０００１～約０．００１ｇ／日、又は体重１ｋｇ当たり約０．０１～約１ｇ／日であり得る。
制御放出性製剤
いくつかの実施形態では、本開示の活性薬剤が投与される身体に放出される様式が体内での時間及び位置に関して制御されるように、本明細書に記載される活性薬剤は、デポー形態に改変され得る（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号明細書を参照されたい）。本開示の活性薬剤のデポー形態は、例えば、活性薬剤と、ポリマーなどの多孔性又は非多孔性材料とを含む埋め込み式の組成物であり得、活性薬剤は、その材料によって若しくはその材料を通して被包若しくは拡散され、且つ／又は非多孔性材料の分解によって拡散される。デポーは、次いで、対象の体内の所望の位置に埋め込まれ、活性薬剤が所定の速度で埋め込み体から放出される。
特定の態様における活性薬剤を含む医薬組成物は、任意のタイプのインビボ放出プロファイルを有するように改変される。いくつかの態様では、医薬組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、長期放出、遅延放出又は二段階放出製剤である。制御放出のためのペプチドを製剤化する方法は、当技術分野において知られている。例えば、Ｑｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ ３７４：４６－５２（２００９）並びに国際公開第２００８／１３０１５８号パンフレット、国際公開第２００４／０３３０３６号パンフレット、国際公開第２０００／０３２２１８号パンフレット及び国際公開第１９９９／０４０９４２号パンフレットを参照されたい。
本組成物は、さらに、例えば、ミセル若しくはリポソーム又は他の被包形態を含むことができるか、或いは長期の貯蔵及び／又は送達効果を提供するために長期放出形態で投与することができる。
組み合わせ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される活性薬剤は単独で投与され、代替の実施形態では、別の治療薬剤、例えば、異なるタイプ（例えば、構造）の本開示の別の活性薬剤と組み合わせて投与される。したがって、本開示は、ＣＤ１１２Ｒを標的とする第１の抗原結合タンパク質、及びＴＩＧＩＴを標的とする第２の抗原結合タンパク質（これらのそれぞれは、本開示による抗原結合タンパク質である）を含む組み合わせを提供する。様々な態様において、第１の抗原結合タンパク質は、表Ａ１又は表Ｂ１に記載される１Ｅ１、１Ｅ１．０１６、２４Ｆ１、２９Ｅ１０、２４Ｆ１．００１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２５、１１Ｅ４、３１Ｂ３、２７Ｇ１２、２８Ｆ９、２８Ｈ７、又は３６Ｃ８のいずれか１つである。様々な態様において、第２の抗原結合タンパク質は、表Ａ２又は表Ｂ２に記載される５５Ｇ７．０４１．００８、５８Ａ７．００３．００８．０７５、４Ｇ１０、１１Ａ３、２８Ｂ８、３９Ｄ２、４３Ｂ７、５５Ｇ７、６６Ｈ９、４３Ｂ７．００２．０１５、５８Ａ７．００３．０８、６６Ｈ９．００９、又は５８Ａ７のいずれか１つである。様々な例において、第１の抗原結合タンパク質は、２４Ｆ１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０又は２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２である。例示的な態様では、第２の抗原結合タンパク質は、４３Ｂ７．００２．０１５又は６６Ｈ９．００９である。一態様では、組み合わせは、２４Ｆ１及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、組み合わせは、２４Ｆ１及び６６Ｈ９．００９を含む。一態様では、組み合わせは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、組み合わせは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び６６Ｈ９．００９を含む。一態様では、組み合わせは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、組み合わせは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び６６Ｈ９．００９を含む。別の態様では、組み合わせは、４３Ｂ７．００２．０１５及び１Ｅ１．０１６又は２４Ｆ１又は２９Ｅ１０を含む。さらに別の態様では、組み合わせは、６６Ｈ９．００９及び１Ｅ１．０１６又は２４Ｆ１又は２９Ｅ１０を含む。例示的な態様では、組み合わせは、４３Ｂ７及び２９Ｅ１０又は２４Ｆ１又は１１Ｅ４を含む。
本開示は、様々な例において、組成物、例えば医薬組成物としての組み合わせを提供する。したがって、本開示は、第１の抗原結合タンパク質及び第２の抗原結合タンパク質を含む組成物、例えば医薬組成物を提供する。様々な例において、第１の抗原結合タンパク質は、２４Ｆ１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０又は２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２である。例示的な態様では、第２の抗原結合タンパク質は、４３Ｂ７．００２．０１５又は６６Ｈ９．００９である。一態様では、組み合わせは２４Ｆ１及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の実施形態では、組成物は、２４Ｆ１及び６６Ｈ９．００９を含む。一態様では、組成物は、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、組成物は、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び６６Ｈ９．００９を含む。一態様では、組成物は、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、組成物は、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び６６Ｈ９．００９を含む。別の態様では、組み合わせは、４３Ｂ７．００２．０１５及び１Ｅ１．０１６又は２４Ｆ１又は２９Ｅ１０を含む。さらに別の態様では、組み合わせは、６６Ｈ９．００９及び１Ｅ１．０１６又は２４Ｆ１又は２９Ｅ１０を含む。例示的な態様では、組み合わせは、４３Ｂ７及び２９Ｅ１０又は２４Ｆ１又は１１Ｅ４を含む。例示的な例では、第１の抗原結合タンパク質及び第２の抗原結合タンパク質は、約１：１の比で組成物中に存在する。
いくつかの態様では、組み合わせ又は組成物は、追加の活性薬剤、例えば、第３の抗原結合タンパク質をさらに含む。任意選択により、第３の抗原結合タンパク質は、以下に限定されないが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、又は共刺激受容体のＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲを含む、免疫系の負の調節因子、免疫抑制因子、又は免疫チェックポイントタンパク質に結合する。様々な例において、追加の活性薬剤は、ＰＤ－１結合タンパク質、例えば、抗ＰＤ－１抗体である。抗ＰＤ－１抗体の例としては、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８）、ペムブロリズマブ（ＭＫ３４７５）、ＢＭＳ ９３６５５８、ＢＭＳ－９３６５５９、ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ）、ｅＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びピディリズマブ（ＣＴ－０１１）が挙げられる。任意選択により、第３の抗原結合タンパク質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１３２０５号明細書（これは、国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットとして公開されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）明細書に記載されている任意のＰＤ－１抗原結合タンパク質である。例示的な例では、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットの配列番号３５２～３５７の、ＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。例示的な例では、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２０２７～２０３２の、ＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。様々な態様において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットの配列番号３５８及び配列番号３５９のＨＣ可変領域アミノ酸配列及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な態様において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２０３３及び配列番号２０３４のＨＣ可変領域アミノ酸配列及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な例において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットの配列番号３６０及び配列番号３６１のＦＬ ＨＣアミノ酸配列及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含む。様々な例において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２０３５及び配列番号２０３６のＦＬ ＨＣアミノ酸配列及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含む。様々な例において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２０９３及び配列番号２０９４のＦＬ ＨＣアミノ酸配列及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含む。任意選択により、第１の抗原結合タンパク質及び第２の抗原結合タンパク質及び第３の抗原結合タンパク質は、約１：１：１の比で組成物中に存在する。
いくつかの態様では、他の治療薬は、癌を治療又は予防することを目的とする。いくつかの実施形態では、他の治療薬は化学療法剤である。いくつかの実施形態では、他の治療薬は、癌の治療のための放射線療法で使用される薬剤である。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の活性薬剤は、白金配位化合物、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生物質、抗有糸分裂アルカロイド及びジフルオロヌクレオシドの１種以上と組み合わせて投与される。
キット
本開示はさらに、本開示の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、若しくは宿主細胞、又はこれらの組み合わせを含むキットを提供する。例示的な態様におけるキットは、容器中に、本開示の少なくとも１種の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、若しくは宿主細胞、又はこれらの組み合わせを含む。例示的な態様では、本開示の少なくとも１種の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞は、キット中に単位用量として提供される。本明細書の目的では、「単位用量」は、好適な担体中に分散した分散量を指す。例示的な態様では、単位用量は、対象に所望の効果、例えば癌の治療を提供するのに十分な量である。例示的な態様において、キットは、いくつかの単位用量、例えば、任意選択により１週間又は１か月供給分の単位用量を含み、各単位用量は個々にパッケージ化されるか、又はさもなければ他の単位用量から分離される。いくつかの実施形態では、キット／単位用量の成分は、患者に投与するための説明書とともにパッケージ化される。一部の実施形態では、キットは、患者に投与するための１つ又は複数のデバイス、例えば、針及びシリンジなどを含む。いくつかの態様では、本開示の少なくとも１種の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、若しくは宿主細胞、又はこれらの組み合わせは、すぐに使用できる形態、例えば、シリンジ、点滴バッグなどに予めパッケージングされる。例示的な態様では、すぐに使用できる形態は、単回使用のためのものである。例示的な態様では、キットは、本開示の少なくとも１種の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸、ベクター、又は宿主細胞の、複数の単回使用のすぐに使用できる形態を含む。いくつかの態様では、キットは、本明細書に記載されるもののいずれかを含む他の治療薬又は診断薬又は薬学的に許容される担体（例えば、溶媒、緩衝剤、希釈剤など）をさらに含む。
様々な態様において、キットは、本開示の２つ以上の抗原結合タンパク質を含む。例示的な例では、キットは、ＣＤ１１２Ｒに結合する第１の抗原結合タンパク質と、ＴＩＧＩＴに結合する第２の抗原結合タンパク質とを含む。任意選択により、第１の抗原結合タンパク質は、第２の抗原結合タンパク質と共に製剤化される。いくつかの態様では、キットは、第１の抗原結合タンパク質と第２の抗原結合タンパク質とを含む組成物を含む。様々な態様において、第１の抗原結合タンパク質は、第２の抗原結合剤とは別個にパッケージング及び／又は製剤化される。様々な例において、第１の抗原結合タンパク質は、表Ａ１又は表Ｂ１に記載される１Ｅ１、１Ｅ１．０１６、２４Ｆ１、２９Ｅ１０、２４Ｆ１．００１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２５、１１Ｅ４、３１Ｂ３、２７Ｇ１２、２８Ｆ９、２８Ｈ７、又は３６Ｃ８のいずれか１つである。様々な態様において、第２の抗原結合タンパク質は、表Ａ２又は表Ｂ２に記載される５５Ｇ７．０４１．００８、５８Ａ７．００３．００８．０７５、４Ｇ１０、１１Ａ３、２８Ｂ８、３９Ｄ２、４３Ｂ７、５５Ｇ７、６６Ｈ９、４３Ｂ７．００２．０１５、５８Ａ７．００３．０８、６６Ｈ９．００９、又は５８Ａ７のいずれか１つである。様々な例において、第１の抗原結合タンパク質は、２４Ｆ１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０又は２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２である。例示的な態様では、第２の抗原結合タンパク質は、４３Ｂ７．００２．０１５又は６６Ｈ９．００９である。一態様では、キットは、２４Ｆ１及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、キットは、２４Ｆ１及び６６Ｈ９．００９を含む。一態様では、キットは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、キットは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び６６Ｈ９．００９を含む。一態様では、キットは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び４３Ｂ７．００２．０１５を含む。別の態様では、キットは、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び６６Ｈ９．００９を含む。別の態様では、キットは、４３Ｂ７．００２．０１５及び１Ｅ１．０１６又は２４Ｆ１又は２９Ｅ１０を含む。さらに別の態様では、キットは、６６Ｈ９．００９及び１Ｅ１．０１６又は２４Ｆ１又は２９Ｅ１０を含む。例示的な態様では、キットは、４３Ｂ７及び２９Ｅ１０又は２４Ｆ１又は１１Ｅ４を含む。例示的な例では、第１の抗原結合タンパク質及び第２の抗原結合タンパク質は、約１：１の比で組成物中に存在する。
様々な例において、キットは、追加の活性薬剤、例えば、第３の抗原結合タンパク質を含む。任意選択により、第３の抗原結合タンパク質は、以下に限定されないが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＣＤ１１２、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ９６、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、又は共刺激受容体のＩＣＯＳ、ＯＸ４０、４１ＢＢ、ＣＤ２７、ＧＩＴＲを含む、免疫系の負の調節因子、免疫抑制因子、又は免疫チェックポイントタンパク質に結合する。様々な例において、追加の活性薬剤は、ＰＤ－１結合タンパク質、例えば、抗ＰＤ－１抗体である。抗ＰＤ－１抗体の例としては、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８）、ペムブロリズマブ（ＭＫ３４７５）、ＢＭＳ ９３６５５８、ＢＭＳ－９３６５５９、ＴＳＲ－０４２（Ｔｅｓａｒｏ）、ｅＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）及びピディリズマブ（ＣＴ－０１１）が挙げられる。任意選択により、第３の抗原結合タンパク質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１３２０５号（これは、国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットとして公開されており、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている任意のＰＤ－１抗原結合タンパク質である。例示的な例では、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットの配列番号３５２～３５７の、ＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。例示的な例では、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２０２７～２０３２の、ＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、ＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列、ＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、及びＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む。様々な態様において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットの配列番号３５８及び配列番号３５９のＨＣ可変領域アミノ酸配列及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な態様において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２０３３及び配列番号２０３４のＨＣ可変領域アミノ酸配列及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含む。様々な例において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットの配列番号３６０及び配列番号３６１のＦＬ ＨＣアミノ酸配列及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含む。様々な例において、第３の抗原結合タンパク質は、それぞれ配列番号２０３５及び配列番号２０３６のＦＬ ＨＣアミノ酸配列及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含む。様々な態様において、各抗原結合タンパク質は、キットに別々にパッケージングされる。任意選択により、キットは、第１、第２、及び第３の抗原結合タンパク質のうちの少なくとも２つを含む容器、例えば、バイアル、シリンジ、バッグなどを含む。任意選択により、キットは、全ての抗原結合タンパク質を混合物として同じ容器中に含む。
治療方法
治療方法が、本開示によってさらに提供される。例示的な実施形態では、方法は、それを必要とする対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、対象を治療するのに有効な量で本開示の医薬組成物を投与することを含む方法である。
本開示の医薬組成物は、ＴＩＧＩＴシグナル伝達及び／又はＣＤ１１２Ｒシグナル伝達及び／又はＰＤ－１シグナル伝達を阻害するのに有用である。特定の理論に束縛されるものではないが、本明細書で提供される組成物のＴＩＧＩＴ阻害活性及び／又はＣＤ１１２Ｒ阻害活性及び／又はＰＤ－１阻害活性は、そのような実体がＴ細胞活性を増強し、免疫応答、特に腫瘍又は癌に対する免疫応答を増強する方法において有用であることを可能にする。
したがって、本明細書では、対象におけるＴ細胞活性を増強し、Ｔ細胞生存及びエフェクター機能を増強し、最終分化及び複製能の喪失を制限し、Ｔ細胞寿命を促進し、標的（例えば、癌）細胞に対する細胞毒性を増強する方法が提供される。例示的な実施形態では、本方法は、本開示の医薬組成物を有効量で対象に投与することを含む。例示的な態様では、Ｔ細胞活性又は免疫応答は、癌細胞若しくは癌組織又は腫瘍細胞若しくは腫瘍に向けられる活性である。例示的な態様では、免疫応答は体液性免疫応答である。例示的な態様では、免疫応答は自然免疫応答である。例示的な態様において、増強される免疫応答は、Ｔ細胞媒介性免疫応答である。
本明細書で使用される場合、「増強する」という用語及びそれから派生する語は、１００％又は完全な増強又は上昇でなくてもよい。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する増強の様々な程度が存在する。この点に関して、本開示の医薬組成物は、任意の量又はレベルまで、例えば、Ｔ細胞活性を増強するか、又は免疫応答を増強し得る。例示的な実施形態では、本開示の方法によって提供される増強は、少なくとも又は約１０％の増強（例えば、少なくとも又は約２０％の増強、少なくとも又は約３０％の増強、少なくとも又は約４０％の増強、少なくとも又は約５０％の増強、少なくとも又は約６０％の増強、少なくとも又は約７０％の増強、少なくとも又は約８０％の増強、少なくとも又は約９０％の増強、少なくとも又は約９５％の増強、少なくとも又は約９８％の増強）である。
Ｔ細胞活性及び免疫応答を測定する方法は、当該技術分野において知られている。Ｔ細胞活性は、例えば、Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ５（７）：ｅ１１８６７（２０１０）に記載されているものなどの細胞毒性アッセイによって測定することができる。他のＴ細胞活性アッセイは、Ｂｅｒｃｏｖｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｄｉａｇｎ Ｌａｂ Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７（６）：８５９－８６４（２０００）に記載されている。免疫応答を測定する方法は、例えば、Ｍａｃａｔａｎｇａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７（９）：１４５２－１４５９（２０１０）、及びＣｌａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７（５）：１１２７－３５（２００１）に記載されている。
また、本明細書において、対象におけるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性を増強する方法も提供される。例示的な実施形態では、本方法は、本開示の医薬組成物を有効量で対象に投与することを含む。例示的な態様では、ＮＫ細胞活性は、癌細胞若しくは癌組織又は腫瘍細胞若しくは腫瘍に向けられる活性である。
さらに、本明細書では、癌を有する対象を治療する方法及び固形腫瘍を有する対象を治療する方法が提供される。例示的な実施形態では、本方法は、対象における癌又は固形腫瘍を治療するのに有効な量で本開示の医薬組成物を対象に投与することを含む。本明細書に開示される方法によって治療可能な癌は、任意の癌、例えば、リンパ系又は血流を介して身体の他の部分に広がり得る、異常で制御されない細胞分裂によって引き起こされる任意の悪性腫瘍又は腫瘍であり得る。癌は、いくつかの態様では、急性リンパ性癌、急性骨髄性白血病、胞巣状横紋筋肉腫、骨癌、脳癌、乳癌、肛門、肛門管又は肛門直腸の癌、眼の癌、肝内胆管の癌、関節の癌、頸部、胆嚢又は胸膜の癌、鼻、鼻腔又は中耳の癌、口腔の癌、外陰部の癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性癌、大腸癌、食道癌、子宮頸癌、消化管カルチノイド腫瘍、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、腎臓癌、喉頭癌、肝臓癌、肺癌、悪性中皮腫、黒色腫、多発性骨髄腫、鼻咽頭癌、非ホジキンリンパ腫、卵巣癌、膵臓癌、腹膜、大網及び腸間膜癌、咽頭癌、前立腺癌、直腸癌、腎臓癌（例えば腎細胞腫（ＲＣＣ））、小腸癌、軟組織癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、尿管癌、及び膀胱癌からなる群から選択されるものである。特定の態様では、癌は、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌及び食道癌、膵臓癌、消化管癌、胃癌、乳癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、肝細胞癌、グリア芽腫、膀胱癌、肺癌、例えば非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、細気管支肺胞上皮癌からなる群から選択される。特定の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、頭頸部癌、腎臓癌、トリプルネガティブ乳癌、及び胃癌である。例示的な態様では、対象は、腫瘍（例えば、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、又はリンパ性悪性腫瘍）を有し、医薬組成物は、対象の腫瘍を治療するのに有効な量で対象に投与される。他の例示的な態様では、腫瘍は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、頭頸部癌、腎臓癌、乳癌、黒色腫、卵巣癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、前立腺癌、胃癌、リンパ腫又は白血病であり、医薬組成物は、対象の腫瘍を治療するのに有効な量で対象に投与される。
本明細書において使用される場合、「治療する」という用語及びそれに関連する語は、１００％又は完全な治療を必ずしも意味しない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有すると認識する治療の様々な程度が存在する。この点に関して、本開示の癌を治療する方法は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。さらに、本開示の方法によって提供される治療は、治療される癌の１つ以上の病態又は症状又は徴候の治療を含み得る。また、本開示の方法によって提供される治療は、癌の進行を遅らせることを包含し得る。例えば、本方法は、癌に対するＴ細胞活性又はＮＫ細胞活性又は免疫応答を増強すること、腫瘍又は癌の増殖を低減すること、腫瘍細胞の転移を低減すること、腫瘍又は癌細胞の細胞死を増加させることなどによって、癌を治療することができる。例示的な態様において、本方法は、癌の発症又は再発を、１日、２日、４日、６日、８日、１０日、１５日、３０日、２か月、４か月、６か月、１年、２年、４年、又はそれ以上遅延させるために治療する。例示的な態様では、本方法は、対象の生存期間を延長するために治療する。
対象
本開示のいくつかの実施形態では、対象は、マウス及びハムスターなどの齧歯（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）目の哺乳動物、ウサギなどのロゴモルファ（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）目の哺乳動物、ネコ科の動物（ネコ）及びイヌ科の動物（イヌ）を含む食肉（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）目の哺乳動物、ウシ亜科の動物（ウシ）及びイノシシ科の動物（ブタ）を含む偶蹄（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）目の哺乳動物、又はウマ科の動物（ウマ）を含む奇蹄（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）目の哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物である。いくつかの態様において、哺乳動物は、霊長（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）目、セボイド（Ｃｅｂｏｉｄ）目、若しくはシモイド（Ｓｉｍｏｉｄ）目（サル）、又は真猿亜目（ヒト及び類人猿）の哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、ヒトである。
製造方法
本開示の抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られた方法によって得ることができる。ポリペプチドをデノボ合成する好適な方法は、例えば、Ｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｆｍｏｃ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２００５；Ｐｅｐｔｉｄｅ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｅｄ．Ｒｅｉｄ，Ｒ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，２０００；Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ，ｅｄ．Ｗｅｓｔｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ，２０００；及び米国特許第５，４４９，７５２号明細書に記載されている。本発明のペプチドを作製するさらなる例示的な方法を本明細書に記載する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、Ｓｙｎｐｅｐ（Ｄｕｂｌｉｎ、ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｃｏｒｐ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、Ｐｅｐｔｉｄｅ ２．０ Ｉｎｃ（Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ、ＶＡ）、及びＡｍｅｒｉｃａｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｏ．（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）などの会社で商業的に合成されている。この点に関して、抗原結合タンパク質は、合成、組換え、単離、及び／又は精製することができる。
また、いくつかの態様では、抗原結合タンパク質は、標準的な組換え方法を使用して、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸を使用して組換え的に産生される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ． ３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４を参照されたい。
本開示の抗原結合タンパク質を作製する方法は、本明細書においてさらに提供される。例示的な実施形態では、方法は、抗原結合タンパク質を発現するように本開示の宿主細胞を培養する工程、及び発現した抗原結合タンパク質を回収する工程を含む。宿主細胞は、本明細書に記載の宿主細胞のいずれかであり得る。例示的な態様では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、及びＢＨＫ細胞からなる群から選択される。例示的な態様では、宿主細胞を培養する工程は、宿主細胞の増殖及び拡大を支持する増殖培地中で宿主細胞を培養することを含む。例示的な態様では、増殖培地は、細胞密度、培養物生存率及び生産性を増加させる。例示的な態様では、増殖培地は、成長因子、ホルモン、及び付着因子の供給源として、アミノ酸、ビタミン、無機塩、グルコース、及び血清を含む。例示的な態様では、増殖培地は、アミノ酸、ビタミン、微量元素、無機塩、脂質及びインスリン又はインスリン様増殖因子からなる完全に化学的に定義された培地である。栄養分に加えて、増殖培地はまた、ｐＨ及び浸透圧を維持するのに役立つ。いくつかの増殖培地が市販されており、当該技術分野において記載されている。例えば、Ａｒｏｒａ，“Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｄｉａ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ”ＭＡＴＥＲ ＭＥＴＨＯＤＳ ３：１７５（２０１３）を参照されたい。
例示的な態様では、本開示の抗原結合タンパク質を作製する方法は、フィード培地中で宿主細胞を培養することを含む。例示的な態様では、本方法は、フェッドバッチモードでフィード培地中で培養することを含む。組換えタンパク質を生成する方法は、当該技術分野において知られている。例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”ＭＡｂｓ２（５）：４６６－４７７（２０１０）を参照されたい。
抗原結合タンパク質を作製する方法は、細胞培養物又はその上清からタンパク質を精製し、好ましくは精製タンパク質を回収するための１つ以上の工程を含み得る。例示的な態様では、本方法は、１つ以上のクロマトグラフィー工程、例えばアフィニティークロマトグラフィー（例えばプロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む。例示的な態様では、本方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー樹脂を用いてタンパク質を精製することを含む。
例示的な実施形態では、本方法は、精製タンパク質などを製剤化し、それにより精製タンパク質を含む製剤を得るための工程をさらに含む。このような工程は、Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ｅｄｓ． Ｊａｍｅｅｌ ａｎｄ Ｈｅｒｓｈｅｎｓｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｂｏｋｅｎ，ＮＪ），２０１０に記載されている。
例示的な実施形態
以下は、本開示の例示的な実施形態の一覧である：
１．（ａ）表Ａ１に記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）表Ａ１に記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、或いは（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせを含む、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質、任意選択により、抗体又はその抗原結合断片。
２．表Ａ１の単一行に列挙される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１３～１８、（ｂ）配列番号２３～２８、（ｃ）配列番号３３～３８、（ｄ）配列番号４３～４８、（ｅ）配列番号５３～５８、（ｆ）配列番号６３～６８、（ｇ）配列番号７３～７８、（ｈ）配列番号８３～８８、（ｉ）配列番号９３～９８、（ｊ）配列番号１０３～１０８、（ｋ）配列番号２３３～２３８、（ｌ）配列番号１９７３～１９７８、（ｍ）配列番号１９８３～１９８８、（ｎ）配列番号１９９３～１９９８、及び（ｏ）配列番号２００３～２００８からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、実施形態１のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
３．（ａ）表Ｂ１に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ１に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、実施形態１又は２のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
４．表Ｂ１の単一行に列挙される一対のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１１～１２、（ｂ）配列番号２１～２２、（ｃ）配列番号３１～３２、（ｄ）配列番号４１～４２、（ｅ）配列番号５１～５２、（ｆ）配列番号６１～６２、（ｇ）配列番号７１～７２、（ｈ）配列番号８１～８２、（ｉ）配列番号９１～９２、（ｊ）配列番号１０１～１０２、（ｋ）配列番号２３１～２３２、（ｌ）配列番号１９７１～１９７２、（ｍ）配列番号１９８１～１９８２、（ｎ）配列番号１９９１～１９９２、及び（ｏ）配列番号２００１～２００２からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、実施形態３のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
５．（ａ）表Ｂ１に記載の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は表Ｂ１のＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ１に記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は表Ｂ１のＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、実施形態１～４のいずれか一つのＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
６．表Ｂの単一行に列挙される一対の完全長（ＦＬ） ＨＣ及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号９～１０、（ｂ）配列番号１９～２０、（ｃ）配列番号２９～３０、（ｄ）配列番号３９～４０、（ｅ）配列番号４９～５０、（ｆ）配列番号５９～６０、（ｇ）配列番号６９～７０、（ｈ）配列番号７９～８０、（ｉ）配列番号８９～９０、（ｊ）配列番号９９～１００、（ｋ）配列番号２２９～２３０、（ｌ）配列番号１９６９～１９７０、（ｍ）配列番号１９７９～１９８０、（ｎ）配列番号１９８９～１９９０、及び（ｏ）配列番号１９９９～２０００からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、実施形態５のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
７．抗体である、実施形態１～６のいずれか一つのＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
８．
（ａ）配列番号３３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号３４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号３５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号３６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号３７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号３８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
（ｂ）配列番号６３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号６４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号６５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号６６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号６７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号６８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
（ｃ）配列番号８３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号８４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号８５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号８６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号８７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号８８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
（ｄ）（ａ）配列番号３１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号３１のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号３２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号３２のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｅ）（ａ）配列番号６１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号６１のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号６２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号６２のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｆ）（ａ）配列番号８１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号８１のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号８２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号８２のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｇ）（ａ）配列番号２９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号２９のＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号３０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号３０のＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｈ）（ａ）配列番号５９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号５９のＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号６０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号６０のＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｉ）（ａ）配列番号７９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号７９のＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号８０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号８０のＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
を含む、実施形態７のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
９．抗体の抗原結合断片である、実施形態１～８のいずれか一つのＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
１０．抗体タンパク質生成物であり、任意選択により、ｓｃＦｖである、実施形態１～９のいずれか一つのＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
１１．表Ａ１、Ｂ１、若しくはＣ１の配列番号のアミノ酸配列、又はその表の配列番号のアミノ酸配列に対して少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列、又はそれらの組み合わせを含むポリペプチド。
１２．実施形態１～１１のいずれか一つのＣＤ１１２Ｒ抗体結合タンパク質又はポリペプチドと異種部分とを含むコンジュゲート。
１３．別のアミノ酸配列に融合した抗原結合タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列を含む、実施形態１２のコンジュゲート。
１４．実施形態１～１３のいずれか一つのＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質又はポリペプチド又はコンジュゲートをコードする核酸。
１５．実施形態９又は１０の抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方をコードする核酸。
１６．（ａ）表Ｂ１に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ１に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む、実施形態１４又は１５の核酸。
１７．実施形態１４～１６のいずれか一つの１種以上の核酸を含むベクター。
１８．実施形態１４～１６のいずれか一つの１種以上の核酸、又は実施形態１７の１種以上のベクターを含む宿主細胞。
１９．宿主細胞は、実施形態１～１０のいずれかのＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を産生する、実施形態１８の宿主細胞。
２０．（ａ）表Ａ２に記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）表Ａ２に記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、或いは（ｇ）（ａ）～（ｆ）の任意の２つ以上の組み合わせを含む、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質、任意選択により、抗体又はその抗原結合断片。
２１．
ａ．Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ２８若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｇｌｕ１又はその保存的アミノ酸置換を含むＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＳｅｒ９１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；Ｖａｌ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｒｇ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩｌｅ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１０９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１１若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＬＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
ｂ．Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ２８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ２９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｇｌｕ１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｉｌｅ２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ６８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ６９若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ｔｙｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｐ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ９６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ９７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；Ｇｌｙ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３５若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｙｓ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ａｒｇ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｎ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ１０５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｎ１０６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＬＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
ｃ．Ａｒｇ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｒｇ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｓｅｒ９１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＬＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）；Ｔｈｒ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｒｐ４７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ５０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｎ６５若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ａｓｎ１０１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ１０３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＨＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
ｄ．Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｓｅｒ９６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｉｌｅ９７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｎ９８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ９９若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；Ａｓｐ３３若しくはその保存的アミノ酸置換を含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｙｓ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ｉｌｅ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１０９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１１１若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＨＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
を含む、実施形態２０のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２２．表Ａ２の単一行に列挙される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１１３～１１８、（ｂ）配列番号１２３～１２８、（ｃ）配列番号１３３～１３８、（ｄ）配列番号１４３～１４８、（ｅ）配列番号１５３～１５８、（ｆ）配列番号１６３～１６８、（ｇ）配列番号１７３～１７８、（ｈ）配列番号１８３～１８８、（ｉ）配列番号１９３～１９８、（ｊ）配列番号２０３～２０８、（ｋ）配列番号２１３～２１８、（ｌ）配列番号２２３～２２８、及び（ｍ）配列番号２０１３～２０１８からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、実施形態２０又は２１のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２３．（ａ）表Ｂ２に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ２に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、実施形態２０～２２のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２４．表Ｂ２の単一行に列挙される一対のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１１１～１１２、（ｂ）配列番号１２１～１２２、（ｃ）配列番号１３１～１３２、（ｄ）配列番号１４１～１４２、（ｅ）配列番号１５１～１５２、（ｆ）配列番号１６１～１６２、（ｇ）配列番号１７１～１７２、（ｈ）配列番号１８１～１８２、（ｉ）配列番号１９１～１９２、（ｊ）配列番号２０１～２０２、（ｋ）配列番号２１１～２１２、（ｌ）配列番号２２１～２２２、及び（ｍ）配列番号２０１１～２０１２からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、実施形態２３のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２５．（ａ）表Ｂ２に記載の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は表Ｂ２のＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ２に記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は表Ｂ２のＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、実施形態２０～２４のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２６．表Ｂ２の単一行に列挙される一対の完全長（ＦＬ） ＨＣ及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１０９～１１０、（ｂ）配列番号１１９～１２０、（ｃ）配列番号１２９～１３０、（ｄ）配列番号１３９～１４０、（ｅ）配列番号１４９～１５０、（ｆ）配列番号１５９～１６０、（ｇ）配列番号１６９～１７０、（ｈ）配列番号１７９～１８０、（ｉ）配列番号１８９～１９０、（ｊ）配列番号１９９～２００、（ｋ）配列番号２０９～２１０、（ｌ）配列番号２１９～２２０、及び（ｍ）配列番号２００９～２０１０からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、実施形態２５のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２７．抗体である、実施形態２０～２６のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２８．
（ａ）配列番号２０３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号２０４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号２０５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号２０６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号２０７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号２０８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
（ｂ）配列番号２２３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号２２４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号２２５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号２２６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号２２７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号２２８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
（ｃ）（ａ）配列番号２０１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２０１のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２０２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２０２のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｄ）（ａ）配列番号２２１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２２１のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２２２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２２２のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｅ）（ａ）配列番号１９９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号１９９のＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２００の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号２００のＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
（ｆ）（ａ）配列番号２１９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号２１９のＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２２０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号２２０のＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
を含む、実施形態２７のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
２９．抗体の抗原結合断片である、実施形態２０～２６のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
３０．抗体タンパク質生成物であり、任意選択により、ｓｃＦｖである、実施形態２０～２６のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
３１．表Ａ２、Ｂ２、若しくはＣ２の配列番号のアミノ酸配列、又はその表の配列番号のアミノ酸配列に対して少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列、又はそれらの組み合わせを含むポリペプチド。
３２．実施形態２０～３１のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗体結合タンパク質又はポリペプチドと異種部分とを含むコンジュゲート。
３３．別のアミノ酸配列に融合した抗原結合タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列を含む、実施形態３２のコンジュゲート。
３４．実施形態２０～３３のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質又はポリペプチド又はコンジュゲートをコードする核酸。
３５．実施形態２７又は２８の抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方をコードする核酸。
３６．（ａ）表Ｂ２に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２のＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ２に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２のＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む、実施形態３４又は３５の核酸。
３７．実施形態３４～３６のいずれか一つの１種以上の核酸を含むベクター。
３８．実施形態３４～３６のいずれか一つの１種以上の核酸、又は実施形態３７の１種以上のベクターを含む宿主細胞。
３９．宿主細胞は、実施形態２０～３０のいずれかのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を産生する、実施形態３７の宿主細胞。
４０．実施形態１～１０のいずれか一つのＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質と、実施形態２０～３０のいずれか一つのＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質とを含む組成物。
４１．（Ａ）ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ａ１又は表Ｂ１に記載される１Ｅ１、１Ｅ１．０１６、２４Ｆ１、２９Ｅ１０、２４Ｆ１．００１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２５、１１Ｅ４、３１Ｂ３、２７Ｇ１２、２８Ｆ９、２８Ｈ７、又は３６Ｃ８、任意選択により、２４Ｆ１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０又は２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２であり、（Ｂ）ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２又は表Ｂ２に記載される５５Ｇ７．０４１．００８、５８Ａ７．００３．００８．０７５、４Ｇ１０、１１Ａ３、２８Ｂ８、３９Ｄ２、４３Ｂ７、５５Ｇ７、６６Ｈ９、４３Ｂ７．００２．０１５、５８Ａ７．００３．０８、６６Ｈ９．００９、又は５８Ａ７のいずれか１つ、任意選択により、４３Ｂ７．００２．０１５又は６６Ｈ９．００９、又は（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせである、実施形態４０の組成物。
４２．（Ａ）２４Ｆ１及び４３Ｂ７．００２．０１５、（Ｂ）２４Ｆ１及び６６Ｈ９．００９、（Ｃ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び４３Ｂ７．００２．０１５、（Ｄ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び６６Ｈ９．００９、（Ｅ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び４３Ｂ７．００２．０１５、（Ｆ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び６６Ｈ９．００９、（Ｇ）４３Ｂ７．００２．０１５及び１Ｅ１．０１６、（Ｈ）４３Ｂ７．００２．０１５及び２４Ｆ１、（Ｉ）４３Ｂ７．００２．０１５及び２９Ｅ１０、（Ｊ）６６Ｈ９．００９及び１Ｅ１．０１６、（Ｋ）６６Ｈ９．００９及び２９Ｅ１０、（Ｌ）４３Ｂ７及び２９Ｅ１０、（Ｍ）４３Ｂ７及び２４Ｆ１、又は（Ｎ）４３Ｂ７及び１１Ｅ４を含む、実施形態４０又は４１の組成物。
４３．ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質及びＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、約１：１の比で前記組成物中に存在する、請求項４０～４２のいずれか一つの組成物。
４４．ＰＤ－１を標的とする第３の抗原結合タンパク質をさらに含む、実施形態４０～４３のいずれか一つの組成物。
４５．第３の抗原結合タンパク質は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１３２０５号（これは、国際公開第２０１９／１４０１９６号パンフレットとして公開されている）に記載されている任意のＰＤ－１抗原結合タンパク質である、実施形態４４の組成物。
４６．第３の抗原結合タンパク質は、配列番号２０３３のＨＣ可変領域アミノ酸配列及び配列番号２０３４のＨＣ可変領域アミノ酸配列を含む、実施形態４４又は４５組成物。
４７．実施形態１～１０のいずれか一つの抗原結合タンパク質、実施形態１１のポリペプチド、実施形態１２又は１３のコンジュゲート、実施形態１４～１６のいずれか一つの核酸、実施形態１７のベクター、実施形態１８又は１９の宿主細胞、実施形態２０～３０のいずれか一つの抗原結合タンパク質、実施形態３１のポリペプチド、実施形態３２又は３３のコンジュゲート、実施形態３４～３６の核酸、実施形態３７のベクター、実施形態３８又は３９の宿主細胞、実施形態４０～４６のいずれか一つの組成物、又はこれらの組み合わせ、及び容器を含むキット。
４８．実施形態１～１０のいずれか一つの抗原結合タンパク質、実施形態１１のポリペプチド、実施形態１２又は１３のコンジュゲート、実施形態１４～１６のいずれか一つの核酸、実施形態１７のベクター、実施形態１８又は１９の宿主細胞、実施形態２０～３０のいずれか一つの抗原結合タンパク質、実施形態３１のポリペプチド、実施形態３２又は３３のコンジュゲート、実施形態３４～３６の核酸、実施形態３７のベクター、実施形態３８又は３９の宿主細胞、実施形態４０～４６のいずれか一つの組成物、又はこれらの組み合わせ、及び薬学的に許容される担体、希釈剤賦形剤、又は希釈剤を含む医薬組成物。
４９．ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を作製する方法であって、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を発現するように実施形態１８又は１９のいずれか一つの宿主細胞を培養する工程、及び発現したＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を回収する工程を含む方法。
５０．ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を作製する方法であって、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を発現するように実施形態３８又は３９のいずれか一つの宿主細胞を培養する工程、及び発現したＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を回収する工程を含む方法。
５１．それを必要とする対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、対象を治療するのに有効な量で実施形態４８の医薬組成物を投与することを含む方法。
５２．対象は固形腫瘍を有し、医薬組成物は対象の固形腫瘍を治療するのに有効な量で対象に投与される、実施形態５１の方法。
５３．それを必要とする対象を治療する方法であって、それを必要とする対象に、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質及びＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を含む第１の医薬組成物、並びにＰＤ－１阻害剤を含む第２の医薬組成物を投与することを含む方法。
５４．対象は固形腫瘍を有し、第１の医薬組成物及び第２の医薬組成物は対象の固形腫瘍を治療するのに有効な量で投与される、実施形態５３の方法。
以下の実施例は本発明を単に説明するために示され、その範囲を決して限定するものではない。
実施例１
この実施例は、癌及び正常Ｔ細胞におけるＴＩＧＩＴファミリー受容体及びリガンド発現を記載する。
相関分析を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）からのＲＮＡｓｅｑデータを用いて、複数の腫瘍適応症について実施し、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーの相互及びＰＤ－１との共発現を評価した。同じ分析を、ＴＩＧＩＴファミリーメンバー及びＰＤ－１のリガンドについて行った。腫瘍適応症には、浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ）、腎明細胞癌（ＫＩＲＣ）、頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ）、及び皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ）が含まれた。
図１Ａの上段に示されるように、ＴＩＧＩＴファミリー受容体のほとんどが、ほとんどの腫瘍適応症において互いに正の相関を示し、これらの受容体の多くが、癌又は腫瘍環境において共発現されることを示唆した。対照的に、ＴＩＧＩＴファミリーメンバーのリガンドは限定された相関を示し（図１Ａの下段）、最良の相関はＣＤ１１２及びＣＤ１５５であった。残りは、互いに又はＰＤ－Ｌ１と良好な相関を示さなかった。
ヒト肝癌由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からの単一細胞ＲＮＡｓｅｑデータも分析し、データは、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１発現が重なる一方、ＣＤ１１２Ｒ発現はより広範であることを示唆した（図１Ｂ）。同様の結果が、結腸直腸癌（ＣＲＣ）及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）由来のＴＩＬからの追加の単一細胞ＲＮＡ ｓｅｑデータセットから得られた（データは示さず）。
ＣＤ１１２Ｒは、ＴＩＧＩＴファミリーの受容体に最近追加されたものである。これは、ＮＫ細胞及び活性化Ｔ細胞上で発現し、主にＣＤ８ Ｔ細胞上で発現することが以前に示された。ＣＤ１１２Ｒ発現は、活性化されたＣＤ８ Ｔ細胞上で誘導されることが確認され、またこれらの細胞のかなりの割合がＰＤ－１及びＴＩＧＩＴも共発現することが確認され、ｓｃＲＮＡｓｅｑデータによって示唆されたパターンと一致した（図１Ｃ）。
初代ヒト細胞におけるＣＤ１１２Ｒ、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ－１並びにリガンドＣＤ１１２及びＣＤ１５５の発現を確認するために、ヒト腫瘍組織由来の腫瘍浸潤免疫細胞及び腫瘍細胞におけるこれらの分子の発現を評価した。限られた数の試料の中で、ＦＡＣＳによって検出可能な受容体の相対的発現には、大きなばらつきがあった（図１Ｄ）。さらに、Ｅｐｃａｍ＋ＣＤ４５－腫瘍細胞とＥｐｃａｍ－ＣＤ４５＋免疫細胞におけるリガンドの発現に有意な差があることが観察された。図１Ｅに示すように、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５はＥｐｃａｍ＋ＣＤ４５－腫瘍細胞においては高レベルで共発現したが、腫瘍内免疫細胞では発現レベルが低く、両方のリガンドを発現する細胞はかなり少なかった。ＰＢＭＣ中のＣＤ４５＋Ｅｐｃａｍ－骨髄細胞は、これらのリガンドを共発現する細胞が存在するとしてもごくわずかしか示さなかった。
これらの結果は、ＣＤ１１２Ｒ、ＴＩＧＩＴ、及びＰＤ－１の発現パターンを示している。
実施例２
この実施例は、ＣＤ１１２Ｒ遮断がＴ細胞応答を増強することを示す。
Ｔ細胞におけるＣＤ１１２Ｒの機能を示すために、ＣＤ１１２及びＣＤ３エンゲージャーを安定に発現する操作されたＣＨＯ細胞を使用するインビトロアッセイ系を開発した。精製ヒトｐａｎ Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８抗体で予め活性化し、次いで、静置した。Ｔ細胞表面に発現したＣＤ１１２ＲがＣＨＯ細胞表面に発現したＣＤ１１２に結合すると、ＩＬ－２の放出が抑制されると予想される。このアッセイの図解を図２Ａに示す。Ｔ細胞が細胞表面でＣＤ１１２Ｒ発現を誘導したことが確認された（図２Ｂ）。ツール抗体がＣＤ１１２Ｒに結合し、ＩＬ－２放出をブロックする能力を、このアッセイ系を用いて試験した。ツール抗体（ＰＬ－５２５７５、ＰＬ－５２５７６、及びＰＬ－５２５７７）は、ｈｕＣＤ１１２Ｒを発現する細胞に対し、用量依存的結合を示し（図２Ｃ）、これらの抗体の相対的親和性／結合活性はリガンド結合をブロックする能力と相関した（図２Ｄ）。これらのツール抗体のＥＣ５０及びＩＣ５０の概要を以下の表に示す。
このアッセイ系を用いて、ツール抗体は、ＣＤ１１２発現ＣＨＯ細胞（図２Ｅの青色の丸、赤色の四角、及び緑色の三角）の存在下で、Ｔ細胞活性を用量依存的に増強した。活性を誘導する抗体の能力は、ＣＨＯ細胞上のＣＤ１１２の存在に依存し、ＣＨＯ細胞を空のベクターでモックトランスフェクトし、ＣＤ１１２を発現しなかった場合、Ｔ細胞活性は増強されなかった。これらのデータは、ＣＤ１１２とＣＤ１１２Ｒとの相互作用がＴ細胞応答を阻害することを示唆する。
以前に示されたように、ＣＤ１１２はＣＤ２２６と結合して共刺激シグナルを誘導する。重要なことに、ＣＤ１１２Ｒの非存在下でのＴ細胞のＣＤ１１２媒介性共刺激は、ＣＤ２２６によって完全に駆動され（図２Ｆ）、ＣＤ１１２ＲがＣＤ２２６と同じリガンドに結合することによって、ＣＤ２２６依存性共刺激シグナルを主に阻害することをさらに確認する。
これらの結果は、ＣＤ１１２Ｒ遮断がＴ細胞応答を増強するための良好な戦略であることを示唆する。
実施例３
この実施例は、ＣＤ１１２Ｒモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成を示す。
ヒトＣＤ１１２Ｒに対する完全ヒト抗体を以下のように作製した。
抗ＣＤ１１２Ｒ免疫応答の生成
マウス株
ヒトＣＤ１１２Ｒに対する完全ヒト抗体を、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスを免疫化することによって作製した（米国特許第６，１１４，５９８号明細書；同第６，１６２，９６３号明細書；同第６，８３３，２６８号明細書；同第７，０４９，４２６号明細書；同第７，０６４，２４４号明細書（これらの文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）；Ｇｒｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ７：１３－２１；Ｍｅｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １５：１４６－１５６；Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ，１９９８，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ，１８８：４８３－４９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １３，５９３－５９７，２００２）。ＸＭＧ４－Ｋ、ＸＭＧ４－ＫＬ、ＸＭＧ２－Ｋ、及びＸＭＧ２－ＫＬ ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株由来の動物を、これらの免疫化のために使用した。さらに、カスタムＸＭＧ２ ＣＤ１１２Ｒ ＫＯマウス株を作製した（Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。
免疫化
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅノックアウト株ＸＭＧ２ ＣＤ１１２Ｒ ＫＯを含む様々なＸｅｎｏＭｏｕｓｅ株に複数の種々の免疫化戦略を適用して、抗体レパートリーを作製した。動物から採血し、４週間～１０週間の間の免疫化試験中の様々な時点で血漿を採取し、ＣＤ１１２Ｒ特異的力価を評価した。
ＣＤ１１２Ｒ特異的血清力価を、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーターによる生細胞ＦＡＣＳ分析によってモニターした。簡潔に記載すると、ＨＥＫ２９３細胞を、モックトランスフェクトするか、又はヒトＣＤ１１２Ｒ若しくはカニクイザルＣＤ１１２Ｒで一過性にトランスフェクトした。免疫した動物からの血清を１００倍に希釈し、氷上のトランスフェクトした細胞上で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄して、結合していない抗体を除去し、Ｃｙ５で標識した二次抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ特異的抗体を、細胞上でさらに１５分間、４度でインキュベートした。細胞を１回洗浄して、結合していない二次抗体を除去し、細胞上の蛍光シグナルをＦＡＣＳによって定量した。ヒト及びカニクイザルのＣＤ１１２Ｒに対して向けられる最高の抗原特異的な血清に固有の力価を有する動物を、ハイブリドーマ作製のために使用した（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）。収穫物１及び収穫物３の動物株はＸＭＧ２／ＸＭＧ４であり、収穫物２からの株はＸＭＧ２ｋｌであった。
モノクローナル抗体の調製
ハイブリドーマの作製
好適な血清力価を示す動物を確認し、リンパ球を脾臓及び／又は流入領域リンパ節から得た。プールされたリンパ球（各収穫物から）を、好適な培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で磨砕することによってリンパ組織から分離した。Ｂ細胞は、標準的な方法を使用して選択し且つ／又は増殖させ、当該技術分野で知られた技術を使用して好適な融合パートナーと融合させた。続いて、抗体を産生するハイブリドーマを、ＦＡＣＳベースの抗原特異的選別を使用して、又は標準的なポリクローナルプレーティング技術によってプレーティングした。
ハイブリドーマ細胞の抗原特異的染色：
ハイブリドーマ細胞をフラスコから取り出し、滅菌ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ ＰＢＳ）中で洗浄した。次いで、細胞を可溶性ヒトＣＤ１１２Ｒタンパク質で染色し、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で再度洗浄し、５μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８ コンジュゲートＦ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ：１０９－５４６－０９８）及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲートストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ、Ｃａｔ：０１６－６００－０８４）を含有する１ｍＬの検出カクテルで染色し、次いで、暗所において４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で再度洗浄し、培地に再懸濁し、次いで、４０ミクロン細胞ストレーナーに通して、凝集した細胞を除去した。ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ３を用い、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７蛍光の両方を示す集団をゲーティングすることによって、抗原特異的細胞を選別した（ＩｇＧ＋及び抗原結合細胞）。
選別した細胞をハイブリドーマ培地中で数日間培養した。ＣＤ１１２Ｒ特異的細胞の濃縮の成功を確認した後、ハイブリドーマを、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ３を用いて３８４ウェルマイクロタイタープレートに単一細胞選別した。２週間の培養後、マイクロタイタープレートからの上清を回収し、ＣＤ１１２Ｒ結合についてスクリーニングした。
ＣＤ１１２Ｒ特異的結合抗体の初期選択
ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗体を同定し選択するために用いたスクリーニングアッセイの順序を図３に示す。
ヒトＣＤ１１２Ｒ特異性アッセイ
トランスフェクトされた細胞を使用して、以下のように、宿主ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３Ｔ細胞に対するフローサイトメトリーを使用して、抗体の結合特異性を評価した。ヒトＣＤ１１２Ｒ、マウスＣＤ１１２Ｒ、ラットＣＤ１１２Ｒ、ヒトＣＤ９６、ヒトＣＤ２２６又は対照発現ベクター、Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号 ３１９８５０８８）、並びに２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４７０１９）により、製造業者によって設定されたプロトコルに従ってトランスフェクトしたＨＥＫ ２９３Ｔ細胞でタンパク質を発現させた。２４時間後、トランスフェクトした細胞をＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％ウシ胎仔血清）に再懸濁し、９６ウェルプレートに加えた。ハイブリドーマ上清試料を、最終的に２．５μｇ／ｍＬとなるように添加し（但し、最終的に１：１０希釈で試験した１１Ｅ４は例外）、細胞を再懸濁し、４℃で１時間インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、非結合抗体を除去した。次いで、ＦＡＣＳ緩衝液で５μｇ／ｍＬに調製したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ断片特異的）二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号 Ｎｏ．１０９－５４５－０９８）を各ウェルに添加し、細胞を再懸濁し、４℃で１５分間インキュベートした。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離して細胞をペレット化し、上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、結合していない二次抗体を除去した。次いで、試料をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを用いてＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーターで読み取った。収穫物１、収穫物２及び収穫物３のヒトＣＤ１１２Ｒに対するバインダー数は、それぞれ２１６、５３９及び５６９であった。ｈｕＣＤ１１２Ｒ抗体はヒトＣＤ１１２Ｒに対して選択的であり、マウス又はラットＣＤ１１２Ｒに対して交差反応しなかった（データは示さず）。
ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ１１２Ｒ／ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）
ＣＤ１１２－ＣＤ１１２Ｒ相互作用を遮断することによってＴ細胞活性を増強することができるハイブリドーマ又は精製抗ＣＤ１１２Ｒ抗体をスクリーニングするために、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＮＦＡＴレポーターアッセイを開発した（図４Ａ）。ヒトＣＤ１１２Ｒ及びＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーターを安定に発現するＪｕｒｋａｔ細胞（ＰｒｏｍｅｇａのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ細胞株 カタログ番号ＣＳ１７６４０１を用いて自社で作製）を、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｉｅｎｃｅｓ）、１×ＭＥＭ ＥＡＡ（Ｓｉｇｍａ）、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、５００μｇ／ｍＬゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び０．５μｇ／ｍＬピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｓｉｇｍａ）で培養した。Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼ／ＣＤ１１２ＲクローンＣ４細胞を、ヒトＣＤ１１２及びヒトＴ細胞エンゲージャーを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）－Ｋ１細胞（自社で作製）と共培養することによって、Ｔ細胞受容体に結合させて刺激した。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２ ＨＡＭ（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００μｇ／ｍＬゲネチシン、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１００μｇ／ｍＬゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する完全増殖培地中、１×１０４個のＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１１２＋細胞を、白色ハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ カタログ番号３６８８）に、３７℃／５％ＣＯ２で一晩播種した。一晩インキュベートした後、増殖培地を、アッセイ培地（１％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）中のハイブリドーマ上清又は抗体の存在下（それぞれの対照を含む）の５×１０４個のＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴｌｕｃ／ＣＤ１１２ＲクローンＣ４細胞に置き換え、３７℃／５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。各ウェル中のレポーターシグナルを、Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｇ７９４０）を使用して、製造業者の推奨に従って決定した。発光は、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。シングルポイントアッセイでは、消耗したハイブリドーマ培養上清試料中のヒトＩｇＧを定量し、固定濃度に正規化し、２．０μｇ／ｍＬで試験した。ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナルの３倍以上の誘導をもたらした抗体は合計２１６であり、その後のスクリーニングに進めた。
初代細胞結合アッセイ
初代ヒト及びカニクイザル細胞によって発現したＣＤ１１２Ｒへのハイブリドーマ上清の結合を、フローサイトメトリーによって試験した。ヒト初代細胞結合アッセイのために、精製ヒトＴ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ．）を解凍し、２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ）を予めコーティングしたプレート中、５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３クローンＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間、Ｔ細胞を刺激した。７２時間後、細胞を取り出し、洗浄し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）と共に０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。次いで、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２でさらに５日間インキュベートした。カニクイザル初代細胞結合アッセイのために、カニクイザルＰＢＭＣ（ＳＮＢＬ）を解凍し、４×１０６～５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ）を予めコーティングしたプレート中、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３クローンＳＰ３４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間、ＰＢＭＣを刺激した。７２時間後、細胞を取り出し、洗浄し、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）と共に０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。次いで、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２でさらに７日間インキュベートした。
４８～７２時間毎に新鮮なＩＬ－２添加を含む完全な培地交換を、ヒト細胞及びｃｙｎｏ細胞の両方で行った。各培地交換時に、細胞を０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。最終インキュベーション後、細胞を、標準化ハイブリドーマ上清、陽性対照抗体及びアイソタイプ対照抗体と共に最終濃度１０μｇ／ｍＬでインキュベーションすることによってフローサイトメトリー用に調製した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ）を５μｇ／ｍＬで二次検出に使用し、８．２５ｎＭのＹｏＰｒｏ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を生／死細胞染色に使用した。次いで、細胞をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで泳動させて、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体結合を検出した。
ｗａｖｅ １における１２００を超える抗体が、２９３Ｔ細胞上に一過性で発現したヒトＣＤ１１２Ｒ受容体に結合することが確認された。これらのうち、２１６抗体はＪｕｒｋａｔ細胞上に発現した内因性ヒトＣＤ１１２Ｒ受容体に結合し、ＣＤ１１２Ｒ活性のアンタゴニストとしても機能することが見出された。ＣＤ１１２Ｒのカニクイザルオルソログと交差反応する抗体を確認するために、１２００個超の組換えヒトバインダーのパネルを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞上に一過性に発現した組換えｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒへの結合について試験した。パネルの２７４の抗体がｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに結合することが見出され、そのうち２つ（１１Ｅ４及び１Ｅ１）のみが初代ｃｙｎｏＴ細胞に発現した内因性のｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに結合することが見出された。
第２のＷａｖｅ及び抗体の選択
ＸＭＧ２ｋｌ株に加えて、カスタム生成されたＸＭＧ２ＣＤ１１２Ｒノックアウト（ＫＯ）マウス株を含む、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ免疫化の第２のｗａｖｅを行った。ハイブリドーマ細胞を、実質的に上記のように作製し、図３に記載のスクリーニングアッセイを用いて、ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗体を特定し選択した。第２のｗａｖｅからの収穫物６～９の代表的なデータを図４Ｂ及び４Ｃに示す。第２のｗａｖｅは１３００を超えるヒトＣＤ１１２Ｒ特異的抗体をもたらし、そのうちの３５０はＪｕｒｋａｔ ＲＧＡによって決定されたように、ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼシグナルの３倍以上の誘導をもたらした。組換えヒトＣＤ１１２Ｒバインダーのｗａｖｅ２パネルでは、２９３Ｔ細胞上に一過性に発現した組換えｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに結合したのはわずか３３６個であり、初代ｃｙｎｏＴ細胞上に発現した内因性ｃｙｎｏＣＤ１１２Ｒに結合したのはわずか２７個の抗体であった。
第１及び第２のｗａｖｅからの抗体収穫物の特徴の要約を図５Ａ及び５Ｂに提供する。Ｊｕｒｋａｔ ＲＧＡによる決定でアンタゴニスト機能を示し、ヒト及びｃｙｎｏ初代細胞結合アッセイによる決定で抗原結合活性を示した抗体を、その後の特徴付けスクリーニング、配列決定、及び親和性決定に進めた。
可溶性ｈＣＤ１１２Ｒによる抗ｈＣＤ１１２Ｒ抗体のハイスループットＫｉｎＥｘＡアフィニティーランキング
ヒトＣＤ１１２Ｒに特異的な選択モノクローナル抗体を、ハイスループット（ＨＴ）ＫｉｎＥｘＡ法を使用し、１００ｐＭのＫｄカットオフを使用して、親和性をランク付けした。この方法は、抗体がＫｄカットオフにおける抗原濃度とＫｄカットオフ濃度未満のＡｂ濃度で平衡化される場合、平衡状態で存在する遊離ＡｂはそのＫｄが１００ｐＭ以下である場合、５０％以下であるという理論に基づいている。
簡潔に記載すると、実験は、２５ｐＭの各抗体を、ＰＢＳ／０．０５％ＮａＮ３／０．０１％ＢＳＡ中、１００ｐＭのｈＣＤ１１２Ｒを用いて、又は用いずに、室温で２４時間平衡化することによって行った。平衡状態で、平衡混合物中及び抗体単独チューブ中に存在する遊離抗体をＫｉｎＥｘＡ中で測定した。ｈＣＤ１１２ＲでコーティングしたＰＭＭＡビーズを使用して遊離Ａｂを捕捉し、Ｍｕ抗ｈＩｇＧ２、Ｇ３、Ｇ４＋抗ｍｕＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ６４７の混合物を使用して検出した。
抗体単独によって生成されたＫｉｎＥｘＡシグナルを１００％遊離とみなし、以下のように抗原の存在下で測定されたシグナルから阻害遊離画分（ＩＦＦ）％を計算する：
最も低いＩＦＦ％を示す抗体は最も高い親和性を有し、逆に、最も高いＩＦＦ％を示す抗体は最も低い親和性を有し、グラフにＩＦＦ％をプロットすることによってそれらをランク付けすることができる。５０％以下のＩＦＦを与えるモノクローナル抗体は、１００ｐＭのＫｄカットオフを通過したはずであり、これは、それぞれ１００ｐＭ以下のＫｄを有するはずであることを意味する。
結果を、図６に示す。分析した１０種の抗体のうち、８種は１００ｐＭ未満のＫＤを示し、２種のみが１００ｐＭを超えるＫＤを示した。
ＣＤ１１２Ｒアンタゴニスト抗体の分子レスキュー及び配列決定
選択ＣＤ１１２Ｒ抗体の重鎖及び軽鎖の分子配列決定を行った。簡潔に記載すると、ＲＮＡ（全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ｍＲＮＡキャッチャープラスキットを使用して、ＣＤ１１２Ｒアゴニスト抗体産生ハイブリドーマ細胞を含有するウェルから精製した。精製したＲＮＡを用いて、逆転写によるｃＤＮＡ合成、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）により抗体重鎖及び軽鎖の可変領域（Ｖ）遺伝子を増幅した。完全ヒト抗体ガンマ重鎖を、Ｑｉａｇｅｎ１ステップ逆転写酵素ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得た。この方法を用いて、ＲＮＡ鋳型から最初のｃＤＮＡ鎖を生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲによりガンマ重鎖の可変領域を増幅した。５’ガンマ鎖特異的プライマーを抗体重鎖のシグナル配列にアニーリングし、一方、３’プライマーをガンマ定常ドメインの領域にアニーリングした。完全ヒトカッパ軽鎖を、Ｑｉａｇｅｎ１ステップ逆転写酵素ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得た。この方法を用いて、ＲＮＡ鋳型から最初のｃＤＮＡ鎖を生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲによりカッパ軽鎖の可変領域を増幅した。５’カッパ軽鎖特異的プライマーを抗体軽鎖のシグナル配列にアニーリングし、一方、３’プライマーをカッパ定常ドメインの領域にアニーリングした。完全ヒトラムダ軽鎖を、Ｑｉａｇｅｎ１ステップ逆転写酵素ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得た。この方法を用いて、ＲＮＡ鋳型から最初のｃＤＮＡ鎖を生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲによりラムダ軽鎖の可変領域を増幅した。５’ラムダ軽鎖特異的プライマーを軽鎖のシグナル配列にアニーリングし、一方、３’プライマーをラムダ定常ドメインの領域にアニーリングした。
増幅したｃＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩ及びアルカリホスファターゼを用いて酵素的に精製し、精製したＰＣＲ産物を直接配列決定した。アミノ酸配列は、対応する核酸配列からバイオインフォマティックスにより推定した。観察されたいずれの変異もＰＣＲの結果ではないことを確認するために、各ハイブリドーマ試料について、２つの追加の独立したＲＴ－ＰＣＲ増幅及び配列決定サイクルを完了した。次に、得られたアミノ酸配列を分析して、抗体の生殖細胞系列配列起点を決定し、生殖細胞系列配列からの差異を同定した。配列決定された抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応するアミノ酸配列をアラインさせ、これらのアラインメントを使用してクローンを類似性によってグループ化した。配列をまた、「ホットスポット」（分子の発現、精製、熱安定性、コロイド安定性、長期保存安定性、インビボ薬物動態、及び／又は免疫原性に悪影響を及ぼすとコンピュータにより予測されたか又は経験的に決定された残基）について分析した。アッセイの結果を図７Ａに示す。図７Ｂは配列多様性について分析された抗体を列挙し、ＶＨ生殖系列及びＨＣ ＣＤＲ３残基を示す。各抗体についてＪｕｒｋａｔ ＲＧＡによって決定されたＥＣ５０（ｎＭ）も列挙する。スクリーニングの次のラウンドに進むために、配列多様性分析及びホットスポット分析に基づいて、図７Ｂの抗体リストを、以下の抗体に絞った：１Ｅ１、１１Ｅ４、２７Ｇ１２、２９Ｅ１０、３１Ｂ３及び２４Ｆ１。
ヒトＣＤ１１２Ｒ受容体－リガンド競合アッセイ
ヒトＣＤ１１２Ｒ結合ハイブリドーマ上清を、以下のように、ビーズ上のフローサイトメトリーを用いて、ヒトＣＤ１１２Ｌを遮断するそれらの能力について試験した。ビオチン化ヒトＣＤ１１２Ｒ－Ｆｃを、ＦＡＣＳ緩衝液中のストレプトアビジンポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、カタログ 番号ＳＶＰ－６０－５）に捕捉させ、室温で３０分間インキュベートした。ビーズをＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、遠心分離してビーズをペレット化し、上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、結合していないタンパク質を除去した。ビオチン化ヒトＣＤ１１２Ｒコーティングビーズを９６ウェルプレートに加えた。ハイブリドーマ上清試料を最終的に５μｇ／ｍＬとなるように加え、ビーズを再懸濁し、室温で１時間インキュベートした。製造業者によって記載されたプロトコルに従って標識され、ＦＡＣＳ緩衝液中で作製された、Ｚｅｎｏｎ（商標）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ 番号Ｚ２５４０８）標識ＣＤ１１２－ｈｕＦｃリガンドを、３７０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加し、暗所において室温で１５分間インキュベートした。ビーズをＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、遠心分離してビーズをペレット化し、上清を除去し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁して、結合していないリガンドを除去した。次いで、試料をＦＡＣＳバッファーに再懸濁し、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを用いてＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーターで読み取った。
結果を図８に示す。この図に示すように、６つの抗体（１Ｅ１、１１Ｅ４、２７Ｇ１２、２９Ｅ１０、３１Ｂ３及び２４Ｆ１）は全て、有意な阻害活性を示し、約９０％以上のＣＤ１１２リガンドがＣＤ１１２Ｒ受容体に結合するのを妨げた。６つの抗体の阻害活性は、それぞれ０．１２ｎＭ及び０．１０ｎＭのＩＣ５０を有する２つの参照抗ＣＤ１１２Ｒ抗体、ＰＬ－５２５７５及びＰＬ－５２５７７の阻害活性と同等であった。
ＣＤ１１２Ｒ抗体のリードパネルのための競合ベースのビニング
選択されたヒトＣＤ１１２Ｒ結合ハイブリドーマ上清を、Ｏｃｔｅｔ ＨＴＸプラットフォームを利用することにより、競合に基づくビニングについて試験した。抗体を、１０ｍＭトリス、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含むアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４）中、２μｇ／ｍＬで、２分間、Ａｎｔｉ－ＨｕＦｃ（動態）バイオセンサーＦｏｒｔｅＢｉｏ １８－５０６４にロードした。その後、バイオセンサーを、アッセイ緩衝液中、５０μｇ／ｍＬの無関係なＨｕＩｇＧ２で５分間ブロックした。１μｇ／ｍＬのＣＤ１１２Ｒをアッセイ緩衝液中で２分間結合させ、次いで、バイオセンサーをアッセイ緩衝液中に１分間浸漬させて、ベースラインシグナルを確立した。ベースラインシグナルが確立された後、２μｇ／ｍＬの抗体（バイオセンサーに結合した抗体とは異なる）を、ＣＤ１１２Ｒへの結合についてバイオセンサー結合抗体と競合する能力を試験した。データを、第２の抗体結合工程の終了時のシグナルが決定されるＦｏｒｔｅＢｉｏＨＴデータ分析ソフトウェアＶ１１．１を用いて分析した。第２の抗体結合工程の終了時のシグナルがベースラインと異なる場合、第２の抗体は、ＣＤ１１２Ｒへの結合について第１の抗体と競合する。
このアッセイの工程の概略図を図９Ａに示す。この概略図では、抗体３１Ｂ３がバイオセンサーに結合される。第２の抗体結合工程で使用される抗体がバイオセンサーに結合した抗体と同じである場合、シグナルはベースラインに対して変化しない。水色の線を確認されたい。しかしながら、第２の抗体結合工程で使用される抗体がバイオセンサーに結合した抗体、例えば２４Ｆ１とは異なり、且つシグナルがベースラインシグナルよりも高い場合、第２の抗体はＢｉｎ Ａに入れる。紫色の線を確認されたい。第２の抗体結合工程で使用される抗体がバイオセンサーに結合した抗体とは異なり、且つシグナルがベースラインより高くない場合、抗体はＢｉｎ Ｂに入れる。
結果を図９Ｂに示す。この図に示すように、抗体２４Ｆ１、２７Ｇ１２、２９Ｅ１０、１Ｅ１、及び１１Ｅ４は全て互いに競合し、Ｂｉｎ Ａに割り当てられた。抗体３１Ｂ３は、他の抗体と競合せず、したがって、Ｂｉｎ Ｂに割り当てられた。
初代ヒト及びＣｙｎｏＴ細胞への結合の確認
初代ヒト及びｃｙｎｏＴ細胞を調製し、実質的に上記のように分析した。抗体１Ｅ１、１１Ｅ４、２７Ｇ１２、２９Ｅ１０、３１Ｂ３及び２４Ｆ１を含有する消耗したハイブリドーマ培養上清を定量し、次いで、初代Ｔ細胞の表面への結合を滴定した。Ｐｒｉｓｍを用いたカーブフィッティング分析により、初代細胞への結合に対するＥＣ５０値を決定することができた。
全ての抗体１Ｅ１、１１Ｅ４、２７Ｇ１２、２９Ｅ１０、３１Ｂ３及び２４Ｆ１で、ヒトＴ細胞への結合のＥＣ５０値は、ｃｙｎｏＰＢＭＣへの結合の１０倍以内であった。
簡潔に記載すると、培養されたヒトＴ細胞及びｃｙｎｏＰＢＭＣを、ヒトでは３μｇ／ｍＬ、ｃｙｎｏでは５μｇ／ｍＬで開始するリードパネルと共にインキュベートし、ヒトにでは０．００１μｇ／ｍＬ、ｃｙｎｏでは０．００２μｇ／ｍＬの最小濃度で１／３で滴定した。５μｇ／ｍＬのＡＦ ６４７ ｇｔ抗ｈｕ ＩｇＧ Ｆｃを二次抗体として使用し、ＹｏＰｒｏ１を生／死細胞染料として使用した。１Ｅ１及び１Ｅ３（これら２つは、精製ｍＡｂを使用した）を除く全てのリードで消耗した上清（ＥＳＮ）を使用した。十分な１１Ｅ４ ＥＳＮがなかったので、１１Ｅ４に構造的に近い１１Ｂ１をアッセイに使用した。分析では、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓを使用してＧｅｏＭｅａｎｓを得、Ｓｃｒｅｅｎｅｒを使用して、アイソタイプ対照、滴定曲線及びＥＣ５０値に対する倍率を決定した。
ｃｙｎｏＰＢＭＣ及びヒトＴ細胞を用いたアッセイの結果を、それぞれ図１０Ａ及び１０Ｂと、表１に示す。図１０Ａ及び１０Ｂのグラフは、示された抗体のｌｏｇ濃度の関数としてプロットされたアイソタイプ対照シグナルに対する倍率をプロットする。表１は、各抗体のＥＣ５０（ｎｇ／μＬ）を提供する。
表１に示すように、１Ｅ１は、初代ヒト及びｃｙｎｏ細胞で発現したＣＤ１１２Ｒに対して最も高い結合親和性を示した。２９Ｅ１０及び２４Ｆ１のＥＣ５０は、２種間及び相互に非常に類似していた。１１Ｂ１はヒトに対して０．１０８ｎｇ／μＬという高いＥＣ５０を示したが、Ｃｙｎｏに対しては０．０２８１ｎｇ／μＬという低いＥＣ５０を示した。
効力の確認
アッセイ培地中２倍で連続的に滴定した、消耗したハイブリドーマ培養上清試料又は精製抗体のシングルポイント分析のために、ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ１１２Ｒ／ＮＦＡＴ－ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を、実質的に上記のようにして実行し、抗体パネルの最終効力を決定した。結果を図１１Ａに示し、これは、示された抗体のｌｏｇ濃度の関数としてプロットしたＮＦＡＴルシフェラーゼ誘導のグラフを提供する。図１１Ａに示すように、試験した全ての抗体は、ＣＤ１１２Ｒアンタゴニストとしての効力を示す。再消耗したハイブリドーマ培養上清に対する効力は非常に類似していた（１．３～３．５ｎＭの範囲）（図１１Ｂ）。
ＣＤ１１２Ｒ抗体のホットスポット改変
カッパ軽鎖のＶＬドメインをＣκドメインに融合し、ＶＨドメインをＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３配列に融合することによって、選択抗ＣＤ１１２Ｒ抗体をＩｇＧ１サブタイプの標準的な抗体構成に変換した。この抗体アイソタイプのＣＨ２ドメインは、Ｎ２９７Ｇ変異を組み込むことによってエフェクター機能が低下するように、また改変ジスルフィド結合（Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ）によって熱安定性が改善するように改変されており、この抗体アイソタイプをＳＥＦＬ２－２と称する。抗ＣＤ１１２Ｒ抗体をさらに操作して、「ホットスポット」、又は分子の発現、精製、熱安定性、コロイド安定性、長期保存安定性、インビボ薬物動態、及び／又は免疫原性に悪影響を及ぼすとコンピュータにより予測されたか又は経験的に決定された残基を除去した。これらのホットスポットにおける様々なアミノ酸変異を、保存、共変異、化学的類似性、構造モデリングからの予測、及び他の抗体工学キャンペーンからの予備知識に基づいて設計した。単一の変異及び変異の組み合わせの両方を含む改変抗体を設計した。
改変バリアントを、設計された可変ドメインを含む合成ＤＮＡ断片を順序付けし、これらをゴールデンゲートクローニング法を使用して、ピューロマイシン選択下で定常ＨＣドメインを、又はハイグロマイシン選択下で定常ＬＣドメインを含有する安定な哺乳動物発現ベクターに挿入することによってクローニングした。ＣＨＯ－Ｋ１細胞においてＨＣ及びＬＣを同時トランスフェクトし、ピューロマイシン及びハイグロマイシンを用いて安定な発現を選択することによって、抗体を発現させた。抗体を、ＡｍＭａｇＴＭプロテインＡ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。各分子の同一性を、インタクトな質量分析によって確認した。各バリアントについて、馴化培地中の発現力価を、プロテインＡセンサーを用いるＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後に存在する高分子量材料の割合（ＨＭＷ％）を、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって測定し、純度を、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた非還元マイクロキャピラリー電気泳動における主ピーク％によって測定した。第１の溶融転移のＴｍ（Ｔｍ１）及び凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を用いてＤＳＦにより測定した。抗体活性を、上記のようにＣＤ１１２Ｒ Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイによって測定し、２つの独立した測定値を平均した。改変バリアントの分析結果を、以下の表２に示す。
ＣＤ１１２Ｒ抗体のフレームワーク改変
抗ＣＤ１１２Ｒ抗体１１Ｅ４（それぞれ配列番号１０１及び１０２のＨＣ可変領域配列及びＬＣ可変領域配列を含む）を、良好に挙動するＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５、ＶＫ１及びＶＫ３生殖系列を優先して、選択された代替ヒトフレームワークに各抗体のＣＤＲをグラフトすることによって、製造可能性が改善するように改変した。代替フレームワークは、配列類似性を考慮して選択した。グラフト前後の配列、特にグラフト接合部の配列を注意深く調べ、いくつかの場合においては、標的とした復帰変異を、ＣＤＲループの機能的コンフォメーションを保持する最良の機会を提供するように設計した。
設計された可変ドメインを含む合成ＤＮＡ断片を順序付けし、これらをゴールデンゲートクローニング法を使用して、定常ＨＣ又はＬＣドメインを含有する安定な哺乳動物発現ベクターに挿入することによって、フレームワーク改変バリアントをクローニングし、ＡｍＭａｇＴＭプロテインＡ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。各バリアントの同一性を、インタクトな質量分析によって確認した。各バリアントについて、馴化培地中の発現力価を、プロテインＡセンサーを用いるＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後に存在する高分子量材料の割合（ＨＭＷ％）を、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって測定し、純度を、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた非還元マイクロキャピラリー電気泳動における主ピーク％によって測定した。第１の溶融転移のＴｍを、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を用いてＤＳＦにより測定した。精製試料を４０℃で２週間インキュベートし、分析サイズ排除クロマトグラフィーにより主ピーク％の変化を測定した。抗体活性を、上記のようにＣＤ１１２Ｒ Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイによって測定し、２つの独立した測定値を平均した。改変バリアントの分析結果を、表３に示す。
ＣＤ１１２Ｒ抗体の酵母ディスプレイの改変
抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の３１Ｂ３、１１Ｅ４、２９Ｅ１０、１Ｅ１．０１６及び２４Ｆ１を、製造可能性が改善され、且つ酵母ディスプレイによるＣＤ１１２Ｒへの結合が増加するように改変した。１１Ｅ４及び１Ｅ１．０１６のためのライブラリー設計は、ＣＤＲウォークを、ＣＤＲにわたって３連で使用して、化学的ホットスポットの負債を含む全てのＣＤＲアミノ酸をカバーした。他の４つの抗体は、ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅ計算論的モデリングソフトウェアパッケージ（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、２０２０）による相同性モデリング及びパッチ分析によって決定された、不良な表面特性の一因であると予測されるそれらの化学的ホットスポット負債及び残基付近に特異的に設計されたライブラリーを有した。蛍光二次物質としてストレプトアビジンＰＥを用いて、ビオチン結合組換えＣＤ１１２Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への高結合について、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてライブラリーを選別した。選別された結合／ディスプレイ二重陽性プール及びディスプレイ陽性プールに存在する可変ドメインを、ＨＣ及びＬＣのＦＷ１及びＦＷ４ドメインに特異的なプライマーを用いて増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑによるＮＧＳ分析に２×３００ｂｐランで供した。陽性結合アミノ酸頻度の比率を陽性ディスプレイアミノ酸頻度で割り、次いで、親配列比率に対し正規化した共通の頻度分析によりデータを処理した後に変異を選択した。濃縮値が親配列以上であった配列を、有益又は許容される多様性とみなし、親和性成熟後のさらなる合理的な抗体操作に使用した。改善された親和性の選択のために、親以上の結合を有する、ＨＣ及びＬＣライブラリーからのバインダープールの配列を用いて、新しい鎖シャッフルライブラリーを構築した。次いで、これらのライブラリーを、酵母上のＣＤ１１２Ｒへの結合を保持する配列について、各ラウンドの濃度を低下させながら、３ラウンド濃縮した。その後、個々の酵母クローンの結合を分析し、配列を決定して、選択された親和性の成熟した／不十分な特性の修復バリアントを得た。バリアントを、上記のように組換え発現系にクローニングした。改変バリアントの分析結果を、以下の表４及び５に示す。
実施例４
この実施例は、ツールＴＩＧＩＴ抗体を特徴付けるために実施された予備的な生化学的及び機能的実験を示す。
競合的受容体－リガンド（Ｒ－Ｌ）結合アッセイを、ヒトＴＩＧＩＴを一過性に発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を使用して、ＴＩＧＩＴ抗体１０Ａ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＴＩＧＩＴ抗体）及びＭＢＳＡ４３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）カタログ番号１６－９５００－８５）に対して行った。簡潔に記載すると、ヒトＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を抗体試料と混合し、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４＋２％ウシ胎仔血清）中、４℃で１時間インキュベートした。次いで、試料が結合した細胞を、４℃で４５分間、２．５μｇ／ｍＬのｈｕＣＤ１５５－Ｆｃ－Ａｌｅｘａ ６４７（自社で作製及び標識）又は１５μｇ／ｍＬのＣＤ１１２－Ｆｃ－Ａｌｅｘａ ６４７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １０００５－Ｈ０２Ｈ；自社で標識）と共にインキュベートした。次いで、７－ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ カタログ番号Ａ９４００－５ＭＧ；７．５μｇ／ｍＬ）細胞生存率測定用染料を添加し、細胞をさらに１５分間４℃でインキュベートし、２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター及びＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを用いて分析した。結果を図１２Ａ及び１２Ｂに示す。図１２Ａは、ツールＴＩＧＩＴ抗体濃度の関数としてプロットされたＣＤ１５５－ＦｃへのＴＩＧＩＴの結合の阻害％のグラフである。図１２Ｂは、抗体濃度の関数としてのＣＤ１１２－Ｆｃへの結合の阻害％のグラフである。図１２Ａ及び１２Ｂに示した結果は、１０Ａ７及びＭＢＳＡ４３ツール抗体がＣＤ１５５及びＣＤ１１２のＴＩＧＩＴとの相互作用をいずれも阻害することを示している。
ツールＴＩＧＩＴ抗体がＣＤ２２６と２９３Ｔ細胞によって内因的に発現されるＣＤ１５５との間の結合相互作用を阻害し得るかどうかを決定するために、さらなる結合アッセイを行った。２９３Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ１５５を内因的に発現する。２９３Ｔ細胞にヒトＴＩＧＩＴを一過性にトランスフェクトさせる（ＴＩＧＩＴ－２９３細胞）か、又はモックトランスフェクトさせた（Ｍｏｃｋ－２９３又は２９３Ｔ Ｍｏｃｋ）。ツールＴＩＧＩＴ抗体の非存在下では、ＣＤ２２６はＴＩＧＩＴ－２９３細胞によって発現されたＴＩＧＩＴによって内因性ＣＤ１５５への結合をブロックされるが、Ｍｏｃｋ－２９３細胞（ＴＩＧＩＴを一過性に発現しない）の状況ではブロックされない。ツールＴＩＧＩＴ抗体の存在下では、ＴＩＧＩＴ－２９３細胞によって発現されるＴＩＧＩＴは、ツール抗体によって結合され、ＣＤ１５５への結合がブロックされ、それによってＣＤ２２６のＣＤ１５５との相互作用が可能になる。図１２Ｃは、アッセイの概略図である。ＴＩＧＩＴ－２９３細胞又はＭｏｃｋ－２９３細胞を、１０μｇ／ｍＬのヒトＣＤ２２６－Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ、６６６－ＤＮ）を含む又は含まない抗体試料と混合し、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４＋２％ウシ胎仔血清）中、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、Ｇｔ抗Ｈｕ ＩｇＧ－Ｆｃ Ａｌｅｘａ（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－６０５－０９８）及び７－ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ、９４００－５ＭＧ）と共に４℃で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター及びＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを用いて分析した。結果を図１２Ｄ～１２Ｅに示す。図１２Ｄのデータは、ｈｕＣＤ２２６がｈｕＣＤ１５５を内因的に発現する２９３Ｔ Ｍｏｃｋ細胞（白丸）に結合し得ることを示している。過剰発現したｈｕＴＩＧＩＴ（黒四角）の存在下では、ＣＤ２２６結合は、ｈｕＣＤ１５５とのシス相互作用をブロックされる。図１２Ｅは、ＴＩＧＩＴツール抗体１０Ａ７（白丸）又はＭＢＳＡ４３（黒四角）による処理が、ツール抗体がＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５のシス相互作用をブロックするので、ＣＤ２２６のＣＤ１５５への結合能力を回復させることを示している。ＣＤ１５５へのＣＤ２２６の結合が完全に遮断されたことを示すため、無関係なアイソタイプ対照（半開菱形）による細胞の処理を含めた（アイソタイプ対照がＴＩＧＩＴに結合しなかったと仮定）。データは、両ツールＴＩＧＩＴ抗体が、ＣＤ１５５－ＴＩＧＩＴ相互作用を妨害すること、１０Ａ７ツール抗体がＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用の妨害に優れていることを支持する。
ＩＦＮ放出アッセイを実施して、ツールＴＩＧＩＴ抗体の機能的効果を決定した。ＩＦＮ放出アッセイでは、ＣＨＯ－Ｋ１－ｈｕＣＤ１５５活性化細胞で刺激された初代ヒトＣＤ８＋記憶Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮγを測定した。図１２Ｆに示した結果は、ＭＢＳＡ４３ツール抗体のみがＩＦＮγ放出を誘導することができたことを示している。ＭＢＳＡ４３とは異なり、１０Ａ７抗体は、刺激されたＴ細胞によるＩＦＮγ放出を活性化することができなかった。
ＩＬ－２プロモーターの制御下でのルシフェラーゼ活性アッセイもまた、ツールＴＩＧＩＴ抗体の機能的効果を決定するために実施した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を、ヒトＣＤ１５５及びＣＤ３－アクチベーターを発現するＣＨＯ細胞によって、ツール抗体又はアイソタイプ対応抗体対照の存在下で、ＩＬ－２プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター遺伝子を刺激した。図１２Ｇに示した結果は、ＭＢＳＡ４３ツール抗体のみがＴＩＧＩＴに結合し、ＣＤ１５５－ＴＩＧＩＴ相互作用を遮断し、Ｔ細胞活性化誘導事象（例えば、ＩＦＮ放出、ＩＬ－２プロモーターの活性化）の回復をもたらしたという点で、図１２Ｆの結果と一致する。
これらの結果は、ツールＴＩＧＩＴ抗体ＭＢＳＡ４３及び１０Ａ７の両方がＴＩＧＩＴに結合し、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５シス相互作用をブロックすることができるが、ＭＢＳＡ４３ツール抗体のみが、ＴＩＧＩＴ媒介Ｔ細胞抑制をブロックすることができたことを示す。
初代ｃｙｎｏサルＴ細胞及びＣＨＯ及び２９３Ｔ細胞に一過性に発現したｃｙｎｏＴＩＧＩＴを用いて、ツールＴＩＧＩＴ抗体のｃｙｎｏＴＩＧＩＴに結合する能力を試験した。ｃｙｎｏＴＩＧＩＴを一過性に発現する２９３Ｔ細胞又はベクター単独を、ツール抗体ＭＢＳＡ４３、１０Ａ７又は１Ｆ４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ ＴＩＧＩＴ抗体）を含む試料と混合し、ＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で１時間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、次いで、ヤギ（Ｇｔ）抗ＨｕＩｇＧ－Ｆｃ Ａｌｅｘａ－６４７又はＧｔ抗Ｍｕ ＩｇＧ－Ｆｃ Ａｌｅｘａ－６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－６０５－０７１）及び７－ＡＡＤと共に４℃で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター及びＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを用いて分析した。
結果を図１２Ｈ及び１２Ｉに示す。図１２Ｈは、１Ｆ４（黒丸）、１０Ａ７（黒四角）及びＭＢＳＡ４３（黒三角）のそれぞれが、２９３Ｔ細胞において一過性に発現されたｃｙｎｏＴＩＧＩＴに結合することを示す。抗体濃度の増加とともに、ベクター単独対照とのＧｅｏＭｅａｎ倍率差が増加していることが観察されるが、ＩｇＧアイソタイプ対照（白菱形）との結合は見られない。しかし、ＭＢＳＡ４３及び１Ｆ４のみが初代活性化ｃｙｎｏＴ細胞への結合を示した（図１２Ｉ）。１０Ａ７のＦＡＣＳプロットは、アイソタイプ対照抗体のＦＡＣＳプロットと重なっており、１０Ａ７が初代活性化ｃｙｎｏＴ細胞に結合しないことを示唆した（図１２Ｉ）。
実施例５
この実施例は、ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成を示す。
抗ＴＩＧＩＴ免疫応答の生成
ネズミ株と免疫化
ヒトＴＩＧＩＴに対する完全ヒト抗体を、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）トランスジェニックマウスを実質的に上記のように免疫化することによって作製した。ＸＭＧ４及びＸＭＧ２ ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）株由来の動物を、これらの免疫化のために使用した。複数の免疫原及び免疫化経路を使用して、抗ヒトＴＩＧＩＴ免疫応答を生成した。ＴＩＧＩＴ特異的血清力価を、一過性にトランスフェクトされた懸濁ＣＨＯ細胞を使用して、Ａｃｃｕｒｉフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による生細胞ＦＡＣＳ分析によってモニターした。ヒトＴＩＧＩＴに対して最高の抗原特異的血清力価を有する動物をハイブリドーマ作製のために殺処理し使用した（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５）。ハイブリドーマを、実質的に実施例３に記載のようにして生成した。
ＴＩＧＩＴ特異的結合抗体の選択
いくつかのスクリーニングアッセイを用いて、抗ヒトＴＩＧＩＴ抗体を同定及び選択した（図１３）。
ＴＩＧＩＴ特異的血清力価を、生細胞ＦＡＣＳ分析によってモニターした。消耗したハイブリドーマ上清を、ＣＨＯ－Ｓ試料で一過性に発現させたヒト又はｃｙｎｏＴＩＧＩＴへの結合について試験し、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター及びＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラー又はＣｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔを用いて分析した。ＦＡＣＳに基づくスクリーニングのために、ＣＨＯ－Ｓ細胞を、ＰＥＩ ＭＡＸを使用して、ヒト又はカニクイザルＴＩＧＩＴをコードする哺乳動物発現コンストラクトで一過性にトランスフェクトした。トランスフェクションの３時間後、５ｍＭの酪酸ナトリウムを加え、２４時間インキュベートした。翌日、１５μＬの消耗したハイブリドーマ培地を３８４ウェルＦＭＡＴプレートの各ウェルに加えた。トランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞及びモックトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｓ細胞（２５，０００細胞／ウェル 合計）を、消耗したハイブリドーマ試料と混合し、ＦＡＣＳ緩衝液中、４℃で１時間インキュベートした。１時間後、細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ ｐＨ７．４＋２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、次いで、Ｇｔ抗ＨｕＩｇＧ－Ｆｃ Ａｌｅｘａ－６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ、１０９－６０５－０９８）又はＧｔ抗ＭｕＩｇＧ－Ｆｃ Ａｌｅｘａ－６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ １１５－６０５－０７１）及び７－ＡＡＤ（Ｓｉｇｍａ、９４００－５ＭＧ）と共に４℃で１５分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で１回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター及びＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを用いて分析した。イメージングスクリーニングのために、ＣＨＯ－Ｓ又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、それぞれＰＥＩ ＭＡＸ又は２９３Ｆｅｃｔｉｎを使用して、ＴＩＧＩＴをコードする哺乳動物発現コンストラクトで一過性にトランスフェクトした。翌日、１５μＬの消耗したハイブリドーマ培地を３８４ウェルＦＭＡＴプレートの各ウェルに加えた。トランスフェクト細胞（２７万個／ｍＬ）、核染色Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（７．５μｇ／ｍＬ）及び二次検出抗体（０．７５μｇ／ｍＬ－ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ａｌｅｘａ ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ））を混合し、この混合物３０μＬを３８４ウェルＦＭＡＴプレートの各ウェルに加えた。約３時間後、上清をＡｑｕａＭａｘプレートリーダーを用いて吸引し、３０μＬのＦＡＣＳ緩衝液を、ｍｕｌｔｉｄｒｏｐ装置を用いて各ウェルに添加した。これらのプレートをＢｉｇ Ｂｅａｒプレート振盪機上に置き、ウェル中に細胞を均一に分布させ、次いで、Ｃｅｌｌ Ｈｅａｌｔｈ Ｂｉｏ－Ａｐｐを使用してＣｅｌｌ Ｉｎｓｉｇｈｔプラットフォームで読み取った。
これらの技術を用いて、ヒトＴＩＧＩＴに特異的な抗体を産生するハイブリドーマ細胞を、表６に概説するように同定した。
ＪｕｒｋａｔヒトＴＩＧＩＴ／ＩＬ－２－ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）
ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用をブロックすることによってＴ細胞活性を増強することができるハイブリドーマ又は精製抗ＴＩＧＩＴ抗体をスクリーニングするために、Ｊｕｒｋａｔ細胞におけるＩＬ－２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を用いた。ＲＧＡは、ヒトＴＩＧＩＴ（ＣＤ１１２Ｒではない）及びＩＬ－２－ルシフェラーゼレポーター（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＣＳ１９１１０３Ａ）を安定に発現するＪｕｒｋａｔ細胞を、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ）、２ｍＭ Ｌ－グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１×ＭＥＭ ＮＥＡＡ（Ｓｉｇｍａ）、１×ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）、５００μｇ／ｍＬゲネチシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｓｉｇｍａ）中で培養したことを除いて、実施例２に記載のものと非常に類似した。ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＩＬ－２－ｌｕｃ２Ｐ／ＴＩＧＩＴ／Ｊｕｒｋａｔレポーター細胞株（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＣＳ１９１１０３Ａ）を、ヒトＣＤ１５５を安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）－Ｋ１細胞及びヒトＴ細胞エンゲージャー（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号ＣＳ１９１１０４Ａ）と共に共培養することにより、Ｔ細胞受容体に結合させて刺激した。Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２ ＨＡＭ（Ｓｉｇｍａ）、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５００μｇ／ｍＬゲネチシン及び２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを含有する完全増殖培地中、１×１０Ｅ４個のＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５＋細胞を、白色ハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ カタログ番号３６８８）に、３７℃／５％ＣＯ２で一晩播種した。図１４Ａは、ＲＧＡの概略図を示す。一晩インキュベートした後、増殖培地を、アッセイ培地（１％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地）中のハイブリドーマ上清又は抗体の存在下（それぞれの対照を含む）の５×１０４個のＪｕｒｋａｔ ＩＬ－２Ｌｕｃ／ＴＩＧＩＴ細胞に置き換え、３７℃／５％ＣＯ２で１８時間インキュベートした。各ウェル中のレポーターシグナルを、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ カタログ番号Ｇ７９４０）を使用して、製造業者の推奨に従って決定した。発光を、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。
活性抗体の選択を図１４Ｂに示す。図１４Ｂに示すように、ＴＩＧＩＴ抗体４３Ｂ７、１１Ａ３、３９Ｄ２、６６Ｈ９、２８Ｂ８、５５Ｇ７、４Ｇ１０及び４８Ｂ７は、ツール抗体ＭＢＳＡ４３よりも良好に機能した。これらの抗体の滴定を行い、抗ＴＩＧＩＴ抗体の効力を決定した。ＪｕｒｋａｔヒトＴＩＧＩＴ／ＩＬ－２－ルシフェラーゼＲＧＡにおけるこれらの抗ＴＩＧＩＴ抗体の活性を表７に示す。
ＴＩＧＩＴ機能ブロッキングアッセイ（初代Ｔ細胞アッセイ）
ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用を遮断することによってＴ細胞活性を増強することができる精製抗ＴＩＧＩＴ抗体をスクリーニングするために、初代ヒトＣＤ８メモリーＴ細胞からのＩＦＮ－γ放出を用いた。ＣＤ８記憶Ｔ細胞を、精製初代ヒトＴ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ．カタログ番号２１５－０１－１０）から、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＣＤ８＋ｖｅ記憶Ｔ細胞エンリッチメントキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ カタログ番号１９１５９）を用いて単離し、１μｇ／ｍＬ固定化抗ＣＤ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ カタログ番号１６－００３７）＋１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎカタログ番号５５５７２５）＋１０ｎｇ／ｍＬ ｒｈＩＬ－２（Ｒ ＆ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ カタログ番号２０２－ＩＬ－０５０／ＣＦ）で７日間、３７℃／５％ＣＯ２で予備刺激した。完全増殖培地中、１×１０４γ線照射ＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５＋細胞を、黒色ハーフエリア９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ カタログ番号３８７５）に、３７℃／５％ＣＯ２で一晩播種した。一晩インキュベーション後、増殖培地を、ＩＣＭ（免疫細胞培地：ＲＰＭＩ １６４０、１０％ウシ胎仔血清、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、１×ＭＥＭ ＮＥＡＡ、１×ピルビン酸ナトリウム及び５５ｍＭ ２－メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ））中の連続希釈抗体の存在下（それぞれの対照を含む）の５×１０３個のＣＤ８記憶Ｔ細胞に置き換え、３７℃／５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。次いで、培養上清を、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）により、製造業者の説明書（Ｃｉｓｂｉｏ カタログ番号６２ＩＦＮＰＥＣ）に従って、ＩＦＮ－γレベルを試験した。蛍光は、ＥｎＶｉｓｉｏｎプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。
結果を、図１４Ｃに示す。抗ＴＩＧＩＴ抗体は、ツール抗体ＭＢＳＡ４３と同様に、又はそれより良好に機能した。初代ＣＤ８記憶Ｔ細胞アッセイにおける抗ＴＩＧＩＴ抗体の３９Ｄ２、４３Ｂ７、及び２８Ｂ８の活性は、それぞれ３８０ｐＭ、９０ｐＭ、及び１６０ｐＭであった。ツールＴＩＧＩＴ抗体ＭＢＳＡ４３を対照として実行し、このツール抗体の効力は１９００ｐＭであった。
ＴＩＧＩＴのための初代細胞結合アッセイ
初代ヒト及びカニクイザル細胞によって発現したＴＩＧＩＴへのハイブリドーマ上清の結合を、フローサイトメトリーによって試験した。ヒト初代細胞結合アッセイでは、精製ヒトＴ細胞（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｏｒｐ．）を解凍し、２．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ）を予めコーティングしたプレート中、５μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３クローンＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及び１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間、Ｔ細胞を刺激した。７２時間後、細胞を取り出し、洗浄し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）と共に０．５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でさらに４８～７２時間インキュベートした。カニクイザル初代細胞結合アッセイのために、カニクイザルＰＢＭＣ（ＳＮＢＬ）を解凍し、４×１０６～５×１０６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。５μｇ／ｍＬの抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ）を予めコーティングしたプレート中、１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３クローンＳＰ３４（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及び１μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ２８（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間、ＰＢＭＣを刺激した。７２時間後、細胞を取り出し、洗浄し、２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－２（Ｐｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ）と共に０．５×１０Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で懸濁した。次いで、細胞を３７℃／５％ＣＯ２でさらに４８～７２時間インキュベートした。最終インキュベーション後、細胞を、標準化ハイブリドーマ上清、陽性対照抗体及びアイソタイプ対照抗体と共に最終濃度１μｇ／ｍＬでインキュベーションすることによってフローサイトメトリー用に調製した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）２断片ヤギ抗ヒＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒａｃｈ）を５μｇ／ｍＬで二次検出に使用し、８．２５ｎＭのＹｏＰｒｏ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を生／死細胞染色に使用した。次いで、細胞をＢＤ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ ＩＩフローサイトメーターで泳動させて、抗ＴＩＧＩＴ抗体結合を検出した。結果を、アイソタイプ対照のｇｅｏｍｅａｎに対するＴＩＧＩＴ発現細胞のＦＡＣＳｇｅｏｍｅａｎ倍率として表し、結合について「はい」又は「いいえ」として表す（表８）。
表８に示すように、４つの抗体（４３Ｂ７、４８Ｂ７、５５Ｇ７、及び６６Ｈ９）のみが、初代ｃｙｎｏ細胞及び初代ヒト細胞の両方に対してバインダーであった。
受容体－リガンド競合アッセイ
次いで、ＴＩＧＩＴ結合ハイブリドーマ上清の、ＴＩＧＩＴがリガンドに結合するのをブロックする能力を試験した。以下のように、ヒトＴＩＧＩＴを一過性に発現するＣＨＯ－ｓ細胞でＦＡＣＳを用いて、抗原特異的ハイブリドーマ上清試料に対して競合結合アッセイを実施した。ヒトＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ－Ｓ細胞を抗体試料（ＴＩＧＩＴに特異的なハイブリドーマ上清）と混合し、４℃で１時間インキュベートし、次いで２回洗浄した。次いで、試料が結合した細胞を、４℃で４５分間、ｈｕＣＤ１５５－Ｆｃ－Ａｌｅｘａ ６４７（自社で作製及び標識）又はＣＤ１１２－Ｆｃ－Ａｌｅｘａ ６４７（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １０００５－Ｈ０２Ｈ；自社で標識）と共にインキュベートした。次いで、７－ＡＡＤ細胞生存率測定用染料を添加し、細胞をさらに１５分間４℃でインキュベートし、２回洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。試料を、ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ（商標）フローサイトメーター及びＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔ ＨｙｐｅｒＣｙｔオートサンプラーを用いて分析した。表９のデータは、それぞれ１．７μｇ／ｍＬ又は１μｇ／ｍＬでのヒトＣＤ１５５又はＣＤ１１２のヒトＴＩＧＩＴへの結合の阻害パーセントを反映する。
ＴＩＧＩＴ親和性測定
抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの親和性決定を、ＯＣＴＥＴバイオセンサーを用いて行った。ヒトＴＩＧＩＴ ｍＡｂを、動態用抗ｈｕＩｇＧ ＦＣキャプチャー（ＡＨＣ）チップ（カタログ番号１８～５０６０）に２μｇ／ｍＬで捕捉した。マウス抗ＴＩＧＩＴ対照ｍＡｂ ＭＢＳＡ４３（カタログ番号１６－９５００－８５）を、２μｇ／ｍｌで抗マウスＩｇＧ Ｆｃキャプチャーチップに捕捉した。ｈｕＴＩＧＩＴ（ＰＬ４４４０３）及びｃｙｎｏＴＩＧＩＴ（ＰＬ４０４６１）の両方の結合を、２００ｎＭ又は１００ｎＭの出発濃度から３ｎＭまでタンパク質を２倍滴定することによって評価した。ｈｕＴＩＧＩＴはモノ－Ｆｃタグを含有するので、５０μｇ／ｍｌの無関係なＩｇＧ２を含有するブロック工程を利用して、Ｏｃｔｅｔチップ上の抗Ｆｃ捕捉試薬をブロックした。ｈｕＴＩＧＩＴ親和性決定のために、会合を５分間モニターし、解離を２０分間モニターした。ｃｙｎｏＴＩＧＩＴの場合、会合を５分間モニターし、解離を５分間モニターした。これらの実験で使用したアッセイ緩衝液は、１０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣＬ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、０．１ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、ｐＨ７．６であった。表１０のデータは、ヒト又はカニクイザルＴＩＧＩＴに対するＴＩＧＩＴ ｍＡｂの相対的親和性を表す。２つのｍＡｂのｃｙｎｏＴＩＧＩＴについての値は、適合が非常に不良であったため、提供されなかった。解離の検出限界は、２０分間にわたる最低５％の解離に基づいて４ｅ－５である。
表１０に示すように、抗体のそれぞれはヒトＴＩＧＩＴに対して高い親和性を示し、ほとんどがｃｙｎｏＴＩＧＩＴに対して高い親和性を示した。
ＴＩＧＩＴ抗体の選択
上記及び図１３に記載のスクリーニングアッセイの結果から、４Ｇ１０、１１Ａ３、２８Ｂ８、４３Ｂ７、６６Ｈ９、３９Ｄ２、及び５５Ｇ７を含む１０未満の独自の抗体が同定された。このような抗体は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＧＡによる決定でアンタゴニスト機能を示し、ヒト及びｃｙｎｏ初代細胞結合アッセイによる決定で抗原結合活性を示し、したがって、このような抗体を、その後の特徴付けスクリーニング、配列決定、及び親和性決定に進めた。これらのＴＩＧＩＴ抗体は、ツールＴＩＧＩＴ抗体ＭＢＳＡ４３及び１０Ａ７よりも良好に機能したものであった。選択されたＴＩＧＩＴ抗体とツール抗体の比較を表１１に示す。この表に示され、図１４Ａ及び１４Ｂによって支持されるように、選択されたＴＩＧＩＴ抗体は、ツール抗体と比較してより良好な活性を示した。
ＴＩＧＩＴ抗体の分子レスキュー及び配列決定
選択ＴＩＧＩＴ抗体の重鎖及び軽鎖の分子配列決定は、ＲＮＡ（全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）をＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体産生ハイブリドーマ細胞を含有するウェルから精製したことを除いて、実質的に実施例３に記載のように行った。
ＴＩＧＩＴ抗体のホットスポット改変
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅキャンペーンから選択された抗ＴＩＧＩＴ抗体を、実質的に実施例３に記載されるように操作して、「ホットスポット」、又は分子の発現、精製、熱安定性、コロイド安定性、長期保存安定性、インビボ薬物動態、及び／若しくは免疫原性に悪影響を及ぼすとコンピュータにより予測されたか又は経験的に決定された残基を除去した。
ホットスポット改変バリアントをクローニングし、ＥｘｐｉＣＨＯ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）においてＨＣ及びＬＣを同時トランスフェクトすることによって一過性に発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。抗体活性を、上記のように、ＴＩＧＩＴ Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイによって測定した。改変バリアントの分析結果を、以下の表１２に示す。
ＴＩＧＩＴ抗体のフレームワークのグラフト
抗ＴＩＧＩＴ抗体５５Ｇ７．０４１（それぞれ配列番号１９２３及び１９２４のＬＣ可変領域配列及びＨＣ可変領域配列を含む）、６６Ｈ９．００９（それぞれ配列番号２２１及び２２２のＨＣ可変領域配列及びＬＣ可変領域配列を含む）、４３Ｂ７．００２．０１５（それぞれ配列番号２０１及び２０２のＨＣ可変領域配列及びＬＣ可変領域配列を含む）、及び５８Ａ７．００３．００８（それぞれ、配列番号２１１及び２１２のＨＣ可変領域配列及びＬＣ可変領域配列を含む）を、良好に挙動するＶＨ１、ＶＨ３、ＶＨ５、ＶＫ１、ＶＫ３、及びＶＬ２生殖系列を優先して、選択された代替ヒトフレームワークに各抗体のＣＤＲをグラフトすることによって、製造可能性が改善するように改変した。各親の代替フレームワークは、配列類似性を考慮して選択した。いずれの場合も、グラフト前後の配列、特にグラフト接合部の配列を注意深く調べ、いくつかの場合においては、標的とした復帰変異を、ＣＤＲループの機能的コンフォメーションを保持する最良の機会を提供するように設計した。
設計された可変ドメインを含む合成ＤＮＡ断片を順序付けし、これらをゴールデンゲートクローニング法を用いて、定常ＨＣ又はＬＣドメインを含有する安定な哺乳動物発現ベクターに挿入することによって、フレームワーク改変バリアントをクローニングした。抗体を、ＣＨＯ－Ｋ１細胞中でＨＣ及びＬＣを同時トランスフェクトすることによって発現させ、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。各バリアントの同一性を、インタクトな質量分析によって確認した。各バリアントについて、馴化培地中の発現力価を、プロテインＡセンサーを用いるＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって測定した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後に存在する高分子量材料の割合（ＨＭＷ％）を、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって測定し、純度を、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた非還元マイクロキャピラリー電気泳動における主ピーク％によって測定した。第１の溶融転移のＴｍを、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を用いてＤＳＦにより測定した。精製試料を４０℃で２週間インキュベートし、分析サイズ排除クロマトグラフィーにより主ピーク％の変化を測定した。抗体活性を、上記のようにＴＩＧＩＴ Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイによって測定し、２つの独立した測定値を平均した。改変バリアントの分析結果を、以下の表１３に示す。
ＴＩＧＩＴ抗体の酵母ディスプレイの最適化
抗ＴＩＧＩＴ抗体の４３Ｂ７．００２．０１５（それぞれ配列番号２０１及び２０２のＨＣ可変領域配列及びＬＣ可変領域配列を含む）及び５８Ａ７．００３．００８（それぞれ配列番号２１１及び２１２のＨＣ可変領域配列及びＬＣ可変領域配列を含む）を、製造性が改善され、且つ酵母ディスプレイによるＴＩＧＩＴへの結合が増加するように改変した。各抗体について、６つの全ＣＤＲ中の残基の全ての可能な隣接対が、縮重ＮＮＫコドンの使用により全ての可能なアミノ酸に同時に変異したライブラリーを作製した。ライブラリーはＢＪ５４６４の酵母誘導体の表面に提示され、ここで、Ｆｄドメインはα凝集素のＮ末端に融合され、ＬＣは酵母表面に融合されなかった。ディスプレイの効率を、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ６４７コンジュゲート結合抗Ｆａｂ抗体の結合によって測定した。蛍光二次物質としてストレプトアビジンＰＥを用いて、ビオチンコンジュゲート組換えＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）への高結合について、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてライブラリーを選別した。選別された結合／ディスプレイ二重陽性プール及びディスプレイ陽性プールに存在する可変ドメインを、ＨＣ及びＬＣのＦＷ１及びＦＷ４ドメインに特異的なプライマーを用いて増幅し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑによるＮＧＳ分析に２×３００ｂｐランで供した。陽性結合アミノ酸頻度の比率を陽性ディスプレイアミノ酸頻度で割り、次いで、親配列比率に対し正規化した共通の頻度分析によりデータを処理した後に変異を選択した。濃縮値が親配列以上であった配列を、有益又は許容される多様性とみなし、親和性成熟後のさらなる合理的な抗体操作に使用した。
各ＨＣ及びＬＣのためのアフィニティー成熟酵母ディスプレイライブラリーを、構造誘導（５８Ａ７．００３．００８）、モデル誘導近接対（４３Ｂ７．００２．０１５）、及びＣＤＲ ＮＮＫスキャニングライブラリー（４３Ｂ７．００２．０１５及び５８Ａ７．００３．００８）の組み合わせを用いて設計した。これらのＨＣ又はＬＣライブラリーを親と同等か又はそれ以上のＴＩＧＩＴ結合について選別した後、４つのライブラリーを鎖シャッフルライブラリーで組み合わせた。ここでは、全てのライブラリー設計を、設計アプローチ間で非依存的であるように、混合した。ライブラリーを、上記のように酵母の表面に提示し、ビオチン標識組換えＴＩＧＩＴ ＥＣＤへの高い結合について、各連続ラウンドにおいてストリンジェンシーを増加させて選別した。高い結合を有するクローンを選択し、個々のクローンとしてスクリーニングし、最も高い結合／ディスプレイ比を有するクローンを配列決定のために選択した。可変ドメインをベクター及び定常ドメインプライマーを用いて増幅し、ＰＣＲ産物をサンガーシークエンシングに供した。化学的負債を導入した配列は、パネル設計から削除した。ＢｉｏＬｕｍｉｎａｔｅモデリングスイート（Ｓｃｈｒｏｅｄｉｎｇｅｒ、ＬＬＣ）によって同定された化学的負債及び電荷表面パッチを、上記のＮＧＳ濃縮ソートデータからの情報を用いて変異させた。組換え発現モノクローナル抗体としてのさらなる特徴付けのために、最終的に改変された配列を選択した。
上位のディスプレイ改変バリアントを、設計された可変ドメインを含む合成ＤＮＡ断片を順序付けし、これらをゴールデンゲートクローニング法を使用して、ピューロマイシン選択下で定常ＨＣドメインを、又はハイグロマイシン選択下で定常ＬＣドメインを含有する安定な哺乳動物発現ベクターに挿入することによってクローニングした。ＣＨＯ－Ｋ１細胞においてＨＣ及びＬＣを同時トランスフェクトし、ピューロマイシン及びハイグロマイシンを用いて安定な発現を選択することによって、抗体を発現させた。抗体を、ＡｍＭａｇＴＭプロテインＡ磁気ビーズ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）を使用するプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。各分子の同一性を、インタクトな質量分析によって確認した。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー後に存在する高分子量材料の割合（ＨＭＷ％）を、分析サイズ排除クロマトグラフィーによって測定し、純度を、ＬａｂＣｈｉｐ ＧＸＩＩ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた非還元マイクロキャピラリー電気泳動における主ピーク％によって測定した。抗体活性を、上記のように、ＴＩＧＩＴ Ｊｕｒｋａｔレポーター遺伝子アッセイによって測定した。改変バリアントの分析結果を、以下の表１４及び１５に示す。
改変ＴＩＧＩＴ抗体及びツール抗体の機能
ＴＩＧＩＴ及びＩＬ－２－ルシフェラーゼコンストラクトを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞、ＣＲＩＳＰＲを用いて改変して、ＣＤ２２６発現をノックアウト（ＫＯ）した。これらのＫＯ細胞をＪｕｒｋａｔ ＲＧＡにおいて使用し、ＴＩＧＩＴ及びＩＬ－２－ルシフェラーゼコンストラクトを発現するＣＤ２２６発現Ｊｕｒｋａｔ細胞と比較した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を、本明細書に記載のＣＨＯ－Ｋ１－ＣＤ１５５＋細胞と共培養し、ルシフェラーゼ活性を測定した。この実験で使用した抗体には、ツール抗体ＭＢＳＡ４３及び改変ＴＩＧＩＴ抗体（上記の通り）ＡＢ１（４３Ｂ７．００２．０１５）及びＡＢ２（６６Ｈ９．０１０）が含まれた。
結果を、図１５に示す。図１５に示すように、ＣＤ２６６をノックアウトすると、最大活性が有意に低下した（白記号対黒記号）。これらのデータは、ＴＩＧＩＴ抗体がＴＩＧＩＴ－ＣＤ２２６シス相互作用をブロックして、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ２２６媒介性シグナル抑制を抑止することを支持する。これらのデータはまた、ＣＤ２２６の関与がより強力なＴＣＲ応答に寄与することを支持する。ＣＤ２２６の存在下では、最大活性には完全には達しないので、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂのＡＢ１及びＡＢ２（それぞれ黒丸及び黒四角）は、ＭＢＳＡ４３（黒菱形）よりも良好にＴＩＧＩＴ－ＣＤ２２６相互作用を遮断する。ＣＤ２２６がノックアウトされると、ＡＢ１、ＡＢ２及びＭＡＢＳＡ４３は、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用を同等に遮断する。
実施例６
本実施例は、本開示の選択抗体の結合親和性を示す。
ヒトＴＩＧＩＴ配列番号１及びｃｙｎｏＴＩＧＩＴ配列番号２０２４への抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合、並びにヒトＣＤ１１２Ｒ配列番号３及びＣＤ１１２Ｒ（Ｎ８１Ｄ）配列番号２０２６への抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用してＢｉａｃｏｒｅ Ｔ２００により特徴付けた。詳細には、Ｆａｂキャプチャーキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）からの抗ヒトＦａｂ抗体を、標準的なアミンカップリング試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＣＭ５チップの４つ全てのフローセルに約６０００～９０００ＲＵで固定化した。ＰＢＳ＋０．００５％Ｐ２０を、アッセイを通して機器ランニング緩衝液として使用した。固定化抗ヒトＦａｂ抗体のみを有する第１のフローセルを、バックグラウンド対照として使用した。抗ＴＩＧＩＴ又は抗ＣＤ１１２Ｒ抗体を、第２、第３、及び第４のフローセルに約１００～１９０ＲＵで捕捉した。ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴ、ヒトＣＤ１１２Ｒ及びＣＤ１１２Ｒ（Ｎ８１Ｄ）を、試料緩衝液（ＰＢＳ＋０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、０．００５％Ｐ２０）で、０．７８～１００ｎＭの範囲の濃度に希釈し、捕捉された抗体表面上に５０μｌ／分で注入して１８０秒間の会合及び３００秒間の解離を行った。解離の終わりに、抗Ｆａｂ抗体表面を、１０ｍＭグリシン、ｐＨ２．１を用いて再生した。
ヒト及びカニクイザルＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ抗体、ヒトＣＤ１１２Ｒ及びＣＤ１１２Ｒ（Ｎ８１Ｄ）に対する抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の結合データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００評価ソフトウェア３．０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分析した。全てのデータを、ブランク対照表面と試料緩衝液のみを注入するブランクサイクルを差し引くことによって二重参照した。ヒトＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合、並びにヒトＣＤ１１２Ｒ及びＣＤ１１２Ｒ（Ｎ８１Ｄ）に対する抗ＣＤ１１２Ｒ抗体の結合について、オンレート（ｋａ）、オフレート（ｋｄ）、平衡解離定数（ＫＤ）及び最大結合応答（Ｒｍａｘ）を、１：１動態結合モデルを使用して、全体的適合から算出した。カニクイザルＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ抗体の結合について、ＫＤ及びＲｍａｘを、１：１定常状態結合モデルを用いて、全体的な適合から算出した。ヒトＴＩＧＩＴ結合特性を表１６に示す。カニクイザルＴＩＧＩＴ結合特性を表１７に示す。ヒトＣＤ１１２Ｒ結合データを表１８に示し、ヒトＣＤ１１２Ｒ（Ｎ８１Ｄ）結合特性を表１９に示す。
実施例７
この実施例は、ＣＤ１１２Ｒ、ＴＩＧＩＴ、及びＰＤ－１の組み合わせ遮断がＴ細胞応答のウィンドウを増加させることを示す。
ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ組み合わせ遮断の効果を評価するために、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５の両方を発現するＣＨＯ Ｋ１細胞を作製した。これらの細胞をＴ細胞と接触させ、ＴＩＧＩＴ－ＣＤ１５５相互作用及びＣＤ１１２Ｒ－ＣＤ１１２相互作用がブロックされた場合にのみ、これらの細胞のＴＣＲの活性化がＩＦＮγ放出をもたらすと予想された。実験設計の概略を図１６Ａに示す。このアッセイでは、３つの異なるＴＩＧＩＴ抗体（４３Ｂ７．００２．０１５、６６Ｈ９．００９及び５８Ａ７．００２．００８）を試験し、単剤として軽度の効果を示したが、ＣＤ１１２Ｒ遮断抗体と組み合わせて使用した場合、Ｔ細胞活性が強く増強された（図１６Ｂ）。
このアッセイでは、さらに、１：１抗体混合物によるＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ遮断を、両方の抗体がＩｇＧ－ｓｃＦｖ構造で存在する二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）による遮断と比較した。モノクローナル抗体混合物のＴ細胞活性に対する効果を、表２０に示す。Ｔ細胞活性に対するこれらの効果は、ｂｓＡｂで達成されたものと同等であり、これらの受容体がＴ細胞活性化に独立して寄与することが示唆された（ｂｓＡｂについてのデータは示さず）。
三重遮断（ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、及びＰＤ－１の３つ全ての遮断）と比較したＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、及びＰＤ－１のうちの２つの二重遮断の活性を、抗原特異的ＣＴＬアッセイにおいて、抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてペプチドパルスＳＫ－ＭＥＬ腫瘍細胞を使用して評価した。ＰＤ－１及びＴＩＧＩＴの二重遮断、三重遮断（３×）、ＴＩＧＩＴの単一遮断、及びＰＤ－１の単一遮断のペプチドパルス腫瘍細胞に対するｐｐ６５ペプチド特異的ＣＴＬ応答を図１７Ａに示す。ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴの二重遮断、三重遮断（３×）、ＴＩＧＩＴの単一遮断、及びＣＤ１１２Ｒの単一遮断のペプチドパルス腫瘍細胞に対するｐｐ６５ペプチド特異的ＣＴＬ応答を図１７Ｂに示す。ＰＤ－１及びＣＤ１１２Ｒの二重遮断、三重遮断（３×）、ＣＤ１１２Ｒの単一遮断、及びＰＤ－１の単一遮断のペプチドパルス腫瘍細胞に対するｐｐ６５ペプチド特異的ＣＴＬ応答を図１７Ｃに示す。予想された結果と観察された結果を図１７Ｄに示す。
図１７Ａ～１７Ｃに示すように、ペプチドパルス腫瘍細胞に対するｐｐ６５ペプチド特異的ＣＴＬ応答は、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、又はＰＤ－１の単一遮断によってわずかに増強され（アイソタイプ対照と比較して）、二重遮断の各場合（ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ、ＴＩＧＩＴ＋ＰＤ－１、ＣＤ１１２Ｒ＋ＰＤ－１）は、ｐｐ６５ペプチド特異的ＣＴＬ応答をさらに増強した。図１７Ａ～１７Ｃのそれぞれにおいて、三重遮断は、腫瘍細胞に対するＴ細胞活性の最も有意な増強を示した。異なる組み合わせの応答が厳密に相加的又は相乗的効果を示すかどうかを、このアッセイにおいては、計算により予想された増強ウィンドウと観察された増強ウィンドウとを比較することによって評価し（図１７Ｄ）、ＴＩＧＩＴ＋ＰＤ－１又はＣＤ１１２Ｒ＋ＰＤ－１の組み合わせの効果は相加的であるが、ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ＋ＰＤ－１の三重遮断の効果は相乗的であることがわかった（図１７Ｄ）。
実施例８
この実施例は、三重遮断が初代ヒト腫瘍細胞培養物においてＴ／ＮＫ細胞応答を増強することを示す。
ＴＩＬに対する単一遮断、二重遮断及び三重遮断の効果を、解離したヒト腫瘍細胞（ＴＩＬを伴う）をＰＤ－１抗体（ニボルマブ「Ｎｉｖｏ」）、ＣＤ１１２Ｒ抗体（２４Ｆ１）、又はＴＩＧＩＴ抗体（４３Ｂ７．００２．０１５）、及びこれらの抗体の２つ又は３つの組み合わせで処理し、ＩＦＮγ産生によって表されるＴＩＬ応答を測定することによって試験した。アイソタイプ対応抗体を対照として用いた。測定を３日目及び６日目に行い、結果を図１７Ｅに示す。
図１７Ｅに示すように、ＩＦＮγ産生は、６日目と比較して３日目でより大きかった。Ｎｉｖｏ＋４３Ｂ７．００２．０１５＋２４Ｆ１抗体による三重遮断は、単一遮断及び二重遮断と比較して、３日目及び６日目の両方で最も高い量のＩＦＮγ産生を誘導した。これらの結果は、比較的低レベルのこれらのチェックポイント受容体を発現する原発性ＴＩＬにおいて（図１７Ｆ及び１７Ｇ）、三重組み合わせ処理がＴＩＬ活性の有意な増強を誘導したことを示唆している。興味深いことに、ａ－ＰＤ－１抗体で処理されたＴＩＬはＴＩＧＩＴ発現をアップレギュレートしたが（図１７Ｈ）、α－ＴＩＧＩＴ抗体で処理されたＴＩＬは培養期間の終わりまでにＰＤ－１をアップレギュレートした（図１７Ｉ）。この発現プロファイルは、同様のインビトロＴ細胞アッセイ及びａ－ＰＤ－１で治療された患者からのデータに関する公表された報告と一致しており、三重遮断が患者のＴ細胞応答を増加させるのに有効であることを示唆している。
実施例９
この実施例は、実施例１、２、７、及び８の結果の考察を提供する。
ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴは主にそれぞれＣＤ１１２及びＣＤ１５５と結合し、腫瘍細胞に対するＴ及びＮＫ細胞応答を抑制する。本発明者らは腫瘍細胞が両リガンドを高レベルで発現し、したがって、ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴの両方を阻害することが、Ｔ／ＮＫ細胞活性を増強するＣＤ２２６の効果的な結合に必要である可能性が高いことを実証した。
本発明者らは、ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴを同時に遮断するモノクローナル抗体の共製剤化混合物を含む組成物を開発した。組成物は、二重特異性分子に構成された２つのモノクローナル抗体と同様に機能した。両方法は、インビトロアッセイにおいて、初代ヒトＴ細胞活性を有意に増強し、全体的な活性は同等であった。加えて、モノクローナルＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ抗体をＰＤ－１遮断抗体と組み合わせて使用する三重遮断は、３つのうちの任意の単一又は二重組み合わせよりも良好に、Ｔ細胞活性をさらに増強した。
ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ共遮断は、三重遮断がＴ／ＮＫ細胞活性を増強するために２つの非重複共刺激経路に関与し得るので、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１との組み合わせ治療のための有望なアプローチを提示する。その結果は、ＰＤ－１／Ｌ１単独療法よりも高い有効性ウィンドウであり得、重要なことには、ＰＤ－１／Ｌ１難治性患者に見られるように、単独療法に対する腫瘍耐性の可能性の低下又はそれを克服する可能性であり得る。
実施例１０
この実施例は、実施例１～２及び７～８で用いられた材料及び方法を記載する。
Ａｒｒａｙ ＳｔｕｄｉｏでのＴＣＧＡ相関プロットの生成
目的の遺伝子の転写レベルを表すｌｏｇ（ＦＰＫＭ）値をＴＣＧＡデータセットから抽出し、散布図にプロットして対相関を示した。ＴＩＧＩＴファミリー受容体及びＰＤ－１、並びに複数の癌適応症のそれらのリガンドについて分析した。
単一細胞ＲＮＡ配列データの分析
５人のヒト肝細胞癌患者から単離されたＴ細胞の単細胞ＲＮＡｓｅｑ分析は以前に記載されている（Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。このデータセットに目的遺伝子を問い合わせ、Ｔａｍａｔｏａを用いて２Ｄ及びボックスプロットを作成した。具体的には、腫瘍組織由来のＴ細胞上のＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ、ＣＤ２２６、及びＰＤ－１の発現を問い合わせた。
ＣＤ１１２Ｒ結合アッセイ及びＦＡＣＳ染色
ヒトＣＤ１１２Ｒに対する抗ＣＤ１１２Ｒツール抗体（ＰＬ－５２５７６、ＰＬ－５２５７５、ＰＬ－５２５７７）の結合を評価するために、ＣＤ１１２Ｒを発現するようにトランスフェクトしたＣＨＯ Ｋ１細胞を、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体、ＣＤ１１２リガンドＦｃ（Ｓｉｎｏ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、又はアイソタイプ対照と共に４℃で１時間インキュベートし、結合した抗体を、ＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）又はＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。
フローサイトメトリーによるＣＤ１１２Ｒ、ＰＤ－１、及びＴＩＧＩＴ発現の特徴を決定するために、予め活性化されたＴ細胞又は解離された腫瘍細胞をＦｃブロッキング試薬でブロックし（室温で１０分）、蛍光色素コンジュゲート抗体と共に４℃で４５分間インキュベートした。ＣＤ１１２Ｒ検出のために、二次ＰＥコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を第２の工程として加えた。いくつかの場合においては、細胞を、ＩＣ固定緩衝液（ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて固定した。データをＢＤ Ｓｙｍｐｈｏｎｙフローサイトメーターを用いて取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析した。
初代ヒトＴ細胞の活性化及び増殖
Ｐａｎ Ｔ細胞及びメ記憶ＣＤ８ Ｔ細胞を、予め凍結したＰＢＭＣ（Ｃｅｐｈｅｕｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）から、磁気ビーズベースのヒトＰａｎ Ｔ細胞（ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）及び記憶ＣＤ８ Ｔ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、製造業者が推奨するプロトコルを用いて精製した。Ｐａｎ Ｔ細胞を、５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ２（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下、１：１の比率でヒト抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に３日間培養し、次いで、活性化ビーズを除去した後、ＩＬ２の追加なしで３日間静置した。記憶ＣＤ８ Ｔ細胞を、５０ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ２（Ｒ＆Ｄシステム）の存在下、１：１の比率でヒト抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に７日間培養し、ＩＬ２を２～３日毎に補充し、次いで、活性化ビーズの除去後、５０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ２の存在下で２日間静置した。ＣＭＶｐｐ６５（４９５－５０３）反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞を拡大するために、ＨＬＡ－Ａ２＋からのＰＢＭＣ、ＣＭＶｐｐ６５（４９５－５０３）反応性ＣＤ８＋ドナーを、５０ＩＵ／ｍｌの組換えＩＬ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＬ７（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１０００ＩＵ／ｍｌ組換えＩＬ４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で、Ｇｒｅｘ－１０フラスコ（ウィルソンウルフ製造）において、１４日間、単球由来樹状細胞分化キット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて生成したＣＭＶｐｐ６５（４９５－５０３）（Ａｎａｓｐｅｃ）ペプチドパルス単球由来樹状細胞と共に培養した。Ｔ細胞を培養及び拡大させるために使用する培地は、ＲＰＭＩ完全培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）＋１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）＋Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ＋ＮＥＡＡ＋ピルビン酸ナトリウム＋β－ＭＥ＋ＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲＰＭＩ１６４０）である。
改変ＣＨＯ細胞の作製
抗ＣＤ３ ｓｃｆｖを発現するＣＨＯ Ｋ１細胞株（内部Ａｍｇｅｎ源から入手）を、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５発現を誘導するためのトランスフェクションに使用した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の推奨プロトコルにより使用して、「低」抗ＣＤ３ ｓｃｆｖを発現するＣＨＯ細胞株を、ｐｃＤＮＡ３．１＿ヒトＣＤ１１２ ｖａｒ ｄｅｌｔａ＿ｚｅｏベクター（内部Ａｍｇｅｎ源から入手）でトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＣＤ１１２を発現するＣＨＯ細胞を単一細胞クローンとして選別し、選択培地（（ＧＩＢＣＯ）１×グルタマックス（ＧＩＢＣＯ）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、及び１００μｇ／ｍＬ ｚｅｏｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）中で増殖させた。ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、及び抗ＣＤ３ｓｃｆｖの両方を発現するＣＨＯ細胞を作製するために、抗ＣＤ３ｓｃｆｖ、及びＣＤ１１２を発現する以前に作製されたＣＨＯ細胞株を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３．２＿ヒトＣＤ１５５ｖａｒ１＿ｐｕｒｏベクター（内部Ａｍｇｅｎ源から入手）でトランスフェクトした。トランスフェクション後、ＣＤ１１２、抗ＣＤ３ｓｃｆｖ、及びＣＤ１５５を発現するＣＨＯ細胞を単一細胞クローンに選別し、選択培地（（ＧＩＢＣＯ）１×グルタマックス（ＧＩＢＣＯ）、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシン、１５μｇ／ｍｌューロマイシン及び１００μｇ／ｍＬ ｚｅｏｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）を含有するＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地）中で拡大させた。ヒトＣＤ１１２Ｒを発現するＣＨＯ Ｋ１細胞株を作製するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者が推奨するプロトコルにより使用して、ＣＨＯ Ｋ１細胞をベクターｐＭＳＣＶ＿ＦＬＡＧ＿ヒトＣＤ１１２Ｒ（Ｎ８１Ｄ）（４１－３２６）＿ＩＲＥＳ＿ＥＧＦＰでトランスフェクトした。
インビトロ初代細胞アッセイ
Ｔ細胞機能に対するＣＤ１１２Ｒ－ＣＤ１１２及びＣＤ２２６－ＣＤ１１２相互作用をブロックする効果を調べるために、ＣＤ１１２を発現するようにトランスフェクトされたか、又はａＣＤ３ｓｃｆｖと共に空ベクターを有するＣＨＯ細胞を、抗ＣＤ２２６（Ａｂｃａｍ）の有無にかかわらず、抗ＣＤ１１２Ｒ抗体又はアイソタイプ対照の存在下で、予め増殖させたＰａｎ Ｔ細胞及び可溶性抗ＣＤ２８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と共培養した。細胞培養上清を２４時間後に回収し、標準ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＴ細胞機能の読み取りとして使用してＩＬ２について評価した。ＣＤ８Ｔ細胞機能に対するＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒの共ブロッキング効果を評価するために、ＣＤ１１２及びＣＤ１５５を発現するＣＨＯ細胞を、予め増殖させた記憶ＣＤ８ Ｔ細胞及び可溶性抗ＣＤ２８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）と、ブロッキング抗体の存在下で共培養し、上清を２４時間後に回収し、ＭＳＤヒトＩＦＮγ Ｖ－ｐｌｅｘ検出キットを用いて分析した。
抗原特異的ＣＴＬアッセイのために、ＳＫＭＥＬ３０細胞を１００ｎｇ／ｍｌの組換えＩＦＮγで２４時間前処理し、１μｇ／ｍＬのＣＭＶｐｐ６５（４９５－５０３）ペプチドでパルスし、ＲＰＭＩ完全培地（Ｇｌｕｔａｍａｘ（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、β－ＭＥ及びＨＥＰＥＳ（ＧＩＢＣＯ）を補充したＲＰＭＩ １６４０）中、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＣＤ１１２Ｒ、及び抗ＰＤ－１抗体の単一、二重、又は１：１：１の比の三重の組み合わせの存在下で、予め増殖させたＣＭＶｐｐ６５（４９５－５０３）反応性ＣＤ８＋Ｔ細胞と７２時間共培養した。細胞培養上清を７２時間後に回収し、ＣＤ８ Ｔ細胞活性化の読み出しとして、ＣＢＡサイトカイン検出キット（ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてＩＦＮγについて評価した。
解離ヒト腫瘍細胞分析
腫瘍切除手術からの腫瘍組織は、ＣＰＭＣ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ）及びＭＴ群（Ｖａｎ Ｎｕｙｓ、ＣＡ）によって患者の同意を得て提供された。組織を、最初に小片に切断し、次いで、３７℃で、消化緩衝液（１０％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ－グルタミン、ＨＥＰＥＳ、１．５ｍｇ／ｍｌ ＩＩ型コラゲナーゼ、１０μｇ／ｍＬ ｉｖ型ヒアルロニダーゼ、１０ｕＭ Ｙ－２７６３２及びＤＮアーゼＩを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２）中、ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓで酵素消化及び機械的解離を行った。消化後、細胞懸濁液を７０μｍメッシュフィルターを通して濾過し、ＲＢＣ溶解緩衝液で処理し、培養培地に再懸濁した。
ＴＩＬ刺激アッセイは、９６ウェルプレートにおいて、抗ＣＤ１１２Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１、及び／又はアイソタイプ対照抗体の組み合わせの存在下（３７℃のＲＰＭＩ完全培地中、それぞれ１試料当たり１０μｇ／ｍＬ、合計３０μｇ／ｍＬの抗体）、１ウェル当たり２５０，０００個の解離腫瘍細胞を培養することにより行った。上清を３日目及び６日目に採取し、ＭＳＤによってＩＦＮγについて分析した。
実施例１１
この実施例は、ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ ｍＡｂを含む製剤を示す。
抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ、又は両方（１４０ｍｇ／ｍＬ総抗体濃度）を含む製剤を調製し、粘度及び安定性を特徴付けた。これらの研究で使用した抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂは４３Ｂ７及び６６Ｈ９を含み、使用した抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂは、１Ｅ１、２９Ｅ１０及び２４Ｆ１であった。結果を、表２１に示す。
表２１に示すように、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂの両方を含む製剤は、１５ｃＰ未満の許容可能な粘度を示した。２４Ｆ１又は１Ｅ１を含む製剤はほぼ同じ粘度（約９．０～約１１．０）を示したが、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ ２９Ｅ１０を含む製剤はより高い粘度を示した。
製剤を４０℃で２週間（２ｗｋ４０Ｃ）貯蔵した後の高分子量（ＨＭＷ）種形成について、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により、初期ＨＭＷ種形成（Ｔ０、貯蔵時間なし）と比較して分析した。結果を、表２２に示す。
表２２に示すように、全ての製剤で、２週間の加速貯蔵（４０℃）後のＨＭＷ種形成の変化は２％未満であった。ＨＭＷ種の変化％は、１Ｅ１及び４３Ｂ７を含む製剤で最小であったが、ＨＭＷ種の変化％は他のほとんどの製剤でも１．５％未満であった。
これらのデータは、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂの両方を含む製剤は安定しており、より高い濃度（例えば、１００μｇ／ｍＬ超）であっても許容される粘度を示すことを支持する。
実施例１２
この実施例は、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及び抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂを含む製剤のインビトロ活性を示す。
様々な比（ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ：ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂが９：１、３：１、１：１、１：３、及び１：９）で抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（２４Ｆ１）及び抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（４３Ｂ７．００２．０１５）を含み、一定量のＰＤ－１ ｍＡｂを含む製剤のインビトロ活性を、製剤による刺激で細胞傷害性Ｔリンパ球によって産生されるＩＦＮ－γの量を測定することによって、インビトロで評価した。アッセイは、次の２つの異なる総ｍＡｂ濃度で行った：１．５ｎＭ（標的カバレッジが飽和に達していない設定をシミュレート）及び３０ｎＭ（飽和をシミュレート）。抗ＰＤ－１ｍＡｂ濃度を０．５ｎＭ（１．５ｎＭの総ｍＡｂ濃度を含む製剤において）及び１０ｎＭ（３０ｎＭの総ｍＡｂ濃度を含む製剤において）に固定した。表２３は、製剤中の各抗体の量をまとめたものである。
図１９Ａに示すように、１．５ｎＭの総Ａｂ量でＴＩＧＩＴ ｍＡｂ及びＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂを含む全ての製剤（バー１～６）は、ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ及びＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂの両方を欠く製剤（バー７～１２）よりも良好に機能した。１．５ｎＭの総Ａｂ量でＴＩＧＩＴ ｍＡｂ及びＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂを含む（バー１～６）のうち、１：１のＴＩＧＩＴ ｍＡｂ：ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ比を有する共製剤は、ＩＦＮγの産生量が最大であったので、されたときに最も良好に機能した。より高い総Ａｂ濃度では、応答は基本的に同じであり（図１９Ｂ）、応答の大きさは２つのｍＡｂの比ではなく、総標的カバレッジによって駆動されたことを示唆している。
実施例１３
この実施例は、ヒトＴＩＬ及び循環リンパ球におけるＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴの発現を示す。
ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ及びＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂを１：１の比率で含む共製剤の成功は、標的細胞上のこれらの標的（ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ）の発現によって影響される可能性がある。したがって、ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴの発現を、ＴＩＬ、エクスビボ原発性ヒト腫瘍組織、及び対応する血液試料のフローサイトメトリーによって評価した。標的の発現が大きく異なった場合、１：１以外の比の使用が正当化され得るという仮説が立てられた。結果を、図２０Ａ－２０Ｃに示す。図２０Ａに示すように、ＣＤ８＋Ｔ細胞はＣＤ１１２ＲよりもＴＩＧＩＴの発現レベルがより高くなる傾向があり、一方、ＮＫ細胞は、腫瘍組織においてＣＤ１１２Ｒ発現が増加する傾向があった。さらに、末梢ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、ＴＩＬと比較してより同等レベルのＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴを発現した（図２０Ｂ）。腫瘍細胞は、様々なレベルのリガンドＣＤ１５５及びＣＤ１１２を発現した（図２０Ｃ）。本開示のＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ ｍＡｂの少なくともいくつかは、それらのそれぞれの標的に対し類似した親和性を示し、且つほぼ同一の薬物動態プロファイルを示す。ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴの発現は、リガンドと同様に、腫瘍対血液においてドナー間で可変であるため、１：１の比でのｍＡｂの組み合わせによる投薬による標的飽和は合理的であり、最終的に同じ下流経路に収束する標的をカバーするための洗練されたアプローチである。
実施例１４
この実施例は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ ｍＡｂのインビボ薬物動態（ＰＫ）を示す。
探索的毒性試験を実施して、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（２４Ｆ１）、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（４３Ｂ７．００２．０１５）、又は両方の抗体を含む製剤の毒性及びＰＫ特性を評価した。ゆっくりとした静脈内（ＩＶ）ボーラス注射によって、雄のカニクイザルの群（１群あたり３匹の動物）に、以下のように投薬した：第１群は、０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及び０．５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの連続投与を受けた。第２群は、５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂを受け、第３群は、５ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂを受けた。平均濃度－時間プロファイルを図２１に示す。この図に示すように、単回ＩＶ投与後、曝露はＴＩＧＩＴ ｍＡｂについては０．５～５ｍｇ／ｋｇの間で用量にほぼ比例して増加し、ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂについては同じ用量レベルで、比例的用量よりわずかに高い。平均ピーク濃度及び濃度－時間曲線下面積は、両方の用量レベルで同様のＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ ｍＡｂであり、ＰＫプロファイルは１：１の比での共製剤に好適であることを示唆した。
実施例１５
この例は、初代ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞におけるＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ＋ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ活性を示す。
ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴはまた、ＮＫ細胞活性を調節するので（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，２０２０；及びＳｔａｎｉｅｔｓｋｙ ｅｔ ａｌ，２０１３）、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（２４Ｆ１）及び抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（４３Ｂ７．００２．０１５）、並びに抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（２４Ｆ１）及び抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（４３Ｂ７．００２．０１５）を１：１の比で含む共製剤の活性を、ＮＫ細胞活性化アッセイにおいて評価した。このアッセイでは、初代ＮＫ細胞を健康なドナーの血液から精製し、次いで、腫瘍細胞と共培養した。ＩＦＮγ産生及び腫瘍細胞死滅によって示されるＮＫ細胞応答を測定した。精製ＮＫ細胞は高レベルのＣＤ２２６、ＴＩＧＩＴ、及びＣＤ１１２Ｒを発現したが、ＰＤ－１は非常に低レベルであった（図２２Ａ）。標的腫瘍細胞は、リガンドＣＤ１１２、ＣＤ１５５、及びＰＤ－Ｌ１を内因的に発現した（図２２Ｂ）。図２２Ｃ～２２Ｄに示すように、ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＴＩＧＩＴ ｍＡｂのそれぞれは、個々にＮＫ細胞活性化を誘導した。２つのＡｂの組み合わせは、腫瘍細胞死滅（図２２Ｃ）及びＩＦＮ産生のさらなる増加をもたらした（図２２Ｄ）。３つの全ての抗体（ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂｓ、ＴＩＧＩＴ ｍＡｂｓ、及びＰＤ－１ｍＡｂｓ；３×）を含む共製剤は、腫瘍細胞死滅又はＩＦＮ産生をさらに増加させることはなく、この結果は、ＰＤ－１の非常に低い発現レベル一致した（図２２Ａ）。
これらのデータは、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ及び抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂの両方を含む製剤のＮＫ細胞活性を誘導する能力を支持する。
実施例１６
この実施例は、エクスビボ原発性ヒト腫瘍浸潤リンパ球アッセイを記載する。
内因性腫瘍細胞に対する腫瘍浸潤Ｔ及びＮＫ細胞応答をより密接にシミュレートするために、解離エクスビボ原発性ヒト腫瘍組織を使用するアッセイを開発した。解離腫瘍組織からの単一細胞懸濁液を、外因性抗原を全く含まない抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ、又はこれらの組み合わせの存在下で培養した。アッセイの背後にある考えは、内因性腫瘍細胞がＴ及び／又がＮＫ細胞に腫瘍由来抗原を供給するということであった。４つの異なる固形腫瘍適応症（膵臓（ＰＡＮＣ）、結腸直腸（ＣＲＣ）、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）、及び消化管（ＧＩＳＴ）癌）を示す１０の異なる試料のうち、３日目にＩＦＮγによる測定で、６つの試料における応答が検出された。これらの場合のそれぞれにおいて、３つ全てのｍＡｂ（抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ、及び抗ＰＤ－１ ｍＡｂ）を含む組み合わせは、最も強力な応答を生じたが（図２３）、最大誘導倍率は試料によって変化した（データは示さず）。
実施例１７
この実施例は、異種移植モデルにおける抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ、抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及びＰＤ－１ ｍＡｂの組み合わせを含む製剤のインビボ有効性を示す。
以下の材料及び方法をこの実験で使用した。
動物、組織及び材料
試験ごとに約６０～１００匹のマウス（雌）を使用した。それぞれの体重は、最初の測定時で約１７～２４ｇであった。試験に用いたマウスの種には以下が含まれた：Ｂａｌｂ／ｃ ＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２ＲダブルＫＯ、Ｂａｌｂ／ｃ ＣＤ１１２Ｒ－ＧＦＰ ＫＩ、Ｂａｌｂ／ｃ ＴＩＧＩＴ ＫＯ、Ｂａｌｂ／ｃ ＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２Ｒ ＷＴ／ＷＴ；Ｃ５７ＢＬ／６ ＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２ＲダブルＫＯ、Ｃ５７ＢＬ／６ ＣＤ１１２Ｒ－ＧＦＰ ＫＩ、Ｃ５７ＢＬ／６ ＴＩＧＩＴ ＫＯ、Ｃ５７ＢＬ／６ ＴＩＧＩＴ×ＣＤ１１２Ｒ ＷＴ／ＷＴ；ＮＯＤ ＳＣＩＤ ＩＬ２ｒｇ（ＮＳＧ）。Ｂａｌｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６はＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｓから入手し、ＮＳＧマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから入手した。腫瘍移植の時点で、マウスは４～１２週齢であった。Ｂａｌｂ／ｃマウスはＣＴ２６（結腸癌）担癌、Ｃ５７ＢＬ／６はＢ１６Ｆ１０（黒色腫）担癌、ＮＳＧマウスはＣＭＶ－ＳＫＭＥＬ３０（黒色腫）担癌であった。
試験物質には、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（４３Ｂ７．００２．０１５）及び抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（２４Ｆ１）を１：１の比で含む共製剤、抗ｍｕＰＤ－１クローン２９Ｆ．１Ａ１２、抗ヒトＰＤ－１、対照物質には、ビヒクル対照（１００％ ＤＰＢＳ）、ｍＩｇＧ１ Ｎ２９７Ｇアイソタイプ対照、ｈＩｇＧ１アイソタイプ対照が含まれた。
方法
ＣＴ２６、Ｂ１６Ｆ１０及びＣＭＶ－ＳＫＭＥＬ３０細胞を、Ｃａｎｃｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ Ｃｅｌｌ Ｂａｎｋ（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ）から入手した。ＣＴ２６細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＮａＰｙｒ、１％ＨＥＰＥＳ及び１％ＮＥＡＡを補充したＲＰＭＩ－１６４０中で、３７℃に維持した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中で、３７℃に維持した。ＣＭＶ－ＳＫＭＥＬ３０細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ＮａＰｙｒ、１％ＮＥＡＡ、１％ＧｌｕｔａＭＡＸ、５μｇ／ｍＬブラスチシジン、及び１μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充したＲＰＭＩ－１６４０中で、３７℃に維持した。細胞は、認証されることに加えて、マイコプラズマ並びにマウスバイアル病原体のパネルによる汚染がないことが決定された。Ｔ２２５組織培養フラスコの細胞を採取し、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ ＸＲ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）上のトリパンブルー排除法によって生細胞を定量した。雌マウスの右側腹部に、０．１ｍＬの無血清培地中の３×１０５個のＣＴ２６又はＢ１６Ｆ１０細胞、又は０．１ｍＬの１：１のＲＰＭＩ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）中の１×１０６個のＣＭＶ－ＳＫＭＥＬ３０細胞を皮下注射した。 ＣＭＶ－ＳＫＭＥＬ３０モデルでは、マウスに２．５×１０６個のＣＭＶ増殖ＣＴＬを静脈内注射した。全ての群が約１００ｍｍ３の同様の平均腫瘍体積を有するように、動物を無作為に群に分けた。
ＣＴ２６及びＢ１６Ｆ１０同系モデルでは、動物に、１００μｇ／マウスのアイソタイプ対照又は抗マウスＰＤ－１抗体を投与した。ＣＭＶ－ＳＫ－ＭＥＬ異種移植モデルでは、動物に、アイソタイプ対照抗体、抗ＴＩＧＩＴ－ｍＡｂ／抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ共製剤（２００μｇ／マウスで）及び／又は抗ＰＤ－１抗体（３００μｇ／マウスで）を腹腔内（ＩＰ）に週２回（２ＱＷ）投与した。動物の体重を測定し、腫瘍体積を週に２回測定した。ＰＲＯ－ＭＡＸ電子デジタルキャリパー（Ｊａｐａｎ Ｍｉｃｒｏｍｅｔｅｒ Ｍｆｇ．Ｃｏ．ＬＴＤ）で測定した腫瘍の長さ、幅及び高さから、腫瘍測定を算出した。［Ｌ×Ｗ×Ｈ］として腫瘍体積を計算し、ｍｍ３で表した。
統計解析
データは、時間の関数としてプロットした各群の平均腫瘍体積±平均標準誤差（ＳＥＭ）として表す。カスタムアプリケーションＩＶＥＡ（ｖ１．２．１．０１９）内に実装された線形混合効果モデルを使用して、腫瘍サイズに対する治療の効果を経時的に対照と比較して評価する統計分析を行った。固定効果には、群×時間交互作用項を有する群、時間が含まれた。共分散構造は、対象のランダム効果により誘導された。ダネットの補正を多重度に適用した。
発現データは、カスタムアプリケーションＩＶＥＡ（ｖ１．２．１．０１９）に実装されたｔ検定／ＡＮＯＶＡを用いて分析した。均質性及び正規性の仮定が、均質性がない場合にウェルチの補正で成立する場合、通常のｔ検定／ＡＮＯＶＡが使用される。ノンパラメトリックオプションは、非正規性の場合に使用される。ＡＮＯＶＡ多重度ダネット／テューキー又は同等の補正がタイプＩエラーの制御に適用される。
腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）パーセントは、以下の式を用いて、試験群及び対照群の腫瘍体積の平均変化の間の差として計算した：
ＴＧＩ％＝１００－［（処理後の最終体積－処理初期体積）／（対照最終体積－対照初期体積）］×１００
結果
この研究では、ＣＤ１１２Ｒ＋ＴＩＧＩＴ＋ＰＤ－１三重遮断のインビボ効果を複数のマウスモデルで評価した。第１のモデルでは、ＣＤ１１２Ｒ、又はＴＩＧＩＴ、又はその両方を欠くノックアウトマウス株を作製し、同系腫瘍モデルにおけるＰＤ－１ブロックｍＡｂを伴う又は伴わない標的欠損の効果を評価した。第２のモデルでは、免疫不全ＮＳＧマウスに、ＣＭＶ抗原を発現するように操作改変されたヒト黒色腫腫瘍細胞株（ＳＫＭＥＬ３０）を、ＣＭＶ Ａｇ特異的ＣＤ８ Ｔ細胞と共に移植した異種移植モデルを作製した。腫瘍が確立された後、マウスにヒトＰＤ－１ ｍＡｂ、ＣＤ１１２Ｒ及びＴＩＧＩＴ ｍＡｂの組み合わせ、又はＰＤ－１＋ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂの三重組み合わせを投与した。研究の過程にわたって腫瘍増殖を測定し、研究終了時の腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）パーセントを計算して、ＰＤ－１単一遮断、ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ組み合わせ（二重ノックアウト又は組み合わせｍＡｂ遮断）、又はＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ＋ＰＤ－１三重組み合わせ（ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ二重ＫＯ又はｍＡｂ組み合わせ、＋ＰＤ－１ ｍＡｂ）の活性をアイソタイプ対照処置群と比較した。
時間（腫瘍移植後）の関数としてプロットした腫瘍体積として示した研究の結果を図２４Ａ～２４Ｃに提供する。図２４Ａに示すように、抗ＰＤ－１抗体で処置し、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１１２Ｒ遺伝子をノックアウトし、それによって３つの標的全ての三重遮断を提供したマウスは、最も高い腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）を示した。ＴＩＧＩＴの遮断（遺伝子ＫＯによる）及び抗体処理によるＰＤ－１の遮断は、６０％のＴＧＩを提供した。同様の結果が、抗ＰＤ－１抗体で処置したＴＩＧＩＴ／ＣＤ１１２ＲダブルノックアウトＢ１６Ｆ１０マウスにおいて見られた。三重遮断は、最大量のＴＧＩをもたらした。図２４Ｃに示すように、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ／抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ組み合わせ製剤＋抗ＰＤ－１ ｍＡｂ（紫）による三重遮断は、アイソタイプ対照処置マウスの腫瘍体積（黒）と比較して腫瘍体積の最大の減少をもたらした。これらの結果は、ＣＤ１１２Ｒ＋ＴＩＧＩＴ＋ＰＤ－１三重遮断が二重組み合わせ又は単一遮断よりも良好に腫瘍増殖を阻害することを支持する。図２４Ａ～２４Ｃのデータは、三重遮断がＰＤ－１ ｍＡｂ単独、又はＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ組み合わせで処置された群と比較して、腫瘍増殖の最も強力な阻害をもたらしたことを支持する。これらの結果は、ＴＩＧＩＴ＋ＣＤ１１２Ｒ＋ＰＤ－１三重遮断がインビボでの腫瘍増殖の阻害するに有効であることを支持する。
これらのデータは、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１１２Ｒ及びＰＤ－１の遮断に伴う、インビボ腫瘍増殖阻害によって表されるような腫瘍の処置を支持する。
実施例１８
この実施例は、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ／抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ製剤の安定性を示す。
抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ（２４Ｆ１）を、９％（ｗ／ｖ）スクロース及び１０ｍＭ酢酸塩中、抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂ（４３Ｂ７。００２．０１５（ＴＩＧＩＴ－１０）又は６６Ｈ９．００９（ＴＩＧＩＴ－１２））を用いて、又は用いずに製剤化した。各製剤は、の最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート８０（ＰＳ８０）をさらに含んだ。各製剤の総抗体濃度は１４０ｍｇ／ｍＬであった。抗ＣＤ１１２Ｒ ｍＡｂ及び抗ＴＩＧＩＴ ｍＡｂの両方を含む製剤は、それぞれ約７０ｍｇ／ｍＬを１：１の比で含んだ。次いで、製剤を－３０℃、４℃、２５℃、又は４０℃で最長４週間貯蔵した。次いで、各製剤試料を、サイズ排除－超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＨＰＬＣ）及び還元キャピラリー電気泳動－ドデシル硫酸ナトリウム（ｒＣＥ－ＳＤＳ）によって分析して、各製剤の安定性を評価した。統合された総面積と比較した分離された各成分のパーセンテージを計算することによって安定性を決定した。各製剤の粘度（１０００ｓ－１の剪断速度、２５℃）を、コーン及びプレートレオメーターを用いてさらに評価した。
ＳＥ－ＵＨＰＬＣの結果を、図２５Ａ～２５Ｈ及び表２４～２７に示す。表２４～２７は、それぞれ－３０℃、４℃、２５℃、４０℃で貯蔵したときのＨＭＷ種％及び抗体主ピーク％を示し、これらのデータを、図２５Ａ～Ｄ（それぞれ－３０℃、４℃、２５℃、４０℃で貯蔵したときのＨＭＷ％）及び図２５Ｅ～２５Ｈ（それぞれ－３０℃、４℃、２５℃、４０℃で貯蔵したときの主ピーク％）に示す。これらの図及び表に示されるように、形成されるＨＭＷ種は２％未満であり、９６．５％を超える主ピークが、４０℃で最長４週間貯蔵された後でさえ維持され、抗体製剤の高い安定性が示唆された。
ｒＣＥ－ＳＤＳアッセイの結果を図２６の表２８に示す。このアッセイでは、タンパク質種は、アニオン性界面活性剤であるＳＤＳに結合しており、ＳＤＳゲル緩衝剤が充填された裸の溶融石英キャピラリー内に電気動力学的に注入される。電圧は、その下でＳＤＳコーティングされたタンパク質が親水性ポリマーベース溶液中での移行におけるそれらの差によって分離される、キャピラリー全体に印加される。タンパク質は、それらがＵＶ検出窓を通過するにつれて光ダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器によって検出される。安定性は、リーチ成分の正確なピーク面積率を決定することによって評価される。ｒＣＥ－ＳＤＳ法は、還元条件下で、重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）、非グリコシル化ＨＣ（ＮＧＨＣ）、及びその他の微細なピーク種及び基を分離する。表２４に示すように、全ての製剤は比較的安定であり、－３０℃、４℃、２５℃、又は４０℃で最長４週間貯蔵した後、約４％のＬＭＷ＋ＨＭＷピークを形成した。しかしながら、ＴＩＧＩＴ－１２ ｍＡｂを含む製剤は、より高い％を伴う。理論に束縛されるものではないが、高い％はこの抗体のクリッピングの増大によって引き起こされる。
粘度アッセイの結果を図２７及び表２９に示す。この図及び表に示されるように、一般に、製剤の粘度は、総抗体濃度が増加するにつれて上昇した。しかしながら、試験した全ての製剤で１５ｃＰ未満の粘度を示し、したがって許容できると考えられた。
本明細書に出版物、特許出願、及び特許などの全ての参考文献は、それぞれの参考文献があたかも、個々に及び具体的に参照により本明細書に組み込まれることが示されているかのごとく、且つ本明細書においてその全体が記載されているかのごとく同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本開示の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む」、「有する」、「包含する」及び「含有する」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（すなわち「含むが、限定されない」を意味する）と解釈されなければならない。
本明細書における値の範囲の列挙は、別途本明細書で指示されない限り、この範囲及び各端点にある別個の値のそれぞれを個々に指す簡略法の役割を果たすことが意図されているに過ぎず、別個の値及び端点のそれぞれは、それが本明細書において個々に列挙されていたかのように本明細書に組み込まれる。
本明細書中で説明されている方法は全て、別途本明細書で指示されない限り、又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書中で提供されるありとあらゆる例又は代表的な言語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本開示をより明らかにすることが意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中の如何なる言語も、任意の特許請求されていない要素を本開示の実施に必須として示していると解釈されるべきではない。
本明細書中で、本開示の好ましい実施形態が説明されており、例えば本開示を実行するための本発明者らに既知の最良の形態が説明されている。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読めば当業者にとって明らかになろう。発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、また、発明者らは、本明細書中で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図している。従って、本開示は、適用される法により認められる通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態で本開示に包含される。

Claims (48)

  1. （ａ）表Ａ１に記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）表Ａ１に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）表Ａ１に記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、及び（ｆ）表Ａ１に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列を含む、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  2. 表Ａ１の単一行に列挙される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含むか、又は （ａ）配列番号１３～１８、（ｂ）配列番号２３～２８、（ｃ）配列番号３３～３８、（ｄ）配列番号４３～４８、（ｅ）配列番号５３～５８、（ｆ）配列番号６３～６８、（ｇ）配列番号７３～７８、（ｈ）配列番号８３～８８、（ｉ）配列番号９３～９８、（ｊ）配列番号１０３～１０８、（ｋ）配列番号２３３～２３８、（ｌ）配列番号１９７３～１９７８、（ｍ）配列番号１９８３～１９８８、（ｎ）配列番号１９９３～１９９８、及び（ｏ）配列番号２００３～２００８からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  3. （ａ）表Ｂ１に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ１に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、請求項１又は２に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  4. 表Ｂ１の単一行に列挙される一対のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１１～１２、（ｂ）配列番号２１～２２、（ｃ）配列番号３１～３２、（ｄ）配列番号４１～４２、（ｅ）配列番号５１～５２、（ｆ）配列番号６１～６２、（ｇ）配列番号７１～７２、（ｈ）配列番号８１～８２、（ｉ）配列番号９１～９２、（ｊ）配列番号１０１～１０２、（ｋ）配列番号２３１～２３２、（ｌ）配列番号１９７１～１９７２、（ｍ）配列番号１９８１～１９８２、（ｎ）配列番号１９９１～１９９２、及び（ｏ）配列番号２００１～２００２からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  5. （ａ）表Ｂ１に記載の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は表Ｂ１の前記ＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ１に記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は表Ｂ１の前記ＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  6. 表Ｂの単一行に列挙される一対の完全長（ＦＬ） ＨＣ及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号９～１０、（ｂ）配列番号１９～２０、（ｃ）配列番号２９～３０、（ｄ）配列番号３９～４０、（ｅ）配列番号４９～５０、（ｆ）配列番号５９～６０、（ｇ）配列番号６９～７０、（ｈ）配列番号７９～８０、（ｉ）配列番号８９～９０、（ｊ）配列番号９９～１００、（ｋ）配列番号２２９～２３０、（ｌ）配列番号１９６９～１９７０、（ｍ）配列番号１９７９～１９８０、（ｎ）配列番号１９８９～１９９０、及び（ｏ）配列番号１９９９～２０００からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  7. 抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  8. ａ．配列番号３３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号３４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号３５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号３６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号３７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号３８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
    （ｂ）配列番号６３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号６４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号６５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号６６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号６７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号６８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
    （ｃ）配列番号８３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号８４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号８５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号８６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号８７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号８８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
    （ｄ）（ａ）配列番号３１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号３１の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号３２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号３２の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｅ）（ａ）配列番号６１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号６１の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号６２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号６２の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｆ）（ａ）配列番号８１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号８１の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号８２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号８２の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｇ）（ａ）配列番号２９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号２９の前記ＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号３０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号３０の前記ＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｈ）（ａ）配列番号５９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号５９の前記ＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号６０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号６０の前記ＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｉ）（ａ）配列番号７９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号７９の前記ＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号８０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号８０の前記ＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
    を含む、請求項７に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  9. 抗体の抗原結合断片である、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  10. 抗体タンパク質生成物であり、任意選択により、ｓｃＦｖである、請求項１～６のいずれか一項に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質。
  11. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質をコードする核酸。
  12. 請求項７又は８に記載の抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方をコードする核酸。
  13. （ａ）表Ｂ１に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ１に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ１の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方を含む、請求項１１又は１２に記載の核酸。
  14. 請求項１１～１３のいずれか一項に記載の１種以上の核酸を含むベクター。
  15. 請求項１１～１３のいずれか一項に記載の１種以上の核酸、又は請求項１４に記載の１種以上のベクターを含む宿主細胞。
  16. 前記宿主細胞は、請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を産生する、請求項１５に記載の宿主細胞。
  17. （ａ）表Ａ２に記載の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）表Ａ２に記載のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）表Ａ２に記載の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）表Ａ２に記載のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列を含む、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  18. （ａ）Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ２８若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｇｌｕ１又はその保存的アミノ酸置換を含むＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＳｅｒ９１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；Ｖａｌ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｒｇ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；及びＩｌｅ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１０９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１１若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＬＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
    （ｂ）Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ２８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ２９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｇｌｕ１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｉｌｅ２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ６８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ６９若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ｔｙｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｐ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ９６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ９７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；Ｇｌｙ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３５若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｙｓ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ａｒｇ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｎ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ１０５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｓｎ１０６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＬＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
    （ｃ）Ａｒｇ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｒｇ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｓｅｒ９１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ９２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ９３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ９４若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＬＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）；Ｔｈｒ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ３１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ３３若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｒｐ４７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｒｐ５０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｎ６５若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ａｓｎ１０１若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｖａｌ１０３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＨＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
    （ｄ）Ｇｌｎ２７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ３０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ３２若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｓｅｒ９６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｉｌｅ９７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｎ９８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｅｕ９９若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列；Ａｓｐ３３若しくはその保存的アミノ酸置換を含むＨＣ ＣＤＲ１アミノ酸配列；Ｔｙｒ５２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ５５若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｓｅｒ５６若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ５８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｈｒ５９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ６０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｒｏ６３若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｌｙｓ６６若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列；Ｉｌｅ１０２若しくはその保存的アミノ酸置換、Ａｌａ１０４若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｇｌｙ１０７若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１０８若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１０９若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｔｙｒ１１０若しくはその保存的アミノ酸置換、Ｐｈｅ１１１若しくはその保存的アミノ酸置換、又はこれらの任意の組み合わせを含むＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列（ここで、位置番号はＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質のＨＣ可変領域アミノ酸配列の相対位置である）
    を含む、請求項１７に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  19. 表Ａ２の単一行に列挙される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１１３～１１８、（ｂ）配列番号１２３～１２８、（ｃ）配列番号１３３～１３８、（ｄ）配列番号１４３～１４８、（ｅ）配列番号１５３～１５８、（ｆ）配列番号１６３～１６８、（ｇ）配列番号１７３～１７８、（ｈ）配列番号１８３～１８８、（ｉ）配列番号１９３～１９８、（ｊ）配列番号２０３～２０８、（ｋ）配列番号２１３～２１８、（ｌ）配列番号２２３～２２８、及び（ｍ）配列番号２０１３～２０１８からなる群から選択される６つのＣＤＲアミノ酸配列を含む、請求項１７又は１８に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  20. （ａ）表Ｂ２に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ２に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、請求項１７～１９のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  21. 表Ｂ２の単一行に列挙される一対のＨＣ可変領域及びＬＣ可変領域アミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１１１～１１２、（ｂ）配列番号１２１～１２２、（ｃ）配列番号１３１～１３２、（ｄ）配列番号１４１～１４２、（ｅ）配列番号１５１～１５２、（ｆ）配列番号１６１～１６２、（ｇ）配列番号１７１～１７２、（ｈ）配列番号１８１～１８２、（ｉ）配列番号１９１～１９２、（ｊ）配列番号２０１～２０２、（ｋ）配列番号２１１～２１２、（ｌ）配列番号２２１～２２２、及び（ｍ）配列番号２０１１～２０１２からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  22. （ａ）表Ｂ２に記載の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は表Ｂ２の前記ＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ２に記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は表Ｂ２の前記ＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせを含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  23. 表Ｂ２の単一行に列挙される一対の完全長（ＦＬ） ＨＣ及びＦＬ ＬＣアミノ酸配列を含むか、又は（ａ）配列番号１０９～１１０、（ｂ）配列番号１１９～１２０、（ｃ）配列番号１２９～１３０、（ｄ）配列番号１３９～１４０、（ｅ）配列番号１４９～１５０、（ｆ）配列番号１５９～１６０、（ｇ）配列番号１６９～１７０、（ｈ）配列番号１７９～１８０、（ｉ）配列番号１８９～１９０、（ｊ）配列番号１９９～２００、（ｋ）配列番号２０９～２１０、（ｌ）配列番号２１９～２２０、及び（ｍ）配列番号２００９～２０１０からなる群から選択される一対のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  24. 抗体である、請求項１７～２３のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  25. （ａ）配列番号２０３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号２０４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号２０５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号２０６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号２０７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号２０８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
    （ｂ）配列番号２２３の重鎖（ＨＣ）相補性決定領域（ＣＤＲ）１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｂ）配列番号２２４のＨＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｃ）配列番号２２５のＨＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｄ）配列番号２２６の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｅ）配列番号２２７のＬＣ ＣＤＲ２アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列、（ｆ）配列番号２２８のＬＣ ＣＤＲ３アミノ酸配列、又は１～４つのアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは
    （ｃ）（ａ）配列番号２０１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２０１の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２０２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２０２の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｄ）（ａ）配列番号２２１のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２２１の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２２２のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は配列番号２２２の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｅ）（ａ）配列番号１９９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号１９９の前記ＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２００の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号２００の前記ＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ；或いは
    （ｆ）（ａ）配列番号２１９の完全長（ＦＬ）ＨＣアミノ酸配列、又は配列番号２１９の前記ＦＬ ＨＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）配列番号２２０の記載のＦＬ ＬＣアミノ酸配列、又は配列番号２２０の前記ＦＬ ＬＣアミノ酸配列に対して１～５０個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組み合わせ
    を含む、請求項２４に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  26. 抗体の抗原結合断片である、請求項１７～２３のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  27. 抗体タンパク質生成物であり、任意選択により、ｓｃＦｖである、請求項１７～２３のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質。
  28. 請求項１７～２７のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質をコードする核酸。
  29. 請求項２４又は２５に記載の抗体の軽鎖、重鎖、又は軽鎖及び重鎖の両方をコードする核酸。
  30. ヌクレオチド配列は、（ａ）表Ｂ２に記載のＨＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２の前記ＨＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；（ｂ）表Ｂ２に記載のＬＣ可変領域アミノ酸配列、又は表Ｂ２の前記ＬＣ可変領域アミノ酸配列に対して１～１５個のアミノ酸のみが異なるか、若しくは少なくとも又は約９０％若しくは約９５％の配列同一性を有するそのバリアント配列；或いは（ｃ）（ａ）及び（ｂ）の両方をコードする、請求項２８又は２９に記載の核酸。
  31. 請求項２８～３０のいずれか一項に記載の１種以上の核酸を含むベクター。
  32. 請求項２８～３０のいずれか一項に記載の１種以上の核酸、又は請求項３１に記載の１種以上のベクターを含む宿主細胞。
  33. 前記宿主細胞は、請求項１７～２７のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を産生する、請求項３１に記載の宿主細胞。
  34. 請求項１～１０のいずれか一項に記載のＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質、及び請求項１７～２７のいずれか一項に記載のＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を含む組成物。
  35. （Ａ）前記ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質は、表Ａ１又は表Ｂ１に記載される１Ｅ１、１Ｅ１．０１６、２４Ｆ１、２９Ｅ１０、２４Ｆ１．００１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２５、１１Ｅ４、３１Ｂ３、２７Ｇ１２、２８Ｆ９、２８Ｈ７、又は３６Ｃ８、任意選択により、２４Ｆ１、２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０又は２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２であり、（Ｂ）前記ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、表Ａ２又は表Ｂ２に記載される５５Ｇ７．０４１．００８、５８Ａ７．００３．００８．０７５、４Ｇ１０、１１Ａ３、２８Ｂ８、３９Ｄ２、４３Ｂ７、５５Ｇ７、６６Ｈ９、４３Ｂ７．００２．０１５、５８Ａ７．００３．０８、６６Ｈ９．００９、又は５８Ａ７のいずれか１つ、任意選択により、前記４３Ｂ７．００２．０１５又は６６Ｈ９．００９、又は（Ａ）と（Ｂ）の組み合わせである、請求項３４に記載の組成物。
  36. 前記組成物は、（Ａ）２４Ｆ１及び４３Ｂ７．００２．０１５、（Ｂ）２４Ｆ１及び６６Ｈ９．００９、（Ｃ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び４３Ｂ７．００２．０１５、（Ｄ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２０及び６６Ｈ９．００９、（Ｅ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び４３Ｂ７．００２．０１５、（Ｆ）２９Ｅ１０＿ＣＯＮＳ．０２２及び６６Ｈ９．００９、（Ｇ）４３Ｂ７．００２．０１５及び１Ｅ１．０１６、（Ｈ）４３Ｂ７．００２．０１５及び２４Ｆ１、（Ｉ）４３Ｂ７．００２．０１５及び２９Ｅ１０、（Ｊ）６６Ｈ９．００９及び１Ｅ１．０１６、（Ｋ）６６Ｈ９．００９及び２９Ｅ１０、（Ｌ）４３Ｂ７及び２９Ｅ１０、（Ｍ）４３Ｂ７及び２４Ｆ１、又は（Ｎ）４３Ｂ７及び１１Ｅ４を含む、請求項３４又は３５に記載の組成物。
  37. 前記ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質及び前記ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質は、約１：１の比で前記組成物中に存在する、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. ＰＤ－１抗原結合タンパク質をさらに含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の組成物。
  39. 請求項１～１０及び１７～２７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項１１～１３及び２８～３０のいずれか一項に記載の核酸、請求項１４又は３１に記載のベクター、請求項１５、１６、３２及び３３のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項３４～３８のいずれか一項に記載の組成物、又はこれらの組み合わせ、並びに容器を含みキット。
  40. ＰＤ－１抗原結合タンパク質をさらに含む請求項３９に記載のキット。
  41. 請求項１～１０及び１７～２７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質、請求項１１～１３及び２８～３０のいずれか一項に記載の核酸、請求項１４又は３１に記載のベクター、請求項１５、１６、３２及び３３のいずれか一項に記載の宿主細胞、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組成物、又はこれらの組み合わせ、並びに薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物。
  42. ＰＤ－１抗原結合タンパク質をさらに含む請求項４１に記載の医薬組成物。
  43. 前記ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を発現するように請求項１５又は１６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記発現したＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を回収する工程を含む、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質を作製する方法。
  44. 前記ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を発現するように請求項３２又は３３のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、及び前記発現したＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を回収する工程を含む、ＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を作製する方法。
  45. それを必要とする対象を治療する方法であって、それを必要とする前記対象に、前記対象を治療するのに有効な量で請求項４１又は４２に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
  46. 前記対象は固形腫瘍を有し、前記医薬組成物は前記対象の前記固形腫瘍を治療するのに有効な量で前記対象に投与される、請求項４５に記載の方法。
  47. それを必要とする対象を治療する方法であって、それを必要とする前記対象に、ＣＤ１１２Ｒ抗原結合タンパク質及びＴＩＧＩＴ抗原結合タンパク質を含む第１の医薬組成物、並びにＰＤ－１阻害剤を含む第２の医薬組成物を投与することを含む方法。
  48. 前記対象は固形腫瘍を有し、前記第１の医薬組成物及び前記第２の医薬組成物は前記対象の前記固形腫瘍を治療するのに有効な量で前記対象に投与される、請求項４７に記載の方法。
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