CN116194482A - Tigit和cd112r阻断 - Google Patents

Tigit和cd112r阻断 Download PDF

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Abstract

本文提供了TIGIT结合蛋白、CD112R结合蛋白、及其组合。还提供了包含TIGIT结合蛋白和CD112R结合蛋白，任选地进一步包含PD‑1结合蛋白的组合物。另外提供了相关缀合物、融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和试剂盒。进一步提供了药物组合物和治疗有需要的受试者的方法，这些药物组合物包含TIGIT结合蛋白、CD112R结合蛋白、或其组合，任选地进一步包含PD‑1抗原结合蛋白、或缀合物、融合蛋白、核酸、载体、或宿主细胞、以及药学上可接受的载剂、稀释剂、或赋形剂。

Description

TIGIT和CD112R阻断
相关申请的交叉引用
本文根据35 U.S.C.§119(e)特此要求于2020年7月15日提交的美国临时申请号63/052,011和于2021年6月18日提交的美国临时申请号63/212,315的权益，并且将其披露内容通过引用特此并入本文。
通过引用并入以电子方式提交的材料
通过引用以其全文并入的是与本文同时提交的计算机可读核苷酸/氨基酸序列表，并且其标识如下：名称为“A-2443-WO-PCT_Seq_Listing.txt”的5.22MB ASCII(文本)文件；创建于2021年6月28日。
背景技术
PD-1/PD-L1轴与癌症中T细胞免疫应答的抑制有关。已在临床上在许多实体瘤适应症中证实此路径的拮抗剂。纳武单抗(Nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)是靶向PD-1路径的两种此类抑制剂，且每种已经获得美国食品与药物管理局(U.S.Food and DrugAdministration，FDA)批准用于治疗转移性黑色素瘤。近来，研究人员已在其他肿瘤类型背景下测试了检查点抑制的范例。虽然已获得一些进展，但检查点抑制疗法仍然处在其他癌症治疗选择的阴影中。
有关检查点抑制剂与其他药剂组合的研究正在进行中或近来已完成。例如，在III期临床试验中对患有不可切除的III期或IV期黑色素瘤的患者测试了纳武单抗与伊匹单抗(ipilimumab)(一种CTLA-4受体阻断抗体)的组合。在此项研究中，在接受纳武单抗与伊匹单抗的组合的患者中实现完全缓解的患者的百分比最高，超过了在接受任一单独药物的组中的患者所展现的结果。然而，对阻断CTLA-4和PD-1检查点受体的免疫疗法的应答并不普遍，并且已经确定了肿瘤逃避应答的多种机制。作为提高总效力并限制肿瘤耐药性的方法，靶向多种路径的组合疗法代表了下一步的基本原理。
需要靶向多种检查点抑制剂路径的安全和有效的组合疗法。
发明内容
本文呈现了展示出在原发性人肿瘤组织中的激活的人T细胞和TIL(肿瘤浸润白细胞)上TIGIT和CD112R的诱导的数据，以及支持TIGIT和CD112R的配体(CD155和CD112)在肿瘤细胞上高共表达水平的数据。本文提供的数据支持，虽然阻断TIGIT或CD112R与其配体的单一相互作用会增强原代人T细胞活性，但同时阻断两种受体(TIGIT和CD112R)与其各自配体的结合会大大增强原代人T细胞的活性。该数据进一步支持，除了阻断TIGIT和CD112R相互作用外，阻断涉及PD-1及其配体的第三种相互作用也会显著增加整个原代人T细胞活性。阻断所有三种分子(PD-1、TIGIT、CD112R)所取得的活性的增加超过了单一阻断(仅TIGIT或仅CD112R)和双重阻断(同时阻断TIGIT和CD112R，同时阻断TIGIT和PD-1，或同时阻断CD112R和PD-1)所取得的活性的增加。
因此，本披露提供了TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗体及其抗原结合片段)、CD112R抗原结合蛋白(例如，抗体及其抗原结合片段)、及其组合。此外，本披露提供了包含TIGIT抗原结合蛋白、CD112R抗原结合蛋白和PD-1抗原结合蛋白的组合物。在某些实施例中，这些组合物包含TIGIT抗体或其TIGIT结合片段、和/或CD112R抗体或其CD112R结合片段、和/或PD-1抗体或其PD-1结合片段。在优选的实施例中，该组合物包含TIGIT抗体和CD112R抗体。本文提供了相关缀合物、融合蛋白、核酸、载体、宿主细胞和试剂盒。
本披露还提供了药物组合物，这些药物组合物包含TIGIT抗原结合蛋白、CD112R抗原结合蛋白、或其组合，任选地进一步包含PD-1抗原结合蛋白、或缀合物、融合蛋白、核酸、载体、或宿主细胞、以及药学上可接受的载剂、稀释剂、或赋形剂。在优选的实施例中，该药物组合物包含1:1比例的TIGIT抗体和CD112R抗体。
提供了制造抗原结合蛋白的方法。还提供了治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用本披露的药物组合物。
附图说明
图1A是描绘指定的肿瘤适应症的细胞的共表达图谱的一系列图。在顶行中，显示了TIGIT家族成员相互之间以及与PD-1的共表达。在底行中，显示了TIGIT家族成员的配体相互之间以及与PD-1的共表达。
图1B是描绘TIGIT、CD112R、CD226、或PD-1的表达的一系列图(数据基于单个细胞RNA seq数据)。
图1C是描绘TIGIT、CD112R、和PD-1的共表达的一系列FACS图。
图1D是列出了对肿瘤浸润T/NK细胞中CD112R、TIGIT、或PD-1的表达呈阳性的CD4T细胞、CD8 T细胞、或自然杀伤(NK)细胞的百分比的表。
图1E是描绘Epcam、CD45、CD112、CD155、CD11c、和CD11b在肿瘤相比于PBMC中表达的一系列图。在Epcam+、CD45+Epcam+、或CD45+Epcam-群体上评估CD112和CD155表达或CD11c和CD11b表达。
图2A是Jurkat报道基因测定(RGA)的图示。该测定系统使用稳定表达CD112和CD3衔接子的工程化的CHO细胞和用CD3/CD28抗体预激活的纯化的人泛T细胞。当在T细胞表面上表达的CD112R与在CHO细胞表面上表达的CD112结合时，预期IL-2的释放会被抑制。
图2B是描绘激活的T细胞(右)相对于未激活的T细胞(左)的CD112R表达增加的图。针对同种型对照显示CD112R染色谱。
图2C是展示抗体或配体与表达人CD112R的CHO细胞之间的结合(用几何平均值(GeoMean)倍数表示)随工具抗体(PL-52575、PL-52576、和PL-52577)或人或小鼠IgG匹配对照抗体(分别为HuIgG同种型和MuIgG同种型)的浓度变化绘制的图。还显示了CD112配体的结合。
图2D是展示配体与在CHO细胞上表达的人CD112R之间的结合的计算的抑制百分比随工具抗体(PL-52575、PL-52576、和PL-52577)或人或小鼠IgG匹配对照抗体(分别为HuIgG同种型和MuIgG同种型)的浓度变化绘制的图。
图2E是与用空载体(Vector)或编码CD112(CD112)的载体转染的CHO细胞相互作用时，IL-2浓度(pg/mL)随工具抗体(PL-52575、PL-52576、和PL-52577)或人或小鼠IgG匹配对照抗体(分别为HuIgG同种型和MuIgG同种型)的浓度变化绘制的图。X轴下面的表中显示了每个工具抗体的EC50。
图2F是IL-2浓度(pg/mL)随测定中CD226抗体或同种型匹配对照抗体的浓度变化绘制的图，在该测定中T细胞与用空载体(载体-CHO)或编码CD112的载体(CD112-CHO)转染的CHO细胞共培养。在一种情况下，显示了没有任何抗体的T细胞。
图3是用于发现抗CD112R拮抗剂抗体的筛选级联的示意图。
图4A是Jurkat报道基因测定(RGA)的示意图。在存在抗体或对照的情况下，将表达CD3衔接子和CD112的CHO细胞与表达NFAT荧光素酶构建体和CD112R的Jurkat T细胞共培养。
图4B是针对收获物6-9绘制的荧光素酶活性的倍数诱导图。
图4C是针对一组350个命中和阳性结合剂绘制的与原代食蟹猴T细胞的结合活性图。
图5A是列出收获物1-3的特征的表，并且图5B是列出收获物6-9的特征的表。
图6是以100pM Kd为任意截止阈值的CD112R抗体的相对结合活性图。
图7A是显示抗体的序列多样性的进化分枝结果图。
图7B是列出了指定的抗体的示例性EC50值以及种系和HC CDR3序列信息的表。
图8是通过指定的抗体或工具抗体(PL-52575、PL-52577)实现的结合的抑制百分比的图。不相关的小鼠和人类抗体作为对照。X轴下面的表中列出了每个工具抗体的EC50值和最大抑制百分比。
图9A是A2、B2、和F2这三种情况下竞争测定的不同阶段的信号图，其中A2是使用两种不同的抗体来确定第二抗体是否与第一抗体竞争结合配体时。B2是在整个测定过程中使用相同的抗体时。F2是使用不相关的对照抗体时。
图9B是列出了由竞争测定确定的与配体结合的相互竞争的抗体(分组A)的表。
将培养的人T细胞和食蟹猴PBMC与不同浓度的抗体一起孵育，起始浓度为3μg/mL(在与人T细胞的测定中)或5μg/mL(在与食蟹猴PBMC的测定中)。抗体以1比3滴定，最低浓度为0.001μg/mL(在与人T细胞的测定中)和0.002μg/mL(在与食蟹猴PBMC的测定中)。FCS表达(FCS Express)用于获得几何平均值，并且Screener用于确定相对于同种型对照的倍数、滴定曲线和EC50值。图10A和10B是相对于同种型对照的倍数随指定的抗体的浓度变化绘制的图。使用食蟹猴PBMC和人T细胞的测定结果分别显示在图10A和10B中。图10A和10B的图绘制了相对于同种型对照信号的倍数随指定的抗体的对数浓度的变化。
图11A是NFAT荧光素酶活性随指定的抗体的浓度变化绘制的图。图11B是列出了在Jurkat RGA中确定的抗体的EC50的表。
图12A是TIGIT与CD155-Fc结合的抑制百分比随工具TIGIT抗体浓度变化绘制的图。图12B是与CD112-Fc结合的抑制百分比随抗体浓度变化的图。
图12C是测试工具TIGIT抗体活性的细胞测定的图示。图12D是在没有任何抗体的情况下，CD226-Fc与图12C的不同细胞结合的图。图12E是在指定浓度的工具抗体或对照抗体存在下CD226-Fc的结合的图。
图12F是在指定浓度的工具抗体或对照抗体存在下由T细胞制造的IFNγ的浓度的图。图12G是在指定浓度的工具抗体或对照抗体存在下诱导的NFAT荧光素酶活性的浓度的图。
图12H是在指定浓度的工具抗体或对照抗体存在下结合的图。1F4是工具抗体，像10A7和MBSA43。图12I是展示指定的抗体相对于同种型对照对原代预激活的食蟹猴T细胞的结合活性的一系列图。
图13是用于发现抗TIGIT抗体的筛选测定的示意图。
图14A是Jurkat报道基因测定(RGA)的示意图。在存在抗体或对照的情况下，将表达CD3衔接子和CD155的CHO细胞与表达NFAT荧光素酶构建体和TIGIT的Jurkat T细胞共培养。图14B是在所示TIGIT抗体或工具抗体(MBSA43)或对照抗体(人IgG4同种型对照、人IgG2同种型对照、鼠IgG1同种型对照)存在下诱导的NFAT荧光素酶活性的图。
图14C是在所示TIGIT抗体或工具抗体(MBSA43)或对照抗体(人IgG同种型对照、鼠IgG1同种型对照)存在下由T细胞制造的IFNγ的图。
图15是在所示TIGIT抗体(AB1或AB2)或工具抗体(MBSA43)存在下，由用IL-2-荧光素酶报告构建体和TIGIT转染的Jurkat T细胞诱导的荧光素酶活性的图。一组细胞被工程化为敲除CD226表达(CD226KO)。
图16A是使用表达TIGIT、CD226和CD112R的T细胞和表达CD155、CD112、和scFV抗CD3的CHO细胞的IFNγ释放测定的示意图。图16B是在指定的抗体组合存在下释放的IFNγ的图。HuIgG1和mIgG1是同种型匹配对照抗体。工具CD112R抗体包括PL-52577。
图17A-17C中的每一个都是在指定的2个或三个抗体的组合或单一抗体存在下释放的IFNγ的图。3x＝抗PD-1、抗TIGIT和抗CD112R抗体的组合。图17D是指定的抗体组合或单一抗体的IFNγ释放测定的预期结果相比于观察结果的图。
图17E是在解离的人肿瘤细胞测定中，在指定的2个或三个抗体组合或单一抗体存在下释放的IFNγ的图。显示了第3天与第6天收集的上清液的IFNγ浓度。
图17F是PBMC或肿瘤细胞中CD4 T细胞中对指定的分子表达阳性的细胞的百分比的图。图17G是PBMC或肿瘤细胞中CD8 T细胞中对指定的分子表达阳性的细胞的百分比的图。
图17H是解离的肿瘤细胞培养物在第6天对PD-1表达阳性的细胞的百分比的图，其中用抗TIGIT抗体、抗CD112R抗体或同种型对照抗体处理这些细胞。
图17I是解离的肿瘤细胞培养物在第6天对TIGIT表达阳性的细胞的百分比的图，其中用抗PD-1抗体、抗CD112R抗体或同种型对照抗体处理这些细胞。
图18是本文引用的表2-5和表12-19的汇编。
图19A和19B中的每一个都是细胞毒性T淋巴细胞在受到包含以所示的不同的比例的抗CD112R mAb(24F1)、抗TIGIT mAb(43B7.002.015)和抗PD-1mAb的配制品刺激后产生的IFN-γ的量(pg/mL)的图。图19A和19B中配制品的总抗体浓度分别为1.5nM和30nM。
图20A-20C是与通过由FACS分析确定的离体原代人肿瘤组织和匹配血液的TIGIT、CD112R和配体CD155、CD112和PDL1表达相关的图。图20A示出了解离的肿瘤组织中CD45+免疫细胞中CD8+T细胞以及CD3-CD56+NK细胞上的TIGIT+和CD112R+细胞的百分比，并且图20B显示了肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或血液中由T/NK联合表达的TIGIT+和CD112R+细胞的百分比。对样品的一个子集进行配体表达分析，其中EpcamHI肿瘤细胞中CD155-、CD112-和PD-L1阳性细胞的百分比显示在图20C中。连接线表示单独的供体的值。这些数据代表了来自四个适应症(PANC、CRC、GIST、和TNBC)的肿瘤组织的组合结果。
图21是雄性食蟹猴IV施用后平均血清mAb浓度随时间变化绘制的图。带圆圈的线绘制了第1组动物的抗TIGIT mAb的平均血清浓度，带方块的线绘制了第1组动物的抗CD112R mAb的平均血清浓度，带三角形的线(向上)绘制了第2组动物的抗TIGIT mAb的平均血清浓度，以及带三角形的线(向下)绘制了第3组动物的抗CD112R mAb的平均血清浓度。
图22A-22D示出CD112R+TIGIT阻断附加地增强人原代NK细胞对肿瘤细胞的活性。图22A是靶阳性NK细胞百分比的图，其中靶为CD226、TIGIT、CD112R、PD-1或CD96，该图显示纯化的人NK细胞表达高水平的CD226、TIGIT、和CD112R以及低水平的PD-1和CD96。图22B是表达CD155、CD112、或PDL1的配体阳性细胞百分比的图，并且该图显示用于测定的靶肿瘤细胞(SKBR3肿瘤细胞系)表达高水平的CD155和CD112以及低水平的PD-L1。图22C是通过由抗PD-1抗体、抗TIGIT抗体、抗CD112R抗体、或抗TIGIT抗体与抗CD112R抗体的组合、或抗PD-1抗体、抗TIGIT抗体与抗CD112R抗体的组合(3X)刺激的纯化的人NK细胞杀伤肿瘤细胞的程度(相对于同种型对照抗体)的图。图22D是由包含抗PD-1抗体、抗TIGIT抗体、抗CD112R抗体、或抗TIGIT抗体与抗CD112R抗体的组合、或抗PD-1抗体、抗TIGIT抗体与抗CD112R抗体的组合(3X)的指定的抗体混合物刺激的IFNγ产生的程度(相对于同种型对照抗体)的图。图22C和22D显示，与同种型(HuIgG1)或PD-1抗体处理的细胞相比，单独阻断TIGIT或CD112R增强了NK细胞的活性，但阻断TIGIT和CD112R两者在16小时附加地增强肿瘤细胞杀伤和IFNg产生。NK细胞活性显示为相对于同种型对照的倍数变化。以10ug/ml添加每种mAb。
在包含抗PD-1抗体、抗TIGIT抗体、抗CD112R抗体、或抗TIGIT抗体与抗CD112R抗体的组合、或抗PD-1抗体、抗TIGIT抗体与抗CD112R抗体的组合(各10ug/ml)的指定的抗体混合物存在下，培养由解离的离体肿瘤组织产生的单个细胞悬浮液，并在第3天通过上清液中的IFNg水平测量T/NK细胞活性。图23是解离的离体肿瘤组织中原代TIL应答的增加(相对于同种型对照抗体)，该图显示包含靶向CD112R+TIGIT+PD-1的所有三种抗体(以1:1:1的比例)的混合物刺激最高的TIL应答。该图显示了来自5个不同组织的平均值和表示SEM的误差条。
图24A-24C表示在几个不同的小鼠肿瘤模型中，肿瘤生长应答随时间变化的图。图24A显示了CT26同系肿瘤模型中的肿瘤生长，其中绘制了用同种型对照或抗PD1抗体治疗的野生型(WT)小鼠、TIGITxCD112R KO(双KO)小鼠、CD112R KO小鼠或TIGIT KO小鼠中的肿瘤体积随肿瘤植入后天数的变化。编号组对应的是(1)用同种型对照抗体治疗的WT小鼠，(2)用同种型对照抗体治疗的TIGITxCD112R KO小鼠，(3)用抗PD-1抗体治疗的WT小鼠，(4)用抗PD-1抗体治疗的CD112R KO小鼠，(5)用抗PD-1抗体治疗的TIGIT KO小鼠以及(6)用抗PD-1抗体治疗的TIGITxCD112R KO小鼠。图24B是B16F10同系肿瘤模型中肿瘤体积的图，其中组的编号对应的是(1)用同种型对照抗体治疗的WT小鼠，(2)用抗PD-1抗体治疗的WT小鼠，(3)用同种型对照抗体治疗的TIGITxCD112R KO(dKO)小鼠，以及(4)用抗PD-1抗体治疗的TIGITxCD112R KO(dKO)小鼠。图24C是在用以下抗体治疗的异种移植模型中测量的肿瘤体积随时间变化的图，这些抗体为：(1)同种型对照抗体，(2)抗PD-1抗体，(3)包含抗TIGITmAb和抗CD112R mAb的组合配制品，以及(4)包含抗TIGIT mAb和抗CD112R mAb以及抗PD-1mAb的组合配制品。
图25A-25D各自是于-30℃(图25A)、4℃(图25B)、25℃(图25C)和40℃(图25D)下储存后配制品中通过SEC测量的高分子量(HMW)物质的百分比随时间(周)变化绘制的图，该配制品包含(1)抗CD112R mAb(CD112R)，(2)抗TIGIT mAb(TIGIT-10)，(3)另一个抗TIGIT mAb(TIGIT-12)，(4)抗CD112RmAb和TIGIT-10mAb两者以及(5)抗CD112R mAb和TIGIT-12两者。
图26是列出了包含70mg/mL或140mg/mL抗CD112R mAb、TIGIT-10或TIGIT-12的配制品、或包含抗CD112R和TIGIT-10(以1:1比例)两者或包含抗CD112R和TIGIT-12(以1:1比例)两者的配制品的LMW+HMW峰百分比的表。
图27是包含70mg/mL或140mg/mL抗CD112R mAb、TIGIT-10或TIGIT-12的配制品、或包含抗CD112R和TIGIT-10(以1:1比例)两者或包含抗CD112R和TIGIT-12(以1:1比例)两者的配制品的粘度(cP)的图。
具体实施方式
TIGIT和CD112R(也称为PVRIG)属于在细胞外区域含有一个或多个免疫球蛋白(Ig)结构域的受体家族。这些受体与也含有一个或多个Ig结构域的配体相互作用。尽管有证据表明每个受体可以与家族中的多个配体相互作用，但基于亲和力测量的排序，TIGIT-CD155和CD112R-CD112代表主要的受体-配体配对。另一个家族成员CD226可以与CD112和CD155相互作用，两者的亲和力都比对于TIGIT-CD155和CD112R-CD112的亲和力弱。CD226的参与增强了T/NK细胞活性，特别是在T/NK细胞对肿瘤细胞应答中。这种“共刺激”信号被认为在TIGIT和CD112R以高水平共表达时受到抑制，这是因为1)TIGIT和CD112R都以比CD226更高的亲和力与配体结合，并有效限制配体的可及性，以及2)TIGIT和CD112R细胞内结构域含有被认为能产生抑制性信号的ITIM或ITIM样结构域，尽管这种信号的性质在T细胞中尚未充分表征。
CD155和CD112的转录物(TIGIT和CD112R的主要配体)存在于大范围的组织和细胞类型中。这与PD-L1相反，PD-L1的表达更受限制，在抗原呈递细胞和肿瘤细胞中优先表达。已经显示这些配体是由不同类型的刺激诱导的：虽然PD-L1由暴露于IFNγ而上调，但CD155和CD112不受暴露于这种细胞因子的调节，而是在响应于DNA损伤、病毒感染和活性氧(ROS)时上调。因此，配体诱导应答进一步区分了TIGIT和CD112R与PD-1所参与的路径。
本披露提供了抗原结合蛋白，例如，抗体及其抗原结合片段，这些抗原结合蛋白与TIGIT结合，例如，TIGIT结合蛋白，在本文中也称为TIGIT抗原结合蛋白。在优选的实施例中，该TIGIT抗原结合蛋白是特异性结合TIGIT的抗体(例如，TIGIT抗体、α-TIGIT抗体)。
本披露另外提供与CD112R结合的抗原结合蛋白，例如，CD112R结合蛋白，在本文中也称为CD112R抗原结合蛋白。在优选的实施例中，该CD112R抗原结合蛋白是特异性结合CD112R的抗体(例如，CD112R抗体、α-CD112R抗体)。
结合特征
在示例性实施例中，本披露的TIGIT抗原结合蛋白结合TIGIT的结合强度根据其亲和力描述。在示例性方面中，本披露的TIGIT抗原结合蛋白与TIGIT的结合强度根据KD描述。同样地，本披露的CD112R抗原结合蛋白结合CD112R的结合强度根据其亲和力描述，以及在示例性方面中，本披露的CD112R抗原结合蛋白与CD112R的结合强度根据KD描述。KD为抗原结合蛋白与其靶标或抗原之间的平衡解离常数，koff/kon的比率。KD与亲和力成反比。KD值与抗原结合蛋白的浓度有关，因此KD值越低，抗原结合蛋白的亲和力越高。在示例性方面中，本文提供的TIGIT抗原结合蛋白和CD112R抗原结合蛋白的KD是微摩尔、纳摩尔、皮摩尔或飞摩尔。在示例性方面中，本文提供的TIGIT抗原结合蛋白或CD112R抗原结合蛋白的KD在约10-4至10-6M、或10-7至10-9M、或10-10至10-12M、或10-13至10-15M范围内。任选地，本文提供的TIGIT抗原结合蛋白或CD112R抗原结合蛋白的KD在约10-12至10-8M，任选地10-11至10-10M范围内。
在多个方面，抗原结合蛋白(例如，抗体)与人TIGIT结合。人TIGIT的氨基酸序列在本文以SEQ ID NO:1提供。特别地，SEQ ID NO:1的氨基酸1-21代表信号肽，并且SEQ ID NO:1的氨基酸22-244代表成熟人TIGIT氨基酸序列。在示例性方面中，抗原结合蛋白以约50nM或更低(例如，约40nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、或约10nM或更低)的KD与人TIGIT结合。在示例性方面中，抗原结合蛋白以小于或约5nM、小于或约4nM、小于或约3nM、小于或约2nM、或小于或约1nM的KD与人TIGIT结合。在多个方面，对于人TIGIT的抗原结合蛋白的KD小于1nM，例如，小于0.75nM、小于0.5nM、或小于0.25nM。任选地，对于人TIGIT的抗原结合蛋白的KD大于或约0.001nM、或大于或约0.01nM、并且小于0.5nM。在多个方面，对于人TIGIT的抗原结合蛋白的KD为约0.01nM至约0.5nM、约0.02nM至约0.5nM、约0.03nM至约0.5nM、约0.04nM至约0.5nM、约0.05nM至约0.5nM、约0.06nM至约0.5nM、约0.07nM至约0.5nM、约0.08nM至约0.5nM、约0.09nM至约0.5nM、约0.1nM至约0.5nM、约0.2nM至约0.5nM、约0.3nM至约0.5nM、约0.4nM至约0.5nM、约0.01nM至约0.4nM、约0.01nM至约0.3nM、约0.01nM至约0.2nM、约0.01nM至约0.1nM、约0.01nM至约0.09nM、约0.01nM至约0.08nM、约0.01nM至约0.07nM、约0.01nM至约0.06nM、约0.01nM至约0.05nM、约0.01nM至约0.04nM、约0.01nM至约0.03nM、或约0.01nM至约0.02nM。在多个方面，抗原结合蛋白还与食蟹猴(cyno)TIGIT结合。食蟹猴TIGIT的氨基酸序列在本文以SEQ ID NO:2024提供。特别地，SEQ ID NO:2024的氨基酸1-21代表信号肽，并且SEQ ID NO:2024的氨基酸22-245代表成熟食蟹猴TIGIT蛋白。在示例性方面中，抗原结合蛋白以约1nM至约25nM，例如，约5nM至约20nM、或约5nM至约15nM的KD与食蟹猴TIGIT结合。在示例性方面中，抗原结合蛋白以约8nM至约14nM的KD与食蟹猴(cyno)TIGIT结合。在多个方面，抗原结合蛋白以高亲和力同时与人TIGIT和食蟹猴TIGIT结合。任选地，对于人TIGIT的抗原结合蛋白的KD为约0.01nM并且小于0.5nM，并且对于食蟹猴TIGIT的抗原结合蛋白的KD为约8nM至约14nM。在示例性情况下，对于人TIGIT的抗原结合蛋白的KD在对于食蟹猴TIGIT的抗原结合蛋白的KD的约100倍、约50倍、约25倍、约10倍、约5倍、或约2倍、或更低以内。在多个方面，对于表达人TIGIT的人T细胞的TIGIT抗原结合蛋白的EC50值在对于表达食蟹猴TIGIT的食蟹猴PBMC的TIGIT抗原结合蛋白的EC50值的约100倍、约50倍、约25倍、约10倍、约5倍、或约2倍、或更低以内。
在不同的情况下，抗原结合蛋白(例如，抗体)与人CD112R结合。人CD112R的氨基酸序列在本文以SEQ ID NO:3提供。特别地，SEQ ID NO:3的氨基酸53代表细胞外结构域的第一氨基酸。在示例性方面中，抗原结合蛋白以高亲和力同时与人CD112R和食蟹猴CD112R结合。在示例性方面中，抗原结合蛋白以约50nM或更低(例如，约40nM或更低、约30nM或更低、约20nM或更低、或约10nM或更低)的KD与人CD112R结合。在示例性方面中，抗原结合蛋白以小于或约5nM、小于或约4nM、小于或约3nM、小于或约2nM、或小于或约1nM的KD与人CD112R结合。在多个方面，对于人CD112R的抗原结合蛋白的KD小于1nM，例如，小于0.75nM、小于0.5nM、或小于0.25nM。任选地，对于人CD112R的抗原结合蛋白的KD大于或约0.001nM、或大于或约0.01nM、并且小于3nM。在多个方面，对于人CD112R的抗原结合蛋白的KD为约0.01nM至约5nM、约0.05nM至约5nM、约0.10nM至约5nM、约0.5nM至约5nM、约1nM至约5nM、约2nM至约5nM、约3nM至约5nM、约4nM至约5nm、约0.01nM至约4nM、约0.01nM至约3nM、约0.01nM至约2nM、约0.01nM至约1nM、约0.01nM至约0.5nM、约0.01nM至约0.1nM、或约0.01nM至约0.05nM。在多个方面，抗原结合蛋白与食蟹猴CD112R结合。食蟹猴CD112R的氨基酸序列在本文以SEQID NO:2022提供，其中氨基酸53是细胞外结构域的第一氨基酸。在示例性方面中，抗原结合蛋白以约1nM至约25nM，例如，约5nM至约20nM、或约5nM至约15nM的KD与食蟹猴(cyno)CD112R结合。在示例性方面中，抗原结合蛋白以约0.05nM至约0.15nM的KD与食蟹猴CD112R结合。任选地，对于人CD112R的抗原结合蛋白的KD为约0.01nM并且小于5nM，并且对于食蟹猴CD112R的抗原结合蛋白的KD为约0.05nM至约0.15nM。
在示例性情况下，对于人CD112R的抗原结合蛋白的KD在对于食蟹猴CD112R的抗原结合蛋白的KD的约100倍、约50倍、约25倍、约10倍、约5倍、或约2倍、或更低以内。在多个方面，对于表达人CD112R的人T细胞的CD112R抗原结合蛋白的EC50值在对于表达食蟹猴CD112R的食蟹猴PBMC的CD112R抗原结合蛋白的EC50值的约100倍、约50倍、约25倍、约10倍、约5倍、或约2倍、或更低以内。
在示例性实施例中，抗原结合蛋白(例如，抗体)表现出对其靶标(TIGIT或CD112R)的结合亲和力，该结合亲和力相对于TIGIT和CD155、TIGIT和CD112、或CD112R和CD112之间的天然相互作用的结合亲和力增加。结合亲和力的增加可以是相对于人TIGIT对其配体(CD155)的结合亲和力、或相对于人CD112R对其配体(CD112)的结合亲和力的至少或约5％增加、至少或约10％增加、至少或约15％增加、至少或约20％增加、至少或约25％增加、至少或约30％增加、至少或约35％增加、至少或约40％增加、至少或约45％增加、至少或约50％增加、至少或约55％增加、至少或约60％增加、至少或约65％增加、至少或约70％增加、至少或约75％增加、至少或约80％增加、至少或约85％增加、至少或约90％增加、至少或约95％增加。在示例性方面中，抗原结合蛋白表现出对其靶标(TIGIT或CD112R)的结合亲和力增加，该增加相对于人TIGIT对人CD155的结合亲和力或人CD112R对人CD112的结合亲和力为约2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、105倍、110倍、115倍、120倍、125倍、130倍、135倍、140倍、145倍、150倍、175倍、200倍、225倍、250倍、275倍、300倍、325倍、350倍、375倍、400倍、425倍、450倍、475倍、500倍、525倍、550倍、575倍、600倍、625倍、650倍、675倍、700倍、725倍、750倍、775倍、800倍、825倍、850倍、875倍、900倍、925倍、950倍、975倍、1000倍、或更多。
竞争测定
在各种实施例中，抗原结合蛋白(例如，抗体)抑制人TIGIT与参考抗体之间的结合相互作用，已知该参考抗体与TIGIT结合但其不是本披露的抗原结合蛋白。在不同的情况下，本披露的TIGIT结合蛋白与参考抗体竞争结合人TIGIT，从而减少与参考抗体结合的人TIGIT的量，这由体外竞争性结合测定确定。在多个方面，本披露的抗原结合蛋白抑制人TIGIT与参考抗体之间的结合相互作用，并且该抑制通过IC50表征。在多个方面，抗原结合蛋白表现出对于抑制人TIGIT与参考抗体之间的结合相互作用的小于约250nM的IC50。在多个方面，抗原结合蛋白表现出小于约200nM、小于约150nM、小于约100nM、小于约90nm、小于约80nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm、或小于约10nm的IC50。在多个方面，抗原结合蛋白表现出小于约9nM、小于约8nM、小于约7nM、小于约6nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于0.5nM或小于0.1nM的IC50。在不同的情况下，本披露的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人TIGIT，从而减少与参考抗体结合的人TIGIT的量，这由基于FACS的测定确定，其中在不存在或存在特定量的本披露的抗原结合蛋白下测量与参考抗体的Fc结合的跟荧光团缀合的第二抗体的荧光。在多个方面，用参考抗体、跟荧光团缀合的第二抗体和表达TIGIT的细胞进行基于FACS的测定。在多个方面，这些细胞经基因工程改造以过表达TIGIT。在一些方面中，这些细胞是用病毒载体转导的HEK293T细胞以表达TIGIT。在可替代的方面，这些细胞内源性表达TIGIT。在进行基于FACS的测定前，在一些方面中，内源性表达TIGIT的这些细胞被预先确定为低TIGIT表达的细胞或高TIGIT表达的细胞。
在示例性方面中，抗原结合蛋白(例如，抗体)抑制人TIGIT与其天然配体(例如，CD155、CD112)之间的结合相互作用。在不同的情况下，抗原结合蛋白(例如，抗体)抑制人TIGIT与CD155之间的结合相互作用，这由如本文实例5中所述的基于FACS的受体-配体竞争结合测定确定。在多个方面，在本披露的抗原结合蛋白(例如，抗体)的存在下，抑制了大于80％(例如，大于85％、大于90％)的人TIGIT与CD155之间的结合相互作用。任选地，在本披露的抗原结合蛋白(例如，抗体)的存在下，抑制了大于95％(例如，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或将近100％)的人TIGIT与CD155之间的结合相互作用，这由如本文实例5中所述的基于FACS的受体-配体竞争结合测定确定。
在各种实施例中，抗原结合蛋白(例如，抗体)抑制人CD112R与参考抗体之间的结合相互作用，已知该参考抗体与CD112R结合但其不是本披露的抗原结合蛋白。在不同的情况下，本披露的CD112R结合蛋白与参考抗体竞争结合人CD112R，从而减少与参考抗体结合的人CD112R的量，这由体外竞争性结合测定确定。在多个方面，本披露的抗原结合蛋白抑制人CD112R与参考抗体之间的结合相互作用，并且该抑制通过IC50表征。在多个方面，抗原结合蛋白表现出对于抑制人CD112R与参考抗体之间的结合相互作用的小于250nM的IC50。在多个方面，抗原结合蛋白表现出小于约200nM、小于约150nM、小于约100nM、小于约90nm、小于约80nm、小于约70nm、小于约60nm、小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm、或小于约10nm的IC50。在多个方面，抗原结合蛋白表现出小于约9nM、小于约8nM、小于约7nM、小于约6nM、小于约5nM、小于约4nM、小于约3nM、小于约2nM、小于约1nM、小于0.5nM或小于0.1nM的IC50。任选地，抗原结合蛋白表现出约0.05nM至约0.5nM(例如，约0.06nM、约0.07nM、约0.08nM、约0.09nM、约0.1nM、约0.2nM、约0.3nM、约0.4nM、约0.5nM)的IC50。在不同的情况下，本披露的抗原结合蛋白与参考抗体竞争结合人CD112R，从而减少与参考抗体结合的人CD112R的量，这由基于FACS的测定确定，其中在不存在或存在特定量的本披露的抗原结合蛋白下测量与参考抗体的Fc结合的荧光团缀合的第二抗体的荧光。在多个方面，用参考抗体、荧光团缀合的第二抗体和表达CD112R的细胞进行基于FACS的测定。在多个方面，这些细胞经基因工程改造以过表达CD112R。在一些方面中，这些细胞是用病毒载体转导的HEK293T细胞以表达CD112R。在可替代的方面，这些细胞内源性表达CD112R。在进行基于FACS的测定前，在一些方面中，内源性表达CD112R的这些细胞被预先确定为低CD112R表达的细胞或高CD112R表达的细胞。
在示例性方面中，抗原结合蛋白(例如，抗体)抑制人CD112R与其天然配体(例如，CD112)之间的结合相互作用。在不同的情况下，抗原结合蛋白(例如，抗体)抑制人CD112R与CD112之间的结合相互作用，这由如本文实例3中所述的基于FACS的受体-配体竞争结合测定确定。在多个方面，在本披露的抗原结合蛋白(例如，抗体)的存在下，抑制了大于90％的人CD112R与CD112之间的结合相互作用。任选地，在本披露的抗原结合蛋白(例如，抗体)的存在下，抑制了大于95％(例如，大于96％、大于97％、大于98％、大于99％或将近100％)的人CD112R与CD112之间的结合相互作用，这由如本文实例3中所述的基于FACS的受体-配体竞争结合测定确定。
测试抗体与另一个抗原结合蛋白竞争结合抗原或其表位的能力的其他结合测定(例如竞争性结合测定或竞争测定)为本领域已知的。参加，例如，Trikha等人,Int JCancer[国际癌症杂志]110:326-335(2004)；Tam等人,Circulation[循环]98(11):1085-1091(1998)；美国专利申请公开号US20140178905；Chand等人,Biologicals[生物制品]46:168-171(2017)；Liu等人,Anal Biochem[分析生物化学]525:89-91(2017)；Goolia等人,JVet Diagn Invest[兽医诊断调查杂志]29(2):250-253(2017)；Hunter和Cochran,MethodsEnzymol[酶学方法]250:21-44(2016)；Cox等人,Immunoassay Methods[免疫测定方法],Immunoassay Methods[免疫测定方法].2012年5月1日[2019年7月8日更新]。在：Sittampalam GS,Grossman A,Brimacombe K,等人,编辑.Assay Guidance Manual[试验指导手册][互联网].Bethesda(MD):Eli Lilly&Company[礼来公司]和the National Centerfor Advancing Translational Sciences[国家转化科学促进中心]；2004-。获得自：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；Clarke,William,“Immunoassays forTherapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology[用于治疗性药物监测和临床毒理学的免疫测定]”,Handbook of Analytical Separations[分析分离手册],第5卷,第95-112页(2004)，和Goolia等人,J Vet Diagn Invest[兽医诊断调查杂志]29(2):250-253(2017)。此外，比较两种抗体的其他方法是本领域已知的，并且包括例如表面等离子体共振(SPR)。可以将SPR用于测定抗体和第二抗体的结合常数，并且可以比较这两个结合常数。
抑制和拮抗
在不同的情况下，抗原结合蛋白(例如，抗体)与其靶标或抗原结合，并且抑制该靶标或抗原与其天然配体或结合配偶体之间的结合相互作用。在示例性方面中，本披露的TIGIT结合蛋白与TIGIT结合，从而抑制TIGIT与CD155之间的结合相互作用。可替代地或另外地，在示例性情况下，本披露的TIGIT结合蛋白抑制TIGIT与其他配体(例如，CD112)之间的结合相互作用。在示例性方面中，本披露的CD112R结合蛋白与CD112R结合，从而抑制CD112R与CD112之间的结合相互作用。可替代地或另外地，在示例性情况下，本披露的CD112R结合蛋白抑制CD112R与其他配体(例如，CD96、CD226、TIGIT)之间的结合相互作用。在多个方面，抗原结合蛋白(例如，抗体)是抑制靶标或抗原的生物活性的拮抗剂。在多个方面，CD112R结合蛋白与CD112R结合，并且抑制CD112与CD112R结合后激活的一条或多条信号转导路径。在多个方面，TIGIT结合蛋白与TIGIT结合，并且抑制CD155与TIGIT结合后激活的一条或多条信号转导路径。TIGIT结合蛋白与TIGIT结合、或CD112R结合蛋白与CD112R结合后，另外的一条或多条信号转导路径可能被抑制。
该抗原结合蛋白(例如，抗体)提供的降低或抑制可能不是100％或完全的抑制或消除或降低。相反，存在本领域普通技术人员认为具有潜在益处或治疗效果的不同程度的降低或抑制。在这方面，该抗原结合蛋白可抑制一种或多种TIGIT和/或CD112R蛋白质至任何量或水平。在示例性实施例中，该抗原结合蛋白提供的降低或抑制是至少或约10％降低或抑制(例如，至少或约20％降低或抑制、至少或约30％降低或抑制、至少或约40％降低或抑制、至少或约50％降低或抑制、至少或约60％降低或抑制、至少或约70％降低或抑制、至少或约80％降低或抑制、至少或约90％降低或抑制、至少或约95％降低或抑制、至少或约98％降低或抑制)。
在示例性情况下，本披露的抗原结合蛋白抑制CD112与CD112R或TIGIT与CD155的结合。在示例性方面中，该抑制可以半最大抑制浓度(IC50)表征，其是抗原结合蛋白在抑制特定生物或生物化学功能方面的有效性的量度。
用于测量本披露的抗原结合蛋白的抑制或拮抗剂活性的合适方法是本领域已知的。在示例性情况下，鉴于CD112R与CD112和/或TIGIT与CD155的同时结合以及T细胞的T细胞受体(TCR)的激活产生使TCR介导的应答失活或关闭的抑制性信号，可以通过测量TCR激活水平来测定抗原结合蛋白的拮抗剂或抑制活性，并且因此，在TCR连接后阻断CD112R与CD112和/或TIGIT与CD155之间的相互作用，导致TCR介导的活性，这些活性包括以下中的一种或多种：TCR亚基的磷酸化、Zap70向TCR的募集、LAT和/或SLP-76的磷酸化、从内质网(ER)的钙动员或钙释放、PLC-γ的激活、二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)的产生、蛋白激酶C的激活、MARPK/Erk信号传导、NF-κB激活、NFAT激活、IL-2启动子的激活、IL-2产生、IFN-γ产生、T细胞增殖等。参见，例如，Smith-Garvin等人,Annu Rev Immunol[免疫学年鉴]27:591-619(2009)。因此，例如，在不同的情况下，可以通过测量IL-2产生、IFN-γ产生和/或NF-κB和/或NFAT的激活来测定本披露的抗原结合蛋白的抑制或拮抗剂活性。在多个方面，使用Jurkat T细胞进行荧光素酶报道基因测定，其中，在TCR激活后并存在TIGIT结合蛋白和/或CD112R结合蛋白下，测量荧光素酶活性。在TIGIT结合蛋白和/或CD112R结合蛋白的存在下，预期荧光素酶活性高于在不存在TIGIT结合蛋白和/或CD112R结合蛋白下观察到的荧光素酶活性。本文实例中描述了Jurkat RGA(参见，例如，实例3和实例5)。在多个方面，可以通过受体-配体结合测定或Jurkat RGA来测量TIGIT结合蛋白和/或CD112R结合蛋白的拮抗剂活性。在多个方面，可以通过Jurkat RGA测量本披露的抗原结合蛋白的拮抗剂活性或抑制活性，并且该活性表示为EC50。在不同的情况下，CD112R抗原结合蛋白或TIGIT抗原结合蛋白的EC50在约0.01nM至约10nM、约0.01nM至约9nM、约0.01nM至约8nM、约0.01nM至约7nM、约0.01nM至约6nM、约0.01nM至约5nM、约0.01nM至约4nM、约0.01nM至约3nM、约0.01nM至约2nM、约0.01nM至约1nM、约0.01nM至约0.5nM、约0.01nM至约0.1nM、约0.01nM至约0.05nM、约0.05nM至约10nM、约0.1nM至约10nM、约0.5nM至约10nM、约1nM至约10nM、约2nM至约10nM、约3nM至约10nM、约4nM至约10nM、约5nM至约10nM、约6nM至约10nM、约7nM至约10nM、约8nM至约10nM、或约9nM至约10nM以内。任选地，如上文所述和/或如图7B或表2-5中所述，CD112R抗原结合蛋白在Jurkat RGA中显示出EC50。任选地，如上文所述和/或如表13-15中所述，TIGIT抗原结合蛋白在Jurkat RGA中显示出EC50。
在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白的IC50小于约10nM，任选地，小于5nM。在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白的IC50小于2nM或小于1nM。在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白的IC50为约0.5nM至约2nM。在不同的情况下，CD112R抗原结合蛋白的IC50在约0.01nM至约10nM、约0.01nM至约9nM、约0.01nM至约8nM、约0.01nM至约7nM、约0.01nM至约6nM、约0.01nM至约5nM、约0.01nM至约4nM、约0.01nM至约3nM、约0.01nM至约2nM、约0.01nM至约1nM、约0.01nM至约0.5nM、约0.01nM至约0.1nM、约0.01nM至约0.05nM、约0.05nM至约10nM、约0.1nM至约10nM、约0.5nM至约10nM、约1nM至约10nM、约2nM至约10nM、约3nM至约10nM、约4nM至约10nM、约5nM至约10nM、约6nM至约10nM、约7nM至约10nM、约8nM至约10nM、或约9nM至约10nM以内。在多个方面，CD112R抗原结合蛋白的IC50是CD112R抗原结合蛋白抑制CD112R与CD112之间的结合相互作用的有效性的量度，这由受体-配体结合测定确定。参见，例如，实例3。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白的IC50小于约10nM，任选地，小于5nM。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白的IC50小于2nM或小于1nM。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白的IC50为约0.5nM至约2nM。在不同的情况下，TIGIT抗原结合蛋白的IC50在约0.01nM至约10nM、约0.01nM至约9nM、约0.01nM至约8nM、约0.01nM至约7nM、约0.01nM至约6nM、约0.01nM至约5nM、约0.01nM至约4nM、约0.01nM至约3nM、约0.01nM至约2nM、约0.01nM至约1nM、约0.01nM至约0.5nM、约0.01nM至约0.1nM、约0.01nM至约0.05nM、约0.05nM至约10nM、约0.1nM至约10nM、约0.5nM至约10nM、约1nM至约10nM、约2nM至约10nM、约3nM至约10nM、约4nM至约10nM、约5nM至约10nM、约6nM至约10nM、约7nM至约10nM、约8nM至约10nM、或约9nM至约10nM以内。在多个方面，TIGIT抗原结合蛋白的IC50是TIGIT抗原结合蛋白抑制TIGIT与CD155或CD112之间的结合相互作用的有效性的量度，这由受体-配体结合测定确定。参见，例如，实例5。
抗原结合蛋白类型
本披露的抗原结合蛋白可以采取本领域中已知的抗原结合蛋白的许多形式中的任何一种。在示例性方面中，抗原结合蛋白为抗体或免疫球蛋白或其抗原结合抗体片段或抗体蛋白产物。
总而言之，抗体形成称为免疫球蛋白的血浆蛋白的家族，并且由免疫球蛋白结构域组成。(Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版，爱思唯尔科学有限公司(Elsevier ScienceLtd.)/加兰出版社(Garland Publishing),1999。如本文所用，术语“抗体”是指具有常规免疫球蛋白形式、包含重链及轻链且包含可变区及恒定区的蛋白质。例如，抗体可以是IgG，其是两对相同多肽链的“Y形”结构，每对具有一条“轻”链(典型地具有约25kDa的分子量)和一条“重”链(通常具有约50-70kDa的分子量)。抗体具有可变区和恒定区。在IgG形式中，可变区通常为约100-110或更多个氨基酸，包含三个互补决定区(CDR)，主要负责抗原识别，并且与结合不同抗原的其他抗体差异很大。恒定区允许抗体募集免疫系统的细胞和分子。可变区由每条轻链和重链的N末端区域构成，而恒定区由每条重链和轻链的C末端部分构成。(Janeway等人,“Structure of the Antibody Molecule and the ImmunoglobulinGenes”[抗体分子和免疫球蛋白基因的结构],Immunobiology:The Immune System inHealth and Disease[免疫生物学：健康与疾病的免疫系统],第4版.爱思唯尔科学有限公司(Elsevier Science Ltd.)/加兰出版社(Garland Publishing),(1999))。
本领域已经描述了抗体CDR的一般结构和特性。简而言之，在抗体支架中，CDR嵌埋于重链及轻链可变区中的框架内，其中，其构成主要负责抗原结合及识别的区域。可变区典型地包含至少三个重链CDR或轻链CDR(Kabat等人,1991,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[有免疫学意义的蛋白质序列],Public Health Service[公共卫生署]N.I.H.,Bethesda[贝塞斯达],Md.[马里兰州]；还参见Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]196:901-917；Chothia等人,1989,Nature[自然]342:877-883)，位于框架区内(由Kabat等人,1991指定框架区1-4、FR1、FR2、FR3和FR4；还参见Chothia和Lesk,1987,同上)。
抗体可以包含本领域已知的任何恒定区。人类轻链分类为κ轻链及λ轻链。重链分类为μ、δ、γ、α或ε，并且将抗体的同种型分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有若干个亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有亚类，包括但不限于IgM1和IgM2。本披露的实施例包括所有这种抗体类别或同种型。轻链恒定区可为例如κ型或λ型轻链恒定区，例如人类κ型或λ型轻链恒定区。重链恒定区可为例如α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区，例如人类α型、δ型、ε型、γ型或μ型重链恒定区。因此，在示例性实施例中，该抗体为同种型IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的抗体，包括IgG1、IgG2、IgG3或IgG4中的任一种。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。在一些实施例中，抗体包含与由哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马、鸡、仓鼠、人等)产生的天然存在的抗体基本上相似的序列。在这方面，抗体可以被认为是哺乳动物抗体，例如小鼠抗体、兔抗体、山羊抗体、马抗体、鸡抗体、仓鼠抗体、人抗体等。在某些方面，抗体是人抗体。在某些方面，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。术语“嵌合抗体”是指含有来自两种或更多种不同抗体的结构域的抗体。嵌合抗体可以例如含有来自一个物种的恒定结构域，和来自第二物种的可变结构域，或更一般地，可以含有来自至少两个物种的氨基酸序列的区段。嵌合抗体还可以含有同一物种内的两种或更多种不同抗体的结构域。术语“人源化”在关于抗体使用时是指至少具有来自经工程改造以具有比原始来源抗体更类似于真人类抗体的结构和免疫学功能的非人类来源CDR区的抗体。例如，人源化可涉及将来自非人类抗体(例如小鼠抗体)的CDR接枝到人类抗体中。人源化还可以涉及所选择的氨基酸取代以使非人序列更类似于人序列。
抗体可以通过酶(例如像木瓜蛋白酶和胃蛋白酶)切割成片段。木瓜蛋白酶切割抗体以产生两个Fab片段和单个Fc片段。胃蛋白酶使抗体裂解，以产生F(ab’)2片段和pFc’片段。在本披露的示例性方面中，本披露的抗原结合蛋白包含抗原结合抗体片段。如本文所用，术语“抗原结合抗体片段”是指能够结合抗体的抗原，并且也被称为“抗原结合片段”或“抗原结合部分”的抗体分子的一部分。在示例性情况下，抗原结合抗体片段为Fab片段或F(ab’)2片段。
抗体架构已经被用于产生越来越多的替代形式，其跨越至少约12–150kDa的分子量范围和具有从单体(n＝1)、二聚体(n＝2)和三聚体(n＝3)到四聚体(n＝4)并且可能更高的化合价(n)范围；此类替代形式在本文中称为“抗体蛋白质产物”。抗体蛋白产物包括基于完整抗体结构的那些和模拟保留完整抗原结合能力的抗体片段的那些，例如scFv、Fab和VHH/VH(以下讨论的)。保留其完整抗原结合位点的最小抗原结合抗体片段为Fv片段，其完全由可变(V)区组成。使用可溶性柔性氨基酸肽接头将V区连接至scFv片段(可变单链片段)以使该分子稳定，或将恒定(C)结构域添加至V区以产生Fab片段[抗原结合片段]。scFv和Fab片段可以容易地在宿主细胞中产生，例如原核宿主细胞。其他抗体蛋白产物包括经二硫键稳定的scFv(ds-scFv)、单链Fab(scFab)以及二聚及多聚抗体形式，如双功能抗体、三功能抗体和四功能抗体，或包含由与寡聚结构域连接的scFv组成的不同形式的迷你抗体(miniAb)。最小的片段是骆驼科重链Ab的VHH/VH以及单结构域Ab(sdAb)。最常用于建造新颖抗体形式的构件为单链可变(V)结构域抗体片段(scFv)，其包含由具有约15个氨基酸残基的肽接头连接的来自重链和轻链的V结构域(VH结构域和VL结构域)。肽体(peptibody)或肽-Fc融合体是另一种抗体蛋白产物。肽体的结构由接枝到Fc结构域上的生物活性肽组成。此项技术中已充分描述了肽抗体。参见，例如，Shimamoto等人.,mAbs 4(5):586-591(2012)。
其他抗体蛋白产物包括单链抗体(SCA)、双功能抗体、三功能抗体；四功能抗体；双特异性或三特异性抗体等。双特异性抗体可分成五个主要类别：BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白以及BsAb缀合物。参见，例如，Spiess等人,Molecular Immunology[分子免疫学]67(2)部分A:97-106(2015)。
在示例性方面中，本披露的抗原结合蛋白包含这些抗体蛋白产物中的任一个。在示例性方面中，本披露的抗原结合蛋白包含scFv、Fab VHH/VH、Fv片段、ds-scFv、scFab、二聚抗体、多聚抗体(例如双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体)、迷你抗体、骆驼科重链抗体的肽体VHH/VH、sdAb、双功能抗体；三功能抗体；四功能抗体；双特异性或三特异性抗体、BsIgG、附加IgG、BsAb片段、双特异性融合蛋白和BsAb结合物中的任一个。
在示例性情况下，本披露的抗原结合蛋白包含呈单体形式或聚合体、寡聚体或多聚体形式的抗体蛋白产物。在抗体包含两种或更多种不同抗原结合区片段的某些实施例中，抗体被视为双特异性的、三特异性的或多特异性的，或者二价的、三价的或多价的，这取决于由抗体识别和结合的不同表位的数目。在示例性方面中，本披露的抗原结合蛋白是包含两个scFv的双特异性抗体(bsAb)，这两个scFv中的一个与TIGIT结合，并且另一个与CD112R结合。在多个方面，与CD112R结合的scFv包含29E10、24F1或11E4的轻链可变区和重链可变区。在多个方面，与TIGIT结合的scFv包含43B7.002.015、66H9.009或58A7.002.008的轻链可变区和重链可变区。在示例性情况下，每个scFv与重链和/或轻链，任选地，IgG重链和/或IgG轻链连接。
抗原结合蛋白的结构
在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含(a)表A1中列出的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸(例如，1、2、3、4个氨基酸)或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)表A1中列出的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)表A1中列出的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)表A1中列出轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)表A1中列出的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)表A1中列出的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或(g)(a)-(f)中的任两个、三个、四个、五个或六个的组合。
表A1：CD112R抗原结合蛋白的CDR的SEQ ID NO:
Figure BDA0004122365630000261
/>
Figure BDA0004122365630000271
1E1也称为18C10。
在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含表A1中列出的LC CDR1氨基酸序列、LC CDR2氨基酸序列、和LC CDR3氨基酸序列以及表A1中列出的HC CDR氨基酸序列的至少1个或2个。在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白包含表A1中列出的HC CDR1氨基酸序列、HC CDR2氨基酸序列、和HC CDR3氨基酸序列以及表A1中列出的LC CDR氨基酸序列的至少1个或2个。在一些实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含所有三个此类CDR。在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含由A1的单行中的SEQ ID NO:表示的氨基酸序列中的3个、4个、5个或所有6个。在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含由表A1的单行的SEQ ID NO:表示的LC CDR氨基酸序列中的每个，和由表A1的同一单行或另一单行中的SEQ ID NO:表示的HC CDR氨基酸序列中的至少1个或2个。在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含由表A1的单行的SEQ ID NO:表示的HC CDR氨基酸序列中的每个，和由表A1的同一单行或另一单行中的SEQ ID NO:表示的LC CDR氨基酸序列中的至少1个或2个。在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含表A1的单行中列出的六个CDR氨基酸序列，或包含选自下组的六个CDR氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:13-18；(b)SEQID NO:23-28；(c)SEQ ID NO:33-38；(d)SEQ ID NO:43-48；(e)SEQ ID NO:53-58；(f)SEQID NO:63-68；(g)SEQ ID NO:73-78；(h)SEQ ID NO:83-88、(i)SEQ ID NO:93-98、(j)SEQID NO:103-108、(k)SEQ ID NO:233-238、(l)SEQ ID NO:1973-1978、(m)SEQ ID NO:1983-1988、(n)SEQ ID NO:1993-1998、和(o)SEQ ID NO:2003-2008。在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白包含如上所述的六个CDR氨基酸序列和重链恒定区，该重链恒定区包含SEQ IDNO:2019或SEQ ID NO:2020的氨基酸序列。
在示例性情况下，表A1的氨基酸序列由至少一个或多个(例如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)插入氨基酸(例如，框架残基)分开。在示例性情况下，在LC CDR1与LC CDR2的序列之间存在约10个至约20个氨基酸，且在LC CDR2与LC CDR3的序列之间存在约25个至约40个氨基酸。在示例性情况下，在LC CDR1与LC CDR2的序列之间存在约14个至约16个氨基酸，且在LC CDR2与LC CDR3的序列之间存在约30个至约35个氨基酸。在示例性情况下，在HC CDR1与HC CDR2的序列之间存在约10个至约20个氨基酸，且在HCCDR2与HC CDR3的序列之间存在约25个至约40个氨基酸。在示例性情况下，在HC CDR1与HCCDR2的序列之间存在约14个至约16个氨基酸，且在HC CDR2与HC CDR3的序列之间存在约30个至约35个氨基酸。在示例性方面中，该插入氨基酸包含框架区。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含(a)表A2中列出的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸(例如，1、2、3、4个氨基酸)或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)表A2中列出的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)表A2中列出的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)表A2中列出轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)表A2中列出的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)表A2中列出的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或(g)(a)-(f)中的任两个、三个、四个、五个或六个的组合。
表A2：TIGIT抗原结合蛋白的CDR的SEQ ID NO:
Figure BDA0004122365630000291
*58A7也称为48B7
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含表A2中列出的LC CDR1氨基酸序列、LC CDR2氨基酸序列、和LC CDR3氨基酸序列以及表A2中列出的HC CDR氨基酸序列的至少1个或2个。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白包含表A2中列出的HC CDR1氨基酸序列、HC CDR2氨基酸序列、和HC CDR3氨基酸序列以及表A2中列出的LCCDR氨基酸序列的至少1个或2个。在一些实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含所有三个此类CDR。在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含由A2的单行中的SEQ ID NO:表示的氨基酸序列中的3个、4个、5个或所有6个。在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含由表A2的单行的SEQ ID NO:表示的LC CDR氨基酸序列中的每个，和由表A2的同一单行或另一单行中的SEQ ID NO:表示的HC CDR氨基酸序列中的至少1个或2个。在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含由表A2的单行的SEQ ID NO:表示的HC CDR氨基酸序列中的每个，和由表A2的同一单行或另一单行中的SEQ ID NO:表示的LC CDR氨基酸序列中的至少1个或2个。在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含表A2的单行中列出的六个CDR氨基酸序列，或包含选自下组的六个CDR氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:113-118；(b)SEQ ID NO:123-128；(c)SEQ ID NO:133-138；(d)SEQ ID NO:143-148；(e)SEQ ID NO:153-158；(f)SEQID NO:163-168；(g)SEQ ID NO:173-178；(h)SEQ ID NO:183-188、(i)SEQ ID NO:193-198、(j)SEQ ID NO:203-208、(k)SEQ ID NO:213-218、(l)SEQ ID NO:223-228、和(m)SEQ IDNO:2013-2018。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白包含如上所述的六个CDR氨基酸序列和重链恒定区，该重链恒定区包含SEQ ID NO:2019或SEQ ID NO:2020的氨基酸序列。
在示例性情况下，表A2的氨基酸序列由至少一个或多个(例如至少2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个)插入氨基酸(例如，框架残基)分开。在示例性情况下，在LC CDR1与LC CDR2的序列之间存在约10个至约20个氨基酸，且在LC CDR2与LC CDR3的序列之间存在约25个至约40个氨基酸。在示例性情况下，在LC CDR1与LC CDR2的序列之间存在约14个至约16个氨基酸，且在LC CDR2与LC CDR3的序列之间存在约30个至约35个氨基酸。在示例性情况下，在HC CDR1与HC CDR2的序列之间存在约10个至约20个氨基酸，且在HCCDR2与HC CDR3的序列之间存在约25个至约40个氨基酸。在示例性情况下，在HC CDR1与HCCDR2的序列之间存在约14个至约16个氨基酸，且在HC CDR2与HC CDR3的序列之间存在约30个至约35个氨基酸。在示例性方面中，该插入氨基酸包含框架区。
在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含表B1的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)SEQ ID NO:11-12；(b)SEQ ID NO:21-22；(c)SEQ ID NO:31-32；(d)SEQ ID NO:41-42；(e)SEQ ID NO:51-52；(f)SEQ ID NO:61-62；(g)SEQ ID NO:71-72；(h)SEQ ID NO:81-82、(i)SEQ ID NO:91-92、(j)SEQ ID NO:101-102、(k)SEQ ID NO:231-232、(l)SEQ ID NO:1971-1972、(m)SEQ ID NO:1981-1982、(n)SEQ ID NO:1991-1992、或(o)SEQ ID NO:2001-2002。在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白包含如上所述的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列和重链恒定区，该重链恒定区包含SEQ ID NO:2019或SEQ ID NO:2020的氨基酸序列。在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含表B1的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)SEQ ID NO:9-10；(b)SEQ ID NO:19-20；(c)SEQ ID NO:29-30；(d)SEQ ID NO:39-40；(e)SEQ ID NO:49-50；(f)SEQ ID NO:59-60；(g)SEQ ID NO:69-70；(h)SEQ ID NO:79-80、(i)SEQ ID NO:89-90、(j)SEQ ID NO:99-100、(k)SEQ ID NO:229-230、(l)SEQ ID NO:1969-1970、(m)SEQ ID NO:1979-1980、(n)SEQID NO:1989-1990、或(o)SEQ ID NO:1999-2000。
表B1：CD112R抗原结合蛋白的可变区和全长(FL)序列的SEQ ID NO:
Figure BDA0004122365630000321
在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含表B2的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)SEQ ID NO:111-112、(b)SEQ ID NO:121-122、(c)SEQ ID NO:131-132、(d)SEQ ID NO:141-142、(e)SEQ ID NO:151-152、(f)SEQ ID NO:161-162、(g)SEQ ID NO:171-172、(h)SEQ IDNO:181-182、(i)SEQ ID NO:191-192、(j)SEQ ID NO:201-202、(k)SEQ ID NO:211-212、(l)SEQ ID NO:221-222、或(m)SEQ ID NO:2011-2012。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白包含如上所述的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列和重链恒定区，该重链恒定区包含SEQID NO:2019或SEQ ID NO:2020的氨基酸序列。在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含表B2的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)SEQ ID NO:109-110、(b)SEQ ID NO:119-120、(c)SEQ ID NO:129-130、(d)SEQ ID NO:139-140、(e)SEQ ID NO:149-150、(f)SEQ ID NO:159-160、(g)SEQ ID NO:169-170、(h)SEQID NO:179-180、(i)SEQ ID NO:189-190、(j)SEQ ID NO:199-200、(k)SEQ ID NO:209-210、(l)SEQ ID NO:219-220、或(m)SEQ ID NO:2009-2010。
表B2：TIGIT抗原结合蛋白的可变区和全长(FL)序列的SEQ ID NO:
Figure BDA0004122365630000331
在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白或TIGIT抗原结合蛋白包含与以上提及的氨基酸序列类似的氨基酸序列，而抗原结合蛋白基本上保留其生物功能，例如其结合其靶标或抗原(例如人TIGIT、人CD112R)或减少、阻断、抑制、消除或干扰由TIGIT与其结合配偶体、CD155的相互作用，或由CD112R与其结合配偶体、CD112的相互作用所引起的信号转导的能力。
在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含相对于具有表A1或表B1中引用的氨基酸序列的亲本氨基酸序列仅差异1个、2个、3个、4个、5个、6个、或更多个氨基酸的氨基酸序列。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白包含相对于具有表A2或表B2中引用的氨基酸序列的亲本氨基酸序列仅差异1个、2个、3个、4个、5个、6个、或更多个氨基酸的氨基酸序列。在示例性方面中，抗原结合蛋白(例如，CD112R抗原结合蛋白或TIGIT抗原结合蛋白)包含亲本序列的变体序列，该变体序列相对于该亲本序列仅差异一个或两个氨基酸。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含一个或多个出现在CDR外的氨基酸取代，例如该一个或多个氨基酸取代出现在重链或轻链的框架区内。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含一个或多个氨基酸取代，而该抗原结合蛋白保留六个CDR的氨基酸序列。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含相对于一个或多个亲本序列仅具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个保守氨基酸取代的氨基酸序列。如本文所用，术语“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸经具有类似性质，例如尺寸、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性的另一个氨基酸取代，且包括在以下五组中的一个内的交换：
I.小的脂肪族、非极性或微极性残基：Ala、Ser、Thr、Pro、Gly；
II.极性、带负电残基及其酰胺和酯：Asp、Asn、Glu、Gln、磺基丙氨酸和高磺基丙氨酸；
III.极性带正电残基：His、Arg、Lys；鸟氨酸(Orn)
IV.大的脂肪族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val、Cys、正亮氨酸(Nle)、高半胱氨酸；
V.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp、乙酰基苯丙氨酸。
在示例性实施例中，抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含相对于亲本序列包含至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，且这些一个或多个氨基酸取代为一个或多个非保守氨基酸取代。如本文所用，术语“非保守氨基酸取代”在本文中定义为一个氨基酸经具有不同性质，例如尺寸、电荷、疏水性、亲水性和/或芳香性的另一个氨基酸取代，且包括在以上五组外的交换。
在示例性方面中，抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含相对于亲本序列包含至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，且取代氨基酸为天然存在的氨基酸。“天然存在的氨基酸”或“标准氨基酸”或“典型氨基酸”意指在真核生物中发现的直接由通用遗传密码的密码子编码的20种α氨基酸(Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、Trp、Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、Glu)中的一个。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含相对于亲本序列包含至少一个氨基酸取代的氨基酸序列，且取代氨基酸为非标准氨基酸或在翻译期间未并入蛋白质中的氨基酸。非标准氨基酸包括(但不限于)：硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸、鸟氨酸、正亮氨酸、β-氨基酸(例如β-丙氨酸、β-氨基异丁酸、β-苯丙氨酸、β-高苯丙氨酸、β-谷氨酸、β-谷氨酰胺、β-高色氨酸、β-亮氨酸、β-赖氨酸)、高氨基酸(例如高苯丙氨酸、高丝氨酸、高精氨酸、单半胱氨酸、高胱氨酸)、N-甲基氨基酸(例如L-红豆碱、N-甲基-丙氨酸、N-甲基-异亮氨酸、N-甲基-亮氨酸)、2-氨基辛酸、7-氨基头孢霉烷酸、4-氨基肉桂酸、α-氨基环己烷丙酸、氨基-(4-羟苯基)乙酸、4-氨基-烟酸、3-氨基苯乙酸等。
在示例性方面中，抗原结合蛋白包含与一个或多个亲本氨基酸序列具有大于或约30％、大于或约50％、或大于或约70％序列同一性的氨基酸序列。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含与亲本氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含沿亲本氨基酸序列全长具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含沿亲本氨基酸序列全长具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在多个方面，CD112R抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含表B1中列出的HC可变区氨基酸序列的变体序列或LC可变区氨基酸序列的变体序列，该变体序列与表B1的序列仅差异1至12个(例如，1至11个、1至10个、1至9个、1至8个、1至7个、1至6个、1至5个、1至4个、1至3个、1个或2个)氨基酸，或具有至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性)。在多个方面，CD112R抗原结合蛋白包含表B1中列出的FL HC氨基酸序列的变体序列或FL LC氨基酸序列的变体序列，该变体序列与表B1的序列仅差异1至46个氨基酸，或具有至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性)。在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含表C1的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)SEQ ID NO:241和242中每个的前100个氨基酸；(b)SEQ ID NO:247和248中每个的前100个氨基酸；(c)SEQ ID NO:249和250中每个的前100个氨基酸；(d)SEQ ID NO:251和252中每个的前100个氨基酸；或(e)SEQ IDNO:263和264中每个的前100个氨基酸。在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白包含SEQ IDNO:242、SEQ ID NO:248、SEQ ID NIO:250、SEQ ID NO:252、或SEQ ID NO:264的前105个、前106个、前107个、前108个、前109个、前110个、前111个、前112个、前113个、前114个、或前115个氨基酸，和/或SEQ ID NO:241、SEQ ID NO:247、SEQ ID NIO:249、SEQ ID NO:251、或SEQID NO:263的前115个、前116个、前117个、前118个、前119个、前120个、前121个、前122个、前123个、前124个、前125个、前126个、或前127个氨基酸。在示例性实施例中，CD112R抗原结合蛋白包含表C1的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)SEQ ID NO:241-242；(b)SEQ ID NO:247-248；(c)SEQ ID NO:249-250；(d)SEQ ID NO:251-252；或(e)SEQ ID NO:263-264。在多个方面，CD112R抗原结合蛋白包含具有表C1的“工程化*”列中列出的奇数编号SEQ ID NO.的FL LC氨基酸序列，和具有比FL LCSEQ ID NO.大一的SEQ ID NO.的FL HC氨基酸序列。在多个方面，CD112R抗原结合蛋白包含表C1的SEQ ID NO中任一个的序列的至少一部分，其中该部分包含氨基酸序列的前100个氨基酸、氨基酸序列的前105个氨基酸、氨基酸序列的前110个氨基酸、氨基酸序列的前115个氨基酸、或氨基酸序列的前120个氨基酸。在不同的情况下，CD112R抗原结合蛋白包含表C1的氨基酸序列的CDR的至少2个、3个、4个、5个、或6个。可以通过本领域已知的任何一种或多种方法确定给定的抗体HC或LC的CDR。参见，例如，Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列],美国卫生与公共服务部(U.S.Dept.of Health and Human Services),NIH(1991)；Chothia等人,J Mol Biol[分子生物学杂志]196:901-917(1987)；Al-Lazikani等人,J Mol Biol[分子生物学杂志]273:927-948(1997)；Abhinandan等人,Mol Immunol[分子免疫学]45:3832-3839(2008)；Lefranc等人,The Immunologist[免疫学家]7:132-136(1999)；Lefranc等人,Dev CompImmunol[发育与比较免疫学]27:55-77(2003)；以及Honegger等人,J Mol Biol[分子生物学杂志]309:657-670(2001)。
表C1：CD112R抗原结合蛋白及其工程化版本的共有FL HC和LC的SEQ ID NO:
Figure BDA0004122365630000371
Figure BDA0004122365630000381
*工程化FL LC为奇数，并且FL HC为偶数。
在多个方面，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含表B2中列出的HC可变区氨基酸序列的变体序列或LC可变区氨基酸序列的变体序列，该变体序列与表B2的序列仅差异1至12个氨基酸，或具有至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性)。在多个方面，TIGIT抗原结合蛋白包含表B2中列出的FL HC氨基酸序列的变体序列或FL LC氨基酸序列的变体序列，该变体序列与表B2的序列仅差异1至46个氨基酸，或具有至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性)。在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含表C2的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)(a)SEQ ID NO:239和240中每个的前100个氨基酸；(b)SEQ ID NO:243和244中每个的前100个氨基酸；(c)SEQ ID NO:245和246中每个的前100个氨基酸；(d)SEQ ID NO:253和254中每个的前100个氨基酸；(e)SEQ ID NO:255和256中每个的前100个氨基酸；(f)SEQ ID NO:257和258中每个的前100个氨基酸、(g)SEQ IDNO:259和260中每个的前100个氨基酸、或(h)SEQ ID NO:261和262中每个的前100个氨基酸。在示例性方面中，CD112R抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:240、SEQ ID NO:244、SEQ IDNIO:246、SEQ ID NO:254、SEQ ID NO:256、SEQ ID NO:258、SEQ ID NO:260、或SEQ ID NO:262的前105个、前106个、前107个、前108个、前109个、前110个、前111个、前112个、前113个、前114个、或前115个氨基酸，和/或SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:243、SEQ ID NIO:245、SEQID NO:253、SEQ ID NO:255、SEQ ID NO:257、SEQ ID NO:259、或SEQ ID NO:261的前115个、前116个、前117个、前118个、前119个、前120个、前121个、前122个、前123个、前124个、前125个、前126个、或前127个氨基酸。在示例性实施例中，TIGIT抗原结合蛋白包含表C2的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含以下氨基酸序列对之一：(a)SEQ IDNO:239-240；(b)SEQ ID NO:243-244；(c)SEQ ID NO:245-246；(d)SEQ ID NO:253-254；(e)SEQ ID NO:255-256；(f)SEQ ID NO:257-258、(g)SEQ ID NO:259-260、或(h)SEQ ID NO:261-262。在多个方面，TIGIT抗原结合蛋白包含具有表C2的“工程化*”列中列出的奇数编号SEQ ID NO.的FL LC氨基酸序列，和具有比FL LC SEQ ID NO.大一的SEQ ID NO.的FL HC氨基酸序列。在多个方面，TIGIT抗原结合蛋白包含表C2的SEQ ID NO中任一个的序列的至少一部分，其中该部分包含氨基酸序列的前100个氨基酸、氨基酸序列的前105个氨基酸、氨基酸序列的前110个氨基酸、氨基酸序列的前115个氨基酸、或氨基酸序列的前120个氨基酸。在不同的情况下，TIGIT抗原结合蛋白包含表C2的氨基酸序列的CDR的至少2个、3个、4个、5个、或6个。可以通过本领域已知的任何一种或多种方法确定给定的抗体HC或LC的CDR。
表C2：TIGIT抗原结合蛋白及其工程化版本的共有FL HC和FL LC的SEQ ID NO:
Figure BDA0004122365630000391
/>
Figure BDA0004122365630000401
*工程化FL LC为奇数，并且FL HC为偶数。
在多个方面，CD112R抗原结合蛋白(例如，抗体或其抗原结合片段)包含抗体、抗体的抗原结合片段(例如，Fab)、或抗体蛋白产物(例如，scFv)。在多个方面，CD112R抗原结合蛋白是二价的，其包含两个抗原结合位点。在多个方面，TIGIT抗原结合蛋白包含抗体、抗体的抗原结合片段(例如，Fab)、或抗体蛋白产物(例如，scFv)。在多个方面，TIGIT抗原结合蛋白是二价的，其包含两个抗原结合位点。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:192或SEQ ID NO:222或与SEQ ID NO:240的前105-115个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的LC可变区氨基酸序列，并且该LC可变区氨基酸序列包含位置1处的谷氨酸(Glu1)或其保守氨基酸取代、位置27处的谷氨酰胺(Gln27)或其保守氨基酸取代、位置28处的丝氨酸(Ser28)或其保守氨基酸取代、位置91处的丝氨酸(Ser91)或其保守氨基酸取代、位置92处的丝氨酸(Ser92)或其保守氨基酸取代、位置93处的丝氨酸(Ser93)或其保守氨基酸取代、位置94处的亮氨酸(Leu94)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Ser28或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Glu1或其保守氨基酸取代的LC CDR2氨基酸序列。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser91或其保守氨基酸取代、Ser92或其保守氨基酸取代、Ser93或其保守氨基酸取代、Leu94或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Gln27或其保守氨基酸取代的LC可变区氨基酸序列，该保守氨基酸取代与TIGIT的氨基酸形成氢键。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:191或SEQ ID NO:221或与SEQ ID NO:239的前115-127个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的HC可变区氨基酸序列，并且包含位置32处的缬氨酸(Val32)或其保守氨基酸取代、位置33处的酪氨酸(Tyr33)或其保守氨基酸取代、位置52处的酪氨酸(Tyr52)或其保守氨基酸取代、位置54处的酪氨酸(Tyr54)或其保守氨基酸取代、位置55处的酪氨酸(Tyr55)或其保守氨基酸取代、位置56处的丝氨酸(Ser56)或其保守氨基酸取代、位置57处的甘氨酸(Gly57)或其保守氨基酸取代、位置58处的甘氨酸(Gly58)或其保守氨基酸取代、位置59处的苏氨酸(Thr59)或其保守氨基酸取代、位置60处的酪氨酸(Tyr60)或其保守氨基酸取代、位置63处的脯氨酸(Pro63)或其保守氨基酸取代、位置66处的精氨酸(Arg66)或其保守氨基酸取代、位置102处的异亮氨酸(Ile102)或其保守氨基酸取代、位置104处的丙氨酸(Ala104)或其保守氨基酸取代、位置107处的甘氨酸(Gly107)或其保守氨基酸取代、位置108处的酪氨酸(Tyr108)或其保守氨基酸取代、位置109处的苯丙氨酸(Phe109)或其保守氨基酸取代、位置110处的酪氨酸(Tyr110)或其保守氨基酸取代、位置111处的酪氨酸(Tyr111)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Val32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Gly57或其保守氨基酸取代、Gly58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Arg66或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Ile102或其保守氨基酸取代、Ala104或其保守氨基酸取代、Gly107或其保守氨基酸取代、Tyr108或其保守氨基酸取代、Phe109或其保守氨基酸取代、Tyr110或其保守氨基酸取代、Tyr111或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在多个方面，Tyr52、Ser56、Thr59、Phe109、Tyr55、Tyr60或其保守氨基酸取代中的每一个与TIGIT的氨基酸形成氢键。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基中的每一个与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Arg66或其保守氨基酸取代的HC可变区氨基酸序列，该Arg66或其保守氨基酸取代与TIGIT的氨基酸形成盐桥。在多个方面，Tyr52和Thr59与TIGIT的相同氨基酸形成氢键。在不同的情况下，Ser56与TIGIT的两个不同氨基酸形成氢键。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:122或212或2012或与SEQ ID NO:246的前105-115个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的LC可变区氨基酸序列，并且包含位置1处的谷氨酸(Glu1)或其保守氨基酸取代、位置2处的异亮氨酸(Ile2)或其保守氨基酸取代、位置27处的谷氨酰胺(Gln27)或其保守氨基酸取代、位置28处的丝氨酸(Ser28)或其保守氨基酸取代、位置29处的缬氨酸(Val29)或其保守氨基酸取代、位置30处的丝氨酸(Ser30)或其保守氨基酸取代、位置31处的丝氨酸(Ser31)或其保守氨基酸取代、位置32处的苏氨酸(Thr32)或其保守氨基酸取代、位置33处的酪氨酸(Tyr33)或其保守氨基酸取代、位置68处的丝氨酸(Ser68)或其保守氨基酸取代、位置69处的甘氨酸(Gly69)或其保守氨基酸取代、位置92处的酪氨酸(Tyr92)或其保守氨基酸取代、位置93处的天冬氨酸盐(Asp93)或其保守氨基酸取代、位置94处的缬氨酸(Val94)或其保守氨基酸取代、位置95处的丝氨酸(Ser95)或其保守氨基酸取代、位置96处的脯氨酸(Pro96)或其保守氨基酸取代、位置97处的色氨酸(Trp97)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Ser28或其保守氨基酸取代、Val29或其保守氨基酸取代、Ser30或其保守氨基酸取代、Ser31或其保守氨基酸取代、Thr32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR2氨基酸序列，该LC CDR2氨基酸序列包含Glu1或其保守氨基酸取代、Ile2或其保守氨基酸取代、Ser68或其保守氨基酸取代、Gly69或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Tyr92或其保守氨基酸取代、Asp93或其保守氨基酸取代、Val94或其保守氨基酸取代、Ser95或其保守氨基酸取代、Pro96或其保守氨基酸取代、Trp97或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC可变区氨基酸序列，该LC可变区氨基酸序列包含Asp93或其保守氨基酸取代、Ser95或其保守氨基酸取代、Try33或其保守氨基酸取代，这些保守氨基酸取代中的每一个与TIGIT的氨基酸形成氢键。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Asp93或其保守氨基酸取代的LC可变区氨基酸序列，该Asp93或其保守氨基酸取代与TIGIT的氨基酸形成盐桥。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:121或211或与SEQ ID NO:245的前115-127个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的HC可变区氨基酸序列，和位置32处的甘氨酸(Gly32)或其保守氨基酸取代、位置35处的酪氨酸(Tyr35)或其保守氨基酸取代、位置52处的酪氨酸(Tyr52)或其保守氨基酸取代、位置54处的酪氨酸(Tyr54)或其保守氨基酸取代、位置55处的酪氨酸(Tyr55)或其保守氨基酸取代、位置56处的丝氨酸(Ser56)或其保守氨基酸取代、位置58处的丝氨酸(Ser58)或其保守氨基酸取代、位置59处的苏氨酸(Thr59)或其保守氨基酸取代、位置60处的苯丙氨酸(Phe60)或其保守氨基酸取代、位置63处的脯氨酸(Pro63)或其保守氨基酸取代、位置66处的赖氨酸(Lys66)或其保守氨基酸取代、位置102处的精氨酸(Arg102)或其保守氨基酸取代、位置104处的天冬酰胺(Asn104)或其保守氨基酸取代、位置105处的色氨酸(Trp105)或其保守氨基酸取代、位置106处的天冬酰胺(Asn106)或其保守氨基酸取代、位置107处的酪氨酸(Tyr107)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Gly32或其保守氨基酸取代、Tyr35或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Ser58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Phe60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Lys66或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Arg102或其保守氨基酸取代、Asn104或其保守氨基酸取代、Trp105或其保守氨基酸取代、Asn106或其保守氨基酸取代、Tyr107或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在多个方面，Ser58、Asn106、Tyr107、Tyr35、Arg102和Ser56或其保守氨基酸取代中的每一个与TIGIT的氨基酸形成氢键。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基中的每一个与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:162或SEQ ID NO:262的前105-115个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的LC可变区氨基酸序列，并且包含位置30处的精氨酸(Arg30)或其保守氨基酸取代、位置31处的精氨酸(Arg31)或其保守氨基酸取代、位置32处的酪氨酸(Tyr32)或其保守氨基酸取代、位置91处的丝氨酸(Ser91)或其保守氨基酸取代、位置92处的酪氨酸(Tyr92)或其保守氨基酸取代、位置93处的丝氨酸(Ser93)或其保守氨基酸取代、位置94处的苏氨酸(Thr94)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Arg30或其保守氨基酸取代、Arg31或其保守氨基酸取代、Tyr32或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser91或其保守氨基酸取代、Tyr92或其保守氨基酸取代、Ser93或其保守氨基酸取代、Thr94或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Tyr32、Tyr92、Thr94、Arg30、Arg31或其保守氨基酸取代的LC可变区氨基酸序列，这些Tyr32、Tyr92、Thr94、Arg30、Arg31或其保守氨基酸取代中的每一个与TIGIT的氨基酸形成氢键。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Arg30或其保守氨基酸取代的LC可变区氨基酸序列，该Arg30或其保守氨基酸取代与TIGIT的氨基酸形成盐桥。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:161或与SEQ ID NO:261的前115-127个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的HC可变区氨基酸序列，和位置30处的苏氨酸(Thr30)或其保守氨基酸取代、位置31处的甘氨酸(Gly31)或其保守氨基酸取代、位置32处的酪氨酸(Tyr32)或其保守氨基酸取代、位置33处的酪氨酸(Tyr33)或其保守氨基酸取代、位置47处的色氨酸(Trp47)或其保守氨基酸取代、位置50处的色氨酸(Trp50)或其保守氨基酸取代、位置52处的丝氨酸(Ser52)或其保守氨基酸取代、位置54处的苏氨酸(Thr54)或其保守氨基酸取代、位置55处的丝氨酸(Ser55)或其保守氨基酸取代、位置57处的丙氨酸(Ala57)或其保守氨基酸取代、位置58处的苏氨酸(Thr58)或其保守氨基酸取代、位置59处的甘氨酸(Gly59)或其保守氨基酸取代、位置60处的酪氨酸(Tyr60)或其保守氨基酸取代、位置65处的谷氨酰胺(Gln65)或其保守氨基酸取代、位置101处的天冬酰胺(Asn101)或其保守氨基酸取代、位置102处的丝氨酸(Ser102)或其保守氨基酸取代、位置103处的缬氨酸(Val103)或其保守氨基酸取代、位置104(Leu104)处的亮氨酸或其保守氨基酸取代、位置105处的酪氨酸(Tyr105)或其保守氨基酸取代、位置106处的酪氨酸(Tyr106)或其保守氨基酸取代、位置107处的酪氨酸(Tyr107)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HCCDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Thr30或其保守氨基酸取代、Gly31或其保守氨基酸取代、Tyr32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Trp47或其保守氨基酸取代、Trp50或其保守氨基酸取代、Ser52或其保守氨基酸取代、Thr54或其保守氨基酸取代、Ser55或其保守氨基酸取代、Ala57或其保守氨基酸取代、Thr58或其保守氨基酸取代、Gly59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Gln65或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Asn101或其保守氨基酸取代、Ser102或其保守氨基酸取代、Val103或其保守氨基酸取代、Leu104或其保守氨基酸取代、Tyr105或其保守氨基酸取代、Tyr106或其保守氨基酸取代、Tyr107或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在多个方面，Leu104、Tyr33、Asn101、Tyr107、Tyr60、Ser55、Ser52或其保守氨基酸取代中的每一个与TIGIT的氨基酸形成氢键。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基中的每一个与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:132或与SEQ ID NO:254的前105-115个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的LC可变区氨基酸序列，并且包含位置27处的谷氨酰胺(Gln27)或其保守氨基酸取代、位置30处的亮氨酸(Leu30)或其保守氨基酸取代、位置32处的丝氨酸(Ser32)或其保守氨基酸取代、位置96处的丝氨酸(Ser96)或其保守氨基酸取代、位置97处的异亮氨酸(Ile97)或其保守氨基酸取代、位置98处的谷氨酰胺(Gln98)或其保守氨基酸取代、位置99处的亮氨酸(Leu99)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Leu30或其保守氨基酸取代、Ser32或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser96或其保守氨基酸取代、Ile97或其保守氨基酸取代、Gln98或其保守氨基酸取代、Leu99或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Ser32或其保守氨基酸取代、和/或Gln98或其保守氨基酸取代的LC可变区氨基酸序列，这些Ser32或其保守氨基酸取代、和/或Gln98或其保守氨基酸取代中的每一个与TIGIT的氨基酸形成氢键。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。
在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含与SEQ ID NO:131或与SEQ ID NO:253的前115-127个氨基酸高度类似(例如，至少或约70％序列同一性(例如，至少或约80％序列同一性、至少或约90％序列同一性、至少或约95％序列同一性))的HC可变区氨基酸序列，和位置33处的天冬氨酸盐(Asp33)或其保守氨基酸取代、位置52处的酪氨酸(Tyr52)或其保守氨基酸取代、位置54处的酪氨酸(Tyr54)或其保守氨基酸取代、位置55处的酪氨酸(Tyr55)或其保守氨基酸取代、位置56处的丝氨酸(Ser56)或其保守氨基酸取代、位置57处的甘氨酸(Gly57)或其保守氨基酸取代、位置58处的甘氨酸(Gly58)或其保守氨基酸取代、位置59处的苏氨酸(Thr59)或其保守氨基酸取代、位置60处的酪氨酸(Tyr60)或其保守氨基酸取代、位置63处的脯氨酸(Pro63)或其保守氨基酸取代、位置66处的赖氨酸(Lys66)或其保守氨基酸取代、位置102处的异亮氨酸(Ile102)或其保守氨基酸取代、位置104处的丙氨酸(Ala104)或其保守氨基酸取代、位置107处的甘氨酸(Gly107)或其保守氨基酸取代、位置108处的酪氨酸(Tyr108)或其保守氨基酸取代、位置109处的苯丙氨酸(Phe109)或其保守氨基酸取代、位置110处的酪氨酸(Tyr110)或其保守氨基酸取代、位置111处的苯丙氨酸(Phe111)或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含含有Asp33或其保守氨基酸取代的HC CDR1氨基酸序列。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Gly57或其保守氨基酸取代、Gly58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Lys66或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在示例性方面中，TIGIT抗原结合蛋白(例如，抗TIGIT抗体)包含HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Ile102或其保守氨基酸取代、Ala104或其保守氨基酸取代、Gly107或其保守氨基酸取代、Tyr108或其保守氨基酸取代、Phe109或其保守氨基酸取代、Tyr110或其保守氨基酸取代、Phe111或其保守氨基酸取代、或其任何组合。在多个方面，Tyr52、Ser56、Thr59、Tyr60、Phe109、Tyr54、Tyr55、Lys66或其保守氨基酸取代中的每一个与TIGIT的氨基酸形成氢键。在多个方面，当TIGIT抗原结合蛋白(例如，TIGIT抗体)与TIGIT结合时，上述命名的氨基酸残基中的每一个与TIGIT的氨基酸相距约3埃至约4埃。
在示例性方面中，抗原结合蛋白包含含有一组如本文所述的电荷对突变的重链氨基酸序列。在特定方面中，该重链氨基酸序列包含选自V1、V103、和V131电荷对突变的电荷对突变。
在其他示例性方面中，抗原结合蛋白相对于天然存在的对应物包含一个或多个氨基酸修饰，从而改善半衰期/稳定性或使抗体更适合于表达/制造。在示例性情况下，抗原结合蛋白经设计以预防或减少Fc与Fc受体之间的相互作用。在示例性情况下，抗原结合蛋白为包含缺乏与Fcγ受体相互作用的能力的恒定区的稳定无效应子功能(SEFL)抗体。SEFL抗体为本领域中已知。参见例如Liu等人,J Biol Chem[生物化学杂志]292:1876-1883(2016)；和Jacobsen等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]292:1865-1875(2017)。在示例性方面中，SEFL抗体包含以下突变中的一种或多种，根据EU系统编号：L242C、A287C、R292C、N297G、V302C、L306C和/或K334C。在示例性方面中，SEFL抗体包含N297G。在示例性方面中，SEFL抗体包含A287C、N297G和L306C。在其他示例性方面中，SEFL抗体包含R292C、N297G和V302C(即SEFL2-2)。在多个方面，抗原结合蛋白包含含有SEQ ID NO:2019，任选地SEQ IDNO:2020的氨基酸序列的重链。
在多个方面，抗原结合蛋白是包含由VH1、VH3、或VH4家族基因区段的V基因区段编码的HC可变区的抗体。在多个方面，抗原结合蛋白是包含由D1、D3、D5、D6或D7家族基因区段的D基因区段编码的HC可变区的抗体。在多个方面，抗原结合蛋白是包含由JH4或JH6家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。任选地，抗原结合蛋白是包含由VH3家族基因区段的V基因区段和D1、D3、或D6家族基因区段的D基因区段、和/或JH4或JH6家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。在不同的情况下，抗原结合蛋白是包含由VH3家族基因区段的V基因区段、D1家族基因的D基因区段、和JH6家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。在不同的情况下，抗原结合蛋白是包含由VH3家族基因区段的V基因区段、D3家族基因的D基因区段、和JH6家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。在不同的情况下，抗原结合蛋白是包含由VH3家族基因区段的V基因区段、D6家族基因的D基因区段、和JH6家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。在不同的情况下，抗原结合蛋白是包含由VH1家族基因区段的V基因区段、D5家族基因的D基因区段、和JH6家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。在不同的情况下，抗原结合蛋白是包含由VH4家族基因区段的V基因区段、D7家族基因的D基因区段、和JH6家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。在不同的情况下，抗原结合蛋白是包含由VH3家族基因区段的V基因区段、D1家族基因的D基因区段、和JH4家族基因区段的J基因区段编码的HC可变区的抗体。
多肽
本文提供了多肽，这些多肽包含以下，基本上由以下组成，或由以下组成：表A1、或表A2、或表B1、或表B2、或表C1、或表C2的氨基酸序列中的一种或多种。在多个方面，多肽包含表A1或表A2的CDR(具有插入氨基酸)中的六个。在多个方面，多肽仅包含表B1或表B2的HC可变氨基酸序列或LC可变氨基酸序列中的一个。在多个方面，多肽包含融合为一个序列的表B1或表B2的HC可变氨基酸序列和LC可变氨基酸序列，任选地，其中这些HC可变氨基酸序列和LC可变氨基酸序列通过接头序列连接在一起。在不同的情况下，多肽包含HC可变区序列的两个拷贝和LC可变区序列的两个拷贝，任选地，这些拷贝用接头序列连接在一起。在一些方面中，多肽包含scFv1、scFv2或(scFv)2的氨基酸序列。在一些方面中，多肽包含双功能抗体、三功能抗体、单结构域抗体、单可变结构域、串联scFv、tascFvs等的氨基酸序列。在多个方面，多肽仅包含表B1、或表B2、或表C1、或表C2的FL HC氨基酸序列或FL LC氨基酸序列中的一个。在多个方面，多肽包含融合为一个序列的表B1、或表B2、或表C1、或表C2的FL HC氨基酸序列和FL LC氨基酸序列，任选地，其中FL HC和FL LC通过接头序列连接在一起。在示例性方面中，多肽包含亲本序列的变体序列，该亲本序列包含表A1、或表A2、或表B1、或表B2、或表C1、或表C2的氨基酸序列。在多个方面，多肽包含相对于亲本序列仅差异1个、2个、3个、4个、5个、6个、或更多个氨基酸的氨基酸序列。在示例性方面中，多肽包含相对于亲本序列仅差异一个或两多个氨基酸的变体序列。在示例性方面中，多肽包含相对于以上提及的一个或多个氨基酸序列仅具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个保守氨基酸取代的变体序列。
在示例性方面中，多肽包含与亲本氨基酸序列具有大于或约30％、大于或约50％、或大于或约70％序列同一性的氨基酸序列。在示例性方面中，多肽包含与亲本氨基酸序列具有至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在示例性方面中，抗原结合蛋白包含沿亲本序列全长具有至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或具有大于90％序列同一性的氨基酸序列。在示例性方面中，多肽包含沿亲本氨基酸序列全长具有至少95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
在本披露的替代或另外的实施例中，如本文进一步描述，多肽经脂质化(例如肉豆蔻酰化、棕榈酰化)、糖基化、酰胺化、羧酸化、磷酸化、酯化、酰化、乙酰化、环化或转变成酸加成盐和/或任选地二聚或聚合或缀合。
本文提供了设计用于模拟本披露的多肽的肽模拟物。这些肽模拟物在结构上与本披露的多肽基本相似，但具有至少一个结构差异。例如，该肽模拟物是具有用于取代一个或多个肽键的一个或多个键的类肽。在示例性情况下，该类肽包含连接到肽骨架的氮的侧链，而不是如肽中的α-碳。在一些方面中，本披露的类肽缺乏酰胺氢，该酰胺氢负责肽和蛋白质中许多二级结构元件。参见，例如，Reyna等人,PNAS[美国科学院院报]89(20):9367-9371(1992)。
肽模拟物及其制造方法为本领域中已知。参见例如Advances in Amino Acid Mimeticsand Peptidomimetics[氨基酸模拟和肽模拟物研究进展]、第1卷和第2卷,Abell,A.编辑,JAI Press Inc.[JAI出版社公司],Greenwich,CT[康涅狄格州格林威治],2006。在一些方面中，肽模拟物为包含D-异构体氨基酸的D-肽肽模拟物。在一些方面中，肽模拟物为类肽，其中氨基酸的侧链连接至肽主链的α氮原子。类肽的制造方法是本领域中已知的。参见例如Zuckermann等人,JACS[美国化学会志]114(26):10646-10647(1992)和Design, Synthesis,and Evaluation ofNovel Peptoids[新颖类肽的设计、合成与评价],Fowler,Sarah,University of Wisconsin-Madison[威斯康星大学麦迪逊分校],2008。在一些方面中，肽模拟物为包含氨基键结合在β碳而非α碳的β氨基酸的β肽。β-肽的制造方法为本领域中已知。参见例如Seebach等人,Helvetica Chimica Acta[瑞士化学学报]79(4):913-941(1996)。
适体
在示例性实施例中，抗原结合蛋白是适体。组合科学领域的最新进展已经鉴定了对给定靶标具有高亲和力和特异性的短聚合物序列(例如，寡核酸或肽分子)。例如，SELEX技术已被用于鉴定具有与哺乳动物抗体相媲美的结合特性的DNA和RNA适体，免疫学领域已产生并分离出与大量化合物结合的抗体或抗体片段，并且噬菌体展示已被用于发现具有非常有利的结合特性的新肽序列。基于这些分子进化技术的成功，可以肯定的是，可以创造出与任何靶分子结合的分子。环结构经常涉及提供所需的结合属性，例如：经常利用由没有互补碱基配对的短区域创建的发夹环的适体，利用环状高可变区和新噬菌体展示库的组合排列的自然衍生的抗体，与线性肽噬菌体展示结果相比，该利用环肽的新噬菌体展示库显示出更好的结果。因此，已经产生足够的证据表明，可以通过组合分子进化技术来创建并确定高亲和力配体。对于本披露，分子进化技术可用于分离对TIGIT或CD112R特异性的化合物，这些化合物抑制TIGIT与CD155或CD112R与CD112之间的结合相互作用。关于适体的更多信息，通常参见，Gold,L.,Singer,B.,He,Y.Y.,Brody.E.,“Aptamers As Therapeutic AndDiagnostic Agents[作为治疗和诊断剂的适体],”J.Biotechnol.[生物技术杂志]74:5-13(2000)。产生适体的相关技术可以在美国专利号6,699,843中找到，将该文献通过引用以其全文并入。
缀合物
本披露还提供了包含与异源部分连接的一种或多种本披露的抗原结合蛋白的缀合物。如本文所用，术语“异源部分”与术语“缀合物部分”同义，且是指与本文所述的抗原结合蛋白不同的任何分子(化学或生物化学、天然存在或未编码)。可连接于本文所述的任一抗原结合蛋白的示例性缀合物部分包括但不限于异源肽或多肽、靶向剂、诊断标记(如放射性同位素、荧光团或酶标记)、包括水溶性聚合物的聚合物或其他治疗剂或诊断剂。在一些实施例中，该缀合物包含一种或多种本文所述的抗原结合蛋白和以下中的一个或多个：肽(与本文所述的抗原结合蛋白不同)、多肽、核酸分子、另一个抗体或其片段、聚合物、量子点、小分子、毒素、诊断剂、碳水化合物、氨基酸。
在示例性实施例中，本披露的缀合物包含如本文所述的抗原结合蛋白和异源部分，该异源部分为多肽(例如与本文所述的任一抗原结合蛋白不同的多肽)，且该缀合物为融合多肽或融合蛋白或嵌合蛋白或嵌合多肽。本文在“融合蛋白”下提供有关此类结合物的另外的描述。
在一些实施例中，异源部分经由非共价键或共价键连接于本披露的抗原结合蛋白。在示例性方面中，抗原结合蛋白与异源部分之间的键经由共价化学键，例如肽键、二硫键等，或经由物理力，如静电、氢、离子、范德瓦耳斯(van der Waals)或疏水性或亲水性相互作用实现。可使用多种非共价偶联系统，包括例如生物素-亲和素、配体/受体、酶/底物、核酸/核酸结合蛋白、脂质/脂质结合蛋白、细胞黏附分子配偶体；或对彼此具有亲和力的任何结合配偶体或其片段。
在示例性实施例中，抗原结合蛋白经由直接共价键，通过使该抗原结合蛋白的靶向氨基酸残基与能够与这些靶向氨基酸的所选择的侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生剂反应来连接于缀合物部分。抗原结合蛋白或缀合物部分上的反应基团包括例如醛、氨基、酯、硫醇、α-卤乙酰基、马来酰亚胺基或肼基基团。衍生剂包括例如马来酰亚胺基苯甲酰基磺基丁二酰亚胺酯(经由半胱氨酸残基结合)、N-羟基丁二酰亚胺(经由赖氨酸残基)、戊二醛、丁二酸酐或本领域中已知的其他试剂。可替代地，缀合物部分可经由中间载剂，如多糖或多肽载剂间接连接于抗原结合蛋白。多糖载剂的实例包括氨基葡聚糖。合适的多肽载剂的实例包括聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、其共聚物和这些氨基酸与例如丝氨酸的其他氨基酸的混合聚合物，以比较所得负荷载剂所需要的溶解特性。
半胱氨酰残基最常与α-卤乙酸酯(和对应胺)，诸如氯乙酸、氯乙酰氨反应，以获得羧甲基或羧酰氨基甲基衍生物。半胱氨酰残基还通过与溴三氟丙酮、α-溴-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰基磷酸酯、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞基苯甲酸酯、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑反应来衍生。
组氨酰残基是通过在pH 5.5-7.0下与焦碳酸二乙酯反应衍生出，因为这种制剂对组氨酰侧链具有相对特异性。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；优选在0.1M二甲胂酸钠中在pH 6.0下进行反应。
赖氨酰基和氨基端残基与丁二酸或其他羧酸酐反应。用这些药剂衍生化具有逆转赖氨酰残基的电荷的效应。其他适用于衍生含α-氨基的残基的试剂包括亚氨酸酯，诸如吡啶亚氨酸甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2,4-戊二酮和转胺酶催化的与乙醛酸酯的反应。
精氨酰残基通过与一种或若干种常规试剂(其中苯甲酰甲醛、2,3-丁二酮、1,2-环己二酮和茚三酮)反应而被修饰。由于胍官能团的高pKa，因此精氨酸残基的衍生化要求反应在碱性条件下进行。此外，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基基团反应。
可以对酪氨酰残基进行特定修饰，特别感兴趣的是通过与芳族重氮化合物或四硝基甲烷反应将光谱标记引入到酪氨酰残基中。最常见地，将N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别用于形成O-乙酰基酪氨酰物质和3-硝基衍生物。
羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)通过与碳化二亚胺(R-N＝C＝N-R')反应来选择性地修饰，其中R和R'为不同烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳化二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4,4-二甲基苯基)碳化二亚胺。此外，天冬氨酰残基和谷氨酰残基通过与铵离子反应转化为天冬酰胺酰残基和谷氨酰胺酰残基。
其他修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化、赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton,Proteins:Structureand Molecular Properties[蛋白质：结构和分子特性],W.H.Freeman&Co.[W.H.弗里曼公司],San Francisco[旧金山],第79-86页(1983))、天冬酰胺或谷氨酰胺的脱酰胺化、N端氨的乙酰化和/或C端羧酸基的酰胺化或酯化。
另一类型共价修饰包括化学上或通过酶将糖苷与抗原结合蛋白偶联。糖可附接于(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的游离巯基；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的游离羟基；(e)芳族残基，诸如酪氨酸或色氨酸的芳族残基；或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述于1987年9月11日公开的WO 87/05330以及Aplin和Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.[CRC生物化学关键评论],第259-306页(1981)中。
在示例性方面中，异源部分经由接头附接于本披露的抗原结合蛋白。在一些方面中，接头包含具有1至约60个或1至30个原子或更长、2至5个原子、2至10个原子、5至10个原子或10至20个原子长的链。在一些实施例中，链原子均为碳原子。在一些实施例中，接头主链中的链原子选自由C、O、N和S组成的组。链原子和接头可根据其预期溶解性(亲水性)选择，以便提供更可溶的结合物。在一些实施例中，接头提供易由在靶标组织或器官或细胞中发现的酶或其他催化剂或水解条件裂解的官能团。在一些实施例中，接头长度足够长以减小位阻可能性。若接头为共价键或肽键且结合物为多肽，则整个结合物可为融合蛋白。此类肽基接头可为任何长度。示例性肽基接头为约1至50个氨基酸长，5至50、3至5、5至10、5至15或10至30个氨基酸长，且为柔性或刚性。在示例性方面中，接头为包含约2至约20个氨基酸的肽。在示例性方面中，接头为包含约2至约15个氨基酸、约2至约10个氨基酸或约2至约5个氨基酸的肽。合适的肽接头为本领域中已知。参见例如Chen等人,Adv Drug DeliveryReviews[先进药物递送评论]65(10):1357-1369(2013)；Arai等人,Protein Eng Des Sel[蛋白质工程化设计与选择]14(8):529-532(2001)；和Wriggers等人,Curr Trends inPeptide Science[肽科学的当前趋势]80(6):736-746(2005)。在示例性方面中，接头为包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO:2021)的肽。
融合蛋白
在示例性实施例中，抗原结合蛋白连接于与本文所述的抗原结合蛋白不同的多肽，且缀合物为融合多肽或融合蛋白或嵌合蛋白或嵌合多肽。因此，本披露提供了包含本披露的抗原结合蛋白和异源多肽或异源肽的融合多肽或融合蛋白。在示例性方面中，本披露的融合蛋白包含融合到LC可变氨基酸序列的HC可变氨基酸序列或融合到FL LC序列的FLHC序列。在多个方面，融合蛋白包含HC可变氨基酸序列与LC可变氨基酸序列之间或FL HC序列与FL LC序列之间的肽接头。
核酸
本披露进一步提供了包含编码本披露的抗原结合蛋白或多肽或融合蛋白的核苷酸序列的核酸。如本文所用的“核酸”包括“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸分子”，且一般意指DNA或RNA的聚合物或其修饰形式，其可为单链或双链、合成或自天然来源获得(例如分离和/或纯化)，其可含有天然、非天然或改变的核苷酸，且其可含有天然、非天然或改变的核苷酸间键，诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键，代替在未修饰的寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。核酸可包含编码本披露抗原结合蛋白或多肽中的任一个的任何核苷酸序列。在一些实施例中，核酸不包含任何插入、缺失、倒位和/或取代。在其他实施例中，核酸包含一个或多个插入、缺失、倒位和/或取代。
在一些方面中，本披露的核酸为重组的。如本文所用，术语“重组”是指(i)在活细胞外，通过将天然或合成核酸区段与可在活细胞中复制的核酸分子接合而构建的分子；或(ii)由以上(i)中所述的分子复制产生的分子。出于本文中的目的，复制可为体外复制或体内复制。
在一些方面中，核酸基于化学合成和/或酶连接反应使用本领域中已知的程序构建。参见例如Sambrook等人,同上；和Ausubel等人,同上。例如，核酸可使用天然存在的核苷酸或经不同修饰的核苷酸化学合成，经不同修饰的核苷酸经设计以增加分子的生物稳定性或增加在杂交后形成的双链体的物理稳定性(例如硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸)。可用于产生核酸的经修饰的核苷酸的实例包括(但不限于)5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫基尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基辫苷、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N取代的腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)、Y苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。可替代地，一种或多种本披露的核酸可自诸如高分子资源公司(MacromolecularResources)(科罗拉多州柯林斯堡(Fort Collins,CO))和Synthegen公司(德克萨斯州休斯顿(Houston,TX))的公司购买。
在多个方面，核酸包含编码本披露的抗原结合蛋白或多肽或融合蛋白的核苷酸序列。在多个方面，核酸包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码具有表A1、或表A2、或表B1、或表B2、或表C1、或表C2中列出的SEQ ID NO:的一种或多种氨基酸序列。在多个方面，核苷酸序列编码包含表A1或表A2的CDR(具有插入氨基酸)中的六个的氨基酸序列。在多个方面，核苷酸序列仅编码表B1或表B2的HC可变氨基酸序列或LC可变氨基酸序列中的一个。在多个方面，核苷酸序列编码融合为一个序列的表B1或表B2的HC可变氨基酸序列和LC可变氨基酸序列，任选地，其中这些HC可变氨基酸序列和LC可变氨基酸序列通过接头序列连接在一起。在不同的情况下，核苷酸序列编码本文所述的多肽。在多个方面，核苷酸序列仅编码表B1、或表B2、或表C1、或表C2的FL HC氨基酸序列或FL LC氨基酸序列中的一个。在多个方面，核苷酸序列编码氨基酸序列(融合为一个序列的表B1、或表B2、或表C1、或表C2的FL HC氨基酸序列和FL LC氨基酸序列)，任选地，其中FL HC和FL LC通过接头序列连接在一起。在示例性方面中，核苷酸序列编码亲本序列的变体序列，该亲本序列包含表A1、或表A2、或表B1、或表B2、或表C1、或表C2的氨基酸序列。在多个方面，核苷酸序列编码相对于亲本序列仅差异1个、2个、3个、4个、5个、6个、或更多个氨基酸的氨基酸序列。在示例性方面中，核苷酸序列编码相对于亲本序列仅差异一个或两个氨基酸的变体序列。在示例性方面中，核苷酸序列编码相对于以上提及的一个或多个氨基酸序列仅具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多个保守氨基酸取代的变体序列。在示例性方面中，核酸包含如表D中所示的SEQ ID NO:2037-2092中任一个的核苷酸序列。在不同的情况下，该SEQ ID NO:2037-2092中任一个的核苷酸序列包含编码信号序列的核苷酸序列。在多个方面，本披露的核酸包含SEQ ID NO:2037-2092中任一个的核苷酸序列(无编码信号序列的核苷酸序列)。在多个方面，核酸包含SEQID NO:2037-2092中任一个的核苷酸序列(无SEQ ID NO:2037-2092中任一个的前60个、63个、66个、或69个核酸)。
表D
Figure BDA0004122365630000601
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Figure BDA0004122365630000611
载体
在一些方面中，本披露的核酸并入载体中。关于此，本披露提供包含任一本披露的核酸的载体。在示例性方面中，载体为重组表达载体。出于本文中的目的，术语“重组表达载体”意指如下经基因修饰的寡核苷酸或多核苷酸构建体，当该构建体包含编码mRNA、蛋白质、多肽或肽的核苷酸序列且载体与宿主细胞在足够使该mRNA、蛋白质、多肽或肽在细胞内表达的条件下接触时允许细胞表达mRNA、蛋白质、多肽或肽。本披露的载体总体上是非天然存在的。但是，载体的一部分可为天然存在的。本发明的载体可以包含任一类核苷酸，包括(但不限于)DNA和RNA，其可为单链或双链、合成或部分自天然来源获得，且其可含有天然、非天然或改变的核苷酸。载体可包含天然存在或非天然存在的核苷酸间键或两类键。在一些方面中，改变的核苷酸或非天然存在的核苷酸间键不阻碍载体的转录或复制。
本披露的载体可为任何合适载体，且可用于转化或转染任何合适宿主。合适的载体包括经设计用于繁殖和扩增或用于表达或两者的那些载体，诸如质粒和病毒。载体可选自由以下组成的组：pUC系列(富酶泰斯生命科学(Fermentas Life Sciences))、pBluescript系列(加利福尼亚洲拉霍亚的斯曲杰公司(Stratagene,LaJoIIa,CA)、pET系列(威斯康星州麦迪逊市的诺瓦基公司(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(瑞典乌普萨拉的法玛西亚生物技术公司(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden))和pEX系列(加利福尼亚州帕罗奥多的克罗泰克公司(Clontech,Palo Alto,CA))。还可使用噬菌体载体，诸如λGTIO、λGTl 1、λZapII(斯曲杰公司(Stratagene))、λEMBL4和λNMl149。植物表达载体的实例包括pBIOl、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(克罗泰克公司(Clontech))。动物表达载体的实例包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(克罗泰克公司(Clontech))。在一些方面中，载体为病毒载体，例如逆转录病毒载体。
本披露的载体可使用例如Sambrook等人,同上和Ausubel等人,同上中所述的标准重组DNA技术制备。呈圆形或线性的表达载体的构建体可经制备以含有在原核或真核宿主细胞中发挥功能的复制系统。复制系统可源自例如CoIEl、2μ质粒、λ、SV40、牛乳头状瘤病毒等。
在一些方面中，载体包含调节序列，诸如转录和翻译起始和终止密码子，其对于载体将引入的宿主类型(例如细菌、真菌、植物或动物)为特定的，任选地而定，且考虑载体基于DNA还是基于RNA。
载体可包括一种或多种标记物基因，其允许选择转化或转染的宿主。标记物基因包括杀生物剂抗性(例如针对抗生素、重金属等的抗性)、营养缺陷型宿主中提供原营养的补充等。适用于本发明的表达载体的标记物基因包括例如新霉素/G418抗性基因、潮霉素抗性基因(hygromycin resistance gene)、组氨醇抗性基因、四环素抗性基因和氨苄西林抗性基因(ampicillin resistance gene)。
载体可包含可操作地连接至编码多肽(包括其功能部分和功能变体)的核苷酸序列或与编码抗原结合蛋白的核苷酸序列互补或杂交的核苷酸序列的天然或标准启动子。例如强、弱、诱导型、组织特异性和发育特异性的启动子的选择在普通技术人员的常规技术范围内。类似地，核苷酸序列与启动子组合还在技术人员的技术范围内。启动子可为非病毒启动子或病毒启动子，例如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠科干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。
在一些实施例中，载体编码抗体轻链、抗体重链、或抗体轻链和重链。在进一步含有编码抗体重链的载体的细胞中表达时，编码抗体轻链的载体可用于产生本发明的抗体。同样地，在进一步含有编码抗体轻链的载体的细胞中表达时，编码抗体重链的载体可用于产生本发明的抗体。因此，虽然轻链和重链两者可以在单个载体上编码，但在某些实施例中，该载体编码轻链但不编码重链。在其他实施例中，载体编码重链但不编码轻链。
在多个方面，本披露的载体包含编码HC可变区或全长HC的核苷酸序列和编码LC可变区或全长LC的核苷酸序列。在可替代的方面，本披露的载体包含编码如表B1、C1、B2或C2中所述的HC可变区或全长HC的核苷酸序列，或编码如表B1、C1、B2或C2中所述的LC可变区或全长LC的核苷酸序列。
宿主细胞
本文提供包含本披露的一种或多种核酸或载体的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”是指可含有本披露的一种或多种载体且能够产生由一种或多种核酸编码的表达产物(例如mRNA、蛋白质)的任一类细胞。在一些方面中宿主细胞为黏附细胞或悬浮细胞，即悬浮生长的细胞。在示例性方面中，宿主细胞为培养细胞，或原代细胞，即直接自生物体分离。宿主细胞可属于任何细胞类型，可来源于任一类组织，且可处于任何发育阶段。
在示例性方面中，细胞为真核细胞，包括(但不限于)酵母细胞、丝状真菌细胞、原生动物细胞、藻类细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。本领域中描述此类宿主细胞。参见例如Frenzel等人,Front Immunol[免疫学前沿]4:217(2013)。在示例性方面中，真核细胞为哺乳动物细胞。在示例性方面中，真核细胞为非人类哺乳动物细胞。在一些方面中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞及其衍生物(例如，CHO-K1、CHO pro-3、CS9)、小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS0、GS-NS0、Sp2/0)、被工程化为缺乏二氢叶酸还原酶(DHFR)活性的细胞(例如，DUKX-X11、DG44)、人胚肾293(HEK293)细胞或其衍生物(例如，HEK293T、HEK293-EBNA)、绿色非洲猴肾细胞(例如，COS细胞、VERO细胞)、人宫颈癌细胞(例如，HeLa)、人骨肉瘤骨上皮细胞U2-OS、腺癌人肺泡基底上皮细胞A549、人纤维肉瘤细胞HT1080、小鼠脑肿瘤细胞CAD、胚胎癌细胞P19、小鼠胚胎成纤维细胞NIH 3T3、小鼠成纤维细胞L929、小鼠神经母细胞瘤细胞N2a、人乳腺癌细胞MCF-7、视网膜母细胞瘤细胞Y79、人视网膜母细胞瘤细胞SO-Rb50、人肝癌细胞HepG2、小鼠B骨髓瘤细胞J558L或幼仓鼠肾(BHK)细胞(Gaillet等人2007；Khan,Adv PharmBull[高级药物通报]3(2):257-263(2013))。在一个特定实施例中，宿主细胞为CS9(CHO细胞系)。
出于扩增或复制载体的目的，在一些方面中宿主细胞为原核细胞，例如细菌细胞。
本披露还提供包含至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群体。在一些方面中，细胞群体为除至少一种不包含任一载体的其他细胞外还包含含有所述载体的宿主细胞的异质性群体。可替代地，在一些方面中，细胞群体为基本上同质群体，其中该群体主要包含含有载体的宿主细胞(例如基本上由其组成)。在一些方面中，群体为纯系细胞群体，其中该群体的所有细胞均为包含载体的单一宿主细胞的纯系，使得该群体的所有细胞均包含载体。在本披露的示例性实施例中，细胞群体为包含含有如本文所述的载体的宿主细胞的纯系群体。
在本披露的多个方面，宿主细胞包含第一载体和第二载体，该第一载体包含编码如表B1、C1、B2或C2中所述的HC可变区或全长HC的核苷酸序列，该第二载体编码如表B1、C1、B2或C2中所述的LC可变区或全长LC的核苷酸序列。
药物组合物
本文提供了组合物，其包含本披露的抗原结合蛋白(例如，TIGIT结合蛋白、CD112R结合蛋白)、多肽、核酸、载体、宿主细胞、缀合物、融合蛋白、或其组合。在一些方面中，组合物包含呈分离和/或纯化形式的本披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞或其组合。在一些方面中，组合物包含单一类型(例如结构)的本披露的结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞，或包含两种或更多种不同类型的本披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞的组合。
在示例性方面中，组合物包含例如经由使例如抗原结合蛋白在某些温度(例如室温)下稳定，增加例如抗原结合蛋白的存放期、减少降解(例如氧化蛋白酶介导的降解)、增加半衰期等而增强抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体、或宿主细胞的化学物理特征的药剂。在一些方面中，组合物包含本文披露的任一药剂作为异源部分或缀合物部分，任选地与本披露的抗原结合蛋白或多肽混合。
在本披露的示例性方面中，组合物另外包含药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。在一些实施例中，如本发明披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞(以下称为“活性剂”)配制成包含该活性剂以及药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂的药物组合物。在这方面，本披露进一步提供了包含活性剂的药物组合物，该药物组合物旨在施用至受试者，例如哺乳动物。
在一些实施例中，活性剂以适合于施用至患者的纯度水平存在于药物组合物中。在一些实施例中，活性剂具有至少约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的纯度水平，和药学上可接受的稀释剂、载剂或赋形剂。在一些实施例中，组合物含有约0.001至约30.0mg/ml的浓度的活性剂。
在示例性方面中，药物组合物包含药学上可接受的载剂。如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”包括任一标准药物载剂，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(例如油/水或水/油乳液)和各种类型润湿剂。该术语还涵盖经美国联邦政府的管理机构批准或在美国药典中列出的用于包括人类的动物的任一试剂。
药物组合物可包含任何药学上可接受的成分，包括例如酸化剂、添加剂、吸附剂、气溶胶喷射剂、排气剂、碱化剂、防结块剂、抗凝剂、抗微生物防腐剂、抗氧化剂、杀菌剂、碱、黏合剂、缓冲剂、螯合剂、包衣剂、着色剂、干燥剂、洗涤剂、稀释剂、消毒剂、崩解剂、分散剂、溶解增强剂、染料、润肤剂、乳化剂、乳化稳定剂、填充剂、成膜剂、风味增强剂、调味剂、流动增强剂、胶凝剂、造粒剂、保湿剂、润滑剂、黏膜黏附剂、软膏基质、软膏、油质运载体、有机碱、锭剂基质、颜料、增塑剂、抛光剂、防腐剂、多价螯合剂、皮肤渗透剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、栓剂基质、表面活性剂(surface active agent)、表面活性剂(surfactant)、悬浮剂、甜味剂、治疗剂、增稠剂、张力剂、毒性剂、增黏剂、吸水剂、水可混溶性共溶剂、水软水剂或润湿剂。参见例如Handbook of Pharmaceutical Excipients[药物赋形剂手册],第三版,A.H.Kibbe(Pharmaceutical Press[医药出版社],London,UK[英国伦敦],2000)，将其通过引用以其全文并入。Remington’sPharmaceutical Sciences[雷明顿药物科学],第十六版,E.W.Martin(Mack Publishing Co.[麦克出版公司],Easton,Pa.[宾夕法尼亚州伊斯顿],1980)，将其通过引用以其全文并入。
在示例性方面中，药物组合物包含在所采用的剂量和浓度下对接受者无毒的配制品材料。在特定实施例中，药物组合物包含活性剂和一种或多种药学上可接受的盐；多元醇；表面活性剂；渗透平衡剂；张力剂；抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；膨胀剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；止痛剂；或另外的药物试剂。在示例性方面中，任选地除一种或多种赋形剂外，药物组合物还包含一种或多种多元醇和/或一种或多种表面活性剂，该一种或多种赋形剂包括但不限于药学上可接受的盐；渗透平衡剂(张力剂)；抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；膨胀剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；和止痛剂。
在某些实施例中，药物组合物可含有用于改变、维持或保持例如组合物的pH值、渗透性、黏性、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、分解或释放速率、表面吸收或渗透的配制品材料。在此类实施例中，合适的配制品材料包括(但不限于)氨基酸(诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其他碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂、和稀释剂；乳化剂；亲水聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐抗衡离子(如钠)；防腐剂(诸如杀藻胺、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(诸如普朗尼克、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨酸酯(诸如聚山梨酸酯20)、聚山梨酯、曲通(triton)、缓血酸胺、胆固醇、泰洛沙泊(tyloxapal))；稳定性增强剂；张力增强剂(如碱金属卤化物、优选氯化钠或氯化钾、甘露醇山梨糖醇)；递送媒剂；稀释剂；赋形剂和/或药用佐剂。参见REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES[雷明顿药物科学],第18版,(A.R.Genrmo编),1990,Mack Publishing Company[麦克出版公司]。
药物组合物可经配制以实现生理学上相容的pH值。在一些实施例中，药物组合物的pH值可例如在约4或约5与约8.0之间或约4.5与约7.5之间或约5.0至约7.5。
施用途径
对于本披露，活性剂或包含活性剂的药物组合物可经由任何合适施用途径施用至受试者。例如，活性剂可经由肠胃外、经鼻、经口、经肺、局部、经阴道或经直肠施用来施用至受试者。以下关于施用途径的论述仅是为描述示例性实施例而提供且不应视为以任何方式限制范围。
适合于肠胃外施用的配制品包括水性和非水性的等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使配制品与预期接受者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。术语“肠胃外”意指不经由消化道，而通过一些其他途径，诸如皮下、肌肉、脊柱内或静脉内。本披露的活性剂可与生理学上可接受的稀释剂在药物载剂(诸如无菌液体或液体混合物，包括水、生理盐水、右旋糖水溶液和相关糖溶液、醇(诸如乙醇或十六醇)、二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮(诸如2,2-二甲基-l53-二氧戊环-4-甲醇)、醚、聚(乙二醇)400、油类、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯)中施用，添加或未添加药学上可接受的表面活性剂，诸如脂肪酸盐或洗涤剂、悬浮剂(诸如果胶、卡波姆(carbomer)、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其他药物佐剂。
可用于肠胃外配制品中的油类包括石油、动物油、植物油或合成油。油类的特定实例包括花生油、大豆油、芝麻油、棉籽油、玉米油、橄榄油、石蜡油和矿物油。合适用于在肠胃外配制品中使用的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯为合适脂肪酸酯的实例。
用于肠胃外配制品中的合适脂肪酸盐包括脂肪族碱金属盐、铵盐和三乙醇胺盐，且合适的洗涤剂包括(a)阳离子型洗涤剂，诸如卤化二甲基二烷基铵和卤化烷基吡锭；(b)阴离子型洗涤剂，诸如烷基、芳基和烯烃磺酸酯、烷基、烯烃、醚和单酸甘油酯硫酸酯和磺基丁二酸酯；(c)非离子型洗涤剂，诸如脂肪胺氧化物、脂肪酸烷醇酰胺和聚氧乙烯聚丙烯共聚物；(d)两性洗涤剂，诸如烷基-β-氨基丙酸酯和2-烷基-咪唑啉季铵盐；和(e)其混合物。
在一些实施例中，肠胃外配制品在溶液中含有约0.5重量％至约25重量％的本披露的活性剂。可使用防腐剂和缓冲剂。为最小化或消除对注射部位的刺激，此类组合物可含有一种或多种亲水亲油平衡(HLB)为约12至约17的非离子型表面活性剂。此类配制品中表面活性剂的量通常在约5重量％至约15重量％范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯，诸如脱水山梨糖醇单油酸酯和环氧乙烷与由环氧丙烷与丙二醇缩合形成的疏水性基质的高分子量加合物。在一些方面中肠胃外配制品呈单位剂量或多剂量密封容器，诸如安瓿和小瓶呈现，且可储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅仅需要在临用前添加无菌液体赋形剂，例如注射用水。在一些方面中，自先前描述的种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备临时配制的注射溶液和悬浮液。
可注射配制品是根据本披露。对用于可注射组合物的有效药物载剂的要求为本领域普通技术人员熟知(参见例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice[药学和药学实践],J.B.Lippincott Company[J.B.利平科特公司],Philadelphia,PA[宾夕法尼亚州费城],Banker和Chalmers编辑,第238-250页(1982),和，以及ASHP Handbook on InjectableDrugs[可注射药物手册],Toissel,第4版,第622-630页(1986))。
剂量
据信本披露的活性剂可用于如本文所述的在抑制TIGIT与CD155或CD112R与CD112结合后产生的生物活性的方法中，且因此据信其可用于增加免疫应答(例如，T细胞介导的免疫应答)的方法中和治疗或预防一种或多种疾病(例如癌症)的方法中。出于本披露的目的，施用的活性剂的量或剂量应足够在合理时间范围内在受试者或动物中实现例如治疗或预防作用。例如，本披露的活性剂的剂量应足够自施用时间起，在约1至4小时、1至4天或1至4周或更长时间，例如5至20周或更多周的时间内治疗如本文所述的癌症。在某些实施例中，时间段可甚至更长。剂量将由特定活性剂的功效和待治疗的动物(例如人类)的情况以及待治疗的动物(例如人类)的体重决定。
用于确定施用剂量的许多测定为本领域中已知。出于本文中的目的，包含比较在向一组哺乳动物中的一种哺乳动物施用既定剂量的本披露的活性剂后癌症治疗程度的测定可用于确定施用至哺乳动物的起始剂量，各组哺乳动物给予不同剂量的活性剂。在施用一定剂量后的癌症治疗程度可由小鼠异种移植模型中例如活性剂的细胞毒性或用活性剂下实现的肿瘤消退程度表示。测量抗原结合蛋白的细胞毒性的方法和测定肿瘤消退的方法为本领域中已知。简而言之，为了测定体内肿瘤消退，可以通过在小鼠右侧腹皮下接种悬浮在PBS(pH 7.4)中的人肿瘤细胞来建立肿瘤异种移植。可以使用数字卡尺测量肿瘤。可以用公式V＝(π/6)LS2计算肿瘤体积V(单位为mm3)，其中L是最大的表面直径，并且S是最小的表面直径。参见，例如，Shi等人,ACS Nano[ACS纳米]9(4):3740-3752(2015)。
本披露的活性剂的剂量还由可能伴随本披露的特定活性剂施用的任何不良副作用的存在、性质和程度决定。通常，主治医师将考虑多种因素，诸如年龄、体重、整体健康、饮食、性别、待施用的本披露的活性剂、施用途径和所治疗的病状的严重程度来决定本披露的活性剂的剂量以治疗每个单独的患者。借助于实例且不旨在限制本披露，本披露的活性剂的剂量可为每天每千克所治疗的受试者体重约0.0001至约1g、约0.0001至约0.001g或约0.01mg至约1g。
控制释放配制品
在一些实施例中，本文所述的活性剂可经修饰成积存形式，使得本披露的活性剂释放至其施用的身体的方式在体内时间和位置方面获得控制(参见例如美国专利第4,450,150号)。本披露的活性剂的积存形式可为例如包含活性剂和多孔或无孔材料，诸如聚合物的可植入组合物，其中活性剂由该材料囊封或扩散在该材料中和/或无孔材料降解。接着积存物植入受试者体内的所需位置，且活性剂以预定速率自植入物释放。
在某些方面中，包含活性剂的药物组合物经修饰以具有任何类型的体内释放概况。在一些方面中，药物组合物为立即释放、控制释放、持续释放、延长释放、延迟释放或两相释放配制品。配制用于控制释放的肽的方法为本领域中已知。参见例如，Qian等人,JPharm[药物杂志]374:46-52(2009)以及国际专利申请公开号WO 2008/130158；WO 2004/033036；WO 2000/032218；和WO 1999/040942。
本发明的组合物可进一步包含例如胶束或脂质体或一些其他囊封形式，或可呈延长释放形式施用以提供长期储存和/或递送作用。
组合
在一些实施例中，本文所述的活性剂单独施用，并且在替代实施例中，与另一治疗剂(例如，不同类型(例如结构)的本披露的另一活性剂)组合施用。因此，本披露提供了组合，该组合包含靶向CD112R的第一抗原结合蛋白和靶向TIGIT的第二抗原结合蛋白，其中每一种都是根据本披露的抗原结合蛋白。在多个方面，第一抗原结合蛋白是如表A1或表B1中所述的1E1、1E1.016、24F1、29E10、24F1.001、29E10_CONS.020、29E10_CONS.021、29E10_CONS.022、29E10_CONS.025、11E4、31B3、27G12、28F9、28H7、或36C8中的任一个。在多个方面，第二抗原结合蛋白是如表A2或表B2中所述的55G7.041.008、58A7.003.008.075、4G10、11A3、28B8、39D2、43B7、55G7、66H9、43B7.002.015、58A7.003.08、66H9.009、或58A7中的任一个。在不同的情况下，第一抗原结合蛋白是24F1、29E10_CONS.020或29E10_CONS.022。在示例性方面中，第二抗原结合蛋白是43B7.002.015或66H9.009。在一方面中，组合包含24F1和43B7.002.015。在另一方面中，组合包含24F1和66H9.009。在一方面中，组合包含29E10_CONS.020和43B7.002.015。在另一方面中，组合包含29E10_CONS.020和66H9.009。在一方面中，组合包含29E10_CONS.022和43B7.002.015。在另一方面中，组合包含29E10_CONS.022和66H9.009。在另一方面中，组合包含43B7.002.015和1E1.016或24F1或29E10。在又另一个方面中，组合包含66H9.009和1E1.016或24F1或29E10。在示例性方面中，组合包含43B7和29E10或24F1或11E4。
在不同的情况下，本披露提供了作为组合物(例如药物组合物)的组合。因此，本披露提供了包含第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白的组合物，例如，药物组合物。在不同的情况下，第一抗原结合蛋白是24F1、29E10_CONS.020或29E10_CONS.022。在示例性方面中，第二抗原结合蛋白是43B7.002.015或66H9.009。在一方面中，组合物包含24F1和43B7.002.015。在另一方面中，组合物包含24F1和66H9.009。在一方面中，组合物包含29E10_CONS.020和43B7.002.015。在另一方面中，组合物包含29E10_CONS.020和66H9.009。在一方面中，组合物包含29E10_CONS.022和43B7.002.015。在另一方面中，组合物包含29E10_CONS.022和66H9.009。在另一方面中，组合物包含43B7.002.015和1E1.016或24F1或29E10。在又另一个方面中，组合物包含66H9.009和1E1.016或24F1或29E10。在示例性方面中，组合物包含43B7和29E10或24F1或11E4。在示例性情况下，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白以约1:1的比例存在于该组合物中。
在一些方面中，组合或组合物进一步包含另外的活性剂，例如，第三抗原结合蛋白。任选地，第三抗原结合蛋白与免疫系统、免疫抑制剂、或免疫检查点蛋白的负调节物结合，该负调节物包括但不限于CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CEACAM-1、TIGIT、LAG3、CD112、CD112R、CD96、TIM3、BTLA、或共刺激受体：ICOS、OX40、41BB、CD27、GITR。在不同的情况下，另外的活性剂是PD-1结合蛋白，例如，抗PD-1抗体。抗PD-1抗体的实例包括纳武单抗(BMS-936558)、派姆单抗(pembrolizumab)(MK3475)、BMS 936558、BMS-936559、TSR-042(Tesaro公司)、ePDR001(诺华公司(Novartis))和匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)。任选地，第三抗原结合蛋白是国际专利申请号PCT/US2019/013205(公开为WO/2019/140196)中公开的任何PD-1抗原结合蛋白，其全部内容通过引用并入本文。在示例性情况下，第三抗原结合蛋白包含WO/2019/140196的SEQ ID NO:352-357对应的HC CDR1氨基酸序列、HC CDR2氨基酸序列、HC CDR3氨基酸序列、LC CDR氨基酸序列、LC CDR2氨基酸序列、和LC CDR3氨基酸序列。在示例性情况下，第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2027-2032对应的HC CDR1氨基酸序列、HC CDR2氨基酸序列、HC CDR3氨基酸序列、LC CDR氨基酸序列、LCCDR2氨基酸序列、和LC CDR3氨基酸序列。在多个方面，第三抗原结合蛋白包含WO/2019/140196的SEQ ID NO:358和SEQ ID NO:359对应的HC可变区氨基酸序列和LC可变区氨基酸序列。在多个方面，第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2033和SEQ ID NO:2034对应的HC可变区氨基酸序列和LC可变区氨基酸序列。在不同的情况下，第三抗原结合蛋白包含WO/2019/140196的SEQ IDNO:360和SEQ ID NO:361对应的FL HC氨基酸序列和FL LC氨基酸序列。在不同的情况下，第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2035和SEQ ID NO:2036对应的FLHC氨基酸序列和FL LC氨基酸序列。在不同的情况下，第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2093和SEQ ID NO:2094对应的FL HC氨基酸序列和FL LC氨基酸序列。任选地，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白以及第三抗原结合蛋白以约1:1:1的比例存在于该组合物中。
在一些方面中，另一治疗剂旨在治疗或预防癌症。在一些实施例中，另一治疗剂为化学治疗剂。在一些实施例中，另一治疗剂为用于治疗癌症的放射疗法中的药剂。因此，在一些方面中，本文所述的活性剂与铂配位化合物、拓扑异构酶抑制剂、抗生素、抗有丝分裂生物碱和二氟核苷中的一种或多种组合施用。
试剂盒
本披露另外提供了包含本披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞或其组合的试剂盒。在示例性方面中，试剂盒在容器中包含至少一种本披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞或其组合。在示例性方面中，至少一种本披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞呈单位剂量提供于试剂盒中。出于本文中的目的，“单位剂量”是指分散在合适载剂中的离散量。在示例性方面中，单位剂量为足够向受试者提供所需作用，例如治疗癌症的量。在示例性方面，该药剂盒包含若干个单位剂量，例如，一周或一个月的单位剂量供应，任选地，每个单位剂量单独包装或以其他方式与其他单位剂量分开包装。在一些实施例中，该药剂盒/单位剂量的组分与对患者给药的说明书一起包装。在一些实施例中，试剂盒包含一种或多种用于施用至患者的装置，例如针和注射器等。在一些方面中，至少一种本披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞或其组合呈备用形式，例如注射器、静脉内袋等预先包装。在示例性方面中，备用形式是一次性使用。在示例性方面中，试剂盒包含至少一种本披露的抗原结合蛋白、多肽、缀合物、融合蛋白、核酸、载体或宿主细胞的多个一次性使用的备用形式。在一些方面，试剂盒进一步包含包括本文所述的任何一种的其他治疗剂或诊断剂或药学上可接受的载剂(例如，溶剂、缓冲剂、稀释剂等)。
在多个方面，试剂盒包含本披露的多于一种抗原结合蛋白。在示例性情况下，试剂盒包含与CD112R结合的第一抗原结合蛋白和与TIGIT结合的第二抗原结合蛋白。任选地，第一抗原结合蛋白与第二抗原结合蛋白一起配制。在一些方面中，试剂盒包含含有第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白的组合物。在多个方面，第一抗原结合蛋白与第二抗原结合剂分开包装和/或配制。在不同的情况下，第一抗原结合蛋白是如表A1或表B1中所述的1E1、1E1.016、24F1、29E10、24F1.001、29E10_CONS.020、29E10_CONS.021、29E10_CONS.022、29E10_CONS.025、11E4、31B3、27G12、28F9、28H7、或36C8中的任一个。在多个方面，第二抗原结合蛋白是如表A2或表B2中所述的55G7.041.008、58A7.003.008.075、4G10、11A3、28B8、39D2、43B7、55G7、66H9、43B7.002.015、58A7.003.08、66H9.009、或58A7中的任一个。在不同的情况下，第一抗原结合蛋白是24F1、29E10_CONS.020或29E10_CONS.022。在示例性方面中，第二抗原结合蛋白是43B7.002.015或66H9.009。在一方面中，试剂盒包含24F1和43B7.002.015。在另一方面中，试剂盒包含24F1和66H9.009。在一方面中，试剂盒包含29E10_CONS.020和43B7.002.015。在另一方面中，试剂盒包含29E10_CONS.020和66H9.009。在一方面中，试剂盒包含29E10_CONS.022和43B7.002.015。在另一方面中，试剂盒包含29E10_CONS.022和66H9.009。在另一方面中，试剂盒包含43B7.002.015和1E1.016或24F1或29E10。在又另一个方面中，试剂盒包含66H9.009和1E1.016或24F1或29E10。在示例性方面中，试剂盒包含43B7和29E10或24F1或11E4。在示例性情况下，第一抗原结合蛋白和第二抗原结合蛋白以约1:1的比例存在于该组合物中。
在不同的情况下，试剂盒包含另外的活性剂，例如，第三抗原结合蛋白。任选地，第三抗原结合蛋白与免疫系统、免疫抑制剂、或免疫检查点蛋白的负调节物结合，该负调节物包括但不限于CTLA-4、PD-1、PD-L1、PD-L2、B7-H3、B7-H4、CEACAM-1、TIGIT、LAG3、CD112、CD112R、CD96、TIM3、BTLA、或共刺激受体：ICOS、OX40、41BB、CD27、GITR。在不同的情况下，另外的活性剂是PD-1结合蛋白，例如，抗PD-1抗体。抗PD-1抗体的实例包括纳武单抗(BMS-936558)、派姆单抗(pembrolizumab)(MK3475)、BMS 936558、BMS-936559、TSR-042(Tesaro公司)、ePDR001(诺华公司(Novartis))和匹地利珠单抗(pidilizumab)(CT-011)。任选地，第三抗原结合蛋白是国际专利申请号PCT/US2019/013205(公开为WO/2019/140196)中公开的任何PD-1抗原结合蛋白，其全部内容通过引用并入本文。在示例性情况下，第三抗原结合蛋白包含WO/2019/140196的SEQ ID NO:352-357对应的HC CDR1氨基酸序列、HC CDR2氨基酸序列、HC CDR3氨基酸序列、LC CDR氨基酸序列、LC CDR2氨基酸序列、和LC CDR3氨基酸序列。在示例性情况下，第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2027-2032对应的HC CDR1氨基酸序列、HC CDR2氨基酸序列、HC CDR3氨基酸序列、LC CDR氨基酸序列、LC CDR2氨基酸序列、和LC CDR3氨基酸序列。在多个方面，第三抗原结合蛋白包含WO/2019/140196的SEQ ID NO:358和SEQ ID NO:359对应的HC可变区氨基酸序列和LC可变区氨基酸序列。在多个方面，第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2033和SEQ ID NO:2034对应的HC可变区氨基酸序列和LC可变区氨基酸序列。在不同的情况下，第三抗原结合蛋白包含WO/2019/140196的SEQ IDNO:360和SEQ ID NO:361对应的FL HC氨基酸序列和FL LC氨基酸序列。在不同的情况下，第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2035和SEQ ID NO:2036对应的FL HC氨基酸序列和FL LC氨基酸序列。在多个方面，每种抗原结合蛋白单独包装在试剂盒中。任选地，试剂盒包含容器，例如小瓶、注射器、袋等，该容器包含第一、第二和第三抗原结合蛋白中的至少两种。任选地，试剂盒在相同的容器中包含所有抗原结合蛋白作为混合物。
治疗方法
本披露另外提供治疗方法。在示例性实施例中，该方法为一种治疗有需要的受试者的方法，其包括向有需要的受试者施用有效治疗受试者的量的本披露的药物组合物。
本披露的药物组合物可用于抑制TIGIT信号传导和/或CD112R信号传导和/或PD-1信号传导。不限于特定理论，本文提供的组合物的TIGIT抑制活性和/或CD112R抑制活性和/或PD-1抑制活性允许此类实体用于增强T细胞活性和增强免疫应答，以及特别地针对肿瘤或癌症的免疫应答的方法中。
因此，本文提供增强受试者中的T细胞活性、增强T细胞存活和效应功能、限制终末分化和复制潜能丧失、促进T细胞寿命和增强针对靶标(例如癌症)细胞的细胞毒性的方法。在示例性实施例中，这些方法包括向受试者施用有效量的本披露的药物组合物。在示例性方面中，T细胞活性或免疫应答是针对癌细胞或癌症组织或肿瘤细胞或肿瘤。在示例性方面中，免疫应答为体液免疫应答。在示例性方面中，免疫应答为先天性免疫应答。在示例性方面中，增强的免疫应答为T细胞介导的免疫应答。
如本文所用，术语“增强”和源自其的词可能不为100％或完全增强或增加。更确切些，存在本领域中普通技术人员认为具有潜在益处或治疗作用的不同程度的增强。在此方面，本披露的药物组合物可增强例如T细胞活性或增强免疫应答至任何量或水平。在示例性实施例中，由本披露的方法提供的增强为至少或约10％增强(例如至少或约20％增强、至少或约30％增强、至少或约40％增强、至少或约50％增强、至少或约60％增强、至少或约70％增强、至少或约80％增强、至少或约90％增强、至少或约95％增强、至少或约98％增强)。
测量T细胞活性和免疫应答的方法为本领域中已知。T细胞活性可通过例如细胞毒性测定，诸如Fu等人,PLoS ONE[公共科学图书馆·综合]5(7):e11867(2010)中描述的那些测量。其他T细胞活性测定描述于Bercovici等人,Clin Diagn Lab Immunol.[临床诊断实验室免疫]7(6):859–864(2000)中。测量免疫应答的方法描述于例如Macatangay等人,ClinVaccine Immunol[临床与疫苗免疫学]17(9):1452-1459(2010)和Clay等人,Clin CancerRes.[临床癌症研究]7(5):1127-35(2001)中。
还本文提供了增强受试者中自然杀伤(NK)细胞活性的方法。在示例性实施例中，这些方法包括向受试者施用有效量的本披露的药物组合物。在示例性方面中，NK细胞活性是针对癌细胞或癌症组织或肿瘤细胞或肿瘤。
本文另外提供治疗患有癌症的受试者的方法和治疗具有实体瘤的受试者的方法。在示例性实施例中，该方法包括向受试者施用有效治疗受试者的癌症或实体瘤的量的本披露的药物组合物。可由本文披露的方法治疗的癌症可为任何癌症，例如由异常和不受控制的细胞分裂引起的可经由淋巴系统或血流扩散至身体其他部分的任何恶性生长或肿瘤。在一些方面中，癌症为选自由以下组成的组的癌症：急性淋巴细胞癌，急性骨髓性白血病，腺泡状横纹肌肉瘤，骨癌，脑癌，乳癌，肛门、肛管或肛门直肠的癌症，眼癌、肝内胆管癌，关节癌，颈、胆囊或胸膜的癌症，鼻、鼻腔或中耳的癌症，口腔癌，外阴癌，慢性淋巴细胞性白血病，慢性髓细胞样癌，结肠癌，食管癌，子宫颈癌，胃肠道类癌肿瘤，霍奇金氏淋巴瘤，舌癌，肾癌，喉癌，肝癌，肺癌，恶性间皮瘤，黑色素瘤，多发性骨髓瘤，鼻咽癌，非霍奇金淋巴瘤，卵巢癌，胰脏癌，腹膜、网膜和肠系膜癌，咽癌，前列腺癌，直肠癌，肾癌(例如肾细胞癌(RCC))，小肠癌，软组织癌，胃癌、睾丸癌，甲状腺癌，输尿管癌和膀胱癌。在特定方面中，癌症选自由以下组成的组：头颈部癌、卵巢癌、子宫颈癌、膀胱和食管癌、胰脏癌、胃肠癌、胃癌、乳癌、子宫内膜癌和结肠直肠癌、肝细胞癌、胶质母细胞瘤、膀胱癌、肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、细支气管肺泡癌。在特定实施例中，肿瘤为非小细胞肺癌(NSCLC)、头颈部癌、肾癌、三阴性乳癌和胃癌。在示例性方面中，受试者具有肿瘤(例如实体瘤、血液系统恶性肿瘤或淋巴类恶性肿瘤)且向该受试者施用有效治疗受试者的肿瘤的量的药物组合物。在其他示例性方面中，该肿瘤为非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈癌、肾癌、乳腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、肝癌、胰脏癌、结肠癌、前列腺癌、胃癌、淋巴瘤或白血病，且向受试者施用有效治疗受试者的肿瘤的量的药物组合物。
如本文所用，术语“治疗”以及与其相关的词不一定暗示100％或完全治疗。更确切些，存在本领域中普通技术人员认为具有潜在益处或治疗作用的不同程度的治疗。在此方面，本披露的癌症治疗方法可提供任何量或任何水平的治疗。此外，由本披露的方法提供的治疗可包括治疗所治疗癌症的一种或多种病状或症状或体征。由本披露的方法提供的治疗还可涵盖减缓癌症的进展。例如，这些方法可通过增强T细胞活性或NK细胞活性或针对癌症的免疫应答，减少肿瘤或癌症生长，减少肿瘤细胞转移，增加肿瘤或癌细胞的细胞死亡等而治疗癌症。在示例性方面中，方法借助于延迟癌症发作或复发1天、2天、4天、6天、8天、10天、15天、30天、两个月、4个月、6个月、1年、2年、4年或更长时间而进行治疗。在示例性方面中，这些方法借助于增加受试者的存活而治疗。
受试者
在本披露的一些实施例中，受试者为哺乳动物，包括(但不限于)啮齿目哺乳动物，诸如小鼠和仓鼠；和兔目哺乳动物，诸如兔；来自食肉目的哺乳动物，包括猫科动物(猫)和犬科动物(犬)；来自偶蹄目的哺乳动物，包括牛科动物(奶牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目，包括马科动物(马)。在一些方面中，哺乳动物属于灵长目、阔鼻小目(Ceboid)或猴目(Simoid)(猴)或类人猿目(人类和猿类)。在一些方面中，哺乳动物为人类。
制造方法
本披露的抗原结合蛋白可通过本领域中已知的方法获得。重新合成多肽的合适方法描述于例如以下中：Chan等人,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis[Fmoc固相肽合成],Oxford University Press,Oxford,United Kingdom[牛津大学出版社，英国牛津],2005；Peptide and Protein Drug Analysis[肽和蛋白药物分析],编辑Reid,R.,MarcelDekker,Inc.[马塞尔德克尔公司],2000；Epitope Mapping[表位作图],编辑Westwood等人,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom[牛津大学出版社，英国牛津],2000；和美国专利第5,449,752号。制造本发明的肽的其他示例性方法阐述于本文中。
在一些实施例中，本文所述的抗原结合蛋白由诸如Synpep公司(加利福尼亚州都柏林(Dublin,CA))、肽技术公司(Peptide Technologies Corp.)(马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg,MD))、多肽系统公司(Multiple Peptide Systems)(加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA))、肽2.0公司(Peptide 2.0Inc.)(弗吉尼亚州尚蒂伊(Chantilly,VA))和美国多肽公司(American Peptide Co.)(加利福尼亚州森尼韦尔(Sunnyvale,CA))的公司商业上合成。在此方面，抗原结合蛋白可为合成、重组、分离和/或纯化的。
此外，在一些方面中，抗原结合蛋白使用编码肽的氨基酸序列的核酸，使用标准重组方法重组产生。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆：实验室手册].第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor[冷泉港实验室出版社],NY 2001；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],Greene Publishing Associates[格林出版公司]和John Wiley&Sons[约翰·威利父子公司],NY[纽约州],1994。
本文进一步提供了制备本披露的抗原结合蛋白的方法。在示例性实施例中，该方法包括培养本披露的宿主细胞以表达抗原结合蛋白，以及收获所表达的抗原结合蛋白。宿主细胞可为本文所述的宿主细胞中的任一个。在示例性方面中，宿主细胞选自由以下组成的组：CHO细胞、NS0细胞、COS细胞、VERO细胞和BHK细胞。在示例性方面中，培养宿主细胞的步骤包括在生长培养基中培养宿主细胞以支持宿主细胞的生长和扩增。在示例性方面中，生长培养基以及时方式增加细胞密度、培养活力和生产能力。在示例性方面中，生长培养基包含氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖和血清作为生长因子、激素和附着因子的来源。在示例性方面中，生长培养基为由氨基酸、维生素、微量元素、无机盐、脂质和胰岛素或胰岛素样生长因子组成的化学成分完全确定的培养基。除营养素外，生长培养基还帮助维持pH值和渗透压度。若干生长培养基可商购且描述于本领域中。参见例如Arora,“Cell CultureMedia:A Review[细胞培养基：评论]”MATER METHODS[材料方法]3:175(2013)。
在示例性方面中，制造本披露的抗原结合蛋白的方法包括在补料培养基中培养宿主细胞。在示例性方面中，该方法包括在进料培养基中以分批进料模式培养。重组蛋白质产生的方法为本领域中已知。参见例如Li等人,“Cell culture processes for monoclonalantibody production[用于单克隆抗体生产的细胞培养过程]”MAbs 2(5):466–477(2010)。
制造抗原结合蛋白的方法可包括从细胞培养物或其上清液纯化蛋白质且优选回收所纯化的蛋白质的一个或多个步骤。在示例性方面中，该方法包括一个或多个层析步骤，例如亲和层析(例如蛋白A亲和层析)、离子交换层析、疏水性相互作用层析。在示例性方面中，该方法包括使用蛋白A亲和层析树脂纯化蛋白质。
在示例性实施例中，该方法进一步包括用于配制所纯化的蛋白质等，从而获得包含所纯化的蛋白质的配制品的步骤。此类步骤描述于Formulation and ProcessDevelopment Strategies for Manufacturing[制造用配制和工艺开发策略],编辑Jameel和Hershenson,John Wiley&Sons,Inc.[约翰·威利父子公司](Hoboken,NJ[新泽西州霍博肯市]),2010中。
示例性实施例
以下是本披露的示例性实施例的列表：
1.一种CD112R抗原结合蛋白，任选地，抗体或其抗原结合片段，该CD112R抗原结合蛋白包含：(a)表A1中列出的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)表A1中列出的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)表A1中列出的HCCDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)表A1中列出轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)表A1中列出的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)表A1中列出的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或(g)(a)-(f)中的任两个或更多个的组合。
2.如实施例1所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含表A1的单行中列出的六个CDR氨基酸序列，或包含选自下组的六个CDR氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:13-18；(b)SEQ ID NO:23-28；(c)SEQ ID NO:33-38；(d)SEQ ID NO:43-48；(e)SEQ ID NO:53-58；(f)SEQ ID NO:63-68；(g)SEQ ID NO:73-78；(h)SEQ ID NO:83-88、(i)SEQ ID NO:93-98、(j)SEQ ID NO:103-108、(k)SEQ ID NO:233-238、(l)SEQ ID NO:1973-1978、(m)SEQ ID NO:1983-1988、(n)SEQ ID NO:1993-1998、和(o)SEQ ID NO:2003-2008。
3.如实施例1或2所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含(a)表B1中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B1中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
4.如实施例3所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含表B1的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:11-12；(b)SEQ ID NO:21-22；(c)SEQ ID NO:31-32；(d)SEQID NO:41-42；(e)SEQ ID NO:51-52；(f)SEQ ID NO:61-62；(g)SEQ ID NO:71-72；(h)SEQID NO:81-82、(i)SEQ ID NO:91-92、(j)SEQ ID NO:101-102、(k)SEQ ID NO:231-232、(l)SEQ ID NO:1971-1972、(m)SEQ ID NO:1981-1982、(n)SEQ ID NO:1991-1992、和(o)SEQ IDNO:2001-2002。
5.如前述实施例中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含(a)表B1中列出的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B1的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B1中列出的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B1的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
6.如实施例5所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含表B的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:9-10；(b)SEQ ID NO:19-20；(c)SEQ ID NO:29-30；(d)SEQ IDNO:39-40；(e)SEQ ID NO:49-50；(f)SEQ ID NO:59-60；(g)SEQ ID NO:69-70；(h)SEQ IDNO:79-80、(i)SEQ ID NO:89-90、(j)SEQ IDNO:99-100、(k)SEQ ID NO:229-230、(l)SEQ IDNO:1969-1970、(m)SEQ ID NO:1979-1980、(n)SEQ ID NO:1989-1990、和(o)SEQ ID NO:1999-2000。
7.如前述实施例中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白是抗体。
8.如权利要求7所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含：
(a)SEQ ID NO:33的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:34的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:35的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:36的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:37的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:38的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(b)SEQ ID NO:63的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:64的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:65的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:66的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:67的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:68的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(c)SEQ ID NO:83的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:84的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:85的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:86的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:87的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:88的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(d)包含(a)SEQ ID NO:31的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQID NO:31的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:32的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:32的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(e)包含(a)SEQ ID NO:61的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQID NO:61的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:62的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:62的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(f)包含(a)SEQ ID NO:81的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQID NO:81的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:82的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:82的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(g)(a)SEQ ID NO:29的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQID NO:29的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:30的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:30的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(h)(a)SEQ ID NO:59的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQID NO:59的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:60的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:60的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(i)(a)SEQ ID NO:79的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQID NO:79的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:80的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:80的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
9.如前述实施例中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段。
10.如前述实施例中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白是抗体蛋白产物，任选地是scFv。
11.一种多肽，其包含表A1、B1、或C1的SEQ ID NO:的氨基酸序列，或与该表的SEQID NO:的氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或其组合。
12.一种缀合物，其包含如前述实施例中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白或多肽、和异源部分。
13.如实施例12所述的缀合物，该缀合物包含与另一个氨基酸序列融合的抗原结合蛋白或多肽的氨基酸序列。
14.一种核酸，其编码如前述实施例中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白、或多肽、或缀合物。
15.一种核酸，其编码如实施例9或10所述的抗体的轻链、重链、或轻链和重链两者。
16.如实施例14或15所述的核酸，其中该核苷酸序列编码(a)表B1中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B1中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)两者。
17.一种载体，其包含一种或多种如实施例14-16中任一项所述的核酸。
18.一种宿主细胞，其包含一种或多种如实施例14-16中任一项所述的核酸或一种或多种如实施例17所述的载体。
19.如实施例18所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生如实施例1-10中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白。
20.一种TIGIT抗原结合蛋白，任选地，抗体或其抗原结合片段，该TIGIT抗原结合蛋白包含：(a)表A2中列出的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)表A2中列出的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)表A2中列出的HCCDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)表A2中列出轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)表A2中列出的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)表A2中列出的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或(g)(a)-(f)中的任两个或更多个的组合。
21.如实施例20所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含：
a.LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Ser28或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR2氨基酸序列，该LC CDR2氨基酸序列包含Glu1或其保守氨基酸取代；和LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser91或其保守氨基酸取代、Ser92或其保守氨基酸取代、Ser93或其保守氨基酸取代、Leu94或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Val32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Gly57或其保守氨基酸取代、Gly58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Arg66或其保守氨基酸取代、或其任何组合；以及HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Ile102或其保守氨基酸取代、Ala104或其保守氨基酸取代、Gly107或其保守氨基酸取代、Tyr108或其保守氨基酸取代、Phe109或其保守氨基酸取代、Tyr110或其保守氨基酸取代、Tyr111或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的LC可变区氨基酸序列
b.LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Ser28或其保守氨基酸取代、Val29或其保守氨基酸取代、Ser30或其保守氨基酸取代、Ser31或其保守氨基酸取代、Thr32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR2氨基酸序列，该LC CDR2氨基酸序列包含Glu1或其保守氨基酸取代、Ile2或其保守氨基酸取代、Ser68或其保守氨基酸取代、Gly69或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LCCDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Tyr92或其保守氨基酸取代、Asp93或其保守氨基酸取代、Val94或其保守氨基酸取代、Ser95或其保守氨基酸取代、Pro96或其保守氨基酸取代、Trp97或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Gly32或其保守氨基酸取代、Tyr35或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Ser58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Phe60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Lys66或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Arg102或其保守氨基酸取代、Asn104或其保守氨基酸取代、Trp105或其保守氨基酸取代、Asn106或其保守氨基酸取代、Tyr107或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的LC可变区氨基酸序列
c.LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Arg30或其保守氨基酸取代、Arg31或其保守氨基酸取代、Tyr32或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser91或其保守氨基酸取代、Tyr92或其保守氨基酸取代、Ser93或其保守氨基酸取代、Thr94或其保守氨基酸取代、或其任何组合，其中位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的LC可变区氨基酸序列；HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Thr30或其保守氨基酸取代、Gly31或其保守氨基酸取代、Tyr32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Trp47或其保守氨基酸取代、Trp50或其保守氨基酸取代、Ser52或其保守氨基酸取代、Thr54或其保守氨基酸取代、Ser55或其保守氨基酸取代、Ala57或其保守氨基酸取代、Thr58或其保守氨基酸取代、Gly59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Gln65或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Asn101或其保守氨基酸取代、Ser102或其保守氨基酸取代、Val103或其保守氨基酸取代、Leu104或其保守氨基酸取代、Tyr105或其保守氨基酸取代、Tyr106或其保守氨基酸取代、Tyr107或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的HC可变区氨基酸序列；
d.LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Leu30或其保守氨基酸取代、Ser32或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser96或其保守氨基酸取代、Ile97或其保守氨基酸取代、Gln98或其保守氨基酸取代、Leu99或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Asp33或其保守氨基酸取代；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Gly57或其保守氨基酸取代、Gly58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Lys66或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Ile102或其保守氨基酸取代、Ala104或其保守氨基酸取代、Gly107或其保守氨基酸取代、Tyr108或其保守氨基酸取代、Phe109或其保守氨基酸取代、Tyr110或其保守氨基酸取代、Phe111或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的HC可变区氨基酸序列；
22.如实施例20或21所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含表A2的单行中列出的六个CDR氨基酸序列，或包含选自下组的六个CDR氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:113-118；(b)SEQ ID NO:123-128；(c)SEQ ID NO:133-138；(d)SEQ IDNO:143-148；(e)SEQ ID NO:153-158；(f)SEQ ID NO:163-168；(g)SEQ ID NO:173-178；(h)SEQ ID NO:183-188、(i)SEQ ID NO:193-198、(j)SEQ ID NO:203-208、(k)SEQ ID NO:213-218、(l)SEQ ID NO:223-228、和(m)SEQ ID NO:2013-2018。
23.如实施例20-22中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含(a)表B2中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B2中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
24.如实施例23所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含表B2的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:111-112、(b)SEQ ID NO:121-122、(c)SEQ ID NO:131-132、(d)SEQ ID NO:141-142、(e)SEQ ID NO:151-152、(f)SEQ ID NO:161-162、(g)SEQ ID NO:171-172、(h)SEQ ID NO:181-182、(i)SEQ ID NO:191-192、(j)SEQ ID NO:201-202、(k)SEQID NO:211-212、(l)SEQ ID NO:221-222、和(m)SEQ ID NO:2011-2012。
25.如实施例20-24中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含(a)表B2中列出的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B2的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B2中列出的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B2的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
26.如实施例25所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含表B2的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:109-110、(b)SEQ ID NO:119-120、(c)SEQ ID NO:129-130、(d)SEQ ID NO:139-140、(e)SEQ ID NO:149-150、(f)SEQ ID NO:159-160、(g)SEQ ID NO:169-170、(h)SEQ ID NO:179-180、(i)SEQ ID NO:189-190、(j)SEQ ID NO:199-200、(k)SEQ IDNO:209-210、(l)SEQ ID NO:219-220、和(m)SEQ ID NO:2009-2010。
27.如实施例20-26中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白是抗体。
28.如实施例27所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含：
(a)SEQ ID NO:203的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:204的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:205的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:206的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:207的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:208的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(b)SEQ ID NO:223的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:224的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:225的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:226的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:227的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:228的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(c)包含(a)SEQ ID NO:201的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:201的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:202的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:202的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(d)包含(a)SEQ ID NO:221的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:221的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:222的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:222的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(e)(a)SEQ ID NO:199的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQID NO:199的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:200的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:200的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(f)(a)SEQ ID NO:219的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQID NO:219的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:220的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:220的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
29.如实施例20-26中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段。
30.如实施例20-26中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白是抗体蛋白产物，任选地是scFv。
31.一种多肽，其包含表A2、B2、或C2的SEQ ID NO:的氨基酸序列，或与该表的SEQID NO:的氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或其组合。
32.一种缀合物，其包含如前述实施例中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白或多肽、和异源部分。
33.如实施例32所述的缀合物，该缀合物包含与另一个氨基酸序列融合的抗原结合蛋白或多肽的氨基酸序列。
34.一种核酸，其编码如前述实施例中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白、或多肽、或缀合物。
35.一种核酸，其编码如实施例27或28所述的抗体的轻链、重链、或轻链和重链两者。
36.如实施例34或35所述的核酸，其中该核苷酸序列编码(a)表B2中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B2中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)两者。
37.一种载体，其包含一种或多种如实施例34至36中任一项所述的核酸。
38.一种宿主细胞，其包含一种或多种如实施例34至36中任一项所述的核酸或一种或多种如实施例37所述的载体。
39.如实施例37所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生如实施例20-30中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白。
40.一种组合物，其包含如实施例1-10中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白和如实施例20-30中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白。
41.如实施例40所述的组合物，其中(A)该CD112R抗原结合蛋白是如表A1或表B1中所述的1E1、1E1.016、24F1、29E10、24F1.001、29E10_CONS.020、29E10_CONS.021、29E10_CONS.022、29E10_CONS.025、11E4、31B3、27G12、28F9、28H7、或36C8，任选地是24F1、29E10_CONS.020或29E10_CONS.022，(B)该TIGIT抗原结合蛋白是如表A2或表B2中所述的55G7.041.008、58A7.003.008.075、4G10、11A3、28B8、39D2、43B7、55G7、66H9、43B7.002.015、58A7.003.08、66H9.009、或58A7中的任一个，任选地是43B7.002.015或66H9.009，或(A)和(B)的组合。
42.如实施例40或41所述的组合物，该组合物包含(A)24F1和43B7.002.015，(B)24F1和66H9.009，(C)29E10_CONS.020和43B7.002.015，(D)29E10_CONS.020和66H9.009，(E)29E10_CONS.022和43B7.002.015，(F)29E10_CONS.022和66H9.009，(G)43B7.002.015和1E1.016，(H)43B7.002.015和24F1，(I)43B7.002.015和29E10，(J)66H9.009和1E1.016，(K)66H9.009和29E10，(L)43B7和29E10，(M)43B7和24F1，或(N)43B7和11E4。
43.如权利要求40-42中任一项所述的组合物，其中该CD112R抗原结合蛋白和该TIGIT抗原结合蛋白以约1:1的比例存在于该组合物中。
44.如实施例40-43中任一项所述的组合物，该组合物进一步包含靶向PD-1的第三抗原结合蛋白。
45.如实施例44所述的组合物，其中该第三抗原结合蛋白是国际专利申请号PCT/US2019/013205(公开为WO/2019/140196)中公开的任何PD-1抗原结合蛋白。
46.如实施例44或45所述的组合物，其中该第三抗原结合蛋白包含SEQ ID NO:2033的HC可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:2034的LC可变区氨基酸序列。
47.一种试剂盒，其包含如实施例1-10中任一项所述的抗原结合蛋白、如实施例11所述的多肽、如实施例12或13所述的缀合物、如实施例14至16中任一项所述的核酸、如实施例17所述的载体、如实施例18或19所述的宿主细胞、如实施例20-30中任一项所述的抗原结合蛋白、如实施例31所述的多肽、如实施例32或33所述的缀合物、如实施例34至36所述的核酸、如实施例37所述的载体、如实施例38或39所述的宿主细胞、如实施例40-46中任一项所述的组合物、或其组合，和容器。
48.一种药物组合物，其包含如实施例1-10中任一项所述的抗原结合蛋白、如实施例11所述的多肽、如实施例12或13所述的缀合物、如实施例14至16中任一项所述的核酸、如实施例17所述的载体、如实施例18或19所述的宿主细胞、如实施例20-30中任一项所述的抗原结合蛋白、如实施例31所述的多肽、如实施例32或33所述的缀合物、如实施例34至36所述的核酸、如实施例37所述的载体、如实施例38或39所述的宿主细胞、如实施例40-46中任一项所述的组合物、或其组合，和药学上可接受的载剂、赋形剂、或稀释剂。
49.一种制造CD112R抗原结合蛋白的方法，该方法包括培养如实施例18或19中任一项所述的宿主细胞以表达该CD112R抗原结合蛋白以及收获所表达的CD112R抗原结合蛋白。
50.一种制造TIGIT抗原结合蛋白的方法，该方法包括培养如实施例38或39中任一项所述的宿主细胞以表达该TIGIT抗原结合蛋白以及收获所表达的TIGIT抗原结合蛋白。
51.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该有需要的受试者施用有效治疗该受试者的量的如实施例48所述的药物组合物。
52.如实施例51所述的方法，其中该受试者具有实体瘤且该药物组合物是以有效治疗该受试者的该实体瘤的量施用至该受试者。
53.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该有需要的受试者施用包含CD112R抗原结合蛋白和TIGIT抗原结合蛋白的第一药物组合物，和包含PD-1抑制剂的第二药物组合物。
54.如实施例53所述的方法，其中该受试者具有实体瘤且该第一药物组合物和第二药物组合物以有效治疗该受试者的该实体瘤的量施用。
给出以下实例仅用于说明本发明，而不以任何方式限制其范围。
实例
实例1
该实例描述了TIGIT家族受体和配体在癌症和正常T细胞中的表达。
使用来自癌症基因组图谱(TCGA)的RNAseq数据对多种肿瘤适应症进行相关性分析，以评估TIGIT家族成员之间以及与PD-1的共表达。对TIGIT家族成员和PD-1的配体进行同样的分析。肿瘤适应症包括乳腺浸润性癌(BRCA)、肾透明细胞癌(KIRC)、颈鳞状细胞癌(HNSC)、和皮肤黑色素瘤(SKCM)。
如图1A的顶行所示，大多数TIGIT家族受体在大多数肿瘤适应症中显示出相互之间的正相关性，这表明许多这些受体在癌症或肿瘤环境中共表达。相反，TIGIT家族成员的配体显示出有限的相关性(图1A的底行)；最好的相关性是CD112与CD155。其余的没有显示出彼此之间或与PD-L1之间的良好的相关性。
还分析了来自人肝癌的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的单个细胞RNAseq数据，并且数据表明，虽然TIGIT和PD-1表达重叠，但CD112R表达更广泛(图1B)。从来自结肠直肠癌(CRC)和非小细胞肺癌(NSCLC)的TILS的其他单个细胞RNA seq数据集获得了类似的结果(数据未显示)。
CD112R是TIGIT受体家族的最新成员。先前已经显示其在NK细胞和激活的T细胞上表达，并且主要在CD8 T细胞上表达。CD112R表达被证实是在CD8 T细胞激活后被诱导的，并且证实相当比例的这些细胞也共表达PD-1和TIGIT，这与scRNAseq数据表明的模式一致(图1C)。
为了确定CD112R、TIGIT、和PD-1以及配体CD112和CD155在原代人细胞中的表达，评估了这些分子在来自人肿瘤组织的肿瘤浸润免疫细胞和肿瘤细胞上的表达。在有限数量的样品中，通过FACS检测到的受体的相对表达高度可变(图1D)。此外，观察到Epcam+CD45-肿瘤细胞与Epcam-CD45+免疫细胞上的配体表达显著不同。如图1E所示，CD112和CD155在Epcam+CD45-肿瘤细胞中以高水平共表达，但在肿瘤内免疫细胞(具有明显较少的表达两种配体的细胞)上以低水平表达。PBMC中的CD45+Epcam-髓细胞显示出很少(如果有的话)的共表达这些配体的细胞。
这些结果表明了CD112R、TIGIT、和PD-1的表达模式。
实例2
该实例表明CD112R阻断增强了T细胞应答。
为了证明CD112R在T细胞中的功能，开发了使用稳定表达CD112和CD3衔接子的工程化的CHO细胞的体外测定系统。将纯化的人泛T细胞用CD3/CD28抗体预激活，然后使其静置。当在T细胞表面上表达的CD112R与在CHO细胞表面上表达的CD112结合时，预期IL-2的释放会被抑制。图2A提供了测定的图示。确认T细胞在细胞表面具有诱导的CD112R表达(图2B)。使用该测定系统测试工具抗体与CD112R结合并阻断IL-2释放的能力。工具抗体(PL-52575；PL-52576和PL-52577)表明了与表达huCD112R的细胞的剂量依赖性结合(图2C)，并且这些抗体的相对亲和力(affinity)/亲合力(avidity)与其阻断配体结合的能力相关(图2D)。下表提供了这些工具抗体的EC50和IC50的总结。
Figure BDA0004122365630000991
使用该测定系统，在表达CD112的CHO细胞存在的情况下，工具抗体剂量依赖性地增强了T细胞的活性(图2E的蓝色圆圈、红色方块和绿色三角形)。抗体诱导活性的能力取决于CHO细胞上CD112的存在，因为当CHO细胞用空载体模拟转染并且不表达CD112时，T细胞的活性不会增强。这些数据表明CD112与CD112R的相互作用抑制了T细胞应答。
如先前所示，CD112与CD226结合以诱导共刺激信号。重要的是，在没有CD112R的情况下，CD112介导的T细胞共刺激完全由CD226驱动(图2F)，这进一步证实了CD112R主要是通过与CD226结合的配体相同的配体结合来抑制CD226依赖性共刺激信号。
这些结果表明，CD112R阻断是增强T细胞应答的良好策略。
实例3
该实例表明了CD112R单克隆抗体(mAb)的产生。
如下产生针对人CD112R的全人抗体。
抗CD112R免疫应答的产生
小鼠品系
通过对
Figure BDA0004122365630001001
转基因小鼠进行免疫接种来产生针对人CD112R的完全人抗体(美国专利第6,114,598号；第6,162,963号；第6,833,268号；第7,049,426号；第7,064,244号，将其通过引用以其全文并入本文中；Green等人,1994,Nature Genetics[自然遗传学]7:13-21；Mendez等人,1997,Nature Genetics[自然遗传学]15:146-156；Green和Jakobovits,1998,J.Ex.Med[实验医学杂志],188:483-495；Kellerman和Green,CurrentOpinion in Biotechnology[生物技术新观点]13,593-597,2002)。来自XMG4-K、XMG4-KL、XMG2-K、和XMG2-KL/>
Figure BDA0004122365630001002
品系的动物用于这些免疫接种。此外，还产生了定制的XMG2 CD112R KO小鼠品系(Horizon Discovery公司)。/>
免疫接种
使用多种不同的免疫接种策略产生抗体库，这些免疫接种策略应用于各种XenoMouse品系，这些品系包括XenoMouse敲除品系XMG2CD112R KO。在免疫研究期间的不同时间点(从4周到10周)，对动物进行放血，并收集血浆，以评估CD112R特异性效价。
通过Accuri流式细胞仪上活细胞FACS分析，监测CD112R特异性血清效价。简言之，将HEK293细胞用人或食蟹猴CD112R模拟转染或短暂转染。将来自经免疫接种的动物的血清稀释100倍且在转染细胞上冰上孵育1小时。然后洗涤细胞，以移除未结合的抗体，且用Cy5标记的第二抗人IgG Fc特异性抗体在细胞上在4摄氏度下另外孵育15分钟。将细胞洗涤一次，以移除未结合的第二抗体，且通过FACS定量细胞上的荧光信号。针对人和食蟹猴CD112R具有最高抗原特异性血清天然效价的动物用于产生杂交瘤(Kohler和Milstein,1975)。收获物1和收获物3的动物品系是XMG2/XMG4，收获物2的品系是XMG2kl。
单克隆抗体的制备
杂交瘤产生
鉴别展现合适血清效价的动物且自脾和/或引流淋巴结获得淋巴细胞。通过在合适培养基(例如达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium，DMEM)；加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中研磨，自淋巴组织解离汇集的淋巴细胞(来自各次收获)。使用标准方法选择和/或扩增B细胞，且使用本领域中已知的技术与合适融合配偶体融合。随后使用基于FACS的抗原特异性分选或标准的多克隆铺板技术对产生抗体的杂交瘤进行铺板。
杂交瘤细胞的抗原特异性染色：
将杂交瘤细胞自烧瓶移除，且在无菌FACS缓冲液(含2％ FBS的PBS)中洗涤。然后将细胞用可溶性人CD112R蛋白染色，并在4摄氏度下孵育1小时。将细胞再次在FACS缓冲液中洗涤，且用1mL含有5μg/mL Alexa Fluor 488结合的F(ab’)2片段山羊抗人类IgG Fc(杰克逊公司(Jackson)，目录号：109-546-098)和Alexa Fluor 647结合的抗生蛋白链菌素(杰克逊公司(Jackson)，目录号：016-600-084)的检测混合物染色，接着在4℃下在黑暗中孵育30分钟。将细胞再次在FACS缓冲液中洗涤，重悬于培养基中，然后穿过40微米细胞过滤器以移除聚集的细胞。使用BD FACSAria 3，通过对展现Alexa Fluor488与Alexa Fluor 647荧光的群体(IgG+和抗原结合细胞)进行闸控，将抗原特异性细胞分类。
将经分类的细胞在杂交瘤培养基中培养几天。在证实CD112R特异性细胞成功富集之后，接着使用BD FACSAria 3，将杂交瘤进行单个细胞分类至384孔微量滴定板。在培养2周之后，自微量滴定板收集上清液，且筛选CD112R结合。
CD112R特异性结合抗体的初始选择
用于鉴定和选择针对人CD112R抗体的筛选测定顺序如图3所示。
人CD112R特异性测定
转染的细胞用于评估抗体对宿主人胚胎肾(HEK)293T细胞的结合特异性(如下使用流式细胞术)。通过使用人CD112R、鼠CD112R、大鼠CD112R、人CD96、人CD226或对照表达载体、GibcoTM
Figure BDA0004122365630001021
培养基(吉布科公司(Gibco)，目录号31985088)和293FectinTM试剂(英杰公司，目录号12347019)，遵循制造商陈述的方案转染，在HEK 293T细胞上表达蛋白质。24小时后，将转染的细胞重悬于FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)中，并添加至96孔板中。添加杂交瘤上清液样品，使其最终为2.5ug/mL(注意11E4除外，其以1:10的最终稀释度测试)，将细胞重悬并在4℃下孵育1小时。将板用FACS缓冲液洗涤两次，离心以沉淀细胞，将上清液去除并重悬于FACS缓冲液中以去除未结合的抗体。然后将在FACS缓冲液中配制的第二Alexa Fluor 488-山羊抗人IgG(Fcγ片段特异性)(杰克森免疫研究公司(JacksonImmunoResearch)，目录号109-545-098)以5ug/mL添加到每个孔中，将细胞重悬，并在4℃下孵育15分钟。将板用FACS缓冲液洗涤两次，离心以沉淀细胞，将上清液去除并重悬于FACS缓冲液中以去除未结合的第二抗体。然后将样品重悬于FACS缓冲液中，并且用IntellicytHyperCyt自动取样器在BD AccuriTM流式细胞仪上读取样品。收获物1、收获物2和收获物3的与人CD112R的结合剂的数目分别为216、539和569。huCD112R抗体对人CD112R有选择性，并且与小鼠或大鼠CD112R没有交叉反应(数据未显示)。
Jurkat人CD112R/NFAT-荧光素酶报道基因测定(RGA)
为了筛选能够通过阻断CD112-CD112R相互作用而增强T细胞活性的杂交瘤或纯化的抗CD112R抗体，开发了Jurkat细胞中的NFAT报道子测定(图4A)。将稳定表达人CD112R和NFAT-荧光素酶报道子的Jurkat细胞(使用普洛麦格公司(Promega)的Jurkat NFAT-荧光素酶细胞系内部产生，目录号CS176401)在补充有10％胎牛血清(西格玛公司)、2mM L-谷氨酰胺(西格玛公司)、10mM HEPES(海克隆公司(Hyclone)，通用电气医疗集团生命科学部(GEHealthcare Life Sciences))、1X MEM NEAA(西格玛公司)、1X丙酮酸钠(西格玛公司)、500ug/mL遗传霉素(英杰公司)和0.5ug/mL嘌呤霉素(英杰公司)的RPMI 1640培养基(西格玛公司(Sigma))中培养。由通过与稳定表达人CD112和人T细胞衔接子(内部产生的)的中国仓鼠卵巢(CHO)-K1细胞共培养的T细胞受体的接合，刺激Jurkat NFAT-荧光素/CD112R克隆C4细胞。在含有营养混合物F12HAM(西格玛公司)、10％胎牛血清、10mM HEPES、500μg/mL遗传霉素、200μg/mL潮霉素B(英杰公司)和100ug/mL博来霉素(英杰公司)的全生长培养基中，将1x 104个CHO-K1-CD112+细胞接种在白色半区96孔板(Costar公司，目录号3688)中，在37℃/5％CO2下过夜。过夜孵育后，在杂交瘤上清或抗体(具有各自的对照)存在的情况下，在测定培养基(补充有1％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES的RPMI 1640培养基)中，用5x 104个Jurkat NFATluc/CD112R克隆C4细胞替代生长培养基，并且在37℃/5％ CO2下孵育18小时。根据制造商的推荐，使用Bio-GLo荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，目录号G7940)确定每个孔中的报道子信号。使用EnVision酶标仪(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))检测发光。对于单点检测，将耗尽型杂交瘤培养基上清液样品中的人IgG量化，相对于固定浓度归一化，并以2.0μg/mL测试。导致NFAT-荧光素酶信号的3倍或更高诱导的抗体共有216个，并被用于后续的筛选。
原代细胞结合测定
通过流式细胞术测试杂交瘤上清液与由原代人和食蟹猴细胞表达的CD112R的结合。对于人类原代细胞结合测定，将经纯化的人类T细胞(生物专业公司(BiologicalSpecialty Corp.))解冻且以2.5×106个细胞/mL的浓度悬浮。在37℃/5％ CO2下将T细胞在预涂5μg/mL抗小鼠IgG Fc(皮尔斯公司(Pierce))的板中用5ug/mL抗人类CD3纯系OKT3(e生物科学公司(eBioscience))和1μg/mL抗人类CD28(BD Pharmingen公司)刺激72小时。72小时后，将细胞去除，洗涤并且以0.5x 106个细胞/mL的浓度用10ng/mL的IL-2(派普泰克公司(Pepro Tech))悬浮。然后将细胞在37℃/5％ CO2下再孵育5天。对于食蟹猕猴原代细胞结合测定，将食蟹猕猴PBMC(SNBL)解冻且以在4×106与5×106个细胞/mL之间的浓度悬浮。在37℃/5％ CO2下将PBMC在预涂5μg/mL抗小鼠IgG Fc(皮尔斯公司(Pierce))的板中用1μg/mL抗人类CD3纯系SP34(BD Pharmingen公司)和1μg/mL抗人类CD28(BD Pharmingen公司)刺激72小时。在72小时之后，移出细胞，洗涤且以0.5x 106个细胞/mL的浓度用20ng/mL IL-2(派普泰克公司(Pepro Tech))悬浮。然后将细胞在37℃/5％ CO2下再孵育7天。
每48至72小时进行一次完全培养基(具有人和食蟹猴细胞)更换，并添加新鲜IL-2。在每次更换培养基时，细胞以0.5x 106个细胞/mL的浓度悬浮。在最终孵育之后，通过以10μg/mL最终浓度与标准化的杂交瘤上清液、阳性对照抗体和同种型对照抗体一起孵育来制备细胞，以用于流式细胞术。5μg/mL Alexa Fluor 647AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人类IgG(H+L)(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoReserach))用于二级检测且8.25nMYoPro1(英杰公司(Invitrogen))用于活/死细胞染色。然后将细胞在BD FACSCanto II流式细胞仪上运行以检测抗CD112R抗体结合。
在波1中，超过1200种抗体被确定为与293T细胞上瞬时表达的人CD112R受体结合。其中，发现216种抗体与Jurkat细胞上表达的内源性人CD112R受体结合，并且也作为CD112R活性的拮抗剂起作用。为了鉴定与CD112R的食蟹猴同源物交叉反应的抗体，对>1200个重组人结合剂的组测试了与在HEK293T细胞上瞬时表达的重组食蟹猴CD112R的结合。发现该组的274种抗体与食蟹猴CD112R结合，仅发现其中的两种(11E4和1E1)与在原代食蟹猴T细胞上表达的内源性食蟹猴CD112R结合。
第二波和抗体选择
除XMG2kl品系外，还进行了第二波的Xenomouse免疫接种，这些免疫接种涉及定制的XMG2 CD112R敲除(KO)小鼠品系。基本上如上所述产生杂交瘤细胞，并且图3中描述的筛选测定用于鉴定和选择针对人CD112R的抗体。图4B和4C显示了来自第二波的收获物6-9的代表性数据。第二波产生了超过1300个人CD112R特异性抗体，其中350个导致了NFAT-荧光素酶信号的3倍或更高诱导，这通过Jurkat RGA确定。在重组人CD112R结合剂的波2组中，只有336个与293T细胞上瞬时表达的重组食蟹猴CD112R结合，并且只有27个抗体与原代食蟹猴T细胞上表达的内源性食蟹猴CD112R结合。
图5A和5B中提供了来自第一波和第二波的收获物的抗体特征的总结。显示出通过Jurkat RGA确定的拮抗剂功能和通过人和食蟹猴原代细胞结合测定确定的抗原结合活性的抗体被推进到后续的特征筛选、测序和亲和力测定。
用可溶性hCD112R情况下抗hCD112R抗体的高通量KinExA亲和力排序
使用高通量(HT)KinExA方法并使用100pM的Kd截留对选择的针对人CD112R的特异性单克隆抗体进行亲和力排序。这种方法是基于这样的理论：当抗体与在Kd截留处的抗原浓度平衡，并且与小于Kd截留浓度的Ab浓度平衡时，如果其Kd为100pM或更低，那么平衡时存在的游离Ab将是50％或更低。
简单地说，实验是通过在PBS/0.05％ NaN3/0.01％ BSA中，将25pM的每个抗体与或不与100pM的hCD112R平衡，在室温下持续24小时完成的。在平衡状态下，用KinExA测量存在于平衡混合物和单独的抗体管中的游离抗体。用涂有hCD112R的PMMA珠来捕获游离的Ab，并使用Mu抗hIgG2、G3、G4+抗muIgG(H+L)Alexa647的混合物进行检测。
单独由抗体产生的KinExA信号被认为是100％游离的，并且由在抗原存在下测量的信号计算％抑制游离分数(IFF)，如下所示：
Figure BDA0004122365630001061
显示出最低％IFF的抗体具有最高的亲和力；相反，显示出最高％IFF的抗体具有最低的亲和力，并且它们可以通过在图中绘制％IFF来进行排序。给出50％或更少的IFF的单克隆抗体应该通过了100pM的Kd截留，这意味着它们具有100pM或更低的Kd。
结果示于图6中。在所分析的十种抗体中，八种抗体的KD低于100pM，只有两种抗体的KD高于100pM。
CD112R拮抗剂抗体的分子拯救和测序
对选定的CD112R抗体的重链和轻链进行分子测序。简单地说，使用Qiagen RNeasymini或Invitrogen mRNA catcher plus试剂盒，自含有产生CD112R拮抗剂抗体的杂交瘤细胞的孔纯化RNA(总RNA或mRNA)。经纯化的RNA用于使用经由逆转录的cDNA合成、接着聚合酶链反应(RT-PCR)来扩增抗体重链和轻链可变区(V)基因。使用Qiagen单步逆转录酶PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得完全人抗体γ重链。此方法用于自RNA模板产生第一链cDNA，接着使用多重PCR扩增γ重链的可变区。将5'γ链特异性引物与抗体重链的信号序列退火，而3'引物与γ恒定域的区域退火。使用Qiagen单步逆转录酶PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得完全人类κ轻链。此方法用于自RNA模板产生第一链cDNA，接着使用多重PCR扩增κ轻链的可变区。5'κ轻链特异性引物与抗体轻链的信号序列黏结，而3'引物与κ恒定域的区域黏结。使用Qiagen单步逆转录酶PCR试剂盒(凯杰公司(Qiagen))获得完全人类λ轻链。此方法用于自RNA模板产生第一链cDNA，接着使用多重PCR扩增λ轻链的可变区。将5'λ轻链特异性引物与轻链的信号序列退火，而3'引物与λ恒定域的区域退火。
使用核酸外切酶I和碱性磷酸酶以酶法纯化扩增的cDNA并对纯化的PCR产物直接测序。通过生物信息学方法，自对应核酸序列推导出氨基酸序列。各杂交瘤样品完成两次另外的独立的RT-PCR扩增和测序循环，以证实观察到的任何突变并非PCR的结果。接着分析衍生的氨基酸序列，以确定抗体的种系序列起源，且鉴别与种系序列的偏差。将对应于测序抗体的互补决定区(CDR)的氨基酸序列比对，且这些比对用于通过类似性将纯系分组。还分析了序列的“热点”(经计算预测或根据经验确定对分子的表达、纯化、热稳定性、胶体稳定性、长期储存稳定性、体内药代动力学和/或免疫原性有负面影响的残基)。序列分析的结果如图7A所示。图7B列出了用于序列多样性分析的抗体，并指出了VH种系和HC CDR3残基。还列出了由Jurkat RGA确定的每个抗体的IC50(nM)。基于序列多样性分析和热点分析，将图7B的抗体列表缩小到以下抗体，以进入下一轮筛选：1E1、11E4、27G12、29E10、31B3和24F1。
人CD112R受体-配体竞争测定
使用流式细胞仪在珠上测试人CD112R结合杂交瘤上清液的阻断人CD112L的能力，具体方法如下。在FACS缓冲液中，将生物素化的人CD112R-Fc捕获在抗生蛋白链菌素聚苯乙烯珠(Spherotech公司，目录号SVP-60-5)上并在室温下孵育30分钟。将珠用FACS缓冲液洗涤两次，离心以沉淀珠，将上清液去除并重悬于FACS缓冲液中以去除未结合的蛋白。将生物素化的人CD112R涂层珠添加到96孔板中。添加杂交瘤上清液样品，使其最终为5μg/mL，将珠重悬并在室温下孵育1小时。添加在FACS缓冲液中配制的ZenonTMAlexa Fluor647(分子探针公司(Molecular Probes)，目录号Z25408)标记的CD112-huFc配体(根据制造商描述的方案标记)，最终浓度为370ng/mL，在黑暗中在室温下孵育15分钟。将珠用FACS缓冲液洗涤一次，离心以沉淀珠，将上清液去除并重悬于FACS缓冲液中以去除未结合的配体。然后将样品重悬于FACS缓冲液中，并且用Intellicyt HyperCyt自动取样器在BD AccuriTM流式细胞仪上读取样品。
结果示于图8中。如该图所示，所有六种抗体(1E1、11E4、27G12、29E10、31B3和24F1)都表现出显著的抑制活性，阻止约90％或更多的CD112配体与CD112R受体结合。六种抗体的抑制活性与两种参考抗CD112R抗体PL-52575和PL-52577(IC50分别为0.12nM和0.10nM)相当。
CD112R抗体先导小组的基于竞争的分组
利用Octet HTX平台，对选定的人CD112R结合杂交瘤上清液进行了基于竞争的分组测试。在包含10mM Tris、0.1％Triton、150mM NaCl、1mM CaCl2、0.1mg/mL BSA的测定缓冲液(pH7.4)中，以2ug/mL将抗体上样到抗HuFc(动力学)生物传感器ForteBio(目录号18-5064)上，持续两分钟。随后将生物传感器用测定缓冲液中的50μg/mL不相关的HuIgG2阻断五分钟。将1μg/mL的CD112R在测定缓冲液中结合两分钟，然后将生物传感器在测定缓冲液中浸泡一分钟以建立基线信号。在建立基线信号后，测试2μg/mL的抗体(与生物传感器结合的抗体不同)与CD112R结合的能力是否竞争超过生物传感器结合的抗体。使用ForteBioHT数据分析软件V11.1分析数据，并且确定了第二抗体结合步骤结束时的信号。如果第二抗体结合步骤结束时的信号与基线不同，那么该第二抗体与CD112R的结合超过了第一抗体与CD112R的结合。
此测定的步骤的示意图如图9A所示。在该示意图中，抗体31B3与生物传感器结合。如果在第二抗体结合步骤中使用的抗体与结合到生物传感器上的抗体相同，那么信号相对于基线不会发生变化。见水蓝色的线。然而，如果在第二抗体结合步骤中使用的抗体与结合到生物传感器上的抗体不同(例如，24F1)，并且信号高于基线信号，那么将该第二抗体置于A组。见紫色的线。如果在第二抗体结合步骤中使用的抗体与结合到生物传感器上的抗体不同，并且信号不高于基线，那么将该抗体置于B组。
结果示于图9B中。如该图所示，抗体24F1、27G12、29E10、1E1和11E4都相互竞争，被分配到A组。抗体31B3不与其他抗体竞争，因此被分配到B组。
对原代人和食蟹猴T细胞的结合确认
基本上如上所述制备和分析原代人和食蟹猴T细胞。将含有抗体1E1、11E4、27G12、29E10、31B3和24F1的耗尽型杂交瘤培养基上清液定量，然后针对在原代T细胞的表面上结合进行滴定。使利用Prism的曲线拟合分析确定与原代细胞结合的EC50值。
对于所有抗体1E1、11E4、27G12、29E10、31B3和24F1，与人T细胞结合的EC50值在与食蟹猴PBMC结合的EC50值的10倍以内。
简单地说，将培养的人T细胞和食蟹猴PBMC与先导小组一起孵育，起始浓度为3μg/mL(对于人)或5μg/mL(对于食蟹猴)，并以1比3滴定，最低浓度为0.001μg/mL(对于人)和0.002μg/mL(对于食蟹猴)。5μg/mL AF 647gt抗hu IgG Fc用作二级染色，YoPro1用作活/死细胞染色。除1E1和1E3外，所有的先导都使用了耗尽型上清液(ESN)，对于这两个先导，使用纯化的mAb。由于没有足够的11E4 ESN，所以在测定中使用了结构上与11E4接近的11B1。为了进行分析，FCS表达用于获得几何平均值，并且Screener用于确定与相对于同种型对照的倍数、滴定曲线和EC50值。
使用食蟹猴PBMC和人T细胞的测定结果分别显示在图10A和10B，以及表1中。图10A和10B的图绘制了相对于同种型对照信号的倍数随指定的抗体的对数浓度的变化。表1提供了每种抗体的EC50(ng/μL)。
表1
Figure BDA0004122365630001091
Figure BDA0004122365630001101
*与11E4结构上相似
如表1所示，1E1对由原代人和食蟹猴细胞表达的CD112R表现出最高的结合亲和力。29E10和24F1的EC50在两个物种之间以及相互之间非常相似。11B1对人的EC50很高，为0.108ng/μL，但对食蟹猴的EC50很低，为0.0281ng/μL。
效力确认
Jurkat人CD112R/NFAT-荧光素酶报道基因测定(RGA)基本上如上所述运行，用于对用耗尽型杂交瘤培养基上清液样品或纯化的抗体进行单点分析，将这些抗体在测定培养基中连续滴定2倍以确定该抗体小组的最终效力。结果示于图11A中，该图提供了NFAT荧光素酶诱导随指定的抗体的对数浓度变化绘制的图。如图11所示，所有测试的抗体都显示出作为CD112R拮抗剂的效力。重新耗尽型杂交瘤培养基上清液的效力非常接近(范围在1.3-3.5nM之间(图11B))。
CD112R抗体的热点工程化
通过将κ轻链的VL结构域与Cκ结构域融合并且VH结构域与CH1-CH2-CH3序列融合，将选定的抗CD112R抗体转化为IgG1亚型的标准抗体形式。该抗体同种型的CH2结构域通过引入N297G突变被工程化以降低效应子功能，并通过工程化的二硫键(R292C，V302C)以提高热稳定性；该抗体同种型为被命名为SEFL2-2。将抗CD112R抗体进行额外的工程化以去除“热点”，即经计算预测或根据经验确定对分子的表达、纯化、热稳定性、胶体稳定性、长期储存稳定性、体内药代动力学和/或免疫原性有负面影响的残基。这些热点处的各种氨基酸突变是根据保守性、共变性、化学相似性、结构模型的预测以及其他抗体工程活动的先验知识设计的。设计的工程化的抗体包括单一突变和突变组合两者。
通过对包含设计的可变结构域的合成DNA片段进行排序，并使用金门(GoldenGate)克隆方法将其插入稳定的哺乳动物表达载体中来克隆工程化的变体，该表达载体含有嘌呤霉素选择下的恒定HC结构域或潮霉素选择下的恒定LC结构域。通过在CHO-K1细胞中共转染HC和LC来表达抗体，并且使用嘌呤霉素和潮霉素选择稳定的表达。使用AmMagTM蛋白A磁珠(金斯瑞公司(GenScript))通过蛋白A亲和色谱法纯化抗体。通过完整质谱法确认每个分子的身份。对于每个变体，使用蛋白A传感器通过ForteBio Octet(颇尔生命科学公司(Pall Life Sciences))测量条件培养基中的表达效价。通过分析性尺寸排阻色谱法测量蛋白A亲和色谱法后存在的高分子量(％HMW)材料的百分比，并且通过使用LabChip GXII(珀金埃尔默公司)的非还原性微毛细管电泳中主峰的百分比测量纯度。使用Prometheus(诺坦普公司(Nanotemper))通过DSF测量第一熔化转变的Tm(Tm1)和起始聚集温度(Tagg)。通过如上所述的CD112R Jurkat报道基因测定抗体活性，对两次独立测量进行平均。工程化的变体的分析结果如下表2所示。
CD112R抗体的框架工程化
通过将每个抗体的CDR嫁接到选定的替代的人框架上(优先选择表现良好的VH1、VH3、VH5、VK1和VK3种系)，将抗CD112R抗体11E4(包含SEQ ID NO 101和102对应的HC可变区序列和LC可变区序列)工程化以提高可制造性。通过考虑序列的相似性来选择替代的框架。仔细检查移植前和移植后的序列，特别是在移植连接处，并且在某些情况下，设计靶向的回复突变以提供保留CDR环的功能构象的最佳机会。
通过对包含设计的可变结构域的合成DNA片段进行排序，并使用金门克隆方法将其插入稳定的哺乳动物表达载体中来克隆框架工程化的变体，该表达载体含有恒定HC活LC结构域，并且使用AmMagTM蛋白A磁珠(金斯瑞公司)通过蛋白A亲和色谱法纯化该克隆框架工程化的变体。通过完整质谱法确认每个变体的身份。对于每个变体，使用蛋白A传感器通过ForteBio Octet(颇尔生命科学公司(Pall Life Sciences))测量条件培养基中的表达效价。通过分析性尺寸排阻色谱法测量蛋白A亲和色谱法后存在的高分子量(％HMW)材料的百分比，并且通过使用LabChip GXII(珀金埃尔默公司)的非还原性微毛细管电泳中主峰的百分比测量纯度。使用Prometheus(诺坦普公司)通过DSF测量第一熔化转变的Tm。将纯化的样品在40℃下孵育2周，并且通过分析性尺寸排阻色谱法确定主峰的变化百分比。通过如上所述的CD112R Jurkat报道基因测定抗体活性，对两次独立测量进行平均。工程化的变体的分析结果如表3所示。
CD112R抗体的酵母展示工程化
将抗CD112R抗体31B3、11E4、29E10、1E1.016、和24F1通过酵母展示工程化以提高可制造性并增加与CD112R的结合。11E4和1E1.016的文库设计采用了一式三份的跨CDR的CDR步移，以覆盖所有的CDR氨基酸，包括化学热点易感性(chemical hotspotliabilities)。其他4种抗体的文库围绕它们的化学热点易感性和预测会导致不良表面特性的残基专门设计，这些残基通过BioLuminate计算模型软件包(
Figure BDA0004122365630001121
有限公司(
Figure BDA0004122365630001122
LLC)，纽约，纽约州，2020)的同源性建模和补丁分析确定。使用抗生蛋白链菌素PE作为二级荧光，针对与生物素缀合的重组CD112R细胞外结构域(ECD)高度结合，利用荧光激活细胞分选法(FACS)对文库进行分选。用针对HC和LC的FW1和FW4结构域的特异性引物扩增存在于分类结合/显示双阳性池和显示阳性池中的可变结构域，并在Illumina MiSeq上进行2x 300bp运行下的NGS分析。通过共同频率分析处理数据后选出突变，其中将阳性结合氨基酸频率的比率除以阳性展示氨基酸频率，然后将其相对于亲本序列比率归一化。富集值大于或等于亲本序列的序列被视为是有益的或可耐受的多样性，并被用于亲和力成熟后的额外合理抗体工程化。为了选择改进的亲和力，使用来自HC和LC文库的结合剂池的序列构建新的链改组文库，其结合力大于或等于亲本。然后对这些文库进行3轮富集，以获得在每轮浓度降低时保留与酵母上的CD112R结合的序列。随后对单个酵母克隆进行结合分析和测序，得到选定的亲和力成熟/性能差的修复变体。如上所述，将变体克隆到重组表达系统中。工程化的变体的分析结果如下表4和5所示。
实例4
该实例表明了为表征工具TIGIT抗体而进行的初步生物化学和功能实验。
使用瞬时表达人TIGIT的CHO-S细胞对TIGIT抗体10A7(Genentech TIGIT抗体)和MBSA43(eBioscienceTM目录号16-9500-85)进行竞争性受体-配体(R-L)结合测定。简单地说，将表达人TIGIT的CHO-S细胞与抗体样品混合，并且在4℃下在FACS缓冲液(1X PBSpH7.4+2％胎牛血清)中孵育1小时。然后将具有结合的样品的细胞与2.5μg/mL huCD155-Fc-Alexa 647(内部产生并标记)或15μg/mL CD112-Fc-Alexa 647(希诺生物公司(SinoBiological)10005-H02H；内部标记)在4℃下一起孵育45分钟。然后添加7-AAD(西格玛公司，目录号A9400-5MG；7.5μg/mL)细胞活力染剂，并且将细胞在4℃下进一步孵育15分钟，洗涤两次，并重悬于FACS缓冲液中。使用BD AccuriTM流式细胞仪和Intellicyt HyperCyt自动取样器分析样品。结果示于图12A和12B中。图12A是TIGIT与CD155-Fc结合的抑制百分比随工具TIGIT抗体浓度变化绘制的图。
图12B是与CD112-Fc结合的抑制百分比随抗体浓度变化的图。图12A和12B中显示的结果表明10A7和MBSA43工具抗体抑制CD155和CD112与TIGIT两者的相互作用。
进行额外的结合测定，以确定工具TIGIT抗体是否能抑制293T细胞内源性表达的CD226与CD155之间的结合相互作用。293T细胞内源性地表达高水平的CD155。将293T细胞用人TIGIT(TIGIT-293细胞)瞬时转染或模拟转染(模拟物-293或293T模拟物)。在没有工具TIGIT抗体的情况下，由TIGIT-293细胞表达的TIGIT阻断了CD226与内源性CD155的结合，但在模拟物-293细胞(不瞬时表达TIGIT)的情况下没有阻断。在工具TIGIT抗体存在的情况下，由TIGIT-293细胞表达的TIGIT被工具抗体结合，并被阻断与CD155结合，从而使CD226与CD155相互作用。图12C提供了测定的示意图。将TIGIT-293细胞或模拟物-293细胞与抗体样品(具有或不具有人CD226-Fc)以10ug/mL(研究开发公司(R&D)，666-DN)混合，并且在4℃下在FACS缓冲液(1X PBS pH7.4+2％胎牛血清)中孵育1小时。将细胞用FACS缓冲液洗涤2X，然后与Gt抗Hu IgG-Fc Alexa(杰克逊公司，109-605-098)和7-AAD(西格玛公司，9400-5MG)在4℃下一起孵育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤1X，并且重悬于FACS缓冲液中。使用BDAccuriTM流式细胞仪和Intellicyt HyperCyt自动取样器分析样品。结果示于图12D-12E中。图12D中的数据表明huCD226可以结合内源性表达huCD155的293T模拟细胞(空心圆)。在过表达的huTIGIT(实心正方形)存在的情况下，阻断CD226与huCD155的顺式相互作用。图12E显示，用TIGIT工具抗体10A7(空心圆)或MBSA43(实心正方形)处理恢复了CD226与CD155结合的能力，因为该工具抗体阻断了TIGIT-CD155的顺式相互作用。包括用不相关的同种型对照(半空心菱形)处理细胞，以证明CD226与CD155的结合被完全阻断(假定该同种型对照不与TIGIT结合)。数据支持两种工具TIGIT抗体都能中断CD155-TIGIT相互作用，并且10A7工具抗体更能中断TIGIT-CD155相互作用。
进行了IFN释放测定，以确定工具TIGIT抗体的功能效果。在IFN释放测定中，测量了由用CHO-K1-huCD155激活剂细胞刺激的原代人CD8+记忆T细胞释放的IFNγ。图12F中所示的结果证明只有MBSA43工具抗体能够诱导IFNγ释放。与MBSA43不同，10A7抗体不能激活由刺激的T细胞释放的IFNγ。
在IL-2启动子的控制下进行荧光素酶活性测定以确定工具TIGIT抗体的功能效果。在存在工具抗体或同种型匹配抗体对照的情况下，通过表达人CD155和CD3-激活剂的CHO细胞刺激Jurkat T细胞进行IL-2启动子驱动的荧光素酶报道基因表达。图12G中所示的结果与图12F的结果一致，因为只有MBSA43工具抗体能够与TIGIT结合并阻断CD155-TIGIT相互作用，导致T细胞激活诱导的事件(例如，IFN释放、IL-2启动子的激活)恢复。
这些结果示出，TIGIT工具抗体MBSA43和10A7均能与TIGIT结合并阻断TIGIT-CD155顺式相互作用，但只有MBSA43工具抗体能够阻断TIGIT介导的T细胞抑制。
使用原代食蟹猴T细胞和在CHO和293T细胞上瞬时表达的食蟹猴TIGIT，测试工具TIGIT抗体与食蟹猴TIGIT结合的能力。将瞬时表达食蟹猴TIGIT或仅表达载体的293T细胞与包含工具抗体MBSA43、10A7或1F4(Genentech TIGIT抗体)的样品混合，并且在4℃下在FACS缓冲液中孵育1小时。将细胞用FACS缓冲液洗涤2X，然后与山羊(Gt)抗Hu IgG-FcAlexa-647或Gt抗Mu IgG-Fc Alexa-647(杰克逊公司，115-605-071)以及7-AAD在4℃下一起孵育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤1X，并且重悬于FACS缓冲液中。使用BD AccuriTM流式细胞仪和Intellicyt HyperCyt自动取样器分析样品。
结果示于图12H和12I中。图12H显示1F4(实心圆)、10A7(实心正方形)和MBSA43(实心三角形)中的每一个都结合在293T细胞中瞬时表达的食蟹猴TIGIT。随着抗体浓度的增加，观察到几何平均值倍数与仅有载体的对照的差异的增加，而者IgG同种型对照(空心菱形)情况下没有观察到结合。然而，只有MBSA43和1F4表现出与原代激活的食蟹猴T细胞的结合(图12I)。10A7的FACS图与同种型对照抗体的FACS图重叠，这表明10A7不与原代激活的食蟹猴T细胞结合(图12I)。
实例5
该实例表明了TIGIT单克隆抗体(mAb)的产生。
抗TIGIT免疫应答的产生
小鼠品系与免疫接种
基本上如上所述，通过对
Figure BDA0004122365630001161
转基因进行免疫接种来产生针对人TIGIT的完全人抗体。来自XMG4和XMG2/>
Figure BDA0004122365630001162
品系的动物用于这些免疫接种。多种免疫原和免疫接种途径用于产生抗人TIGIT免疫应答。使用瞬时转染的悬浮CHO细胞，通过Accuri流式细胞仪(BD生命科学公司(BD Biosciences))上的活细胞FACS分析，监测TIGIT特异性血清效价。将针对人TIGIT具有最高抗原特异性血清效价的动物处死，用于产生杂交瘤(Kohler和Milstein,1975)。基本上如实例3中所述产生杂交瘤。
TIGIT特异性结合抗体的选择
采用几种筛选测定方法来鉴定和选择抗人TIGIT抗体(图13)。
通过活细胞FACS分析，监测TIGIT特异性血清效价。测试耗尽型杂交瘤上清液与在CHO-S样品上瞬时表达的人或食蟹猴TIGIT的结合，并使用BD AccuriTM流式细胞仪和Intellicyt HyperCyt自动取样器或通过Cell Insight进行分析。为了基于FACS的筛选，使用PEI MAX将CHO-S细胞用编码人或食蟹猴TIGIT的哺乳动物表达构建体瞬时转染。转染后3小时，添加5mM丁酸钠并孵育24小时。第二天，将15μL耗尽型杂交瘤培养基添加至384孔FMAT板的各孔中。将转染和模拟转染的CHO-S细胞(共25,000个细胞/孔)与耗尽型杂交瘤样品混合，并且在4℃下在FACS缓冲液中孵育1小时。1小时后，将细胞用FACS缓冲液(1X PBS pH7.4+2％ FBS)洗涤2X，然后与Gt抗Hu IgG-Fc Alexa-647(杰克逊公司，109-605-098)或Gt抗MuIgG-Fc Alexa-647(杰克逊公司，115-605-071)以及7-AAD(西格玛公司，9400-5MG)在4℃下一起孵育15分钟。将细胞用FACS缓冲液洗涤1X，并且重悬于FACS缓冲液中。使用BD AccuriTM流式细胞仪和Intellicyt HyperCyt自动取样器分析样品。为了成像筛选，分别使用PEIMAX或293Fectin将CHO-S或HEK293T细胞用编码TIGIT的哺乳动物表达构建体瞬时转染。第二天，将15μL耗尽型杂交瘤培养基添加至384孔FMAT板的各孔中。然后将转染的细胞(27万/mL)、核染剂Hoechst 33342(7.5μg/mL)和第二检测抗体(0.75μg/mL-山羊抗人IgG(H+L)Alexa 488(杰克森免疫研究公司))混合，并且将30μL的此混合物添加至384孔FMAT板的各孔中。在约3小时之后，使用AquaMax板式读数器吸出上清液，且使用多点仪器将30μLFACS缓冲液添加至各孔中。将板置于Big Bear板式震荡器上，以使细胞均匀分布在孔中，接着在Cell Insight平台上使用Cell Health Bio-App读取。
使用这些技术，鉴定了如表6所概述的产生对人TIGIT特异性的抗体的杂交瘤细胞。
表6
收获 抗原特异性结合剂
1 89
2 288
4 904
5 708
6 608
7 684
Jurkat人TIGIT/IL-2-荧光素酶报道基因测定(RGA)
为了筛选能够通过阻断TIGIT-CD155相互作用而增强T细胞活性的杂交瘤或纯化的抗TIGIT抗体，采用了Jurkat细胞中的IL-2报道基因测定(RGA)。RGA与实例2中描述的非常相似，除了以下情况：将稳定表达人TIGIT(不是CD112R)和IL-2-荧光素酶报道子的Jurkat细胞(普洛麦格公司，目录号CS191103A)在补充有10％胎牛血清(西格玛公司)、2mML-谷氨酰胺(西格玛公司)、10mM HEPES(海克隆公司，通用电气医疗集团生命科学部)、1XMEM NEAA(西格玛公司)、1X丙酮酸钠(西格玛公司)、500ug/mL遗传霉素(英杰公司)和200ug/mL潮霉素B(英杰公司)的RPMI 1640培养基(西格玛公司)中培养。通过与稳定表达人CD155和人T细胞衔接子(普洛麦格公司，目录号CS191104A)的中国仓鼠卵巢(CHO)-K1细胞共培养通过T细胞受体的接合，刺激GloResponseTMIL-2-luc2P/TIGIT/Jurkat报道细胞系(普洛麦格公司，目录号CS191103A)。在含有营养混合物F12 HAM(西格玛公司)、10％胎牛血清、10mM HEPES、500μg/mL遗传霉素和200μg/mL潮霉素B的全生长培养基中，将1x 10E4个CHO-K1-CD155+细胞接种在白色半区96孔板(Costar公司，目录号3688)中，在37℃/5％ CO2下过夜。图14A示出了RGA的示意图。过夜孵育后，在杂交瘤上清或抗体(具有各自的对照)存在的情况下，在测定培养基(补充有1％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺、10mM HEPES的RPMI1640培养基)中，用5x 104个Jurkat IL-2Luc/TIGIT细胞替代生长培养基，并且在37℃/5％CO2下孵育18小时。根据制造商的推荐，使用Bio-GloTM荧光素酶测定系统(普洛麦格公司，目录号G7940)确定每个孔中的报道信号。使用EnVision酶标仪(珀金埃尔默公司(PerkinElmer))检测发光。
图14B中示出了活性抗体的选择。如图14B中所示，TIGIT抗体43B7、11A3、39D2、66H9、28B8、55G7、4G10、和48B7性能均优于工具抗体MBSA43。将这些抗体用滴定法运行，以确定抗TIGIT抗体的效力。表7中示出了Jurkat人TIGIT/IL-2-荧光素酶RGA中的这些抗TIGIT抗体的活性。
表7
Figure BDA0004122365630001181
Figure BDA0004122365630001191
TIGIT功能性阻断测定(原代T细胞测定)
为了筛选能够通过阻断TIGIT-CD155相互作用而增强T细胞活性的纯化的抗TIGIT抗体，采用了来自原代人CD8记忆T细胞的IFN-γ释放。使用EasySepTM人CD8+ve记忆T细胞富集试剂盒(干细胞公司(StemCell)，目录号19159)，从纯化的原代人T细胞(生物专业公司，目录号215-01-10)中分离CD8记忆T细胞，并且将该CD8记忆T细胞用1μg/mL固定抗CD3(伊生物科学公司，目录号16-0037)+1μg/ml抗CD28(BD PharMingen公司，目录号555725)+10ng/mL rhIL-2(研究开发系统公司(R&D Systems)，目录号202-IL-050/CF)在37℃/5％ CO2下预刺激7天。)。在全生长培养基中，将1x 104个γ辐射的CHO-K1-CD155+细胞接种在黑色半区96孔板(Costar公司，目录号3875)中，在37℃/5％ CO2下过夜。过夜孵育后，在连续稀释的抗体(具有各自的对照)存在的情况下，在ICM(免疫细胞培养基：RPMI 1640，10％胎牛血清，10mM HEPES，2mM L-谷氨酰胺，1X MEM NEAA，1X丙酮酸钠和55mM 2-巯基乙醇(吉布科公司))中，用5x 103个CD8记忆T细胞替换生长培养基，并且在37℃/5％CO2下孵育48小时。然后根据制造商的说明，通过时间解析荧光(HTRF)(浠思公司(Cisbio)，目录号62IFNPEC)测试培养基上清液的IFN-γ水平。使用EnVision酶标仪(珀金埃尔默公司)检测荧光。
结果示于图14C中。抗TIGIT抗体性能与工具抗体MBSA43相似或优于工具抗体MBSA43。原代CD8记忆T细胞测定中的抗TIGIT抗体39D2、43B7、和28B8的活性分别为380pM、90pM、和160pM。将工具TIGIT抗体MBSA43作为对照运行，并且该工具抗体的效力为1900pM。
TIGIT的原代细胞结合测定
通过流式细胞术测试杂交瘤上清液与由原代人和食蟹猴细胞表达的TIGIT的结合。对于人类原代细胞结合测定，将经纯化的人类T细胞(生物专业公司(BiologicalSpecialty Corp.))解冻且以2.5×106个细胞/mL的浓度悬浮。在37℃/5％ CO2下将T细胞在预涂5μg/mL抗小鼠IgG Fc(皮尔斯公司)的板中用5μg/mL抗人CD3克隆OKT3(伊生物科学公司)和1μg/mL抗人CD28(BD Pharmingen公司)刺激72小时。72小时后，将细胞去除，洗涤并且以0.5x 106个细胞/mL的浓度用10ng/mL的IL-2(派普泰克公司(Pepro Tech))悬浮。然后将细胞在37℃/5％ CO2下再孵育48至72小时。对于食蟹猕猴原代细胞结合测定，将食蟹猕猴PBMC(SNBL)解冻且以在4×106与5×106个细胞/mL之间的浓度悬浮。在37℃/5％ CO2下将PBMC在预涂5μg/mL抗小鼠IgG Fc(皮尔斯公司(Pierce))的板中用1μg/mL抗人类CD3纯系SP34(BD Pharmingen公司)和1μg/mL抗人类CD28(BD Pharmingen公司)刺激72小时。72小时后，将细胞去除，洗涤并且以0.5x 10E6个细胞/mL的浓度用20ng/mL的IL-2(派普泰克公司)悬浮。然后将细胞在37℃/5％ CO2下再孵育48至72小时。在最终孵育之后，通过以1μg/mL最终浓度与标准化的杂交瘤上清液、阳性对照抗体和同种型对照抗体一起孵育来制备细胞，以用于流式细胞术。5μg/mL Alexa Fluor 647AffiniPure F(ab’)2片段山羊抗人类IgG(H+L)(杰克逊免疫研究公司(Jackson ImmunoReserach))用于二级检测且8.25nM YoPro1(英杰公司(Invitrogen))用于活/死细胞染色。然后将细胞在BD FACSCanto II流式细胞仪上运行以检测抗TIGIT抗体结合。结果表示为相对于同种型对照的几何平均值的表达TIGIT的细胞的FACS几何平均值倍数，并对于结合而言以“有”“无”表示(表8)。
表8
Figure BDA0004122365630001211
如表8所示，只有四种抗体(43B7、48B7、55G7、和66H9)对于原代食蟹猴和原代人细胞两者都是结合剂。
受体–配体竞争测定
然后测试结合TIGIT的杂交瘤上清液阻断TIGIT结合配体的能力。在抗原特异性杂交瘤上清液样品上，使用FACS，在瞬时表达人TIGIT的CHO-s细胞上如下进行竞争性结合测定。将表达人TIGIT的CHO-S细胞与抗体样品(对TIGIT特异性的杂交瘤上清液)混合，并且在4℃下孵育1小时，然后洗涤两次。然后将具有结合样品的细胞与huCD155-Fc-Alexa 647(内部产生并标记)或CD112-Fc-Alexa 647(希诺生物公司，10005-H02H；内部标记)在4℃下一起孵育45分钟。接着添加7-AAD细胞活力染剂，且将细胞在4℃下进一步孵育15分钟，洗涤两次且再悬浮于FACS缓冲液中。使用BD AccuriTM流式细胞仪和Intellicyt HyperCyt自动取样器分析样品。表9中的数据反映分别在1.7μg/mL或1ug/mL下人CD155或CD112与人TIGIT的结合的抑制百分比。
表9
Figure BDA0004122365630001221
TIGIT亲和力测定
使用OCTET生物传感器进行抗TIGIT mAb的亲和力测定。将人TIGIT mAb以2μg/mL捕获在抗huIgG FC捕获(AHC)针头(目录号18-5060)上，用于动力学研究。将小鼠抗TIGIT对照mAb MBSA43(目录号16-9500-85)以2μg/ml捕获在抗小鼠IgG Fc捕获针头上。通过将蛋白质从200nM或100nM的起始浓度的2倍滴定至3nM，评估huTIGIT(PL44403)和食蟹猴TIGIT(PL40461)的结合。由于huTIGIT含有单Fc标签，因此利用含有50μg/ml不相关的IgG2的阻断步骤来阻断Octet针头上的抗Fc捕获试剂。对于huTIGIT亲和力测定，缔合被监测5分钟，解离被监测20分钟。在食蟹猴TIGIT的情况下，缔合被监测5min，并且解离被监测5min。这些实验中使用的测定缓冲液是10mM Tris、150mM NaCL、1mM CaCl2、0.1mg/ml牛血清白蛋白(BSA)、0.13％ Triton X-100，pH 7.6。表10中的数据表示TIGIT mAb对人或食蟹猴TIGIT的相对亲和力。由于拟合很差，没有提供2种mAb的食蟹猴TIGIT的值。基于20分钟内最低5％的解离，解离的检测极限为4e-5。
表10
Figure BDA0004122365630001231
NB＝无结合
如表10所示，每一种抗体对人TIGIT表现出高亲和力，并且大多数抗体对食蟹猴TIGIT表现出高亲和力。
TIGIT抗体的选择
上述筛选测定和图13中的结果导致鉴定出少于10种独特的抗体，包括4G10、11A3、28B8、43B7、66H9、39D2、和55G7。此类抗体显示出通过Jurkat RGA确定的拮抗剂功能和通过人和食蟹猴原代细胞结合测定确定的抗原结合活性，并且因此这些抗体被推进到后续的特征筛选、测序和亲和力测定。这些TIGIT抗体是性能优于工具TIGIT抗体MBSA43和10A7的抗体。表11提供了选定的TIGIT抗体与工具抗体的比较。如该表所示，并如图14A和14B所支持，选定的TIGIT抗体与工具抗体相比表现出更好的活性。
表11
Figure BDA0004122365630001232
Figure BDA0004122365630001241
*活性优于工具抗体MBSA43
TIGIT抗体的分子拯救和测序
对选择的TIGIT抗体的重链和轻链基本上如实例3中所述进行分子测序，除了从含有产生TIGIT拮抗剂抗体的杂交瘤细胞的孔中纯化RNA(总RNA或mRNA)。
TIGIT抗体的热点工程化
基本上如实例3中所述，将从XenoMouse活动中选择的抗TIGIT抗体进行工程化以去除“热点”，即经计算预测或根据经验确定对分子的表达、纯化、热稳定性、胶体稳定性、长期储存稳定性、体内药代动力学和/或免疫原性有负面影响的残基。
将热点工程化的变体通过共转染HC和LC在ExpiCHO细胞(生命技术公司(LifeTechnologies))中进行克隆，瞬时表达，并且通过蛋白A亲和色谱法纯化。通过如上所述的TIGIT Jurkat报道基因测定抗体活性。工程化的变体的分析结果如下表12所示。
TIGIT抗体的框架嫁接
通过将每个抗体的CDR嫁接到选定的替代的人框架上(优先选择表现良好的VH1、VH3、VH5、VK1、VK3和VL2种系)，将抗TIGIT抗体55G7.041(分别包含SEQ ID NO 1923和1924的LC可变区序列和HC可变区序列)、66H9.009(分别包含SEQ ID NO 221和222的HC可变区序列和LC可变区序列)、43B7.002.015(分别包含SEQ ID NO 201和202的HC可变区序列和LC可变区序列)和58A7.003.008(分别包含SEQ ID NO 211和212的HC可变区序列和LC可变区序列)工程化以提高可制造性。通过考虑序列的相似性来选择每个亲本的替代框架。在每种情况下，仔细检查移植前和移植后的序列，特别是在移植连接处，并且在某些情况下，设计靶向的回复突变以提供保留CDR环的功能构象的最佳机会。
通过对包含设计的可变结构域的合成DNA片段进行排序，并使用金门克隆方法将其插入稳定的哺乳动物表达载体中来克隆框架工程化的变体，该表达载体含有恒定HC或LC结构域。将抗体通过在CHO-K1细胞中共转染HC和LC进行表达，并且使用MabSelect SuRe树脂(通用电气医疗集团生命科学部)，通过蛋白A亲和色谱法纯化。通过完整质谱法确认每个变体的身份。对于每个变体，使用蛋白A传感器通过ForteBio Octet(颇尔生命科学公司(Pall Life Sciences))测量条件培养基中的表达效价。通过分析性尺寸排阻色谱法测量蛋白A亲和色谱法后存在的高分子量(％HMW)材料的百分比，并且通过使用LabChip GXII(珀金埃尔默公司)的非还原性微毛细管电泳中主峰的百分比测量纯度。使用Prometheus(诺坦普公司)通过DSF测量第一熔化转变的Tm。将纯化的样品在40℃下孵育2周，并且通过分析性尺寸排阻色谱法确定主峰的变化百分比。通过如上所述的TIGIT Jurkat报道基因测定抗体活性，对两次独立测量进行平均。工程化的变体的分析结果如下表13所示。
TIGIT抗体的酵母展示优化
将抗TIGIT抗体43B7.002.015(包含SEQ ID NO 201和202对应的HC可变区序列和LC可变区序列)和58A7.003.008(包含SEQ ID NO 211和212对应的HC可变区序列和LC可变区序列)通过酵母展示工程化以提高可制造性并增加与TIGIT的结合。对于每个抗体，都产生文库，其中将所有六个CDR中的每一个可能的相邻的残基对通过使用简并NNK密码子同时突变为所有可能的氨基酸。将文库展示在BJ5464的酵母衍生物的表面，其中Fd结构域与α-凝集素的N末端融合，并且LC没有与酵母表面融合。通过Alexafluor 647缀合的抗Fab抗体的结合测量展示的效率。使用抗生蛋白链菌素PE最为二级荧光，利用荧光激活细胞分选法(FACS)对文库进行分选，用于与生物素缀合的重组TIGIT细胞外结构域(ECD)高度结合。用针对HC和LC的FW1和FW4结构域的特异性引物扩增存在于分类结合/显示双阳性池和显示阳性池中的可变结构域，并在Illumina MiSeq上进行2x 300bp运行下的NGS分析。通过共同频率分析处理数据后选出突变，其中将阳性结合氨基酸频率的比率除以阳性展示氨基酸频率，然后将其相对于亲本序列比率归一化。富集值大于或等于亲本序列的序列被视为是有益的或可耐受的多样性，并被用于亲和力成熟后的额外合理抗体工程化。
使用结构引导(58A7.003.008)、模型引导的接近对(43B7.002.015)和CDR NNK扫描文库(43B7.002.015和58A7.003.008)的组合，设计每个HC和LC的亲和力成熟酵母展示文库。在将这些HC或LC文库针对等于或大于亲本的TIGIT结合进行分类后，将4个文库在链改组文库中合并。在这里，将所有的文库设计混合在一起，以实现设计方法之间的不可知。如上所述，将文库展示在酵母的表面，并在每一连续轮中以增加的严格性针对与生物素标记的重组TIGIT ECD的高结合进行分选。选择具有高结合的克隆，并将这些克隆筛选为单个克隆，并且选择具有最高结合/展示比率的克隆进行测序。使用载体和恒定结构域引物扩增可变结构域，并将PCR产物提交给桑格(Sanger)测序。将引入化学易感性的序列从小组设计中删除。利用上述NGS富集分选数据的信息，对由BioLuminate建模套件(
Figure BDA0004122365630001261
有限公司)确定的化学易感性和电荷表面片进行突变。选择最终的工程化序列作为重组表达的单克隆抗体，用于进一步表征。
通过对包含设计的可变结构域的合成DNA片段进行排序，并使用金门克隆方法将其插入稳定的哺乳动物表达载体中来克隆靠前的展示工程化的变体，该表达载体含有嘌呤霉素选择下的恒定HC结构域或潮霉素选择下的恒定LC结构域。通过在CHO-K1细胞中共转染HC和LC来表达抗体，并且使用嘌呤霉素和潮霉素选择稳定的表达。使用AmMagTM蛋白A磁珠(金斯瑞公司(GenScript))通过蛋白A亲和色谱法纯化抗体。通过完整质谱法确认每个分子的身份。通过分析性尺寸排阻色谱法测量蛋白A亲和色谱法后存在的高分子量(％HMW)材料的百分比，并且通过使用LabChip GXII(珀金埃尔默公司)的非还原性微毛细管电泳中主峰的百分比测量纯度。通过如上所述的TIGIT Jurkat报道基因测定抗体活性。工程化的变体的分析结果如下表14和15所示。
工程化的TIGIT抗体和工具抗体的功能
使用CRISPR对表达TIGIT和IL-2-荧光素酶构建体的Jurkat T细胞修饰，以敲除(KO)CD226表达。将这些KO细胞用于Jurkat RGA中，并与表达TIGIT和IL-2-荧光素酶构建体的表达CD226的Jurkat细胞进行比较。将Jurkat细胞与如本文所述的CHO-K1-CD155+细胞共培养，并且测量荧光素酶活性。该实验中使用的抗体包括工具抗体MBSA43和工程化的TIGIT抗体(如上所述)AB1(43B7.002.015)和AB2(66H9.010)。
结果示于图15中。如图15所示，敲除CD266导致最大活性的显著下降(空心符号与实心符号)。这些数据支持TIGIT抗体阻断TIGIT-CD226顺式相互作用以预防TIGIT-CD226介导的信号抑制。这些数据还支持CD226参与有助于更强的TCR应答。在CD226存在的情况下，抗TIGIT mAb AB1和AB2(分别为实心圆和实心正方形)比MBSA43(实心菱形)更能阻断TIGIT-CD226相互作用，因为没有完全达到最大活性。当CD226被敲除时，AB1、AB2和MABSA43类似地阻断TIGIT-CD155相互作用。
实例6
该实例表明了本披露选择的抗体的结合亲和力。
使用表面等离子体共振(SPR)技术，在Biacore T200上表征抗TIGIT抗体与人TIGIT SEQ ID NO:1和食蟹猴TIGIT SEQ ID NO:2024的结合、以及抗CD112R抗体与人CD112R SEQ ID NO:3和CD112R(N81D)SEQ ID NO:2026的结合。详细地说，使用标准胺偶联试剂(通用电气医疗集团生命科学部)将来自Fab捕获试剂盒(电气医疗集团生命科学部)的抗人Fab抗体固定在CM5芯片的所有四个流通池上至大约6000-9000RU。在整个测定中，PBS加0.005％ P20用作仪器运行缓冲液。将具有固定的抗人Fab抗体的第一流通池仅用作背景对照。在第二、第三和第四流通池上捕获抗TIGIT或抗CD112R抗体至大约100-190RU。将浓度范围为0.78至100nM的人和食蟹猴TIGIT、人CD112R和CD112R(N81D)在样品缓冲液(PBS加0.1mg/ml BSA，0.005％ P20)中稀释，并且以50μl/min，将其注射到捕获的抗体表面，持续180秒缔合，并且持续300秒解离。解离结束后，使用10mM甘氨酸(pH 2.1)将抗Fab抗体表面再生。
使用Biacore T200评价软件3.0(通用电气医疗集团生命科学部)分析抗TIGIT抗体与人和食蟹猴TIGIT的结合数据、抗CD112R抗体与人CD112R和CD112R(N81D)的结合数据。所有数据均通过减去空白对照表面和仅注入样品缓冲液的空白循环进行双重参考。对于抗TIGIT抗体与人TIGIT的结合和抗CD112R抗体与人CD112R和CD112R(N81D)的结合，使用1:1动态结合模型，根据整体拟合计算缔合速率(ka)、离解速率(kd)、平衡解离常数(KD)以及最大结合应答(Rmax)。对于抗TIGIT抗体与食蟹猴TIGIT的结合，使用1:1稳态结合模型，根据整体拟合计算KD和Rmax。表16中示出了人TIGIT结合表征。表17中示出了食蟹猴TIGIT结合表征。表18中示出了人CD112R结合数据，并且表19中示出了人CD112R(N81D)结合表征。
实例7
该实例表明CD112R、TIGIT、与PD-1的组合阻断增加了T细胞应答的窗口。
为了评估CD112R与TIGIT组合阻断的效果，产生了同时表达CD112和CD155的CHOK1细胞。使这些细胞与T细胞接触，并且只有当TIGIT-CD155相互作用和CD112R-CD112相互作用被阻断时，预期这些细胞的TCR的激活引起IFNγ的释放。细胞测定系统的示意图如图16A所示。测试了三种不同的TIGIT抗体(43B7.002.015、66H9.009和58A7.002.008)，作为单一药剂显示出轻度的效果，但当与CD112R阻断抗体组合使用时，该测定中T细胞活性强烈增强(图16B)。
此外，将1:1抗体混合物对CD112R和TIGIT的阻断与双特异性抗体(bsAb)对其的阻断进行比较，其中在该测定中两种抗体都以IgG-scFv形式存在。单克隆抗体混合物对T细胞活性的影响如表20所示。这些对T细胞活性的影响与使用bsAb实现的影响相当，这表明这些受体独立地促进T细胞激活(bsAb的数据未显示)。
表20
Figure BDA0004122365630001291
()中提供了标准偏差；n＝3
在使用经肽脉冲处理的SK-MEL肿瘤细胞作为抗原呈递细胞(APC)的抗原特异性CTL测定中，评估了TIGIT、CD112R和PD-1中两个的双重阻断与三重阻断(阻断TIGIT、CD112R和PD-1中所有三个)的活性。图17A显示了对于PD-1和TIGIT的双重阻断、三重阻断(3x)、TIGIT的单一阻断和PD-1的单一阻断，pp65肽特异性CTL对经肽脉冲处理的肿瘤细胞的应答。图17B显示了对于CD112R和TIGIT的双重阻断、三重阻断(3x)、TIGIT的单一阻断和CD112R的单一阻断，pp65肽特异性CTL对经肽脉冲处理的肿瘤细胞的应答。图17C显示了对于PD-1和CD112R的双重阻断、三重阻断(3x)、CD112R的单一阻断和PD-1的单一阻断，pp65肽特异性CTL对经肽脉冲处理的肿瘤细胞的应答。预期和观察到的结果如图17D所示。
如图17A-17C所示，TIGIT、CD112R或PD-1的单一阻断(相对于同种型对照)略微增强了pp65肽特异性CTL对经肽脉冲处理的肿瘤细胞的应答，而双重阻断(TIGIT+CD112R、TIGIT+PD-1、CD112R+PD-1)中的每种情况进一步增强了pp65肽特异性CTL应答。在图17A-17C中的每一个中，显示出三重阻断针对肿瘤细胞的T细胞活性的最显著增加。通过比较该测定中计算出的预期增强窗口相比于观察到的增强窗口来评估不同组合的应答是否代表严格意义上的相加效应或协同效应(图17D)，结果发现，虽然TIGIT+PD-1或CD112R+PD-1组合的效应是相加的，但TIGIT+CD112R+PD-1的三重阻断的效应是协同的(图17D)。
实例8
该实例表明三重阻断增强了原代人肿瘤细胞培养物中的T/NK细胞应答。
通过用PD-1抗体(纳武单抗“Nivo”)、CD112R抗体(24F1)或TIGIT抗体(43B7.002.015)以及这些抗体中的两个或三个的组合来处理解离的人肿瘤细胞(伴随TIL)，并测量以IFNγ产生为代表的TIL应答，测试单一阻断、双重阻断和三重阻断对TIL的效应。同种型匹配抗体用作对照。在第3天和第6天进行测量，并且结果如图17E所示。
如图17E所示，与第6天相比，第3天的IFNγ产生更大。与单一阻断和双重阻断相比，用Nivo+43B7.002.015+24F1抗体的三重阻断在第3天和第6天都能诱导最高量的IFNγ产生。这些结果表明，在表达相对较低水平的这些检查点受体的原代TIL中(图17F和17G)，三者组合处理诱导了TIL活性的显著增强。有趣的是，观察到用a-PD-1抗体处理的TIL有上调的TIGIT表达(图17H)，而用α-TIGIT抗体处理的那些在培养期结束时有上调的PD-1(图17I)。这种表达谱与已发表的关于类似体外T细胞测定和接受a-PD-1治疗的患者的数据报告一致，这表明三重阻断将有效地增加患者的T细胞应答。
实例9
该实例提供了实例1、2、7和8的结果的讨论。
CD112R和TIGIT分别主要与CD112和CD155接合，并抑制T和NK细胞对肿瘤细胞的应答。我们证明，肿瘤细胞表达高水平的两种配体，因此，CD226的有效结合可能需要同时抑制CD112R和TIGIT，从而增强T/NK细胞活性。
我们开发了组合物，该组合物包含同时阻断CD112R和TIGIT的单克隆抗体的共配制混合物。该组合物的性能与形成双特异性分子的两种单克隆抗体的性能一样好。在体外测定中，这两种方式都显著提高了原代人T细胞活性，而且总体活性相当。此外，使用与PD-1阻断抗体组合的单克隆CD112R和TIGIT抗体的三重阻断进一步增强了T细胞活性，优于三者的任何单一或双重组合。
CD112R和TIGIT共阻断为PD-1/PD-L1的组合治疗提出了有希望的方法，因为三重阻断可以参与两个非冗余的共刺激路径，以提高T/NK细胞活性。其结果可能是比PD-1/L1单药疗法增加了疗效窗口，重要的是，减少了以下的可能性或克服了以下：肿瘤对单药疗法的抗性，如在PD-1/L1难治性患者中看到的。
实例10
该实例描述了在实例1-2和7-8的实验中使用的材料和方法。
Array Studio中的TCGA相关图生成
从TCGA数据集中提取代表目的基因转录水平的对数(FPKM)值，并绘制成散点图以显示成对的相关性。对TIGIT家族受体和PD-1及其配体进行了多种癌症适应症分析。
单个细胞RNA序列数据分析
先前已经描述了从五名人肝细胞癌患者中分离出的T细胞的单细胞RNA seq分析(Zheng等人,2017)。对该数据集查询目的基因，并使用Tamatoa生成2D和箱形图。特别地，查询了肿瘤组织中TIGIT、CD112R、CD226和PD-1在T细胞上的表达。
CD112R结合测定与FACS染色
为评估抗CD112R工具抗体(PL-52576、PL-52575、PL-52577)对人CD112R的结合，将转染以表达CD112R的CHO K1细胞与抗CD112R抗体、CD112配体Fc(希诺生物公司)、或同种型对照在4C下一起孵育1小时，并且用APC缀合的抗人IgG第二抗体(研究开发系统公司)或PE缀合的抗小鼠IgG第二抗体(杰克森免疫研究公司)检测结合的抗体。
为了通过流式细胞术来表征CD112R、PD-1和TIGIT表达的表达，将先前激活的T细胞或解离的肿瘤细胞用Fc阻断试剂阻断(室温下10分钟)并与荧光染料缀合的抗体在4C下孵育45min。为了检测CD112R，第二步添加第二PE缀合抗人IgG(杰克森免疫研究公司)。在一些情况下，使用IC固定缓冲液(伊生物科学公司)固定细胞。使用BD Symphony流式细胞仪获取数据，并使用FlowJo软件进行分析。
原代人T细胞激活与扩增
使用基于磁珠的人泛T细胞(美天旎生物技术公司(miltenyi Biotec))和记忆CD8T细胞分离试剂盒(干细胞技术公司(STEMCELL technologies))，使用制造商推荐的方案从先前冷冻的PBMC(Cepheus Bioscience公司)中纯化泛T细胞和记忆CD8 T细胞。在50IU/ml重组人IL2(研究开发系统公司)存在下，将泛T细胞与人抗CD3/抗CD28 dynabeads(生命技术公司)以1:1比例培养3天，然后在去除激活珠后，在没有补充IL2的情况下静置3天。在50IU/ml重组人IL2(研究开发系统公司)存在下，将记忆CD8 T细胞与人抗CD3/抗CD28dynabeads(生命技术公司)以1:1比例培养7天，每2-3天补充IL2，然后在去除激活珠后，在50IU/ml重组人IL2存在下静置2天。为了扩增CMVpp65(495-503)反应性CD8+T细胞，将来自HLA-A2+、CMVpp65(495-503)反应性CD8+供体的PBMC与CMVpp65(495-503)(Anaspec公司)肽脉冲处理的单核细胞衍生的树突状细胞(使用单核细胞衍生的树突状细胞分化试剂盒(研究开发系统公司)产生)在50IU/ml重组IL2(研究开发系统公司)、10ng/ml重组IL7(研究开发系统公司)、1000IU/ml重组IL4(研究开发系统公司)的存在下，在Grex-10烧瓶(威尔逊沃尔夫公司(Wilson wolf)制造)中一起培养14天。用于培养和扩增T细胞的培养基是RPMI完全培养基(补充有谷氨酰胺(吉布科公司)+10％ FBS(吉布科公司)+Pen/strep+NEAA+丙酮酸钠+β-ME+HEPES(吉布科公司)的RPMI 1640)。
工程化的CHO细胞的产生
表达抗CD3 scfv的CHO K1细胞系(从安进公司(Amgen)内部来源获得)用于转染以诱导CD112和CD155表达。使用Lipofectamine 2000转染试剂盒(英杰公司)，使用制造商的推荐方案，用pcDNA3.1_人CD112 varδ_zeo载体(从安进公司内部来源获得)转染表达“低”抗CD3 scfv的CHO细胞系。转染后，将表达CD112的CHO细胞分选为单个细胞克隆，并允许其在选择培养基(含(吉布科公司)1X谷氨酸(吉布科公司)、10％热灭活FBS(吉布科公司)、200ug/ml潮霉素和100ug/ml博来霉素和(赛默飞世尔公司(Thermo Fischer))的Ham's F12培养基)中生长。为了产生同时表达CD112、CD155和抗CD3scfv的CHO细胞，使用Lipofectamine 2000(英杰公司)，用pcDNA3.2_人CD155 var 1_puro载体(从安进公司内部来源获得)转染先前产生的表达抗CD3scfv和CD112的CHO细胞系。转染后，将表达CD112、抗CD3scfv、和CD155的CHO细胞分选为单个细胞克隆，并允许其在选择培养基(含(吉布科公司)1X谷氨酸(吉布科公司)、10％热灭活FBS(吉布科公司)、200ug/ml潮霉素、15ug/ml嘌呤霉素、和100ug/ml博来霉素和(赛默飞世尔公司(Thermo Fischer))的Ham's F12培养基)中扩增。为了产生表达人CD112的CHO K1细胞系，使用Lipofectamine 2000试剂盒(英杰公司)，使用制造商的推荐方案，用载体pMSCV_FLAG_人CD112R(N81D)(41-326)_IRES_EGFP转染CHO K1细胞。
体外原代细胞测定
为了探察阻断CD112R-CD112和CD226-CD112相互作用对T细胞功能的影响，将转染以表达CD112的CHO细胞或具有空载体与aCD3scfv的CHO细胞与先前扩增的泛T细胞和可溶性抗CD28(百进公司(Biolegend))在抗CD112R抗体或同种型对照(有或没有抗CD226(艾博抗公司(Abcam)))存在下共培养。24小时后收获细胞培养上清液，并且使用标准ELISA试剂盒(研究开发系统公司)作为T细胞功能的读取来评估IL2。为了评估共阻断TIGIT和CD112R对CD8 T细胞功能的影响，将表达CD112和CD155的CHO细胞与先前扩增的记忆CD8 T细胞和可溶性抗CD28(百进公司)在阻断抗体存在下共培养，并且24小时后收集上清液并使用MSD人IFNγV-plex检测试剂盒分析。
对于抗原特异性CTL测定，将SKMEL30细胞用100ng/ml重组IFNγ预处理24小时，用1ug/ml CMVpp65(495-503)肽脉冲，并且在抗TIGIT、抗CD112R和抗PD-1抗体的单一、双重或三重组合(以1:1:1比例)存在下，在RPMI完全培养基(补充有谷氨酰胺(吉布科公司)、10％FBS(吉布科公司)、Pen/strep、NEAA、丙酮酸钠、β-ME和HEPES(吉布科公司)的RPMI 1640)中，与先前扩增的CMVpp65(495-503)反应性CD8+T细胞共培养72小时。72小时后收获细胞培养上清液，并且使用CBA细胞因子检测试剂盒(BD生命科学公司)作为CD8 T细胞激活的读取来评估IFNγ。
解离的人肿瘤细胞分析
来自肿瘤切除手术的肿瘤组织由CPMC(加州太平洋医疗中心)和通过MT集团(凡奈斯(Van Nuys)，加州)提供，得到患者的同意。将组织进行如下处理：首先切成小块，随后在37C下，在消化缓冲液(补充有10％ FBS、Penn/strep、L-谷氨酰胺、HEPES、1.5mg/ml II型胶原酶、10ug/ml iv型透明质酸酶、10uM Y-27632和DNA酶I的DMEM/F12)中，用GentleMacs进行酶消化和机械解离。消化后，将细胞悬浮液通过70um筛网过滤器过滤，用RBC裂解缓冲液处理并重悬于培养基中。
通过以下进行TIL刺激测定：在抗CD112R、TIGIT、PD-1的组合和/或同种型对照抗体(各自以10ug/ml，在RPMI完全培养基中30ug/ml总抗体/样品)的存在下，在37℃下在96孔板中每孔培养250,000个解离的肿瘤细胞。在第3天和第6天收获上清液，并通过MSD分析IFNγ。
实例11
该实例展示了包含CD112R mAb和TIGIT mAb的配制品。
制备包含抗TIGIT mAb、抗CD112R mAb或两者(总抗体浓度140mg/mL)的配制品，并对其粘度和稳定性进行表征。在这些研究中使用的抗TIGIT mAb包括43B7和66H9，并且使用的抗CD112RmAb是1E1、29E10和24F1。结果示于表21中。
表21
Figure BDA0004122365630001351
以约70mg/mL的每种类型的mAb配制包含抗TIGIT mAb和抗CD112R mAb的1:1混合物的共配制品。以140mg/mL的浓度制备包含抗TIGIT mAb或抗CD112R mAb的单一mAb配制品。
如表21所示，包含抗TIGIT mAb、抗CD112R mAb两者的配制品表现出小于15cP的可接受的粘度。虽然包含24F1或1E1的配制品表现出大致相同的粘度(约9.0至约11.0)，但包含抗CD112R mAb29E10的配制品表现出更高的粘度，
将通过尺寸排阻色谱法(SEC)分析配制品在40℃下储存两周后(2wk40C)的高分子量(HMW)物质形成，与最初的HMW物质形成(T0，无储存时间)进行比较。结果示于表22中。
表22
Figure BDA0004122365630001361
如表22所示，在加速储存(40℃)2周后，所有配制品显示出HMW物质形成的变化小于2％。对于包含1E1和43B7的配制品，％HMW物质的变化最小，但对于大多数其他配制品，％HMW物质的变化也小于1.5％。
这些数据支持包含抗TIGIT mAb、抗CD112R mAb两者的配制品是稳定的，并且即使在较高的浓度下(例如，大于100μg/mL)也表现出可接受的粘度。
实例12
该实例表明了包含抗CD112R mAb和抗TIGIT mAb的配制品的体外活性。
包含不同比例(9:1、3:1、1:1、1:3和1:9TIGIT mAb:CD112RmAb)的抗CD112R mAb(24F1)和抗TIGIT mAb(43B7.002.015)，并具有固定数量的PD-1mAb的配制品的体外活性通过测量细胞毒性T淋巴细胞受配制品刺激后产生的IFN-γ的量来评估。该测定在两种不同的mAb总浓度下进行：1.5nM(模拟靶标覆盖率未达到饱和的情况)和30nM(模拟饱和)。将抗PD-1mAb浓度固定为0.5nM(对于包含1.5nM mAb总浓度的配制品)和10nM(对于包含30nMmAb总浓度的配制品)。表23总结了配制品中每种抗体的量。
表23
Figure BDA0004122365630001371
Figure BDA0004122365630001381
如图19A所示，包含TIGIT mAb和CD112R mAb的总Ab量为1.5nM的配制品(柱1-6)的性能优于那些同时缺乏TIGIT mAb和CD112R mAb的配制品(柱7-12)。在包含TIGIT mAb和CD112R mAb的总Ab量为1.5nM的配制品中(柱1-6)，具有1:1TIGIT mAb:CD112RmAb比例的共配制品性能最好，因为产生了最高量的IFNγ。在较高的Ab总浓度下，应答基本上是相同的(图19B)，这表明应答的程度是由总靶标覆盖率而不是两个mAb的比率驱动的。
实例13
该实例表明了CD112R和TIGIT在人TIL和循环淋巴细胞上的表达。
包含1:1比例的TIGIT mAb和CD112R mAb的共配制品的成功可能受到这些靶标(CD112R和TIGIT)在靶细胞上表达的影响。因此，在TIL、离体原代人肿瘤组织和匹配的血液样品上，通过流式细胞术对CD112R和TIGIT的表达进行评估。假定靶标的表达程度大不相同，那么可能需要使用1:1以外的比例。结果示于图20A-20C中。如图20A所示，CD8+T细胞倾向于TIGIT的表达水平高于CD112R，而NK细胞倾向于在肿瘤组织中增加CD112R表达。此外，与TIL相比，外周CD8+T和NK细胞表达的CD112R和TIGIT水平更具可比性(图20B)。肿瘤细胞表达不同水平的配体CD155和CD112(图20C)。本披露的CD112R和TIGIT mAb中的至少一些表现出与其各自靶标的相似亲和力范围和几乎相同的药代动力学谱。由于CD112R和TIGIT在肿瘤相比于血液中的表达因供体而异，配体的表达也一样，通过以1:1的比例给药的mAb组合的靶标饱和是合理的，并且其也是覆盖最终汇聚于同一下游路径的靶标的优秀方法。
实例14
该实例表明了CD112R mAb和TIGIT mAb在非人灵长类动物(NHP)中的体内药代动力学(PK)。
进行了探索性毒理学研究以评估包含抗CD112R mAb(24F1)、抗TIGIT mAb(43B7.002.015)或这两种抗体的配制品的毒性和PK特征。通过缓慢静脉内(IV)推注，雄性食蟹猴组(每组3只动物)按如下给药：第1组接受依次施用0.5mg/kg抗CD112R mAb和0.5mg/kg抗TIGIT mAb。第2组接受5mg/kg抗TIGIT mAb，而第3组接受5mg/kg抗CD112R mAb。图21中提供了平均浓度-时间曲线。如该图所示，单次IV施用后，TIGIT mAb的暴露量增加在0.5和5mg/kg之间的大约剂量比例，而略高于CD112R mAb在相同的剂量水平下的剂量比例。在两个剂量水平下，CD112R mAb和TIGIT mAb的平均峰浓度和浓度-时间曲线下的面积相似，这表明PK谱适合以1:1的比例进行共配制。
实例15
该实例表明了原代人自然杀伤(NK)细胞中CD112R mAb+TIGIT mAb的活性。
由于CD112R和TIGIT也调节NK细胞活性(Li等人,2020；和Stanietsky等人,2013)，所以在NK细胞激活试验中评估了抗CD112RmAb(24F1)和抗TIGIT mAb(43B7.002.015)以及包含1:1比例的抗CD112R mAb(24F1)和抗TIGIT mAb(43B7.002.015)的共配制品的活性。为了进行测定，将原代NK细胞从来自健康供体的血液中纯化，然后与肿瘤细胞共培养。测量以IFNγ产生和肿瘤细胞杀伤为代表的NK细胞应答。纯化的NK细胞表达高水平的CD226、TIGIT、和CD112R，但表达极低水平的PD-1(图22A)。靶肿瘤细胞内源性表达配体CD112、CD155、和PD-L1(图22B)。如图22C-22D所示，CD112R mAb和TIGIT mAb各自单独诱导NK细胞激活。两种Ab的组合提供了肿瘤细胞杀伤(图22C)和IFN产生(图22D)的进一步增加。包含所有三种抗体(CD112R mAb、TIGIT mAb和PD-1mAb；3X)的共配制品不会进一步增加肿瘤细胞杀伤或IFN产生，该结果与PD-1的极低水平表达一致(图22A)。
这些数据支持包含抗TIGIT mAb和抗CD112R mAb两者的配制品诱导NK细胞活性的能力。
实例16
该实例描述了离体原代人肿瘤浸润淋巴细胞测定。
为了更接近地模拟肿瘤浸润T和NK细胞对内源性肿瘤细胞的应答，开发了使用解离的离体原代人肿瘤组织的测定方法。在抗TIGIT mAb、抗CD112R mAb、抗PD-1mAb或其组合的存在下(没有任何外源抗原)，培养来自解离的肿瘤组织的单细胞悬浮液。该测定背后的想法是，内源性肿瘤细胞向T和/或NK细胞提供肿瘤衍生的抗原。在代表4种不同实体瘤适应症(胰脏癌(PANC)、结肠直肠癌(CRC)、三阴性乳腺癌(TNBC)和胃肠(GIST)癌)的10个不同样品中，如在第3天通过IFNγ测量，检测到了6个样品的应答。在每一种情况下，包括所有三种mAb(抗TIGIT mAb、抗CD112R mAb和抗PD-1mAb)的组合产生了最稳健的应答(图23)，尽管最大诱导倍数因样品而异(数据未显示)。
实例17
该实例表明了包含抗TIGIT mAb、抗CD112R mAb和PD-1mAb的组合的配制品在异种移植模型中的体内功效。
以下材料和方法用于该实验。
动物、组织和材料
每个研究大约使用60-100只小鼠(雌性)。第一次测量时，每只重约17-24g。研究中使用的小鼠品系包括：Balb/c TIGITxCD112R双KO、Balb/c CD112R-GFP KI、Balb/c TIGITKO、Balb/cTIGITxCD112R WT/WT；C57BL/6TIGITxCD112R双KO、C57BL/6CD112R-GFP KI、C57BL/6TIGIT KO、C57BL/6TIGITxCD112RWT/WT；NOD SCID IL2rg(NSG)。Balb/c和C57BL/6来源于维通利华实验室(Charles River Labs)，并且NSG小鼠获得自杰克逊实验室(Jackson Labs)。在肿瘤植入时，小鼠为4至12周大。Balb/c小鼠携带CT26(结肠癌)肿瘤，C57BL/6携带B16F10(黑色素瘤)肿瘤，NSG小鼠携带CMV-SKMEL30(黑色素瘤)肿瘤。
测试物品包括包含1:1比例的抗TIGIT mAb(43B7.002.015)和抗CD112R mAb(24F1)的共配制品、抗muPD-1克隆29F.1A12、抗人PD-1，并且对照物品包括媒剂对照(100％DPBS)、mIgG1 N297G同种型对照、hIgG1同种型对照。
方法
CT26、B16F10和CMV-SKMEL30细胞获得自癌症药理学细胞库(CancerPharmacology Cell Bank)(安进公司，千橡市)。在37℃下，将CT26细胞保持在补充有10％FBS、1％ NaPyr、1％ HEPES和1％NEAA的RPMI-1640中。在37℃下，将B16F10细胞保持在补充有10％ FBS的DMEM中。在37℃下，将CMV-SKMEL30保持在补充有10％ FBS、1％ NaPyr、1％NEAA、1％谷氨酰胺、5ug/mL杀稻瘟素和1ug/mL嘌呤霉素的RPMI-1640中。除了经过鉴定外，还确定细胞中无支原体和鼠小瓶病原体组的污染。收获细胞的T225组织培养烧瓶，并在Vi-Cell XR(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，布雷亚(Brea)，加利福尼亚州)上通过台盼蓝排除法对活细胞进行定量。在雌性小鼠右侧腹皮下注射0.1mL无血清培养基中的3×105个CT26或B16F10细胞，或0.1mL 1:1RPMI:基质胶(BD生命科学公司，马萨诸塞州贝德福德)中的1×106个CMV-SKMEL30细胞。在CMV-SKMEL30模型中，小鼠还静脉注射了2.5×106个CMV扩增的CTL。将动物随机分组，使得每组具有大约100mm3的相似平均肿瘤体积。
在CT26和B16F10同源模型中，以100μg/小鼠向动物给予同种型对照或抗鼠PD-1抗体。在CMV-SK-MEL异种移植模型中，每周两次(2QW)腹膜内(IP)向动物给予同种型对照抗体、抗TIGIT-mAb/抗CD112R mAb共配制品(以200μg/小鼠)和/或抗PD-1抗体(以300μg/小鼠)。对动物称重，并且每周测量两次肿瘤体积。从使用PRO-MAX电子数字卡尺(日本测微仪制造有限公司(Japan Micrometer Mfg.Co.LTD))测量的肿瘤的长度、宽度和高度来计算肿瘤尺寸。将肿瘤体积计算为[L×W×H]并以mm3表示。
统计分析
数据表示为随时间的变化绘制的每组的平均肿瘤体积±平均值的标准误差(SEM)。使用自定义应用程序IVEA(v1.2.1.019)中实现的线性混合效应模型进行统计分析，以评估相对于对照组而言，治疗随时间对肿瘤大小的效应。固定效应包括组、时间与组*时间相互作用项。协方差结构是由于受试者随机效应而引起的。邓尼特校正(Dunnett’scorrection)适用于多重性。
使用自定义应用程序IVEA(v1.2.1.019)中实现的t检验/ANOVA分析表现的数据。当同质性时使用普通t检验/ANOVA以及在缺乏同质性的情况下正态性假设与Welch校正一致。非参数选项用于非正态的情况。应用ANOVA的多重性邓尼特/图基(Tukey)或同等的校正来控制I型错误。
肿瘤生长抑制百分比(TGI)计算为试验组和对照组的肿瘤体积平均变化之差，计算公式为：
％TGI＝100-[(治疗的最终体积-治疗的初始体积)/(对照的最终体积-对照的初始体积)]×100
结果
在这项研究中，在多个小鼠模型中评估了CD112R+TIGIT+PD-1三重阻断的体内效应。在第一个模型中，产生了缺乏CD112R或TIGIT或两者的基因敲除小鼠品系，并评估了同系肿瘤模型中靶标缺乏与或不与PD-1阻断mAb一起的效应。在第二个模型中，产生了异种移植模型，其中免疫缺陷NSG小鼠被植入人黑色素瘤肿瘤细胞系(SKMEL30)(该细胞系被工程化以表达CMV抗原)以及CMV Ag特异性CD8 T细胞。肿瘤建立后，向小鼠给予人PD-1mAb、CD112R和TIGIT mAb组合，或PD-1+TIGIT+CD112R mAb三重组合。在研究过程中测量肿瘤生长，并计算研究终止时的肿瘤生长抑制百分比(TGI)，以比较PD-1单一阻断、TIGIT+CD112R组合(双敲除或组合mAb阻断)或TIGIT+CD112R+PD-1三重组合(TIGIT+CD112R双KO或mAb组合，加上PD-1mAb)与同种型对照治疗组的活性。
图24A-24C提供了随时间(肿瘤植入后)变化绘制的肿瘤体积的研究结果。如图24A所示，用抗PD-1抗体以及TIGIT和CD112R基因敲除(从而提供对所有三个靶标的三重阻断)治疗的小鼠表现出最高程度的肿瘤生长抑制(TGI)。阻断TIGIT(通过基因KO)和通过抗体治疗阻断PD-1提供了60％ TGI。在用抗PD-1抗体治疗的TIGIT/CD112R双敲除的B16F10小鼠中也出现了类似的结果。三重阻断导致了最大量的TGI。如图24C所示，用抗TIGIT mAb/抗CD112RmAb组合配制品加上抗PD-1mAb(紫色)进行三重阻断引起肿瘤体积相对于同种型对照治疗小鼠(黑色)的肿瘤体积减小最多。这些结果支持CD112R+TIGIT+PD-1三重阻断比双组合或单一阻断更好地抑制肿瘤生长。图24A-24C的数据支持，与单独使用PD-1mAb或TIGIT+CD112R组合治疗的组相比，三重阻断引起对肿瘤生长的最稳健的抑制。这些结果支持TIGIT+CD112R+PD-1三重阻断在体内抑制肿瘤生长方面有效。
这些数据支持以体内肿瘤生长抑制(阻断TIGIT、CD112R和PD-1)为代表的肿瘤治疗。
实例18
该实例表明了抗TIGIT mAb/抗CD112R mAb配制品的稳定性。
抗CD112R mAb(24F1)在9％(w/v)蔗糖和10mM醋酸中与或不与抗TIGIT mAb(43B7.002.015(TIGIT-10)或66H9.009(TIGIT-12))一起配制。每个配制品还包含最终浓度为0.01％(w/v)的聚山梨醇酯80(PS80)。每种配制品的总抗体浓度为140mg/mL。包含抗CD112R mAb和抗TIGIT mAb两者的配制品，以1:1的比例包含每者约70mg/mL。然后将配制品在-30℃、4℃、25℃、或40℃下储存长达4周。然后通过尺寸排阻超高效液相色谱法(SE-UHPLC)和还原毛细管电泳-十二烷基硫酸钠(rCE-SDS)分析每种配制品的样品，以评估每种配制品的稳定性。通过计算每个分离的组分与总积分面积相比的百分比来确定稳定性。使用锥板流变仪额外评估每种配制品的粘度(在25℃下，以1000s-1剪切)。
图25A-25H和表24-27提供了SE-UHPLC结果。表24-27分别提供了在-30℃、4℃、25℃和40℃下储存后的HMW物质百分比和抗体主峰百分比，数据显示在图25A-D(分别为在-30℃、4℃、25℃和40℃下储存后的HMW百分比)和图25E-25H(分别为在-30℃、4℃、25℃和40℃下储存后的主峰百分比)。如这些图和表所示，即使在40℃下储存长达4周，形成的HMW物质仍少于2％，主峰仍保持在大于96.5％，这表明该抗体配制品具有高稳定性。
表24
Figure BDA0004122365630001441
表25
Figure BDA0004122365630001451
表26
Figure BDA0004122365630001452
表27
Figure BDA0004122365630001453
图26的表28中提供了rCE-SDS测定的结果。在该测定中，蛋白质物质与SDS(阴离子洗涤剂)结合，并通过电动力学注射到填充有SDS凝胶缓冲液的裸露熔融石英毛细管中。在毛细管上施加电压，在此电压下，SDS包被的蛋白质由于在基于亲水聚合物的溶液中的迁移不同而被分离。蛋白质通过UV检测窗口时，通过光电二极管阵列(PDA)检测器检测。通过确定到达组分(reach component)的校正峰面积百分比来评估稳定性。rCE-SDS方法在还原条件下分离出重链(HC)、轻链(LC)、非糖基化的HC(NGHC)和其他次要的峰物质和基团。如表24所示，所有配制品都相对稳定，在-30℃、4℃、25℃或40℃下储存长达4周后形成约4％的LMW+HMW峰。然而，包含TIGIT-12mAb的配制品与更高的百分比有关。不受理论束缚，较高的百分比是由该抗体的剪切增加引起的。
粘度测定的结果如图27和表29中所示。如该图和表所示，通常配制品的粘度随总抗体浓度的增加而增加。然而，所有测试的配制品都显示粘度小于15cP，并且因此被认为是可以接受的。
表29
Figure BDA0004122365630001461
在此所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请、和专利)均通过引用在此并入，引用的程度如同每个参考文献被个别地并且明确地指示通过引用结合并且以其全部内容在此阐述。
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Claims (48)

1.一种CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含：(a)表A1中列出的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)表A1中列出的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)表A1中列出的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)表A1中列出轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)表A1中列出的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；和(f)表A1中列出的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列。
2.如权利要求1或2所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含表A1的单行中列出的六个CDR氨基酸序列，或包含选自下组的六个CDR氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:13-18；(b)SEQ ID NO:23-28；(c)SEQ ID NO:33-38；(d)SEQ ID NO:43-48；(e)SEQ ID NO:53-58；(f)SEQ ID NO:63-68；(g)SEQ ID NO:73-78；(h)SEQ ID NO:83-88、(i)SEQ ID NO:93-98、(j)SEQ ID NO:103-108、(k)SEQ ID NO:233-238、(l)SEQ ID NO:1973-1978、(m)SEQ ID NO:1983-1988、(n)SEQ ID NO:1993-1998、和(o)SEQ ID NO:2003-2008。
3.如前述权利要求中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含(a)表B1中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B1中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
4.如权利要求4所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含表B1的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:11-12；(b)SEQ ID NO:21-22；(c)SEQ ID NO:31-32；(d)SEQ IDNO:41-42；(e)SEQ ID NO:51-52；(f)SEQ ID NO:61-62；(g)SEQ ID NO:71-72；(h)SEQ IDNO:81-82、(i)SEQ ID NO:91-92、(j)SEQ ID NO:101-102、(k)SEQ ID NO:231-232、(l)SEQID NO:1971-1972、(m)SEQ ID NO:1981-1982、(n)SEQ ID NO:1991-1992、和(o)SEQ ID NO:2001-2002。
5.如前述权利要求中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含(a)表B1中列出的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B1的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B1中列出的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B1的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
6.如权利要求5所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含表B的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:9-10；(b)SEQ ID NO:19-20；(c)SEQ ID NO:29-30；(d)SEQ ID NO:39-40；(e)SEQ ID NO:49-50；(f)SEQ ID NO:59-60；(g)SEQ ID NO:69-70；(h)SEQ ID NO:79-80、(i)SEQ ID NO:89-90、(j)SEQ ID NO:99-100、(k)SEQ ID NO:229-230、(l)SEQ IDNO:1969-1970、(m)SEQ ID NO:1979-1980、(n)SEQ ID NO:1989-1990、和(o)SEQ ID NO:1999-2000。
7.如前述权利要求中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白是抗体。
8.如权利要求7所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白包含：
a.SEQ ID NO:33的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:34的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:35的HCCDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:36的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:37的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:38的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(b)SEQ ID NO:63的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:64的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:65的HCCDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:66的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:67的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:68的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(c)SEQ ID NO:83的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:84的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:85的HCCDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:86的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:87的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:88的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(d)包含(a)SEQ ID NO:31的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ IDNO:31的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:32的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:32的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(e)包含(a)SEQ ID NO:61的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ IDNO:61的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:62的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:62的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(f)包含(a)SEQ ID NO:81的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ IDNO:81的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:82的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:82的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(g)(a)SEQ ID NO:29的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ IDNO:29的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQID NO:30的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:30的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(h)(a)SEQ ID NO:59的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ IDNO:59的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQID NO:60的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:60的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(i)(a)SEQ ID NO:79的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ IDNO:79的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQID NO:80的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:80的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
9.如权利要求1-6中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段。
10.如权利要求1-6中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白，该CD112R抗原结合蛋白是抗体蛋白产物，任选地是scFv。
11.一种核酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白。
12.一种核酸，其编码如权利要求7或8所述的抗体的轻链、重链、或轻链和重链两者。
13.如权利要求11或12所述的核酸，其中该核苷酸序列编码(a)表B1中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B1中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B1的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)两者。
14.一种载体，其包含一种或多种如权利要求11至13中任一项所述的核酸。
15.一种宿主细胞，其包含一种或多种如权利要求11至13中任一项所述的核酸或一种或多种如权利要求14所述的载体。
16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生如权利要求1-10中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白。
17.一种TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含：(a)表A2中列出的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)表A2中列出的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)表A2中列出的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)表A2中列出轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)表A2中列出的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；和(f)表A2中列出的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列。
18.如实施例17所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含：
(a)LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Ser28或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR2氨基酸序列，该LC CDR2氨基酸序列包含Glu1或其保守氨基酸取代；和LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser91或其保守氨基酸取代、Ser92或其保守氨基酸取代、Ser93或其保守氨基酸取代、Leu94或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Val32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Gly57或其保守氨基酸取代、Gly58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Arg66或其保守氨基酸取代、或其任何组合；以及HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Ile102或其保守氨基酸取代、Ala104或其保守氨基酸取代、Gly107或其保守氨基酸取代、Tyr108或其保守氨基酸取代、Phe109或其保守氨基酸取代、Tyr110或其保守氨基酸取代、Tyr111或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的LC可变区氨基酸序列
(b)LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Ser28或其保守氨基酸取代、Val29或其保守氨基酸取代、Ser30或其保守氨基酸取代、Ser31或其保守氨基酸取代、Thr32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR2氨基酸序列，该LC CDR2氨基酸序列包含Glu1或其保守氨基酸取代、Ile2或其保守氨基酸取代、Ser68或其保守氨基酸取代、Gly69或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LCCDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Tyr92或其保守氨基酸取代、Asp93或其保守氨基酸取代、Val94或其保守氨基酸取代、Ser95或其保守氨基酸取代、Pro96或其保守氨基酸取代、Trp97或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Gly32或其保守氨基酸取代、Tyr35或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Ser58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Phe60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Lys66或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Arg102或其保守氨基酸取代、Asn104或其保守氨基酸取代、Trp105或其保守氨基酸取代、Asn106或其保守氨基酸取代、Tyr107或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的LC可变区氨基酸序列
(c)LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Arg30或其保守氨基酸取代、Arg31或其保守氨基酸取代、Tyr32或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser91或其保守氨基酸取代、Tyr92或其保守氨基酸取代、Ser93或其保守氨基酸取代、Thr94或其保守氨基酸取代、或其任何组合，其中位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的LC可变区氨基酸序列；HC CDR1氨基酸序列，该HC CDR1氨基酸序列包含Thr30或其保守氨基酸取代、Gly31或其保守氨基酸取代、Tyr32或其保守氨基酸取代、Tyr33或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Trp47或其保守氨基酸取代、Trp50或其保守氨基酸取代、Ser52或其保守氨基酸取代、Thr54或其保守氨基酸取代、Ser55或其保守氨基酸取代、Ala57或其保守氨基酸取代、Thr58或其保守氨基酸取代、Gly59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Gln65或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Asn101或其保守氨基酸取代、Ser102或其保守氨基酸取代、Val103或其保守氨基酸取代、Leu104或其保守氨基酸取代、Tyr105或其保守氨基酸取代、Tyr106或其保守氨基酸取代、Tyr107或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的HC可变区氨基酸序列；
(d)LC CDR1氨基酸序列，该LC CDR1氨基酸序列包含Gln27或其保守氨基酸取代、Leu30或其保守氨基酸取代、Ser32或其保守氨基酸取代、或其任何组合；LC CDR3氨基酸序列，该LC CDR3氨基酸序列包含Ser96或其保守氨基酸取代、Ile97或其保守氨基酸取代、Gln98或其保守氨基酸取代、Leu99或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR1氨基酸序列，该HCCDR1氨基酸序列包含Asp33或其保守氨基酸取代；HC CDR2氨基酸序列，该HC CDR2氨基酸序列包含Tyr52或其保守氨基酸取代、Tyr54或其保守氨基酸取代、Tyr55或其保守氨基酸取代、Ser56或其保守氨基酸取代、Gly57或其保守氨基酸取代、Gly58或其保守氨基酸取代、Thr59或其保守氨基酸取代、Tyr60或其保守氨基酸取代、Pro63或其保守氨基酸取代、Lys66或其保守氨基酸取代、或其任何组合；HC CDR3氨基酸序列，该HC CDR3氨基酸序列包含Ile102或其保守氨基酸取代、Ala104或其保守氨基酸取代、Gly107或其保守氨基酸取代、Tyr108或其保守氨基酸取代、Phe109或其保守氨基酸取代、Tyr110或其保守氨基酸取代、Phe111或其保守氨基酸取代、或其任何组合；其中，位置编号是相对于该TIGIT抗原结合蛋白的HC可变区氨基酸序列。
19.如权利要求17或18所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含表A2的单行中列出的六个CDR氨基酸序列，或包含选自下组的六个CDR氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:113-118；(b)SEQ ID NO:123-128；(c)SEQ ID NO:133-138；(d)SEQ IDNO:143-148；(e)SEQ ID NO:153-158；(f)SEQ ID NO:163-168；(g)SEQ ID NO:173-178；(h)SEQ ID NO:183-188、(i)SEQ ID NO:193-198、(j)SEQ ID NO:203-208、(k)SEQ ID NO:213-218、(l)SEQ ID NO:223-228、和(m)SEQ ID NO:2013-2018。
20.如权利要求17-19中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含(a)表B2中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B2中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
21.如权利要求20所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含表B2的单行中列出的一对HC可变区和LC可变区氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:111-112、(b)SEQ ID NO:121-122、(c)SEQ ID NO:131-132、(d)SEQ ID NO:141-142、(e)SEQ ID NO:151-152、(f)SEQ ID NO:161-162、(g)SEQ ID NO:171-172、(h)SEQ ID NO:181-182、(i)SEQ ID NO:191-192、(j)SEQ ID NO:201-202、(k)SEQ IDNO:211-212、(l)SEQ ID NO:221-222、和(m)SEQ ID NO:2011-2012。
22.如权利要求17-21中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含(a)表B2中列出的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B2的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B2中列出的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与表B2的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
23.如权利要求22所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含表B2的单行中列出的一对全长(FL)HC和FL LC氨基酸序列，或包含选自下组的一对氨基酸序列，该组由以下组成：(a)SEQ ID NO:109-110、(b)SEQ ID NO:119-120、(c)SEQ ID NO:129-130、(d)SEQ ID NO:139-140、(e)SEQ ID NO:149-150、(f)SEQ ID NO:159-160、(g)SEQ ID NO:169-170、(h)SEQ ID NO:179-180、(i)SEQ ID NO:189-190、(j)SEQ ID NO:199-200、(k)SEQ IDNO:209-210、(l)SEQ ID NO:219-220、和(m)SEQ ID NO:2009-2010。
24.如权利要求17-23中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白是抗体。
25.如权利要求24所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白包含：
(a)SEQ ID NO:203的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:204的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:205的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:206的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:207的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:208的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(b)SEQ ID NO:223的重链(HC)互补决定区(CDR)1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:224的HC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(c)SEQ ID NO:225的HC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(d)SEQ ID NO:226的轻链(LC)CDR1氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(e)SEQ ID NO:227的LC CDR2氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；(f)SEQ ID NO:228的LC CDR3氨基酸序列或仅差异1-4个氨基酸或具有至少或约90％序列同一性的其变体序列；或
(c)包含(a)SEQ ID NO:201的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ IDNO:201的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:202的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:202的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(d)包含(a)SEQ ID NO:221的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ IDNO:221的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQ ID NO:222的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与SEQ ID NO:222的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(e)(a)SEQ ID NO:199的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ IDNO:199的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQID NO:200的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:200的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合；或
(f)(a)SEQ ID NO:219的全长(FL)HC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ IDNO:219的FL HC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)SEQID NO:220的FL LC氨基酸序列或仅差异1-50个氨基酸或与SEQ ID NO:220的FL LC氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)的组合。
26.如权利要求17-23中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白是抗体的抗原结合片段。
27.如权利要求17-23中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白，该TIGIT抗原结合蛋白是抗体蛋白产物，任选地是scFv。
28.一种核酸，其编码如前述权利要求中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白。
29.一种核酸，其编码如权利要求24或25所述的抗体的轻链、重链、或轻链和重链两者。
30.如权利要求28或29所述的核酸，其中该核苷酸序列编码(a)表B2中列出的HC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的HC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列；(b)表B2中列出的LC可变区氨基酸序列或仅差异1-15个氨基酸或与表B2的LC可变区氨基酸序列具有至少或约90％或约95％序列同一性的其变体序列，或(c)(a)和(b)两者。
31.一种载体，其包含一种或多种如权利要求28至30中任一项所述的核酸。
32.一种宿主细胞，其包含一种或多种如权利要求28至30中任一项所述的核酸或一种或多种如权利要求31所述的载体。
33.如权利要求31所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生如权利要求17-27中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白。
34.一种组合物，其包含如权利要求1-10中任一项所述的CD112R抗原结合蛋白和如权利要求17-27中任一项所述的TIGIT抗原结合蛋白。
35.如权利要求34所述的组合物，其中(A)该CD112R抗原结合蛋白是如表A1或表B1中所述的1E1、1E1.016、24F1、29E10、24F1.001、29E10_CONS.020、29E10_CONS.021、29E10_CONS.022、29E10_CONS.025、11E4、31B3、27G12、28F9、28H7、或36C8，任选地是24F1、29E10_CONS.020或29E10_CONS.022，(B)该TIGIT抗原结合蛋白是如表A2或表B2中所述的55G7.041.008、58A7.003.008.075、4G10、11A3、28B8、39D2、43B7、55G7、66H9、43B7.002.015、58A7.003.08、66H9.009、或58A7中的任一个，任选地是43B7.002.015或66H9.009，或(A)和(B)的组合。
36.如权利要求34或35所述的组合物，其中该组合物包含(A)24F1和43B7.002.015，(B)24F1和66H9.009，(C)29E10_CONS.020和43B7.002.015，(D)29E10_CONS.020和66H9.009，(E)29E10_CONS.022和43B7.002.015，(F)29E10_CONS.022和66H9.009，(G)43B7.002.015和1E1.016，(H)43B7.002.015和24F1，(I)43B7.002.015和29E10，(J)66H9.009和1E1.016，(K)66H9.009和29E10，(L)43B7和29E10，(M)43B7和24F1，或(N)43B7和11E4。
37.如权利要求34-36中任一项所述的组合物，其中该CD112R抗原结合蛋白和该TIGIT抗原结合蛋白以约1:1的比例存在于该组合物中。
38.如权利要求34-37中任一项所述的组合物，其进一步包含PD-1抗原结合蛋白。
39.一种试剂盒，其包含如权利要求1-10和17-27中任一项所述的抗原结合蛋白、如权利要求11-13和28-30中任一项所述的核酸、如权利要求14或31所述的载体、如权利要求15、16、32、和33中任一项所述的宿主细胞、如权利要求34-38中任一项所述的组合物、或其组合，和容器。
40.如权利要求39所述的试剂盒，其进一步包含PD-1抗原结合蛋白。
41.一种药物组合物，其包含如权利要求1-10和17-27中任一项所述的抗原结合蛋白、如权利要求11-13和28-30中任一项所述的核酸、如权利要求14或31所述的载体、如权利要求15、16、32、和33中任一项所述的宿主细胞、如权利要求33-36中任一项所述的组合物、或其组合，和药学上可接受的载剂、赋形剂、或稀释剂。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其进一步包含PD-1抗原结合蛋白。
43.一种制造CD112R抗原结合蛋白的方法，该方法包括培养如权利要求15或16中任一项所述的宿主细胞以表达该CD112R抗原结合蛋白以及收获所表达的CD112R抗原结合蛋白。
44.一种制造TIGIT抗原结合蛋白的方法，该方法包括培养如权利要求32或33中任一项所述的宿主细胞以表达该TIGIT抗原结合蛋白以及收获所表达的TIGIT抗原结合蛋白。
45.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该有需要的受试者施用有效治疗该受试者的量的如权利要求41或42所述的药物组合物。
46.如权利要求45所述的方法，其中该受试者具有实体瘤且该药物组合物是以有效治疗该受试者的该实体瘤的量施用至该受试者。
47.一种治疗有需要的受试者的方法，该方法包括向该有需要的受试者施用包含CD112R抗原结合蛋白和TIGIT抗原结合蛋白的第一药物组合物，和包含PD-1抑制剂的第二药物组合物。
48.如权利要求47所述的方法，其中该受试者具有实体瘤且该第一药物组合物和第二药物组合物是以有效治疗该受试者的该实体瘤的量施用至该受试者。
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