KR20150018604A - 히포 경로를 조절하는 결합제 및 그의 용도 - Google Patents

히포 경로를 조절하는 결합제 및 그의 용도 Download PDF

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KR20150018604A
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오스틴 엘. 거니
쎄실 샤르티에-쿠르토
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온코메드 파마슈티칼스, 인크.
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Abstract

본 발명은 히포(Hippo) 경로 및 히포 경로 신호전달을 조절하는 작용제, 예컨대 항체, 가용성 수용체, 폴리펩티드, 펩티드 및 소분자에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 작용제에 대해 스크리닝하고/거나 이를 확인하는 방법, 및 암과 같은 질환의 치료에 상기 작용제를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

히포 경로를 조절하는 결합제 및 그의 용도 {BINDING AGENTS THAT MODULATE THE HIPPO PATHWAY AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2012년 6월 6일에 출원된 미국 가출원 번호 61/656,249, 2012년 12월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 61/737,390 및 2013년 3월 14일에 출원된 미국 가출원 번호 61/783,190을 우선권 주장하며, 이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 히포(Hippo) 경로 및 히포 경로 신호전달을 조절하는 작용제, 예컨대 항체 및 가용성 수용체, 뿐만 아니라 암과 같은 질환의 치료에 상기 작용제를 사용하는 방법에 관한 것이다.
히포 경로는, 세포 증식 및 세포 사멸을 조절하고 기관 크기를 결정하는 신호전달 경로이다. 상기 경로는 포유동물에서 종양 억제자로서의 역할을 하는 것으로 여겨지며, 인간 암에서 이러한 경로의 장애가 종종 검출된다. 상기 경로는 줄기 세포 및 전구 세포의 자기-재생 및 분화에 관여하고/거나 이를 조절할 수 있다. 또한, 히포 경로는 상처 치유 및 조직 재생에 관여할 수 있다. 또한, 히포 경로는 다른 신호전달 경로, 예컨대 Wnt, Notch 및 헷지호그와 교차-소통하기 때문에 광범위하게 다양한 생물학적 사건에 영향을 미칠 수 있고, 이의 기능장애는 암 이외에도 다수의 인간 질환에 관여할 수 있는 것으로 여겨진다. 검토를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Halder et al., 2011, Development 138:9-22; Zhao et al., 2011, Nature Cell Biology 13:877-883; Bao et al., 2011, J. Biochem. 149:361-379; Zhao et al., 2010, J. Cell Sci. 123:4001-4006]을 참조한다.
히포 경로는 드로소필라(Drosophila) 및 포유동물 시스템 사이에서 고도로 보존된 키나제 캐스케이드로 구성된다. 드로소필라에서, 비정형 카드헤린 다크소우스(Dachsous) (Ds) 및 패트(Fat) (Ft)가 히포 경로에 대한 수용체로서 작용하는 것으로 보고된 바 있다 (예를 들어, 문헌 [Bennett et al., 2006, Curr. Biol., 16:2101-2110; Matakatsu et al., 2006, Development, 133:2315-2324] 참조). 최근에는, 드로소필라 세포 부착 분자 에키노이드(Echinoid) (Ed)가 살바도르(Salvador) (Sav)와 상호작용하고, 히포 신호전달에 관여할 수 있는 것으로 보고되었다 (Yue et al., 2012, Dev. Cell, 22:255-267). 그러나, 포유동물 히포 경로에 대해서는 세포 표면 수용체가 확인되지 않았다.
포유동물 히포 경로의 핵심 성분 중 2개는 Lats1 및 Lats2이며, 이는 드로소필라 와르츠(Warts) (Wts)에 상동성인 핵 Dbf2-관련 (NDR) 패밀리 단백질 키나제이다. Lats1/2 단백질은 드로소필라 매츠(Mats)에 상동성인 스캐폴드 단백질 Mob1A/B (Mps 원 바인더 키나제 활성화제-유사 1A 및 1B)와의 회합에 의해 활성화된다. 또한, Lats1/2 단백질은 드로소필라 히포에 상동성인 STE20 패밀리 단백질 키나제 Mst1 및 Mst2에 의한 인산화에 의해 활성화된다. Lats1/2 키나제는 드로소필라 요르키(Yorkie)에 상동성인 하류 이펙터 YAP (Yes-연관 단백질) 및 TAZ (PDZ-결합 모티프를 갖는 전사 보조활성화제; WWTR1)를 인산화시킨다. Lats1/2에 의한 YAP 및 TAZ의 인산화는 히포 신호전달 경로 내에서 중요한 사건이다. Lats1/2는 다중 부위에서 YAP를 인산화시키지만, Ser127의 인산화가 YAP 억제에 결정적이다. YAP의 인산화는 14-3-3 패밀리 단백질에 대한 단백질-결합 모티프를 생성시키고, 이는 14-3-3 단백질의 결합에 따라 세포 세포질에서의 YAP의 잔류 및/또는 격리로 이어진다. 마찬가지로, Lats1/2는 다중 부위에서 TAZ를 인산화시키지만, Ser89의 인산화가 TAZ 억제에 결정적이다. TAZ의 인산화는 세포 세포질에서의 TAZ의 잔류 및/또는 격리로 이어진다. YAP와 유사하게, TAZ의 인산화 또한 14-3-3 결합 부위를 생성시킨다. 또한, YAP 및 TAZ의 인산화는 YAP 또는 TAZ 유비퀴틴화에 의해 촉매되는 인산화-의존성 분해를 활성화함으로써 이들 단백질을 탈안정화시키는 것으로 여겨진다. 따라서, 히포 경로가 "온"인 경우에, YAP 및/또는 TAZ는 인산화되고, 불활성이며, 일반적으로 세포질에서 격리되고; 대조적으로, 히포 경로가 "오프"인 경우에, YAP 및/또는 TAZ는 비-인산화되고, 활성이며, 일반적으로 핵에서 발견된다.
비-인산화되고 활성화된 YAP는 세포 핵 내로 전위되며, 여기서 그의 주요 표적 전사 인자는 TEA-도메인-함유 패밀리의 4종의 단백질 (TEAD1-TEAD4, 총괄적으로 "TEAD")이다. YAP는 TEAD (또는 다른 전사 인자, 예컨대 Smad1, RUNX, ErbB4 및 p73)와 함께 결합 조직 성장 인자 (CTGF), Gli2, Birc5, Birc2, 섬유모세포 성장 인자 1 (FGF1) 및 암피레귤린 (AREG)을 비롯한 다양한 유전자의 발현을 유도하는 것으로 나타났다. YAP와 유사하게, 비-인산화된 TAZ도 세포 핵 내로 전위되며, 여기서 이는 다수의 DNA-결합 전사 인자, 예컨대 퍼옥시솜 증식자-활성화된 수용체 γ (PPARγ), 갑상선 전사 인자-1 (TTF-1), Pax3, TBX5, RUNX, TEAD1 및 Smad2/3/4와 상호작용한다. YAP/TAZ-전사 인자 복합체에 의해 활성화된 다수의 유전자는 세포 생존 및 증식을 매개한다. 따라서, 일부 조건 하에 YAP 및/또는 TAZ는 종양유전자로서 작용하고, 히포 경로는 종양 억제자로서 작용한다. 따라서, 히포 경로를 표적화하는 것은 암 및 다른 질환에 대한 치료적 개입을 위한 또 다른 영역일 수 있다.
본 발명의 간단한 개요
본 발명은 히포 경로를 조절하는 결합제, 예컨대 항체, 가용성 수용체 및 소분자를 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 결합제를 포함하는 조성물, 예컨대 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 결합제는 신규 폴리펩티드, 예컨대 항체 및 융합 단백질이다. 특정 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 결합제는 신규 소형 펩티드 또는 소분자이다. 특정 실시양태에서, 결합제는 인간 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 세포 부착 분자 (IgCAM)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 단편이다. 본 발명은 히포 경로를 조절하는 결합제를 종양을 앓고 있는 대상체에게 투여함으로써, 종양의 성장을 억제하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 히포 경로를 조절하는 결합제를 암의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 암을 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 히포 경로를 조절하는 결합제를 종양 또는 암 전이의 억제를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써, 종양 또는 암 전이를 억제하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하거나, 종양 성장을 억제하거나 또는 전이를 억제하는 방법은 히포 경로를 활성화 또는 자극하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하거나, 종양 성장을 억제하거나 또는 전이를 억제하는 방법은 YAP 활성을 억제하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하거나, 종양 성장을 억제하거나 또는 전이를 억제하는 방법은 TAZ 활성을 억제하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암을 치료하거나, 종양 성장을 억제하거나 또는 전이를 억제하는 방법은 종양의 종양발생성을 감소시키는 것을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 IgCAM에 특이적으로 결합하는 결합제, 예컨대 항체 또는 가용성 수용체를 제공한다. 이들 결합제는 본원에서 "IgCAM-결합제"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, 결합제는 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 JAM (접합부 부착 분자) 패밀리, PVR (폴리오바이러스 수용체) 패밀리 및/또는 CADM (세포 부착 분자) 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CLMP, VSIG4, VSIG8, JAM2, JAM3, CADM1, CADM3, CADM4, PVRL1, PVRL3, PVRL4, TIGIT, TMIGD1 및/또는 TMEM25의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CADM1, CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 CADM3의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성을 조절한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성의 효능제이고/거나 히포 경로 신호전달을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 활성을 억제하고/거나, YAP의 인산화를 증진시키고/거나, YAP의 분해를 증진시키고/거나, YAP의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성을 억제하고/거나, TAZ의 인산화를 증진시키고/거나, TAZ의 분해를 증진시키고/거나, TAZ의 활성화를 억제한다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성의 길항제이고/거나 히포 경로 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 활성을 증가시키고/거나, YAP의 인산화를 감소시키고/거나, YAP의 분해를 감소시키고/거나, YAP의 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성을 증가시키고/거나, TAZ의 인산화를 감소시키고/거나, TAZ의 분해를 감소시키고/거나, TAZ의 활성화를 증가시킨다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 단리된다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 실질적으로 순수하다.
각각의 상기 언급된 측면 및 실시양태, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및 실시양태 중 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 1가 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 인간 IgCAM에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 인간 IgCAM 및 하나 이상의 마우스 IgCAM에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 하나 이상의 IgCAM에 10nM 미만의 KD로 결합한다.
각각의 상기 언급된 측면 및 실시양태, 뿐만 아니라 본원에 기재된 다른 측면 및 실시양태 중 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 IgCAM의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 IgCAM의 세포외 도메인의 일부 또는 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 인간 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 하나 이상의 인간 IgCAM에 결합한다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 하나 이상의 인간 IgCAM 및 하나 이상의 마우스 IgCAM에 결합한다. 일부 실시양태에서, 가용성 수용체는 하나 이상의 IgCAM에 10nM 미만의 KD로 결합한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 결합제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 본 발명은 이들 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터, 뿐만 아니라 발현 벡터 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 세포를 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 하이브리도마 세포주이다.
다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 히포 경로를 조절하는 IgCAM-결합제 (본원에 기재된 각각의 결합제 포함)와 종양을 접촉시키는 것을 포함하는, 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성의 효능제이고/거나, 히포 경로 신호전달을 증진시키고/거나, YAP 활성을 억제하고/거나, YAP의 인산화를 증진시키고/거나, YAP의 분해를 증진시키고/거나, YAP의 활성화를 억제하고/거나, TAZ 활성을 억제하고/거나, TAZ의 인산화를 증진시키고/거나, TAZ의 분해를 증진시키고/거나, TAZ의 활성화를 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 히포 경로를 조절하는 IgCAM-결합제 (본원에 기재된 각각의 결합제 포함)를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성의 효능제이고/거나, 히포 경로 신호전달을 증진시키고/거나, YAP 활성을 억제하고/거나, YAP의 인산화를 증진시키고/거나, YAP의 분해를 증진시키고/거나, YAP의 활성화를 억제하고/거나, TAZ 활성을 억제하고/거나, TAZ의 인산화를 증진시키고/거나, TAZ의 분해를 증진시키고/거나, TAZ의 활성화를 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 IgCAM-결합제 (본원에 기재된 임의의 것 포함)와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 히포 경로 신호전달을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 유방 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 YAP를 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 세포 핵에서 상승된 수준의 YAP를 함유한다. 일부 실시양태에서, 종양은 YAP-의존성 유전자의 상승된 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 TAZ를 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 발현한다. 일부 실시양태에서, 종양은 세포 핵에서 상승된 수준의 TAZ를 함유한다. 일부 실시양태에서, 종양은 TAZ-의존성 유전자의 상승된 발현 수준을 갖는다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 종양의 성장을 억제한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 히포 경로 신호전달을 조절하는 임의의 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 히포 경로 활성의 효능제이고/거나, 히포 경로 신호전달을 증진시키고/거나, YAP 활성을 억제하고/거나, YAP의 인산화를 증진시키고/거나, YAP의 분해를 증진시키고/거나, YAP의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 TAZ 활성을 억제하고/거나, TAZ의 인산화를 증진시키고/거나, TAZ의 분해를 증진시키고/거나, TAZ의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 일부 실시양태에서, 암은 유방암이다. 일부 실시양태에서, 암은 폐암이다. 일부 실시양태에서, 암은 흑색종이다. 일부 실시양태에서, 암은 난소암이다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 YAP를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 YAP-의존성 유전자의 상승된 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 TAZ를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 발현한다. 일부 실시양태에서, 암은 TAZ-의존성 유전자의 상승된 발현 수준을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 히포 경로를 조절하는 결합제 (본원에 기재된 임의의 결합제 포함)를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 YAP의 활성화 및/또는 비정상적 YAP 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 히포 경로 신호전달을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 YAP 인산화를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 YAP 분해를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 세포질에서의 YAP의 잔류를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 핵으로의 YAP 전위를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 YAP-의존성 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 치료 유효량의 히포 경로를 조절하는 결합제 (본원에 기재된 각각의 결합제 포함)를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 TAZ의 활성화 및/또는 비정상적 TAZ 활성과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 히포 경로 신호전달을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 TAZ 인산화를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 TAZ 분해를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 세포질에서의 TAZ의 잔류를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 핵으로의 TAZ 전위를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 TAZ-의존성 유전자의 발현을 감소시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 히포 경로 신호전달을 억제하는 IgCAM-결합제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 히포 경로 신호전달을 조절하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 히포 경로 신호전달을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 YAP 인산화를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 YAP 분해를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 세포질에서의 YAP의 잔류를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 핵으로의 YAP 전위를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 YAP-의존성 유전자의 발현을 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 TAZ 인산화를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 TAZ 분해를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 세포질에서의 TAZ의 잔류를 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 핵으로의 TAZ 전위를 증가시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로의 조절은 TAZ-의존성 유전자의 발현을 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상처를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서 상기 방법은 대상체에서의 상처 치유를 촉진하고/거나 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제와 같은 히포 경로 신호전달을 조절하는 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여된 결합제는 히포 경로 활성의 길항제이고/거나, 히포 경로 신호전달을 저해하고/거나, YAP 활성을 증가시키고/거나, YAP의 인산화를 저해하고/거나, YAP의 분해를 저해하고/거나, YAP의 활성화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 투여된 결합제는 TAZ 활성을 증가시키고/거나, TAZ의 인산화를 저해하고/거나, TAZ의 분해를 저해하고/거나, TAZ의 활성화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 상처는 급성 피부 상처이다. 일부 실시양태에서, 상처는 만성 피부 상처이다. 일부 실시양태에서, 상처는 외과적 상처이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조직 재생을 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 본원에 기재된 결합제와 같은 히포 경로 신호전달을 조절하는 결합제와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 본원에 기재된 결합제와 같은 히포 경로 신호전달을 조절하는 결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로 신호전달의 조절은 히포 경로를 길항하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로 신호전달의 조절은 히포 경로의 신호전달을 감소시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 면역 관련 장애 (예컨대, 자가면역 장애); 염증 (급성 및 만성 염증성 장애 둘 다 포함); 허혈 (예컨대, 심근경색); 외상성 손상 (예컨대, 화상, 열상 및 찰과상); 감염 (예컨대, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염); 및 만성 손상 (예컨대, 간 경변증)에 의해 유발된 조직 손상의 치료를 포함한다.
각각의 상기 언급된 측면, 뿐만 아니라 본원에 달리 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태 중 특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암의 세포에서의 YAP 및/또는 TAZ의 위치 (예를 들어, 핵 또는 세포질)를 결정하는 단계를 포함한다. 각각의 상기 언급된 측면, 뿐만 아니라 본원에 달리 기재된 다른 측면 및/또는 실시양태 중 특정 실시양태에서, 상기 방법은 YAP-의존성 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 TAZ-의존성 유전자 또는 이들 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 히포 경로 신호전달을 조절하는 결합제 (본원에 기재된 각각의 결합제를 포함하지만, 이에 제한되지는 않음)로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하거나 또는 이러한 인간 대상체를 선택하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체가 참조 샘플에서의 YAP의 발현과 비교하여 상승된 YAP 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체가 YAP의 사전-결정된 수준과 비교하여 상승된 YAP 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체가 정상 조직에서의 YAP의 발현과 비교하여 상승된 YAP 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 정상 조직으로부터의 세포의 핵에서의 YAP의 수준과 비교하여 종양 세포의 핵에서 상승된 수준의 YAP를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체가 정상 조직으로부터의 세포에서의 비-인산화 YAP의 수준과 비교하여 종양 세포에서 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체가 정상 조직에서의 TAZ의 발현과 비교하여 상승된 TAZ 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체가 정상 조직으로부터의 세포의 핵에서의 TAZ의 수준과 비교하여 종양 세포의 핵에서 상승된 수준의 TAZ를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체가 정상 조직으로부터의 세포에서의 비-인산화 TAZ의 수준과 비교하여 종양 세포에서 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, "정상 조직"은 종양과 동일한 유형의 조직, 예를 들어 폐 종양과 동일한 유형의 조직 및 정상 폐 조직이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 작용제와 같은 IgCAM-결합제를 사용하여 종양 세포를 표적화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포독성제에 접합되거나 또는 이와 복합체를 형성한다.
본원에 기재된 바와 같은 IgCAM-결합제를 포함하는 조성물 및 상기 결합제를 생산하는 세포주가 제공된다. 또한, 본원에 기재된 IgCAM-결합제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 추가로 제공된다. 또한, 본원에 기재된 IgCAM-결합제와 같은 결합제를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하고/거나 종양 성장을 억제하는 방법이 제공된다. 또한, 본원에 기재된 IgCAM-결합제와 같은 결합제를 포함하는 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 상처 치유 및/또는 조직 재생을 증진시키는 방법이 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 히포 경로를 조절하는 작용제를 스크리닝하고/거나 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 작용제에 대해 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 작용제는 히포 경로를 조절한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하고/거나 이를 확인하는 방법은 시험 작용제와 세포를 접촉시키고, 이분자 형광 상보성 (BiFC) 검정을 사용하여 YAP 및/또는 TAZ의 세포 국재화를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 작용제를 스크리닝하고/거나 확인하는 방법은 (a) 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, (b) 세포의 제2 세트와 비교한 세포의 제1 세트에서의 인산화 YAP 및/또는 인산화 TAZ의 양을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 작용제를 스크리닝하고/거나 확인하는 방법은 (a) 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, (b) 세포의 제2 세트와 비교한 세포의 제1 세트에서의 비-인산화 YAP 및/또는 비-인산화 TAZ의 양을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 작용제를 스크리닝하고/거나 확인하는 방법은 (a) 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, (b) 세포의 제2 세트에서의 YAP-의존성 유전자 및/또는 TAZ-의존성 유전자의 발현과 비교한, 세포의 제1 세트에서의 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 및/또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자는 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 시험 작용제는 항체, 가용성 수용체, 소분자, 폴리펩티드, 펩티드, 펩티드모방체 또는 약물 화합물이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 스크리닝 방법에 의해 확인된 작용제를 제공한다.
본 발명의 측면 또는 실시양태가 마쿠쉬 군 또는 다른 대안적 군의 측면에서 기재된 경우에, 본 발명은 총괄하여 열거된 전체 군 뿐만 아니라, 개별 군 및 주요 군의 모든 가능한 하위군의 각 구성원, 및 또한 군 구성원 중 하나 이상이 부재하는 주요 군도 포함한다. 또한, 본 발명은 청구된 본 발명에서 임의의 군 구성원 중 하나 이상이 명시적으로 배제된 것도 고려한다.
도 1. 온코메드(OncoMed) 종양 은행으로부터의 환자-유래 종양에서의 YAP의 마이크로어레이 유전자 발현 분석.
도 2. dnYAP의 발현에 의한 종양 성장의 억제. 종양 세포에 dnYAP-렌티바이러스 (-○-) 또는 GFP-렌티바이러스 (-●-)를 형질도입하고, 72시간 동안 인큐베이션하였다. GFP 양성 및 DAPI 음성 (GFP+/DAPI-)으로서 확인된 형질도입된 세포를 유동 세포측정법에 의해 분류하고, NOD/SCID 마우스 내에 피하 주사하였다. 종양 성장을 3개월 동안 모니터링하였고, 데이터는 종양 부피 (mm3)로서 제시한다. (a) OMP-M6 흑색종 종양; (b) OMP-C18 결장 종양; (c) OMP-C37 결장 종양; (d) OMP-PN7 췌장 종양; (e) OMP-C11 결장 종양; (f) OMP-L2 폐 종양; (g) OMP-OV22 난소 종양; (h) OMP-LU52 폐 종양; (i) 마이크로어레이 분석에 의해 결정된 바와 같은 종양에서의 YAP 발현.
도 3. YAP 활성에 대한 dnYAP의 발현의 효과.
도 4. 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같은, 히포 경로 성분에 대한 세포 분리의 효과.
도 5. 후보 히포 경로 수용체의 가계도.
도 6. 후보 히포 경로 수용체, 막-결합된 디코이 수용체 및 가용성 수용체의 다이어그램.
도 7. 막-고정된 디코이 수용체의 발현. (a) 형광 현미경검사에 의해 관찰된 바와 같은 GFP-태그부착된 IgCAM 디코이 수용체의 세포 표면 발현. (b) GFP-태그부착된 IgCAM 디코이 수용체의 유동 세포측정법 히스토그램.
도 8. 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된 바와 같은, 히포 경로 성분에 대한 IgCAM 디코이 수용체의 효과.
도 9. YAP 핵 전위의 결정을 위한 이분자 형광 상보성 검정. (a) YAP, TEAD2 및 TEAD3을 포함하는 YFP 구축물의 다이어그램. (b) 형광 현미경검사 및 위상 대조에 의해 관찰된 바와 같은 저밀도 세포의 핵 YFP 형광. (c) 형질도입된 HeLa 세포의 FACS 분석.
도 10. GFP-YAP를 발현하는 테트라시클린-유도성 HeLa 세포주 NC12. (a) Tet 활성화에 반응한 GFP-YAP의 발현. (b) Tet 활성화에 반응한 GFP-YAP 발현의 웨스턴 블롯 분석.
도 11. YAP 핵 전위의 결정에 사용하기 위한 Cre-의존성 EmGFP 발현 구축물 및 YAP-Cre 구축물의 다이어그램.
도 12. 결장 종양 OMP-C18에서의 막-고정된 IgCAM 디코이 수용체의 과다-발현에 의한 종양 성장에 대한 효과. (a) CADM2, CADM4, CD226, PVR; (b) CADM3, TMEM25, JAM3, TIGIT; (c) CADM3, TMEM25, JAM3, TIGIT; (d) JAM2, PVRL1, ESAM; (e) VSIG1, VSIG4, PVRL4, CD200; (f) PVRL3, JAM1, CADM1, VSIG2; 및 (g) CLMP, VSIG8, TMIGD1, VSIG3.
도 13. 결장 종양 OMP-LU2에서의 막-고정된 IgCAM 디코이 수용체의 과다-발현에 의한 종양 성장에 대한 효과. (a) CADM2; (b) CADM3, PVRL4, VSIG4; (c) CD226, JAM2, JAM3, CADM1; (d) CADM4, TIGIT, PVRL1, PVRL3.
도 14. 결장 종양 OMP-LU40에서의 막-고정된 IgCAM 디코이 수용체의 과다-발현에 의한 종양 성장에 대한 효과. (a) CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CD226, PVR; (b) PVRL4, VSIG4, CD226; (c) PVRL3, ESAM, VSIG2.
도 15. FLAG-태그부착된 전장 CADM1, CADM3, PVR, PVRL1 및 PVRL3으로 형질감염시킨 세포를 사용한 IgCAM 단백질 복합체의 웨스턴 블롯 분석. CADM3-CD4TM-GFP 및 LGR5-CD4TM-GFP 구축물을 음성 대조군으로 사용하였다. 단백질 복합체를 (a) 아파딘, DCAF7, DLG1, INADL, LIN7, LIN7C; (b) MPDZ, MPP5?, PARD3, FLAG 대조군; (c) YAP, 포스포-YAP에 대해 분석하였다. 튜불린 및 액틴을 대조군으로서 사용하였다.
도 16. FLAG-태그부착된 전장 CADM1 및 c-myc-태그부착된 YAP로 형질감염시킨 세포를 사용한 IgCAM1 단백질 복합체의 웨스턴 블롯 분석. 단백질 복합체를 myc-태그부착된 YAP 및 FLAG-태그부착된 CADM1에 대해 분석하였다.
본 발명은, 히포 경로를 조절하는 항체 및 가용성 수용체와 같은 폴리펩티드를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 신규 작용제를 제공한다. 작용제는 히포 경로 신호전달의 효능제 및 길항제를 포함한다. 관련 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드, 상기 작용제를 포함하는 조성물 및 상기 작용제를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하는 방법이 제공된다. 신규 작용제를 사용하는 방법, 예컨대 종양 성장을 억제하는 방법, 암을 치료하는 방법, 히포 경로 신호전달을 활성화하고/거나 증진시키는 방법, 히포 경로 신호전달을 억제하거나 또는 감소시키는 방법, 및/또는 치료를 위한 대상체를 확인하고/거나 선택하는 방법이 추가로 제공된다.
I. 정의
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어 및 어구가 하기에 정의된다.
본원에 사용된 용어 "효능제" 및 "효능작용"은 표적 및/또는 신호전달 경로 (예를 들어, 히포 경로)의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로, 실질적으로 유도하거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 증가시키거나 또는 증진시킬 수 있는 작용제를 지칭하거나 또는 기재한다. 용어 "효능제"는 단백질의 활성을 부분적으로 또는 완전히 유도하거나, 활성화하거나, 촉진하거나, 증가시키거나 또는 증진시키는 임의의 작용제를 포함하도록 본원에서 사용된다. 적합한 효능제는 구체적으로 효능제 항체 또는 그의 단편, 가용성 수용체 및 다른 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "길항제" 및 "길항작용"은 표적 및/또는 신호전달 경로 (예를 들어, 히포 경로)의 생물학적 활성을 직접 또는 간접적으로, 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화시킬 수 있는 작용제를 지칭하거나 또는 기재한다. 용어 "길항제"는 단백질의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 억제하거나, 감소시키거나 또는 중화시키는 작용제를 포함하도록 본원에서 사용된다. 적합한 길항제는 구체적으로 길항제 항체 또는 그의 단편, 가용성 수용체 및 다른 융합 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "조절" 및 "조절하다"는 생물학적 활성에서의 변화 또는 변경을 지칭한다. 조절은 활성을 자극 또는 억제하는 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 조절은 활성의 증가 또는 감소 (예를 들어, 히포 경로 신호전달의 감소; 히포 경로 신호전달의 증가), 결합 특징의 변화, 또는 단백질, 경로 또는 다른 생물학적 관심 지점의 활성과 연관된 생물학적, 기능적 또는 면역학적 특성의 임의의 다른 변화일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내의 하나 이상의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질 또는 이들의 조합물을 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 본원에 사용된 상기 용어는 무손상 폴리클로날 항체, 무손상 모노클로날 항체, 항체 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편), 단일 쇄 Fv (scFv) 항체, 다중특이적 항체, 예컨대 2개 이상의 무손상 항체로부터 생성된 이중특이적 항체, 이중특이적 항체, 단일특이적 항체, 1가 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 융합 단백질, 및 항체가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 항체는 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로서 지칭되는 그의 중쇄 불변 도메인의 정체에 기초하여 5가지 주요 부류의 이뮤노글로불린: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 또는 그의 하위부류 (이소형) (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 중 임의의 것일 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린은 상이한, 널리-공지된 서브유닛 구조 및 3차원 형상을 갖는다. 항체는 네이키드일 수 있거나, 또는 다른 분자, 예컨대 비제한적으로 독소 및 방사성동위원소에 접합될 수 있다.
용어 "항체 단편"은 무손상 항체의 일부를 지칭하고, 무손상 항체의 항원 결정 가변 영역을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, 선형 항체, 단일 쇄 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "항체 단편"은 항원-결합 부위 또는 에피토프-결합 부위를 포함한다.
항체의 "가변 영역"이라는 용어는 단독이거나 또는 조합된, 항체 경쇄의 가변 영역 또는 항체 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역은 "초가변 영역"으로서도 또한 공지된 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)에 의해 연결된 4개의 프레임워크 영역 (FR)으로 이루어진다. 각각의 쇄 내의 CDR은 프레임워크 영역에 의해 근접하게 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. CDR을 결정하기 위한 2가지 이상의 기술이 존재한다: (1) 종-교차 서열 가변성에 기초한 접근법 (즉, Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda MD.) 및 (2) 항원-항체 복합체의 결정학적 연구에 기초한 접근법 (Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948). 또한, 이들 두 접근법의 조합이 당업계에서 CDR을 결정하는데 때때로 사용되기도 한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 단일 항원 결정기 또는 에피토프의 고도로 특이적인 인식 및 결합에 관련된 균질한 항체 집단을 지칭한다. 이는, 전형적으로 다양한 항원 결정기에 대해 지시된 다양한 항체들의 혼합물을 포함하는 폴리클로날 항체와는 대조적이다. 용어 "모노클로날 항체"는 무손상 및 전장 모노클로날 항체 둘 다, 뿐만 아니라 항체 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv), 단일 쇄 (scFv) 항체, 항체 부분 또는 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 항원 인식 부위 (항원-결합 부위)를 포함하는 임의의 다른 변형된 이뮤노글로불린 분자를 포함한다. 또한, "모노클로날 항체"는 다수의 기술, 예컨대 비제한적으로 하이브리도마 생산, 파지 선택, 재조합 발현 및 트랜스제닉 동물에 의해 제조된 이러한 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인간화 항체"는 최소의 비-인간 서열을 함유하는 특이적 이뮤노글로불린 쇄, 키메라 이뮤노글로불린 또는 그의 단편인 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 전형적으로 인간화 항체는, CDR의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린이다 (Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536). 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체 내의 상응하는 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 개선하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 내 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 인간화 항체는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR을 함유하는 1개 이상, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있지만, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 인간화 항체는 또한 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것인 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부 또는 단편을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간에 의해 생산된 항체, 또는 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 제조된, 인간에 의해 생산된 항체에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체를 지칭한다. 이러한 인간 항체의 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확히 배제한다.
본원에 사용된 용어 "키메라 항체"는 이뮤노글로불린 분자의 아미노산 서열이 2가지 이상의 종으로부터 유래된 것인 항체를 지칭한다. 전형적으로, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 어느 한 종의 포유동물 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼 등)로부터 유래된 항체의 가변 영역에 상응하는 반면, 불변 영역은 또 다른 종 (통상적으로 인간)으로부터 유래된 항체의 서열과 상동성이어서 이러한 종에서 면역 반응을 유발하는 것을 방지한다.
본원에 사용된 어구 "친화도 성숙 항체"는, 변경(들)을 보유하지 않는 모 항체와 비교 시 항원에 대한 항체의 친화도에서의 개선을 유발하는 하나 이상의 변경이 그의 하나 이상의 CDR 내에 있는 항체를 지칭한다. 바람직한 친화도 성숙 항체는 표적 항원에 대해 나노몰 또는 심지어 피코몰의 친화도를 가질 것이다. 친화도 성숙 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 생산된다. 예를 들어, 문헌 [Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783]은 VH 및 VL 도메인 셔플링에 의한 친화도 성숙을 기재하고 있다. CDR 및/또는 프레임워크 잔기의 무작위 돌연변이유발은 문헌 [Barbas et al., 1994, PNAS, 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154:3310-9; 및 Hawkins et al., 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 용어 "가용성 수용체"는 세포로부터 가용성 형태로 분비될 수 있는 수용체 단백질의 세포외 단편을 지칭한다. 용어 "가용성 수용체"는 전체 세포외 도메인, 또는 세포외 도메인의 일부 또는 단편을 포함하는 분자를 포함한다.
용어 "에피토프" 및 "항원 결정기"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 특정한 항체에 의해 인식되고 특이적으로 결합될 수 있는 항원의 해당 부분을 지칭한다. 항원이 폴리펩티드인 경우에, 에피토프는 인접 아미노산, 및 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비인접 아미노산 둘 다로부터 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로부터 형성된 에피토프 (선형 에피토프로서도 또한 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성 시에 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프 (입체형태적 에피토프로서도 또한 지칭됨)는 전형적으로 단백질 변성 시에 상실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3개, 보다 통상적으로는 적어도 5, 6, 7 또는 8-10개의 아미노산을 고유한 공간 입체형태로 포함한다.
용어 "선택적으로 결합하는" 또는 "특이적으로 결합하는"은, 결합제가 무관한 단백질을 비롯한 다른 물질보다 빈번하게, 신속하게, 긴 지속기간으로, 큰 친화도로 또는 상기의 것들의 일부 조합으로 에피토프, 단백질 또는 표적 분자와 반응하거나 또는 회합하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합하는"은, 예를 들어 결합제가 단백질 또는 표적에 약 0.1mM 이하, 보다 통상적으로는 약 1μM 미만의 KD로 결합하는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, "특이적으로 결합하는"은 결합제가 표적에 적어도 약 0.1μM 이하, 적어도 약 0.01μM 이하 또는 적어도 약 1nM 이하의 KD로 결합하는 것을 의미한다. 상이한 종에서의 상동 단백질 사이의 서열 동일성 때문에, 특이적 결합은 하나 초과의 종에서의 단백질 또는 표적을 인식하는 결합제를 포함할 수 있다. 마찬가지로, 상이한 단백질의 폴리펩티드 서열의 특정 영역 내의 상동성 때문에, 특이적 결합은 하나 초과의 단백질 또는 표적을 인식하는 결합제를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 표적에 특이적으로 결합하는 결합제는 제2 표적에 특이적으로 결합할 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이에 따라, "특이적 결합"은 독점적 결합, 즉 단일 표적에 대한 결합을 (포함할 수는 있지만) 반드시 필요로 하지는 않는다. 따라서, 특정 실시양태에서 결합제는 하나 초과의 표적에 특이적으로 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제 상의 동일한 항원-결합 부위가 다중 표적에 결합할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서 항체는 2개의 동일한 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 이들 각각은 2개 이상의 단백질 상의 동일한 에피토프에 특이적으로 결합한다. 특정의 대안적 실시양태에서, 항체는 이중특이적일 수 있고, 특이성이 상이한 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함한다. 비제한적 예로서, 이중특이적 항체는 하나의 단백질 상의 에피토프를 인식하는 1개의 항원-결합 부위를 포함할 수 있고, 제2 단백질 상의 상이한 에피토프를 인식하는 제2의 상이한 항원-결합 부위를 추가로 포함한다. 일반적으로, 반드시는 아니지만, 결합에 대한 언급은 특이적 결합을 의미한다.
용어 "폴리펩티드" 및 "펩티드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 임의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭한다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산이 개재될 수 있다. 또한, 이 용어는 자연적으로, 또는 개입에 의해, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분과의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 이러한 정의에는, 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 포함)를 함유하는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형물이 또한 포함된다. 본 발명의 폴리펩티드는 항체를 기초로 할 수 있기 때문에, 특정 실시양태에서 폴리펩티드는 단일 쇄 또는 회합된 쇄로서 발생할 수 있는 것으로 이해된다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 및 "핵산 분자"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭하며, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기, 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다.
"고 엄격성 조건"은 (1) 세척을 위해 낮은 이온 강도 및 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 15mM 염화나트륨/1.5mM 시트르산나트륨 (1x SSC)을 0.1% 소듐 도데실 술페이트와 함께 사용하는 것; (2) 혼성화 동안 42℃에서 변성제, 예컨대 포름아미드, 예를 들어 50% (v/v) 포름아미드를 5x SSC (0.75M NaCl, 75mM 시트르산나트륨) 중 pH 6.5의 0.1% 소 혈청 알부민/0.1% 피콜(Ficoll)/0.1% 폴리비닐피롤리돈/50mM 인산나트륨 완충제와 함께 사용하는 것; 또는 (3) 42℃에서의 50% 포름아미드, 5x SSC, 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1% 피로인산나트륨, 5x 덴하르트(Denhardt) 용액, 음파처리된 연어 정자 DNA (50μg/ml), 0.1% SDS 및 10% 덱스트란 술페이트를, 55℃에서의 50% 포름아미드를 함유하는 0.2x SSC 중 세척액과 함께 사용하고, 이어서 55℃에서의 EDTA를 함유하는 0.1x SSC로 이루어진 고-엄격성 세척액을 사용하는 것에 의해 확인될 수 있다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드의 문맥에서 용어 "동일한" 또는 퍼센트 "동일성"은, 임의의 보존적 아미노산 치환은 서열 동일성의 부분으로 간주하지 않으면서 최대한의 상응을 위해 (필요한 경우, 갭을 도입하여) 비교 및 정렬하는 경우에, 동일하거나 또는 명시적인 백분율의 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기를 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 지칭한다. 퍼센트 동일성은 서열 비교 소프트웨어 또는 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의해 측정할 수 있다. 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 정렬을 획득하는데 사용될 수 있는 다양한 알고리즘 및 소프트웨어는 당업계에 널리 공지되어 있다. 이들은 BLAST, ALIGN, 메갈라인(Megalign), 베스트핏(BestFit), GCG 위스콘신 패키지(Wisconsin Package) 및 이들의 변형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 2개의 본 발명의 핵산 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 것은, 최대한의 상응을 위해 비교 및 정렬하는 경우에, 서열 비교 알고리즘을 사용하거나 또는 육안 검사에 의한 측정 시 이들이 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 일부 실시양태에서는 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 길이가 적어도 약 10개, 적어도 약 20개, 적어도 약 40-60개 잔기, 적어도 약 60-80개 잔기 또는 이들 사이의 임의의 정수 값인 서열의 영역에 걸쳐 동일성이 존재한다. 일부 실시양태에서, 60-80개 잔기보다 긴 영역, 예컨대 적어도 약 80-100개 잔기에 걸쳐 동일성이 존재하고, 일부 실시양태에서는, 비교되는 서열들의 전체 길이, 예컨대 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역에 걸쳐 서열들이 실질적으로 동일하다.
"보존적 아미노산 치환"은 하나의 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 잔기로 대체된 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 당업계에 정의되어 있으며, 이는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다. 예를 들어, 티로신을 페닐알라닌으로 치환하는 것은 보존적 치환이다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 항체의 서열에서의 보존적 치환은 이러한 아미노산 서열을 함유하는 폴리펩티드 또는 항체가 항원(들), 즉 폴리펩티드 또는 항체가 결합하는 하나 이상의 IgCAM 단백질(들)에 결합하는 것을 무효로 하지 않는다. 항원 결합을 배제하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 하나 이상의 관심 유전자(들) 또는 서열(들)을 숙주 세포 내에 전달할 수 있고, 통상적으로는 이를 발현할 수 있는 구축물을 의미한다. 벡터의 예는 바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 플라스미드, 코스미드, 또는 파지 벡터, 양이온성 축합제와 회합된 DNA 또는 RNA 발현 벡터, 및 리포솜 내에 캡슐화된 DNA 또는 RNA 발현 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
"단리된" 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 자연에서 발견되지 않는 형태의 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물이다. 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 더 이상 자연에서 발견되는 형태가 아닌 정도로 정제된 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드, 항체, 폴리뉴클레오티드, 벡터, 세포 또는 조성물은 실질적으로 순수하다.
본원에 사용된 용어 "실질적으로 순수한"은 적어도 50% 순수하거나 (즉, 오염물을 함유하지 않음), 적어도 90% 순수하거나, 적어도 95% 순수하거나, 적어도 98% 순수하거나 또는 적어도 99% 순수한 물질을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "암" 및 "암성"은 세포 집단이 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 것인 포유동물의 생리학적 상태를 지칭하거나 또는 기재한다. 암의 예는 암종, 모세포종, 육종 및 혈액암, 예컨대 림프종 및 백혈병을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "종양" 및 "신생물"은 과도한 세포 성장 또는 증식으로부터 유발된, 양성 (비-암성) 또는 전암성 병변을 비롯한 악성 (암성)의 임의의 조직 덩어리를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "전이"는 새로운 위치에서의 유사한 암성 병변의 발생과 함께 암이 원래 부위에서 신체의 다른 영역으로 확산 또는 이전되는 과정을 지칭한다. "전이성" 또는 "전이" 세포는, 인접 세포와의 부착성 접촉을 상실하고 혈류 또는 림프를 통해 1차 질환 부위로부터 이동하여 인접 신체 구조를 침습하는 것이다.
용어 "암 줄기 세포" 및 "CSC" 및 "종양 줄기 세포" 및 "종양 개시 세포"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 이는 (1) 광범위한 증식 능력을 갖고; 2) 분화 세포가 감소된 증식 또는 발달 잠재성을 갖는 것인 하나 이상의 유형의 분화 세포 자손을 발생시키는 비대칭 세포 분열이 가능하고; (3) 자기-재생 또는 자기-유지를 위한 대칭 세포 분열이 가능한 암 또는 종양으로부터의 세포를 지칭한다. 이들 특성은 종양을 형성하는데 실패하는 대다수의 종양 세포와 비교하여, 면역손상 숙주 (예를 들어, 마우스) 내로의 연속 이식 시 종양 또는 암을 형성하거나 또는 확립하는 능력을 암 줄기 세포에 부여한다. 암 줄기 세포는 카오스 방식으로 분화에 대한 자기-재생을 겪음으로써, 돌연변이가 발생할 때 시간에 따라 변화할 수 있는 비정상적 세포 유형을 갖는 종양을 형성한다.
용어 "암 세포" 및 "종양 세포"는 대부분의 암 세포 집단을 포함하는 비-종양발생 세포, 및 종양발생 줄기 세포 (암 줄기 세포) 둘 다를 비롯하여, 암 또는 종양 또는 전암성 병변으로부터 유래된 전체 세포 집단을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "암 세포" 또는 "종양 세포"는 재생 및 분화 능력이 결여된 세포만 지칭하여 이러한 종양 세포를 암 줄기 세포와 구별하는 경우에 용어 "비-종양발생"에 의해 수식될 것이다.
본원에 사용된 용어 "종양발생"은 자기-재생 (추가의 종양발생 암 줄기 세포를 발생시킴) 및 모든 다른 종양 세포를 발생시키는 증식 (분화 및 이에 따라 비-종양발생 종양 세포를 발생시킴)의 특성을 비롯한 암 줄기 세포의 기능적인 특징을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "종양발생성"은 면역손상 숙주 (예를 들어, 마우스) 내로의 연속 이속 시 촉지성 종양을 형성하는, 종양으로부터의 세포의 무작위 샘플의 능력을 지칭한다.
용어 "대상체"는 특정한 치료의 수용자가 되는, 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 등을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 임의의 동물 (예를 들어, 포유동물)을 지칭한다. 전형적으로, 용어 "대상체" 및 "환자"는 본원에서 인간 대상체에 대한 언급 시 상호교환가능하게 사용된다.
용어 "제약상 허용되는"은 인간을 비롯한 동물에서의 사용에 대해 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되었거나 (또는 승인가능하거나), 또는 미국 약전 또는 일반적으로 인정되는 다른 약전에 열거된 생성물 또는 화합물을 지칭한다.
용어 "제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 아주반트" 또는 "허용되는 제약 담체"는, 하나 이상의 본 개시내용의 결합제 (예를 들어, 항체)와 함께 대상체에 투여될 수 있고 그의 약리학적 활성을 파괴하지 않으며, 치료 효과를 전달하기에 충분한 용량으로 투여되는 경우에 비독성인 부형제, 담체 또는 아주반트를 지칭한다.
용어 "유효량" 또는 "치료 유효량" 또는 "치료 효과"는 대상체, 예컨대 포유동물에서 질환 또는 장애를 "치료"하는데 유효한 결합제, 항체, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 유기 소분자 또는 다른 약물의 양을 지칭한다. 암의 경우에, 치료 유효량의 약물 (예를 들어, 항체)은 치료 효과를 가지며, 이에 따라 암 세포의 수를 감소시킬 수 있거나; 종양발생성, 종양발생 빈도 또는 종양발생 능력을 감소시킬 수 있거나; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도를 감소시킬 수 있거나; 종양 크기를 감소시킬 수 있거나; 암 세포 집단을 감소시킬 수 있거나; 주변 기관 내로의 암 세포 침윤 (예를 들어, 연질 조직 및 골 내로의 암 확산 포함)을 억제하거나 또는 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 전이를 억제하고 정지시킬 수 있거나; 종양 또는 암 세포 성장을 억제하고 정지시킬 수 있거나; 암과 연관된 증상 중 하나 이상을 어느 정도로 완화시킬 수 있거나; 이환율 및 사망률을 감소시킬 수 있거나; 삶의 질을 개선할 수 있거나; 또는 이러한 효과들의 조합이 가능하다. 작용제, 예를 들어 항체가 기존의 암 세포의 성장을 방지하고/거나 이를 사멸시킨다는 점에서, 이는 세포증식억제성 및/또는 세포독성으로 지칭될 수 있다.
용어 "치료하는" 또는 "치료" 또는 "치료하다", 또는 "완화시키는" 또는 "완화시키다"는 1) 진단된 병리학적 상태 또는 장애를 치유하고/하거나, 둔화시키고/거나, 그의 증상을 줄이고/거나 그의 진행을 중단시키는 치료적 수단, 및 2) 표적화된 병리학적 상태 또는 장애의 발달을 방지하거나 또는 둔화시키는 예방적 또는 방지적 수단 둘 다를 지칭한다. 따라서, 치료를 필요로 하는 이는 이미 장애를 앓고 있는 이; 장애를 앓기 쉬운 이; 및 장애가 방지되어야 하는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 환자가 하기 중 하나 이상을 나타내면 대상체가 본 발명의 방법에 따라 성공적으로 "치료"된 것이다: 암 세포 수의 감소 또는 암 세포의 완전한 부재; 종양 크기의 감소; 연부 조직 및 골 내로의 암 세포 확산을 비롯한 주변 기관 내로의 암 세포 침윤의 억제 또는 부재; 종양 또는 암 세포 전이의 억제 또는 부재; 암 성장의 억제 또는 부재; 특정 암과 연관된 하나 이상의 증상의 완화; 이환율 및 사망율 감소; 삶의 질의 개선; 종양발생성 감소; 암 줄기 세포의 수 또는 빈도 감소; 또는 효과들의 일부 조합.
본 개시내용 및 특허청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥적으로 명확하게 달리 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다.
실시양태가 본원에서 "포함하는"이라는 표현과 함께 기재되는 어떠한 경우에든, "~로 이루어진" 및/또는 "~로 본질적으로 이루어진"의 표현으로 기재되지만 다른 면에서는 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다. 또한, 실시양태가 본원에서 "~로 본질적으로 이루어진"이라는 표현과 함께 기재되는 어떠한 경우에든, "~로 이루어진"의 표현으로 기재되지만 다른 면에서는 유사한 실시양태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 어구에 사용되는 용어 "및/또는"은 A 및 B 둘 다; A 또는 B; A (단독); 및 B (단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에 사용되는 용어 "및/또는"은 하기 각각의 실시양태: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)를 포함하도록 의도된다.
II. 히포 경로를 조절하는 작용제
본 발명은 히포 경로를 조절하는 작용제를 제공한다. 히포 경로는 세포-세포 접촉에 의해 조절되며, 이는 히포 경로 신호전달 사건을 지시 및/또는 제어하는 세포 표면 수용체가 존재함을 암시한다. 포유동물 세포에서의 이들 수용체의 정체는 설명되지 않았다. 상피 세포 생물학의 핵심적인 특징은 상피 세포가 단일-세포 층으로 존재한다는 것이다. 이에 따라, 이들은 3개의 구별된 표면인 루멘에 노출된 정단 표면, 기저막과 상호작용하는 기저측 막 및 인접 세포 간의 상호작용 영역을 형성하는 "세포간 표면"을 갖는다. 본 발명자들은, 상기 3번째 표면인 세포간 표면이 직접적인 세포-세포 통신을 가능하게 하는 영역일 가능성이 크기 때문에 추정 히포 경로 수용체는 일반적으로 이에 제한될 것이라고 가정하였다. 세포 부착 분자 (CAM)를 비롯한 다수의 단백질은 세포가 서로 그리고 그의 미세환경과 상호작용하는 것에 관여한다. 이들 단백질 중 일부는 세포간 막 영역 내에 상주하는 것으로 공지되어 있으며, 부착 접합부에 기여하는 카드헤린, 간극 접합부에 기여하는 코넥신, 및 치밀 접합부에 기여하는 클라우딘 및 오클루딘을 포함한다. 이들 단백질 이외에, 다른 단백질도 치밀 접합부 및 부착 접합부에 의해 생성된 정단 접합부 복합체에 상주하는 것으로 생각된다.
흥미롭게도, 이들 세포간 표면 단백질 중 다수는 다양한 바이러스에 대한 수용체로서 확인되었다. 바이러스는 세포간 계면 내의 이들 수용체의 국재화를 이용하도록 진화하였을 가능성이 크며, 이는 면역계에 의한 공격 및 클리어런스에 보다 취약해질 수 있는 루멘에 대한 노출 없이 증진된 세포 간의 바이러스 확산을 허용할 수 있다. 이들 단백질 중에는 콕사키 바이러스 및 아데노바이러스에 대한 수용체인 CAR (또는 CXAR), 폴리오바이러스 수용체인 PVR, 헤르페스 바이러스에 대한 수용체인 PVRL1, 홍역 바이러스에 대한 수용체인 PVRL4 및 레오바이러스에 대한 수용체인 접합부 부착 분자 (JAM1 또는 JAM-A)가 있다. 예를 들어, 문헌 [Barton et al., 2001, Cell 104:441-451; Gonzalez-Mariscal et al., 2009, Front. Biosci., 14:731-768; Muhlebach et al., 2011, Nature 480:530-533]을 참조한다.
세포간 표면 수용체 중 다수는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 세포 부착 분자 (IgCAM)의 구성원이고, 일반적으로 구조 및 기능 둘 다에서 관련된다. 이들 단백질 중 대부분은 제I형 막횡단 단백질이며, 이는 전형적으로 하나 이상의 Ig-유사 도메인을 함유하는 세포외 도메인 (ECD), 단일 막횡단 도메인 및 세포질 꼬리로 이루어진다. IgCAM 구성원은 그의 N-말단 Ig-유사 도메인을 통한 상호작용을 매개하며, 이는 통상적으로 대향 세포 표면 상의 다른 Ig-유사 도메인에 결합하고 (동종친화성 부착), 또한 인테그린 및 탄수화물과 상호작용한다 (이종친화성 부착) (Wong et al., 2012, Int. J. Cell Biol.; epub). 흥미롭게도, IgCAM 분자 중 다수는 또한 면역 세포 상에서도 발현되며, 이는 세포간 계면 내의 그의 정상적인 국재화가 변경되는 경우에 면역감시 메카니즘이 유발될 수 있음을 시사한다. 히포 경로를 조절하는 수용체를 확인하기 위해, 본 발명자들은 이러한 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리의 특정한 하위세트가 히포 경로에서의 세포간 신호전달을 매개하기에 아주 유리한 입장에 있을 것이라고 가정하였다.
따라서, 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 작용제는 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 세포 부착 분자 (IgCAM)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합한다. 이들 작용제는 본원에서 "IgCAM-결합제"로서 지칭된다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 소분자이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 소형 펩티드이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 JAM 패밀리, PVR 패밀리 및/또는 CADM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 결합한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 JAM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 결합한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 PVR 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 결합한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 결합한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 결합한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CLMP, VSIG4, VSIG8, JAM2, JAM3, CADM1, CADM3, CADM4, PVRL1, PVRL3, PVRL4, TIGIT, TMIGD1 및/또는 TMEM25에 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM1, CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3에 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3에 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM3에 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM1에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 초과의 IgCAM에 특이적으로 결합한다. 다수의 인간 IgCAM에 대한 전장 아미노산 (aa) 서열은 당업계에 공지되어 있고, 몇몇은 본원에 서열 1 (AMICA), 서열 2 (CAR), 서열 3 (CLMP), 서열 4 (ESAM), 서열 5 (GPA33), 서열 6 (JAM1), 서열 7 (JAM2), 서열 8 (JAM3), 서열 9 (VSIG1), 서열 10 (VSIG2), 서열 11 (VSIG3), 서열 12 (VSIG4), 서열 13 (VSIG8), 서열 14 (CADM1), 서열 15 (CADM2), 서열 16 (CADM3), 서열 17 (CADM4), 서열 18 (CRTAM), 서열 19 (TMIGD1), 서열 20 (CD96), 서열 21 (CD200), 서열 22 (CD200R1), 서열 23 (CD200R1L), 서열 24 (CD226), 서열 25 (PVRIG), 서열 26 (PVR), 서열 27 (PVRL1), 서열 28 (PVRL2), 서열 29 (PVRL3), 서열 30 (PVRL4), 서열 31 (TIGIT) 및 서열 32 (TMEM25)로서 제공된다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 IgCAM의 효능제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 JAM 패밀리, PVR 패밀리 및/또는 CADM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 효능제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 JAM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 효능제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 PVR 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 효능제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 효능제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 효능제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 효능제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CLMP, VSIG4, VSIG8, JAM2, JAM3, CADM3, CADM4, PVRL1, PVRL3, PVRL4, TIGIT, TMIGD1 및/또는 TMEM25의 효능제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM1, CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3의 효능제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3의 효능제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM3의 효능제이다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 활성화한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 유도한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 핵으로의 YAP 전위를 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 인산화를 증진 또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 분해를 증진 또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 세포질에서의 YAP 잔류 또는 격리를 증진 또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP-의존성 유전자 또는 YAP-의존성 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시킨다. 용어 "YAP-의존성 유전자(들)"는 그의 발현이 YAP에 의해 조절 (예를 들어, 증가 또는 감소)되는 유전자를 지칭한다. 이 용어는 그의 발현이 YAP 및 전사 인자의 조합에 의해 조절되는 유전자, 하위세트 또는 개별 유전자의 총괄적인 군을 반영하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 핵으로의 TAZ 전위를 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 인산화를 증진 또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 분해를 증진 또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 세포질에서의 TAZ 잔류를 증진 또는 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ-의존성 유전자 또는 TAZ-의존성 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시킨다. 용어 "TAZ-의존성 유전자(들)"는 그의 발현이 TAZ에 의해 조절 (예를 들어, 증가 또는 감소)되는 유전자를 지칭한다. 이 용어는 그의 발현이 TAZ 및 전사 인자의 조합에 의해 조절되는 유전자, 하위세트 또는 개별 유전자의 총괄적인 군을 반영하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, ADAMTS5, AXL, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시킨다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 접촉-의존성 성장 억제를 증진시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 증식을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 고정-비의존성 성장을 억제한다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 IgCAM의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 JAM 패밀리, PVR 패밀리 및/또는 CADM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 JAM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 PVR 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM 패밀리로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CLMP, VSIG4, VSIG8, JAM2, JAM3, CADM3, CADM4, PVRL1, PVRL3, PVRL4, TIGIT, TMIGD1 및/또는 TMEM25의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM1, CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM3의 길항제이다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 저해한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 핵으로의 YAP 전위를 촉진한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 인산화를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 분해를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 세포질에서의 YAP 잔류를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 핵으로의 TAZ 전위를 촉진한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 인산화를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 분해를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 세포질에서의 TAZ 잔류를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 신호전달 경로에 의해 저해되는 유전자의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 증가시킨다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 IgCAM에 결합하고, 제2 단백질과 IgCAM의 상호작용을 방해한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 IgCAM에 결합하고, 제2 IgCAM과 IgCAM의 상호작용을 방해한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 제2 IgCAM과 하나 이상의 IgCAM의 상호작용을 방해하는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 제2 IgCAM과 하나 이상의 IgCAM의 상호작용을 방해하는 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 제2 IgCAM과 하나 이상의 IgCAM의 상호작용을 방해하는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 제2 IgCAM과 하나 이상의 IgCAM의 상호작용을 방해하는 가용성 수용체를 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 제2 IgCAM과 하나 이상의 IgCAM의 상호작용을 방해하는 소분자이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 제2 IgCAM과 하나 이상의 IgCAM의 상호작용을 방해하는 소형 펩티드이다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 IgCAM 단백질에 약 1μM 이하, 약 100nM 이하, 약 40nM 이하, 약 20nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하 또는 약 0.1nM 이하의 해리 상수 (KD)로 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 IgCAM에 약 1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 IgCAM에 약 0.1nM 이하의 KD로 결합한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 IgCAM-결합제는 하나 이상의 추가의 IgCAM에 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 인간 IgCAM에 약 0.1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 인간 IgCAM 및 마우스 IgCAM 둘 다에 약 10nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 인간 IgCAM 및 마우스 IgCAM 둘 다에 약 1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 인간 IgCAM 및 마우스 IgCAM 둘 다에 약 0.1nM 이하의 KD로 결합한다. 일부 실시양태에서, IgCAM에 대한 결합제의 해리 상수는 비아코어(Biacore) 칩 상에 고정화된 IgCAM의 적어도 일부 또는 단편을 포함하는 IgCAM 융합 단백질을 사용하여 결정된 해리 상수이다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 인간 IgCAM에 약 1μM 이하, 약 100nM 이하, 약 40nM 이하, 약 20nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하 또는 약 0.1nM 이하의 반수 최대 유효 농도 (EC50)로 결합한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 또한 하나 이상의 추가의 IgCAM에 약 40nM 이하, 약 20nM 이하, 약 10nM 이하, 약 1nM 이하 또는 약 0.1nM 이하의 EC50로 결합한다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 재조합 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편이다. 일부 실시양태에서, 항체는 1가이다. 일부 실시양태에서, 항체는 2가이다. 일부 실시양태에서, 항체는 단일특이적이다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 또는 다중특이적이다. 일부 실시양태에서, 항체는 세포독성 모이어티에 접합된다. 일부 실시양태에서, 항체는 단리된다. 일부 실시양태에서, 항체는 실질적으로 순수하다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 폴리클로날 항체이다. 폴리클로날 항체는 임의의 공지된 방법에 의해 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리클로날 항체는 관련 항원 (예를 들어, 정제된 펩티드 단편, 전장 재조합 단백질 또는 융합 단백질)의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 동물 (예를 들어, 토끼, 래트, 마우스, 염소 또는 당나귀)을 면역화시킴으로써 발생된다. 항원은 담체, 예컨대 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 혈청 알부민에 임의로 접합될 수 있다. 항원을 (운반 단백질의 존재 또는 부재 하에) 멸균 염수 중에 희석하고, 통상적으로 아주반트 (예를 들어, 완전 또는 불완전 프로인트 아주반트)와 조합하여 안정한 에멀젼을 형성한다. 충분한 기간 후에, 면역화된 동물의 혈액, 복수 등으로부터 폴리클로날 항체를 회수한다. 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 투석을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 당업계의 표준 방법에 따라 폴리클로날 항체를 혈청 또는 복수로부터 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 모노클로날 항체이다. 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 하이브리도마 방법을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497] 참조). 일부 실시양태에서, 하이브리도마 방법을 사용하여, 마우스, 햄스터 또는 다른 적합한 숙주 동물을 상기 기재된 바와 같이 면역화시킴으로써, 면역화 항원에 특이적으로 결합할 항체의 생산을 림프구로부터 유발한다. 일부 실시양태에서, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역화 항원은 인간 단백질, 또는 그의 일부 또는 단편일 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역화 항원은 마우스 단백질, 또는 그의 일부 또는 단편일 수 있다.
면역화 후에, 림프구를 단리하고, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 적합한 골수종 세포주와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하고, 이어서 이를 융합되지 않은 림프구 및 골수종 세포로부터 선택할 수 있다. 선택된 항원에 대해 특이적으로 지시된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 면역침전, 이뮤노블롯팅 및 시험관내 결합 검정 (예를 들어, 유동 세포측정법, FACS, ELISA 및 방사성면역검정)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법에 의해 확인할 수 있다. 하이브리도마는 표준 방법을 사용하여 시험관내 배양으로 증식시키거나 (J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, San Diego, CA) 또는 생체내에서 동물의 복수 종양으로서 증식시킬 수 있다. 모노클로날 항체는 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 겔 전기영동 및 투석을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 당업계의 표준 방법에 따라 배양 배지 또는 복수액으로부터 정제할 수 있다.
특정 실시양태에서, 모노클로날 항체는 당업자에게 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567 참조). 모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를, 예컨대 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자를 특이적으로 증폭시키는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 성숙 B-세포 또는 하이브리도마 세포로부터 단리하고, 통상적인 기술을 사용하여 그의 서열을 결정한다. 이어서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를, 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli), 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포 내로 형질감염시키는 경우에 모노클로날 항체를 생산하는 적합한 발현 벡터 내로 클로닝한다. 다른 실시양태에서는, 재조합 모노클로날 항체 또는 그의 단편을, 원하는 종의 CDR 및/또는 가변 영역을 발현하는 파지 디스플레이 라이브러리로부터 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; 및 Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597] 참조).
모노클로날 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드(들)를 재조합 DNA 기술을 사용하여 매우 다양한 방식으로 추가로 변형시켜, 대안적인 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예를 들어 마우스 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 불변 도메인을, 예를 들어 인간 항체의 이들 영역에 대해 치환하여 키메라 항체를 생성하거나, 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대해 치환하여 융합 항체를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 불변 영역을 말단절단 또는 제거하여 목적하는 모노클로날 항체의 항체 단편을 생성한다. 가변 영역(들)의 부위-지정 또는 고밀도 돌연변이유발을 사용하여 모노클로날 항체의 특이성, 친화도 등을 최적화할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 IgCAM에 대한 모노클로날 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로 인간화 항체는, 당업자에게 공지된 방법의 사용에 의해 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종 (예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터 등)의 CDR로부터의 잔기에 의해 대체된 인간 이뮤노글로불린이다. 일부 실시양태에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 갖는 비-인간 종으로부터의 항체에서의 상응하는 잔기로 대체된다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 항체 특이성, 친화도 및/또는 결합 능력을 개선하고 최적화하기 위해 Fv 프레임워크 영역 내 및/또는 대체된 비-인간 잔기 내의 추가의 잔기의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 인간화 항체는 비-인간 이뮤노글로불린에 상응하는 모든 또는 실질적으로 모든 CDR을 함유하는 1개 이상, 전형적으로는 2 또는 3개의 가변 도메인 영역을 실질적으로 모두 포함할 수 있지만, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 또한 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것인 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 일부 또는 단편을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 인간화 항체는 인간 대상체에 투여되는 경우에 항원성 및 HAMA (인간 항-마우스 항체) 반응을 감소시킬 수 있기 때문에 치료적으로 사용된다. 당업자는 공지된 기술에 따라 감소된 면역원성을 갖는 기능적 인간화 항체를 수득할 수 있을 것이다 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 및 5,693,762 참조).
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 인간 항체이다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 직접 제조할 수 있다. 일부 실시양태에서, 시험관 내에서 면역화되거나, 또는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생산하는 면역화된 개체로부터 단리된 불멸화 인간 B 림프구가 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147:86-95]; 및 미국 특허 번호 5,750,373; 5,567,610 및 5,229,275 참조). 일부 실시양태에서, 인간 항체는 인간 항체를 발현하는 파지 라이브러리로부터 선택될 수 있다 (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). 대안적으로, 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 면역화되지 않은 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내 생산할 수 있다. 항체 파지 라이브러리의 생성 및 사용에 대한 기술은 또한 미국 특허 번호 5,969,108; 6,172,197; 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; 및 7,264,963; 및 문헌 [Rothe et al., 2008, J. Mol. Bio., 376:1182-1200]에 기재되어 있다. 쇄 셔플링 (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783) 및 부위-지정 돌연변이유발을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 친화도 성숙 전략이 당업계에 공지되어 있고, 이를 사용하여 고친화도 인간 항체를 생성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 함유하는 트랜스제닉 마우스에서 생산될 수 있다. 이들 마우스는 면역화 시에, 내인성 이뮤노글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 전체 레퍼토리를 생산할 수 있다. 이러한 접근법은 미국 특허 번호 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 및 5,661,016에 기재되어 있다.
본 발명은 하나 이상의 인간 IgCAM 단백질을 특이적으로 인식하는 이중특이적 항체를 또한 포함한다. 이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프를 특이적으로 인식하여 이에 결합할 수 있다. 상이한 에피토프는 동일한 분자 내에 (예를 들어, 하나의 인간 IgCAM 상의 2개의 에피토프) 또는 상이한 분자 상에 (예를 들어, 하나의 인간 IgCAM 상의 1개의 에피토프 및 제2 분자 상의 1개의 에피토프) 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체는 모노클로날 인간 또는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 제1 항원 표적 (예를 들어, IgCAM) 뿐만 아니라 제2 항원 표적, 예컨대 백혈구 상의 이펙터 분자 (예를 들어, CD2, CD3, CD28, CD80 또는 CD86) 또는 Fc 수용체 (예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16)를 특이적으로 인식하고 그에 결합하여, 제1 항원 표적을 발현하는 세포에 세포 방어 메카니즘을 집중시키도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 항체를 사용하여 세포독성제를 특정한 표적 항원을 발현하는 세포에 지시할 수 있다. 이러한 항체는 항원-결합 아암, 및 세포독성제 또는 방사성핵종 킬레이트화제, 예컨대 EOTUBE, DPTA, DOTA 또는 TETA에 결합하는 아암을 보유한다.
이중특이적 항체를 제조하는 기술은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science, 229:81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol., 121:120; Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol., 152:5368]; 미국 특허 번호 5,731,168; 및 미국 특허 공개 번호 2011/0123532를 참조한다. 이중특이적 항체는 무손상 항체 또는 항체 단편일 수 있다. 2가 초과의 원자가를 갖는 항체가 또한 고려된다. 예를 들어, 삼중특이적 항체가 제조될 수 있다 (Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60). 따라서, 특정 실시양태에서 IgCAM에 대한 항체는 다중특이적이다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체 (또는 다른 폴리펩티드)는 단일특이적일 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 항체가 함유하는 하나 이상의 항원-결합 부위 각각은 하나 초과의 IgCAM 상의 상동성 에피토프에 결합할 수 있다 (또는 결합한다). 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 단일특이적 항체의 항원-결합 부위는, 예를 들어 PVR 및 PVRL1에 결합할 수 있다 (또는 결합한다) (즉, 동일한 에피토프가 PVR 뿐만 아니라 PVRL1 단백질 상에서 발견됨).
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체 단편이다. 항체 단편은 무손상 항체와는 상이한 기능 또는 능력을 가질 수 있으며; 예를 들어 항체 단편은 증가된 종양 침투를 가질 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다양한 기술, 예컨대 비제한적으로 무손상 항체의 단백질분해적 소화가 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생산된 F(ab')2 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 감소시킴으로써 생성된 Fab 단편을 포함한다. 다른 실시양태에서, 항체 단편은 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 생성된 Fab 단편을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 재조합적으로 생산된다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 Fv 또는 단일 쇄 Fv (scFv) 단편을 포함한다. Fab, Fv 및 scFv 항체 단편은 이들 단편의 다량 생산을 허용하는 이. 콜라이 또는 다른 숙주 세포에서 발현되고, 이로부터 분비될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 본원에 논의된 바와 같은 항체 파지 라이브러리로부터 단리된다. 예를 들어, Fab 발현 라이브러리의 구축을 위한 방법을 사용하여 (Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281), IgCAM, 또는 그의 유도체, 단편, 유사체 또는 상동체에 대해 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편을 신속하고 효과적으로 확인하도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 단편은 선형 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 항체 단편은 단일특이적 또는 이중특이적이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 scFv이다. 하나 이상의 인간 IgCAM에 특이적인 단일-쇄 항체의 생산을 위한 다양한 기술을 사용할 수 있으며, 이는 당업자에게 공지되어 있다.
추가로, 특히 항체 단편의 경우에는 혈청 반감기를 증가 (또는 감소)시키도록 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는, 예를 들어 항체 단편 내 적절한 영역의 돌연변이에 의한 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프의 항체 단편 내로의 혼입, 또는 상기 에피토프의 펩티드 태그 내로의 혼입, 및 이어서 말단 또는 중간에서의 항체 단편과의 융합 (예를 들어, DNA 또는 펩티드 합성에 의함)에 의해 달성될 수 있다.
이종접합체 항체가 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 이종접합체 항체는 2개의 공유 연결된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역 세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화하도록 제안되었다 (미국 특허 번호 4,676,980). 또한, 이종접합체 항체는 합성 단백질 화학에서 공지된 방법, 예컨대 가교제를 포함하는 것을 사용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 사용하거나 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 구축될 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트를 포함한다.
본 발명의 목적을 위해, 변형된 항체는 항체와 표적 (즉, 인간 IgCAM)의 회합을 제공하는 임의 유형의 가변 영역을 포함할 수 있음을 알아야 한다. 이와 관련하여, 가변 영역은, 체액 반응 개시 및 목적하는 종양 연관 항원에 대한 이뮤노글로불린 생성을 유도할 수 있는 임의 유형의 포유동물의 것을 포함하거나 또는 이로부터 유래할 수 있다. 이에 따라, 변형된 항체의 가변 영역은, 예를 들어 인간, 뮤린, 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 원숭이, 마카크 등) 또는 토끼 기원일 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 이뮤노글로불린의 가변 및 불변 영역은 둘 다 인간 기원이다. 다른 실시양태에서, 적합성 항체의 가변 영역 (통상적으로는 비-인간 공급원으로부터 유래됨)은 분자의 결합 특성을 개선하거나 또는 면역원성을 감소시키도록 조작되거나 또는 특이적으로 조정될 수 있다. 이러한 점에서, 본 발명에 유용한 가변 영역은 인간화될 수 있거나, 또는 다르게는 개입된 아미노산 서열의 포함을 통해 변경될 수 있다.
특정 실시양태에서, 중쇄 및 경쇄 둘 다에서의 가변 도메인은 하나 이상의 CDR의 적어도 부분적인 대체에 의해, 필요한 경우에는 부분 프레임워크 영역 대체 및 서열 변형 및/또는 변경에 의해 변경된다. CDR은, 프레임워크 영역이 유래되는 항체와 동일한 부류 또는 심지어는 하위부류의 항체로부터 유래될 수 있지만, CDR은 다양한 부류의 항체로부터, 바람직하게는 다양한 종의 항체로부터 유래될 것으로 예상된다. 하나의 가변 도메인의 항원 결합 능력을 또 다른 가변 도메인으로 전달하기 위해 모든 CDR을 공여자 가변 영역으로부터의 모든 CDR로 대체할 필요는 없을 수도 있다. 그보다는, 항원-결합 부위의 활성을 유지하는데 필요한 잔기를 전달하는 것만이 필요할 수 있다.
가변 영역에 대한 변경에도 불구하고, 당업자는 본 발명의 변형된 항체가, 원하는 생화학적 특징, 예컨대 천연 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성을 갖는 항체와 비교하여 증가된 종양 국재화 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하도록 적어도 1개 이상의 불변 영역 도메인의 분획이 결실되거나 또는 달리 변경된 항체 (예를 들어, 전장 항체 또는 그의 면역반응성 단편)를 포함할 것임을 알 것이다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역은 인간 불변 영역을 포함할 것이다. 본 발명과 상용성인 불변 영역에 대한 변형은 1개 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함한다. 본원에 개시된 변형된 항체는 3개의 중쇄 불변 도메인 (CH1, CH2 또는 CH3) 중 1개 이상 및/또는 경쇄 불변 도메인에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체의 불변 영역으로부터의 1개 이상의 도메인이 부분적으로 또는 전체적으로 결실된다. 일부 실시양태에서, 변형된 항체는 전체 CH2 도메인이 제거된 도메인 결실 구축물 또는 변이체 (ΔCH2 구축물)를 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재하는 불변 영역에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개 아미노산 잔기)에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 변형된 항체는 CH3 도메인이 항체의 힌지 영역에 직접 융합되도록 조작된다. 다른 실시양태에서는, 펩티드 스페이서가 힌지 영역과 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고 나머지 CH3 도메인 (변형되거나 또는 변형되지 않음)이 5-20개 아미노산 스페이서에 의해 힌지 영역에 결합된 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 첨가하여, 불변 도메인의 조절 요소가 유리되고 접근가능하게 유지되거나, 또는 힌지 영역이 가요성으로 유지되도록 보장할 수 있다. 그러나, 일부 경우에는 아미노산 스페이서가 면역원성이어서 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있음에 주목해야 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 구축물에 첨가된 임의의 스페이서는 변형된 항체의 원하는 생물학적 질을 유지하도록 비교적 비-면역원성일 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 항체는 불변 도메인의 부분 결실, 또는 수 개 또는 심지어 단일 아미노산의 치환만을 가질 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시켜 암 세포 국재화 및/또는 종양 침투를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 조절하고자 하는 특이적 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 C1q 결합)을 제어하는 1개 이상의 불변 영역 도메인의 일부분을 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 불변 영역 무손상과 연관된 다른 바람직한 기능은 남기면서 항체의 선택된 특징 (예를 들어, 혈청 반감기)을 개선할 수 있다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 개시된 항체의 불변 영역은 생성된 구축물의 기능을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 항체의 구성 및 면역원성 프로파일은 실질적으로 유지시키면서, 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예를 들어, Fc 결합)을 방해하는 것이 가능할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 항체는 원하는 특징, 예컨대 이펙터 기능의 감소 또는 증가를 증진시키거나 또는 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착 부위를 제공하도록 불변 영역에 대한 하나 이상의 아미노산의 부가를 포함한다.
불변 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 또는 IgM 항체 (상기 항체가 항원에 결합된 경우)의 Fc 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체계를 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 자가면역 과민반응에 관여할 수 있다. 또한, 항체의 Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 세포에 결합할 수 있다. 다양한 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체, 예컨대 IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)이 존재한다. 세포 표면 상의 Fc 수용체에 대한 항체의 결합은 다수의 중요하고 다양한 생물학적 반응, 예컨대 항체-코팅된 입자의 포식 및 파괴, 면역 복합체의 클리어런스, 항체-코팅된 표적 세포의 킬러 세포에 의한 용해 (항체-의존성 세포 세포독성 또는 ADCC로 불림), 염증 매개물의 방출, 태반 전달 및 이뮤노글로불린 생산의 제어를 유발한다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합 항체는 변경된 이펙터 기능을 제공하며, 이는 결과적으로 투여된 항체의 생물학적 프로파일에 영향을 미친다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 불변 영역 도메인의 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 항체의 Fc 수용체 결합을 감소시켜, 암 세포 국재화 및/또는 종양 침투를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 불변 영역 변형은 항체의 혈청 반감기를 증가 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 디술피드 연결 또는 올리고사카라이드 모이어티가 제거되도록 변형된다. 본 발명에 따른 불변 영역에 대한 변형은 당업자에게 널리 공지된 생화학적 또는 분자적 공학 기술을 사용하여 용이하게 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체인 IgCAM-결합제는 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항체는 ADCC 활성 및/또는 보체-의존성 세포독성 (CDC) 활성을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 이 항체는 이펙터 기능을 갖지 않는다.
본 발명은 본원에 제시된 키메라, 인간화 및 인간 항체, 또는 그의 항체 단편과 실질적으로 상동성인 변이체 및 등가물을 추가로 포함한다. 이들은, 예를 들어 보존적 치환 돌연변이, 즉 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 함유할 수 있다. 예를 들어, 보존적 치환은 아미노산을 동일한 공통 부류 내의 또 다른 아미노산으로 치환하는 것, 예컨대 예를 들어 하나의 산성 아미노산을 또 다른 산성 아미노산으로, 하나의 염기성 아미노산을 또 다른 염기성 아미노산으로, 또는 하나의 중성 아미노산을 또 다른 중성 아미노산으로 치환하는 것을 지칭한다. 보존적 아미노산 치환에 의해 의도되는 것은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본원에 기재되어 있다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 IgCAM에 결합하는 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 IgCAM에 결합하는 항체를 생산하는 방법은 하이브리도마 기술을 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 생산하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 33, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 34, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 35, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 36, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 37, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 38, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 39, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 40, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 41, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 42, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 43, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 44, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 45, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 46, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 47, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 48, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 49, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 50, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 51, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 52, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 53, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 54, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 55, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 56, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 57, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 58, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 59, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 60, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 61, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 62, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 63, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 서열 64, 또는 그의 일부 또는 단편을 면역원으로서 사용하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 IgCAM에 결합하는 항체를 생성하는 방법은 인간 파지 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본 발명은 하나 이상의 IgCAM에 결합하는 항체를 확인하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 FACS를 사용하여 IgCAM, 또는 그의 일부 또는 단편에 결합하는 것에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 ELISA를 사용하여 IgCAM, 또는 그의 일부 또는 단편에 결합하는 것에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 클론원성 검정에서 세포 형태에 대한 효과에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 클론원성 검정에서 세포 성장 및/또는 증식에 대한 효과에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 히포 경로 신호전달의 활성화 또는 증진에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 YAP 활성화의 억제에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 YAP의 전위에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 YAP 인산화에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 TAZ 활성화의 억제에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 TAZ의 전위에 대해 스크리닝함으로써 확인된다. 일부 실시양태에서, 항체는 TAZ 인산화에 대해 스크리닝함으로써 확인된다.
일부 실시양태에서, 인간 IgCAM에 대한 항체를 생성하는 방법은 인간 IgCAM의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgCAM에 대한 항체를 생성하는 방법은 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25로부터의 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 IgCAM에 대한 항체를 생성하는 방법은 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64의 적어도 일부 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 포유동물로부터 항체 또는 항체-생산 세포를 단리하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 인간 IgCAM에 결합하는 모노클로날 항체를 생성하는 방법은 (a) AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25로부터의 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드로 포유동물을 면역화시키는 것; (b) 면역화된 포유동물로부터 항체-생산 세포를 단리하는 것; (c) 항체-생산 세포를 골수종 세포주의 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 (d) 하나 이상의 IgCAM에 결합하는 항체를 발현하는 하이브리도마 세포를 선택하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 히포 경로 효능제이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 히포 경로 신호전달을 활성화하고/거나 증가시키고/거나 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 YAP 인산화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 YAP 분해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 세포질에서의 YAP의 잔류를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 YAP 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 핵으로의 YAP 전위를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 TAZ 인산화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 TAZ 분해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 세포질에서의 TAZ의 잔류를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 TAZ 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 핵으로의 TAZ 전위를 억제한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 히포 경로 길항제이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 히포 경로 신호전달을 억제하고/거나 감소시키고/거나 저해한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 YAP 인산화를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 YAP 분해를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 세포질에서의 YAP의 잔류를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 YAP 활성화를 증가 또는 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 핵으로의 YAP 전위를 증가 또는 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 TAZ 인산화를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 TAZ 분해를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 세포질에서의 TAZ의 잔류를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 TAZ 활성화를 증가 또는 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 항체는 핵으로의 TAZ 전위를 증가 또는 증진시킨다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 IgCAM에 대한 항체를 생산하는 방법은 단일 항원-결합 부위를 포함하는 막-결합 이종이량체 분자를 사용하여 항체를 확인하는 것을 포함한다. 일부 비제한적 실시양태에서, 항체는 그 전문이 본원에 참조로 포함된 국제 공개 WO 2011/100566에 기재된 방법 및 폴리펩티드를 사용하여 확인된다.
일부 실시양태에서, 하나 이상의 인간 IgCAM에 대한 항체를 생산하는 방법은 하나 이상의 인간 IgCAM에 결합하는 항체에 대해 항체-발현 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 파지 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 포유동물 세포 디스플레이 라이브러리이다. 일부 실시양태에서, 스크리닝은 패닝을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 인간 IgCAM의 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 단편을 사용하여 스크리닝된다. 일부 실시양태에서, 항체-발현 라이브러리는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 인간 IgCAM의 세포외 도메인의 적어도 일부 또는 단편을 사용하여 스크리닝된다. 일부 실시양태에서, 제1 스크리닝에서 확인된 항체를 상이한 IgCAM을 사용하여 다시 스크리닝함으로써, 하나 초과의 IgCAM에 결합하는 항체를 확인한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 단리된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 실질적으로 순수하다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 IgCAM의 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 IgCAM의 세포외 도메인 (예를 들어, IgCAM의 N-말단 도메인)의 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM의 세포외 도메인의 단편을 포함하는 가용성 수용체는 전체 IgCAM ECD를 포함하는 가용성 수용체와 비교하여 변경된 생물학적 활성 (예를 들어, 증가된 단백질 반감기)을 나타낼 수 있다. 단백질 반감기는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 폴리에틸렌 옥시드 (PEO)로의 공유 변형에 의해 추가로 증가될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgCAM은 인간 IgCAM이다. 특정 실시양태에서, IgCAM ECD 또는 IgCAM ECD의 단편은 JAM 패밀리, PVR 패밀리 또는 CADM 패밀리로부터 선택된 인간 IgCAM ECD이다. 특정 실시양태에서, IgCAM ECD는 JAM 패밀리로부터 선택된 인간 IgCAM ECD이다. 특정 실시양태에서, IgCAM ECD는 PVR 패밀리로부터 선택된 인간 IgCAM ECD이다. 특정 실시양태에서, IgCAM ECD는 CADM 패밀리로부터 선택된 인간 IgCAM ECD이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgCAM ECD는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25로부터의 IgCAM ECD이다. 특정 실시양태에서, 인간 IgCAM ECD는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25로부터의 IgCAM ECD이다. 일부 실시양태에서, 인간 IgCAM ECD는 CLMP, VSIG4, VSIG8, JAM2, JAM3, CADM3, CADM4, PVRL1, PVRL3, PVRL4, TIGIT, TMIGD1 및/또는 TMEM25로부터의 IgCAM ECD이다. 일부 실시양태에서, 인간 IgCAM ECD는 CADM1, CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3으로부터의 IgCAM ECD이다. 일부 실시양태에서, 인간 IgCAM ECD는 CADM3, PVRL1 및/또는 PVRL3으로부터의 IgCAM ECD이다. 일부 실시양태에서 인간 IgCAM ECD는 CADM3으로부터의 IgCAM ECD이다. 일부 실시양태에서, 인간 IgCAM ECD는 CADM1로부터의 것이 아니다.
AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25에 대한 추정 ECD 도메인은 서열 33-64로서 제공된다. 당업자가 다양한 ECD 도메인에 상응하는 정확한 아미노산을 이해할 때 차이가 있을 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 ECD의 N-말단 및/또는 C-말단은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산만큼 연장 또는 단축될 수 있다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서 IgCAM-결합제는, 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 등)의 보존적 치환을 포함하고 IgCAM(들)에 결합할 수 있는 상기 언급된 IgCAM ECD 서열 중 어느 하나의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제, 예컨대 인간 IgCAM의 ECD를 포함하는 가용성 수용체는 융합 단백질이다. 본원에 사용된 "융합 단백질"은 2개 이상의 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 발현되는 하이브리드 단백질이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제, 예컨대 인간 IgCAM의 ECD를 포함하는 가용성 수용체는 비-IgCAM 폴리펩티드를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM 가용성 수용체는 다른 비-IgCAM 기능적 및 구조적 폴리펩티드, 예컨대 비제한적으로 인간 Fc 영역, 단백질 태그 (예를 들어, myc, FLAG, GST), 다른 내인성 단백질 또는 단백질 단편, 또는 IgCAM ECD와 제2 폴리펩티드 사이의 임의의 링커 영역을 포함하는 임의의 다른 유용한 단백질 서열에 연결된 IgCAM ECD를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 비-IgCAM 폴리펩티드는 인간 Fc 영역이다. Fc 영역은 이뮤노글로불린의 부류 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE 중 임의의 것으로부터 획득될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG1 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 인간 IgG2 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 야생형 Fc 영역의 천연 변이체이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 돌연변이된 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 N-말단에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산만큼 말단절단된다 (예를 들어, 힌지 도메인에서). 일부 실시양태에서, Fc 영역은 C-말단에서 말단절단된다 (예를 들어, 리신이 부재함). 일부 실시양태에서, 바람직하지 않은 디술피드 결합 형성을 방해하기 위해 힌지 도메인 내의 아미노산을 변화시킨다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 않은 디술피드 결합 형성을 방해하기 위해 시스테인을 상이한 아미노산으로 대체한다. 일부 실시양태에서, 바람직하지 않은 디술피드 결합 형성을 방해하기 위해 시스테인을 세린으로 대체한다. 특정 실시양태에서, 비-IgCAM 폴리펩티드는 서열 65, 서열 66 또는 서열 67을 포함한다. 특정 실시양태에서, 비-IgCAM 폴리펩티드는 서열 65, 서열 66 또는 서열 67로 본질적으로 이루어진다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 적어도 IgCAM ECD 또는 그의 단편 및 Fc 영역을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, IgCAM ECD의 C-말단은 이뮤노글로불린 Fc 영역의 N-말단에 연결된다. 일부 실시양태에서, IgCAM ECD는 Fc 영역에 직접 (즉, 개재 펩티드 링커 없이) 연결된다. 일부 실시양태에서, IgCAM ECD는 Fc 영역에 펩티드 링커를 통해 연결된다.
본원에 사용된 용어 "링커"는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, IgCAM ECD, 또는 그의 일부 또는 단편) 및 제2 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 영역) 사이에 삽입된 링커를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 링커는 펩티드 링커이다. 링커는 융합 단백질의 발현, 분비 또는 생물활성에 불리하게 영향을 미쳐서는 안 된다. 링커는 항원성이어서는 안 되고, 면역 반응을 유발해서는 안 된다. 적합한 링커는 당업자에게 공지되어 있으며, 종종 글리신 및 세린 잔기의 혼합물을 포함하고, 종종 입체 비장애인 아미노산을 포함한다. 유용한 링커에 혼입될 수 있는 다른 아미노산은 트레오닌 및 알라닌 잔기를 포함한다. 링커는 그 길이가, 예를 들어 1-50개 아미노산 길이, 1-22개 아미노산 길이, 1-10개 아미노산 길이, 1-5개 아미노산 길이 또는 1-3개 아미노산 길이의 범위일 수 있다. 링커는 SerGly, GGSG, GSGS, GGGS, S(GGS)n (여기서, n은 1-7임), GRA, 폴리(Gly), 폴리(Ala), ESGGGGVT (서열 74), LESGGGGVT (서열 75), GRAQVT (서열 76), WRAQVT (서열 77) 및 ARGRAQVT (서열 78)를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같은 링커는 제1 폴리펩티드 (예를 들어, IgCAM ECD)의 C-말단 또는 제2 폴리펩티드 (예를 들어, Fc 영역)의 N-말단으로부터의 아미노산 잔기를 포함하지 않는 개재 펩티드 서열이다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 서열 65, 서열 66 또는 서열 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64를 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 서열 65, 서열 66 또는 서열 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 링커에 의해 연결된다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64의 일부 또는 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 서열 65, 서열 66 또는 서열 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64의 일부 또는 단편을 포함하는 제1 폴리펩티드; 및 서열 65, 서열 66 또는 서열 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 링커에 의해 연결된다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64와 적어도 80% 동일한 제1 폴리펩티드; 및 서열 65, 서열 66 또는 서열 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 직접 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64와 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64와 적어도 80% 동일한 제1 폴리펩티드; 및 서열 65, 서열 66 또는 서열 67을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하며, 여기서 제1 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드에 링커에 의해 연결된다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리펩티드는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 또는 서열 64와 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다.
IgCAM은 일반적으로 단백질의 수송을 지시하는 신호 서열을 함유한다. 신호 서열 (신호 펩티드 또는 리더 서열로서도 또한 지칭됨)은 신생 폴리펩티드의 N-말단에 위치한다. 이는 폴리펩티드를 세포질 세망으로 표적화하고, 단백질은 그의 목적지, 예를 들어 소기관의 내부 공간으로, 내부 막으로, 세포 외부 막으로, 또는 분비를 통해 세포 외부로 분류된다. 대부분의 신호 서열은 단백질이 세포질 세망으로 수송된 후에 신호 펩티다제에 의해 단백질로부터 절단된다. 폴리펩티드로부터의 신호 서열의 절단은 통상적으로 아미노산 서열 내의 특정 부위에서 발생하고, 신호 서열 내의 아미노산 잔기에 좌우된다. 통상적으로는 1개의 특정 절단 부위가 있지만, 신호 펩티다제에 의해 1개 초과의 절단 부위가 인식되고/거나 사용될 수 있어 폴리펩티드의 비-균질 N-말단이 유발된다. 예를 들어, 신호 서열 내의 상이한 절단 부위의 사용은 N-말단 아미노산들이 상이하게 발현된 폴리펩티드를 유발할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩티드는 N-말단이 상이한 폴리펩티드들의 혼합물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, N-말단은 그 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 아미노산만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, N-말단은 그 길이가 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산만큼 상이하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 실질적으로 균질한데, 즉 폴리펩티드들의 N-말단이 동일하다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 1개 이상 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 등)의 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 1개의 절단 부위가 우세하도록 하는 아미노산 치환 및/또는 결실을 포함하고, 이에 의해 1개의 N-말단이 있는 실질적으로 균질한 폴리펩티드가 유발된다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드의 신호 서열은 천연 IgCAM 신호 서열이 아니다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 이뮤노글로불린의 Fc 영역을 포함한다. 당업자는, 본 발명의 결합제 중 일부가, 원하는 생화학적 특징, 예컨대 천연 또는 변경되지 않은 불변 영역을 포함하는 대략 동일한 면역원성의 융합 단백질과 비교하여 증가된 암 세포 국재화, 증가된 종양 침투, 감소된 혈청 반감기 또는 증가된 혈청 반감기를 제공하도록 Fc 영역의 적어도 일부가 결실되거나 또는 달리 변경된 융합 단백질을 포함할 것임을 알 것이다. Fc 영역에 대한 변형은 1개 이상의 도메인에서의 하나 이상의 아미노산의 부가, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 변형된 융합 단백질은 2개의 중쇄 불변 도메인 (CH2 또는 CH3) 중 1개 이상 또는 힌지 영역에 대한 변경 또는 변형을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서는, 전체 CH2 도메인이 제거될 수 있다 (△CH2 구축물). 일부 실시양태에서, 생략된 불변 영역 도메인은 부재하는 불변 영역 도메인에 의해 전형적으로 부여되는 분자 가요성의 일부를 제공하는 짧은 아미노산 스페이서 (예를 들어, 10개 aa 잔기)에 의해 대체된다.
일부 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 CH3 도메인이 힌지 영역 또는 제1 폴리펩티드에 직접 연결되도록 조작된다. 다른 실시양태에서는, 펩티드 스페이서가 힌지 영역 또는 제1 폴리펩티드와 변형된 CH2 및/또는 CH3 도메인 사이에 삽입된다. 예를 들어, CH2 도메인이 결실되고 나머지 CH3 도메인 (변형되거나 또는 변형되지 않음)이 5-20개 아미노산 스페이서에 의해 힌지 영역 또는 제1 폴리펩티드에 결합된 구축물이 발현될 수 있다. 이러한 스페이서를 첨가하여, 불변 도메인의 조절 요소가 유리되고 접근가능하게 유지되거나, 또는 힌지 영역이 가요성으로 유지되도록 보장할 수 있다. 그러나, 일부 경우에는 아미노산 스페이서가 면역원성이어서 구축물에 대해 원치 않는 면역 반응을 유도할 수 있음에 주목해야 한다. 따라서, 특정 실시양태에서, 구축물에 첨가된 임의의 스페이서는 융합 단백질의 원하는 생물학적 질을 유지하도록 비교적 비-면역원성일 것이다.
일부 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 불변 도메인의 부분 결실, 또는 수 개 또는 심지어 단일 아미노산의 치환만을 가질 수 있다. 예를 들어, CH2 도메인의 선택된 영역에서의 단일 아미노산의 돌연변이는 Fc 결합을 실질적으로 감소시켜 암 세포 국재화 및/또는 종양 침투를 증가시키기에 충분할 수 있다. 유사하게, 특정 이펙터 기능 (예를 들어, 보체 C1q 결합)을 제어하는 하나 이상의 불변 영역 도메인의 일부분을 단순히 결실시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 불변 영역의 부분 결실은 대상체 불변 영역 도메인 무손상과 연관된 다른 바람직한 기능은 남기면서 결합제의 선택된 특징 (예를 들어, 혈청 반감기)을 개선할 수 있다. 또한, 상기 언급된 바와 같이, 개시된 융합 단백질의 불변 영역은 생성된 구축물의 프로파일을 증진시키는 하나 이상의 아미노산의 돌연변이 또는 치환을 통해 변형될 수 있다. 이러한 점에서, 변형된 융합 단백질의 구성 및 면역원성 프로파일은 실질적으로 유지시키면서, 보존된 결합 부위에 의해 제공되는 활성 (예를 들어, Fc 결합)을 방해하는 것이 가능할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 원하는 특징, 예컨대 이펙터 기능의 감소 또는 증가를 증진시키거나 또는 보다 많은 세포독소 또는 탄수화물 부착 부위를 제공하도록 불변 영역에 대한 하나 이상의 아미노산의 부가를 포함한다.
불변 영역이 몇몇 이펙터 기능을 매개한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 또는 IgM 항체 (항원에 결합됨)의 Fc 영역에 대한 보체의 C1 성분의 결합은 보체계를 활성화한다. 보체의 활성화는 세포 병원체의 옵소닌화 및 용해에 중요하다. 보체의 활성화는 또한 염증 반응을 자극하고, 또한 자가면역 과민반응에도 관여할 수 있다. 또한, Fc 영역은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 세포에 결합한다. 다양한 부류의 항체에 특이적인 다수의 Fc 수용체, 예컨대 IgG (감마 수용체), IgE (엡실론 수용체), IgA (알파 수용체) 및 IgM (뮤 수용체)이 존재한다.
일부 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 변경된 이펙터 기능을 제공하며, 이는 결과적으로 투여된 작용제의 생물학적 프로파일에 영향을 미친다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 불변 영역 도메인의 (점 돌연변이 또는 다른 수단을 통한) 결실 또는 불활성화는 순환하는 변형된 작용제의 Fc 수용체 결합을 감소시켜, 암 세포 국재화 및/또는 종양 침투를 증가시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 불변 영역 변형은 작용제의 혈청 반감기를 증가 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 불변 영역은 디술피드 연결 또는 올리고사카라이드 모이어티 부착 부위가 제거되도록 변형된다.
특정 실시양태에서, 변형된 융합 단백질은 통상적으로 Fc 영역과 연관된 하나 이상의 이펙터 기능을 갖지 않는다. 일부 실시양태에서, 작용제는 ADCC 활성 및/또는 CDC 활성을 갖지 않는다. 특정 실시양태에서, 작용제는 Fc 수용체 및/또는 보체 인자에 결합하지 않는다. 특정 실시양태에서, 작용제는 이펙터 기능을 갖지 않는다.
본 발명의 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 특이적 결합에 대해 검정될 수 있다. 사용될 수 있는 면역검정은 비아코어 분석, FACS 분석, 면역형광, 면역세포화학, 웨스턴 블롯, 방사성면역검정, ELISA, "샌드위치" 면역검정, 면역침전 검정, 침전 반응, 겔 확산 침강소 반응, 면역확산 검정, 응집 검정, 보체-고정 검정, 면역방사측정 검정, 형광 면역검정 및 단백질 A 면역검정과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 검정 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 검정은 일상적이며, 당업계에 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NY] 참조).
예를 들어, 인간 IgCAM, 예컨대 PVR에 대한 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)의 특이적 결합은 ELISA를 사용하여 결정할 수 있다. ELISA 검정은 항원을 제조하고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트의 웰을 항원으로 코팅하고, 검출가능한 화합물, 예컨대 효소 기질 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제 또는 알칼리성 포스파타제)에 접합시킨 IgCAM-결합제를 웰에 첨가하고, 소정의 기간 동안 인큐베이션하고, 항원에 결합된 항체의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서는, IgCAM-결합제를 검출가능한 화합물에 접합시키지 않고, 대신에 IgCAM-결합제를 인식하는 제2의 접합된 항체를 웰에 첨가한다. 일부 실시양태에서, 웰을 항원으로 코팅하는 대신에, IgCAM-결합제를 웰에 코팅할 수 있고, 코팅된 웰에 항원을 첨가한 후에 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체를 첨가할 수 있다. 당업자는 검출되는 신호를 증가시키도록 변형될 수 있는 파라미터, 뿐만 아니라 당업계에 공지된 ELISA의 다른 변형에 대해 알고 있을 것이다.
또 다른 예에서, 인간 IgCAM에 대한 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)의 특이적 결합은 FACS를 사용하여 결정할 수 있다. FACS 스크리닝 검정은 융합 단백질 (예를 들어, PVR-CD4TM)로서 항원을 발현하는 cDNA 구축물을 생성하고, 구축물을 세포 내로 형질감염시키고, 항원을 세포의 표면 상에서 발현시키고, IgCAM-결합제를 형질감염된 세포와 혼합하고, 소정 기간 동안 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다. IgCAM-결합제에 의해 결합된 세포는 검출가능한 화합물에 접합된 제2 항체 (예를 들어, PE-접합된 항-Fc 항체) 및 유동 세포측정기를 사용함으로써 확인할 수 있다. 당업자는 검출되는 신호를 최적화하도록 변형될 수 있는 파라미터, 뿐만 아니라 스크리닝 (예를 들어, 차단 항체에 대한 스크리닝)을 증진시킬 수 있는 FACS의 다른 변형에 대해 알고 있을 것이다.
항원/표적 (예를 들어, IgCAM)에 대한 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)의 결합 친화도 및 결합제-항원/표적 상호작용의 오프-율은 경쟁적 결합 검정에 의해 결정할 수 있다. 경쟁적 결합 검정의 한 예는, 표지된 (예를 들어, 3H 또는 125I) 항원/표적, 또는 그의 단편 또는 변이체를 증가되는 양의 비표지된 항원/표적의 존재 하에 관심 결합제와 함께 인큐베인션하고, 이어서 표지된 항원/표적에 결합된 결합제를 검출하는 것을 포함하는 방사성면역검정이다. 항원/표적 (예를 들어, IgCAM)에 대한 결합제의 친화도 및 결합 오프-율은 스캐차드(Scatchard) 플롯 분석에 의한 데이터로부터 결정할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 항원/표적 (예를 들어, IgCAM)에 결합하는 결합제의 결합 온-율 및 오프-율을 결정하는데 비아코어 동역학적 분석을 사용한다. 비아코어 동역학적 분석은 칩 표면 상에 항원/표적 (예를 들어, IgCAM)이 고정화된 칩으로부터의 결합제의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 하나 이상의 인간 IgCAM에 결합하고, 히포 경로 활성을 조절한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, 히포 경로 신호전달을 활성화하고/거나 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, YAP 인산화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, YAP 분해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, YAP-의존성 유전자 및/또는 YAP-의존성 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, YAP-의존성 유전자의 발현은 YAP와 TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4, Smad1, Smad4, RUNX, ErbB4 및 p73으로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자의 조합에 의해 조절된다. 본원에 기재된 바와 같이, YAP-의존성 유전자의 예는 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, Gli2, BIRC2, BIRC5, FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3 및 AREG를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, TAZ 인산화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, TAZ 분해를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, TAZ-의존성 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, TAZ-의존성 유전자의 발현은 TAZ와 TEAD1, TEAD2, TEAD3, TEAD4, RUNX, ERBB4, SMAD2/3/4, PAX3, TBX5, TTF-1, PPARγ 및 p73으로 이루어진 군으로부터 선택된 전사 인자의 조합에 의해 조절된다. TAZ-의존성 유전자의 예는 CTGF, CD44, FN1, BIRC5 (서바이빈), ADAMTS1, GLI2, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이고, CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 조절한다 (예를 들어, 증가 또는 감소시킴).
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 하나 이상의 인간 IgCAM의 효능제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 IgCAM의 효능제이고, 히포 경로 활성을 활성화하고/거나 증가시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 IgCAM의 활성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25 중 하나 이상의 활성을 증가시킨다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 세포 성장 또는 세포 증식을 억제한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 성장 또는 세포 증식을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 억제한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 클론원성 검정에서 세포 성장 또는 세포 형태에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합은 히포 경로 신호전달을 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 저해한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 핵으로의 YAP 전위를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 인산화를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 분해를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 세포질에서의 YAP 잔류를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 핵으로의 TAZ 전위를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 인산화를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 분해를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 세포질에서의 TAZ 잔류를 저해하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 길항제이고, CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 조절한다 (예를 들어, 증가 또는 감소시킴).
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 하나 이상의 인간 IgCAM의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하나 이상의 IgCAM의 길항제이고, 히포 경로 활성을 저해 및/또는 억제한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 1, 2, 3, 4개 또는 그 초과의 IgCAM의 활성을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25 중 하나 이상의 활성을 감소시킨다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 세포 성장 또는 세포 증식을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포 성장 또는 세포 증식을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 또는 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 YAP 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP의 인산화를 증가시킴으로써 YAP 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP의 세포질 잔류 또는 격리를 증가시킴으로써 YAP 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP의 핵 전위를 감소시킴으로써 YAP 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP의 분해를 증가시킴으로써 YAP 활성의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 활성을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 억제한다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 TAZ 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ의 인산화를 증가시킴으로써 TAZ 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ의 세포질 잔류 또는 격리를 증가시킴으로써 TAZ 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ의 핵 전위를 감소시킴으로써 TAZ 활성의 길항제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ의 분해를 증가시킴으로써 TAZ 활성의 길항제이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 약 100%만큼 억제한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 히포 경로 신호전달을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 의해 히포 경로 신호전달이 증가된다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 히포 경로 신호전달의 증가는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 히포 경로 신호전달 수준의 증가를 유발한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 히포 경로 신호전달의 증가는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 인산화 YAP 양의 증가를 유발한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 히포 경로 신호전달의 증가는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 비-인산화 YAP 양의 감소를 유발한다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 히포 경로 신호전달의 증가는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 인산화 TAZ 양의 증가를 유발한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 히포 경로 신호전달의 증가는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 비-인산화 TAZ 양의 감소를 유발한다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 YAP 및/또는 TAZ의 활성화를 억제한다. YAP 및/또는 TAZ의 활성화를 억제하는 IgCAM-결합제는 특정 실시양태에서, 하나 이상의 IgCAM에 의해 YAP 및/또는 TAZ의 활성화를 억제하지만, 반드시 모든 IgCAM에 의해 YAP 및/또는 TAZ의 활성화를 억제하는 것은 아니라는 것이 이해된다. 특정 실시양태에서, YAP 및/또는 TAZ의 활성화는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM에 의해 억제된다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 YAP의 활성화의 억제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 YAP 및/또는 TAZ의 활성화 수준의 감소를 유발한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 YAP 및/또는 TAZ의 활성화의 억제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 인산화 YAP 및/또는 TAZ 양의 증가를 유발한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제에 의한 YAP 및/또는 TAZ의 활성화의 억제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 비-인산화 YAP 양의 감소를 유발한다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 하나 이상의 YAP-의존성 유전자의 발현을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP-의존성 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ-의존성 유전자에 의해 코딩되는 하나 이상의 단백질의 발현을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 IgCAM은 하나 이상의 YAP-의존성 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, 및 AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 발현 수준의 감소를 유발한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95%의 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자 발현 수준의 감소를 유발한다.
IgCAM-결합제 (또는 후보 IgCAM-결합제)가 히포 경로 신호전달을 조절하는지를 결정하기 위한 생체내 및 시험관내 검정은 당업계에 공지되어 있거나 또는 개발되고 있다. 일부 실시양태에서, 히포 경로 신호전달에 대한 작용제의 효과는 YAP 및/또는 TAZ 활성에 의해 평가된다. 히포 경로가 억제되는 경우에, 활성화된 비-인산화 YAP 및/또는 TAZ는 세포의 핵으로 전위되며, 여기서 이는 DNA-결합 전사 인자, 예컨대 TEAD와 결합하여 다양한 표적 유전자의 전사로 이어진다. 따라서, 예를 들어, 반딧불이 루시페라제 리포터 유전자의 상류 쪽의 TEAD 결합 부위로서 작용하는 SV40 인핸서로부터의 GT-IIC 모티프의 다중 카피를 함유하는 리포터 벡터 (TBS-Luc 리포터)를 이용하는 세포-기반 루시페라제 리포터 검정이 YAP 및/또는 TAZ 활성을 시험관내 측정하는데 사용될 수 있다. IgCAM-결합제가 히포 경로를 활성화함으로써 YAP 및/또는 TAZ 활성을 억제하는 경우에, 루시페라제 활성이 억제될 것이다. TBS-Luc 리포터 검정 이외에도, 히포 경로 신호전달에 대한 IgCAM-결합제 (또는 후보 작용제)의 효과는 YAP-의존성 유전자 및/또는 TAZ-의존성 유전자, 예컨대 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5, FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3 및 AREG의 발현 수준에 대한 작용제의 효과를 측정함으로써 시험관내 또는 생체내 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 히포 경로 신호전달에 대한 IgCAM-결합제의 효과는 또한 Mst1, Mst2, Lats1, Lats2, YAP 및/또는 TAZ의 인산화 상태에 대한 작용제의 효과를 측정함으로써 평가할 수 있다.
일부 실시양태에서, 히포 경로 신호전달의 조절은 YAP의 전위에 의해 평가된다. 상기 기재된 바와 같이, 히포 경로가 억제되는 경우에는, 활성화된 비-인산화 YAP는 핵으로 전위된다. YAP 단백질을, 예를 들어 GFP로 태그부착함으로써, YAP의 위치를 결정할 수 있다. 따라서, 예를 들어, YAP-GFP 융합 단백질을 사용하는 세포-기반 검정을 사용하여, 작용제로의 처리 후에 YAP의 위치를 관찰함으로써 YAP 활성화를 결정할 수 있다. YAP 활성화를 결정하기 위한 또 다른 검정은 Cre-의존성 형광 단백질과의 YAP-Cre 융합 단백질을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 형광 단백질 DsRed의 단량체 형태를 loxP 부위 5'에 의해 녹색 형광 단백질에 플랭킹하고, 이는 리포터 단백질로서 작용한다. YAP를 Cre의 코딩 영역에 융합시킨다. YAP가 불활성이며 세포질에 존재하는 경우에는, 형광 단백질 DsRed가 핵에서 발현되지만; YAP가 활성화되는 경우에는, YAP-Cre 단백질이 세포의 핵으로 전위되고, Cre/loxP 재조합에 의해 DsRed가 제거되며, 녹색 형광 단백질이 핵에서 발현된다.
일부 실시양태에서, 히포 경로 신호전달의 조절은 TAZ의 전위에 의해 평가된다. YAP에서와 같이, 히포 경로가 억제되는 경우에는, 활성화된 비-인산화 TAZ가 핵으로 전위된다. TAZ 단백질을, 예를 들어 GFP로 태그부착함으로써, TAZ의 위치를 결정할 수 있다. 따라서, 예를 들어, TAZ-GFP 융합 단백질을 사용하는 세포-기반 검정을 사용하여, 작용제로의 처리 후에 TAZ의 위치를 관찰함으로써 TAZ 활성화를 결정할 수 있다. TAZ 활성화를 결정하기 위한 또 다른 검정은 Cre-의존성 형광 단백질과의 TAZ-Cre 융합 단백질을 사용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 형광 단백질 DsRed의 단량체 형태를 loxP 부위 5'에 의해 녹색 형광 단백질에 플랭킹한다. TAZ를 Cre의 코딩 영역에 융합시킨다. TAZ가 불활성이며 세포질에 존재하는 경우에는, 형광 단백질 DsRed가 핵에서 발현되지만; TAZ가 활성화되는 경우에는, TAZ-Cre 단백질이 세포의 핵으로 전위되고, Cre/loxP 재조합에 의해 DsRed가 제거되며, 녹색 형광 단백질이 핵에서 발현된다.
일부 실시양태에서, YAP 또는 TAZ 전위는 신규 이분자 형광 상보성 (BiFC) 검정을 사용하여 평가된다. BiFC 검정은, 형광 단백질의 2개의 비-형광 단편이 회합하여 형광 복합체를 형성할 수 있고, 단편의 회합은 이들 단편을 서로 상호작용하는 2개의 단백질에 융합시킴으로써 용이해질 수 있다는 발견에 기반한다. 일부 실시양태에서, YAP (또는 TAZ)의 C-말단을 황색 형광 단백질 (YFP)의 C-말단에 융합시켜 YAP-YFPC를 생성시킨다. YFP의 N-말단을 TEAD2 또는 TEAD3의 N-말단에 융합시켜 YFPN-TEAD2 또는 YFPN-TEAD3을 생성시킨다. 이들 구축물을 세포 내로 형질감염시킨다. 히포 경로가 억제되는 조건 하에, YAP-YFPC 구축물은 세포의 핵으로 전위될 것이며, 여기서 이는 YFPN-TEAD 구축물과 복합체를 형성하여, 에피형광 현미경검사에 의해 검출될 수 있는 기능적 형광 단백질을 생성할 것이다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 하기 효과 중 하나 이상을 갖는다: 종양 세포의 증식 억제, 종양 성장의 억제, 종양의 종양발생성 감소, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도 감소에 의한 종양의 종양발생성 감소, 종양 세포의 세포 사멸 유발, 세포 접촉-의존성 성장 억제의 증가, 종양 세포 아폽토시스의 증가, 상피 중간엽 전이 (EMT)의 감소 또는 종양 세포의 생존 감소.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 종양 성장을 억제할 수 있다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 종양 성장을 생체내 (예를 들어, 이종이식편 마우스 모델, 및/또는 암을 앓고 있는 인간에서) 억제할 수 있다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 동물 모델, 예컨대 마우스 이종이식편 모델에서 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 동물 모델, 예컨대 마우스 이종이식편 모델에서 암 줄기 세포를 포함하는 종양의 종양발생성을 감소시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도는 적어도 약 2배, 약 3배, 약 5배, 약 10배, 약 50배, 약 100배 또는 약 1000배 감소된다. 특정 실시양태에서, 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소는 동물 모델을 사용하는 한계 희석 검정에 의해 결정한다. 종양 내 암 줄기 세포의 수 또는 빈도의 감소를 결정하기 위한 한계 희석 검정의 사용에 대한 추가의 예 및 지침은, 예를 들어 국제 공개 번호 WO 2008/042236; 미국 특허 공개 번호 2008/0064049; 및 미국 특허 공개 번호 2008/0178305에서 찾을 수 있다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포의 증식을 증가시키고/거나, 상처 치유를 증가시키고/거나, 조직 재생을 증가시킨다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 IgCAM-결합제는 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간에서 적어도 약 5시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주 또는 적어도 약 2주의 순환 반감기를 갖는다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 마우스, 시노몰구스 원숭이 또는 인간에서의 순환 반감기가 적어도 약 5시간, 적어도 약 10시간, 적어도 약 24시간, 적어도 약 3일, 적어도 약 1주 또는 적어도 약 2주인 IgG (예를 들어, IgG1 또는 IgG2) 항체이다. 작용제, 예컨대 폴리펩티드 및 항체의 반감기를 증가 (또는 감소)시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, IgG 항체의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법은 pH 6.0에서 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 항체의 pH-의존성 결합을 증가시키는 Fc 영역에서의 돌연변이의 도입을 포함한다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2005/0276799, 2007/0148164 및 2007/0122403 참조). Fc 영역이 결여된 항체 단편의 순환 반감기를 증가시키는 공지된 방법은 PEG화와 같은 기술을 포함한다.
본 발명의 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 폴리펩티드이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 소형 펩티드이다. 폴리펩티드는 하나 이상의 인간 IgCAM에 결합하는 재조합 폴리펩티드, 천연 폴리펩티드 또는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명의 일부 아미노산 서열은 해당 단백질의 구조 또는 기능에 대해 유의한 영향을 미치지 않으면서 달라질 수 있다는 것이 당업계에 인지되어 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 인간 IgCAM에 대해 실질적인 활성을 나타내는 폴리펩티드의 변이체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합 폴리펩티드의 아미노산 서열 변이체는 결실, 삽입, 전위, 반복 및/또는 다른 유형의 치환을 포함한다.
폴리펩티드, 그의 유사체 및 변이체는 통상적으로 폴리펩티드의 일부가 아닌 추가의 화학적 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 유도체화된 모이어티는 폴리펩티드의 용해도, 생물학적 반감기 및/또는 흡수를 개선할 수 있다. 모이어티는 또한 폴리펩티드 및 변이체의 바람직하지 않은 부작용을 감소시키거나 또는 제거할 수 있다. 화학적 모이어티의 개관은 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences, Philadelphia, PA]에서 찾을 수 있다.
본원에 기재된 폴리펩티드는 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 방법은 직접 단백질 합성 방법에서부터 폴리펩티드 서열을 코딩하는 DNA 서열의 구축 및 이들 서열을 적합한 숙주에서 발현시키는 것까지의 범위에 이른다. 일부 실시양태에서, 관심 야생형 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 재조합 기술을 사용하여 단리 또는 합성함으로써 DNA 서열을 구축한다. 임의로는, 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 이 서열에 돌연변이를 일으킴으로써, 그의 기능적 유사체를 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zoeller et al., 1984, PNAS, 81:5662-5066] 및 미국 특허 번호 4,588,585를 참조한다.
일부 실시양태에서, 관심 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열은 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 화학적 합성에 의해 구축할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 원하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 기반으로, 관심 재조합 폴리펩티드가 생산될 숙주 세포에서 유리한 해당 코돈을 선택함으로써 설계될 수 있다. 단리된 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 합성하는데 표준 방법을 적용할 수 있다. 예를 들어, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역된 유전자를 구축할 수 있다. 또한, 특정의 단리된 폴리펩티드를 코딩하기 위한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어, 목적하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 몇몇 소형 올리고뉴클레오티드를 합성한 다음, 이들을 라이게이션할 수 있다. 개별 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 상보적 조립체를 위한 5' 또는 3' 오버행을 함유한다.
조립 (합성, 부위-지정 돌연변이유발 또는 또 다른 방법에 의함)된 후에, 특정한 관심 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 벡터 내에 삽입되고, 원하는 숙주에서의 단백질의 발현을 위해 적절한 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 적당한 조립체는 적합한 숙주에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열분석, 제한 효소 맵핑 및/또는 발현에 의해 확인될 수 있다. 당업계에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 숙주에서의 형질감염된 유전자의 높은 발현 수준을 획득하기 위해, 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능적인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 연결되어야 한다.
특정 실시양태에서, 재조합 발현 벡터를 사용하여, 하나 이상의 인간 IgCAM에 대한 결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 코딩하는 DNA를 증폭 및 발현시킨다. 예를 들어, 재조합 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유래된 적합한 전사 및/또는 번역 조절 요소에 작동가능하게 연결된, IgCAM-결합제, 항-IgCAM 항체 또는 그의 단편의 폴리펩티드 쇄를 코딩하는 합성 또는 cDNA-유래 DNA 단편을 갖는 복제가능한 DNA 구축물일 수 있다. 전사 단위는 일반적으로 (1) 유전 요소, 또는 유전자 발현에서 조절 역할을 갖는 요소, 예를 들어 전사 프로모터 또는 인핸서, (2) mRNA로 전사되고, 단백질로 번역되는 구조적 또는 코딩 서열, 및 (3) 적절한 전사 및 번역 개시 및 종결 서열의 조립체를 포함한다. 조절 요소는 전사를 조절하기 위한 오퍼레이터 서열을 포함할 수 있다. 통상적으로 복제 기점에 의해 부여되는 숙주에서의 복제 능력, 및 형질전환체의 인식을 용이하게 하는 선택 유전자를 추가로 혼입할 수 있다. DNA 영역은 이들이 서로 기능적으로 관련된 경우에 "작동가능하게 연결"된 것이다. 예를 들어, 신호 펩티드 (분비 리더)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전구체로서 발현되는 경우에 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결된 것이고; 프로모터는 코딩 서열의 전사를 제어하는 경우에 상기 서열에 작동가능하게 연결된 것이고; 리보솜 결합 부위는 번역이 허용되도록 위치된 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일부 실시양태에서, 효모 발현 시스템에 사용하기 위한 구조적 요소는 숙주 세포에 의해 번역된 단백질의 세포외 분비를 가능하게 하는 리더 서열을 포함한다. 다른 실시양태에서, 재조합 단백질이 리더 또는 수송 서열 없이 발현되는 경우에, 이는 N-말단 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다. 이 잔기는 임의로는 후속적으로, 발현된 재조합 단백질로부터 절단되어 최종 생성물을 제공할 수 있다.
발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 숙주의 선택에 따라 달라진다. 광범위하게 다양한 발현 숙주/벡터 조합물이 사용될 수 있다. 진핵 숙주에 유용한 발현 벡터는, 예를 들어 SV40, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스 및 시토메갈로바이러스로부터의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터를 포함한다. 박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예컨대 pCR1, pBR322, pMB9를 비롯한 이. 콜라이로부터의 플라스미드 및 그의 유도체, 및 보다 넓은 숙주 범위의 플라스미드, 예컨대 M13 및 다른 필라멘트형 단일-가닥 DNA 파지를 포함한다.
IgCAM-결합 폴리펩티드 또는 IgCAM-결합 항체 (또는 항원으로서 사용하기 위한 IgCAM 단백질)의 발현에 적합한 숙주 세포는 적절한 프로모터의 제어 하의 원핵생물, 효모 세포, 곤충 세포 또는 고등 진핵 세포를 포함한다. 원핵생물은 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예를 들어 이. 콜라이 또는 바실루스(Bacillus)를 포함한다. 고등 진핵 세포는 하기 기재된 바와 같은 포유동물 기원의 확립된 세포주를 포함한다. 세포-무함유 번역 시스템이 또한 사용될 수 있다. 박테리아, 진균, 효모 및 포유동물 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 문헌 [Pouwels et al. (1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NY)]에 기재되어 있다. 항체 생산을 비롯한 단백질 생산 방법에 대한 추가의 정보는, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0187954; 미국 특허 번호 6,413,746 및 6,660,501; 및 국제 특허 공개 번호 WO 2004/009823에서 찾을 수 있다.
다양한 포유동물 또는 곤충 세포 배양 시스템이 재조합 폴리펩티드를 발현시키는데 사용된다. 포유동물 세포에서의 재조합 단백질의 발현이 바람직할 수 있는데, 이는 이러한 단백질이 일반적으로 정확하게 폴딩되고, 적절하게 변형되며, 생물학적으로 기능성이기 때문이다. 적합한 포유동물 숙주 세포주의 예는 COS-7 (원숭이 신장-유래), L-929 (뮤린 섬유모세포-유래), C127 (뮤린 유방 종양-유래), 3T3 (뮤린 섬유모세포-유래), CHO (차이니즈 햄스터 난소-유래), HeLa (인간 자궁경부암-유래), BHK (햄스터 신장 섬유모세포-유래) 및 HEK-293 (인간 배아 신장-유래) 세포주, 및 이들의 변이체를 포함한다. 포유동물 발현 벡터는 비-전사 요소, 예컨대 복제 기점, 적합한 프로모터 및 발현될 유전자에 연결된 인핸서, 및 다른 5' 또는 3' 플랭킹 비-전사 서열, 및 5' 또는 3' 비-번역 서열, 예컨대 필수 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여자 및 수용자 부위, 및 전사 종결 서열을 포함할 수 있다. 곤충 세포에서의 이종 단백질의 생산을 위한 바큘로바이러스 시스템은 당업자에게 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47] 참조).
따라서, 본 발명은 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 포함하는 세포를 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포는 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 항체를 생산한다. 특정 실시양태에서, 세포는 융합 단백질을 생산한다. 일부 실시양태에서, 세포는 가용성 수용체를 생산한다.
형질전환된 숙주에 의해 생산된 단백질을 임의의 적합한 방법에 따라 정제할 수 있다. 표준 방법은 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화도 및 크기 칼럼 크로마토그래피), 원심분리, 시차 용해도, 또는 단백질 정제를 위한 임의의 다른 표준 기술에 의한 것을 포함한다. 친화성 태그, 예컨대 헥사-히스티딘, 말토스 결합 도메인, 인플루엔자 코트 서열 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 단백질에 부착시켜 적절한 친화도 칼럼 상의 통과에 의한 용이한 정제를 가능하게 할 수 있다. 단리된 단백질은 또한 단백질분해, 질량 분광측정법 (MS), 핵 자기 공명 (NMR), 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 및 X선 결정학과 같은 기술을 사용하여 물리적으로 특성화될 수도 있다.
일부 실시양태에서, 배양 배지 내에 재조합 단백질을 분비하는 발현 시스템으로부터의 상청액을 먼저 상업적으로 입수가능한 단백질 농축 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 농축할 수 있다. 농축 단계 후에, 농축물을 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 일부 실시양태에서는, 음이온 교환 수지, 예를 들어 펜던트 디에틸아미노에틸 (DEAE) 기를 갖는 매트릭스 또는 기재를 사용할 수 있다. 매트릭스는 아크릴아미드, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스, 또는 단백질 정제에 통상적으로 사용되는 다른 유형일 수 있다. 일부 실시양태에서는, 양이온 교환 단계를 사용할 수 있다. 적합한 양이온 교환체는 술포프로필 또는 카르복시메틸 기를 포함하는 다양한 불용성 매트릭스를 포함한다. 일부 실시양태에서는, 비제한적으로 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT)를 비롯한 히드록시아파타이트 배지를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 소수성 RP-HPLC 매질, 예를 들어 메틸 또는 다른 지방족 기를 갖는 실리카 겔을 사용하는 1개 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 IgCAM-결합제를 추가로 정제할 수 있다. 또한, 균질한 재조합 단백질을 제공하기 위해 상기 정제 단계의 일부 또는 전부의 다양한 조합을 사용할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 박테리아 배양물에서 생산된 재조합 단백질은, 예를 들어 세포 펠릿으로부터의 초기 추출에 이어서 하나 이상의 농축, 염석, 수성 이온 교환 또는 크기 배제 크로마토그래피 단계에 의해 단리될 수 있다. HPLC가 최종 정제 단계를 위해 사용될 수 있다. 재조합 단백질의 발현에 사용되는 미생물 세포는, 동결-해동 순환, 음파처리, 기계적 파괴 또는 세포 용해제 사용을 비롯한 임의의 편리한 방법에 의해 파괴될 수 있다.
항체 및 다른 단백질을 정제하기 위한 당업계에 공지된 방법은 또한, 예를 들어 미국 특허 공개 번호 2008/0312425, 2008/0177048 및 2009/0187005에 기재된 것을 포함한다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는, 항체가 아니거나 또는 항체 Fc 영역을 포함하지 않는 폴리펩티드이다. 특정 실시양태에서, 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 G, 리포칼린, 피브로넥틴 도메인, 안키린 컨센서스 반복 도메인 및 티오레독신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유형의 단백질 스캐폴드를 포함한다. 단백질 표적에 높은 친화도로 결합하는 비-항체 폴리펩티드를 확인 및 생산하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15:14-27; Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol., 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; 및 Skerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83]을 참조한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합 폴리펩티드를 생산 및/또는 확인하는데 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합 폴리펩티드를 생산 및/또는 확인하는데 포유동물 세포 디스플레이 기술이 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 다수의 접합 형태 (즉, 면역접합체 또는 방사성접합체) 또는 비-접합 형태 중 어느 하나로 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 결합제는 악성 또는 암 세포를 제거하기 위한 CDC 및 ADCC를 포함하는 대상체의 천연 방어 메카니즘을 이용하기 위해 비-접합 형태로 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 세포독성제에 접합된다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 메토트렉세이트, 아드리아미신, 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편, 예컨대 비제한적으로 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이다. 일부 실시양태에서, 세포독성제는 방사성접합체 또는 방사성접합된 결합제를 생성하기 위한 방사성동위원소이다. 다양한 방사성핵종 (90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 131In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re 및 212Bi를 포함하지만 이에 제한되지는 않음)이 방사성접합된 결합제의 생성에 이용가능하다. 결합제와 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대 칼리케아미신, 메이탄시노이드, 트리코텐 및 CC1065, 및 독소 활성을 갖는 이들 독소의 유도체의 접합체가 또한 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체, 가용성 수용체 또는 폴리펩티드)는 메이탄시노이드에 접합된다. 결합제 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질-커플링 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조된다.
III. 폴리뉴클레오티드
특정 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 인간 IgCAM에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 용어 "폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드"는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 뿐만 아니라 추가의 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA 형태 또는 DNA 형태로 존재할 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하고; 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있고, 단일 가닥인 경우에는 코딩 가닥 또는 비-코딩 (안티-센스) 가닥일 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 80% 동일한, 적어도 85% 동일한, 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 일부 실시양태에서는 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 또한, 서열 33, 서열 34, 서열 35, 서열 36, 서열 37, 서열 38, 서열 39, 서열 40, 서열 41, 서열 42, 서열 43, 서열 44, 서열 45, 서열 46, 서열 47, 서열 48, 서열 49, 서열 50, 서열 51, 서열 52, 서열 53, 서열 54, 서열 55, 서열 56, 서열 57, 서열 58, 서열 59, 서열 60, 서열 61, 서열 62, 서열 63 및 서열 64로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이 폴리뉴클레오티드에 상보적인 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다. 특정 실시양태에서, 혼성화는 고 염격성 조건 하에 일어난다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 세포로부터 폴리펩티드의 수송을 제어하기 위한 분비 서열로서 작용하는 리더 서열)에 대해 동일한 리딩 프레임 내에서 융합된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩티드는 전구단백질이며, 리더 서열이 숙주 세포에 의해 절단되도록 하여 성숙한 형태의 폴리펩티드를 형성할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드는 성숙 단백질 + 추가의 5' 아미노산 잔기인 전구단백질을 코딩할 수 있다. 프로서열을 갖는 성숙 단백질은 전구단백질이며, 이는 불활성 형태의 단백질이다. 프로서열이 절단되면, 활성의 성숙 단백질이 남는다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어 코딩된 폴리펩티드의 정제를 가능하게 하는 마커 서열에 대해 동일한 리딩 프레임 내에서 융합된 성숙 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 포함한다. 예를 들어, 마커 서열은 박테리아 숙주의 경우에는 마커에 융합된 성숙 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 태그일 수 있거나, 또는 마커 서열은 포유동물 숙주 (예를 들어, COS-7 세포)가 사용된 경우에는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 헤마글루티닌 (HA) 태그일 수 있다. 일부 실시양태에서, 마커 서열은 다른 친화성 태그와 함께 사용될 수 있는 서열 DYKDDDDK (서열 73)의 펩티드인 FLAG-태그이다.
추가로 본 발명은, 예를 들어 단편, 유사체 및/또는 유도체를 코딩하는 상기 기재된 폴리뉴클레오티드의 변이체에 관한 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 적어도 약 80% 동일한, 적어도 약 85% 동일한, 적어도 약 90% 동일한, 적어도 약 95% 동일한, 일부 실시양태에서는 적어도 약 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본원에 사용된, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도, 예를 들어 95% "동일한" 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드라는 어구는, 폴리뉴클레오티드 서열이 참조 뉴클레오티드 서열의 각 100개의 뉴클레오티드당 5개 이하의 점 돌연변이를 포함할 수 있다는 것을 제외하고는 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열이 참조 서열과 동일하다는 것을 의미하도록 의도된다. 즉, 참조 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 획득하기 위해서는, 참조 서열 내 뉴클레오티드의 5% 이하를 결실시키거나 또는 또 다른 뉴클레오티드로 치환될 수 있거나, 또는 참조 서열 내 전체 뉴클레오티드의 5% 이하의 다수의 뉴클레오티드를 참조 서열 내로 삽입할 수 있다. 참조 서열의 이들 돌연변이는, 참조 서열 내 뉴클레오티드 사이에 개별적으로 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 인접한 군에 배치된, 참조 뉴클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치 또는 이들 말단 위치 사이의 임의의 부위에서 발생할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 둘 다에서의 변경을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 변이체는 침묵 치환, 부가 또는 결실을 일으키는 변경을 함유하지만, 코딩된 폴리펩티드의 특성 또는 활성을 변경시키지는 않는다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드 변이체는 유전자 코드의 축중성으로 인한 침묵 치환에 의해 생성된다. 폴리뉴클레오티드 변이체는 다양한 이유로, 예를 들어 특정한 숙주에 대한 코돈 발현을 최적화하기 위해 (즉, 인간 mRNA에서의 코돈을 박테리아 숙주, 예컨대 이. 콜라이가 선호하는 것으로 변화시키기 위해) 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 단리된다. 특정 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 순수하다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 세포가 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 발현 벡터는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.
IV. 사용 방법 및 제약 조성물
본 발명의 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 및 가용성 수용체)는 비제한적으로 암의 치료와 같은 치유적 치료 방법을 비롯한 다양한 적용에 유용하다. 특정 실시양태에서, 결합제는 히포 경로 신호전달을 활성화하고/거나 증진시키고/거나, 세포 접촉-의존성 성장 억제를 증가시키고/거나, YAP 활성화를 억제하고/거나, TAZ 활성화를 억제하고/거나, 종양 성장을 억제하고/거나, 종양 부피를 감소시키고/거나, 종양 세포 아폽토시스를 증가시키고/거나, 종양의 종양발생성을 감소시키는데 유용하다. 사용 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로의 효능제이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP 활성을 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성을 억제한다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)는 YAP의 활성화, TAZ의 활성화, 감소된 히포 경로 신호전달 및/또는 비정상적 히포 경로 신호전달과 연관된 질환의 치료에 유용하다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 IgCAM의 비정상적 발현 또는 비정상적 노출과 연관된 질환의 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 질환은 YAP 활성화에 의존성인 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환은 TAZ 활성화에 의존성인 질환이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 수준을 특징으로 하는 장애의 치료에 사용된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본 발명은 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 사용하여 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)와 세포를 시험관내 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 불멸화 세포주 또는 암 세포주를 배지에서 배양하고, 여기에 IgCAM-결합제를 첨가하여 종양 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포를 환자 샘플, 예컨대 예를 들어 조직 생검, 흉막 삼출 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, 이를 배지에서 배양하고, 여기에 IgCAM-결합제를 첨가하여 종양 성장을 억제한다.
일부 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체 또는 가용성 수용체)를 종양 또는 종양 세포와 생체내 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제와 종양 또는 종양 세포를 접촉시키는 것은 동물 모델에서 실행된다. 예를 들어, IgCAM-결합제는 이종이식편을 갖는 면역손상 마우스 (예를 들어, NOD/SCID 마우스)에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 세포를 환자 샘플, 예컨대 예를 들어 조직 생검, 흉막 삼출 또는 혈액 샘플로부터 단리하고, 이를 면역손상 마우스 내로 주사한 다음, IgCAM-결합제를 투여하여 종양 세포 성장을 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 종양 성장을 예방하기 위해 종양발생 세포를 동물 내로 도입하는 것과 동시에 또는 그 직후에 투여된다 ("예방 모델"). 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 종양이 특정한 크기로 성장한 후에 치료제로서 투여된다 ("치료 모델"). 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다.
특정 실시양태에서, 종양의 성장을 억제하는 방법은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 종양을 앓고 있거나 또는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, 대상체는 YAP의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, "상승된" 발현 수준은 동일한 조직 유형의 정상 조직에서의 YAP의 발현 수준과 비교한 것이다. 일부 실시양태에서, "상승된" 발현 수준은 동일한 조직 유형의 다른 종양에서의 YAP의 발현 수준과 비교한 것이다. 일부 실시양태에서, "상승된" 발현 수준은 참조 샘플에서의 YAP의 발현 수준과 비교한 것이다. 일부 실시양태에서, "상승된" 발현 수준은 YAP의 사전-결정된 수준과 비교한 것이다. 이러한 비교는 용어 "증가된", "감소된" 및 유사한 용어에도 또한 적용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 증가된 수준의 비-인산화 YAP를 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 감소된 수준의 인산화 YAP를 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 YAP-의존성 유전자의 증가된 발현을 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 TAZ의 상승된 발현 수준을 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 증가된 수준의 비-인산화 TAZ를 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 감소된 수준의 인산화 TAZ를 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 TAZ-의존성 유전자의 증가된 발현을 갖는 종양을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다.
또한, 본 발명은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도는 IgCAM-결합제의 투여에 의해 감소된다. 또한, 본 발명은 유효량의 IgCAM-결합제와 종양을 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양 내 암 줄기 세포의 빈도를 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다.
일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 위장 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 교모세포종 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 결장직장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 난소 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 폐 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 췌장 종양이다. 특정 실시양태에서, 종양은 흑색종 종양이다.
특정 실시양태에서, 종양은 히포 경로 신호전달이 불활성이거나 또는 낮은 수준에 있는 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 히포 경로 신호전달이 비정상적인 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 종양 세포는 접촉-의존성 성장 억제를 상실하였다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 종양 세포에서는 고정-의존성 성장이 증진되었다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 종양 세포에서는 세포 증식이 증가되었다.
특정 실시양태에서, 종양은 YAP의 상승된 발현 수준을 갖거나 또는 YAP를 과다-발현한다. 일반적으로, 단백질의 "상승된 발현 수준을 갖는 종양"이라는 어구 (또는 유사한 어구)는 정상 조직에서의 동일한 단백질의 발현 수준과 비교한, 종양에서의 단백질의 발현 수준을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 핵에서 상승된 수준의 YAP를 갖는다. 일반적으로, 단백질의 "상승된 수준을 갖는 종양"이라는 어구 (또는 유사한 어구)는 정상 조직에서의 동일한 단백질의 수준과 비교한, 종양에서의 단백질의 수준을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 종양은 TAZ의 상승된 발현 수준을 갖거나 또는 TAZ를 과다-발현한다. 특정 실시양태에서, 종양은 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 갖는다. 일부 실시양태에서, 종양은 핵에서 상승된 수준의 TAZ를 갖는다.
추가로, 본 발명은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 암은 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하여 상승된 수준의 YAP를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하여 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하여 감소된 수준의 인산화 YAP를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 암은 증가된 수준의 하나 이상의 YAP-의존성 유전자를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하여 상승된 수준의 TAZ를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하여 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 암은 정상 조직에서의 발현 수준과 비교하여 감소된 수준의 인산화 TAZ를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, 암은 증가된 수준의 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자를 발현하는 세포를 특징으로 한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하고, 핵으로의 YAP 및/또는 TAZ 전위를 억제하고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하고, YAP 및/또는 TAZ의 인산화를 증진시키고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하고, 세포질에서의 YAP 및/또는 TAZ 잔류를 증진시키고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하고, YAP 및/또는 TAZ 분해를 증진시키고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하고, YAP 및/또는 TAZ 활성화를 억제하고, 암의 성장을 억제하거나 또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 인간 IgCAM의 세포외 도메인에 결합하고, YAP 및/또는 TAZ 활성화를 억제하고, 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현을 감소시키거나 또는 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 CADM1에 결합하지 않는다.
본 발명은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체 (예를 들어, 치료를 필요로 하는 대상체)에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시양태에서, 대상체는 암성 종양을 앓고 있다. 특정 실시양태에서, 대상체는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, 암을 치료하는 방법은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 대상체는 YAP 및/또는 TAZ의 상승된 발현을 갖는 종양을 앓고 있다.
특정 실시양태에서, 암은 결장직장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 위장암, 흑색종, 자궁경부암, 방광암, 교모세포종 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이다. 특정 실시양태에서, 암은 췌장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 난소암이다. 특정 실시양태에서, 암은 결장직장암이다. 특정 실시양태에서, 암은 유방암이다. 특정 실시양태에서, 암은 전립선암이다. 특정 실시양태에서, 암은 폐암이다. 특정 실시양태에서, 암은 흑색종이다.
또한, 본 발명은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 종양의 종양발생성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 종양은 암 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양의 종양발생성은 종양 내 암 줄기 세포의 빈도를 감소시킴으로써 감소된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 사용하는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, 종양 내 암 줄기 세포의 빈도는 IgCAM-결합제의 투여에 의해 감소된다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암에서의 YAP 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 YAP 발현 수준을 결정하는 단계는 세포질 및/또는 핵 YAP의 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 YAP의 발현 수준을 참조 샘플에서의 YAP의 발현 수준과 비교한다. 본원에 사용된 "참조 샘플"은 정상 조직, 동일한 조직 유형의 비-암성 조직, 동일한 조직 유형의 종양 조직 및 상이한 조직 유형의 종양 조직을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 YAP의 발현 수준을 YAP의 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 YAP의 발현 수준을 YAP의 사전-결정된 발현 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암 내 세포의 핵에서의 YAP의 발현 수준을 참조 샘플 내 세포의 핵에서의 YAP의 발현 수준 또는 YAP의 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암 내 세포에서의 인산화 YAP의 발현 수준을 참조 샘플에서의 인산화 YAP의 발현 수준 또는 인산화 YAP의 사전-결정된 수준과 비교한 것이다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암 내 세포에서의 비-인산화 YAP를 참조 샘플에서의 비-인산화 YAP의 발현 수준 또는 비-인산화 YAP의 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, YAP 발현의 수준을 결정하는 것은 치료 전에 수행한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암이 참조 샘플에서의 YAP의 발현 또는 YAP의 사전-결정된 수준과 비교하여 상승된 수준의 YAP 발현을 갖는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 투여한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암이 참조 샘플에서의 비-인산화 YAP의 발현 또는 비-인산화 YAP의 사전-결정된 수준과 비교하여 상승된 수준의 비-인산화 YAP 발현을 갖는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 투여한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암에서의 TAZ 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 TAZ 발현 수준을 결정하는 단계는 세포질 및/또는 핵 TAZ의 발현 수준을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 TAZ의 발현 수준을 참조 샘플에서의 TAZ의 발현 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 TAZ의 발현 수준을 TAZ의 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암 내 세포의 핵에서의 TAZ의 발현 수준을 참조 샘플 내 세포의 핵에서의 TAZ의 발현 수준 또는 TAZ의 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암 내 세포에서의 인산화 TAZ의 발현 수준을 참조 샘플에서의 인산화 TAZ의 발현 수준 또는 인산화 TAZ의 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암 내 세포에서의 비-인산화 TAZ의 발현 수준을 참조 샘플에서의 비-인산화 TAZ의 발현 수준 또는 비-인산화 TAZ의 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, TAZ 발현의 수준을 결정하는 것은 치료 전에 수행한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암이 참조 샘플에서의 TAZ의 발현 또는 TAZ의 사전-결정된 수준과 비교하여 상승된 TAZ 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 투여한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암이 참조 샘플에서의 비-인산화 TAZ의 발현 또는 비-인산화 TAZ의 사전-결정된 수준과 비교하여 상승된 비-인산화 TAZ 발현 수준을 갖는 경우에, 대상체에게 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 투여한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암에서의 YAP-의존성 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 YAP-의존성 유전자의 발현 수준을 참조 샘플에서의 YAP-의존성 유전자의 발현 수준 또는 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 방법은 종양 또는 암에서의 TAZ-의존성 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 또는 암에서의 TAZ-의존성 유전자의 발현 수준을 참조 샘플에서의 TAZ-의존성 유전자의 발현 수준 또는 사전-결정된 수준과 비교한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 대상체가 참조 샘플에서의 비-인산화 YAP의 발현 또는 비-인산화 YAP의 사전-결정된 수준과 비교하여 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하는, IgCAM-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양이 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 갖는 경우에, 대상체는 하나 이상의 IgCAM에 특이적으로 결합하는 IgCAM-결합제로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료에 대해 선택된 경우에, 대상체는 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 투여받는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, 대상체가 참조 샘플에서의 YAP 활성의 발현 또는 사전-결정된 수준의 YAP 활성과 비교하여 상승된 수준의 YAP 활성을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하는, IgCAM-결합제로의 치료를 위한 대상체를 확인하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체가 참조 샘플에서의 YAP-의존성 유전자의 발현 또는 사전-결정된 수준과 비교하여 증가된 YAP-의존성 유전자 발현을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하는, IgCAM-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법이 제공된다.
또한, 본 발명은 대상체가 참조 샘플에서의 비-인산화 TAZ의 발현 또는 사전-결정된 수준의 비-인산화 TAZ와 비교하여 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하는, IgCAM-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 종양이 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 갖는 경우에, 대상체는 하나 이상의 IgCAM에 특이적으로 결합하는 IgCAM-결합제로의 치료에 대해 선택된다. 일부 실시양태에서, 치료에 대해 선택된 경우에, 대상체는 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 투여받는다. 특정 실시양태에서, 대상체는 제거된 종양을 앓았었다. 일부 실시양태에서, 대상체가 참조 샘플에서의 TAZ 활성의 발현 또는 사전-결정된 수준의 TAZ 활성과 비교하여 상승된 수준의 TAZ 활성을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하는, IgCAM-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 대상체가 참조 샘플에서의 TAZ-의존성 유전자의 발현 또는 사전-결정된 수준과 비교하여 증가된 TAZ-의존성 유전자 발현을 갖는 종양을 앓고 있는지를 결정하는 것을 포함하는, IgCAM-결합제로의 치료를 위한 인간 대상체를 확인하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명은 (a) 적어도 부분적으로, 상승된 수준의 비-인산화 YAP를 갖고/거나 상승된 수준의 비-인산화 TAZ를 갖는 암을 앓고 있는 대상체에 기초하여 치료를 위한 대상체를 선택하고, (b) 상기 대상체에게 치료 유효량의 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 투여하는 것을 포함하는, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.
세포, 종양 또는 암에서의 YAP 및/또는 TAZ 발현 수준을 결정하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 핵산 발현에 대해서, 이들 방법은 PCR-기반 검정, 마이크로어레이 분석 및 뉴클레오티드 서열분석 (예를 들어, 넥스트젠(NextGen) 서열분석)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 단백질 발현에 대해서, 이들 방법은 웨스턴 블롯 분석, 단백질 어레이, 면역조직화학 (IHC) 검정, ELISA 및 FACS를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
종양 또는 암이 상승된 수준의 YAP 및/또는 TAZ 발현을 갖는지를 결정하는 방법은 다양한 샘플을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 샘플은 종양 또는 암을 앓고 있는 대상체로부터 취해진다. 일부 실시양태에서, 샘플은 신선 종양/암 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 동결된 종양/암 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 포르말린-고정된 파라핀-포매 샘플이다. 일부 실시양태에서, 샘플은 세포 용해물로 가공된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 DNA 또는 RNA로 가공된다.
비정상 (예를 들어, 감소된 수준)의 히포 경로 신호전달과 연관된 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 추가로 제공된다. 일부 실시양태에서, 치료 방법은 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다.
또한, 본 발명은 유효량의 IgCAM-결합제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서의 히포 경로 신호전달을 활성화하거나 또는 증진시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 IgCAM-결합제와 세포를 접촉시키는 단계가 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 생체내 방법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 활성화하고/거나, 유도하고/거나, 증진시키고/거나, 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ의 활성화를 억제한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다.
또한, 본 발명은 유효량의 IgCAM-결합제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서의 히포 경로 신호전달을 불활성화 또는 억제하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 IgCAM-결합제와 세포를 접촉시키는 단계가 치료 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 생체내 방법이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 시험관내 또는 생체외 방법이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 신호전달을 억제하고/거나, 저해하고/거나, 감소시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 YAP의 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ의 활성화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 대상체에서 상처를 치료하고/거나 상처 치유를 촉진하거나 또는 증진시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 히포 경로 신호전달을 조절하는 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성의 길항제이고/거나, 히포 경로 신호전달을 저해하고/거나, YAP 활성을 증가시키고/거나, YAP의 인산화를 저해하고/거나, YAP의 분해를 저해하고/거나, YAP의 활성화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 투여된 결합제는 TAZ 활성을 증가시키고/거나, TAZ의 인산화를 저해하고/거나, TAZ의 분해를 저해하고/거나, TAZ의 활성화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 상처는 급성 상처이다. 일부 실시양태에서, 상처는 외과적 상처이다. 일부 실시양태에서, 상처는 만성 피부 상처이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 조직을 재생시키는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 히포 경로 신호전달을 조절하는 IgCAM-결합제와 세포를 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 치료 유효량의 히포 경로 신호전달을 조절하는 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 히포 경로 활성의 길항제이고/거나, 히포 경로 신호전달을 저해하고/거나, YAP 활성을 증가시키고/거나, YAP의 인산화를 저해하고/거나, YAP의 분해를 저해하고/거나, YAP의 활성화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 TAZ 활성을 증가시키고/거나, TAZ의 인산화를 저해하고/거나, TAZ의 분해를 저해하고/거나, TAZ의 활성화를 촉진한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 면역 관련 장애 (예컨대, 자가면역 장애); 염증 (급성 및 만성 염증성 장애 둘 다 포함); 허혈 (예컨대, 심근경색); 외상성 손상 (예컨대, 화상, 열상 및 및 찰과상); 감염 (예컨대, 박테리아, 바이러스 및 진균 감염); 및 만성 질환 (예컨대, 간 경변증)에 의해 유발된 조직 손상의 치료를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본원에 기재된 작용제와 같은 IgCAM-결합제를 사용하여 종양 세포를 표적화하는 방법을 제공한다. 종양 세포 상에서의 IgCAM의 과다-발현 또는 종양 세포 상에서의 IgCAM의 비정상적 노출은 IgCAM이 본원에 기재된 결합제에 의한 감시 또는 면역감시에 대한 표적으로서 작용하도록 할 수 있다. 예를 들어, 대부분의 정상 세포 아키텍처 내에서 IgCAM은 세포간 표면에서 발현될 것이고, IgCAM-결합제에 의해 검출되지 않을 것이다. 그러나, 정상 세포 아키텍처를 상실한 종양은 IgCAM의 비정상적 노출을 갖는 세포를 포함할 수 있으며, 이는 이들 세포를 IgCAM-결합제로의 감시에 의해 검출가능하도록 한다. IgCAM-결합제는 세포독성제에 접합될 수 있기 때문에, 종양 세포 상에서의 IgCAM의 비정상적 노출 및/또는 발현은 또한 세포독소의 종양 세포로의 표적화 전달을 가능하게 할 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 상기 방법은 유효량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합제는 항체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 가용성 수용체이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 세포독성제에 접합되거나 또는 이와 복합체를 형성한다.
본 발명은 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 포함하는 제약 조성물을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 비히클을 추가로 포함한다. 이러한 제약 조성물은 대상체 (예를 들어, 인간 환자)에서 종양 성장을 억제하고, 암을 치료하는데 사용된다.
특정 실시양태에서, 제제는 본 발명의 정제된 결합제를 제약상 허용되는 비히클 (예를 들어, 담체 또는 부형제)과 조합함으로써 저장 및 사용을 위해 제조된다. 적합한 제약상 허용되는 비히클은 비독성 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 염, 예컨대 염화나트륨; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제, 예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 시클로헥산올, 3-펜탄올 및 m-크레졸; 저분자량 폴리펩티드 (예를 들어, 약 10개 미만의 아미노산 잔기); 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 탄수화물, 예컨대 모노사카라이드, 디사카라이드, 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물, 예컨대 Zn-단백질 착물; 및 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, PA).
본 발명의 제약 조성물은 국부 또는 전신 치료를 위해 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 표피 또는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 점적물, 좌제, 스프레이, 액체 및 분말에 의한 국소 투여; 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입 (네뷸라이저에 의한 것 포함)에 의한 폐 투여, 기관내 투여, 비강내 투여; 경구 투여; 또는 정맥내, 동맥내, 종양내, 피하, 복막내, 근육내 (예를 들어, 주사 또는 주입) 또는 두개내 (예를 들어, 척수강내 또는 뇌실내)를 포함하는 비경구 투여일 수 있다.
치료 제제는 단위 투여 형태일 수 있다. 이러한 제제는 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 용액 또는 현탁액, 또는 좌제를 포함한다. 고체 조성물, 예컨대 정제에서, 주요 활성 성분은 제약 담체와 혼합된다. 통상의 정제화 성분은 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 희석제 (예를 들어, 물)를 포함한다. 이들은 본 발명의 화합물 또는 비-독성의 그의 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성하는데 사용될 수 있다. 이어서, 고체 예비제제 조성물은 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 제제 또는 조성물의 정제, 환제 등은 코팅되거나 또는 달리 배합되어 지속 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 외부 성분으로 덮힌 내부 조성물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 두 성분은, 붕해에 저항성이 있어 내부 성분이 손상 없이 위를 통과하게 하거나 또는 방출을 지연시키는 역할을 하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있고, 이러한 물질은 다수의 중합체성 산 및 중합체성 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
본원에 기재된 IgCAM-결합제는 또한 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이러한 마이크로캡슐은, 예를 들어 코아세르베이션 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조되며, 예를 들어 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 중의 또는 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, 2005, University of the Sciences in Philadelphia, PA]에 기재된 바와 같은 마크로에멀젼 중의 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐이다.
특정 실시양태에서, 제약 제제는 리폼솜과 복합체를 형성한 본 발명의IgCAM-결합제를 포함한다. 리포솜을 제조하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 일부 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발에 의해 생성될 수 있다. 규정된 기공 크기의 필터를 통해 리포솜을 압출하여 원하는 직경을 갖는 리포솜을 수득할 수 있다.
특정 실시양태에서, 지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 IgCAM-결합제를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반-투과성 매트릭스를 포함하며, 여기서 매트릭스는 성형품 (예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐) 형태로 존재한다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔, 예컨대 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐 알콜), 폴리락티드, L-글루탐산과 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
특정 실시양태에서, IgCAM-결합제를 투여하는 것 이외에도, 방법 또는 치료는 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 추가의 치료제는 IgCAM-결합제의 투여 이전에, 그와 동시에, 및/또는 그 후에 투여될 수 있다. IgCAM-결합제 및 추가의 치료제(들)를 포함하는 제약 조성물이 또한 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 추가의 치료제는 1, 2, 3종 또는 그 초과의 추가의 치료제를 포함한다.
2종 이상의 치료제와의 조합 요법은 상이한 작용 메카니즘에 의해 작동하는 작용제들을 종종 사용하지만, 이것이 요구되는 것은 아니다. 상이한 작용 메카니즘을 갖는 작용제를 사용하는 조합 요법은 상가적 또는 상승작용적 효과를 유발할 수 있다. 조합 요법은 단독요법에서 사용되는 것보다 낮은 용량의 각각의 작용제를 허용하여, 독성 부작용을 감소시키고/거나 작용제(들)의 치료 지수를 증가시킬 수 있다. 조합 요법은 내성 암 세포가 발생할 가능성을 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 비-종양발생 세포에 영향을 미치는 (예를 들어, 이를 억제하거나 또는 사멸시키는) 치료제 및 종양발생 CSC에 영향을 미치는 (예를 들어, 이를 억제하거나 또는 사멸시키는) 치료제를 포함한다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제 및 하나 이상의 추가의 치료제의 조합물은 상가적 또는 상승작용적 효과를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 IgCAM-결합제의 치료 지수의 증가를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 작용제(들)의 치료 지수의 증가를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 IgCAM-결합제의 독성 및/또는 부작용의 감소를 유발한다. 일부 실시양태에서, 조합 요법은 추가의 작용제(들)의 독성 및/또는 부작용의 감소를 유발한다.
유용한 치료제 부류는, 예를 들어 항튜불린 작용제, 아우리스타틴, DNA 작은 홈 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제 (예를 들어, 백금 착물, 예컨대 시스플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 삼핵 백금 착물 및 카르보플라틴), 안트라시클린, 항생제, 항폴레이트제, 항대사물, 화학요법 증감제, 두오카르마이신, 에토포시드, 플루오린화 피리미딘, 이오노포어, 렉시트롭신, 니트로소우레아, 플라티놀, 퓨린 항대사물, 퓨로마이신, 방사선 증감제, 스테로이드, 탁산, 토포이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 치료제는 알킬화제, 항대사물, 항유사분열, 토포이소머라제 억제제 또는 혈관신생 억제제이다. 일부 실시양태에서, 제2 치료제는 백금 착물, 예컨대 카르보플라틴 또는 시스플라틴이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 백금 착물 및 탁산이다.
IgCAM-결합제와 조합하여 투여할 수 있는 치료제는 화학요법제를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 방법 또는 치료는 본 발명의 IgCAM-결합제를 화학요법제와 조합하거나 또는 화학요법제의 칵테일과 조합하여 투여하는 것을 포함한다. IgCAM-결합제로의 치료는 화학요법제의 투여 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 수행할 수 있다. 조합 투여는 단일 제약 제제로의 또는 개별 제제를 사용하는 공-투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제들이 그의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있도록 하는 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 진료의가 경험적으로 결정하는 바와 같이 사용될 수 있다. 이러한 화학요법제에 대한 제제 및 투여 스케줄은 또한 문헌 [The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA]에 기재되어 있다.
본 발명에 유용한 화학요법제는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 시클로포스파미드 (시톡산(CYTOXAN)); 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸라멜라민, 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 폴산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시토신 아라비노시드, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 폴산 보충제, 예컨대 폴린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK; 라족산; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 (Ara-C); 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (탁솔(TAXOL)) 및 도세탁셀 (탁소테레(TAXOTERE)); 클로람부실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; CPT11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플로오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈 (젤로다(XELODA)); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 화학요법제는 또한 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐, 예컨대 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 억제 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (파레스톤(FARESTON)); 및 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 시스플라틴이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 카르보플라틴이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제이다. 토포이소머라제 억제제는 토포이소머라제 효소 (예를 들어, 토포이소머라제 I 또는 II)의 작용을 방해하는 화학요법제이다. 토포이소머라제 억제제는 독소루비신 HCl, 다우노루비신 시트레이트, 미톡산트론 HCl, 악티노마이신 D, 에토포시드, 토포테칸 HCl, 테니포시드 (VM-26) 및 이리노테칸, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 이리노테칸이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물이다. 항대사물은 정상적인 생화학적 반응에 요구되는 대사물과 유사하지만, 세포의 하나 이상의 정상적인 기능, 예컨대 세포 분열을 방해하기에 충분하게 상이한 구조를 갖는 화학물질이다. 항대사물은 겜시타빈, 플루오로우라실, 카페시타빈, 메토트렉세이트 소듐, 랄리트렉세드, 페메트렉세드, 테가푸르, 시토신 아라비노시드, 티오구아닌, 5-아자시티딘, 6-메르캅토퓨린, 아자티오프린, 6-티오구아닌, 펜토스타틴, 플루다라빈 포스페이트 및 클라드리빈, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 겜시타빈이다.
특정 실시양태에서, 화학요법제는 튜불린에 결합하는 작용제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는 항유사분열제이다. 일부 실시양태에서, 작용제는 탁산이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 또는 도세탁셀, 또는 파클리탁셀 또는 도세탁셀의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 파클리탁셀 (탁솔), 도세탁셀 (탁소테레), 알부민-결합 파클리탁셀 (아브락산(ABRAXANE)), DHA-파클리탁셀 또는 PG-파클리탁셀이다. 특정의 대안적 실시양태에서, 항유사분열제는 빈카 알칼로이드, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈 또는 빈데신, 또는 이들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항유사분열제는 키네신 Eg5의 억제제 또는 유사분열 키나제, 예컨대 오로라 A 또는 Plk1의 억제제이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 파클리탁셀이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 소분자와 같은 작용제를 포함한다. 예를 들어, 치료는 본 발명의 IgCAM-결합제와 종양-연관 항원, 예컨대 EGFR, HER2 (ErbB2) 및/또는 VEGF에 대한 억제제로서 작용하는 소분자의 조합 투여를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 IgCAM-결합제는 게피티닙 (이레사(IRESSA)), 에를로티닙 (타르세바(TARCEVA)), 수니티닙 (수텐트(SUTENT)), 라파타닙, 반데타닙 (작티마(ZACTIMA)), AEE788, CI-1033, 세디라닙 (레센틴(RECENTIN)), 소라페닙 (넥사바르(NEXAVAR)) 및 파조파닙 (GW786034B)으로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질 키나제 억제제와 조합되어 투여된다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR 억제제를 포함한다.
특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 소분자이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 mTOR/AKR 경로의 억제제이다.
일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 생물학적 분자, 예컨대 항체를 포함한다. 예를 들어, 치료는 본 발명의 IgCAM-결합제와 종양-연관 항원에 대한 다른 항체, 예컨대 비제한적으로 EGFR, HER2/ErbB2 및/또는 VEGF에 결합하는 항체의 조합 투여를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 마커에 특이적인 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 성분에 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 암 줄기 세포 경로를 억제하는 항체이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Notch 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 Wnt 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 BMP 경로의 억제제이다. 일부 실시양태에서, 추가의 치료제는 β-카테닌 신호전달을 억제하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 혈관신생 억제제 (예를 들어, 항-VEGF 또는 VEGF 수용체 항체)인 항체이다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 베바시주맙 (아바스틴(AVASTIN)), 라무시루맙, 트라스투주맙 (헤르셉틴(HERCEPTIN)), 페르투주맙 (옴니타르그(OMNITARG)), 파니투무맙 (벡티빅스(VECTIBIX)), 니모투주맙, 잘루투무맙 또는 세툭시맙 (에르비툭스(ERBITUX))이다.
또한, 본원에 기재된 IgCAM-결합제로의 치료는 다른 생물학적 분자, 예컨대 하나 이상의 시토카인 (예를 들어, 림포카인, 인터류킨, 종양 괴사 인자 및/또는 성장 인자)과의 조합 치료를 포함할 수 있거나 또는 종양의 외과적 제거, 암 세포의 제거, 또는 치료 의사에 의해 필요해 보이는 임의의 다른 요법을 수반할 수 있다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 조직 재생을 위해, IgCAM-결합제를 아드레노메둘린 (AM), 안지오포이에틴 (Ang), BMP, BDNF, EGF, 에리트로포이에틴 (EPO), FGF, GDNF, G-CSF, GM-CSF, GDF9, HGF, HDGF, IGF, 이동-자극 인자, 미오스타틴 (GDF-8), NGF, 뉴로트로핀, PDGF, 트롬보포이에틴, TGF-α, TGF-β, TNF-α, VEGF, PlGF, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-7로 이루어진 군으로부터 선택된 성장 인자와 조합할 수 있다.
특정 실시양태에서, 치료는 방사선 요법과 조합된 본 발명의 IgCAM-결합제의 투여를 포함한다. IgCAM-결합제로의 치료는 방사선 요법 이전에, 그와 동시에 또는 그 후에 수행할 수 있다. 이러한 방사선 요법에 대한 투여 스케줄은 숙련된 진료의에 의해 결정될 수 있다.
조합 투여는 단일 제약 제제로의 또는 개별 제제를 사용하는 공-투여, 또는 임의의 순서이지만 일반적으로는 모든 활성제가 그의 생물학적 활성을 동시에 나타낼 수 있도록 하는 기간 내의 연속 투여를 포함할 수 있다.
IgCAM-결합제 및 하나 이상의 추가의 치료제의 조합은 임의의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다는 것을 알 것이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 이전에 제2 치료제로의 치료를 겪은 환자에게 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, IgCAM-결합제 및 제2 치료제는 실질적으로 동시에 또는 공동으로 투여될 것이다. 예를 들어, 대상체는 제2 치료제로의 치료 과정 (예를 들어, 화학요법)을 겪는 동안 IgCAM-결합제 (예를 들어, 항체)를 제공받을 수 있다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 제2 치료제로의 치료 후 1년 이내에 투여될 것이다. 특정의 대안적 실시양태에서, IgCAM-결합제는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 10, 8, 6, 4 또는 2개월 이내에 투여될 것이다. 특정의 다른 실시양태에서, IgCAM-결합제는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 4, 3, 2 또는 1주 이내에 투여될 것이다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 제2 치료제로의 임의의 치료 후 5, 4, 3, 2 또는 1일 이내에 투여될 것이다. 또한, 2종 (또는 그 초과)의 작용제 또는 치료는 대상체에게 몇 시간 또는 몇 분 이내에 (즉, 실질적으로 동시에) 투여될 수 있음을 알 것이다.
질환의 치료를 위해, 본 발명의 IgCAM-결합제의 적절한 투여량은 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 질환의 반응성, IgCAM-결합제가 치료 목적으로 투여되는지 아니면 예방 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법 및 환자의 임상 이력 등에 따라 달라질 수 있으며, 이들 모두는 치료의의 판단에 따른다. IgCAM-결합제는 한 번에 또는 수 일에서 수 개월까지 지속되는 일련의 치료에 걸쳐, 또는 치유가 이루어지거나 또는 질환 상태의 축소 (예를 들어, 종양 크기의 감소)가 달성될 때까지 투여될 수 있다. 최적의 투여 스케쥴은 환자의 체내 약물 축적의 측정으로부터 계산될 수 있고, 개별 작용제의 상대적 효력에 따라 달라질 것이다. 투여하는 의사는 최적의 투여량, 투여 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 투여량은 0.01μg 내지 100mg/체중 kg, 0.1μg 내지 100mg/체중 kg, 1μg 내지 100mg/체중 kg, 1mg 내지 100mg/체중 kg, 1mg 내지 80mg/체중 kg, 10mg 내지 100mg/체중 kg, 10mg 내지 75mg/체중 kg, 또는 10mg 내지 50mg/체중 kg이다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제의 투여량은 약 0.1mg 내지 약 20mg/체중 kg이다. 특정 실시양태에서, 투여량은 1일, 1주, 1개월 또는 1년에 1회 이상으로 제공될 수 있다. 특정 실시양태에서, IgCAM-결합제는 매주 1회, 2주마다 1회 또는 3주마다 1회 제공된다.
일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 초기의 보다 높은 "부하" 용량에 이어서 하나 이상의 보다 낮은 용량으로 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도도 또한 변할 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 요법은 초기 용량을 투여하고, 이어서 추가의 용량 (또는 "유지" 용량)을 1주에 1회, 2주마다 1회, 3주마다 1회 또는 1개월마다 1회 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 투여 요법은 초기 부하 용량에 이어서, 예를 들어 초기 용량의 1/2의 유지 용량을 매주 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 초기 부하 용량에 이어서, 예를 들어 초기 용량의 1/2의 유지 용량을 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다. 또는 투여 요법은 3주 동안 3개의 초기 용량에 이어서, 예를 들어 동일량의 유지 용량을 격주로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 임의의 치료제의 투여는 부작용 및/또는 독성을 유발할 수 있다. 일부 경우에, 부작용 및/또는 독성은 매우 심각하여 특정한 작용제를 치료 유효 용량으로 투여하는 것을 배제시킨다. 일부 경우에, 약물 요법은 중단되어야만 하고, 다른 작용제가 시도될 수 있다. 그러나, 동일한 치료 부류 내의 다수의 작용제는 종종 유사한 부작용 및/또는 독성을 나타내고, 이는 환자가 요법을 중단해야만 하거나, 또는 가능한 경우에, 치료제와 연관된 불쾌한 부작용을 겪어야만 함을 의미한다.
따라서, 본 발명은 IgCAM-결합제, 화학요법제 등의 투여와 연관된 부작용 및/또는 독성을 감소시킬 수 있는, 하나 이상의 작용제를 투여하기 위한 간헐적 투여 전략을 사용하는 것을 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서 암을 치료하는 방법은 대상체에게 치료 유효 용량의 IgCAM-결합제를 치료 유효 용량의 화학요법제와 조합하여 투여하는 것을 포함하며, 여기서 작용제 중 하나 또는 둘 다는 간헐적 투여 전략에 따라 투여된다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 IgCAM-결합제를 약 2주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 IgCAM-결합제를 약 3주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 간헐적 투여 전략은 초기 용량의 IgCAM-결합제를 대상체에게 투여하고, 후속 용량의 IgCAM-결합제를 약 4주마다 1회 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, IgCAM-결합제는 간헐적 투여 전략을 사용하여 투여되고, 화학요법제는 매주 투여된다.
V. 스크리닝
본 발명은 히포 경로를 조절하는 작용제를 확인하는 스크리닝 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 발명은 히포 경로 활성을 조절하는 후보 작용제, 예컨대 비제한적으로 단백질, 항체, 가용성 수용체, 펩티드, 펩티드모방체, 소분자, 화합물 또는 다른 약물에 대해 스크리닝하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하고/거나 이를 확인하는 방법은 작용제가 히포 경로 성분에 대해 영향을 미치는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 작용제에 대해 스크리닝하는 것을 포함하며, 여기서 작용제는 히포 경로를 조절한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 활성에 대한 효과를 갖는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 TAZ 활성에 대한 효과를 갖는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 및/또는 TAZ 활성을 감소시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 및/또는 TAZ 활성을 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP-의존성 유전자 또는 TAZ-의존성 유전자의 발현을 감소시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP-의존성 유전자 또는 TAZ-의존성 유전자의 발현을 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현을 감소 또는 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 및/또는 TAZ 인산화에 대한 효과를 갖는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 및/또는 TAZ 인산화를 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 및/또는 TAZ 인산화를 감소시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 비-인산화 YAP 및/또는 비-인산화 TAZ를 감소시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 비-인산화 YAP 및/또는 비-인산화 TAZ를 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 세포질에서의 YAP 및/또는 TAZ의 수준을 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 세포질에서의 YAP 및/또는 TAZ의 수준을 감소시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 및/또는 TAZ 분해를 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 YAP 및/또는 TAZ 분해를 감소시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 핵에서의 YAP 및/또는 TAZ의 수준을 감소시키는지를 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 작용제가 핵에서의 YAP 및/또는 TAZ의 수준을 증가시키는지를 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 후보 또는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, 세포의 제1 세트에서의 YAP-의존성 유전자 및/또는 TAZ-의존성 유전자의 발현을 세포의 제2 세트에서의 YAP-의존성 유전자 및/또는 TAZ-의존성 유전자의 발현과 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 후보 또는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, 세포의 제2 세트에서의 YAP-의존성 유전자 및/또는 TAZ-의존성 유전자의 발현과 비교한, 세포의 제1 세트에서의 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 및/또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자는 CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, GLI2, BIRC2, BIRC5 (서바이빈), FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3, AREG, FN1, ADAMTS1, AXL, ADAMTS5, MET, CYR61, IL8, ZEB1, FOXC2, N-카드헤린 및 SNAIL로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 세트에서의 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 및/또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현이 세포의 제2 세트에서의 YAP-의존성 유전자(들) 및/또는 TAZ-의존성 유전자(들)의 발현과 비교하여 증가한 경우에는, 작용제가 히포 경로를 억제하였다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 세트에서의 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 및/또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현이 세포의 제2 세트에서의 YAP-의존성 유전자(들) 및/또는 TAZ-의존성 유전자(들)의 발현과 비교하여 감소한 경우에는, 작용제가 히포 경로를 활성화하였다.
일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 후보 또는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, 세포의 제1 세트에서의 Mst1, Mst2, Lats1, Lats2, YAP 및/또는 TAZ의 인산화 상태를 세포의 제2 세트에서의 Mst1, Mst2, Lats1, Lats2, YAP 및/또는 TAZ의 인산화 상태와 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 후보 또는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, 세포의 제2 세트에서의 Mst1, Mst2, Lats1, Lats2, YAP 및/또는 TAZ의 인산화 상태와 비교한 세포의 제1 세트에서의 Mst1, Mst2, Lats1, Lats2, YAP 및/또는 TAZ의 인산화 상태를 결정하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 후보 또는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, 세포의 제2 세트와 비교한 세포의 제1 세트에서의 인산화 YAP 및/또는 인산화 TAZ의 양을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 세트에서의 인산화 YAP 및/또는 인산화 TAZ의 양이 세포의 제2 세트와 비교하여 증가한 경우에는, 작용제가 히포 경로를 활성화하였다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 세트에서의 인산화 YAP 및/또는 인산화 TAZ의 양이 세포의 제2 세트와 비교하여 감소한 경우에는, 작용제가 히포 경로를 억제하였다.
일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 후보 또는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, 세포의 제2 세트와 비교한 세포의 제1 세트에서의 비-인산화 YAP 및/또는 비-인산화 TAZ의 양을 결정하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 세트에서의 비-인산화 YAP 및/또는 비-인산화 TAZ의 양이 세포의 제2 세트와 비교하여 증가한 경우에는, 작용제가 히포 경로를 억제하였다. 일부 실시양태에서, 세포의 제1 세트에서의 비-인산화 YAP 및/또는 비-인산화 TAZ의 양이 세포의 제2 세트와 비교하여 감소한 경우에는, 작용제가 히포 경로를 활성화하였다.
일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 후보 또는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고, 세포의 제1 세트에서의 YAP 및/또는 TAZ의 위치 (핵 또는 세포질)를 세포의 제2 세트와 비교하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 후보 작용제가 히포 경로를 자극 또는 활성화한 경우에는, 세포의 제1 세트는 세포의 제2 세트보다 세포질에서 더 높은 수준의 YAP 및/또는 TAZ를 갖는다.
일부 실시양태에서, 히포 경로를 조절하는 후보 또는 시험 작용제에 대해 스크리닝하는 방법은 (a) 후보 또는 시험 작용제와 세포를 접촉시키고, (b) 이분자 형광 상보성 (BiFC) 검정을 사용하여 YAP 및/또는 TAZ의 세포 국재화를 결정하는 것을 포함한다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, YAP 및/또는 TAZ가 세포의 세포질에서 우세하게 국재화된 경우에는, 히포 경로는 활성화되었다. 상기 방법의 일부 실시양태에서, YAP 및/또는 TAZ가 세포의 핵에서 우세하게 국재화된 경우에는, 히포 경로는 억제되었다.
또한, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 스크리닝 방법에 의해 확인된, 히포 경로를 조절하는 작용제를 제공한다.
VI. IgCAM-결합제를 포함하는 키트
본 발명은 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용될 수 있는, 본원에 기재된 IgCAM-결합제를 포함하는 키트를 제공한다. 특정 실시양태에서, 키트는 하나 이상의 정제된 IgCAM-결합제를 하나 이상의 용기에 포함한다. 일부 실시양태에서, 키트는 검출 검정을 수행하는데 필요하고/거나 충분한 성분, 예컨대 모든 대조군, 검정을 수행하기 위한 지침서, 및 분석 및 결과 표시를 위한 임의의 필요한 소프트웨어 모두를 함유한다. 당업자는 개시된 본 발명의 IgCAM-결합제가 당업계에 널리 공지된 확립된 키트 포맷 중 하나에 용이하게 혼입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
IgCAM-결합제 뿐만 아니라 하나 이상의 추가의 치료제를 포함하는 키트가 추가로 제공된다. 특정 실시양태에서, 제2 (또는 그 초과의) 치료제는 화학요법제이다. 특정 실시양태에서, 제2 (또는 그 초과의) 치료제는 혈관신생 억제제이다.
본 개시내용의 실시양태는, 본 개시내용의 특정 항체의 제조 및 본 개시내용의 항체를 사용하는 방법을 상술하는 하기의 비제한적 실시예를 참고하여 추가로 정의될 수 있다. 물질 및 방법 둘 다에 대한 다수의 변형이 본 개시내용의 범위로부터 벗어나지 않으면서 실시될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1
OMP 종양에서의 YAP의 발현
온코메드 종양 은행에서의 환자-유래 종양의 마이크로어레이 유전자 발현 분석을 수행하여 YAP 발현의 수준을 결정하였다. 방광 (2), 뇌 (2), 유방 (15), 결장 (25), 간 (1), 폐 (19), 흑색종 (11), 난소 (9) 및 췌장 (17)을 비롯한 101개의 종양을 평가하였다. NOD/SCID 마우스에 연속적으로 이식시킨 이들 종양으로부터 전체 RNA를 단리하였다. 바이오애널라이저(Bioanalyzer) (애질런트(Agilent), 캘리포니아주 산타 클라라)를 사용하여 RNA 품질을 모니터링하였다. 정제한 RNA를 확립된 아피메트릭스(Affymetrix) 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 샘플을 제조업체의 기술 매뉴얼에 개략화된 바와 같이 아피메트릭스 HG-U133 플러스 2.0 마이크로어레이 (아피메트릭스, 캘리포니아주 산타 클라라)에 혼성화하였다. 혼성화 후에, 마이크로어레이를 세척하고, 스캐닝하고, 분석하였다. GCRMA 알고리즘 (바이오컨덕터(Bioconductor), www.bioconductor.org)을 사용하여, 스캐닝된 어레이 배경 조정 및 신호 강도 정규화를 수행하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 종양의 대략 80%가 중간 내지 높은 수준의 YAP 발현을 나타냈다.
실시예 2
우성 음성 YAP에 의한 종양 성장의 억제
우성 음성 인간 YAP (dnYAP)를 코딩하는 돌연변이 YAP 유전자를 설계하고, 합성하였다. dnYAP 단백질은 YAP TEAD 결합 도메인, 2개의 WW 도메인 및 PDZ 도메인을 포함한다 (서열 68). YAP 활성화 도메인을 결실시키고, 아미노산 127에서의 세린을 알라닌 잔기로 대체하였다 (S127A). 이 치환은 핵심 인산화 부위를 제거하고, dnYAP가 세포질로부터 핵으로 전위되도록 한다.
종양 세포에서 dnYAP를 시험관내 및 생체내 발현시키기 위해, dnYAP 유전자를 극초기 CMV 프로모터를 함유하는 렌티바이러스 벡터 내에 클로닝하였다. 렌티바이러스 벡터는 또한 형질도입된 세포의 시각화 및 선택을 가능하게 하는 IRES-GFP 부분을 함유한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV-1-유래, 복제 결함, tat-비의존성, 자기-불활성화 '제3 세대' 벡터이다 (예를 들어, 문헌 [Durand et al., Viruses, 2011, 3:132-159] 참조). dnYAP-발현 렌티바이러스 벡터를 pOM420으로 명명하였다. dnYAP-발현 렌티바이러스 벡터 및 3개의 헬퍼 플라스미드를 HEK-293T 세포 내에 일시적으로 형질감염시켜 dnYAP 렌티바이러스를 생산하였다. 3개의 헬퍼 플라스미드는 바이러스 생산에 필요한 보완적인 기능을 제공하였다. 광범위하게 다양한 인간 종양 세포 내로의 바이러스 진입을 매개하기 위해, 바이러스를 수포성 구내염 바이러스 외피 G 단백질 (VSV-G)로 가성형태화하였다.
해리된 흑색종 OMP-M6 세포 (5 x 105개 세포/웰)를 6-웰 프리마리아(Primaria)™ 플레이트 (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 캘리포니아주 산호세)에 시딩하고, dnYAP-렌티바이러스 (LOM420, CMV-dnYAP-IRES-GFP) 또는 대조군으로서의 GFP-렌티바이러스 (LOM92, CMV-IRES-GFP)를 형질도입하였다. 렌티바이러스를 플레이팅 시점 (t = 0)에 세포당 2.5개 감염성 입자의 감염 다중도 (MOI)로 세포에 첨가하였다. 세포를 렌티바이러스와 함께 밤새 인큐베이션하고, 세척하고, 배양 배지 중에서 다시 인큐베이션하였다. 배양 배지는 DMEM 저 글루코스, F12 배지, B27 배지, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물, 헤파린, rhEGF, rhFGF-2 및 항생제였다. 72시간 후에, 세포를 수집하고, 트립신처리하고, 세척하고, 2% FBS 및 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 몰레큘라 프로브스(Molecular Probes)/인비트로젠(Invitrogen), 뉴욕주 그랜드 아일랜드)을 함유하는 HBSS 중에 재현탁시켰다. GFP 양성 및 DAPI 음성 (GFP+/DAPI-)으로서 확인된 형질도입된 흑색종 OMP-M6 세포를 FACSAria 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)를 사용하는 유동 세포측정법에 의해 분류하였다. 세포 집단 순도를 분류된 세포의 분획의 재분석에 의해 확인하고, 세포를 50% 매트리겔(Matrigel)™ (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)과 혼합하였다. 대조 렌티바이러스-형질도입된 GFP+/DAPI- 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (200개 세포/마우스, n = 10). dnYAP 렌티바이러스-형질도입된 GFP+/DAPI- 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (200개 세포/마우스, n = 8). 3개월 동안 종양 성장을 모니터링하였다.
GFP만을 발현하는 흑색종 OMP-M6 세포를 주사한 마우스는 주사 후 대략 40일째에 주사 부위에서 촉지성 종양을 가졌다. 이들 종양은 2.5개월 내에 2000mm3의 평균 부피에 도달하였다. 대조적으로, dnYAP를 발현하는 흑색종 OMP-M6 세포를 주사한 마우스는 매우 천천히 성장하거나 또는 전혀 성장하지 않은 종양을 가졌다. dnYAP-발현 흑색종 OMP-M6 세포의 성장 속도는 대조군과 비교하여 대략 17배 더 느렸다 (각각 2.8mm3/일 대 47.5mm3/일). 이러한 효과는 모든 측정에서 주목할 만하였으며, 통계적으로 유의성이 있었다. 도 2a에 나타낸 바와 같이, 주사 후 제75일에 dnYAP를 발현하는 흑색종 OMP-M6 종양의 성장은 GFP를 발현하는 OMP-M6 종양 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다 (93% 감소, 각각 2669mm3의 평균 종양 부피와 비교한 186mm3의 평균 종양 부피). 이러한 결과는, YAP가 흑색종에서 종양유전자로서 작용할 수 있고, dnYAP는 종양 성장을 억제하는데 매우 효율적이었음을 시사한다.
결장 종양 OMP-C18, OMP-C11, OMP-C37, 췌장 종양 OMP-PN7, 폐 종양 OMP-LU52 및 OMP-LU2, 및 난소 종양 OMP-OV22를 비롯한 추가의 종양을 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 형질도입된 종양 세포 및 마우스 수는 각 샘플의 종양발생 특성에 기초하여 달라졌다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, dnYAP로 형질도입시킨 결장 종양 OMP-C18 세포는 어떠한 종양도 생성하지 않은 반면 (0마리/5마리), GFP를 발현하는 세포 대조군은 제47일에 10마리 마우스 중 9마리에서 323mm3의 평균 부피를 갖는 종양을 생성하였다. 도 2c에 나타낸 바와 같이, dnYAP로 형질도입시킨 결장 종양 OMP-C37 세포는 1개의 종양만을 생성하였고 (1마리/10마리), 이 종양은 GFP 음성인 것으로 나타났으며, 이에 따라 이 종양은 dnYAP를 발현하지 않는 세포로부터 발생한 것이었다. 대조적으로, GFP를 발현하는 OMP-C37 종양 세포 대조군은 제67일에 10마리 마우스 중 9마리에서 342mm3의 평균 부피를 갖는 종양을 생성하였다. 도 2d에 나타낸 바와 같이, dnYAP로 형질도입시킨 췌장 종양 OMP-PN7 세포는 10마리 마우스 중 4마리에서 종양을 생성하였다. OMP-C37로 알 수 있는 바와 같이, 가장 거대한 종양은 GFP 음성인 것으로 나타난 반면, 다른 3개의 종양은 오직 7% GFP 양성, 15% GFP 양성 및 41% GFP 양성인 것으로 나타났으며, 이는 제한된 양의 dnYAP 발현을 가리킨다. 대조적으로, GFP를 발현하는 OMP-PN7 종양 세포 대조군은 제80일에 9마리 마우스 중 8마리에서 766mm3의 평균 부피를 갖는 종양을 생성하였다. 도 2e에 나타낸 바와 같이, dnYAP로 형질도입시킨 결장 종양 OMP-C11 세포는 종양을 생성하였지만 (7마리/10마리), 모두 제53일에 65mm3의 평균 부피를 가져서 극히 작았다. 대조적으로, GFP를 발현하는 OMP-C11 종양 세포 대조군은 제53일에 10마리 마우스 중 10마리에서 945mm3의 평균 부피를 갖는 종양을 생성하였다. 도 2f에 나타낸 바와 같이, dnYAP로 형질도입시킨 폐 종양 OMP-LU2 세포는 제87일에 10마리 마우스 중 4마리에서 251mm3의 평균 종양 부피를 갖는 종양을 생성한 반면, GFP를 발현하는 세포 대조군은 제87일에 10마리 마우스 중 9마리에서 1023mm3의 평균 부피를 갖는 종양을 생성하였다. 도 2g에 나타낸 바와 같이, dnYAP로 형질도입시킨 난소 종양 OMP-OV22 세포는 9마리 마우스 중 8마리에서 종양을 생성하였지만, 종양은 평균 부피 268mm3를 가져서 대조군보다 작았다. GFP를 발현하는 OMP-OV22 종양 세포 대조군은 제108일에 8마리 마우스 중 8마리에서 416mm3의 평균 부피를 갖는 종양을 생성하였다. 도 2h에 나타낸 바와 같이, dnYAP를 발현하는 OMP-LU52 종양의 성장은 제62일에 GFP를 발현하는 OMP-LU52 종양 대조군과 비교하여 감소하였다 (종양 부피에서의 53% 감소, 1041mm3의 평균 종양 부피와 비교한 490mm3의 평균 종양 부피).
이러한 결과는 흑색종 종양 OMP-M6으로 관찰한 결과와 유사하였으며 (즉, dnYAP에 의한 YAP 활성의 억제는 종양 성장을 감소시키거나 또는 방지함), 이는 YAP가 흑색종에서 뿐만 아니라 결장암, 췌장암 및 폐암에서 종양유전자로서 작용할 수 있음을 입증하였다. 폐 종양 OMP-LU52 및 난소 종양 OMP-OV22에서의 dnYAP 발현에 의한 종양 성장의 억제는 연구된 다른 종양보다 적었다. 흥미롭게도, 마이크로어레이 분석에 의해 제시된 바와 같이, OMP-LU52는 다른 종양과 비교하여 매우 낮은 YAP 발현 수준을 가졌다 (도 2i). 이는, dnYAP가 연구된 종양 대부분에서 YAP 활성에 대한 직접적인 영향을 갖고 있고, LU52 세포에는 오직 소량의 YAP만이 존재하기 때문에 폐 종양 LU52에서는 dnYAP가 보다 제한된 효과를 갖는다는 개념을 지지한다.
실시예 3
dnYAP를 발현하는 종양 세포의 마이크로어레이 분석
실시예 2에 기재된 바와 같이, 결장 종양 OMP-C18, 결장 종양 OMP-C37, 췌장 종양 OMP-PN7 및 폐 종양 OMP-LU52로부터의 종양 세포에 dnYAP-렌티바이러스 (LOM420, CMV-dnYAP-IRES-GFP) 또는 대조군으로서의 GFP-렌티바이러스 (LOM92, CMV-IRES-GFP)를 형질도입하였다. 형질도입된 세포를 3일 동안 배양하고, GFP 발현에 대해 FACS 분류하였다. 이들 형질도입된 종양 세포의 유전자 발현 프로파일을 마이크로어레이 분석에 의해 결정하였다. RNA를 형질도입된 세포로부터 단리하고, 확립된 아피메트릭스 프로토콜을 사용하여 처리하였다. 샘플을 제조업체의 기술 매뉴얼에 개략화된 바와 같이 아피메트릭스 HG-U133 플러스 2.0 마이크로어레이 (아피메트릭스, 캘리포니아주 산타 클라라)에 혼성화하였다. 혼성화 후에, 마이크로어레이를 세척하고, 스캐닝하고, 분석하였다. GCRMA 알고리즘 (바이오컨덕터, www.bioconductor.org)을 사용하여, 스캐닝된 어레이 배경 조정 및 신호 강도 정규화를 수행하였다. dnYAP를 발현하는 종양 세포에 대해 확립된 유전자 발현 프로파일을 GFP-발현 종양 세포에 대해 확립된 유전자 발현 프로파일과 비교하고, IPA 소프트웨어 (인제뉴어티 시스템즈(Ingenuity Systems), 캘리포니아주 레드우드 시티)를 사용하여 분석하였다.
dnYAP를 발현하는 결장 종양 OMP-C18 및 OMP-C37 및 췌장 종양 OMP-PN7로부터의 유전자 발현 프로파일은 대조 종양 세포와 비교하여 적어도 2배 (p 값 ≤ 0.05) 유의하게 하향-조절된 208개 유전자의 중복을 나타내었다. 분석은, dnYAP의 발현에 의해 하향-조절된 유전자가 다수의 세포 경로 및/또는 기능, 예컨대 세포 부착, 극성, 암 줄기 세포, 막 및 분비 트래픽킹, DNA 복구, RNA 대사, 유사분열, 세포 사멸 및 유비퀴틴화에 관여함을 나타내었다. 적어도 2개의 종양에서 하향-조절된 일부 막 단백질은 CA12, CLDN2, PAG1, SEMA4D, GPC4, CD44, CD47, CD133, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, EPHB2 및 TDGF1을 포함하였고, 적어도 2개의 종양에서 하향-조절된 일부 성장 인자 및 시토카인은 AREG-B, IL33, GRB2 및 IGFBP3이었다 (표 1). 확인된 유전자 중 일부는 암 줄기 세포 유전자이고/거나 암 줄기 세포 마커, 예를 들어 CD133, CD44, TDGF1, CD47 및 EPHB2를 코딩하는 것으로 보고되었다.
<표 1>
Figure pct00001
실시예 4
YAP 활성에 대한 dnYAP의 효과
YAP 활성에 대한 dnYAP의 효과를 평가하기 위해, 플라스미드의 다양한 조합물로 HEK-293T 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. TEAD 결합 부위로서 작용하는 SV40 인핸서의 GT-IIC 모티프의 6 카피를 함유하는 프로모터를 포함하는 루시페라제 리포터 (TBS-Luc 리포터)로 세포를 형질감염시켰다. 또한, TEAD, YAP 또는 GFP-YAP, 및/또는 dnYAP 또는 GFP-dnYAP를 발현하는 플라스미드의 다양한 조합물로 세포를 형질감염시켰다. 모든 형질감염은 내부 대조군으로서의 레닐라(Renilla) 루시페라제를 발현하는 플라스미드를 포함하였다. 1.5 x 105개 HEK-293T 세포/웰을 96-웰 플레이트 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)에 시딩하고, 제조업체의 지침에 따라 퓨젠(FuGENE) 6 형질감염 시약 (로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science), 인디애나주 인디애나폴리스)을 사용하여 플라스미드의 등몰 믹스 250ng으로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 48-72시간 동안 인큐베이션하고, 제조업체의 지침에 따라 듀얼-글로(Dual-Glo)® 루시페라제 검정 시스템 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨)을 사용하여 루시페라제 활성을 측정하였다. 활성은 레닐라 루시페라제 활성에 대한 반딧불이 루시페라제 활성의 비로서 나타내었다.
YAP 및 GFP-YAP 둘 다는 TBS-Luc 리포터의 TEAD-매개 전사를 강력하게 유도하였다 (도 3, #4). dnYAP 및 GFP-dnYAP 둘 다는 루시페라제 활성에서의 유의한 감소에 의해 입증된 바와 같이 YAP 활성을 강력하게 억제하였다 (도 3, #5 및 #6). 또한, 생체내 종양 연구에서 사용한 dnYAP 발현 렌티바이러스 벡터 (pOM420) 또한 루시페라제 활성에서의 유의한 감소에 의해 입증된 바와 같이 YAP 활성을 강력하게 억제하였음이 입증되었다 (도 3, #7). 이러한 결과는, 루시페라제-기반 검정을 사용하여 분자를 YAP 활성에 대한 그의 효과에 대해 평가 및/또는 스크리닝할 수 있음을 입증하였다. 따라서, 본 검정을 사용하여 분자를 히포 경로에 대한 그의 효과에 대해 평가 및/또는 스크리닝할 수 있다.
검정을 단순화하고, 다중 플라스미드로의 형질감염을 피하기 위해, HEK-293T 세포를 TBS-Luc 리포터 벡터로 안정하게 형질감염시키고, 히그로마이신 B를 사용하여 클론을 선택하였다. YAP로 클론을 일시적으로 형질감염시키고, 루시페라제 활성을 측정하였다. 2개의 클론이 YAP 발현 후에 루시페라제 활성의 강력한 유도를 나타내는 것으로 확인되었다. 이러한 안정한 리포터 세포주를 사용하여 분자를 히포 경로에 대한 그의 효과에 대해 평가 및/또는 스크리닝할 수 있다.
실시예 5
히포 경로 성분에 대한 세포 분리의 효과
세포 분리는 MCF10A 유방 세포주에서 히포 경로 성분의 인산화의 변화를 유도하는 것으로 보고되었다 (Zhao et al., 2012, Genes Dev., 26:54-68). 세포 분리가 HEK-293T 세포에서도 유사한 효과를 갖는지를 조사하기 위해 연구를 수행하였다. HEK-293T 세포를 배양액 중에서 대략 80% 전면생장률로 성장시키고, 트립신처리하고, PBS로 세척하고, 3개의 실험 군으로 나누었다. 군 1에서의 세포를 조직 추출 시약 완충제 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로 직접 용해시켰다. 군 2 및 3에서의 세포를 6-웰 프리마리아™ 플레이트 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)에 1 x 106개 세포/웰의 세포 밀도로 시딩하고, 각각 1시간 및 20시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 부착된 세포를 PBS로 세척하고, 플레이트에서 조직 추출 시약 완충제로 직접 용해시켰다. 단백질의 인산화 형태 및 단백질의 모든 형태를 인식하는 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 분석에 의해 단백질 Lats1, Lats2 및 YAP를 분석하였다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (로슈 몰레큘라(Roche Molecular), 캘리포니아주 플레젠튼)을 함유하는 조직 추출 시약 완충제를 사용하여 전세포 단백질 추출물을 제조하였다. 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (PAGE)에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유를 함유하는 TBS-T (0.1% 트윈 20을 함유하는 트리스-완충 염수) 중에서 인큐베이션하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 막을 4℃에서 밤새 3% BSA를 함유하는 TBS-T 중에서 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 일차 항체를 적절한 이차 HRP 접합 항체로 검출하고, 실온에서 1시간 동안 5% 밀크를 함유하는 TBS-T 중에서 인큐베이션하고, 슈퍼시그널 웨스트(SuperSignal West) 화학발광 기질 (피어스-써모 피셔 사이언티픽(Pierce-Thermo Fisher Scientific), 일리노이주 록포드)을 사용하여 시각화하였다. 사용한 일차 항체는 토끼 항-인산화 YAP (pYAP) (Ser127) 항체, 토끼 항-YAP 항체, 토끼 항-인산화 Lats1 (pLats1) (Thr1079) 항체, 토끼 항-pLats1 (Ser909) 항체, 토끼 항-Lats1 항체 (모두 셀 시그널링(Cell Signaling) (메사추세츠주 댄버스)으로부터의 것) 및 토끼 항-Lats2 항체 (압캠(abcam), 메사추세츠주 캠브리지)였다. 사용한 이차 항체는 HRP-접합 어피니퓨어(Affinipure) 당나귀 항-토끼 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈(Jackson ImmunoResearch Laboratories), 펜실베니아주 웨스트 그로브)였다. 후속적으로, 막을 스트리핑하고 (리스토어 플러스(Restore Plus) 스트리핑 완충제, 피어스-써모 피셔 사이언티픽, 일리노이주 록포드), 마우스 항-액틴 항체 (밀리포어, 메사추세츠주 빌러리카) 및 HRP-접합 어피니퓨어 당나귀 항-마우스 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 다시 프로빙하여 각 샘플에 대한 동등 단백질 로딩량을 평가 및 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, pLats1 (S909 또는 T1079) 및 Lats2 단백질의 양은 군 3 세포 (t = 20시간 인큐베이션/부착)와 비교하여 군 1 세포 (t = 0) 및 군 2 세포 (t = 1시간 인큐베이션/부착)에서 유의하게 더 낮았다. 전체 Lats1 단백질의 검출가능한 감소는 어떠한 군에서도 관찰되지 않았다. 또한, pYAP 단백질의 양은 군 3 세포 (t = 20시간 인큐베이션/부착)와 비교하여, 군 1 세포 (t = 0)에서는 감소하였고, 군 2 세포 (t = 1시간 인큐베이션/부착)에서는 검출불가능하였다. Lats1에 대해 관찰된 결과와 유사하게, 전체 YAP의 감소는 어떠한 군에서도 존재하지 않았다. 이러한 결과는, 히포 경로가 HEK-293T 세포에서 실험적으로 시험관내 조절될 수 있었고, 히포 경로 성분의 인산화 상태 (예를 들어, pLats1, pYAP)에서의 변형이 검출될 수 있음을 입증한다.
실시예 6
IgCAM 구축물
잠재적 히포 경로 수용체를 확인하기 위해, 인간 게놈에 의해 코딩되는 IgCAM 단백질의 상동성-기반 생물정보학 분석을 수행하였다. 후보 히포 경로 수용체의 가계도 또는 계통도는 도 5에 나타내었다. 단백질은 일반적으로 3개의 군: 1) JAM1, JAM2, JAM3, CAR, CLMP, AMICA, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4 및 VSIG8을 함유하는 "JAM-유사" 패밀리; 2) CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM 및 TMIGD1을 함유하는 "CADM-유사" 패밀리; 및 3) PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96 및 TIGIT를 함유하는 "PVR-유사" 패밀리에 속한다.
히포 경로 신호전달에서의 이들 분자의 가능한 기능을 조사하기 위해, 막-고정된 단백질 및 가용성 "디코이" 수용체를 비롯한 IgCAM 구축물을 제조하였다 (도 6). 각각의 막-고정된 디코이 수용체는 막횡단 및 세포질 도메인을 인간 CD4 단백질의 막횡단 및 세포내 도메인으로 대체하였기 때문에, 신호전달에 관하여 비-기능성이도록 설계하였다. 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간 IgCAM 단백질의 세포외 도메인 (ECD) 영역을 CD4의 막횡단 도메인 및 세포내 도메인 및 C-말단 GFP 단백질 태그에 라이게이션함으로써 막-고정된 IgCAM 단백질 구축물을 생성하였다. 이러한 구축물은 "IgCAM"-CD4TM-GFP, 예를 들어 CAR-CD4TM-GFP로서 지칭된다. 가용성 디코이 수용체는 이뮤노글로불린 Fc 도메인에 연결된 IgCAM의 ECD를 포함하도록 설계하였다. 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 인간 IgCAM 단백질의 ECD 영역을 인간 IgG1의 Fc 도메인에 라이게이션함으로써 가용성 수용체 IgCAM 단백질 구축물을 생성하였다. 이러한 구축물은 "IgCAM"-Fc, 예를 들어 CAR-Fc로서 지칭된다. 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이, 구축물에 사용된 임의의 주어진 IgCAM 단백질의 ECD 영역은 ECD를 포함할 수 있거나 또는 ECD의 일부 또는 단편을 포함할 수 있다. 또한, ECD인 것으로 간주되는 것은 ECD의 아미노 말단, 카르복실 말단 또는 둘 모두에서 1, 2, 3개 또는 그 초과의 아미노산만큼 달라질 수 있다. 이러한 융합 단백질을 사용하여 히포 경로에서의 IgCAM 단백질의 역할을 조사할 수 있다.
생성된 구축물은 표 2의 IgCAM 단백질로부터의 ECD 영역, 또는 그의 일부 또는 단편을 포함한다.
<표 2>
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 7
히포 경로 성분에 대한 IgCAM 단백질의 효과
실시예 6에 기재된 IgCAM 구축물로 HEK-293T 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. 3.5 x 105개 HEK-293T 세포/웰을 6-웰 프리마리아™ 플레이트 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)에 시딩하였다. 대략 18시간 후에, 제조업체의 지침에 따라 퓨젠 6 형질감염 시약 (로슈 어플라이드 사이언스, 인디애나폴리스)을 사용하여 IgCAM-CD4TM-GFP 구축물 (상기 기재됨) 1ug을 세포에 형질감염시켰다. 사용한 IgCAM-CD4TM-GFP 구축물은 CAR-CD4TM-GFP, CLMP-CD4TM-GFP, VSIG1-CD4TM-GFP, VSIG2-CD4TM-GFP, VSIG3-CD4TM-GFP, VSIG8-CD4TM-GFP, ESAM-CD4TM-GFP, JAM1-CD4TM-GFP, JAM2-CD4TM-GFP, JAM3-CD4TM-GFP, CADM1-CD4TM-GFP, CADM2-CD4TM-GFP, CADM3-CD4TM-GFP, CADM4-CD4TM-GFP, CD226-CD4TM-GFP, CD200-CD4TM-GFP, CD200R1-CD4TM-GFP, CD200R1L-CD4TM-GFP, PVR-CD4TM-GFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL2-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP, PVRL4-CD4TM-GFP, TIGIT-CD4TM-GFP, TMIGD1-CD4TM-GFP 및 TMEM25-CD4TM-GFP를 포함하였다. 대조군으로서 FLAG-mIgG1-CD4TM-GFP, LGR5-CD4TM, CD4TM 및 RSPO4-CD4TM-GFP를 사용하였다.
세포 배양 성장 및 GFP 국재화를 분석하기 위해, 니콘(Nikon) 수은-증기 램프 및 카메라에 부착된 니콘 이클립스(Eclipse) TS100 도립 조직 배양 현미경을 사용하여 일시적 형질감염 동안 세포 배양을 모니터링하였다. 형질감염된 세포의 대표적인 예를 나타내는 도 7a에서 입증된 바와 같이, IgCAM-CD4TM-GFP 단백질은 세포 표면에서 발현되었고, 형광 현미경검사에 의해 검출가능하였다.
28시간 후에, 일부 형질감염된 세포를 트립신처리하여 단세포 현탁액을 수득하고, 세척하고, FBS 및 DAPI (몰레큘라 프로브스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 함유하는 HBSS 중에 재현탁시켰다. GFP 발현 수준에 의해 결정되는 바와 같은 형질감염 효율, 및 DAPI 염색에 의해 결정되는 바와 같은 생존율을 FACSCanto™ 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)에서 분석하였다. 도 7b는 IgCAM-CD4TM-GFP 형질감염된 세포의 대표적인 유동 세포측정법 히스토그램을 나타내며, 이는 세포의 98%가 GFP 양성이었음을 입증한다. 26종의 IgCAM-CD4TM-GFP 구축물로 형질감염시킨 세포에 대해, GFP 양성 세포의 백분율은 대략 75% 내지 99.5% (평균 93% ± 6.8%) 범위였다. 이러한 결과는 IgCAM-CD4TM-GFP 구축물을 사용한 형질감염이 매우 효율적이었음을 입증하였다.
다른 세포를 조직 배양 플레이트에서 직접 용해시켰다. 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일 (로슈 몰레큘라, 캘리포니아주 플레젠튼)을 함유하는 조직 추출 시약 완충제 (인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 사용하여 전세포 단백질 추출물을 제조하였다. 단백질을 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 5% 탈지유를 함유하는 TBS-T 중에서 인큐베이션하여 비-특이적 결합을 차단하였다. 막을 4℃에서 밤새 3% BSA를 함유하는 TBS-T 중에서 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 결합된 일차 항체를 적절한 이차 HRP 접합 항체로 검출하고, 실온에서 1시간 동안 5% 밀크를 함유하는 TBS-T 중에서 인큐베이션하고, 슈퍼시그널 웨스트 화학발광 기질 (피어스-써모 피셔 사이언티픽 인크., 일리노이주 록포드)을 사용하여 시각화하였다. 사용한 일차 항체는 토끼 항-pYAP (Ser127) 항체, 토끼 항-YAP 항체, 토끼 항-pLats1 (Thr1079) 항체, 토끼 항-pLats1 (Ser909) 항체 및 토끼 항-Lats1 항체 (모두 셀 시그널링 (메사추세츠주 댄버스)으로부터의 것)였다. 사용한 이차 항체는 HRP-접합 어피퓨어 당나귀 항-토끼 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 펜실베니아주 웨스트 그로브)였다. 후속적으로, 리스토어 플러스 스트리핑 완충제 (피어스-써모 피셔 사이언티픽, 일리노이주 록포드)를 사용하여 막을 스트리핑하고, 마우스 항-액틴 항체 (밀리포어, 메사추세츠주 빌러리카) 및 HRP-접합 어피퓨어 당나귀 항-마우스 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리즈, 펜실베니아주 웨스트 그로브)로 다시 프로빙하여 각 샘플에 대한 동등 단백질 로딩량을 평가 및 확인하였다.
단백질 발현 정량화를 위해, 웨스턴 블롯을 스캐닝하고, 생성된 이미지를 밴드 강도에 대해 밀도측정법 소프트웨어 (이미지제이(ImageJ) 소프트웨어, NIH)를 사용하여 분석하였다. 각 단백질 밴드의 강도 신호를 동일한 샘플의 액틴 신호에 대해 정규화하였다. 표 3에서의 수치는 FLAG-mIgG1 대조군에 대한 상대 단백질 양에 해당한다. 양의 결과는 대조군에 대한 증가된 배수 변화를 나타내고, 음의 결과는 대조군에 대한 감소된 배수 변화를 나타낸다.
<표 3>
Figure pct00004
도 8 및 표 3에 나타낸 바와 같이, IgCAM-ECD 구축물의 발현은 히포 경로의 일부 성분에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 예를 들어, pLats1 및 pYAP는 대조군과 비교 시 CD200-ECD의 발현에 의해 증가하였다. 대조적으로, pLats1 및 pYAP는 대조군과 비교 시 CADM3-ECD의 발현에 의해 감소하였다. 이러한 결과는 일부 IgCAM 단백질, 예컨대 CD200 및 CADM3의 ECD의 과다-발현이 시험관내 히포 경로의 성분 (Lats1 및 YAP)에 영향을 미칠 수 있었음을 입증하고, IgCAM-결합제를 사용하여 히포 경로를 조절할 수 있음을 시사한다.
실시예 8
YAP 핵 전위의 결정을 위한 이분자 형광 상보성 검정
YAP 국재화는 히포 경로의 활성에 대한 판독값으로서의 역할을 할 수 있다. 인간 YAP1, TEAD2 및 TEAD3을 포함하는 이분자 형광 상보성 (BiFC) 구축물을 생성하였다 (도 9a). 구체적으로, 황색 형광 단백질 (YFP, 아미노산 156-239)의 C-말단을 링커 서열 (RPACKIPNDLKQKVMNH, 서열 72)에 의해 YAP1의 C-말단에 융합시켜 pcDNA3.1(+) 벡터 내 구축물 YAP1-YFPC를 생성하였다. YFP (아미노산 1-155)의 N-말단을 링커 서열 (RPACKIPNDLKQKVMNH, 서열 72)에 의해 TEAD2 또는 TEAD3의 N-말단에 융합시켜 pcDNA3.1/히그로 벡터 내 구축물 YFPN-TEAD2 및 YFPN-TEAD3을 생성하였다. YAP1-YFPC 구축물 및 YFPN-TEAD2, 또는 YAP1-YFPC 구축물 및 YFPN-TEAD3을 HeLa 세포에 안정하게 형질감염시키고, G-418 및 히그로마이신 B를 사용하여 이중 형질감염체를 선택하였다. YAP의 활성화는 YAP-YFPC 단백질의 우세한 핵 국재화로 이어져 YFPN-TEAD 단백질과의 상호작용을 가능하게 하고, YFP 형광을 일으켜야 한다. 안정한 클론으로부터의 트립신처리된 세포를 저밀도로 다시 플레이팅하고 (YAP가 활성화됨), 광시야 에피형광 현미경검사에 의해 YFP 형광을 평가하였다 (도 9b). 추가의 세포주를 생성시키고, YAP1-YFPC 구축물을 HeLa 세포에 안정하게 형질감염시키고, G-418을 사용하여 형질감염체를 선택하였다. YFPN-TEAD2 또는 YFPN-TEAD3을 발현하는 렌티바이러스를 HeLa YAP1-YFPC 세포주에 형질도입할 수 있다.
문헌 [Vassilev et al., 2001, Genes and Development, 15:1229-1241 및 Li et al., 2010, Genes and Development, 24:235-240]으로부터의 검정에 기반하여, YAP1 및 TEAD2의 동족 결합 도메인으로 구성된 말단절단 구축물을 사용하는 BiFC 검정의 변형을 개발하였다. 특히, 인간 YAP1의 아미노산 47-154 및 50-171을 그의 C-말단에서 YFPC (aa 156-239)에 융합시켜 각각 YAP1(47-154)-YFPC 및 YAP1(50-171)-YFPC를 생성하였다. 또한, 인간 TEAD2의 아미노산 115-447 및 221-447을 그의 N-말단에서 YFPN (aa 1-115)에 융합시켜 (핵 국재화 서열이 YFPN 도메인에 선행됨) NLS-YFPN-TEAD2(115-447) 및 NLS-YFPN-TEAD2(221-447)를 생성하였다 (도 9a). 상기 기재된 바와 같이, 이러한 구축물을 렌티바이러스 감염에 의해 HeLa 세포 또는 MCF10A 세포에 안정하게 형질감염시키거나 또는 안정하게 형질도입하였고, 생성된 세포주를 BiFC 검정에 사용하여 광시야 에피형광 현미경검사 또는 유동 세포측정법에 의해 YAP1 국재화를 관찰하였다. YAP1 국재화를 사용하여 히포 경로 신호전달 상태를 결정하였다.
YAP1(50-171)-YFPC 및 NLS-YFPN-TEAD2(221-447)의 발현을 형질도입하기 위해 렌티바이러스로 감염시킨 HeLa 세포를 FACS에 의해 YFP-양성 (BiFC-양성) 세포에 대해 분류하고, 후속적으로 광시야 현미경검사에 의해 영상화하였다 (도 9b 및 9c).
이들 세포주를 사용하여, YAP 활성화/불활성화 및 잠재적으로 히포 경로에 영향을 미치는 분자 (예를 들어, 항체, 단백질 또는 소분자)를 스크리닝 및 확인하였다.
실시예 9
YAP 핵 전위의 결정을 위한 검정
개별 세포에서의 YAP 국재화는 또한 YAP-GFP 융합 단백질을 사용하여 평가할 수 있다. GFP는 YAP의 직접적인 모니터링을 허용하는데, 이는 YAP의 활성화는 YAP-GFP의 우세한 핵 전위로 이어져야 하기 때문이다. YAP-GFP 구축물을 pLenti6.3/TO/V5-DEST 벡터 (인비트로젠/라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 내로 클로닝하여 pLenti6.3-TO-YAPGFP-DEST (pOM1017)를 생성하였다. 이 벡터는 YAP-GFP 융합 단백질의 테트라시클린 (Tet)-조절된 발현을 허용한다. HeLa 세포를 CMV 프로모터의 제어 하에 높은 수준의 Tet 리프레서를 구성적으로 발현하는 pLenti3.3/TR 리프레서 플라스미드 (인비트로젠/라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로 형질감염시켰다. G418 500μg/ml를 사용하여, 안정하게 형질감염된 세포를 선택하였다. Tet-유도성 YAP-GFP 구축물 pOM1017을 형질감염된 HeLa 세포에 일시적으로 형질감염시키고, 세포를 테트라시클린으로 처리함으로써 클론을 스크리닝하였다. 몇몇 클론은 1μg/ml 테트라시클린의 존재 하에서만 YAP-GFP 발현을 나타내는 것으로 확인되었다. 클론 중 하나인 HeLaB5를 YAP-GFP 구축물 pOM1017로 안정하게 형질감염시켰다. 500μg/ml G418 및 블라스티시딘 4μg/ml를 사용하여 이중 형질감염체를 선택하였다. 클론을 FACS에 의해 테트라시클린의 존재 및 부재 하의 GFP의 발현에 대해 분석하였다. 1μg/ml 테트라시클린의 첨가 시에 GFP-YAP 발현의 엄격한 조절을 나타내는 하나의 클론 NC12를 획득하였다 (도 10a). Tet 유도 시의 YAP-GFP의 발현을 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인하였다 (도 10b). NC12 세포주는 살아있는 세포의 실시간 영상화를 허용하는 BD 경로 시스템 상에서 실행하는 검정에 사용할 수 있다. 본 검정을 사용하여, YAP 활성화/불활성화 및 잠재적으로 히포 경로에 영향을 미치는 분자 (예를 들어, 항체, 단백질 또는 소분자)를 스크리닝 및 확인할 수 있다.
실시예 10
YAP 핵 전위를 결정하기 위한 검정
개별 세포에서의 YAP 국재화는 Cre-의존성 에메랄드 녹색 형광 단백질 (EmGFP) 발현 구축물 (도 11)과 공발현되는 YAP-Cre 융합 단백질을 사용하여 평가할 수 있다. 구체적으로, 형광 단백질 DsRed의 단량체 형태 mCherry를 loxP 부위 5'에 의해 EmGFP에 플랭킹하여 벡터 pcDNA3.1(+) (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 내 플록스 mCherry/EmGFP 구축물을 생성하였다. YAP를 벡터 pLenti6.3/TO/V5-DEST (라이프 테크놀로지스, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 내 Tet 오퍼레이터의 제어 하에 Cre의 코딩 영역에 N- 또는 C-말단으로 융합시켜 각각 구축물 Cre-YAP 또는 YAP-Cre를 생성하였다. mCherry/EmGFP 구축물 및 Cre-YAP 또는 mCherry/EmGFP 구축물 및 YAP-Cre를 HeLa 세포 내로 안정하게 형질감염시키고, G-418 및 블라스티시딘을 사용하여 이중 형질감염체를 선택하였다. 불활성 세포질 YAP-Cre 또는 Cre-YAP로부터 발생하는 mCherry 형광, 또는 활성 핵 YAP-Cre 또는 Cre-YAP로부터 발생하는 EmGFP 형광을 광시야 에피형광 현미경검사 또는 유동 세포측정법에 의해 검정하였다. 이들 세포주를 사용하여, YAP 활성화/불활성화 및 히포 경로의 활성에 영향을 미치는 분자 (예를 들어, 항체, 단백질 또는 소분자)를 스크리닝 및 확인하였다.
실시예 11
결장 종양 OMP-C18에서의 막-고정된 IgCAM 디코이 수용체의 과다-발현에 의한 종양 성장에 대한 효과
해리된 결장 OMP-C18 세포 (1 x 106개 세포/웰)를 6-웰 프리마리아™ 플레이트 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)에 시딩하고, 막-고정된 디코이 수용체 CADM2-CD4TM-GFP, CADM4-CD4TM-GFP, CD226-CD4TM-GFP, PVR-CD4TM-GFP를 발현하거나 또는 대조군으로서 GFP만을 발현하는 RRL-기반 렌티바이러스를 형질도입하였다. RRL-기반 렌티바이러스는 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP 유전자를 발현한다. 또한, 제2 대조군은 형질도입되지 않은 세포의 군이었다. 렌티바이러스를 플레이팅 시점 (t = 0)에 OMP-C18 세포의 20% 내지 60% 감염을 유발하는 MOI로 세포에 첨가하였다. 배양 배지는 DMEM 저 글루코스, F12 배지, B27 배지, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물, 헤파린, rhEGF, rhFGF-2 및 항생제였다. 72시간 후에, 세포를 수집하고, 트립신처리하고, 세척하고, 2% FBS 및 DAPI (몰레큘라 프로브스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 함유하는 HBSS 중에 재현탁시켰다. 형질도입된 결장 OMP-C18 세포 (GFP+/DAPI-)를 FACSAria 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)를 사용하는 유동 세포측정법에 의해 분류하였다. 세포 집단 순도를 분류된 세포의 분획의 재분석에 의해 확인하였다. 분류된 세포를 50% 매트리겔™ (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)과 혼합하였다. 대조 렌티바이러스-형질도입된 GFP+/DAPI- 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (300개 세포/마우스, n = 10). IgCAM 디코이 수용체 렌티바이러스-형질도입된 GFP+/DAPI- 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (300개 세포/마우스, n = 10). 비-형질도입된 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (300개 세포/마우스, n = 5). 종양 성장을 매주 모니터링하고, 가장 빠르게 성장하는 종양이 ~1500mm3에 도달하였을 때 실험을 종결하였다.
도 12a에 나타낸 바와 같이, 제45일에 OMP-C18 종양에서의 CADM4 및 CD226 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 종양 성장을 증가시키는 것으로 나타났다. CADM2 디코이 수용체의 과다-발현 또한 대조군과 비교하여 종양 성장을 증가시키는 것으로 나타났지만, CADM4 및 CD226보다 덜 명백한 수준으로 증가시켰다.
OMP-C18 결장 종양, 및 막-고정된 디코이 수용체 CADM3-CD4TM-GFP, TMEM25-CD4TM-GFP, JAM3-CD4TM-GFP 및 TIGIT-CD4TM-GFP (도 12b 및 12c), JAM2-CD4TM-GFP, JAM2FL-GFP, PVRL1-CD4TM-GFP 및 ESAM-CD4TM-GFP (도 12d), VSIG1-CD4TM-GFP, VSIG4-CD4TM-GFP, PVRL4-CD4TM-GFP 및 CD200-FL-GFP (도 12e), PVRL3-CD4TM-GFP, JAM1-CD4TM-GFP, CADM1-CD4TM-GFP 및 VSIG2-CD4TM-GFP (도 12f), 및 CLMP-CD4TM-GFP, VSIG8-CD4TM-GFP, TMIGD1-CD4TM-GFP 및 VSIG3-CD4TM-GFP (도 12g)를 발현하는 RRL-기반 렌티바이러스를 사용하여 유사한 연구를 수행하였다.
도 12b에 나타낸 바와 같이, 제34일에 CADM3 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-C18 종양 세포의 성장을 유의하게 억제하였다. 또한, JAM3 및 TIGIT도 종양 성장을 어느 정도로 억제하는 것으로 나타났다. 제48일에, 대조군과 비교한 CADM3에 의한 종양 성장의 억제는 제34일에서보다 훨씬 더 컸다 (도 12c). 또한, 제48일에 TEMEM25, JAM3 및 TIGIT 디코이 수용체의 과다-발현도 대조군과 비교하여 종양 성장을 유의하게 억제하였지만, CADM3에 의해 관찰된 정도로는 아니었다. 제49일에, VSIG4, PVRL4 및 CD200 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-018 종양 세포의 성장을 유의하게 억제하였다 (도 12e). 제49일에, VSIG8 및 TIMIGD1의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-018 종양 세포의 성장을 유의하게 억제하였다 (도 12g).
실시예 12
폐 종양 OMP-LU2 및 OMP-LU40에서의 막-고정된 IgCAM 디코이 수용체의 과다-발현에 의한 종양 성장에 대한 효과
해리된 결장 OMP-LU2 세포 (1 x 106개 세포/웰)를 6-웰 프리마리아™ 플레이트 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)에 시딩하고, 막-고정된 디코이 수용체 CADM2-CD4TM-GFP, CADM4-CD4TM-GFP, PVRL4-CD4TM-GFP, VSIG4-CD4TM-GFP, CADM1-CD4TM-GFP, CD226-CD4TM-GFP, JAM3-CD4TM-GFP, JAM2-CD4TM-GFP, JAM2FL-GFP, CADM4-CD4TM-GFP, TIGIT-CD4TM-GFP, PVRL1-CD4TM-GFP, PVRL3-CD4TM-GFP를 발현하거나, 양성 대조군으로 dnYAP를 발현하거나 또는 음성 대조군으로 GFP만을 발현하는 RRL-기반 렌티바이러스를 형질도입하였다. RRL-기반 렌티바이러스는 CMV 프로모터의 제어 하에 GFP 유전자를 발현한다. 또한, 제2 대조군은 형질도입되지 않은 세포의 군이었다. 렌티바이러스를 플레이팅 시점 (t = 0)에 OMP-LU2 세포의 20% 내지 60% 감염을 유발하는 MOI로 세포에 첨가하였다. 배양 배지는 DMEM 저 글루코스, F12 배지, B27 배지, 인슐린-트랜스페린-셀레늄 보충물, 헤파린, rhEGF, rhFGF-2 및 항생제였다. 72시간 후에, 세포를 수집하고, 트립신처리하고, 세척하고, 2% FBS 및 DAPI (몰레큘라 프로브스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)를 함유하는 HBSS 중에 재현탁시켰다. 형질도입된 폐 OMP-LU2 세포 (GFP+/DAPI-)를 FACSAria 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)를 사용하는 유동 세포측정법에 의해 분류하였다. 세포 집단 순도를 분류된 세포의 분획의 재분석에 의해 확인하였다. 분류된 세포를 50% 매트리겔™ (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세)과 혼합하였다. 대조 렌티바이러스-형질도입된 GFP+/DAPI- 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (300개 세포/마우스, n = 10). IgCAM 디코이 수용체 렌티바이러스-형질도입된 GFP+/DAPI- 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (300개 세포/마우스, n = 10). 비-형질도입된 세포를 NOD/SCID 마우스의 측복부에 피하 주사하였다 (300개 세포/마우스, n = 5). 종양 성장을 매주 모니터링하고, 가장 빠르게 성장하는 종양이 ~1500mm3에 도달하였을 때 실험을 종결하였다.
제108일에, CADM3 및 VSIG4 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-LU2 폐 종양 세포의 성장을 유의하게 억제하였다 (도 13b). 제71일에, JAM3 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-LU2 폐 종양 세포의 성장을 유의하게 억제하였다 (도 13c). 또한, 제70 또는 71일에, JAM2, CADM4 및 PVRL1 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-LU2 종양 세포의 성장을 억제하였다 (도 13c 및 13d).
OMP-LU40 폐 종양, 및 막-고정된 디코이 수용체 CADM1-CD4TM-GFP, CADM2-CD4TM-GFP, CADM3-CD4TM-GFP, CADM4-CD4TM-GFP, CD226-CD4TM-GFP 및 PVR-CD4TM-GFP (도 14a), PVRL4-CD4TM-GFP, VSIG4-CD4TM-GFP 및 CD226FL-GFP (도 14b), PVRL3-CD4TM-GFP, ESAM-CD4TM-GFP 및 VSIG2-CD4TM-GFP (도 14c)를 발현하는 RRL-기반 렌티바이러스를 사용하여 유사한 연구를 수행하였다.
제118일에, CADM2 및 CADM3 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-LU40 폐 종양 세포의 성장을 유의하게 억제하였다 (도 13a). 제120일에, PVRL4 디코이 수용체의 과다-발현은 대조군과 비교하여 OMP-LU2 폐 종양 세포의 성장을 유의하게 억제하였다 (도 13b).
실시예 11 및 12에 기재된 연구에서의 디코이 수용체에 의한 억제를 표 4에 요약하였다. 수치는 대조 종양과 비교한, 종양 크기에서의 배수 변화 감소를 나타낸다.
<표 4>
Figure pct00005
막-고정된 디코이로서 사용한 14종의 IgCAM은 결장 및/또는 폐 종양에서 종양 성장을 감소시켰으며, 억제는 1.5 내지 56배 범위였다. 14종의 IgCAM 중에서, CADM3, JAM3 및 PVRL4가 가장 큰 효과를 나타내었다.
실시예 13
단백질체학 연구
IgCAM의 신호전달 경로(들) 하류를 조사하기 위해, 단백질체학 접근법을 채택하여 종양 성장 및/또는 히포 경로에 관여하는 후보 IgCAM 세트를 함유하는 단백질 복합체를 확인하였다. FLAG-태그부착된 전장 IgCAM인 CADM1, CADM3, CD200, JAM2, PVR, PVRL1 및 PVRL3으로 독립적으로 HEK-293T 세포를 일시적으로 형질감염시켰다. FLAG-태그부착된 YFP (황색 형광 단백질)를 대조군으로서 사용하였다. 형질감염 후 4일째에, 수확한 세포 펠릿으로부터 생성된 용해물을 원심분리에 의해 정화하고, 마우스 IgG-아가로스 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이트)로 사전-청정화한 다음, 항-FLAG 아가로스 (시그마-알드리치)와 함께 인큐베이션하였다. 항-FLAG 면역침전물을 (2x) 비-환원성 트리스-글리신 SDS 샘플 완충제 (라이프 테크놀로지스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로 용리하였다. 용출액을 질량 분광측정법을 위한 엠에스바이오웍스(MSBioworks) (미국 미시간, IP-웍스 서비스(IP-Works service))에 적용하여, 형질감염된 "미끼" IgCAM과 함께 공동-면역침전된 단백질을 확인하였다.
형질감염된 "미끼" IgCAM과 공동-면역침전된 단백질을 먼저 내인성 IgCAM과의 이형 상호작용에 대해 분석하였다. 예를 들어, 내인성 JAM3은 JAM2와 공동-면역침전되고, 이는 FACS-결합 검정으로 관찰된 결과를 입증한다. FACS-결합 검정으로 질량 분광측정법에 의해 확인되지 않은 일부 상호작용을 검출하였지만 (즉, JAM2 및 CADM3 사이의 상호작용), 그 반대 또한 사실이다 (즉, PVR 및 CD200 사이의 상호작용).
그 다음, 1039개의 확인된 단백질의 목록에 그의 기능에 대해 주석을 달았는데; 관심 카테고리는 1) 세포골격/모터, 2) 전사, 3) 키나제/포스파타제/신호전달 캐스케이드, 4) 기타 효소적 활성, 5) 소형/이종삼량체 G 단백질, 6) 스캐폴딩/단백질 복합체, 및 7) 수용체/표면 단백질/부착/IgCAM-관련을 포함하였다. g:프로파일러 데이터베이스(g:Profiler database) (http://biit.cs.ut.ee/gprofiler)를 사용하여 상기 7개의 카테고리에서 확인된 125개 단백질의 선택된 목록 및 히포 경로의 단백질 성분 사이의 단백질-단백질 상호작용 네트워크를 분석하였다. 125개의 단백질을 또한 피어슨(Pearson) 상관관계에 의해 분석하여 동일한 단백질 세트와 복합체를 형성하는 "미끼" IgCAM의 군집을 확인하였다. 이들 2개의 분석에 기초하여, CADM1, CADM3, PVRL1 및 PVRL3은 막 및/또는 세포-세포 접합부에 국재화된 단백질 세트와 공동-면역침전되는 IgCAM으로서 확인되었다. 이들 단백질 중 히포 성분, 예컨대 안지오모틴 또는 메를린과 상호작용할 수 있는 일부는 DCAF7, DDB1, DLG1, INADL, LIN7C, MPDZ, MPP5, MPP7, PARD3 및 PRKCI를 포함한다.
이들 단백질 복합체를 검증하기 위해, FLAG-태그부착된 전장 CADM1, CADM3, PVR, PVRL1 및 PVRL3으로, 내부 음성 대조군으로서의 CADM3-CD4TM-GFP 및 LGR5-CD4TM-GFP 구축물로 일시적으로 형질감염시킨 HEK-293T 세포로부터 면역침전물 (상기 기재된 방법 참조)을 제조하였다. 간략하게, 형질감염 후 4일째에, 수확한 세포 펠릿으로부터 생성된 용해물을 원심분리에 의해 정화하고, 마우스 IgG-아가로스 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)로 사전-청정화한 다음, 항-FLAG 아가로스 (시그마-알드리치)와 함께 인큐베이션하였다. 항-FLAG 면역침전물을 (2x) 비-환원성 트리스-글리신 SDS 샘플 완충제 (라이프 테크놀로지스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로 용리하였다. 전체 세포 용해물 및 면역침전물 용출액을 4-12% 트리스-글리신 미디(Midi) 겔 (라이프 테크놀로지스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 상에서 전개시키고, 아이블롯(iBlot)에 의해 PVDF 막 (라이프 테크놀로지스/인비트로젠) 상에 옮겼다. 블롯을 하기 단백질에 대한 항체로 프로빙하였다: 아파딘/MLLT4 (#6492; 셀 시그널링 테크놀로지, 메사추세츠주 댄버스); DCAF7 (# ab138490; 압캠, 메사추세츠주 캠브리지); DLG1 (# ab134156); INADL (# ab151257; 압캠); LIN7 (압캠, ab127049; 압캠); LIN7C (# ab82646; 압캠); MPDZ (# ab101277; 압캠); MPP5 (# ab155132; 압캠); PARD3 (# ab64646; 압캠); YAP1 (# ab52771; 압캠); 포스포-YAP1 (# 4911; 셀 시그널링 테크놀로지), 및 대조군으로서의 튜불린 및 액틴. 웨스턴 블롯은 도 15a-15c에 나타내었고, IgCAM을 함유하는 양성으로 확인된 복합체는 표 5에 요약하였다.
<표 5>
Figure pct00006
특히 주목할 것은, YAP1이 CADM1, CADM3, PVRL1 및 PVRL3과 공동-면역침전된 것이며, 이는 IgCAM이 히포 경로에 관여한다는 가설을 지지한다.
HEK-293T 세포를 FLAG-태그부착된 전장 CADM1 및 c-myc-태그부착된 YAP로 일시적으로 형질감염시켜 추가의 실험을 수행하였다. 형질감염 후 4일째에, 수확한 세포 펠릿으로부터 생성된 용해물을 원심분리에 의해 정화하고, 항-c-myc 아가로스 (시그마-알드리치)와 함께 인큐베이션하였다. 항-c-myc 면역침전물을 (2x) 비-환원성 트리스-글리신 SDS 샘플 완충제 (라이프 테크놀로지스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드)로 용리하였다. 전체 세포 용해물 및 면역침전 용출액을 4-12% 트리스-글리신 미디 겔 (라이프 테크놀로지스/인비트로젠, 뉴욕주 그랜드 아일랜드) 상에서 전개시키고, 아이블롯에 의해 PVDF 막 (라이프 테크놀로지스/인비트로젠) 상에 옮겼다. 블롯을 항-myc 항체 또는 항-FLAG 항체로 프로빙하였다.
도 16에 나타낸 바와 같이, YAP1은 CADM1과 공동-면역침전되었다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 오직 예시적 목적만을 위한 것이고, 그에 관한 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제시될 것이며 이들을 본원의 취지 및 범위 내에 또한 포함되어야 하는 것으로 이해된다.
본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 및 등록 번호/데이터베이스 서열 (폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열 둘 다 포함)은, 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원, 인터넷 사이트, 또는 등록 번호/데이터베이스 서열이 참조로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 개시된 서열은 다음과 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
SEQUENCE LISTING <110> GURNEY, Austin L. CHARTIER-COURTAUD, Cecile <120> BINDING AGENTS THAT MODULATE THE HIPPO PATHWAY AND USES THEREOF <130> 2293.091PC03/PAC/KBK <140> PCT/US2013/044503 <141> 2013-06-06 <150> US 61/783,190 <151> 2013-03-14 <150> US 61/737,390 <151> 2012-12-14 <150> US 61/656,249 <151> 2012-06-06 <160> 79 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 394 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Phe Cys Pro Leu Lys Leu Ile Leu Leu Pro Val Leu Leu Asp Tyr 1 5 10 15 Ser Leu Gly Leu Asn Asp Leu Asn Val Ser Pro Pro Glu Leu Thr Val 20 25 30 His Val Gly Asp Ser Ala Leu Met Gly Cys Val Phe Gln Ser Thr Glu 35 40 45 Asp Lys Cys Ile Phe Lys Ile Asp Trp Thr Leu Ser Pro Gly Glu His 50 55 60 Ala Lys Asp Glu Tyr Val Leu Tyr Tyr Tyr Ser Asn Leu Ser Val Pro 65 70 75 80 Ile Gly Arg Phe Gln Asn Arg Val His Leu Met Gly Asp Ile Leu Cys 85 90 95 Asn Asp Gly Ser Leu Leu Leu Gln Asp Val Gln Glu Ala Asp Gln Gly 100 105 110 Thr Tyr Ile Cys Glu Ile Arg Leu Lys Gly Glu Ser Gln Val Phe Lys 115 120 125 Lys Ala Val Val Leu His Val Leu Pro Glu 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Leu Gly Ala Met Ala Ala Thr 115 120 125 Leu Val Val Ile Cys Thr Ala Val Ile Val Val Val Ala 130 135 140 <210> 64 <211> 206 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> TMEM25 - ECD without predicted signal sequence <400> 64 Glu Leu Glu Pro Gln Ile Asp Gly Gln Thr Trp Ala Glu Arg Ala Leu 1 5 10 15 Arg Glu Asn Glu Arg His Ala Phe Thr Cys Arg Val Ala Gly Gly Pro 20 25 30 Gly Thr Pro Arg Leu Ala Trp Tyr Leu Asp Gly Gln Leu Gln Glu Ala 35 40 45 Ser Thr Ser Arg Leu Leu Ser Val Gly Gly Glu Ala Phe Ser Gly Gly 50 55 60 Thr Ser Thr Phe Thr Val Thr Ala His Arg Ala Gln His Glu Leu Asn 65 70 75 80 Cys Ser Leu Gln Asp Pro Arg Ser Gly Arg Ser Ala Asn Ala Ser Val 85 90 95 Ile Leu Asn Val Gln Phe Lys Pro Glu Ile Ala Gln Val Gly Ala Lys 100 105 110 Tyr Gln Glu Ala Gln Gly Pro Gly Leu Leu Val Val Leu Phe Ala Leu 115 120 125 Val Arg Ala Asn Pro Pro Ala Asn Val Thr Trp Ile Asp Gln Asp Gly 130 135 140 Pro Val Thr Val Asn Thr Ser Asp Phe Leu Val Leu Asp Ala Gln Asn 145 150 155 160 Tyr Pro Trp Leu Thr Asn His Thr Val Gln Leu Gln Leu Arg Ser Leu 165 170 175 Ala His Asn Leu Ser Val Val Ala Thr Asn Asp Val Gly Val Thr Ser 180 185 190 Ala Ser Leu Pro Ala Pro Gly Leu Leu Ala Thr Arg Val Glu 195 200 205 <210> 65 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 20 25 30 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 35 40 45 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 50 55 60 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 65 70 75 80 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 85 90 95 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 100 105 110 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 115 120 125 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 130 135 140 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 145 150 155 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Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 67 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 68 <211> 321 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> dnYAP <400> 68 Met Asp Pro Gly Gln Gln Pro Pro Pro Gln Pro Ala Pro Gln Gly Gln 1 5 10 15 Gly Gln Pro Pro Ser Gln Pro Pro Gln Gly Gln Gly Pro Pro Ser Gly 20 25 30 Pro Gly Gln Pro Ala Pro Ala Ala Thr Gln Ala Ala Pro Gln Ala Pro 35 40 45 Pro Ala Gly His Gln Ile Val His Val Arg Gly Asp Ser Glu Thr Asp 50 55 60 Leu Glu Ala Leu Phe Asn Ala Val Met Asn Pro Lys Thr Ala Asn Val 65 70 75 80 Pro Gln Thr Val Pro Met Arg Leu Arg Lys Leu Pro Asp Ser Phe Phe 85 90 95 Lys Pro Pro Glu Pro Lys Ser His Ser Arg Gln Ala Ser Thr Asp Ala 100 105 110 Gly Thr Ala Gly Ala Leu Thr Pro Gln His Val Arg Ala His Ala Ser 115 120 125 Pro Ala Ser Leu Gln Leu Gly Ala Val Ser Pro Gly Thr Leu Thr Pro 130 135 140 Thr Gly Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Thr Pro Thr Ala Gln His Leu 145 150 155 160 Arg Gln Ser Ser Phe Glu Ile Pro Asp Asp Val Pro Leu Pro Ala Gly 165 170 175 Trp Glu Met Ala Lys Thr Ser Ser Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn His 180 185 190 Ile Asp Gln Thr Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Ala Met Leu Ser 195 200 205 Gln Met Asn Val Thr Ala Pro Thr Ser Pro Pro Val Gln Gln Asn Met 210 215 220 Met Asn Ser Ala Ser Gly Pro Leu Pro Asp Gly Trp Glu Gln Ala Met 225 230 235 240 Thr Gln Asp Gly Glu Ile Tyr Tyr Ile Asn His Lys Asn Lys Thr Thr 245 250 255 Ser Trp Leu Asp Pro Arg Leu Asp Pro Arg Phe Ala Met Asn Gln Arg 260 265 270 Ile Ser Gln Ser Ala Pro Val Lys Gln Pro Pro Pro Leu Ala Pro Gln 275 280 285 Ser Pro Gln Gly Gly Val Met Gly Gly Ser Asn Leu Asn Asp Met Glu 290 295 300 Ser Val Leu Ala Ala Thr Lys Leu Asp Lys Glu Ser Phe Leu Thr Trp 305 310 315 320 Leu <210> 69 <211> 239 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> YFP <400> 69 Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Phe Gly Tyr Gly Leu Gln Cys Phe Ala Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly 115 120 125 Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Tyr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 225 230 235 <210> 70 <211> 447 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Met Gly Glu Pro Arg Ala Gly Ala Ala Leu Asp Asp Gly Ser Gly Trp 1 5 10 15 Thr Gly Ser Glu Glu Gly Ser Glu Glu Gly Thr Gly Gly Ser Glu Gly 20 25 30 Ala Gly Gly Asp Gly Gly Pro Asp Ala Glu Gly Val Trp Ser Pro Asp 35 40 45 Ile Glu Gln Ser Phe Gln Glu Ala Leu Ala Ile Tyr Pro Pro Cys Gly 50 55 60 Arg Arg Lys Ile Ile Leu Ser Asp Glu Gly Lys Met Tyr Gly Arg Asn 65 70 75 80 Glu Leu Ile Ala Arg Tyr Ile Lys Leu Arg Thr Gly Lys Thr Arg Thr 85 90 95 Arg Lys Gln Val Ser Ser His Ile Gln Val Leu Ala Arg Arg Lys Ser 100 105 110 Arg Glu Ile Gln Ser Lys Leu Lys Asp Gln Val Ser Lys Asp Lys Ala 115 120 125 Phe Gln Thr Met Ala Thr Met Ser Ser Ala Gln Leu Ile Ser Ala Pro 130 135 140 Ser Leu Gln Ala Lys Leu Gly Pro Thr Gly Pro Gln Ala Ser Glu Leu 145 150 155 160 Phe Gln Phe Trp Ser Gly Gly Ser Gly Pro Pro Trp Asn Val Pro Asp 165 170 175 Val Lys Pro Phe Ser Gln Thr Pro Phe Thr Leu Ser Leu Thr Pro Pro 180 185 190 Ser Thr Asp Leu Pro Gly Tyr Glu Pro Pro Gln Ala Leu Ser Pro Leu 195 200 205 Pro Pro Pro Thr Pro Ser Pro Pro Ala Trp Gln Ala Arg Gly Leu Gly 210 215 220 Thr Ala Arg Leu Gln Leu Val Glu Phe Ser Ala Phe Val Glu Pro Pro 225 230 235 240 Asp Ala Val Asp Ser Tyr Gln Arg His Leu Phe Val His Ile Ser Gln 245 250 255 His Cys Pro Ser Pro Gly Ala Pro Pro Leu Glu Ser Val Asp Val Arg 260 265 270 Gln Ile Tyr Asp Lys Phe Pro Glu Lys Lys Gly Gly Leu Arg Glu Leu 275 280 285 Tyr Asp Arg Gly Pro Pro His Ala Phe Phe Leu Val Lys Phe Trp Ala 290 295 300 Asp Leu Asn Trp Gly Pro Ser Gly Glu Glu Ala Gly Ala Gly Gly Ser 305 310 315 320 Ile Ser Ser Gly Gly Phe Tyr Gly Val Ser Ser Gln Tyr Glu Ser Leu 325 330 335 Glu His Met Thr Leu Thr Cys Ser Ser Lys Val Cys Ser Phe Gly Lys 340 345 350 Gln Val Val Glu Lys Val Glu Thr Glu Arg Ala Gln Leu Glu Asp Gly 355 360 365 Arg Phe Val Tyr Arg Leu Leu Arg Ser Pro Met Cys Glu Tyr Leu Val 370 375 380 Asn Phe Leu His Lys Leu Arg Gln Leu Pro Glu Arg Tyr Met Met Asn 385 390 395 400 Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr Ile Leu Gln Val Val Thr Asn Arg Asp 405 410 415 Thr Gln Glu Leu Leu Leu Cys Thr Ala Tyr Val Phe Glu Val Ser Thr 420 425 430 Ser Glu Arg Gly Ala Gln His His Ile Tyr Arg Leu Val Arg Asp 435 440 445 <210> 71 <211> 435 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Met Ala Ser Asn Ser Trp Asn Ala Ser Ser Ser Pro Gly Glu Ala Arg 1 5 10 15 Glu Asp Gly Pro Glu Gly Leu Asp Lys Gly Leu Asp Asn Asp Ala Glu 20 25 30 Gly Val Trp Ser Pro Asp Ile Glu Gln Ser Phe Gln Glu Ala Leu Ala 35 40 45 Ile Tyr Pro Pro Cys Gly Arg Arg Lys Ile Ile Leu Ser Asp Glu Gly 50 55 60 Lys Met Tyr Gly Arg Asn Glu Leu Ile Ala Arg Tyr Ile Lys Leu Arg 65 70 75 80 Thr Gly Lys Thr Arg Thr Arg Lys Gln Val Ser Ser His Ile Gln Val 85 90 95 Leu Ala Arg Lys Lys Val Arg Glu Tyr Gln Val Gly Ile Lys Ala Met 100 105 110 Asn Leu Asp Gln Val Ser Lys Asp Lys Ala Leu Gln Ser Met Ala Ser 115 120 125 Met Ser Ser Ala Gln Ile Val Ser Ala Ser Val Leu Gln Asn Lys Phe 130 135 140 Ser Pro Pro Ser Pro Leu Pro Gln Ala Val Phe Ser Thr Ser Ser Arg 145 150 155 160 Phe Trp Ser Ser Pro Pro Leu Leu Gly Gln Gln Pro Gly Pro Ser Gln 165 170 175 Asp Ile Lys Pro Phe Ala Gln Pro Ala Tyr Pro Ile Gln Pro Pro Leu 180 185 190 Pro Pro Thr Leu Ser Ser Tyr Glu Pro Leu Ala Pro Leu Pro Ser Ala 195 200 205 Ala Ala Ser Val Pro Val Trp Gln Asp Arg Thr Ile Ala Ser Ser Arg 210 215 220 Leu Arg Leu Leu Glu Tyr Ser Ala Phe Met Glu Val Gln Arg Asp Pro 225 230 235 240 Asp Thr Tyr Ser Lys His Leu Phe Val His Ile Gly Gln Thr Asn Pro 245 250 255 Ala Phe Ser Asp Pro Pro Leu Glu Ala Val Asp Val Arg Gln Ile Tyr 260 265 270 Asp Lys Phe Pro Glu Lys Lys Gly Gly Leu Lys Glu Leu Tyr Glu Lys 275 280 285 Gly Pro Pro Asn Ala Phe Phe Leu Val Lys Phe Trp Ala Asp Leu Asn 290 295 300 Ser Thr Ile Gln Glu Gly Pro Gly Ala Phe Tyr Gly Val Ser Ser Gln 305 310 315 320 Tyr Ser Ser Ala Asp Ser Met Thr Ile Ser Val Ser Thr Lys Val Cys 325 330 335 Ser Phe Gly Lys Gln Val Val Glu Lys Val Glu Thr Glu Tyr Ala Arg 340 345 350 Leu Glu Asn Gly Arg Phe Val Tyr Arg Ile His Arg Ser Pro Met Cys 355 360 365 Glu Tyr Met Ile Asn Phe Ile His Lys Leu Lys His Leu Pro Glu Lys 370 375 380 Tyr Met Met Asn Ser Val Leu Glu Asn Phe Thr Ile Leu Gln Val Val 385 390 395 400 Thr Ser Arg Asp Ser Gln Glu Thr Leu Leu Val Ile Ala Phe Val Phe 405 410 415 Glu Val Ser Thr Ser Glu His Gly Ala Gln His His Val Tyr Lys Leu 420 425 430 Val Lys Asp 435 <210> 72 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 72 Arg Pro Ala Cys Lys Ile Pro Asn Asp Leu Lys Gln Lys Val Met Asn 1 5 10 15 His <210> 73 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> FLAG Tag <400> 73 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 74 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 74 Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr 1 5 <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 75 Leu Glu Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 76 Gly Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 77 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 77 Trp Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 78 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Linker <400> 78 Ala Arg Gly Arg Ala Gln Val Thr 1 5 <210> 79 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly 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Lys 275 280 285 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 290 295 300 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 305 310 315 320 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

Claims (28)

  1. 하나 이상의 이뮤노글로불린 슈퍼패밀리 세포 부착 분자 (IgCAM)의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하며, 여기서 IgCAM은 AMICA, CAR, CLMP, ESAM, GPA33, VSIG1, VSIG2, VSIG3, VSIG4, VSIG8, JAM1, JAM2, JAM3, CADM1, CADM2, CADM3, CADM4, CRTAM, TMIGD1, PVR, PVRL1, PVRL2, PVRL3, PVRL4, PVRIG, CD200, CD200R1, CD200R1L, CD226, CD96, TIGIT 및 TMEM25로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 작용제.
  2. 제1항에 있어서, 가용성 수용체인 작용제.
  3. 제2항에 있어서, 가용성 수용체가
    (a) IgCAM의 세포외 도메인 또는 그의 단편;
    (b) 서열 33-64로 이루어진 군으로부터 선택된 서열; 또는
    (c) 서열 33-64로 이루어진 군으로부터 선택된 서열의 단편
    을 포함하는 것인 작용제.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 가용성 수용체가 CADM1, CADM3, PVRL1, PVRL2 또는 PVRL3의 세포외 도메인, 또는 그의 일부를 포함하는 것인 작용제.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 가용성 수용체가 Fc 영역을 포함하는 것인 작용제.
  6. 제1항에 있어서, 항체인 작용제.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체, 재조합 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, 항원-결합 부위를 포함하는 항체 단편 또는 이중특이적 항체인 작용제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 히포(Hippo) 경로를 조절하고/거나;
    (b) 히포 경로 신호전달을 활성화하거나 또는 증가시키고/거나;
    (c) YAP 활성을 감소시키고/거나;
    (d) 인산화 YAP를 증가시키고/거나;
    (e) YAP-의존성 유전자의 발현을 감소시키고/거나;
    (f) CD44, CD47, CD133, TDGF1, EPHB2, CA12, LRP4, GPC4, CLDN2, CTGF, PAG1, SEMA4D, RHEB, MAGI1, ITPR3, CD168, NRP2, Gli2, Birc2, Birc5, FGF1, IL33, GRB2, IGFBP3 및 AREG로 이루어진 군으로부터 선택된 유전자 중 하나 이상의 발현을 감소시키는
    작용제.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 아폽토시스를 조절하고/거나;
    (b) 세포 증식을 조절하고/거나;
    (c) 상피 중간엽 전이 (EMT)를 조절하는
    작용제.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 종양 또는 종양 세포의 성장을 억제하는 작용제.
  11. 제10항에 있어서, 종양이 결장직장 종양, 결장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 뇌 종양, 위장 종양 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양인 작용제.
  12. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 작용제 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 작용제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  14. 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  15. (a) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 작용제를 생산하거나;
    (b) 제13항의 폴리뉴클레오티드를 포함하거나; 또는
    (c) 제13항의 벡터를 포함하는
    단리된 세포.
  16. 종양 성장을 억제하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 작용제의 용도.
  17. 제16항에 있어서, 종양이 결장직장 종양, 결장 종양, 췌장 종양, 폐 종양, 난소 종양, 간 종양, 유방 종양, 신장 종양, 전립선 종양, 흑색종, 자궁경부 종양, 방광 종양, 뇌 종양, 위장 종양 및 두경부 종양으로 이루어진 군으로부터 선택된 종양인 용도.
  18. 암을 치료하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 작용제의 용도.
  19. 제18항에 있어서, 암이 결장직장암, 결장암, 췌장암, 폐암, 난소암, 간암, 유방암, 신장암, 전립선암, 흑색종, 자궁경부암, 방광암, 뇌암, 위장암 및 두경부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
  20. 히포 경로를 조절하기 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 작용제의 용도.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 유효량의 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 용도.
  22. 제20항에 있어서, 추가의 치료제가 화학요법제, 항체, 혈관신생 억제제, 또는 면역 반응을 조절하는 분자인 용도.
  23. 하나 이상의 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 작용제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 히포 경로를 조절하는 방법.
  24. (a) 하나 이상의 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 시험 작용제와 세포를 접촉시키고,
    (b) 이분자 형광 상보성 (BiFC) 검정을 사용하여 YAP 및/또는 TAZ의 세포 국재화를 결정하는 것
    을 포함하는, 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하는 방법.
  25. (a) 하나 이상의 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고,
    (b) 세포의 제2 세트와 비교한 세포의 제1 세트에서의 인산화 YAP 및/또는 인산화 TAZ의 양을 결정하는 것
    을 포함하는, 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하는 방법.
  26. (a) 하나 이상의 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고,
    (b) 세포의 제2 세트와 비교한 세포의 제1 세트에서의 비-인산화 YAP 및/또는 비-인산화 TAZ의 양을 결정하는 것
    을 포함하는, 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하는 방법.
  27. (a) 하나 이상의 IgCAM의 세포외 도메인에 특이적으로 결합하는 시험 작용제와 세포의 제1 세트를 접촉시키고, 세포의 제2 세트는 접촉시키지 않고,
    (b) 세포의 제2 세트에서의 YAP-의존성 유전자 및/또는 TAZ-의존성 유전자의 발현과 비교한, 세포의 제1 세트에서의 하나 이상의 YAP-의존성 유전자 및/또는 하나 이상의 TAZ-의존성 유전자의 발현을 결정하는 것
    을 포함하는, 히포 경로를 조절하는 작용제에 대해 스크리닝하는 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항의 방법에 의해 확인된 작용제.
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