JP2016512533A - Ｍｅｔ結合剤およびその使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、ヒトMETを特異的に結合する結合剤、WNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する結合剤、ヒトMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合する二重特異性剤、ならびにがんのような疾患を処置するための剤を使用する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2013年3月14日付で出願された米国特許仮出願第61/783,552号; 2013年5月31日付で出願された米国特許仮出願第61/829,477号; および2013年11月1日付で出願された米国特許仮出願第61/898,851号の優先権の恩典を主張するものであり、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
発明の分野
本発明は広くは、MET、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分、またはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分の両方を結合する抗体、二重特異性剤および他の結合剤、特にMETおよび1種もしくは複数種のWNTタンパク質の両方を結合する二重特異性剤に関し、ならびにがんのような疾患の処置のための結合剤を使用する方法に関する。
発明の背景
がんは、先進諸国の主要な死因の1つであって、米国だけでも毎年100万人以上ががんと診察され、500,000人が死亡する。通算して、3人に1人よりも多くが一生のうちになんらかの形のがんを発病するであろうと推測される。200種を上回るさまざまな種類のがんが存在し、それらのうちの4つ、すなわち乳房、肺、結腸直腸、および前立腺のがんが全ての新患のほぼ半分を占める(Siegel et al., 2011, CA: A Cancer J. Clin,, 61:212-236 (非特許文献1))。
シグナル伝達経路は、通常、細胞外シグナルと核とをつなげて、細胞成長、分化、生存、および死を直接的または間接的に制御する遺伝子の発現を引き起こす。多種多様のがんにおいて、シグナル伝達経路が調節不全となっており、腫瘍の発生および/または進行につながっている可能性がある。ヒトの発がんに関与するシグナル伝達経路には、WNT経路、Ras-Raf-MEK-ERKまたはMAPK経路、PI3K-AKT経路、MET/HGF経路、CDKN2A/CDK4経路、Bcl-2/TP53経路、およびNOTCH経路が含まれるが、これらに限定されることはない。
MET/HGF (肝細胞成長因子)経路は、初期胚発生において重要な役割を果たすことが示されている。しかしながら、成人組織では、MET経路は創傷修復のようなプロセスを除き、その成長のシグナル伝達プログラムが厳重に制御されており、主として静止している。MET経路の調節不全は、細胞増殖、アポトーシスからの保護、血管新生、浸潤、および転移につながりうる。METは、タンパク質過剰発現、構成的活性化、リガンド依存性の活性化、遺伝子増幅、遺伝子変異、および/またはMET修飾(例えば、リン酸化)を含む種々の異なる機構によって調節不全とされうる。MET経路は、肺、結腸直腸、乳房、肝臓、胃、膵臓、および脳を含むがこれらに限定されない、多くの腫瘍型において調節不全とされることが示されている。
WNTシグナル伝達経路は、胚パターン形成、後胚組織の維持、および幹細胞生物学機能のいくつかの重要な調節因子の1つである。より具体的には、WNTシグナル伝達は、幹細胞集団による自己複製を含む、細胞極性の発生および細胞運命の決定において重要な役割を果たしている。WNT経路の無秩序な活性化は非常に多くのヒトがんと関連しており、その活性化は細胞の発生運命を変化させうるものと考えられている。WNT経路の活性化は、腫瘍細胞を未分化の状態に維持し、および/または無制御増殖を引き起こしうる。したがって、発がんは、正常な発生および組織修復を制御する恒常性維持機構に取って代わることで進行することができる(Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50 (非特許文献2); Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31 (非特許文献3)に概説されている)。
MET経路およびWNT経路は両方ともに、がん治療の潜在的な標的として特定された。がん処置のために改善された分子、特にヒトMETおよびWNT経路の1種または複数種のWNT構成成分(すなわち、WNTタンパク質)を特異的に結合する二重特異性剤を提供することは、本発明の目的の1つである。本発明の別の目的は、MET経路およびWNT経路を調節するために、ならびに腫瘍成長を阻害するためにこれらの新規の二重特異性剤を用いることである。
Siegel et al., 2011, CA: A Cancer J. Clin,, 61:212-236 Reya & Clevers, 2005, Nature, 434:843-50 Beachy et al., 2004, Nature, 432:324-31
本発明は、MET、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分、またはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分の両方を結合する抗体、可溶性受容体、または二重特異性剤のような、結合剤、ならびに該結合剤を含んだ、薬学的組成物のような、組成物を提供する。METを結合する結合剤、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する結合剤、またはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分の両方を結合する結合剤、ならびにそのような結合剤の薬学的組成物も提供される。ある種の態様において、結合剤は抗体、抗体断片、およびそのような抗体に関連した他のポリペプチドなどの、新規のポリペプチドである。ある種の態様において、結合剤は可溶性受容体およびそのような可溶性受容体に関連した他のポリペプチドなどの、新規のポリペプチドである。ある種の態様において、結合剤は、ヒトMETを特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、結合剤は、1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、結合剤は、1種または複数種のヒトFrizzled (FZD)タンパク質を特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、結合剤は、1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する可溶性FZD受容体である。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する二重特異性剤である。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤である。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質を特異的に結合する二重特異性分子である。本発明は、腫瘍を有する対象に結合剤を投与する段階により腫瘍の成長を阻害する方法をさらに提供する。本発明は、結合剤を、それを必要としている対象に投与する段階によりがんを処置する方法をさらに提供する。いくつかの態様において、がんを処置するまたは腫瘍成長を阻害する方法は、結合剤でがん幹細胞を標的化する段階を含む。ある種の態様において、本方法は、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減させる段階、腫瘍内のがん幹細胞の数を低減させる段階、腫瘍の腫瘍形成性を低減させる段階、および/または腫瘍内のがん幹細胞の数もしくは頻度を低減させることにより腫瘍の腫瘍形成性を低減させる段階を含む。
1つの局面において、本発明は、ヒトMETを特異的に結合する、抗体のような、結合剤を提供する。いくつかの態様において、結合剤はMETと肝細胞成長因子との結合を阻害する。いくつかの態様において、結合剤はMETの活性化を阻害する。ある種の態様において、結合剤(例えば、二重特異性剤)は、ヒトMETを結合することに加えてヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する。ある種の態様において、結合剤(例えば、二重特異性剤)は、ヒトMETを結合することに加えて1種または複数種のヒトFZDタンパク質を特異的に結合する。ある種の態様において、結合剤(例えば、二重特異性剤)は、ヒトMETを結合することに加えて1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する。
ある種の態様において、結合剤は、ヒトMETの細胞外ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのSemaドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのSemaドメイン内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのPSI (プレキシン-セマホリン-インテグリン)ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのIPT (免疫グロブリン様折畳み、プレキシン、転写因子)ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETの1つまたは複数のIPT反復ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのSemaドメイン、PSIドメイン、および/または1つもしくは複数のIPT反復ドメインを特異的に結合する。
いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号25〜932内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号25〜836内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号25〜515内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号50〜130内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号70〜110内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号97〜101を含むエピトープを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、SEQ ID NO:93の位置番号99の位置にグルタミンを含むエピトープを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号519〜562内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号563〜950内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号563〜836内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号563〜656内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号657〜740内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号741〜855内に特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号856〜950内に特異的に結合する。
いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETを特異的に結合する抗体である。いくつかの態様において、MET結合剤は、ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3; ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む抗体である。
ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7と少なくとも約80%の配列同一性を有する重鎖可変領域; および/またはSEQ ID NO:8と少なくとも約80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。ある種の態様において、結合剤は、SEQ ID NO:7と少なくとも約90%の配列同一性を有する重鎖可変領域; および/またはSEQ ID NO:8と少なくとも約90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、結合剤は、SEQ ID NO:7と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域; および/またはSEQ ID NO:8と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、結合剤は、SEQ ID NO:7の重鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:8の軽鎖可変領域を含む抗体である。
ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94と少なくとも約80%の配列同一性を有する重鎖可変領域; および/またはSEQ ID NO:95と少なくとも約80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む抗体である。ある種の態様において、結合剤は、SEQ ID NO:94と少なくとも約90%の配列同一性を有する重鎖可変領域; および/またはSEQ ID NO:95と少なくとも約90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、結合剤は、SEQ ID NO:94と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域; および/またはSEQ ID NO:95と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、結合剤は、SEQ ID NO:94の重鎖可変領域、および/またはSEQ ID NO:95の軽鎖可変領域を含む抗体である。ある種の態様において、結合剤は、SEQ ID NO:94の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95の軽鎖可変領域を含む抗体である。
いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、もしくはSEQ ID NO:112の重鎖; および/またはSEQ ID NO:11、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:98、もしくはSEQ ID NO:101の軽鎖を含む抗体である。
いくつかの態様において、結合剤は抗体73R009である。いくつかの態様において、結合剤は抗体73R009の変種である。いくつかの態様において、結合剤は73R009の一価バージョン(version)である。いくつかの態様において、結合剤は抗体73R009のヒト化バージョンである。いくつかの態様において、結合剤は、73R010ともいわれる、抗体73R009 H12L7である。いくつかの態様において、結合剤は、望ましくないジスルフィド結合の形成を低減するようにシステイン残基のセリン残基との置換を含む抗体73R010の変種である。抗体「73R010」への言及は、システイン置換を有する変種を含む。
別の局面において、本発明は、ヒトMETを特異的に結合する、二重特異性剤である結合剤を提供する。いくつかの態様において、二重特異性剤はヒトMETおよび第2の標的を特異的に結合する。いくつかの態様において、二重特異性剤はヒトMETおよびヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、二重特異性剤はヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質の両方を結合する。いくつかの態様において、二重特異性剤は二重特異性抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体はヒトMETおよびヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体はヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質の両方を結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体はヒトMETおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質の両方を結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体は2つの同一の軽鎖を含む。ある種の態様において、二重特異性抗体はIgG抗体である。ある種の態様において、二重特異性抗体はIgG1抗体である。ある種の態様において、二重特異性抗体はIgG2抗体である。
別の局面において、本発明は、第1の結合部位を含む第1の腕部および第2の結合部位を含む第2の腕部を含む二重特異性剤を提供する。いくつかの態様において、第1の結合部位は第1の抗体由来の第1の抗原結合部位を含み、第2の結合部位は第2の抗体由来の第2の抗体結合部位を含む。いくつかの態様において、第1の結合部位は抗体由来の抗原結合部位を含み、第2の結合部位は、抗体由来ではない結合部位を含む。いくつかの態様において、第1の腕部は一価抗体を含み、第2の腕部は可溶性受容体を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここで第1の結合部位が、ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3をさらに含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位を含み、ここで第1の結合部位が、(a) ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3、ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここでこの第1の結合部位が
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびXがRではない
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR3; ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、WASTRES (SEQ ID NO:85)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここで第1の結合部位が第1の抗体由来の第1の抗原結合部位を含み、第2の結合部位は第2の抗体由来の第2の抗原結合部位を含む。したがって、いくつかの態様において、二重特異性剤は二重特異性抗体である。いくつかの態様において、第2の結合部位は1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する。いくつかの態様において、1種または複数種のWNTタンパク質は、WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT10a、およびWNT10bからなる群より選択される。いくつかの態様において、第2の結合部位は1種または複数種のFrizzled (FZD)タンパク質を特異的に結合する。いくつかの態様において、1種または複数種のFZDタンパク質は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される。いくつかの態様において、1種または複数種のFZDタンパク質は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここで第2の結合部位が可溶性受容体を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、ヒトFZDタンパク質の細胞外ドメイン(ECD)を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、ヒトFZDタンパク質のECDの断片を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、ヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、FZD1のFriドメイン、FZD2のFriドメイン、FZD3のFriドメイン、FZD4のFriドメイン、FZD5のFriドメイン、FZD6のFriドメイン、FZD7のFriドメイン、FZD8のFriドメイン、FZD9のFriドメイン、またはFZD10のFriドメインを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体はヒトFZD8のFriドメインを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、およびSEQ ID NO:31からなる群より選択される配列を含むヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、およびSEQ ID NO:41からなる群より選択される配列を含むヒトFZDタンパク質の最小のコアFriドメインを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:39のヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む。いくつかの態様において、ヒトFZDタンパク質のFriドメインは、異種ポリペプチド(すなわち、非FZDポリペプチド)に直接連結される。いくつかの態様において、ヒトFZDタンパク質のFriドメインは、リンカーによって異種ポリペプチドにつながれる。いくつかの態様において、異種ポリペプチドはヒトFc領域を含む。いくつかの態様において、異種ポリペプチドはSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:91、またはSEQ ID NO:92を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、第1のポリペプチドが第2のポリペプチドに直接連結されている、(a) SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、またはSEQ ID NO:41の第1のポリペプチド; および(b) SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:91、またはSEQ ID NO:92の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、第1のポリペプチドがリンカーによって第2のポリペプチドにつながれている、(a) SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、またはSEQ ID NO:41の第1のポリペプチド; および(b) SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:91、またはSEQ ID NO:92の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:28を含んだ第1のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:28の第1のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:28の第1のポリペプチド、およびSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:29を含んだ第1のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:29の第1のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、可溶性受容体は、SEQ ID NO:29の第1のポリペプチド、および第2のポリペプチドSEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、またはSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体はSEQ ID NO:52またはSEQ ID NO:50を含む。いくつかの態様において、可溶性受容体はSEQ ID NO:52を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の腕部、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の腕部を含み、ここで第1の腕部がASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3、ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含み、かつここで第2の腕部がSEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:87を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここで第1の結合部位が、SEQ ID NO:7と少なくとも約90%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8と少なくとも約90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、第1の抗原結合部位は、SEQ ID NO:7と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、第1の抗原結合部位は、SEQ ID NO:7の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8の軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の腕部、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の腕部を含み、ここで第1の腕部が、SEQ ID NO:7と少なくとも約90%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8と少なくとも約90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、かつここで第2の腕部がSEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:87を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここで第1の結合部位が、SEQ ID NO:94と少なくとも約90%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95と少なくとも約90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、第1の抗原結合部位は、SEQ ID NO:94と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、第1の抗原結合部位は、SEQ ID NO:94の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95の軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の腕部、およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の腕部を含み、ここで第1の腕部が、SEQ ID NO:94と少なくとも約90%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95と少なくとも約90%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、かつここで第2の腕部がSEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:87を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、(a) 約0.1 nM〜約1.0 nMのKDでヒトMETを結合する第1の結合部位および(b) 約0.1 nM〜約20 nMのKDでヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含む。
上記の局面の各々のある種の態様、ならびに本明細書の他の箇所で記述される他の局面および/または態様において、結合剤は単離される。上記の局面の各々のある種の態様、ならびに本明細書の他の箇所で記述される他の局面および/または態様において、結合剤は実質的に純粋である。
別の局面において、本発明は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、およびSEQ ID NO:112からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドは単離される。ある種の態様において、ポリペプチドは実質的に純粋である。ある種の態様において、ポリペプチドは抗体または抗体の部分、例えば抗体断片である。いくつかの態様において、ポリペプチドは可溶性受容体または可溶性受容体の断片である。いくつかの態様において、ポリペプチドは融合タンパク質である。
本発明は、本明細書において記述される二重特異性剤、抗体、可溶性受容体、および/またはポリペプチドを含む細胞をさらに提供する。本発明は、本明細書において記述される二重特異性剤、抗体、可溶性受容体、および/またはポリペプチドを産生する細胞をさらに提供する。いくつかの態様において、細胞は原核細胞である。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。
別の局面において、本発明は、上記の局面、ならびに本明細書において記述される他の局面および/または態様の各々の結合剤および/またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド分子を提供する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、およびSEQ ID NO:112からなる群より選択される配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、およびSEQ ID NO:109からなる群より選択される配列を含む。
本発明は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、ならびに発現ベクターおよび/またはポリヌクレオチドを含む細胞をさらに提供する。いくつかの態様において、細胞は原核細胞である。いくつかの態様において、細胞は真核細胞である。
本明細書において記述される結合剤、二重特異性剤、抗体、可溶性受容体、および/またはポリペプチドならびに薬学的に許容される担体を含んだ薬学的組成物がさらに提供される。
別の局面において、本発明は、本明細書において記述される結合剤、二重特異性剤、抗体、可溶性受容体、および/またはポリペプチドを使用する方法を提供する。いくつかの態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、腫瘍を本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の有効量と接触させる段階を含む。いくつかの態様において、対象において腫瘍の成長を阻害する方法は、本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。いくつかの態様において、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減させることにより対象において腫瘍の腫瘍形成性を低減させる方法は、本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。いくつかの態様において、対象において腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減させる方法は、本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。いくつかの態様において、対象において腫瘍内の上皮間葉移行(EMT)を阻害する方法は、本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。いくつかの態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、結腸腫瘍、卵巣腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頚腫瘍、膀胱腫瘍、グリア芽細胞腫および頭頸部腫瘍からなる群より選択される。
いくつかの態様において、対象においてがんを処置する方法は、本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。本発明は同様に、本明細書において記述される剤または抗体である、がんを処置する方法で用いるための二重特異性剤または抗体を提供する。本発明は同様に、がんの処置用の医薬の製造のための本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の使用を提供する。いくつかの態様において、がんは、結腸直腸がん、結腸がん、卵巣がん、膵臓がん、肺がん、肝臓がん、乳房がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、黒色腫、子宮頚がん、膀胱がん、グリア芽細胞腫および頭頸部がんからなる群より選択される。いくつかの態様において、方法は、少なくとも1つのさらなる治療剤を投与する段階をさらに含む。
本発明は同様に、本明細書において記述される剤または抗体である、がんを処置する方法で用いるための二重特異性剤または抗体を提供する。本発明は同様に、がんの処置用の医薬の製造のための本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の使用を提供する。
薬学的組成物の一部である、本明細書において記述される結合剤、二重特異性剤、抗体、可溶性受容体、またはポリペプチドの有効量を対象(例えば、ヒト)に投与する段階を含む、処置の方法も提供される。
別の局面において、本発明は、本明細書において記述される結合剤、二重特異性剤、抗体、可溶性受容体、またはポリペプチドによる処置を目的にヒト対象を特定する方法またはヒト対象を選択する方法を提供する。いくつかの態様において、本方法は、対象が参照サンプルと比べてまたは所定のレベルと比べてMET発現レベルの上昇を有する腫瘍を有するかどうかを判定する段階を含む。いくつかの態様において、本方法は、腫瘍がMET発現レベルの上昇を有する場合、処置を目的に対象を特定する段階または処置を目的に対象を選択する段階を含む。
本発明の局面または態様がマーカッシュ群または代替物に関するその他の群分けにより記述されている場合、本発明は、記載されている群全体をまとめて包含するだけでなく、個別的に群の各要素も、主群のなかで可能なあらゆる下位群も包含し、群の要素の1つまたは複数を欠いた主群も包含する。本発明は、主張する発明における群の要素のいずれかの1つまたは複数の明示的な除外も想定する。
肝細胞成長因子とヒトMETとの結合の阻害。HGFのみで処理した細胞を陽性対照として用い、未処理のトランスフェクション細胞を陰性対照として用いた。 肝細胞成長因子とヒトMETとの結合の阻害。HEK-293T細胞にヒトMET構築体を一過性にトランスフェクションし、その後、これを抗MET抗体5D5および肝細胞成長因子(HGF)と混合した。各FACSプロット上の四角枠の重ね合わせ内部のシグナルの存在は、特異的な結合を示す。各FACSプロットの下に結合率を示す。各FACSプロットの下に2つの陽性対照の平均の結合率と比べた結合の阻害率を示す。 肝細胞成長因子とヒトMETとの結合の阻害。HEK-293T細胞にヒトMET構築体を一過性にトランスフェクションし、その後、これを抗MET抗体73R009の一価バージョンおよび肝細胞成長因子(HGF)と混合した。各FACSプロット上の四角枠の重ね合わせ内部のシグナルの存在は、特異的な結合を示す。各FACSプロットの下に結合率を示す。各FACSプロットの下に2つの陽性対照の平均の結合率と比べた結合の阻害率を示す。 肝細胞成長因子とヒトMETとの結合の阻害。HEK-293T細胞にヒトMET構築体を一過性にトランスフェクションし、その後、これを抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06および肝細胞成長因子(HGF)と混合した。各FACSプロット上の四角枠の重ね合わせ内部のシグナルの存在は、特異的な結合を示す。各FACSプロットの下に結合率を示す。各FACSプロットの下に2つの陽性対照の平均の結合率と比べた結合の阻害率を示す。 肝細胞成長因子により誘導されたMET活性の阻害。A549細胞を抗MET抗体73R009の一価バージョン、抗MET/FZD8二重特異性剤5D5/FZD8-Fc、または抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06で1時間、前処理し、その後、ヒト肝細胞成長因子で刺激した。細胞溶解物をウエスタンブロッティングによって分析した。 WNTシグナル伝達の阻害。8xTCFルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いて、STF-293細胞におけるWNTシグナル伝達を測定した。STF-293細胞を抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06 (-◆-)または対照結合剤の一価抗MET抗体5D5/FLAG (-X-)および一価FZD8-Fc/FLAG (-▲-)で処理した。細胞を、WNT3a L細胞馴化培地を含有する培地(-ж-)、またはWNT3aを過剰発現していない細胞由来の対照培地(-●-)に曝露した。 OMP-LU45肺腫瘍成長の阻害。LU45肺腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。マウスを対照抗体(-●-)、一価抗MET抗体5D5 (-□-)、一価FZD8-Fc FLAG (-▲-)、二価FZD8-Fc (54F28) (-◆-)、または抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤(-▼-)で処置した。処置後の日数にわたる腫瘍容積(mm3)としてデータを示す。 OMP-LU45肺腫瘍成長の阻害。LU45肺腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。マウスをタキソールと組み合わせて、対照抗体(-●-)、一価抗MET抗体5D5 (-□-)、一価FZD8-Fc FLAG (-▲-)、二価FZD8-Fc (54F28) (-◆-)、または抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤(-▼-)で処置した。処置後の日数にわたる腫瘍容積(mm3)としてデータを示す。 315B07のエピトープ・マッピング。HEK-293T細胞にsema構築体を一過性にトランスフェクションし、その後、これを抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B07または抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤5D5/FZD8-Fcと混合した。特異的な結合をFACS分析によって判定した。 抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B07の予測されるエピトープおよび抗MET抗体5D5の予測されるエピトープを示すMETのリボン構造。 MMTV-Wnt1乳房腫瘍成長の阻害。MMTV-Wnt1腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。マウスを対照抗体(-■-)、二価FZD8-Fc (54F28) (-▼-)、30 mg/kgの抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B07 (-○-)、または60 mg/kgの抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B07 (-Δ-)で処置した。処置後の日数にわたる腫瘍容積(mm3)としてデータを示す。 KP4膵臓腫瘍成長の阻害。KP4膵臓腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。マウスを対照抗体(-■-)、抗FZD抗体18R5 (-▼-)、一価FZD8-Fc/FLAG (-Δ-)、一価抗MET抗体5D5/FLAG (-●-)、または抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤(-○-)で処置した。処置後の日数にわたる腫瘍容積(mm3)としてデータを示す。 OMP-LIV1肝細胞がんの腫瘍成長の阻害。OMP-LIV1肝細胞がん(HCC)腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。マウスをソラフェニブ(-■-)、ソラフェニブと組み合わせて一価抗MET/FLAG (-▼-)、ソラフェニブと組み合わせて一価FZD8-Fc/FLAG (-●-)、またはソラフェニブと組み合わせて抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B07 (-Δ-)で処置した。処置後の日数にわたる腫瘍容積(mm3)としてデータを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、METを結合する新規の結合剤、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する新規の結合剤、またはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分の両方を結合する新規の結合剤を提供する。本明細書において用いられる「WNT経路の構成成分」という語句は一般に、1種もしくは複数種のWNTタンパク質および/または1種もしくは複数種のFZDタンパク質をいう。関連したポリペプチドおよびポリヌクレオチド、該結合剤を含む組成物、ならびに該結合剤を作出する方法も提供される。腫瘍成長を阻害する方法、がんを処置する方法、腫瘍の腫瘍形成性を低減する方法、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減する方法、EMTを阻害する方法、血管新生を阻害する方法、ならびに/または処置の対象を特定および/または選択する方法のような、新規の結合剤を使用する方法がさらに提供される。
ヒトMETを特異的に結合するモノクローナル抗体、抗体73R009が特定された。抗体73R009のヒト化バージョン、抗体73R010が作出された。抗体73R009は、約1.1 nMの、ヒトMETに対する結合親和性を有し、かつマウスMETを結合しない。該抗体の一価バージョンが作出され、1.4 nMの、ヒトMETに対する結合親和性を有する。ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤315B06、315B07、および315B09が産生された。二重特異性剤315B06は、1.8 nMの、ヒトMETに対する結合親和性を有し、かつマウスMETを結合しない。二重特異性剤315B07は、約125 pMの、ヒトMETに対する結合親和性を有し、かつマウスMETを結合しない。二重特異性剤315B06は、ヒト肝細胞成長因子(HGF)とヒトMETとの結合を阻害する(実施例2、図1)。二重特異性剤315B06は、HGF誘導性のMET活性を阻害する(実施例3、図2)。二重特異性剤315B06は、WNT経路シグナル伝達を阻害する(実施例4、図3)。二重特異性剤315B07に対するヒトMET上のエピトープが決定され、一価抗MET抗体5D5のエピトープとは異なることが示された(実施例7、図5および6)。抗MET抗体およびFZD8-Fcを含んだ二重特異性剤は、タキソールと併用した場合にヒト肺腫瘍の成長を阻害した(実施例5、図4)。抗MET抗体およびFZD8-Fcを含んだ二重特異性剤は、乳房腫瘍の成長を阻害し(実施例8、図7)、ヒト膵臓腫瘍の成長を阻害し(実施例9、図8)、およびヒト肝臓腫瘍の成長を阻害した(実施例10、図9)。
I. 定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
本明細書において用いられる「抗体」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、糖質、ポリヌクレオチド、脂質または前記の組み合わせのような標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原結合部位によって認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子をいう。本明細書において用いられる場合、この用語は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体断片(Fab、Fab'、F(ab')2およびFv断片のような)、一本鎖Fv (scFv)抗体、二重特異性抗体のような多重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、および抗原結合部位を含む改変されたその他任意の免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γおよびμといわれる重鎖定常ドメインの同一性に基づき、5つの主要なクラスの免疫グロブリン：IgA、IgD、IgE、IgGおよびIgM、またはそのサブクラス(アイソタイプ) (例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)のいずれかでありうる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。抗体はありのままでも、または毒素および放射性同位体を含むが、これらに限定されない、他の分子に結合されていてもよい。
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部をいい、無傷の抗体の抗原決定可変領域をいう。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されることはない。本明細書において用いられる「抗体断片」は、少なくとも1つの抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。
抗体の「可変領域」という用語は、単独または組み合わせのいずれかの、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域をいう。重鎖または軽鎖の可変領域は通常、「超可変領域」としても知られる、3つの相補性決定領域(CDR)によって連結された、4つのフレームワーク領域(FR)からなる。各鎖中のCDRは、フレームワーク領域によって近接してともに保持され、そして他の鎖由来のCDRとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRを決定するには少なくとも2つの技術がある: (1) 種間配列変動に基づくアプローチ(すなわち、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda, MD)、および(2) 抗原-抗体複合体の結晶学的研究に基づくアプローチ(Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948)。さらに、CDRを決定するために当技術分野においてこれらの2つのアプローチの組み合わせが用いられることもある。
本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」という用語は、1つの抗原決定基またはエピトープの極めて特異的な認識および結合に関わる、均質な抗体集団をいう。これは、種々の異なる抗原決定基に対して作製された異なる抗体の混合物を典型的に含むポリクローナル抗体と対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷のかつ全長のモノクローナル抗体と抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、一本鎖(scFv)抗体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原結合部位を含む改変されたその他任意の免疫グロブリン分子の両方を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ産生、ファージ選択、組み換え発現、およびトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない、任意のいくつかの技法によって作出されたそのような抗体をいう。
本明細書において用いられる「ヒト化抗体」という用語は、最小限の非ヒト配列を含む特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはその断片である非ヒト(例えば、マウス)抗体の形態をいう。典型的には、ヒト化抗体は、CDRの残基が、所望の特異性、親和性および/または結合能を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギまたはハムスター)のCDR由来の残基に置き換えられているヒト免疫グロブリンである(Jones et al., 1986, Nature, 321 :522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536)。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域の残基が、所望の特異性、親和性および/または結合能を有する非ヒト種由来の抗体において対応する残基と置き換えられる。ヒト化抗体を、Fvフレームワーク領域中のおよび/または置き換えられた非ヒト残基内のさらなる残基の置換によりさらに改変して、抗体の特異性、親和性および/または結合能を改良および最適化してもよい。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRの全てまたは実質的に全てを含有する少なくとも1つの、および典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む一方で、フレームワーク領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれ、の少なくとも一部分を含むこともできる。ヒト化抗体を作出するために用いられる方法は、当技術分野で周知である。
本明細書において用いられる「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、またはヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体をいう。ヒト抗体は、当技術分野において公知の技法のいずれかを用いて作出されうる。ヒト抗体のこの定義は、非ヒトCDRを含むヒト化抗体を明確に排除する。
本明細書において用いられる「キメラ抗体」という用語は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つまたはそれ以上の種に由来する抗体をいう。典型的には、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、所望の特異性、親和性および/または結合能を有する、1つの哺乳動物種(例えば、マウス、ラット、ウサギなど)に由来する抗体の可変領域に対応するが、定常領域は、別の種(通常はヒト)に由来する抗体中の配列に対応する。
本明細書において用いられる「親和性成熟抗体」という語句は、抗体の1つまたは複数のCDRにおける1つまたは複数の改変を有する抗体であって、それらの改変を保有していない親抗体と比べて、抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす該抗体をいう。この定義には、CDR残基に対する改変と併せて作出された非CDR残基における改変も含まれる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当技術分野において公知の手順によって産生される。例えば、Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783には、VHおよびVLドメインシャッフリングによる親和性成熟が記述されている。CDRおよび/またはフレームワーク残基のランダム変異導入法は、Barbas et al., 1994, PNAS, 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol, 154:3310-9; およびHawkins et al., 1992, J. Mol. Biol, 226:889-896によって記述されている。部位特異的突然変異誘発法を用いて、親和性成熟抗体を得てもよい。
「エピトープ」および「抗原決定基」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、特定の抗体により認識され特異的に結合されうる抗原のその部分をいう。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは連続的なアミノ酸からも形成され、タンパク質の三次元的折り畳みによって近接して並べられた非連続的なアミノ酸からも形成されうる。連続的なアミノ酸から形成されたエピトープ(直鎖状エピトープともいわれる)は、タンパク質が変性した場合にも典型的には維持されるが、三次元的折り畳みによって形成されたエピトープ(立体配座エピトープともいわれる)は、タンパク質が変性すると典型的には失われる。エピトープは、典型的には、独特の空間的配置の中に少なくとも3アミノ酸、より一般的には、少なくとも5アミノ酸または8〜10アミノ酸を含む。
「ヘテロ多量体分子」または「ヘテロ多量体」または「ヘテロ多量体複合体」または「ヘテロ多量体ポリペプチド」という用語は、第2のポリペプチドが少なくとも1つのアミノ酸残基だけ第1のポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる、少なくとも第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを含む分子をいうように本明細書において互換的に用いられる。ヘテロ多量体分子は、第1および第2のポリペプチドによって形成された「ヘテロ二量体」または「ヘテロ二量体剤」を含むことができ、またはさらなるポリペプチドが存在するさらに高次の三次構造を形成することができる。
本明細書において用いられる「アンタゴニスト」および「アンタゴニストの」という用語は、標的および/またはシグナル伝達経路(例えば、WNT経路またはMET経路)の生物学的活性を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、低減する、または無力化する任意の分子をいう。「アンタゴニスト」という用語は、タンパク質の活性を部分的にまたは完全に遮断する、阻害する、低減する、または無力化する任意の分子を含むように本明細書において用いられる。適当なアンタゴニスト分子は特に、アンタゴニスト抗体、抗体断片、可溶性受容体、または可溶性受容体の断片を含むが、これらに限定されることはない。
本明細書において用いられる「調節」および「調節する」という用語は、生物学的活性の変化または改変をいう。調節は、活性の刺激または阻害を含むが、これらに限定されることはない。調節は、活性の増加もしくは減少(例えば、経路シグナル伝達の減少)、結合特性の変化、またはタンパク質の活性、経路もしくは他の生物学的関心対象と関連した生物学的、機能的もしくは免疫学的特性の任意の他の変化でありうる。
「選択的に結合する」または「特異的に結合する」という用語は、結合剤または抗体が、関連のないまたは関連のあるタンパク質を含む別の物質とよりも、エピトープ、タンパク質または標的分子と、より高頻度に、より迅速に、より長い持続時間で、より高い親和性で、または前記のいくつかの組み合わせで反応または結合することを意味する。ある種の態様において、「特異的に結合する」とは、例えば、抗体が約0.1 mMまたはそれ以下、しかし、より通常には、約1 μM未満のKDでタンパク質を結合することを意味する。ある種の態様において、「特異的に結合する」とは、抗体が、時には、少なくとも約0.1 μMまたはそれ以下、またある時には、少なくとも約0.01 μMまたはそれ以下、またある時には、少なくとも約1 nMまたはそれ以下のKDで標的を結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間の配列同一性のため、特異的結合は、2種以上の種におけるタンパク質(例えば、ヒトMETおよびマウスMET)を認識する抗体を含むことができる。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列のある種の領域内の相同性のため、特異的結合は、2種以上のタンパク質(例えば、ヒトWNT1およびヒトWNT7)を認識する抗体(または他のポリペプチドもしくは結合剤)を含むことができる。ある種の態様において、第1の標的を特異的に結合する抗体または結合剤は、第2の標的を特異的に結合してもしなくてもよいことが理解されよう。したがって、「特異的な結合」とは、排他的な結合、すなわち単一の標的との結合を(含むことができるが)必ずしも必要としない。かくして、結合剤は、ある種の態様において、2種以上の標的を特異的に結合することができる。ある種の態様において、複数の標的が剤または抗体上の同じ抗原結合部位によって結合されうる。例えば、抗体は、場合によっては、それぞれが2種またはそれ以上のタンパク質上の同じエピトープを特異的に結合する2つの同一の抗原結合部位を含むことができる。ある種の代替的な態様において、抗体は二重特異性または多重特異性であることができ、異なる特異性を有する少なくとも2つの抗原結合部位を含むことができる。非限定的な例として、二重特異性剤は、1つのタンパク質(例えば、ヒトMET)上の標的を認識する1つの結合部位を含むことができ、第2のタンパク質(例えば、ヒトWNTタンパク質)上の異なる標的を認識するもう1つの、異なる結合部位をさらに含むことができる。一般的に、しかし必ずというわけではないが、結合への言及は特異的な結合を意味する。
「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸の重合体をいう。この重合体は直鎖または分岐鎖であってよく、修飾アミノ酸を含んでよく、非アミノ酸によって中断されてよい。これらの用語は同様に、天然によりあるいは介入により、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの、その他任意の操作もしくは修飾により改変されたアミノ酸重合体を包含する。例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体(例えば、非天然アミノ酸を含む)、ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義のなかに含まれる。本発明のポリペプチドは、ある種の態様において、抗体に基づきうるので、ポリペプチドは一本鎖または結合した鎖として生じてもよいことが理解されよう(例えば、二量体)。
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドの重合体をいい、DNAおよびRNAを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および/またはその類似体、あるいはDNAポリメラーゼもしくはRNAポリメラーゼによって重合体に組み込むことができる任意の基質でもよい。
「高ストリンジェンシーの条件」は、(1) 洗浄のために低いイオン強度および高い温度、例えば50℃で15 mM塩化ナトリウム/1.5 mMクエン酸ナトリウム/0.1%ドデシル硫酸ナトリウムを利用する; (2) ハイブリダイゼーションの間に5×SSC (0.75 M NaCl、75 mMクエン酸ナトリウム)中、変性剤、例えばホルムアミド、例えば、50% (v/v)ホルムアミド＋0.1%ウシ血清アルブミン/0.1% Ficoll/0.1%ポリビニルピロリドン/50 mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 6.5を42℃で利用する; または(3) ハイブリダイゼーションの間に5×SSC中50%ホルムアミド、50 mMリン酸ナトリウム(pH 6.8)、0.1%ピロリン酸ナトリウム、5×デンハルト溶液、超音波処理済みサケ精子DNA (50 μg/ml)、0.1% SDS、および10%硫酸デキストランを42℃で利用し、42℃で0.2×SSCおよび50%ホルムアミド中にて洗浄し、その後、EDTAを含有する0.1×SSCからなる高ストリンジェンシー洗浄を55℃で行うものによって特定されうる。
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチドという文脈において、「同一の」または「同一性」の割合という用語は、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部として全く考慮することなく、最大一致を得るように比較されアライメントされた場合に(必要であれば、ギャップを導入して)、同じであるか、または特定の割合の同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有するかの、2つまたはそれ以上の配列または部分配列をいう。同一性の割合は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアライメントを得るために使用できるさまざまなアルゴリズムおよびソフトウェアが当技術分野において公知である。これらにはBLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCG Wisconsin Packageおよびそのバリエーションが含まれるが、これらに限定されることはない。いくつかの態様において、本発明の2つの核酸またはポリペプチドは実質的に同一であり、それらが、最大一致を得るように比較されアライメントされ、配列比較アルゴリズムを用いてまたは目視検査によって測定された場合に、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、およびいくつかの態様において少なくとも95%、96%、97%、98%、99%のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有することを意味する。いくつかの態様において、同一性は、長さが少なくとも約10残基、少なくとも約20残基、少なくとも約40〜60残基、少なくとも約60〜80残基またはその間の任意の整数値である配列の領域にわたって存在する。いくつかの態様において、同一性は、少なくとも約80〜100残基のような、60〜80残基よりも長い領域にわたって存在し、いくつかの態様において、配列はヌクレオチド配列のコード領域のような、比較されている配列の全長にわたって実質的に同一である。
「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む、類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野において定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換するのが保存的置換である。本発明のポリペプチドおよび抗体の配列における保存的置換は、アミノ酸配列を含有するポリペプチドまたは抗体と、ポリペプチドまたは抗体が結合する抗原との結合を阻止しないことが好ましい。抗原結合を妨げない、ヌクレオチドおよびアミノ酸の保存的置換を特定する方法は当技術分野において周知である。
本明細書において用いられる「ベクター」という用語は、宿主細胞において関心対象の1つまたは複数の遺伝子または配列を送達できる、通常は、発現できる構築体を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のDNAまたはRNA発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と結合したDNAまたはRNA発現ベクター、およびリポソーム中にカプセル封入されたDNAまたはRNA発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されることはない。
本明細書において用いられる場合、「可溶性受容体」という用語は、可溶型で細胞から分泌されうる受容体の第1の膜貫通ドメインの前にある受容体タンパク質の細胞外ドメイン(またはその断片)をいう。一般に、これは受容体タンパク質のN末端部分である。
本明細書において用いられる場合、「FZD可溶性受容体」または「可溶性FZD受容体」という用語は、可溶型で細胞から分泌されうる受容体の第1の膜貫通ドメインの前にあるFZD受容体タンパク質のN末端細胞外断片をいう。N末端細胞外ドメイン(ECD)全体およびより小さな断片を含んだFZD可溶性受容体は、この用語によって包含される。したがって、FZD Friドメインを含んだFZD可溶性受容体も、この用語のなかに含まれる。
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、天然では見られない形態にあるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物には、天然で見られる形態にはない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様において、単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は実質的に純粋である。
本明細書において用いられる「実質的に純粋な」という用語は、少なくとも50%純粋である(すなわち、夾雑物を含まない)、少なくとも90%純粋である、少なくとも95%純粋である、少なくとも98%純粋である、または少なくとも99%純粋である材料をいう。
本明細書において用いられる「がん」および「がん性」という用語は、無秩序な細胞増殖を特徴とする細胞集団を含む哺乳動物における生理的状態をいい、または記述する。がんの例としては、がん腫、芽細胞腫、肉腫、ならびにリンパ腫および白血病のような血液がんが挙げられるが、これらに限定されることはない。
本明細書において用いられる「腫瘍」および「新生物」という用語は、過度の細胞成長または増殖に起因する、前がん病変を含む良性(非がん性)病変または悪性(がん性)病変の任意の組織塊をいう。
本明細書において用いられる「転移」という用語は、身体の出現部位から他の領域にがんが拡散または移動し、新たな場所での類似のがん性病変の発生を伴う過程をいう。「転移」または「転移性」細胞は、隣接する細胞との接着性接触を失い、疾患の原発部位から二次部位へ(例えば、血流またはリンパを介して)移動する。
「がん幹細胞」および「CSC」および「腫瘍幹細胞」および「腫瘍開始細胞」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、(1) 高い増殖能を有し; 2) 非対称細胞分裂を行って、増殖能力または発生能力の低下したおよび/または制限された1つまたは複数のタイプの分化した細胞子孫を作出でき; かつ(3) 自己複製または自己維持のための対称細胞分裂を行うことができる、がんまたは腫瘍由来の細胞をいう。これらの特性によって、がん幹細胞には、免疫不全宿主(例えば、マウス)に累代移植されると、腫瘍を形成できない大多数の腫瘍細胞と比較して腫瘍またはがんを形成または樹立する能力が付与される。がん幹細胞は、分化に対して無秩序な様式で自己複製を起こし、変異が生じるにつれて経時変化しうる異常細胞型を含む腫瘍を形成する。
「がん細胞」および「腫瘍細胞」という用語は、がん細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成性細胞および腫瘍形成性幹細胞(がん幹細胞)の両方を含む、がんまたは腫瘍または前がん病変に由来する細胞の全集団をいう。本明細書において用いられる場合、「がん細胞」または「腫瘍細胞」という用語は、再生および分化する能力が無い腫瘍細胞のみをいう場合に、腫瘍細胞とがん幹細胞を区別するために「非腫瘍形成性の」という用語で修飾される。
本明細書において用いられる「腫瘍形成性の」という用語は、(さらなる腫瘍形成性がん幹細胞を生じる)自己複製の特性、および(分化した、したがって、非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じる)他の全ての腫瘍細胞を発生する増殖を含む、がん幹細胞の機能的特徴をいう。
本明細書において用いられる「腫瘍形成性」という用語は、腫瘍由来細胞の無作為サンプルが、免疫不全宿主(例えば、マウス)に累代移植されると、触診可能な腫瘍を形成する能力をいう。この定義には、免疫不全宿主(例えば、マウス)に累代移植されると、触診可能な腫瘍を形成するがん幹細胞の濃縮されたおよび/または単離された集団も含まれる。
「対象」という用語は、特定の処置のレシピエントとなるべき、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯類などを含むが、これに限定されない任意の動物(例えば、哺乳動物)をいう。典型的には、ヒト対象に関して、本明細書では「対象」および「患者」という用語が互換的に用いられる。
「薬学的に許容される」という用語は、ヒトを含めて、動物での使用が、連邦政府もしくは州政府の監督官庁によって承認された(もしくは承認可能な)または米国薬局方もしくは他の一般に認められた薬局方に記載されている製品もしくは化合物をいう。
「薬学的に許容される賦形剤、担体もしくは補助剤」または「許容される薬学的な担体」という用語は、少なくとも1つの本開示の結合剤とともに、対象に投与でき、かつその結合剤の活性を破壊しない賦形剤、担体または補助剤をいう。賦形剤、担体または補助剤は、治療効果を送達するのに十分な用量で結合剤とともに投与された場合に無毒でなければならない。
「有効量」または「治療的有効量」または「治療的効果」という用語は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「処置する」のに有効な、結合剤、抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機低分子または他の薬物の量をいう。がんの場合、薬物(例えば、抗体)の治療的有効量は、治療的効果を有し、したがってがん細胞の数を減らす; 腫瘍形成性、腫瘍形成頻度もしくは腫瘍形成能を下げる; がん幹細胞の数もしくは頻度を減らす; 腫瘍サイズを減らす; がん細胞集団を減らす; 例えば、軟組織もしくは骨へのがんの拡散を含む末梢臓器へのがん細胞の浸潤を阻むおよび/もしくは止める; 腫瘍もしくはがん細胞転移を阻むおよび/もしくは止める; 腫瘍もしくはがん細胞成長を阻むおよび/もしくは止める; がんと関連する症状の1つもしくは複数をある程度まで和らげる; 有病率および死亡率を減らす; 生活の質を良くする; またはこのような効果の組み合わせをもたらすことができる。剤、例えば抗体が既存のがん細胞の成長を抑止する、かつ/または既存のがん細胞を死滅化する程度まで、それを、細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性ということができる。
「処置する」もしくは「処置」もしくは「処置するため」または「緩和する」もしくは「緩和するため」という用語は、1) 診断された病理学的状態もしくは障害の症状を治癒する、減速する、軽減する、および/または診断された病理学的状態もしくは障害の進行を食い止める治療的手段、ならびに2) 標的化された病理学的状態または障害の発生を阻止するまたは遅延する予防的または防止的手段の両方をいう。したがって、処置を必要とする者には、障害を既に有する者; 障害を有する傾向がある者; および障害が予防されるべき者が含まれる。いくつかの態様において、患者が以下の1つまたは複数を示すなら、対象は本発明の方法によって成功裏に「処置されて」いる: がん細胞の数の低下もしくはがん細胞の完全な非存在; 腫瘍サイズの低下; 軟組織および骨へのがん細胞の拡散を含む末梢臓器へのがん細胞浸潤の阻害もしくは非存在; 腫瘍もしくはがん細胞転移の阻害もしくは非存在; がん成長の阻害もしくは非存在; 特異的ながんと関連する1つもしくは複数の症状の緩和; 有病率および死亡率の低下; 生活の質の改善; 腫瘍形成性の低下; がん幹細胞の数もしくは頻度の低下; またはこのような効果のいくつかの組み合わせ。
本開示および特許請求の範囲において用いられる場合、「1つの(a)」、「1つの(an)」および「その(the)」という単数形は、文脈上明らかに他の指示がない限り、複数形を含む。
本明細書において「含む」という言い回しで態様が記述された場合はいつでも、「からなる」および/または「から本質的になる」によって記述される他の類似する態様も提供されることが理解されよう。本明細書において「から本質的になる」という言い回しで態様が記述された場合はいつでも、「からなる」によって記述される他の類似する態様も提供されることも理解されよう。
本明細書において「Aおよび/またはB」のような語句において用いられる「および/または」という用語は、AおよびBも; AまたはBも; A (のみ)も; およびB (のみ)も含むことが意図される。同様に、「A、Bおよび/またはC」のような語句において用いられる「および/または」という用語は、以下の態様のそれぞれを含むことが意図される: A、BおよびC; A、BまたはC; AまたはC; AまたはB; BまたはC; AおよびC; AおよびB; BおよびC; A (のみ); B (のみ); ならびにC (のみ)。
II. MET結合剤
本発明は、ヒトMETを特異的に結合する剤を提供する。該剤は、本明細書において「MET結合剤」といわれる。「MET結合剤」という語句は、METのみを結合する剤ならびにMETおよび少なくとも1つのさらなる標的または抗原の両方を結合する二重特異性剤を包含する。したがって、いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETを特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METおよび少なくとも1つのさらなる標的または抗原の両方を特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METおよび1種または複数種のWNTタンパク質の両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METおよび1種または複数種のFZDタンパク質の両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤はポリペプチドである。いくつかの態様において、MET結合剤は抗体である。いくつかの態様において、MET結合剤は一価抗体である。いくつかの態様において、MET結合剤はヘテロ二量体である。ある種の態様において、MET結合剤は二重特異性抗体である。ある種の態様において、MET結合剤は二重特異性剤である。ある種の態様において、MET結合剤は、可溶性受容体を含んだ二重特異性剤である。ある種の態様において、MET結合剤は、METを特異的に結合する一価抗体を含んだ二重特異性剤である。ある種の態様において、MET結合剤は、METを特異的に結合する一価抗体およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する一価抗体を含んだ二重特異性剤である。ある種の態様において、MET結合剤は、METを特異的に結合する一価抗体および1種または複数種のWNTタンパク質を特異的に結合する可溶性受容体を含んだ二重特異性剤(例えば、ヘテロ二量体剤)である。
ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETの細胞外ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETのSemaドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETのSemaドメイン内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETのSemaドメインのα鎖を特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETのSemaドメインのβ鎖を特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのPSI (プレキシン-セマホリン-インテグリン)ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのIPT (免疫グロブリン様折畳み、プレキシン、転写因子)ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETの1つまたは複数のIPT反復ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、結合剤は、ヒトMETのSemaドメイン、PSIドメイン、および/または1つもしくは複数のIPT反復ドメインを特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETのSemaドメインを特異的に結合するが、マウスMETのSemaドメインを特異的に結合しない。
いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号25〜932内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号25〜836内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号25〜515内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号25〜307内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号308〜515内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号50〜130内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号70〜110内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号90〜110内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号97〜101を含むエピトープを特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:93の位置番号99に対応するグルタミンを含むエピトープを特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、アミノ酸PCQDC (SEQ ID NO:113)を含むエピトープを特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号519〜562内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号563〜950内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号563〜836内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号563〜656内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号657〜740内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号741〜855内に特異的に結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMET (SEQ ID NO:93)のアミノ酸番号856〜950内に特異的に結合する。
ある種の態様において、本発明は、ヒトMETを特異的に結合するMET結合剤を提供し、このMET結合剤が、ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3をさらに含む。ある種の態様において、MET結合剤は、(a)
ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3、ならびに(b)
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。
ある種の態様において、本発明は、ヒトMETを特異的に結合するMET結合剤を提供し、このMET結合剤が、(a) ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、または1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を含んだその変種; (b)
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、または1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を含んだその変種; (c) KGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3、または1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を含んだその変種; (d)
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、または1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を含んだその変種; (e) STSNLAS (SEQ ID NO:5)
を含んだ軽鎖CDR2、または1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を含んだその変種; および(f)
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3、または1、2、3もしくは4個のアミノ酸置換を含んだその変種を含む。ある種の態様において、アミノ酸置換は保存的置換である。いくつかの態様において、置換は、生殖細胞系ヒト化プロセスの一部として特定および/または作出される。
ある種の態様において、本発明は、METを特異的に結合するMET結合剤を提供し、このMET結合剤が、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:94と少なくとも約80%の配列同一性を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:95と少なくとも約80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:94と少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:95と少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7を含んだ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8を含んだ軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94を含んだ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95を含んだ軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8から本質的になる軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94から本質的になる重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95から本質的になる軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8の軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95の軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様において、本発明は、METを特異的に結合するMET結合剤を提供し、このMET結合剤が、SEQ ID NO:12を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:14を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:12の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:13を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:14を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:13の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:88を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:14を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:88の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含む。
いくつかの態様において、本発明は、METを特異的に結合するMET結合剤を提供し、このMET結合剤が、SEQ ID NO:99を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:101を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:99の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:100を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:101を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:100の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:108を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:101を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:108の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:112を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:101を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:112の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:111を含んだ重鎖およびSEQ ID NO:101を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:111の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。
ある種の態様において、本発明は、抗体73R009または73R009のヒト化バージョン(すなわち、73R010もしくはその変種)のCDRの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含む、ヒトMETを特異的に結合するMET結合剤を提供する(表1参照)。いくつかの態様において、MET結合剤は、73R009もしくは73R009のヒト化バージョンのCDRの1つもしくはそれ以上、73R009もしくは73R009のヒト化バージョンのCDRの2つもしくはそれ以上、73R009もしくは73R009のヒト化バージョンのCDRの3つもしくはそれ以上、73R009もしくは73R009のヒト化バージョンのCDRの4つもしくはそれ以上、73R009もしくは73R009のヒト化バージョンのCDRの5つもしくはそれ以上、または73R009もしくは73R009のヒト化バージョンのCDRの6つ全てを含む。
Figure 2016512533
ある種の態様において、MET結合剤は、抗体73R009の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、抗体73R009のヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、抗体73R010の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、(リーダー配列を有するまたは有しない)抗体73R009または抗体73R010の重鎖および軽鎖を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、重鎖がヘテロ二量体(例えば、二重特異性剤)またはヘテロ多量体の形成を促進するように修飾されている、(リーダー配列を有するまたは有しない)抗体73R009または抗体73R010の重鎖および軽鎖を含む。ある種の態様において、MET結合剤は抗体73R009である。ある種の態様において、MET結合剤は抗体73R010 (73R009 H12L7)である。ある種の態様において、MET結合剤は抗体73R010の変種である。いくつかの態様において、MET結合剤は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に寄託され、かつPTA-13609と指定されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、ATCCに寄託され、かつPTA-120387と指定されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、ATCCに寄託され、かつPTA-120695と指定されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、ATCCに寄託され、かつPTA-13610と指定されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、ATCCに寄託され、かつPTA-120388と指定されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含む。
ある種の態様において、MET結合剤は、抗体73R009を含むか、抗体73R009から本質的になるか、または抗体73R009からなる。ある種の態様において、MET結合剤は、抗体73R009のヒト化バージョンを含むか、抗体73R009のヒト化バージョンから本質的になるか、または抗体73R009のヒト化バージョンからなる。ある種の態様において、MET結合剤は、抗体73R010を含むか、抗体73R010から本質的になるか、または抗体73R010からなる。
ある種の態様において、MET結合剤は本発明の結合剤と、同じかまたは本質的に同じMET上のエピトープを結合する。別の態様において、MET結合剤は、本発明の結合剤が結合するMET上のエピトープと重複するMET上のエピトープを結合する抗体または二重特異性剤である。ある種の態様において、MET結合剤は抗体73R009または抗体73R009のヒト化バージョンと、同じかまたは本質的に同じMET上のエピトープを結合する。ある種の態様において、MET結合剤は抗体73R010と、同じかまたは本質的に同じMET上のエピトープを結合する。別の態様において、MET結合剤は、抗体73R009または抗体73R009のヒト化バージョンが結合するMET上のエピトープと重複するMET上のエピトープを結合する抗体または二重特異性剤である。別の態様において、MET結合剤は、抗体73R010が結合するMET上のエピトープと重複するMET上のエピトープを結合する抗体または二重特異性剤である。
ある種の態様において、MET結合剤は抗体である。いくつかの態様において、抗体は組み換え抗体である。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト抗体である。いくつかの態様において、抗体はIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM抗体である。ある種の態様において、抗体はIgG1抗体である。ある種の態様において、抗体はIgG2抗体である。ある種の態様において、抗体は、抗原結合部位を含む抗体断片である。いくつかの態様において、抗体は二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は一価抗体である。いくつかの態様において、抗体は単一特異性である。いくつかの態様において、抗体は多重特異性である。
いくつかの態様において、MET結合剤はMETと肝細胞成長因子との結合を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETと肝細胞成長因子との結合を遮断する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを特異的に結合し、METの内部移行を促進する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを特異的に結合し、METの分解を刺激する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを特異的に結合し、METの二量体化を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを特異的に結合し、METの活性化を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを特異的に結合し、METのリン酸化を阻害および/または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを特異的に結合し、腫瘍成長を阻害する。
いくつかの態様において、MET結合剤は、約100 nMまたはそれ以下のKDでMETを結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約10 nMまたはそれ以下のKDでMETを結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約1 nMまたはそれ以下のKDでMETを結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約0.1 nMまたはそれ以下のKDでMETを結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約0.01 nMまたはそれ以下のKDでMETを結合する。いくつかの態様において、MET結合剤の少なくとも1つのCDRにおける少なくとも1つのアミノ酸残基は、METに対するMET結合剤の親和性が改変されるように、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの態様において、METに対するMET結合剤の親和性は増加する。いくつかの態様において、METに対するMET結合剤の親和性は減少する。いくつかの態様において、MET結合剤はヒトMETを結合する。いくつかの態様において、MET結合剤はヒトMETおよびマウスMETを結合する。いくつかの態様において、MET結合剤はヒトMETを結合するが、マウスMETを結合しない。
ある種の態様において、本発明は、二重特異性剤であるMET結合剤を提供する。いくつかの態様において、MET結合剤は、第1の腕部および第2の腕部を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、第1の腕部および第2の腕部を含んだ二重特異性剤であり、ここで第1の腕部が、METを特異的に結合する第1の結合部位を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、第1の腕部および第2の腕部を含んだ二重特異性剤であり、ここで第1の腕部が、METを特異的に結合する第1の結合部位を含み、かつ第2の腕部が、第2の標的または抗原を特異的に結合する第2の結合部位を含む。いくつかの態様において、第1の結合部位は抗原結合部位を含む。いくつかの態様において、第2の結合部位は抗原結合部位を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、第1の腕部が、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位を含み、かつ第2の腕部が、WNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する第2の結合部位を含む、二重特異性剤である。
ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤である。ある種の態様において、二重特異性剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質の両方を特異的に結合する二重特異性抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種のFZDタンパク質を特異的に結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択される1種または複数種のFZDタンパク質を結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8を含む1種または複数種のFZDタンパク質を結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体はFZD7を結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体はFZD5および/またはFZD8を結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体はFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8を特異的に結合する。FZD結合剤の非限定的な例は、米国特許第7,982,013号において見出すことができる。
ある種の態様において、二重特異性抗体は、METおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質の細胞外ドメイン(ECD)を特異的に結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体は、METおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質の細胞外ドメイン(ECD)の断片を特異的に結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体は、1種または複数種のヒトFZDタンパク質のFriドメイン(システインリッチドメイン(CRD)としても知られる)内に特異的に結合する。ヒトFZDタンパク質の各々のFriドメインの配列は、当技術分野において公知であり、SEQ ID NO:21 (FZD1)、SEQ ID NO:22 (FZD2)、SEQ ID NO:23 (FZD3)、SEQ ID NO:24 (FZD4)、SEQ ID NO:25 (FZD5)、SEQ ID NO:26 (FZD6)、SEQ ID NO:27 (FZD7)、SEQ ID NO:28 (FZD8)、SEQ ID NO:29 (FZD8)、SEQ ID NO:30 (FZD9)およびSEQ ID NO:31 (FZD10)として提供されている。予測される最小のFriドメインの配列は、SEQ ID NO:32 (FZD1)、SEQ ID NO:33 (FZD2)、SEQ ID NO:34 (FZD3)、SEQ ID NO:35 (FZD4)、SEQ ID NO:36 (FZD5)、SEQ ID NO:37 (FZD6)、SEQ ID NO:38 (FZD7)、SEQ ID NO:39 (FZD8)、SEQ ID NO:40 (FZD9)およびSEQ ID NO:41 (FZD10)として提供されている。ある種の態様において、二重特異性抗体は、ヒトFZDタンパク質の生物学的結合部位(BBS)に特異的に結合する。FZDタンパク質のBBSは、米国特許第7,982,013号に記述されている。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒトFZDタンパク質のBBSの少なくとも一部に特異的に結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8のBBSの少なくとも一部に特異的に結合する。
ある種の態様において、二重特異性抗体は、ヒトMETを結合し、1種、2種、3種、4種、5種、またはそれ以上のFZDタンパク質を結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒトMETを特異的に結合し、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される1種、2種、3種、4種、または5種のFZDタンパク質を結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、METを特異的に結合し、少なくともFZD5およびFZD8を結合する。
ある種の態様において、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質を結合する二重特異性抗体は、FZDアンタゴニストである。ある種の態様において、二重特異性抗体はWnt経路アンタゴニストである。ある種の態様において、二重特異性抗体はWntシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、二重特異性抗体はカノニカルWntシグナル伝達を阻害する。
ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤である。ある種の態様において、二重特異性剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性抗体である。ある種の態様において、二重特異性抗体は、ヒトMETを特異的に結合し、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上のWNTタンパク質を結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒトMETを結合し、WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT4、WNT5a、WNT5b、WNT6、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT9a、WNT9b、WNT10a、WNT10b、WNT11、およびWNT16からなる群より選択される1種または複数種のヒトWNTタンパク質を結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体は、ヒトMETを結合し、WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT10a、およびWNT10bからなる群より選択される1種またはそれ以上の(または2種もしくはそれ以上の、3種もしくはそれ以上の、4種もしくはそれ以上の、5種もしくはそれ以上などの) WNTタンパク質を結合する。ある種の態様において、1種またはそれ以上の(または2種もしくはそれ以上の、3種もしくはそれ以上の、4種もしくはそれ以上の、5種もしくはそれ以上などの) WNTタンパク質は、WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT8a、WNT8b、WNT10a、およびWNT10bからなる群より選択される。WNT結合剤の非限定的な例は、国際公開WO 2011/088127において見出すことができる。
ある種の態様において、二重特異性抗体は、METおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質のC末端システインリッチドメイン(CRD)を特異的に結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体は、SEQ ID NO:57 (WNT1)、SEQ ID NO:58 (WNT2)、SEQ ID NO:59 (WNT2b)、SEQ ID NO:60 (WNT3)、SEQ ID NO:61 (WNT3a)、SEQ ID NO:62 (WNT7a)、SEQ ID NO:63 (WNT7b)、SEQ ID NO:64 (WNT8a)、SEQ ID NO:65 (WNT8b)、SEQ ID NO:66 (WNT10a)、およびSEQ ID NO:67 (WNT10b)からなる群より選択される1種または複数種のWNTタンパク質内のドメインを結合する。
ある種の態様において、ヒトMETおよび1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性抗体は、WNTアンタゴニストである。ある種の態様において、二重特異性抗体はWNT経路アンタゴニストである。ある種の態様において、二重特異性抗体はWNTシグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、二重特異性抗体はカノニカルWNTシグナル伝達を阻害する。
ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤である。ある種の態様において、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、ヘテロ二量体剤である。ある種の態様において、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、可溶性受容体を含んだヘテロ二量体剤である。ある種の態様において、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、融合タンパク質を含んだヘテロ二量体剤である。ある種の態様において、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、一価抗体を含んだ第1の腕部および可溶性受容体を含んだ第2の腕部を含むヘテロ二量体剤である。ある種の態様において、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、一価抗体を含んだ第1の腕部および融合タンパク質を含んだ第2の腕部を含むヘテロ二量体剤である。いくつかの態様において、融合タンパク質は免疫アドヘシンである。
ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤であり、この二重特異性剤がFZD受容体タンパク質(例えば、可溶性受容体)の細胞外ドメイン(ECD)を含む。ある種の態様において、FZDタンパク質はヒトFZDタンパク質である。ある種の態様において、ヒトFZDタンパク質はFZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10である。ある種の態様において、ヒトFZDタンパク質はFZD8である。可溶性FZD受容体の非限定的な例は、米国特許第7,723,477号および同第7,947,277号; ならびに米国特許出願公開第2011/0305695号において見出すことができる。
いくつかの態様において、二重特異性剤はFZDタンパク質のECDのFriドメインを含む。ヒトFZD1〜10タンパク質の各々に対するFriドメインは、SEQ ID NO:21〜31として提供されている。ヒトFZD1〜10タンパク質の各々に対する最小(またはコア) Friドメインは、SEQ ID NO:32〜41として提供されている。当業者は、さまざまなFriドメインに対応する正確なアミノ酸に関するその理解が異なりうる。したがって、上記でおよび本明細書で概略が述べられているドメインのN末端および/またはC末端は、1、2、3、4、5、6、7、8、9個または場合により10個のアミノ酸だけ伸長または短縮されうる。
いくつかの態様において、FZD Friドメインを含む可溶性受容体は、FZD ECD全体を含んだ可溶性受容体と比べて変化した生物学的活性(例えば、増加したタンパク質半減期)を示しうる。いくつかの態様において、タンパク質半減期は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチレンオキシド(PEO)での共有結合修飾によってさらに増加されうる。
ある種の態様において、二重特異性剤は、ヒトFZDタンパク質のFriドメイン、または1種もしくは複数種のヒトWNTタンパク質を結合するFriドメインの断片もしくは変種を含む。ある種の態様において、ヒトFZDタンパク質はFZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10である。ある種の態様において、ヒトFZDタンパク質はFZD8である。ある種の態様において、ヒトFZDタンパク質はFZD4である。ある種の態様において、ヒトFZDタンパク質はFZD5である。ある種の態様において、ヒトFZDタンパク質はFZD10である。ある種の態様において、FZDタンパク質はFZD4であり、二重特異性剤はSEQ ID NO:24を含む。ある種の態様において、FZDタンパク質はFZD5であり、二重特異性剤はSEQ ID NO:25を含む。ある種の態様において、FZDタンパク質はFZD7であり、二重特異性剤はSEQ ID NO:27を含む。ある種の態様において、FZDタンパク質はFZD8であり、二重特異性剤はSEQ ID NO:28またはSEQ ID NO:29を含む。ある種の態様において、FZDタンパク質はFZD10であり、二重特異性剤はSEQ ID NO:31を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、FZD1の最小Friドメイン(SEQ ID NO:32)、FZD2の最小Friドメイン(SEQ ID NO:33)、FZD3の最小Friドメイン(SEQ ID NO:34)、FZD4の最小Friドメイン(SEQ ID NO:35)、FZD5の最小Friドメイン(SEQ ID NO:36)、FZD6の最小Friドメイン(SEQ ID NO:37)、FZD7の最小Friドメイン(SEQ ID NO:38)、FZD8の最小Friドメイン(SEQ ID NO:39)、FZD9の最小Friドメイン(SEQ ID NO:40)、またはFZD10の最小Friドメイン(SEQ ID NO:41)を含んだFriドメインを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、FZD8の最小Friドメイン(SEQ ID NO:39)を含んだFriドメインを含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、FZD1のFriドメイン、FZD2のFriドメイン、FZD3のFriドメイン、FZD4のFriドメイン、FZD5のFriドメイン、FZD6のFriドメイン、FZD7のFriドメイン、FZD8のFriドメイン、FZD9のFriドメイン、またはFZD10のFriドメインから本質的になるFriドメインを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、FZD8のFriドメインから本質的になるFriドメインを含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO;33、SEQ ID MO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、およびSEQ ID NO:41からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:39を含んだFriドメインを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:39のFriドメインを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:28を含んだFriドメインを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:28のFriドメインを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:29を含んだFriドメインを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:29のFriドメインを含む。
ある種の態様において、二重特異性剤は、1つまたは複数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個など)の保存的置換を含み、かつWNTタンパク質を結合できる上述したFZD Friドメイン配列のいずれか1つの変種を含む。
ある種の態様において、可溶性FZD受容体を含んだ剤のような、二重特異性剤は、異種ポリペプチド(すなわち、非FZDポリペプチド)をさらに含む。いくつかの態様において、可溶性FZD受容体は、ヒトFc領域、タンパク質タグ(例えば、myc、FLAG、GST)、他の内因性タンパク質もしくはタンパク質断片、またはFZD ECDもしくはFriドメインと第2のポリペプチドとの間の任意のリンカー領域を含む任意の他の有用なタンパク質配列を含むが、これらに限定されない、他の異種の機能的および構造的ポリペプチドに連結されたFZD ECDまたはFriドメインを含みうる。ある種の態様において、異種ポリペプチドはヒトFc領域を含む。Fc領域は、免疫グロブリンIgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEのクラスのいずれかより得ることができる。いくつかの態様において、Fc領域はヒトIgG1 Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域はヒトIgG2 Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は野生型Fc領域(自然界に見られるFc領域変種を含む)である。いくつかの態様において、Fc領域は変異Fc領域である。いくつかの態様において、Fc領域は、(例えば、蝶番ドメイン中の) 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個またはそれ以上のアミノ酸だけN末端の位置で切断される。いくつかの態様において、蝶番ドメイン中のアミノ酸を変化させて、望ましくないジスルフィド結合の形成を妨げる。いくつかの態様において、システインをセリンで置き換えて、望ましくないジスルフィド結合の形成を妨げまたは遮断する。いくつかの態様において、Fc領域は1、2、3個またはそれ以上のアミノ酸だけC末端の位置で切断される。いくつかの態様において、Fc領域は1個のアミノ酸だけC末端の位置で切断される。ある種の態様において、異種ポリペプチドはSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:91、またはSEQ ID NO:92を含む。ある種の態様において、異種ポリペプチドはSEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:91、またはSEQ ID NO:92である。ある種の態様において、異種ポリペプチドはSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52を含む。ある種の態様において、異種ポリペプチドはSEQ ID NO:48、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52である。
ある種の態様において、二重特異性剤は、FZD受容体の少なくとも最小のFriドメインおよびFc領域を含んだ融合タンパク質を含む。本明細書において用いられる場合、「融合タンパク質」は、少なくとも2種の遺伝子のヌクレオチド配列を含んだ核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。いくつかの態様において、第1のポリペプチドのC末端は、免疫グロブリンFc領域のN末端に連結されている。いくつかの態様において、第1のポリペプチド(例えば、FZD Friドメイン)はFc領域に直接(すなわち、介在性リンカーなしで)連結されている。いくつかの態様において、第1のポリペプチドはリンカーを介してFc領域に連結されている。
本明細書において用いられる場合、「リンカー」という用語は、第1のポリペプチド(例えば、FZD成分)と第2のポリペプチド(例えば、Fc領域)の間に挿入されたリンカーをいう。いくつかの態様において、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーはポリペプチドの発現、分泌、または生物活性に悪影響を及ぼすべきではない。リンカーは抗原性であるべきでなく、免疫反応を誘発すべきでない。適当なリンカーは当業者に公知であり、グリシン残基およびセリン残基の混合物を含むことが多く、立体的に障害のないアミノ酸を含むことが多い。有用なリンカーに組み入れることができる他のアミノ酸には、スレオニン残基およびアラニン残基が含まれる。リンカーは長さがさまざま、例えば長さが1〜50アミノ酸、長さが1〜22アミノ酸、長さが1〜10アミノ酸、長さが1〜5アミノ酸、または長さが1〜3アミノ酸でありうる。リンカーは、SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、nが1〜7であるS(GGS)n、GRA、ポリ(Gly)、ポリ(Ala)、
Figure 2016512533
を含んでよいが、これらに限定されることはない。本明細書において用いられる場合、リンカーは第1のポリペプチド(例えば、FZD Friドメイン)のC末端、または第2のポリペプチド(例えば、Fc領域)のN末端のどちらかに由来するアミノ酸残基を含まない介在性ペプチド配列である。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、FZD Friドメイン、Fc領域、およびFZD FriドメインをFc領域に接続するリンカーを含む。いくつかの態様において、FZD Friドメインは、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:39を含む。いくつかの態様において、リンカーは
Figure 2016512533
を含む。
FZD受容体および免疫グロブリンタンパク質は、タンパク質の輸送を指令するシグナル配列を含む。シグナル配列(シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれる)は、新生ポリペプチドのN末端に位置する。それらはポリペプチドを小胞体に標的化し、タンパク質はその行き先へ、例えば、オルガネラの内空へ、内膜へ、細胞外膜へ、または分泌を介して細胞外部へ選別される。ほとんどのシグナル配列は、タンパク質が小胞体に輸送された後に、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。ポリペプチドからのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列中の特異的な部位で起こり、それはシグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常、1つの特異的な切断部位が存在するが、シグナルペプチダーゼによって2つ以上の切断部位が認識および/または使用され、その結果、ポリペプチドの非均一N末端をもたらしうる。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位の使用は、異なるN末端アミノ酸を有する発現ポリペプチドをもたらしうる。したがって、いくつかの態様において、本明細書において記述されるポリペプチドは、異なるN末端を有するポリペプチドの混合物を含みうる。いくつかの態様において、N末端は長さが1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸だけ異なる。いくつかの態様において、ポリペプチドは実質的に均一である、すなわち、ポリペプチドは同じN末端を有する。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は1個または複数個(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個など)のアミノ酸置換および/または欠失を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドのシグナル配列は、1つの切断部位を優位にさせ、それにより1つのN末端を有する実質的に均一なポリペプチドを生じさせるアミノ酸置換および/または欠失を含む。
いくつかの態様において、METおよび1種または複数種のWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、SEQ ID NO:28を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:28を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:28を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:49またはSEQ ID NO:51を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:28を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:50またはSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:28を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、METおよび1種または複数種のWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、SEQ ID NO:29を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:29を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:29を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:49またはSEQ ID NO:51を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:29を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:50またはSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:29を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、METおよび1種または複数種のWNTタンパク質を特異的に結合する二重特異性剤は、SEQ ID NO:39を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:39を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:47またはSEQ ID NO:48を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:39を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:49またはSEQ ID NO:51を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:39を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:50またはSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、SEQ ID NO:39を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤はSEQ ID NO:55またはSEQ ID NO:56を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤はSEQ ID NO:56を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤はSEQ ID NO:87を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、(a) ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、および(b) WNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する第2の結合部位を含んだ二重特異性剤であり、ここで第1の結合部位が、(a) ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3、ならびに(b)
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、(a) ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、および(b) 1種または複数種のWNTタンパク質を結合する第2の結合部位を含んだ二重特異性剤であり、ここで第1の結合部位が、(a) ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3、ならびに(b)
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、(a) ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位および(b) WNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する第2の結合部位を含んだ二重特異性剤であり、ここで第1の結合部位が、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびXがRではない
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR3; ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、WASTRES (SEQ ID NO:85)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、(a) ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、および(b) WNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する第2の結合部位を含んだ二重特異性剤であり、ここで第1の結合部位が、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:94と少なくとも約80%の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、第1の結合部位は、SEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:95と少なくとも約80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域をさらに含む。ある種の態様において、第1の結合部位は、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:94と少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:95と少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、(a) ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位を含んだ第1の腕部、および(b) 1種または複数種のWNTタンパク質を結合する第2の結合部位を含んだ第2の腕部を含む二重特異性剤であり、ここで第1の腕部が、ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3、ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含み; かつ第2の腕部がFZD8 Friドメインを含む。いくつかの態様において、第2の腕部は、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:39を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETを特異的に結合し、かつWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部が、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、もしくはSEQ ID NO:112の重鎖、および/またはSEQ ID NO:14もしくはSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:13の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:100の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:111の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部が、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:111、またはSEQ ID NO:112の重鎖、およびSEQ ID NO:14またはSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつここで二重特異性剤の第2の腕部が、FZD8 Friドメインを含んだ第1のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含んだ第1のポリペプチドおよびヒトFc領域を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含んだ第1のポリペプチドおよびヒトIgG1 Fc領域を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含んだ第1のポリペプチドおよびヒトIgG2 Fc領域を含んだ第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第2の腕部は、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:39を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤の第2の腕部は、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、またはSEQ ID NO:39を含んだ第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、またはSEQ ID NO:52を含んだ第2のポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:13の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:28の第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:52の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:100の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:28の第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:52の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:111の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:28の第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:52の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:13の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:56を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:100の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:56を含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:111の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:56を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、二重特異性剤315B06といわれる。二重特異性剤315B06は、(a) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、指定番号PTA-13609を割り当てられたSEQ ID NO:16を含むプラスミドによってコードされる重鎖; (b) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-13610を割り当てられたSEQ ID NO:19を含むプラスミドによってコードされる軽鎖; および(c) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-13611を割り当てられたSEQ ID NO:89を含むプラスミドによってコードされるポリペプチドを含む。二重特異性剤315B06は、(a) ATCCに寄託され、指定番号PTA-13609を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:13を含んだ重鎖; (b) ATCCに寄託され、指定番号PTA-13610を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:14を含んだ軽鎖; および(c) ATCCに寄託され、指定番号PTA-13611を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:56を含んだポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、二重特異性剤315B07といわれる。いくつかの態様において、二重特異性剤315B07は、(a) ブダペスト条約の条件の下、2013年5月29日付でATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、指定番号PTA-120387を割り当てられたSEQ ID NO:103を含むプラスミドによってコードされる重鎖; (b) ブダペスト条約の条件の下、2013年5月29日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-120388を割り当てられたSEQ ID NO:106を含むプラスミドによってコードされる軽鎖; および(c) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-13611を割り当てられたSEQ ID NO:89を含むプラスミドによってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤315B07は、(a) ATCCに寄託され、指定番号PTA-120387を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:100を含んだ重鎖; (b) ATCCに寄託され、指定番号PTA-120388を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:101を含んだ軽鎖; および(c) ATCCに寄託され、指定番号PTA-13611を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:56を含んだポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、二重特異性剤315B09といわれる。いくつかの態様において、二重特異性剤315B09は、(a) ブダペスト条約の条件の下、2013年11月6日付でATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、指定番号PTA-120695を割り当てられたSEQ ID NO:109を含むプラスミドによってコードされる重鎖; (b) ブダペスト条約の条件の下、2013年5月29日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-120388を割り当てられたSEQ ID NO:106を含むプラスミドによってコードされる軽鎖; および(c) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-13611を割り当てられたSEQ ID NO:89を含むプラスミドによってコードされるポリペプチドを含む。いくつかの態様において、二重特異性剤315B09は、(a) ATCCに寄託され、指定番号PTA-120695を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:111を含んだ重鎖; (b) ATCCに寄託され、指定番号PTA-120388を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:101を含んだ軽鎖; および(c) ATCCに寄託され、指定番号PTA-13611を割り当てられたプラスミドによってコードされるSEQ ID NO:56を含んだポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、ATCCに寄託され、PTA-13609と指定されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含んだ重鎖およびATCCに寄託され、PTA-13610と指定されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ATCCに寄託され、PTA-120387と指定されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含んだ重鎖およびATCCに寄託され、PTA-120388と指定されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ATCCに寄託され、PTA-120695と指定されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域を含んだ重鎖およびATCCに寄託され、PTA-120388と指定されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ軽鎖を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ATCCに寄託され、PTA-13611と指定されたプラスミドによってコードされるポリペプチドを含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:88の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含み、かつここで二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:28の第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:50の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:88の重鎖およびSEQ ID NO:14の軽鎖を含み、かつここで二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:87を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:108の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつここで二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:28の第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:50の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:108の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつここで二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:87を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:114の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつここで二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:28の第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:50の第2のポリペプチドを含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:114の重鎖およびSEQ ID NO:101の軽鎖を含み、かつここで二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:87を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、特異的にヒトMETを結合し、かつ1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤であり、ここで二重特異性剤の第1の腕部が、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:94と少なくとも約80%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:95と少なくとも約80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部がFZD8 Friドメインを含む。ある種の態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:94と少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:95と少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約97%、または少なくとも約99%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含む。ある種の態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:7と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含む。ある種の態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:94と少なくとも約95%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95と少なくとも約95%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含む。ある種の態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:7を含んだ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8を含んだ軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含む。ある種の態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:94を含んだ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95を含んだ軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含む。ある種の態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:7の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8の軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含む。ある種の態様において、二重特異性剤の第1の腕部は、SEQ ID NO:94の重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95の軽鎖可変領域を含み、かつ二重特異性剤の第2の腕部は、FZD8 Friドメインを含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、二重特異性腕部の第1の腕部が第1のCH3ドメインを含み、二重特異性剤の第2の腕部が第2のCH3ドメインを含み、かつCH3ドメインの各々がヘテロ二量体またはヘテロ多量体の形成を促進するように修飾されている二重特異性剤である。いくつかの態様において、第1および第2のCH3ドメインは、ノブ・イントゥ・ホール(knobs-into-holes)技法を用いて修飾される。いくつかの態様において、第1および第2のCH3ドメインは、静電相互作用の改変を引き起こすアミノ酸の変化または置換を含む。いくつかの態様において、第1および第2のCH3ドメインは、疎水性/親水性相互作用の改変を引き起こすアミノ酸の変化を含む。
いくつかの態様において、MET結合剤は、(a) SEQ ID NO:74の位置番号253および292に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されまたは置き換えられている第1のヒトIgG1定常領域、ならびにSEQ ID NO:74の位置番号240および282に対応する位置のアミノ酸がリジンで置換されまたは置き換えられている第2のヒトIgG1定常領域; (b) SEQ ID NO:75の位置番号249および288に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されまたは置き換えられている第1のヒトIgG2定常領域、ならびにSEQ ID NO:75の位置番号236および278に対応する位置のアミノ酸がリジンで置換されまたは置き換えられている第2のヒトIgG2定常領域; (c) SEQ ID NO:76の位置番号300および339に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されまたは置き換えられている第1のヒトIgG3定常領域、ならびにSEQ ID NO:76の位置番号287および329に対応する位置のアミノ酸がリジンで置換されまたは置き換えられている第2のヒトIgG3定常領域; かつ(d) SEQ ID NO:77の位置番号250および289に対応する位置のアミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置換されまたは置き換えられている第1のヒトIgG4定常領域、ならびにSEQ ID NO:77の位置番号237および279に対応する位置のアミノ酸がリジンで置換されまたは置き換えられている第2のIgG4定常領域からなる群より選択される2つの重鎖定常領域を含む二重特異性剤である。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられているSEQ ID NO:74の位置番号253および292に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG1定常領域、ならびにアミノ酸がリジンで置き換えられているSEQ ID NO:74の位置番号240および282に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG1定常領域を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられているSEQ ID NO:75の位置番号249および288に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG2定常領域、ならびにアミノ酸がリジンで置き換えられているSEQ ID NO:75の位置番号236および278に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG2定常領域を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられているSEQ ID NO:76の位置番号300および339に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG3定常領域、ならびにアミノ酸がリジンで置き換えられているSEQ ID NO:76の位置番号287および329に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG2定常領域を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、アミノ酸がグルタミン酸またはアスパラギン酸で置き換えられているSEQ ID NO:77の位置番号250および289に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG4定常領域、ならびにアミノ酸がリジンで置き換えられているSEQ ID NO:77の位置番号237および279に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG4定常領域を含む。
いくつかの態様において、二重特異性剤は、アミノ酸がグルタミン酸で置き換えられているSEQ ID NO:75の位置番号249および288に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG2定常領域、ならびにアミノ酸がリジンで置き換えられているSEQ ID NO:75の位置番号236および278に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG2定常領域を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、アミノ酸がアスパラギン酸で置き換えられているSEQ ID NO:75の位置番号249および288に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第1のヒトIgG2定常領域、ならびにアミノ酸がリジンで置き換えられているSEQ ID NO:75の位置番号236および278に対応する位置でのアミノ酸置換を有する第2のヒトIgG2定常領域を含む。
ある種の態様において、MET結合剤は、約1 μMもしくはそれ以下、約100 nMもしくはそれ以下、約40 nMもしくはそれ以下、約20 nMもしくはそれ以下、約10 nMもしくはそれ以下、約1 nMもしくはそれ以下または約0.1 nMもしくはそれ以下の解離定数(KD)でMETおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約20 nMまたはそれ以下のKDでMETおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約10 nMまたはそれ以下のKDでMETおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約1 nMまたはそれ以下のKDでMETおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約0.1 nMまたはそれ以下のKDでMETおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約100 nMまたはそれ以下のKDでヒトMETおよびマウスMETの両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約50 nMまたはそれ以下のKDでヒトMETおよびマウスMETの両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、ヒトMETを結合するが、マウスMETを結合しない。いくつかの態様において、MET結合剤は、約100 nMまたはそれ以下のKDで1種または複数種のヒトWNTタンパク質を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約50 nMまたはそれ以下のKDで1種または複数種のヒトWNTタンパク質を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約20 nMまたはそれ以下のKDで1種または複数種のヒトWNTタンパク質を結合する。いくつかの態様において、METに対する結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の解離定数は、Biacoreチップ上に固定化されている少なくともMETの一部分を含んだMET融合タンパク質を用いて決定された解離定数である。いくつかの態様において、WNTタンパク質に対する結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の解離定数は、Biacoreチップ上に固定化されている少なくともWNTタンパク質の一部分を含んだWNT融合タンパク質を用いて決定された解離定数である。
いくつかの態様において、MET結合剤は、METを特異的に結合する第1の結合部位およびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含む二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、約100 nMまたはそれ以下のKDでMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分(例えば、WNTタンパク質またはFZDタンパク質)の両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約50 nMまたはそれ以下のKDでMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約20 nMまたはそれ以下のKDでMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤は、約10 nMまたはそれ以下のKDでMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合する。いくつかの態様において、MET結合剤または抗体は、約1 nMまたはそれ以下のKDでMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合する。
いくつかの態様において、MET結合剤は、第2の結合部位の結合親和性よりも弱い結合親和性を有する第1の結合部位を含む二重特異性剤である。例えば、いくつかの態様において、二重特異性剤は、約0.1 nMから1 nMに及ぶKDでMETを結合してよく、約1 nMから10 nMに及ぶKDでWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合してよい。あるいは二重特異性剤は、約1 nMから10 nMに及ぶKDでMETを結合してよく、約0.1 nMから1 nMに及ぶKDでWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合してよい。いくつかの態様において、二重特異性剤は、約0.1 nMから1 nMに及ぶKDでWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合してよく、約1 nMから10 nMに及ぶKDでMETを結合してよい。あるいは二重特異性剤は、約1 nMから10 nMに及ぶKDでWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合してよく、約0.1 nMから1 nMに及ぶKDでMETを結合してよい。いくつかの態様において、2つの結合部位間の親和性の差異は、約2倍もしくはそれ以上、約3倍もしくはそれ以上、約5倍もしくはそれ以上、約8倍もしくはそれ以上、約10倍もしくはそれ以上、約15倍もしくはそれ以上、約30倍もしくはそれ以上、約50倍もしくはそれ以上、または約100倍もしくはそれ以上であってよい。いくつかの態様において、METに対する抗原結合部位の少なくとも1つのCDRにおける少なくとも1つのアミノ酸残基は、MET結合部位の親和性が改変されるように、異なるアミノ酸で置換される。いくつかの態様において、MET結合部位の親和性は増加する。いくつかの態様において、MET結合部位の親和性は減少する。いくつかの態様において、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の結合部位の両方の親和性は改変される。2つの結合部位の親和性の調節は、二重特異性剤の生物学的活性に影響を与えうる。例えば、METまたはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分に対する結合部位の親和性を低下させることは、所望の効果、例えば結合剤の毒性の低下または結合剤の治療指数の増加を及ぼしうる。
非限定的な例として、二重特異性剤は、(a) 約0.1 nM〜約10 nMのKDでヒトMETを結合する第1の結合部位、および(b) 約0.1 nM〜約20 nM、約0.5 nM〜約20 nM、約1.0 nM〜10 nMのKDで1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する第2の結合部位を含みうる。
ある種の態様において、MET結合剤は約1 μMもしくはそれ以下、約100 nMもしくはそれ以下、約40 nMもしくはそれ以下、約20 nMもしくはそれ以下、約10 nMもしくはそれ以下、約1 nMもしくはそれ以下または約0.1 nMもしくはそれ以下の半最大有効濃度(EC50)でMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分(例えば、WNTタンパク質またはFZDタンパク質)を結合する。ある種の態様において、MET結合剤は約1 μMもしくはそれ以下、約100 nMもしくはそれ以下、約40 nMもしくはそれ以下、約20 nMもしくはそれ以下、約10 nMもしくはそれ以下、約1 nMもしくはそれ以下または約0.1 nMもしくはそれ以下の半最大有効濃度(EC50)でMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分(例えば、WNTタンパク質またはFZDタンパク質)を結合する。
ある種の態様において、MET結合剤は抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は組み換え抗体である。いくつかの態様において、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの態様において、抗体はキメラ抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト化抗体である。いくつかの態様において、抗体はヒト抗体である。いくつかの態様において、抗体はIgA、IgD、IgE、IgGまたはIgM抗体である。ある種の態様において、抗体はIgG1抗体である。ある種の態様において、抗体はIgG2抗体である。ある種の態様において、抗体は、抗原結合部位を含む抗体断片である。いくつかの態様において、抗体は二重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は一価抗体である。いくつかの態様において、抗体は単一特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は多重特異性抗体である。いくつかの態様において、抗体は細胞傷害性部分に結合される。いくつかの態様において、抗体は単離される。いくつかの態様において、抗体は実質的に純粋である。
本発明の結合剤は、当技術分野において公知の任意の方法により特異的結合についてアッセイすることができる。使用できるイムノアッセイ法には、例えば、Biacore分析、FACS分析、免疫蛍光、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ法、ELISA法、「サンドイッチ」イムノアッセイ法、免疫沈降アッセイ法、沈殿反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ法、凝集アッセイ法、補体固定アッセイ法、免疫放射線測定法、蛍光イムノアッセイ法、均一時間分解蛍光アッセイ(HTRF)法およびプロテインAイムノアッセイ法などの技法を用いた、競合的アッセイ系および非競合的アッセイ系が含まれるが、これらに限定されることはない。このようなアッセイ法は日常的なものであり、当技術分野において周知である(例えば、Ausubel et al., Editors, 1994-present, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照のこと)。
例えば、剤とヒトMETとのおよび/またはWNT経路の構成成分(例えば、FZDタンパク質もしくはWNTタンパク質)との特異的結合は、ELISA法を用いて決定されうる。ELISAアッセイ法には抗原を調製する段階、96ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングする段階、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ)基質などの検出可能な化合物を結合させた結合剤をウェルに添加する段階、一定時間インキュベートする段階、および抗原に結合した結合剤の存在を検出する段階が含まれる。いくつかの態様において、結合剤に検出可能な化合物を結合させないが、その代わりに、結合剤を認識する第2の抗体(例えば、抗Fc抗体)であって、検出可能な化合物を結合させた該抗体がウェルに添加される。いくつかの態様において、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、結合剤をウェルにコーティングしてもよく、コーティングされたウェルに抗原を添加した後に、検出可能な化合物を結合させた第2の抗体を添加してもよい。当業者であれば、検出されたシグナルを増加させるためにパラメータを変えられること、および当技術分野において公知のELISAの他の変化形に精通しているであろう。
別の例において、剤とヒトMETとのおよび/またはWNT経路の構成成分(例えば、FZDタンパク質もしくはWNTタンパク質)との特異的結合は、FACSを用いて決定されうる。FACSスクリーニングアッセイ法には、融合タンパク質として抗原を発現するcDNA構築体を作出する段階、構築体を細胞にトランスフェクションする段階、細胞の表面に抗原を発現させる段階、結合剤とトランスフェクションされた細胞とを混合する段階、および一定時間インキュベートする段階が含まれうる。結合剤が結合した細胞は、検出可能な化合物を結合させた二次抗体(例えば、PE結合抗Fc抗体)およびフローサイトメーターを用いることによって特定されうる。当業者であれば、検出されたシグナルを最適化するためにパラメータを変えられること、およびスクリーニング(例えば、ブロッキング抗体のスクリーニング)を増強しうるFACSの他の変化形に精通しているであろう。
抗原(例えば、METまたはWNT経路の構成成分)に対する結合剤の結合親和性および結合剤-標的相互作用のオフ速度(off-rate)は、競合的結合アッセイ法によって決定することができる。競合的結合アッセイ法の一例は、漸増量の非標識抗原の存在下で、標識された抗原/標的(例えば、3Hもしくは125I)またはその断片もしくは変種と関心対象の結合剤とをインキュベーションした後に、標識された抗原/標的に結合した抗体を検出する段階を含む、ラジオイムノアッセイ法である。抗原/標的に対する結合剤の親和性および結合オフ速度は、スキャッチャードプロット分析によってデータから決定することができる。いくつかの態様において、Biacore動態解析を用いて、抗原(例えば、METまたはWNT経路の構成成分)を結合する結合剤の結合オンおよびオフ速度を決定する。いくつかの態様において、Biacore動態解析は、その表面に固定化された抗原/標的(例えば、METまたはWNT経路の構成成分)を有するチップからの結合剤の結合および解離を解析する段階を含む。いくつかの態様において、Biacore動態解析は、その表面に固定化された結合剤を有するチップからの抗原または標的(例えば、METまたはWNT経路の構成成分)の結合および解離を解析する段階を含む。
本発明は、特異的にMETを結合し、WNT経路の少なくとも1種の構成成分を結合し、またはMETおよびWNT経路の少なくとも1種の構成成分の両方を結合するポリペプチドを提供する。いくつかの態様において、ポリペプチドはヒトMETを結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドはヒトMETおよびマウスMETを結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドはヒトMETを結合するが、マウスMETを結合しない。いくつかの態様において、ポリペプチドはヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは1種または複数種のヒトFZDタンパク質を結合する。いくつかの態様において、ポリペプチドは1種または複数種のヒトWNTタンパク質を結合する。いくつかの態様において、ポリペプチド多量体は、METおよびヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する。いくつかの態様において、ポリペプチド多量体は、METおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質を結合する。いくつかの態様において、ポリペプチド多量体は、METおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を結合する。
いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、およびSEQ ID NO:114からなる群より選択される配列を含んだポリペプチドを含む。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、およびSEQ ID NO:52からなる群より選択される配列を含んだポリペプチドをさらに含む。
ある種の態様において、MET結合剤はMETとの特異的結合について、SEQ ID NO:7を含んだ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8を含んだ軽鎖可変領域を含む抗体または二重特異性剤と競合する。ある種の態様において、MET結合剤はMETとの特異的結合について、SEQ ID NO:94を含んだ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:95を含んだ軽鎖可変領域を含む抗体または二重特異性剤と競合する。ある種の態様において、MET結合剤はヒトMETとの特異的結合について、抗体73R009と競合する。ある種の態様において、MET結合剤はヒトMETとの特異的結合について、抗体73R009のヒト化バージョンと競合する。ある種の態様において、MET結合剤はヒトMETとの特異的結合について、抗体73R010 (73R009 H12L7)と競合する。ある種の態様において、MET結合剤はヒトMETとの特異的結合について、抗体73R009の一価バージョンと競合する。いくつかの態様において、MET結合剤はヒトMETとの特異的結合について、抗体73R009の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んだ二重特異性剤と競合する。いくつかの態様において、MET結合剤はヒトMETとの特異的結合について、抗体73R009のヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んだ二重特異性剤と競合する。いくつかの態様において、MET結合剤はヒトMETとの特異的結合について、抗体73R010 (73R009 H12L7)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んだ二重特異性剤と競合する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETとの特異的結合について、インビトロ競合的結合アッセイ法において本明細書において記述されるMET結合剤と競合する。いくつかの態様において、METはヒトMETである。いくつかの態様において、METはマウスMETである。
ある種の態様において、MET結合剤は本発明の抗体または二重特異性剤と、MET上の、同じエピトープ、または本質的に同じエピトープを結合する。別の態様において、MET結合剤は、本発明の抗体または二重特異性剤が結合するMET上のエピトープと重複するMET上のエピトープを結合する抗体である。ある種の態様において、MET結合剤は抗体73R009、73R009のヒト化バージョン、または抗体73R010 (73R009 H12L7)と、MET上の、同じエピトープ、または本質的に同じエピトープを結合する。別の態様において、MET結合剤は、抗体73R009、73R009のヒト化バージョン、または抗体73R010 (73R009 H12L7)が結合するMET上のエピトープと重複するMET上のエピトープを結合する抗体または結合剤である。ある種の態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B06、315B07、または315B09と、MET上の、同じエピトープ、または本質的に同じエピトープを結合する。別の態様において、MET結合剤は、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09が結合するMET上のエピトープと重複するMET上のエピトープを結合する抗体または結合剤である。
ある種の態様において、MET結合剤は、(例えば、競合的結合アッセイ法において) METとの特異的結合について、抗体73R009、73R009の一価バージョン、抗体73R009のヒト化バージョン、または抗体73R010 (73R009 H12L7)と競合する剤である。ある種の態様において、MET結合剤は、(例えば、競合的結合アッセイ法において) METとの特異的結合について、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09と競合する剤である。
ある種の態様において、結合剤は1種または複数種のWNTタンパク質との特異的結合について、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09と競合する。いくつかの態様において、結合剤または抗体は1種または複数種のWNTタンパク質との特異的結合について、インビトロ競合的結合アッセイ法において本明細書において記述される剤と競合する。いくつかの態様において、1種または複数種のWNTタンパク質はヒトWNTタンパク質である。
ある種の態様において、結合剤(例えば、抗体)は本発明の二重特異性剤と、1種または複数種のWNTタンパク質上の、同じ標的、または本質的に同じ標的を結合する。いくつかの態様において、結合剤は、本発明の二重特異性剤が結合する1種または複数種のWNTタンパク質上の標的と重複する1種または複数種のWNTタンパク質上の標的を結合する。ある種の態様において、結合剤は二重特異性剤315B06、315B07、または315B09と、1種または複数種のWNTタンパク質上の、同じ標的、または本質的に同じ標的を結合する。別の態様において、結合剤は、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09が結合するWNT上の標的と重複する1種または複数種のWNTタンパク質上の標的を結合する。
ある種の態様において、結合剤は、(例えば、競合的結合アッセイ法において) 1種または複数種のWNTタンパク質との特異的結合について、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09と競合する剤である。
ある種の態様において、結合剤は、(例えば、競合的結合アッセイ法において) METおよび/または1種もしくは複数種のWNTタンパク質との特異的結合について、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09と競合する剤である。
ある種の態様において、本明細書において記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)は、METを結合し、MET活性を調節する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METアンタゴニストであり、MET活性を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤は、MET活性を阻害する。MET活性は、MET/HGF相互作用の阻害もしくは遮断、MET二量体化の阻害もしくは遮断、MET排出(shedding)の増加、MET内部移行の増加、および/またはMET分解の増加を含むが、これらに限定されない、いくつかの異なる機構によって阻害されうる。いくつかの態様において、MET結合剤はMET活性化を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETリン酸化を阻害および/または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETアンタゴニストであり、腫瘍成長を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤は腫瘍成長を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETアンタゴニストであり、血管新生を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤は血管新生を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETアンタゴニストであり、EMTを阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はEMTを阻害する。
ある種の態様において、本明細書において記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)は、1種または複数種のヒトWNTタンパク質を結合し、WNT経路の活性を調節する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路アンタゴニストであり、WNT経路の活性を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路の活性を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路アンタゴニストであり、β-カテニン活性を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はβ-カテニン活性を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路アンタゴニストであり、腫瘍成長を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路アンタゴニストであり、腫瘍細胞の分化を誘導する。いくつかの態様において、MET結合剤は腫瘍細胞の分化を誘導する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路アンタゴニストであり、がん幹細胞の分化を誘導する。いくつかの態様において、MET結合剤はがん幹細胞の分化を誘導する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路アンタゴニストであり、腫瘍細胞上での分化マーカーの発現を誘導する。いくつかの態様において、MET結合剤は腫瘍細胞上での分化マーカーの発現を誘導する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路アンタゴニストであり、がん幹細胞上での分化マーカーの発現を誘導する。いくつかの態様において、MET結合剤はがん幹細胞上での分化マーカーの発現を誘導する。
ある種の態様において、本明細書において記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)は、ヒトMETを結合する二重特異性剤であり、MET活性を調節する。ある種の態様において、本明細書において記述されるMET結合剤は、ヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する二重特異性剤であり、WNT活性を調節する。ある種の態様において、本明細書において記述されるMET結合剤は、ヒトMETおよびヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する二重特異性剤であり、MET活性およびWNT経路の活性の両方を調節する。いくつかの態様において、二重特異性剤はMETアンタゴニストかつWNT経路アンタゴニストであり、MET活性およびWNT経路の活性の両方を阻害する。いくつかの態様において、二重特異性剤はMETアンタゴニストかつWNT経路アンタゴニストであり、METシグナル伝達およびWNT経路シグナル伝達を阻害する。いくつかの態様において、二重特異性剤はMETアンタゴニストかつWNT経路アンタゴニストであり、腫瘍成長を阻害する。
ある種の態様において、MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)は、METのアンタゴニストである。いくつかの態様において、MET結合剤はMETのアンタゴニストであり、MET活性を阻害する。ある種の態様において、MET結合剤はMET活性を、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%だけ阻害する。ある種の態様において、ヒトMET活性を阻害するMET結合剤は、抗体73R009、抗体73R009のヒト化バージョン、または抗体73R010 (73R009 H12L7)を含む。ある種の態様において、ヒトMET活性を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の一価バージョンまたは抗体73R010 (73R009 H12L7)を含む。ある種の態様において、ヒトMET活性を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、抗体73R009のヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、ヒトMET活性を阻害するMET結合剤は、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09である。
ある種の態様において、MET結合剤はWNT経路のアンタゴニストである。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路のアンタゴニストであり、WNT経路の活性を阻害する。ある種の態様において、MET結合剤はWNT経路の活性を、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または約100%だけ阻害する。ある種の態様において、ヒトWNT経路の活性を阻害するMET結合剤は、抗体73R009、抗体73R009のヒト化バージョン、または抗体73R010 (73R009 H12L7)を含む。ある種の態様において、ヒトWNT経路の活性を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の一価バージョンまたは抗体73R010 (73R009 H12L7)を含む。ある種の態様において、ヒトWNT経路の活性を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、抗体73R009のヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある種の態様において、ヒトWNT経路の活性を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の抗原結合部位、抗体73R009のヒト化バージョンの抗原結合部位、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の抗原結合部位を含んだ二重特異性剤である。ある種の態様において、ヒトWNT経路の活性を阻害するMET結合剤は、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09である。
ある種の態様において、MET結合剤はMETと肝細胞成長因子(HGF)との結合を阻害する。ある種の態様において、MET結合剤はMETとHGFとの結合を、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%だけ阻害する。ある種の態様において、ヒトMETとHGFとの結合を阻害するMET結合剤は、抗体73R009、抗体73R009のヒト化バージョン、または抗体73R010 (73R009 H12L7)である。ある種の態様において、ヒトMETとHGFとの結合を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の一価バージョンまたは抗体73R010 (73R009 H12L7)である。ある種の態様において、ヒトMETとHGFとの結合を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の抗原結合部位、抗体73R009のヒト化バージョンの抗原結合部位、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の抗原結合部位を含んだ二重特異性剤である。ある種の態様において、ヒトMETとHGFとの結合を阻害するMET結合剤は、抗体73R009の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、抗体73R009のヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んだ二重特異性剤である。ある種の態様において、ヒトMETとHGFとの結合を阻害するMET結合剤は、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09である。
ある種の態様において、MET結合剤(例えば、二重特異性剤)は、1種または複数種のWNTタンパク質と1種または複数種のFZDタンパク質との結合を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤(例えば、二重特異性剤)は、1種または複数種のWNTタンパク質とFZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、および/またはFZD10との結合を阻害する。いくつかの態様において、MET結合剤(例えば、二重特異性剤)は、1種または複数種のWNTタンパク質とFZD8との結合を阻害する。ある種の態様において、MET結合剤は1種または複数種のWNTタンパク質と少なくとも1種のFZD受容体との結合を、少なくとも約10%、少なくとも約25%、少なくとも約50%、少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%だけ阻害する。ある種の態様において、1種または複数種のヒトWNTタンパク質と少なくとも1種のFZD受容体との結合を阻害するMET結合剤は、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09である。
MET結合剤(または候補MET結合剤)がMET活性化を阻害するかどうかを決定するためのインビボおよびインビトロでのアッセイ法は、当技術分野において公知である。例えば、ヒトHGFとMETとの結合は、METのチロシンリン酸化およびMETシグナル伝達経路の活性化をもたらす。それゆえ、HGFに応答性であるヒト細胞は、METのリン酸化ならびに分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)およびAKTのような下流MET経路の構成成分のリン酸化を分析することにより、HGF誘導性のMET活性化の阻害を評価するために用いられうる。MET結合剤(または候補MET結合剤)がMET二量体化を阻害するか、MET分解を促進するか、および/またはMET「排出」を促進するかどうかを決定するためのアッセイ法も、当技術分野において公知である。
MET結合剤(または候補MET結合剤)がWNT経路の活性化またはシグナル伝達を阻害するかどうかを決定するためのインビボおよびインビトロでのアッセイ法は、当技術分野において公知である。例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に複数コピーのTCF結合ドメインを含有するTCF/Lucレポーターベクターを利用した、細胞に基づくルシフェラーゼレポーターアッセイ法を用いて、インビトロでβ-カテニンシグナル伝達レベルを測定することができる(Gazit et al., 1999, Oncogene, 18; 5959-66; TOPflash, Millipore, Billerica MA)。結合剤の存在下における1種または複数種のWNTタンパク質(例えば、トランスフェクション細胞により発現されたWNTまたはWNT馴化培地により供与されたWNT)の存在下でのβ-カテニンシグナル伝達のレベルを、結合剤の非存在下でのシグナル伝達のレベルと比較する。TCF/Lucレポーターアッセイ法に加えて、β-カテニンシグナル伝達に及ぼす結合剤(または候補剤)の効果は、c-myc (He et al., 1998, Science, 281:1509-12)、サイクリンD1 (Tetsu et al., 1999, Nature, 398:422-6)、および/またはフィブロネクチン(Gradl et al. 1999, Mol. Cell Biol., 19:5576-87)のような、β-カテニン調節遺伝子の発現のレベルに及ぼす剤の効果を測定することによりインビトロでまたはインビボで測定されうる。ある種の態様において、β-カテニンシグナル伝達に及ぼす結合剤の効果はまた、ディシブルド(Dishevelled)-1、ディシブルド-2、ディシブルド-3、LRP5、LRP6、および/またはβ-カテニンのリン酸化状態に及ぼす剤の効果を測定することにより評価されうる。
ある種の態様において、MET結合剤は以下の効果: 腫瘍細胞の増殖を阻害する効果、腫瘍成長を阻害する効果、腫瘍の腫瘍形成性を低減する効果、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減する効果、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減することにより腫瘍の腫瘍形成性を低減する効果、腫瘍細胞の細胞死を誘発する効果、腫瘍内の細胞を分化誘導する効果、腫瘍形成性細胞を非腫瘍形成性状態に分化させる効果、がん幹細胞を分化させる効果、腫瘍細胞における分化マーカーの発現を誘導する効果、がん幹細胞における分化マーカーの発現を誘導する効果、腫瘍細胞の転移を抑止する効果、血管新生を阻害する効果、腫瘍細胞の生存を低下させる効果、または上記の任意の組み合わせの1つまたは複数を有する。
ある種の態様において、MET結合剤は、腫瘍成長を阻害することができる。ある種の態様において、MET結合剤は、インビボで(例えば、異種移植マウスモデルで、および/またはがんを有するヒトで)腫瘍成長を阻害することができる。ある種の態様において、腫瘍成長は非処置腫瘍と比べて少なくとも約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約50倍、約100倍、または約1000倍阻害される。
ある種の態様において、MET結合剤は、腫瘍の腫瘍形成性を低減することができる。ある種の態様において、MET結合剤は、マウス異種移植モデルのような、動物モデルにおいてがん幹細胞を含む腫瘍の腫瘍形成性を低減することができる。ある種の態様において、MET結合剤は、腫瘍内のがん幹細胞の数または頻度を減少させることにより腫瘍の腫瘍形成性を低減することができる。ある種の態様において、腫瘍内のがん幹細胞の数または頻度は、少なくとも約2倍、約3倍、約5倍、約10倍、約50倍、約100倍、または約1000倍だけ低減される。ある種の態様において、がん幹細胞の数または頻度の低減は、動物モデルを用いた限界希釈アッセイ法によって判定される。腫瘍内のがん幹細胞の数または頻度の低減を判定するために限界希釈アッセイ法を用いることに関するさらなる例および手引きは、例えば、国際公開番号WO 2008/042236; 米国特許出願公開第2008/0064049号; および米国特許出願公開第2008/0178305号において見出すことができる。
ある種の態様において、本明細書において記述されるMET結合剤は、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間または少なくとも約2週間の、マウス、カニクイザルまたはヒトでの循環血中半減期を有する。ある種の態様において、MET結合剤は、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間または少なくとも約2週間の、マウス、カニクイザルまたはヒトでの循環血中半減期を有するIgG (例えば、IgG1またはIgG2)抗体である。ある種の態様において、MET結合剤は、少なくとも約2時間、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間または少なくとも約2週間の、マウス、カニクイザルまたはヒトでの循環血中半減期を有するIgG (例えば、IgG1またはIgG2)定常領域を少なくとも1つ含む剤である。ポリペプチド、可溶性受容体、および/または抗体のような剤の半減期を増加させる(または減少させる)方法は、当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環血中半減期を増加させる公知の方法には、pH 6.0で抗体と新生児型Fc受容体(FcRn)とのpH依存的な結合を増加させるFc領域における変異の導入が含まれる(例えば、米国特許出願公開第2005/0276799号、同第2007/0148164号および同第2007/0122403号を参照のこと)。Fc領域を欠く抗体断片の循環血中半減期を増加させる公知の方法には、PEG化のような技法が含まれる。
いくつかの態様において、本明細書において記述される結合剤は抗体である。ポリクローナル抗体は任意の公知の方法によって調製することができる。いくつかの態様において、ポリクローナル抗体は、複数回の皮下注射または腹腔内注射により関心対象の抗原(例えば、精製されたペプチド断片、完全長組み換えタンパク質または融合タンパク質)で動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、ヤギ、またはロバ)を免疫することによって産生される。抗原は任意で、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)または血清アルブミンのような担体に結合されてもよい。抗原(担体タンパク質ありまたはなしの)を滅菌食塩水中に希釈し、通常、アジュバント(例えば、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント)と組み合わせて安定な乳濁液を形成させる。十分な時間の後、免疫した動物から、通常は血液または腹水からポリクローナル抗体を回収する。ポリクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および透析を含むが、これらに限定されない、当技術分野において標準的な方法にしたがって血清または腹水から精製することができる。
いくつかの態様において、結合剤はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は当業者に公知のハイブリドーマ法を用いて調製することができる(例えば、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256:495-497を参照のこと)。いくつかの態様において、ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスターまたは他の適切な宿主動物を上述のように免疫して、免疫用の抗原を特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発させる。いくつかの態様において、リンパ球はインビトロで免疫することができる。いくつかの態様において、免疫用の抗原はヒトタンパク質またはその部分であることができる。いくつかの態様において、免疫用の抗原はマウスタンパク質またはその部分であることができる。
免疫の後、リンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて適当な骨髄腫細胞株と融合させる。当技術分野において公知のように特殊培地を用いてハイブリドーマ細胞を選択するが、融合していないリンパ球および骨髄腫細胞はこの選択過程を生き延びられない。選択された抗原に対して特異的に作製されたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、免疫沈降法、免疫ブロッティング法およびインビトロ結合アッセイ法(例えば、フローサイトメトリー、FACS、ELISAおよびラジオイムノアッセイ法)を含むが、これらに限定されない、さまざまな技法によって特定することができる。ハイブリドーマは標準的な方法(J.W. Goding, 1996, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 3rd Edition, Academic Press, San Diego, CA)を用いるインビトロの培養で、またはインビボで動物中の腹水腫瘍として増殖することができる。モノクローナル抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動および透析を含むが、これらに限定されない、当技術分野において標準的な方法にしたがって培地または腹水から精製することができる。
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は当業者に公知であるように組み換えDNA技法を用いて作出することができる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるRT-PCRによって単離し、それらの配列を、標準的な技法を用いて決定する。重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを次いで、トランスフェクションされていなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌(E. coli)、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞または骨髄腫細胞のような宿主細胞へトランスフェクションされた場合にモノクローナル抗体を産生する適当な発現ベクターへクローニングする。
ある種の他の態様において、組み換えモノクローナル抗体またはその断片を、所望の種の可変ドメインまたはCDRを発現するファージディスプレイライブラリから単離することができる(例えば、McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628; およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597を参照のこと)。いくつかの態様において、組み換えモノクローナル抗体またはその断片を、所望の種の可変ドメインまたはCDRを発現する哺乳動物細胞ディスプレイライブラリから単離することができる(例えば、米国特許出願公開第2011/0287979号を参照のこと)。
モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、例えば、組み換えDNA技術を用いることによって改変し、代わりの抗体または代わりの二重特異性剤を作製することができる。いくつかの態様において、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、例えば、ヒト抗体のそれらの領域に置き換えてキメラ抗体を作製することができ、または非免疫グロブリンポリペプチドに置き換えて融合抗体を作製することができる。いくつかの態様において、定常領域を切断または除去してモノクローナル抗体の望ましい抗体断片を作製する。可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
いくつかの態様において、結合剤はヒト化抗体である。典型的には、ヒト化抗体は、CDR由来の残基が当業者に公知の方法を用いて、所望の特異性、親和性および/または結合能力を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど)のCDR由来の残基により置き換えられている、ヒト免疫グロブリンである。いくつかの態様において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域残基が、所望の特異性、親和性および/または結合能力を有する非ヒト種由来の抗体における対応残基で置き換えられる。いくつかの態様において、ヒト化抗体を、Fvフレームワーク領域中および/または置き換えられた非ヒト残基内のさらなる残基の置換によりさらに改変して、抗体の特異性、親和性および/または能力を改良および最適化することができる。一般に、ヒト化抗体は、フレームワーク領域の全て、または実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものであるのに対して、非ヒト免疫グロブリンに対応するCDRの全て、または実質的に全てを含んだ少なくとも1つ、および典型的には2つまたは3つの可変ドメイン領域の実質的に全てを含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンの少なくとも一部を含むことができる。ある種の態様において、そのようなヒト化抗体は、ヒト対象に投与された時に抗原性およびHAMA (ヒト抗マウス抗体)反応を低減しうるので治療的に用いられる。当業者は、公知の技法にしたがって免疫原性の低下した機能的なヒト化抗体を得ることができるであろう(例えば、米国特許第5,225,539号; 同第5,585,089号; 同第5,693,761号; および同第5,693,762号を参照のこと)。
ある種の態様において、結合剤はヒト抗体である。ヒト抗体は当技術分野において公知のさまざまな技法を用いて直接調製することができる。いくつかの態様において、ヒト抗体は、インビトロで免疫された不死化ヒトBリンパ球から、または免疫個体から単離されたリンパ球から作製されうる。どちらの場合にも、標的抗原に対して作製された抗体を産生する細胞を、作製かつ単離することができる(例えば、Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77; Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147:86-95; ならびに米国特許第5,750,373号; 同第5,567,610号; および同第5,229,275号を参照のこと)。いくつかの態様において、ヒト抗体を発現するファージライブラリーから、ヒト抗体を選択することができる(Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581)。あるいは、ファージディスプレイ技術を用いて、非免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体断片を産生してもよい。抗体ファージライブラリの作出および使用のための技法は同様に、米国特許第5,969,108号; 同第6,172,197号; 同第5,885,793号; 同第6,521,404号; 同第6,544,731号; 同第6,555,313号; 同第6,582,915号; 同第6,593,081号; 同第6,300,064号; 同第6,653,068号; 同第6,706,484号; および同第7,264,963号; ならびにRothe et al., 2008, J. Mol. Bio., 376: 1182-1200に記述されている。抗体が特定されたら、鎖シャッフリング(Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783)および部位特異的突然変異誘発法を含むが、これらに限定されない、当技術分野において公知の親和性成熟戦略を利用して、高親和性ヒト抗体を作製してもよい。
いくつかの態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子導入マウスにおいて作出することができる。免疫によって、これらのマウスは、内因性免疫グロブリンを産生せずに、ヒト抗体の全レパートリーを産生することができる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号; 同第5,545,806号; 同第5,569,825号; 同第5,625,126号; 同第5,633,425号; および同第5,661,016号に記述されている。
本発明は二重特異性剤および二重特異性抗体も包含する。二重特異性剤は、少なくとも2種の異なる標的またはエピトープを特異的に認識かつ結合することができる。異なる標的は、同じ分子内(例えば、単一のタンパク質上に2つの標的)であってよく、または異なる分子上(例えば、1つのタンパク質上に1つの標的かつもう1つのタンパク質上に2つめの標的)であってよい。いくつかの態様において、二重特異性剤または二重特異性抗体は、個別の剤または抗体と比べてまたは2腫の剤の混合物と比べて効力の増強を有する。いくつかの態様において、二重特異性剤または二重特異性抗体は、個別の剤と比べてまたは2種以上の剤の組み合わせと比べて毒性の低減を有する。いずれの結合剤も特有の薬物動態(PK) (例えば、循環血中半減期)を持ちうることが当業者には公知である。いくつかの態様において、二重特異性剤または二重特異性抗体は、2種の個別の結合剤が異なるPKプロファイルを有する2種の活性な結合剤のPKを同調させる能力を有する。いくつかの態様において、二重特異性剤または二重特異性抗体は、2種の結合剤の作用を共通の領域(例えば、腫瘍および/または腫瘍環境)中に集中させる能力を有する。いくつかの態様において、二重特異性剤または二重特異性抗体は、2種の結合剤の作用を共通の標的(例えば、腫瘍または腫瘍細胞)へ集中させる能力を有する。いくつかの態様において、二重特異性剤または二重特異性抗体は、2種の結合剤の作用を2種以上の生物学的経路または機能へ標的化する能力を有する。
ある種の態様において、二重特異性抗体は、METおよび第2の標的を特異的に結合する。ある種の態様において、二重特異性抗体は、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒトMETおよび1種または複数種のヒトFZDタンパク質を特異的に結合する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒト化抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、ヒト抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、キメラ抗体である。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、がん幹細胞数または頻度を低減する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、毒性および/または副作用の減少を有する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、2種の個別の抗体の混合物または単剤としての抗体と比べて毒性および/または副作用の減少を有する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、治療指数の増加を有する。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、2種の個別の抗体の混合物または単剤としての抗体と比べて治療指数の増加を有する。
いくつかの態様において、二重特異性抗体は、METを発現する細胞に細胞防御機構を集中させるために、ヒトMETを特異的に認識かつ結合することができるだけでなく、白血球上のエフェクタ分子(例えば、CD2、CD3、CD28、CD80もしくはCD86)またはFc受容体(例えば、CD64、CD32もしくはCD16)のような、第2の抗原標的も特異的に認識かつ結合することができる。いくつかの態様において、二重特異性抗体を用いて、特定の標的抗原を発現する細胞に細胞傷害剤を向けることができる。これらの抗体は抗原結合部位(例えば、ヒトMETに対する)、および細胞傷害剤または放射性核種キレート剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTAもしくはTETAを結合する第2の部位を保有する。
二重特異性抗体を作出するための技法は当業者によって知られており、例えば、Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539; Brennan et al., 1985, Science, 229:81; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymol., 121: 120; Traunecker et al., 1991, EMBO J., 10:3655-3659; Shalaby et al., 1992, J. Exp. Med., 175:217-225; Kostelny et al., 1992, J. Immunol, 148: 1547-1553; Gruber et al., 1994, J. Immunol, 152:5368; 米国特許第5,731,168号; 国際公開番号WO 2009/089004; および米国特許出願公開第2011/0123532号を参照されたい。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、2つの重鎖間の界面の一部であるアミノ酸の改変を有する重鎖定常領域を含む。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、「ノブ・イントゥ・ホール」戦略を用いて作製することができる(例えば、米国特許第5,731,168号; Ridgway et. al., 1996, Prot. Engin., 9:617-621を参照のこと)。時には、「ノブ」および「ホール」という専門用語は、「突起」および「空洞」という用語に置き換えられる。いくつかの態様において、二重特異性抗体は、重鎖間でジスルフィド結合を形成できない可変蝶番領域を含みうる(例えば、WO 2006/028936参照)。いくつかの態様において、改変は、静電相互作用の改変を引き起こすアミノ酸の変化を含みうる。いくつかの態様において、改変は、疎水性/親水性相互作用の改変を引き起こすアミノ酸の変化を含みうる(例えば、米国特許出願第2011/0123532号を参照されたい)。
二重特異性抗体は、無傷の抗体または抗原結合部位を含む抗体断片であることができる。三価以上の結合価を有する抗体も企図される。例えば、三重特異性抗体を調製することができる(Tutt et al., 1991, J. Immunol., 147:60)。したがって、ある種の態様において、METおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分に対する抗体は多重特異性である。
ある種の態様において、本明細書において記述される抗体(または他のポリペプチド)は単一特異性であってよい。ある種の態様において、抗体が含む1つまたは複数の抗原結合部位のそれぞれが、異なるタンパク質上の相同なエピトープを結合することができる(または結合する)。
ある種の態様において、結合剤は抗体断片を含む。抗体断片は無傷の抗体とは異なる機能または能力を有することができ; 例えば、抗体断片は増大した腫瘍浸透性を有することができる。無傷の抗体のタンパク質分解消化を含むが、これに限定されない、さまざまな技法が抗体断片の産生で公知である。いくつかの態様において、抗体断片は抗体分子のペプシン消化によって産生されるF(ab')2断片を含む。いくつかの態様において、抗体断片は、F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって作出されたFab断片を含む。他の態様において、抗体断片はパパインおよび還元剤による抗体分子の処理によって作出されたFab断片を含む。ある種の態様において、抗体断片は組み換えに技法を用いて産生される。いくつかの態様において、抗体断片はFvまたは一本鎖Fv (scFv)断片を含む。Fab、FvおよびscFv抗体断片は大腸菌または他の宿主細胞内で発現させ、大腸菌または他の宿主細胞から分泌させることができ、したがって、これらの断片の大量産生が可能である。いくつかの態様において、抗体断片は、本明細書において論じられるように抗体ファージライブラリから単離される。例えば、Fab発現ライブラリの構築(Huse et al., 1989, Science, 246: 1275-1281)のための方法を用いて、METおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分、またはその誘導体、断片、類似体もしくは相同体に対する所望の特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ有効な特定を可能にすることができる。いくつかの態様において、抗体断片は直鎖状の抗体断片である。ある種の態様において、抗体断片は単一特異性または二重特異性である。ある種の態様において、結合剤はscFvである。METまたはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分に特異的な一本鎖抗体の産生のためにさまざまな技法を用いることができる。
さらに、とりわけ抗体断片の場合には、その血清中半減期を変化させる(例えば増加または減少させる)ために抗体を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体断片中の適切な領域の変異による、抗体断片中へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、またはペプチドタグにエピトープを組み込み、これを次いで抗体断片のいずれかの端にもしくは真ん中に(例えば、DNAもしくはペプチド合成によって)融合することにより行うことができる。
ヘテロ結合体抗体も本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は2種類の共有結合した抗体から構成される。例えば、免疫細胞を不必要な細胞に標的化するために、そのような抗体が提案されている(例えば、米国特許第4,676,980号を参照のこと)。ヘテロ結合体抗体は、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学における公知の方法を用いてインビトロで調製できることも企図される。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いてまたはチオエーテル結合を形成させることによって構築することができる。この目的に適した試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル-4-メルカプトブチリミデートが挙げられる。
本発明の目的のためには、改変された剤が、剤と標的(すなわち、ヒトMETまたはヒトWNTタンパク質)との会合を提供する任意のタイプの領域を含みうることを理解されたい。いくつかの態様において、前記領域は、液性反応の開始および所望の抗原に対する免疫グロブリンの作出を誘導できる、任意のタイプの哺乳動物のものを含んでもまたはそれに由来してもよい、可変領域である。したがって、改変抗体の可変領域は、例えば、ヒト、マウス、非ヒト霊長類(例えば、カニクイザル、マカクなど)またはウサギ由来であってよい。いくつかの態様において、改変された免疫グロブリンの可変領域および定常領域の両方がヒトのものである。他の態様において、結合特性を改善するように、または分子の免疫原性を低減するように、適合性を有する抗体(通常、非ヒト供給源に由来する)の可変領域を遺伝子操作することができ、または特異的に調整することができる。この点に関して、移入アミノ酸配列を含めることにより、本発明において有用な可変領域をヒト化することができ、または他の方法で改変することができる。
ある種の態様において、重鎖および軽鎖の両方の可変ドメインを、1つまたは複数のCDRの少なくとも一部の置き換えによって、必要な場合には、部分的なフレームワーク領域の置き換えならびに配列の改変および/または変更によって変更する。CDRは、フレームワーク領域が得られた抗体と同じクラス、さらには同じサブクラスの抗体に由来しうるが、CDRが、異なるクラスの抗体、多くの場合、異なる種からの抗体に由来することが想定される。ある可変ドメインの抗原結合能を別の可変ドメインに移すためには、CDRの全てを、供与側の可変領域からのCDRの全てで置き換えることは必要でない場合がある。むしろ、抗原結合部位の活性を維持するのに必要な残基を移すことのみが必要な場合がある。
可変領域への変化にもかかわらず、当業者であれば、本発明の改変抗体は、天然のまたは変化していない定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の抗体と比較して、望ましい生化学的特徴が得られるように、例えば、腫瘍局在性が増大または血清中半減期が増大するように、定常領域ドメインの1つまたは複数の少なくとも一部が欠失されている、または他の方法で変えられている抗体(例えば、完全長抗体またはその免疫反応性断片)または二重特異性剤を含むことを理解するだろう。いくつかの態様において、改変抗体の定常領域はヒト定常領域を含む。本発明に適合する定常領域への改変は、1つまたは複数のドメイン内の1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失または置換を含む。本明細書において開示された改変抗体および/または二重特異性剤は、3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2もしくはCH3)の1つまたは複数へのおよび/または軽鎖定常ドメイン(CL)への改変または修飾を含んでもよい。いくつかの態様において、1つまたは複数のドメインが改変抗体の定常領域から部分的または全体的に欠失される。いくつかの態様において、改変抗体は、CH2ドメイン全体が除去されているドメイン欠失構築体または変種(ΔCH2構築体)を含む。いくつかの態様において、除かれた定常領域ドメインは、典型的には、存在しない定常領域によって付与される、ある程度の分子可撓性をもたらす短いアミノ酸スペーサー(例えば、10アミノ酸残基)により置換される。
いくつかの態様において、改変抗体または二重特異性剤は、CH3ドメインを抗体の蝶番領域へ直接融合するように遺伝子操作される。他の態様において、蝶番領域と改変されたCH2および/またはCH3ドメインの間にペプチドスペーサーが挿入される。例えば、CH2ドメインが欠失され、かつ残りのCH3ドメイン(改変または未改変)が蝶番領域に5〜20個のアミノ酸スペーサーを用いて連結された、構築体を発現させることができる。このようなスペーサーを付加して、定常ドメインの調節エレメントを遊離状態でアクセス可能に保つこと、または蝶番領域の可撓性を保つことを確実にすることができる。しかしながら、アミノ酸スペーサーは、場合によっては、免疫原性を有することが判明しており、構築体に対する望ましくない免疫反応を誘発しうることに留意すべきである。したがって、ある種の態様において、構築体に付加されるどのスペーサーも、改変抗体の望ましい生化学的特質を維持するように、比較的、非免疫原性であろう。
いくつかの態様において、改変抗体または二重特異性剤は定常ドメインの部分的欠失または少数のもしくは単一のアミノ酸の置換だけを有することができる。例えば、CH2ドメインの選択域における単一のアミノ酸の変異は、Fc結合を大幅に低減し、それによって腫瘍局在性および/または腫瘍浸透性を増大させるのに十分でありうる。同様に、調節しようとする特定のエフェクタ機能(例えば、補体C1q結合)を制御する1つまたは複数の定常領域ドメインの部分を単純に欠失させることが望ましい場合がある。定常領域のこのような部分的欠失は、この定常領域ドメインに関連する他の望ましい機能をそのままにしておく一方で、抗体の選択的特徴(血清中半減期)を改善しうる。さらに、上にも示唆したように、開示された抗体および/または二重特異性剤の定常領域は、得られる構築体のプロファイルを向上させる、1つまたは複数のアミノ酸の変異または置換によって改変されてもよい。この点で、改変抗体の構成および免疫原性プロファイルを実質的に維持する一方で、保存された結合部位(例えば、Fc結合活性)によって提供される活性を妨害することが可能な場合がある。ある種の態様において、改変抗体および/または二重特異性剤は、エフェクタ機能の減少もしくは増加などの望ましい特徴を増強するように、またはさらに多くの細胞毒素もしくは糖鎖の付着部位をもたらすように、定常領域への1つまたは複数のアミノ酸の付加を含んでもよい。
定常領域がいくつかのエフェクタ機能を媒介することが当技術分野において公知である。例えば、補体のC1成分と(抗原に結合した) IgGまたはIgM抗体のFc領域が結合すると補体系が活性化される。補体活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体活性化はまた炎症反応を刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、抗体のFc領域またはFc融合タンパク質は、Fc受容体(FcR)を発現している細胞を結合することができる。IgG (γ受容体)、IgE (ε受容体)、IgA (α受容体)およびIgM (μ受容体)を含む、異なるクラスの抗体に特異的ないくつかのFc受容体がある。抗体と、細胞表面上のFc受容体が結合すると、貪食および抗体コーティング粒子の破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解(抗体依存性細胞傷害またはADCCと呼ばれる)、炎症メディエータの放出、胎盤通過および免疫グロブリン産生の制御を含む、いくつかの重要かつ多様な生物学的反応が誘発される。
ある種の態様において、改変抗体および/または二重特異性剤は変化したエフェクタ機能をもたらし、これが、今度は、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を与える。例えば、いくつかの態様において、定常領域ドメインの(点変異または他の手段を通じた)欠失または不活性化は、血中改変抗体のFc受容体結合を低減し、それによってがん細胞局在性および/または腫瘍浸透性を増大しうる。他の態様において、定常領域の修飾は抗体および/または二重特異性剤の血清中半減期を増大する。他の態様において、定常領域の修飾は抗体および/または二重特異性剤の血清中半減期を低減する。いくつかの態様において、定常領域を修飾して、ジスルフィド結合またはオリゴサッカライド部分を除去する。本発明による定常領域に対する修飾は、当業者に知られる周知の生物化学工学または分子工学の技法を用いて容易に作出されうる。
ある種の態様において、抗体および/または二重特異性剤は、1つまたは複数のエフェクタ機能を有しない。例えば、いくつかの態様において、抗体または二重特異性剤は、ADCC活性を有さず、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)活性を有しない。ある種の態様において、抗体および/または二重特異性剤は、Fc受容体および/または補体因子を結合しない。ある種の態様において、抗体および/または二重特異性剤はエフェクタ機能を有しない。
本発明は、本明細書において記述される、キメラ抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体、もしくはその抗体断片、または二重特異性剤に実質的に相同な変種および等価体をさらに包含する。これらは、例えば、保存的置換変異、すなわち、類似のアミノ酸による1つまたは複数のアミノ酸の置換を含みうる。例えば、保存的置換は、例えば、1つの酸性アミノ酸のもう1つの酸性アミノ酸との置換、1つの塩基性アミノ酸のもう1つの塩基性アミノ酸との置換または1つの中性アミノ酸のもう1つの中性アミノ酸による置換のような、アミノ酸の同じ一般的クラス内の別のアミノ酸との置換をいう。保存的アミノ酸置換によって意図されているものは、当技術分野において周知であり、本明細書において記述されている。
したがって、本発明は、METおよび1種または複数種のWNTタンパク質の両方を特異的に結合する二重特異性剤を含めて、METおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する抗体または二重特異性剤を産生するための方法を提供する。いくつかの態様において、METまたはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する抗体を産生するための方法は、ハイブリドーマ技法を使用する段階を含む。いくつかの態様において、METまたはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する剤あるいはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する二重特異性剤を作出する方法は、ヒトファージディスプレイライブラリをスクリーニングする段階を含む。いくつかの態様において、METまたはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する剤あるいはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する二重特異性剤を作出する方法は、哺乳動物細胞ディスプレイライブラリをスクリーニングする段階を含む。本発明は、METおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する剤を特定する方法をさらに提供する。いくつかの態様において、剤は、METまたはその断片との結合のFACSスクリーニングにより特定される。いくつかの態様において、剤は、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分またはその断片との結合のFACSスクリーニングにより特定される。いくつかの態様において、剤は、METおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分またはその断片の両方との結合のFACSスクリーニングにより特定される。いくつかの態様において、剤は、METとの結合を、ELISAを用いてスクリーニングすることにより特定される。いくつかの態様において、剤は、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分との結合を、ELISAを用いてスクリーニングすることにより特定される。いくつかの態様において、剤は、METおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分との結合を、ELISAを用いてスクリーニングすることにより特定される。いくつかの態様において、剤は、ヒトMETとヒト肝細胞成長因子との結合の遮断のFACSスクリーニングにより特定される。いくつかの態様において、剤は、1種または複数種のWNTタンパク質とヒトFZDタンパク質との結合の遮断のFACSスクリーニングにより特定される。いくつかの態様において、剤は、WNT経路シグナル伝達の阻害または遮断のスクリーニングにより特定される。いくつかの態様において、剤は、MET活性の阻害または遮断のスクリーニングにより特定される。
ある種の態様において、本明細書において記述される抗体および/または二重特異性剤は単離される。ある種の態様において、本明細書において記述される抗体および/または二重特異性剤は、実質的に純粋である。
本発明のいくつかの態様において、MET結合剤はポリペプチドである。ポリペプチドは、METおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する、抗体またはその断片を含む組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであることができる。いくつかの態様において、ポリペプチドは多量体である。いくつかの態様において、ポリペプチドは二量体である。ポリペプチドは、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する、可溶性受容体またはその断片を含む組み換えポリペプチド、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドであることができる。タンパク質の構造または機能にほとんど影響を与えずに本明細書において記述される結合剤のいくつかのアミノ酸配列を変化させられることが当技術分野において認識されよう。したがって、本発明はヒトMETおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分に対する、実質的な活性を示すまたは抗体もしくはその断片の領域を含む、ポリペプチドの変化をさらに含む。いくつかの態様において、MET結合ポリペプチドのアミノ酸配列の変化は欠失、挿入、逆位、繰り返し、および/または他のタイプの置換を含む。
いくつかの態様において、本明細書において記述されるポリペプチドは単離される。いくつかの態様において、本明細書において記述されるポリペプチドは、実質的に純粋である。
ポリペプチド、その類似体および変種は、通常、タンパク質の部分にはない、さらなる化学的部分を含有するようにさらに改変することができる。誘導体化部分は、ポリペプチドの溶解度、生物学的半減期および/または吸収を改善するまたは他の方法で調節することができる。この部分はまた、ポリペプチドおよび変種の任意の望ましくない副作用を低減または除外することもできる。そのような化学的部分の概説は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, Londonにおいて見出すことができる。
本明細書において記述されるポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適当な方法によって産生することができる。そのような方法は、直接的なタンパク質合成法から、ポリペプチド配列をコードするDNA配列の構築と、適当な宿主におけるこれらの配列の発現に及ぶ。いくつかの態様において、DNA配列は、組み換え技術を用いて、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離または合成することによって構築される。任意で、この配列は、その機能的類似体を得るために、部位特異的変異誘発によって変異誘発されてもよい。例えば、Zoeller et al., 1984, PNAS, 81:5662-5066および米国特許第4,588,585号を参照されたい。
いくつかの態様において、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって構築されうる。オリゴヌクレオチドは、望ましいポリペプチドのアミノ酸配列と、関心対象の組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞に好ましいコドンを選択することに基づいて設計することができる。標準的な方法を適用して、関心対象の単離ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳(back-translate)した遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、望ましいポリペプチドの一部をコードする、いくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、核酸連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的なアセンブリのための5'または3'突出部を含有する。
(合成、部位特異的変異誘発または別の方法によって)アセンブルされたら、関心対象の特定のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現ベクターに挿入し、望ましい宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に機能的に連結することができる。適切なアセンブリは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および適当な宿主での生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確認することができる。当技術分野において周知のように、宿主におけるトランスフェクションされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選択された発現宿主において機能する転写発現制御配列および翻訳発現制御配列に機能的に連結されなければならない。
ある種の態様において、ヒトMETおよび/またはWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分に結合する、抗体もしくはその断片または二重特異性剤をコードするDNAを増幅および発現するために、組み換え発現ベクターが用いられる。例えば、組み換え発現ベクターは、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子または昆虫遺伝子に由来する適当な転写調節エレメントおよび/または翻訳調節エレメントに機能的に連結された、抗MET抗体もしくは抗MET抗体およびFZD可溶性受容体を含む二重特異性剤またはその断片のような、MET結合剤のポリペプチド鎖をコードする合成DNA断片またはcDNAに由来するDNA断片を有する複製可能なDNA構築体であることができる。転写単位は、一般的に、(1) 遺伝子発現において調節的な役割を果たす遺伝的エレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、(2) mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに(3) 適切な転写および翻訳の開始配列および終結配列のアセンブリを含む。調節エレメントは、転写を制御するためのオペレーター配列を含むことがある。通常、複製起点によって付与される、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込むことができる。DNA領域は、それらが互いに機能的に関連している場合に、「機能的に連結され」ている。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNAは、ポリペプチド分泌に関与する前駆体としてポリペプチドが発現されるのであれば、ポリペプチドDNAに機能的に連結されており; プロモーターは、コード配列の転写を制御すれば、コード配列に機能的に連結されており; またはリボソーム結合部位は、コード配列が翻訳されるように配置されていれば、コード配列に機能的に連結されている。いくつかの態様において、酵母発現系における使用を目的とした構造エレメントには、宿主細胞により翻訳されるタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。他の態様において、組み換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列もなく発現される状況では、N末端メチオニン残基を含むことがある。この残基は任意で、最終産物を得るために、発現された組み換えタンパク質から後に切断されてもよい。
発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択に依る。多種多様の発現宿主/ベクターの組み合わせを利用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含んだベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9およびその誘導体を含む大腸菌に由来するプラスミド、さらに広い宿主域のプラスミド、例えば、M13、ならびに他の繊維状一本鎖DNAファージが含まれる。
本発明の結合剤(例えば、ポリペプチド)は、1つまたは複数のベクターから発現させることができる。例えば、いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドは1つのベクターにより発現され、かつ軽鎖ポリペプチドは第2のベクターにより発現される。いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、1つのベクターにより発現される。いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドは1つのベクターにより発現され、軽鎖ポリペプチドは第2のベクターにより発現され、かつ可溶性受容体を含むポリペプチドは第3のベクターにより発現される。いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは1つのベクターにより発現され、かつ可溶性受容体を含むポリペプチドは第2のベクターにより発現される。いくつかの態様において、3つのポリペプチドが1つのベクターから発現される。したがって、いくつかの態様において、重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチド、および可溶性受容体を含むポリペプチドは単一のベクターにより発現される。
MET結合ポリペプチドもしくは剤(または抗原として使用するMET、WNTもしくはFZDタンパク質)の発現に適した宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母細胞、昆虫細胞または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または杆菌(Bacillus)が含まれる。高等真核細胞には、下記に記述の哺乳動物に由来する樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も利用されうる。細菌、真菌、酵母、および哺乳動物の細胞宿主で用いるのに適したクローニングおよび発現ベクターは、Pouwels et al., 1985, Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, NYに記述されている。抗体産生を含む、タンパク質産生の方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願公開第2008/0187954号; 米国特許第6,413,746号; 同第6,660,501号; および国際特許公開番号WO 04/009823において見出すことができる。
組み換えポリペプチドを発現させるために、さまざまな哺乳動物培養系が用いられうる。哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の発現は、これらのタンパク質がおおむね正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ生物学的に機能するので望ましいこともある。適当な哺乳動物宿主細胞株の例としては、COS-7 (サル腎臓由来)細胞株、L-929 (マウス線維芽細胞由来)細胞株、C127 (マウス乳腺腫瘍由来)細胞株、3T3 (マウス線維芽細胞由来)細胞株、CHO (チャイニーズハムスター卵巣由来)細胞株、HeLa (ヒト子宮頸がん由来)細胞株、BHK (ハムスター腎臓線維芽細胞由来)細胞株、HEK-293 (ヒト胎児腎臓由来)細胞株およびこれらの細胞株の変種が挙げられるが、これらに限定されることはない。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結される適当なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナーおよびスプライスアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含んでもよい。
昆虫細胞培養系(例えば、バキュロウイルス)における組み換えタンパク質の発現も、正しく折り畳まれ、生物学的に機能的なタンパク質を産生するための確固たる方法を供与する。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、当業者には周知である(例えば、Luckow and Summers, 1988, Bio/Technology, 6:47を参照のこと)。
したがって、本発明は、本明細書において記述される結合剤を含んだ細胞を提供する。いくつかの態様において、細胞は、本明細書において記述される結合剤を産生する。ある種の態様において、細胞は抗体を産生する。いくつかの態様において、細胞は、抗MET抗体のような、MET結合剤を産生する。いくつかの態様において、細胞は、METを結合する二重特異性剤を産生する。いくつかの態様において、細胞は、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する二重特異性剤を産生する。いくつかの態様において、細胞は、METおよび1種または複数種のFZDタンパク質を結合する二重特異性剤を産生する。いくつかの態様において、細胞は、METおよび1種または複数種のWNTタンパク質を結合する二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は抗体73R009を産生する。ある種の態様において、細胞は抗体73R009のヒト化バージョンを産生する。ある種の態様において、細胞は抗体73R010 (73R009 H12L7)を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R009由来の抗原結合部位を含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R009のヒト化バージョン由来の抗原結合部位を含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R010 (73R009 H12L7)由来の抗原結合部位を含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R009由来の抗原結合部位およびFZD Friドメインを含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R009のヒト化バージョン由来の抗原結合部位およびFZD Friドメインを含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R010 (73R009 H12L7)由来の抗原結合部位およびFZD Friドメインを含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R009由来の抗原結合部位およびFZD8 Friドメインを含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R009のヒト化バージョン由来の抗原結合部位およびFZD8 Friドメインを含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は、抗体73R010 (73R009 H12L7)由来の抗原結合部位およびFZD8 Friドメインを含む二重特異性剤を産生する。ある種の態様において、細胞は二重特異性剤315B06を産生する。ある種の態様において、細胞は二重特異性剤315B07を産生する。ある種の態様において、細胞は二重特異性剤315B09を産生する。
形質転換宿主により産生された、二重特異性剤を含むタンパク質は、任意の適当な方法にしたがって精製することができる。標準的な方法には、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、およびサイジングカラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法が含まれる。適切なアフィニティーカラム上での通過による容易な精製を可能にするために、アフィニティータグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼをタンパク質に付着させることができる。免疫グロブリンを精製するために用いられるアフィニティークロマトグラフィーは、プロテインA、プロテインGおよびプロテインLクロマトグラフィーを含むことができる。単離されたタンパク質は、タンパク質分解、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、質量分析(MS)、核磁気共鳴(NMR)、等電点電気泳動(IEF)、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、およびx線結晶構造解析のような技法を用いて物理的に特徴付けることができる。単離されたタンパク質の純度は、SDS-PAGE、SEC、キャピラリーゲル電気泳動、IEF、およびキャピラリー等電点電気泳動(cIEF)を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の技法を用いて判定することができる。
いくつかの態様において、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルタ、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて、組み換えタンパク質を培地に分泌する発現系からの上清を濃縮することができる。濃縮段階後に、濃縮物を適当な精製マトリックスに適用することができる。いくつかの態様において、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックスまたは基材を利用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロースまたはタンパク質精製において一般に利用される他のタイプでもよい。いくつかの態様において、陽イオン交換段階を利用することができる。適当な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含むさまざまな不溶性のマトリックスが含まれる。いくつかの態様において、セラミックハイドロキシアパタイト(CHT)を含むがこれに限定されない、ハイドロキシアパタイト媒体を利用することができる。ある種の態様において、組み換えタンパク質(例えば、MET結合剤)をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを利用した、1つまたは複数の逆相HPLC段階を利用することができる。均一な組み換えタンパク質を得るために、前記の精製段階の一部または全部を、さまざまな組み合わせで、利用することができる。
いくつかの態様において、本明細書に記述される二重特異性剤のようなヘテロ二量体タンパク質は、本明細書において記述される方法のいずれかにしたがって精製される。いくつかの態様において、二重特異性剤は、少なくとも1つのクロマトグラフィー段階を用いて単離および/または精製される。いくつかの態様において、少なくとも1つのクロマトグラフィー段階は、アフィニティークロマトグラフィーを含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのクロマトグラフィー段階は、陰イオン交換クロマトグラフィーをさらに含む。いくつかの態様において、単離および/または精製された抗体産物は、少なくとも90%のヘテロ二量体剤を含む。いくつかの態様において、単離および/または精製された産物は、少なくとも95%、96%、97%、98%または99%のヘテロ二量体剤を含む。いくつかの態様において、単離および/または精製された産物は、約100%のヘテロ二量体剤を含む。
いくつかの態様において、細菌培養において産生された組み換えタンパク質は、例えば、最初に、細胞ペレットから抽出し、その後に、1回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィーまたはサイズ排除クロマトグラフィー段階を行うことによって単離することができる。最後の精製段階にはHPLCを利用することができる。組み換えタンパク質の発現において利用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来法によって破壊することができる。
抗体および他のタンパク質の精製のための当技術分野における公知の方法にはまた、例えば、米国特許出願公開第2008/0312425号; 同第2008/0177048号; および同第2009/0187005号に記述の方法が含まれる。
ある種の態様において、MET結合剤は、抗体ではないポリペプチドである。高親和性で、タンパク質標的に結合する非抗体ポリペプチドを特定および産生するためのさまざまな方法が当技術分野において公知である。例えば、Skerra, 2007, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304; Hosse et al., 2006, Protein Science, 15: 14-27; Gill et al., 2006, Curr. Opin. Biotechnol, 17:653-658; Nygren, 2008, FEBS J., 275:2668-76; およびSkerra, 2008, FEBS J., 275:2677-83を参照されたい。ある種の態様において、ファージまたは哺乳動物細胞ディスプレイ技術を用いて、抗体ではないMET結合ポリペプチドを産生および/または特定することができる。ある種の態様において、ポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメインおよびチオレドキシンからなる群より選択されるタイプのタンパク質足場を含む。
ある種の態様において、MET結合剤は、いくつかの結合型(例えば、免疫結合体もしくは放射性結合体)または非結合型のいずれか1つで用いることができる。ある種の態様において、剤は、悪性細胞またはがん細胞を排除するために、補体依存性細胞傷害および抗体依存性細胞毒性を含む対象の天然の防御機構を生かすために非結合型で用いることができる。
いくつかの態様において、MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)は細胞傷害剤に結合される。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、メトトレキセート、アドリアマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシンまたは他の挿入剤を含むが、これらに限定されない、化学療法剤である。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPIIおよびPAP-S)、ニガウリ(Momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(Sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン(enomycin)、ならびにトリコテセンを含むが、これらに限定されない、細菌、真菌、植物もしくは動物に由来する酵素活性を有する毒素、またはその断片である。いくつかの態様において、細胞傷害剤は、放射線結合体または放射線結合抗体を産生するための放射性同位体である。放射性結合抗体の産生のために、90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Reおよび212Biを含むが、これらに限定されない、さまざまな放射性核種を利用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記述される結合剤と1つまたは複数の低分子毒素、例えばカリケアマイシン、メイタンシノイド、トリコテンおよびCC1065、ならびにこれらの毒素の毒素活性を有する誘導体との結合体も用いることができる。いくつかの態様において、本明細書に記述される結合剤はメイタンシノイドと結合体化される。いくつかの態様において、本明細書に記述される結合剤はメルタンシン(mertansine)(DM1)と結合体化される。本明細書に記述される結合剤と細胞傷害剤の結合体は、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジジチオール(pyridyidithiol))プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能基誘導体(例えば、ジメチルアジプイミダートHCl)、活性エステル(例えば、ジスクシンイミジルスベラート)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン2,6-ジイソシアネート)、およびビス活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)を含むが、これらに限定されない、さまざまな二官能基性タンパク質カップリング剤を用いて作出されうる。
III. ポリヌクレオチド
ある種の態様において、本発明は、MET、WNT経路の1種もしくは複数種の構成成分、またはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分の両方を特異的に結合するポリペプチド(またはポリペプチドの断片)をコードするポリヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドを包含する。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列だけを含むポリヌクレオチド、ならびにさらなるコード配列および/または非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。例えば、いくつかの態様において、本発明は、ヒトMETに対する抗体をコードする、またはこのような抗体の断片(例えば、抗原結合部位を含んだ断片)をコードするポリヌクレオチド配列を含んだポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本発明は、1種もしくは複数種のヒトFZDタンパク質を結合するポリペプチドをコードする、またはこのようなポリペプチドの断片(例えば、結合部位を含んだ断片)をコードするポリヌクレオチド配列を含んだポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本発明は、1種もしくは複数種のヒトWNTタンパク質を結合するポリペプチドをコードする、またはこのようなポリペプチドの断片(例えば、結合部位を含んだ断片)をコードするポリヌクレオチド配列を含んだポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドはRNAの形態であってもよく、DNAの形態であってもよい。DNAは、cDNA、ゲノムDNA、および合成DNAを含み、二本鎖または一本鎖でもよく、一本鎖ならコード鎖または非コード(アンチセンス)鎖でもよい。
ある種の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111、およびSEQ ID NO:114からなる群より選択される配列を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、およびSEQ ID NO:109からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、およびSEQ ID NO:109からなる群より選択されるポリヌクレオチド配列の相補体を含む。
ある種の態様において、ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、およびSEQ ID NO:109からなる群より選択される配列を含んだポリヌクレオチドと少なくとも約80%同一の、少なくとも約85%同一の、少なくとも約90%同一の、少なくとも約95%同一の、およびいくつかの態様において、少なくとも約96%、97%、98%または99%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む。SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、またはSEQ ID NO:109とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、またはSEQ ID NO:109の相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドも提供される。ある種の態様において、ハイブリダイゼーションは高ストリンジェンシーの条件下である。
本発明の結合剤は、1つまたは複数のポリヌクレオチドによりコードされうる。例えば、いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドは1つのポリヌクレオチドによりコードされ、軽鎖ポリペプチドは第2のポリヌクレオチドによりコードされる。いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、1つのポリヌクレオチドによりコードされる。いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドは1つのポリヌクレオチドによりコードされ、軽鎖ポリペプチドは第2のポリヌクレオチドによりコードされ、可溶性受容体を含んだポリペプチドは第3のポリヌクレオチドによりコードされる。いくつかの態様において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、1つのポリヌクレオチドによりコードされ、可溶性受容体を含んだポリペプチドは第2のポリヌクレオチドによりコードされる。いくつかの態様において、3つのポリペプチドは1つのポリヌクレオチドよりコードされる。したがって、いくつかの態様において、重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチド、および可溶性受容体を含んだポリペプチドは、単一のポリヌクレオチドによりコードされる。
ある種の態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現および分泌を補助するポリヌクレオチド(例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列)と同じ読み枠で融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。リーダー配列を有するポリペプチドはプレタンパク質であり、成熟型のポリペプチドを形成させるために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有する場合がある。ポリヌクレオチドはまた、成熟タンパク質とさらなる5'アミノ酸残基であるプロタンパク質をコードすることもできる。プロ配列を有する成熟タンパク質がプロタンパク質であり、不活性型のタンパク質である。プロ配列が切断されると、活性のある成熟タンパク質が残る。
ある種の態様において、ポリヌクレオチドは、例えば、コードされるポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列と同じ読み枠で融合した、成熟ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、細菌宿主の場合、マーカー配列は、マーカーと融合した成熟ポリペプチドを精製するための、pQE-9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグでもよく、または哺乳動物宿主(例えば、COS-7細胞)が用いられる場合、マーカー配列は、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来する血球凝集素(HA)タグでもよい。いくつかの態様において、マーカー配列はFLAGタグ、つまり配列
Figure 2016512533
のペプチドであり、これを他のアフィニティータグとともに用いてもよい。
本発明はさらに、例えば、断片、類似体および/または誘導体をコードする前記ポリヌクレオチドの変種に関する。
ある種の態様において、本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤(例えば、抗体もしくは二重特異性剤)またはその断片を含んだポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約80%同一の、少なくとも約85%同一の、少なくとも約90%同一の、少なくとも約95%同一の、およびいくつかの態様において、少なくとも約96%、97%、98%または99%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含んだポリヌクレオチドを提供する。
本明細書において用いられる場合、参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、95%「同一の」ヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドという語句は、参照ヌクレオチド配列の各100ヌクレオチドあたり点変異を5個までポリヌクレオチド配列が含むことができる以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味するように意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列のヌクレオチドの5%までが欠失されても、または別のヌクレオチドで置換されてもよく、あるいは参照配列における全ヌクレオチドの5%までのいくつかのヌクレオチドが参照配列中に挿入されてもよい。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の5'もしくは3'末端の位置または末端位置間の任意の場所で行われてもよく、参照配列の中のヌクレオチドの間に個々に、あるいは参照配列内の1つもしくは複数の近接するグループの中に分散されてもよい。
ポリヌクレオチド変種は、コード領域、非コード領域、またはその両方の変化を含有してもよい。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、サイレントな置換、付加、または欠失を生じるが、コードされるポリペプチドの性質または活性を変えない変化を含有する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、(遺伝暗号の縮重によって)ポリペプチドのアミノ酸配列に対する変化を生じさせないサイレントな置換を含む。ポリヌクレオチド変種は、さまざまな理由で、例えば、特定の宿主に向けてコドン発現を最適化するように産生することができる(すなわち、ヒトmRNAのコドンを大腸菌のような細菌宿主に好まれるコドンに変える)。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、配列の非コード領域またはコード領域において少なくとも1つのサイレントな変異を含む。
いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、コードされるポリペプチドの発現(または発現レベル)を調節するようにまたは変化させるように産生される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、コードされるポリペプチドの発現を増加させるように産生される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、コードされるポリペプチドの発現を減少させるように産生される。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、親のポリヌクレオチド配列と比べてコードされるポリペプチドの発現の増加を有する。いくつかの態様において、ポリヌクレオチド変種は、親のポリヌクレオチド配列と比べてコードされるポリペプチドの発現の減少を有する。
いくつかの態様において、少なくとも1つのポリヌクレオチド変種は、ヘテロ二量体分子またはヘテロ多量体分子の産生を増加させるように(コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく)産生される。いくつかの態様において、少なくとも1つのポリヌクレオチド変種は、二重特異性剤の産生を増加させるように(コードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく)産生される。
ある種の態様において、ポリヌクレオチドは単離される。ある種の態様において、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。
本明細書において記述されるポリヌクレオチドを含んだベクターおよび細胞も提供される。いくつかの態様において、発現ベクターはポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、ポリヌクレオチドを含んだ発現ベクターを含む。いくつかの態様において、宿主細胞は、ポリヌクレオチドを含む。
IV. 使用方法および薬学的組成物
METまたはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する本発明の(抗体および二重特異性剤を含む) MET結合剤は、がんの処置のような、治療的処置方法を含むが、これに限定されない、さまざまな用途において有用である。ある種の態様において、この剤は、MET活性を阻害するのに、WNT経路の活性を阻害するのに、腫瘍成長を阻害するのに、腫瘍容積を低減するのに、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減するのに、腫瘍の腫瘍形成性を低減するのに、腫瘍細胞の分化を誘導するのに、がん幹細胞の分化を誘導するのに、腫瘍細胞上での分化マーカーの発現を誘導するのに、がん幹細胞上での分化マーカーの発現を誘導するのに、血管新生を阻害するのに、および/またはEMTを阻害するのに有用である。使用方法は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボのものであってよい。ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETのアンタゴニストである。ある種の態様において、MET結合剤は、WNT経路の1種または複数種の構成成分のアンタゴニストである。ある種の態様において、MET結合剤は、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方のアンタゴニストである。
本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤を用いて腫瘍の成長を阻害するための方法を提供する。ある種の態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビトロで腫瘍細胞をMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)と接触させる段階を含む。例えば、不死化細胞株またはがん細胞株を、腫瘍細胞成長を阻害するように本明細書において記述される抗体または二重特異性剤が添加されている培地中で培養する。いくつかの態様において、腫瘍細胞を、例えば、組織生検、胸水または血液サンプルのような患者サンプルから単離し、腫瘍細胞成長を阻害するようにMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)が添加されている培地中で培養する。
いくつかの態様において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビボで腫瘍または腫瘍細胞をMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)と接触させる段階を含む。ある種の態様において、腫瘍または腫瘍細胞をMET結合剤と接触させる段階は、動物モデルにおいて行われる。例えば、本明細書において記述される抗体または二重特異性剤は、腫瘍異種移植片を有する免疫不全宿主動物(例えば、NOD/SCIDマウス)に投与されうる。いくつかの態様において、腫瘍細胞および/またはがん幹細胞を、例えば、組織生検、胸水または血液サンプルのような患者サンプルから単離し、免疫不全宿主動物(例えば、NOD/SCIDマウス)に注射し、次いで、腫瘍細胞成長を阻害するようにこのマウスに結合剤を投与する。いくつかの態様において、腫瘍成長を抑止するように、MET結合剤は、動物への腫瘍形成性細胞の導入と同時に、またはその直後(「予防モデル」)に投与される。いくつかの態様において、MET結合剤は、腫瘍が特定の大きさに成長した後(「治療モデル」)に、治療用物質として投与される。ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する本明細書において記述される二重特異性剤である。ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のWNTタンパク質を特異的に結合する本明細書において記述される二重特異性剤である。
ある種の態様において、対象において腫瘍の成長を阻害する方法は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。ある種の態様において、対象はヒトである。ある種の態様において、対象は、腫瘍を有するか、または除去された腫瘍を有していた。ある種の態様において、腫瘍はがん幹細胞を含む。ある種の態様において、腫瘍内のがん幹細胞の頻度は、MET結合剤の投与によって低減される。本発明は同様に、腫瘍を本明細書において記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の有効量と接触させる段階を含む、腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減する方法を提供する。いくつかの態様において、対象において腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減する方法は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する本明細書において記述される二重特異性剤である。ある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよび1種または複数種のWNTタンパク質を特異的に結合する本明細書において記述される二重特異性剤である。
本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象において血管新生を阻害するための方法をさらに提供する。いくつかの態様において、血管新生は腫瘍血管新生である。
本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤の有効量と腫瘍細胞を接触させる段階を含む、腫瘍細胞の上皮間葉移行(EMT)を阻害するための方法をさらに提供する。本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象において腫瘍細胞のEMTを阻害するための方法をさらに提供する。
本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤の有効量と腫瘍細胞を接触させる段階を含む、腫瘍細胞の分化を誘導するための方法をさらに提供する。いくつかの態様において、本方法は、本明細書において記述されるMET結合剤の有効量と、がん幹細胞を含む腫瘍細胞を接触させる段階によりがん幹細胞の分化を誘導する段階を含む。本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象において腫瘍細胞の分化を誘導するための方法をさらに提供する。いくつかの態様において、本方法は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階によりがん幹細胞の分化を誘導する段階を含む。
いくつかの態様において、腫瘍は固形腫瘍である。ある種の態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、結腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、胃腸腫瘍、黒色腫、子宮頚腫瘍、膀胱腫瘍、グリア芽細胞腫および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある種の態様において、腫瘍は結腸直腸腫瘍または結腸腫瘍である。ある種の態様において、腫瘍は卵巣腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍は肺腫瘍である。ある種の態様において、腫瘍は膵臓腫瘍である。ある種の態様において、腫瘍は、トリプルネガティブ乳房腫瘍を含む、乳房腫瘍である。いくつかの態様において、腫瘍はグリア芽細胞腫である。
本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象においてがんを処置するための方法をさらに提供する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを結合し、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤はWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合し、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する二重特異性剤であり、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を結合する二重特異性剤であり、がんに関与したシグナル伝達経路の二重阻害を提供する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを結合し、MET/HGF相互作用を妨害し、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを結合し、METとHGFとの結合を遮断し、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤はMETを結合し、血管新生を阻害し、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤は、WNT経路の1種または複数種の構成成分を結合し、WNT/FZD相互作用を妨害し、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤は、METおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分の両方を結合し、MET/HGF相互作用を妨害し、WNT/FZD相互作用を妨害し、がん成長を阻害または低減する。いくつかの態様において、MET結合剤は1種または複数種のWNTタンパク質を結合し、がん内のがん幹細胞の頻度を低減する。
本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、対象(例えば、処置を必要としている対象)においてがんを処置する方法を提供する。ある種の態様において、対象はヒトである。ある種の態様において、対象はがん性腫瘍を有する。ある種の態様において、対象は、腫瘍が除去されている。本発明は同様に、本明細書において記述される剤または抗体である、がんを処置する方法で用いるための二重特異性剤または抗体を提供する。本発明は同様に、がんの処置用の医薬の製造のための本明細書において記述される二重特異性剤または抗体の使用を提供する。
ある種の態様において、がんは、結腸直腸がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がん、肝臓がん、乳房がん、腎臓がん、前立腺がん、胃腸がん、黒色腫、子宮頚がん、膀胱がん、グリア芽細胞腫および頭頸部がんからなる群より選択されるがんである。ある種の態様において、がんは卵巣がんである。ある種の態様において、がんは結腸直腸がんまたは結腸がんである。ある種の態様において、がんは膵臓がんである。ある種の態様において、腫瘍は、トリプルネガティブ乳がんを含む、乳がんである。ある種の態様において、がんは前立腺がんである。ある種の態様において、がんは、非小細胞肺がんおよび小細胞肺がんを含む、肺がんである。
いくつかの態様において、対象のがん/腫瘍はある種の処置に対して抵抗性でありうる。非限定的な例として、対象のがん(または腫瘍)は化学療法抵抗性でありうる。いくつかの態様において、対象のがんはEGFR阻害剤に対して耐性でありうる。
幹細胞および/または前駆細胞のレベルの増加によって特徴付けられる疾患または障害を対象において処置する方法がさらに提供される。いくつかの態様において、処置方法は、本明細書において記述されるMET結合剤、ポリペプチド、抗体、または二重特異性剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。
本明細書において記述される方法のいずれかのある種の態様において、MET結合剤は、ヒトMETおよびWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する二重特異性剤である。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここでこの第1の結合部位がASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3を含み、ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。いくつかの態様において、二重特異性剤は、ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、およびヒトWNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位を含み、ここでこの第1の抗原結合部位が
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR1、
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR2、およびXがRではない
Figure 2016512533
を含んだ重鎖CDR3; ならびに
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR1、WASTRES (SEQ ID NO:85)を含んだ軽鎖CDR2、および
Figure 2016512533
を含んだ軽鎖CDR3を含む。
本明細書において記述される方法のいずれかのある種の態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7またはSEQ ID NO:94と少なくとも約80%の配列同一性を有する重鎖可変領域、およびSEQ ID NO:8またはSEQ ID NO:95と少なくとも約80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む二重特異性剤である。
本明細書において記述される方法のいずれかのいくつかの態様において、MET結合剤は抗体である。いくつかの態様において、抗MET抗体は、抗体73R009、抗体73R009のヒト化バージョン、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。いくつかの態様において、抗MET抗体は抗体73R009である。いくつかの態様において、抗MET抗体は抗体73R009のヒト化バージョンである。いくつかの態様において、抗MET抗体は抗体73R010 (73R009 H12L7)またはその変種である。いくつかの態様において、抗MET抗体は抗体73R009の一価バージョンまたは抗体73R010 (73R007 H12L7)である。いくつかの態様において、抗MET抗体は、PTA-13609としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびPTA-13610としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ抗体である。いくつかの態様において、抗MET抗体は、PTA-120387としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびPTA-120388としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ抗体である。いくつかの態様において、抗MET抗体は、PTA-120695としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびPTA-120388としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ抗体である。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗体73R009由来の抗原結合部位、抗体73R009のヒト化バージョン由来の抗原結合部位、または抗体73R010 (73R009 H12L7)由来の抗原結合部位を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、PTA-13609としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびPTA-13610としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、PTA-120387としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびPTA-120388としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、PTA-120695としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびPTA-120388としてATCCに寄託されたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗体73R009の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、抗体73R009のヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んだ第1の腕部、ならびにFZD8 Friドメインを含んだ第2の腕部を含む二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗体73R009の重鎖可変領域および軽鎖可変領域、抗体73R009のヒト化バージョンの重鎖可変領域および軽鎖可変領域、または抗体73R010 (73R009 H12L7)の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含んだ第1の腕部、ならびにFZD8 FriドメインおよびヒトFc領域を含んだ第2の腕部を含む二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B06である。いくつかの態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B07である。いくつかの態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B09である。
いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:28を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:29を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、およびSEQ ID NO:39を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、およびSEQ ID NO:56を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:13およびSEQ ID NO:14を含み; かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:56を含む、二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、およびSEQ ID NO:28を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、およびSEQ ID NO:29を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、およびSEQ ID NO:39を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、およびSEQ ID NO:56を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:100およびSEQ ID NO:101を含み; かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:56を含む、二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:101、およびSEQ ID NO:56を含んだ二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は、二重特異性剤の第1の腕部がSEQ ID NO:111およびSEQ ID NO:101を含み; かつ二重特異性剤の第2の腕部がSEQ ID NO:56を含む、二重特異性剤である。
ある種の態様において、本方法は、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを決定する段階をさらに含む。いくつかの態様において、「MET発現のレベル」はタンパク質レベルについてである。いくつかの態様において、「MET発現のレベル」は核酸レベル(DNAまたはRNA)についてである。いくつかの態様において、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを参照サンプルにおけるMET発現のレベルと比較する。本明細書において用いられる場合、「参照サンプル」は、正常組織、同じ組織型の非がん性組織、同じ組織型の腫瘍組織、および異なる組織型の腫瘍組織を含むが、これらに限定されることはない。したがって、いくつかの態様において、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを正常組織におけるMET発現のレベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを同じ組織型の非がん性組織におけるMET発現のレベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを同じ組織型の腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを異なる組織型の腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを所定のMETレベルと比較する。いくつかの態様において、MET発現のレベルを決定することは、処置の前に行われる。いくつかの態様において、MET発現のレベルを決定することは、免疫組織化学によるものである。いくつかの態様において、腫瘍またはがんが、正常組織または同じ組織型の非がん性組織におけるMET発現と比べてMET発現のレベルの上昇を有する場合、本明細書において記述されるMET結合剤を対象に投与する。例えば、いくつかの態様において、腫瘍またはがんが、参照サンプルにおけるMET発現のレベルと比べてMET発現のレベルの上昇を有する場合、MET結合剤(例えば、二重特異性剤315B06、315B07、または315B09)を対象に投与する。いくつかの態様において、腫瘍またはがんが、所定のMETレベルと比べてMET発現のレベルの上昇を有する場合、本明細書において記述されるMET結合剤を対象に投与する。
さらに、本発明は、対象が参照サンプルにおけるMETの発現と比べてMET発現のレベルの上昇を有する腫瘍を有するかどうかを判定する段階を含む、MET結合剤による処置を目的にヒト対象を特定する方法を提供する。いくつかの態様において、参照サンプルは正常組織または同じ組織型の非がん性組織である。いくつかの態様において、参照サンプルは同じ組織型の腫瘍/がん組織である。いくつかの態様において、参照サンプルは異なる組織型の腫瘍/がん組織である。いくつかの態様において、腫瘍またはがんにおけるMET発現のレベルを所定のMETレベルと比較する。いくつかの態様において、腫瘍がMET発現のレベルの上昇を有する場合、METを特異的に結合する剤による処置を目的に対象を選択する。いくつかの態様において、処置を目的に選択される場合、本明細書において記述されるMET結合剤を対象に投与する。例えば、いくつかの態様において、腫瘍におけるMETの発現レベルを判定し、腫瘍が参照サンプルにおけるMETのレベルまたは所定のレベルと比べてMET発現のレベルの上昇を有する場合、METを特異的に結合する剤による処置を目的に対象を選択する。処置を目的に選択される場合、本明細書において記述されるMET結合剤を対象に選択する。ある種の態様において、対象は、腫瘍が除去されている。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗体73R009またはその一価バージョンである。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗体73R009のヒト化バージョンまたはその一価バージョンである。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗体73R010 (73R009 H12L7)またはその一価バージョンである。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗MET/FZD-Fc二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B06である。いくつかの態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B07である。いくつかの態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B09である。
本発明は、対象が、METの発現レベルの上昇を有する腫瘍を有するかどうかを判定する段階を含む、MET結合剤による処置を目的にヒト対象を選択する方法を提供する。いくつかの態様において、MET結合剤による処置を目的にヒト対象を選択する方法は、対象が、METの発現レベルの上昇を有する腫瘍を有するかどうかを判定する段階を含み、ここで腫瘍がMETの発現レベルの上昇を有する場合、METを特異的に結合する剤による処置を目的に対象を選択する。本発明は、対象が、高いMET発現レベルを有する腫瘍を有するかどうかを判定する段階を含む、MET結合剤による処置を目的にヒト対象を選択する方法を提供する。いくつかの態様において、MET結合剤による処置を目的にヒト対象を選択する方法は、対象が、高いMET発現レベルを有する腫瘍を有するかどうかを判定する段階を含み、ここで腫瘍が高いMET発現レベルを有する場合、METを特異的に結合する剤による処置を目的に対象を選択する。いくつかの態様において、「上昇した」または「高い」発現レベルは、同じ細胞型の正常組織におけるMETの発現レベルとの比較である。いくつかの態様において、「上昇した」または「高い」発現レベルは、同じ細胞型の他の腫瘍におけるMETの発現レベルとの比較である。いくつかの態様において、「上昇した」または「高い」発現レベルは、参照サンプルにおけるMETの発現レベルとの比較である。いくつかの態様において、「上昇した」または「高い」発現レベルは、所定のMETレベルとの比較である。いくつかの態様において、処置を目的に選択される場合、本明細書において記述されるMET結合剤を対象に投与する。いくつかの態様において、対象は、腫瘍が除去されている。いくつかの態様において、MET結合剤は、抗MET抗体である。いくつかの態様において、抗MET抗体は、抗体73R009またはその一価バージョンである。いくつかの態様において、抗MET抗体は、抗体73R009のヒト化バージョンまたはその一価バージョンである。いくつかの態様において、抗MET抗体は、抗体73R010 (73R009 H12L7)またはその一価バージョンである。いくつかの態様において、MET結合剤は抗MET/FZD-Fc二重特異性剤である。いくつかの態様において、MET結合剤は抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤である。いくつかの態様において、抗MET/FZD-Fc二重特異性剤は315B06である。いくつかの態様において、抗MET/FZD-Fc二重特異性剤は315B07である。いくつかの態様において、MET結合剤は二重特異性剤315B09である。
本発明は同様に、(a) 少なくとも部分的には、上昇したまたは高いMET発現レベルを有するがんを有する対象に基づき、処置を目的に対象を選択する段階、および(b) 本明細書において記述されるMET結合剤の治療的有効量を対象に投与する段階を含む、ヒト対象においてがんを処置する方法を提供する。
細胞、腫瘍、またはがんにおいてMET発現のレベルを判定するための方法は、当業者によって知られている。核酸発現の場合、これらの方法は、PCRに基づくアッセイ法、マイクロアレイ分析、およびヌクレオチド配列決定(例えば、NextGen配列決定)を含むが、これらに限定されることはない。タンパク質発現の場合、これらの方法は、ウエスタンブロット分析、タンパク質アレイ、ELISA、免疫組織化学(IHC)アッセイ法、およびFACS分析を含むが、これらに限定されることはない。
腫瘍またはがんが上昇したまたは高いMET発現レベルを有するかどうかを判定するための方法では、種々のサンプルを用いることができる。いくつかの態様において、サンプルは、腫瘍またはがんを有する対象から採取される。いくつかの態様において、サンプルは新鮮な腫瘍/がんサンプルである。いくつかの態様において、サンプルは凍結された腫瘍/がんサンプルである。いくつかの態様において、サンプルはホルマリン固定されパラフィン包埋されたサンプルである。いくつかの態様において、サンプルは細胞溶解物に加工処理される。いくつかの態様において、サンプルはDNAに加工処理される。いくつかの態様において、サンプルはRNAに加工処理される。
本発明は、本明細書において記述される結合剤を含んだ薬学的組成物をさらに提供する。ある種の態様において、薬学的組成物はさらに、薬学的に許容される媒体を含む。これらの薬学的組成物には対象(例えば、ヒト患者)における腫瘍成長の阻害および/またはがんの処置において用途がある。
ある種の態様において、本発明は、組成物中の剤の少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%が二重特異性剤またはヘテロ二量体剤である、二重特異性剤を含んだ薬学的組成物を提供する。ある種の態様において、二重特異性剤はIgG (例えば、IgG2またはIgG1)に基づく剤である。ある種の態様において、二重特異性剤はIgG2に基づく剤である。ある種の態様において、組成物中の全剤の約10%未満、約5%未満、約2%未満または約1%未満が単一特異性剤またはホモ二量体剤である。ある種の態様において、組成物中の剤は少なくとも約98%ヘテロ二量体性である。
ある種の態様において、本発明の精製された抗体または剤と薬学的に許容される媒体(例えば、担体または賦形剤)を組み合わせることによって、保管および使用のための製剤が調製される。適当な薬学的に許容される媒体には、無毒の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液; 塩、例えば、塩化ナトリウム; アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質; 防腐剤、例えば塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えばメチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、ゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾール; 低分子量ポリペプチド(例えば、約10未満のアミノ酸残基); タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン; 親水性重合体、例えば、ポリビニルピロリドン; アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン; 炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン; キレート剤、例えば、EDTA; 糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール; 塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム; 金属錯体、例えばZn-タンパク質錯体; および非イオン界面活性剤、例えばTWEENまたはポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これらに限定されることはない。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, London)。
本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のための多様な手法で投与することができる。投与は表皮パッチもしくは経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレイ、液剤および散剤による局所投与; 噴霧器による投与を含む、散剤もしくはエアロゾル剤の吸入もしくはガス注入による肺投与、気管内投与および鼻腔内投与; 経口投与; または静脈内投与、動脈内投与、腫瘍内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与(例えば、注射もしくは注入)もしくは頭蓋内投与(例えば、くも膜下腔内投与もしくは脳室内投与)を含む、非経口投与でもよい。
治療用製剤は単位剤形でもよい。このような製剤には、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解した溶液もしくは懸濁液、または坐剤が含まれる。錠剤などの固形組成物では、主要な有効成分が薬学的担体と混合されている。従来の錠剤化成分には、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはゴム、および他の希釈剤(例えば、水)が含まれる。本発明の化合物またはその無毒な薬学的に許容される塩の均一混合物を含む固体の前製剤組成物を形成するために、これらを用いることができる。次いで、固体前製剤組成物を、上述の型の単位剤形へ細分する。持効性の長所を与える剤形を提供するために、製剤または組成物の錠剤、丸剤などをコーティングするか、他の方法で調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、外部成分によって覆われた内部組成物を含むことができる。さらに、崩壊に抵抗するよう働いて、内部成分にそのまま胃を通過させるかまたはその放出を遅らせることができる腸溶層によって、二つの成分を分離することができる。このような腸溶層またはコーティングにはさまざまな材料を用いることができる。このような材料は、いくつかのポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースのような材料との混合物を含む。
本明細書において記述されるMET結合剤をマイクロカプセル中に封入することもできる。このようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術または界面重合法によって、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセルが、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル)中に、またはRemington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, 2012, Pharmaceutical Press, Londonに記述されているマクロエマルジョン中に調製される。
ある種の態様において、薬学的製剤には、リポソームと複合体化された本発明のMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)が含まれる。リポソームを作出するための方法は、当業者に公知である。例えば、いくつかのリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって生成することができる。規定の孔径のフィルタに通してリポソームを押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームが得られる。
ある種の態様において、徐放性調製物を調製することができる。徐放性調製物の適当な例には、MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)を含む、固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形された物品(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)の形をしている。徐放性マトリックスのさらなる例には、ポリエステル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)などのヒドロゲル、ポリラクチド、L-グルタミン酸と7エチル-L-グルタメートの共重合体、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商標) (乳酸-グリコール酸共重合体および酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸共重合体、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、およびポリD-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
ある種の態様において、本明細書に記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)を投与する段階に加えて、前記の方法または処置は、少なくとも一種のさらなる治療剤を投与する段階をさらに含む。さらなる治療剤はMET結合剤の投与の前に、MET結合剤の投与と同時に、および/またはMET結合剤の投与の後に投与することができる。MET結合剤およびさらなる治療剤を含む薬学的組成物も提供される。いくつかの態様において、少なくとも一種のさらなる治療剤は1種、2種、3種またはそれ以上のさらなる治療剤を含む。
少なくとも2種の治療剤による併用療法では、異なる作用機序によって働く剤を用いることが多いが、これは必要とされない。異なる作用機序を有する剤を用いた併用療法は、相加効果または相乗効果をもたらしうる。併用療法は単剤療法において用いられるよりも各剤の用量を低くすることを可能にし、それによって毒性副作用を低減しおよび/または少なくとも1種の剤の治療指数を増大しうる。併用療法は、耐性がん細胞が発現する可能性を減らしうる。いくつかの態様において、併用療法は、非腫瘍形成性細胞に主に影響を与える(例えば、阻害または死滅化する)治療剤、および腫瘍形成性CSCに主に影響を与える(例えば、阻害または死滅化する)治療剤を含む。
治療剤の有用なクラスには、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)およびトリ-核白金錯体、ならびにカルボプラチン)、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。ある種の態様において、第2の治療剤は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤または血管新生阻害剤である。いくつかの態様において、第2の治療剤は、カルボプラチンまたはシスプラチンのような白金錯体である。いくつかの態様において、さらなる治療剤は、タキサンと組み合わせた白金錯体である。
MET結合剤と組み合わせて投与されうる治療剤には、化学療法剤が含まれる。したがって、いくつかの態様において、前記の方法または処置は、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤のカクテルと組み合わせた本発明のMET結合剤の投与を伴う。いくつかの態様において、前記の方法または処置は、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤のカクテルと組み合わせた、METおよび1種または複数種のWNTタンパク質を結合する本発明の二重特異性剤の投与を伴う。
本発明において有用な化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド(シトキサン(CYTOXAN)); アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン; アジリジン、例えば、ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa); アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamime)を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine); ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード; ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン; 抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン; 代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル(5-FU); 葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート; プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン; ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU; アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン; 抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン; 葉酸補充剤、例えば、フォリン酸; アセグラトン; アルドホスファミドグリコシド; アミノレブリン酸; アムサクリン; ベストラブシル; ビサントレン; エダトレキサート(edatraxate); デフォファミン(defofamine); デメコルチン; ジアジクオン; エルフォルミチン(elformithine); 酢酸エリプチニウム; エトグルシド; 硝酸ガリウム; ヒドロキシウレア; レンチナン; ロニダミン; ミトグアゾン; ミトキサントロン; モピダモール; ニトラクリン; ペントスタチン; フェナメット; ピラルビシン; ポドフィリニック酸; 2-エチルヒドラジド; プロカルバジン; PSK; ラゾキサン; シゾフラン(sizofuran); スピロゲルマニウム; テヌアゾン酸; トリアジクオン; 2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン; ウレタン; ビンデシン; ダカルバジン; マンノムスチン; ミトブロニトール; ミトラクトール; ピポプロマン; ガシトシン(gacytosine); アラビノシド(Ara-C); タキソイド、例えば、パクリタキセル(タキソール)およびドセタキセル(タキソテール); クロランブシル; ゲムシタビン; 6-チオグアニン; メルカプトプリン; メトトレキセート; 白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン; ビンブラスチン; 白金; エトポシド(VP-16); イホスファミド; マイトマイシンC; ミトキサントロン; ビンクリスチン; ビノレルビン; ナベルビン; ノバントロン; テニポシド; ダウノマイシン; アミノプテリン; イバンドロン酸; CPT11; トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000; ジフルオロメチルオルニチン(DMFO); レチノイン酸; エスペラミシン; カペシタビン(ゼローダ); および前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。化学療法剤にはまた、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(FARESTON)を含む抗エストロゲン、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体も含まれる。ある種の態様において、第2の治療剤はシスプラチンである。ある種の態様において、第2の治療剤はカルボプラチンである。ある種の態様において、第2の治療剤はパクリタキセルである。
ある種の態様において、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素(例えば、トポイソメラーゼIまたはII)の作用を妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤には、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCl、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド(VM-26)およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。ある種の態様において、第2の治療剤はイリノテカンである。
ある種の態様において、化学療法剤は、代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要な代謝産物に似ているが、細胞の1つまたは複数の正常機能、例えば、細胞分裂を妨害するのに十分に異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗物質には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセートナトリウム、ラリトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されることはない。ある種の態様において、第2の治療剤はゲムシタビンである。
ある種の態様において、化学療法剤は、チューブリンに結合する剤を含むが、これに限定されない、有糸分裂阻害剤である。いくつかの態様において、剤はタキサンである。ある種の態様において、剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体である。ある種の態様において、剤は、パクリタキセル(タキソール)、ドセタキセル(タキソテール)、アルブミン結合パクリタキセル(アブラキサン)、DHA-パクリタキセル、またはPG-パクリタキセルである。ある種の代替的な態様において、有糸分裂阻害剤は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、もしくはビンデシン、またはその薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体を含む。いくつかの態様において、有糸分裂阻害剤は、キネシンEg5の阻害剤または有糸分裂キナーゼ、例えば、AuroraAもしくはPlk1の阻害剤である。ある種の態様において、MET結合剤と組み合わせて投与される化学療法剤が有糸分裂阻害剤を含む場合、処置されているがんまたは腫瘍は、乳がんまたは乳腺腫瘍である。
いくつかの態様において、追加の治療剤は、低分子等の剤を含む。例えば、処置は、本発明のMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)と、EGFR、ErbB2、HER2および/またはMETを含むが、これらに限定されない、さらなる腫瘍関連タンパク質に対する阻害剤として作用する低分子との併用投与を伴ってもよい。ある種の態様において、追加の治療剤は、がん幹細胞経路を阻害する低分子である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、NOTCH経路の低分子阻害剤である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、WNT経路の低分子阻害剤である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、BMP経路の低分子阻害剤である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する低分子である。
いくつかの態様において、追加の治療剤は、抗体のような、生体分子を含む。例えば、処置は、本発明のMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)と、EGFR、ErbB2、および/またはHER2を結合する抗体を含むが、これらに限定されない、さらなる腫瘍関連タンパク質に対する他の抗体との併用投与を伴ってもよい。ある種の態様において、追加の治療剤は、抗がん幹細胞マーカー抗体である抗体である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、NOTCH経路の構成成分を結合する抗体である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、WNT経路の構成成分を結合する抗体である。ある種の態様において、追加の治療剤は、がん幹細胞経路を阻害する抗体である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、NOTCH経路の抗体阻害剤である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、WNT経路の抗体阻害剤である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、BMP経路の抗体阻害剤である。いくつかの態様において、追加の治療剤は、β-カテニンシグナル伝達を阻害する抗体である。ある種の態様において、追加の治療剤は、血管新生の阻害剤または調節剤である抗体(例えば、抗VEGF抗体または抗VEGF受容体抗体)である。ある種の態様において、追加の治療剤は、ベバシズマブ(アバスチン)、トラスツズマブ(ハーセプチン)、パニツムマブ(ベクチビックス)またはセツキシマブ(エルビタックス)である。
さらに、本明細書において記述されるMET結合剤による処置は、1つまたは複数のサイトカイン(例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子および/または増殖因子)のような、他の生体分子による併用処置を含んでもよく、あるいは腫瘍、がん細胞の外科的除去によって、または処置を行っている医師により必要とみなされた他の任意の療法によって達成されてもよい。
ある種の態様において、処置は、放射線療法と組み合わせた本発明のMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の投与を伴う。MET結合剤による処置は、放射線療法の施与の前に、放射線療法の施与と同時に、または放射線療法の施与の後に行ってもよい。当業者は、このような放射線療法の投薬計画を決定することができる。
MET結合剤およびさらなる治療剤の組み合わせを、任意の順番で、または同時に投与できることが理解されよう。MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)による処置は、化学療法の施与の前に、化学療法の施与と同時に、または化学療法の施与の後に行ってもよい。併用投与は、1種類の薬学的製剤での、もしくは別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、またはどちらの順番でもよいが、活性剤の全てがその生物学的活性を同時に発揮できるように、一般的にある期間内で行われる、連続投与を含んでもよい。そのような化学療法剤の調製および投薬計画は、製造業者の指示にしたがってまたは当業者により実験的に決定されるように用いられうる。そのような化学療法剤の調製および投薬計画はまた、The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PAに記述されている。
いくつかの態様において、MET結合剤は、治療剤による処置を以前に受けたことがある患者に投与される。ある種の他の態様において、MET結合剤および追加の治療剤は、実質的に同時にまたは時を同じくして投与される。例えば、対象は、第2の治療剤(例えば、化学療法)による一連の処置を受けると同時に、MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)を投与されることができる。ある種の態様において、MET結合剤は、第2の治療剤による処置の1年以内に投与される。ある種の代替的な態様において、MET結合剤は、第2の治療剤による任意の処置の10ヶ月以内、8ヶ月以内、6ヶ月以内、4ヶ月以内または2ヶ月以内に投与される。ある種の他の態様において、MET結合剤は、第2の治療剤による任意の処置の4週間以内、3週間以内、2週間以内または1週間以内に投与される。いくつかの態様において、MET結合剤は、第2の治療剤による任意の処置の5日以内、4日以内、3日以内、2日以内または1日以内に投与される。さらに、数時間または数分のうちに(すなわち、実質的に同時に)、2種(またはそれ以上)の剤または処置を対象に投与できることが理解されよう。
疾患の処置のために、本発明のMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の適切な投与量は、処置されている疾患のタイプ、疾患の重篤度および経過、疾患の応答性、MET結合剤が治療目的または予防目的で投与されているかどうか、以前の療法、患者の病歴などに依り、全て、処置を行っている医師の自由裁量で決まる。MET結合剤は、一回で投与されてもよく、または数日〜数ヶ月に及ぶ一連の処置として投与されてもよく、あるいは治癒が達成されるか、または疾患状態の減退が達成される(例えば、腫瘍のサイズが縮小する)か、または不変が達成されるまで投与されてもよい。最適な投薬計画は、患者の体内の薬物蓄積の測定から計算することができ、個々の抗体または剤の相対効力に依って変化するであろう。投与を行っている医師は、最適な投与量、投薬方法および反復率を決定することができる。ある種の態様において、MET結合剤の投与量は、約0.01 μg〜約100 mg/kg体重、約0.1 μg〜約100 mg/kg体重、約1 μg〜約100 mg/kg体重、約1 mg〜約100 mg/kg体重、約1 mg〜約80 mg/kg体重、約10 mg〜約100 mg/kg体重、約10 mg〜約75 mg/kg体重、または約10 mg〜約50 mg/kg体重である。ある種の態様において、MET結合剤の投与量は、約0.1 mg〜約20 mg/kg体重である。ある種の態様において、投与量は、1日に、1週間に、1ヶ月にまたは1年に1回または複数回与えることができる。ある種の態様において、MET結合剤は、週に1回、2週間に1回、3週間に1回または月に1回与えられる。
いくつかの態様において、MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)は、初回の、より高い「負荷」用量で投与され、その後に1回または複数回の、より低い用量で投与されうる。いくつかの態様において、投与の頻度は変化してもよい。いくつかの態様において、投薬レジメンは、初回用量の投与、その後に週に1回、2週間に1回、3週間に1回または月に1回のさらなる用量(または「維持」用量)の投与を含みうる。例えば、投薬レジメンは、初回負荷用量の投与、その後に、例えば初回用量の2分の1の、週1回の維持用量の投与を含みうる。あるいは投薬レジメンは、初回負荷用量の投与、その後に、例えば隔週に初回用量の2分の1の、維持用量の投与を含みうる。あるいは投薬レジメンは、3週間3回の初回用量の投与、その後に、例えば隔週に同量の、維持用量の投与を含みうる。あるいは投薬レジメンは、初回用量の投与、その後に3週ごとまたは月に1回のさらなる用量の投与を含みうる。処置を行っている医師は、測定された滞留時間および体液または組織中の薬物濃度に基づいて、投薬のための反復率を評価することができる。治療の経過は、従来の技法およびアッセイ法によってモニターすることができる。
当業者には公知であるように、いずれかの治療剤の投与は、副作用および/または毒性をもたらしうる。場合によっては、副作用および/または毒性は、治療的に有効な用量での特定の剤の投与を妨げるほど重篤である。場合によっては、薬物治療を中断しなければならず、他の剤を試さなければならない。しかしながら、同じ薬効分類内の多くの剤は、類似の副作用および/または毒性を示すことが多く、このことは、患者が治療を止めるか、または可能なら、治療剤に関連した不快な副作用に苦しむのを止めるかしなければならないことを意味している。
治療剤由来の副作用には、じんましん、皮膚発疹、そう痒、吐き気、嘔吐、食欲減退、下痢、悪寒、発熱、疲労、筋肉の痛みおよび疼痛、頭痛、低血圧、高血圧、低カリウム血症、骨影響、低血球数、出血、ならびに心血管障害が含まれうるが、これらに限定されることはない。
したがって、本発明の1つの局面は、本明細書に記述されるMET結合剤の投与に関連した副作用および/または毒性を低減しうる間欠投薬レジメンを用いて剤を投与する段階を含む、患者においてがんを処置する方法を対象とする。本明細書において用いられる場合、「間欠投薬」は、週1回超の投薬間隔を用いた投薬レジメン、例えば、2週間に1回、3週間に1回、4週間に1回などの投薬をいう。いくつかの態様において、ヒト患者においてがんを処置するための方法は、間欠投薬レジメンにしたがって本明細書に記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の有効な用量を患者に投与する段階を含む。いくつかの態様において、ヒト患者においてがんを処置するための方法は、間欠投薬レジメンにしたがってMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の有効な用量を患者に投与する段階、およびMET結合剤の治療指数を増加させる段階を含む。いくつかの態様において、間欠投薬レジメンは、患者にMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の初回用量を投与する段階、および約2週間に1回、MET結合剤の後続用量を投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠投薬レジメンは、患者にMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の初回用量を投与する段階、および約3週間に1回、MET結合剤の後続用量を投与する段階を含む。いくつかの態様において、間欠投薬レジメンは、患者にMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の初回用量を投与する段階、および約4週間に1回、MET結合剤の後続用量を投与する段階を含む。
いくつかの態様において、間欠投薬レジメンにおける後続用量は、初回用量とほぼ同じ量であるか、または初回用量よりも少ない。他の態様において、後続用量は、初回用量よりも多い量である。当業者によって知られるように、用いられる用量は、達成されるべき臨床目標に依って変化するであろう。いくつかの態様において、初回用量は、約0.25 mg/kg〜約20 mg/kgである。いくつかの態様において、初回用量は、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約0.5 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約1 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約2.5 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約5 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約7.5 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約10 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約12.5 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約15 mg/kgである。ある種の態様において、初回用量は、約20 mg/kgである。いくつかの態様において、後続用量は、約0.25 mg/kg〜約15 mg/kgである。ある種の態様において、後続用量は、約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15 mg/kgである。ある種の態様において、後続用量は、約0.5 mg/kgである。ある種の態様において、後続用量は、約1 mg/kgである。ある種の態様において、後続用量は、約2.5 mg/kgである。ある種の態様において、後続用量は、約5 mg/kgである。いくつかの態様において、後続用量は、約7.5 mg/kgである。いくつかの態様において、後続用量は、約10 mg/kgである。いくつかの態様において、後続用量は、約12.5 mg/kgである。
いくつかの態様において、投薬スケジュールは、特定の投与回数または「サイクル」に限定されうる。いくつかの態様において、MET結合剤は3回、4回、5回、6回、7回、8回、またはそれ以上のサイクルの間、投与される。例えば、MET結合剤は6サイクルの間2週ごとに投与され、MET結合剤は6サイクルの間3週ごとに投与され、MET結合剤は4サイクルの間2週ごとに投与され、MET結合剤は4サイクルの間3週ごとに投与される、など。当業者が投薬スケジュールを決定し、その後に修正してもよい。
かくして、本発明は、間欠投薬レジメンを用いてMET結合剤を患者に投与する段階を含むヒト患者において本明細書において記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の毒性を低減させるための方法を提供する。間欠投薬レジメンを用いてMET結合剤を患者に投与する段階を含むヒト患者においてMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の副作用を低減させるための方法も提供される。間欠投薬レジメンを用いてMET結合剤を患者に投与する段階を含む、ヒト患者においてMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の治療指数を増加させるための方法も提供される。
初回用量および後続用量のための送達方法の選択は、動物またはヒト患者が、体内へのMET結合剤の導入を許容できることにしたがって行われる。したがって、本明細書において記述される局面および/または態様のいずれかにおいて、MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)の投与は、静脈内注射または静脈内によるものでありうる。いくつかの態様において、投与は静脈内注入によるものである。本明細書において記述される局面および/または態様のいずれかにおいて、MET結合剤の投与は、非静脈内経路によるものでありうる。
V. MET/WNT結合剤を含むキット
本発明は、本明細書において記述されるMET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)を含んだ、かつ本明細書において記述される方法を実施するのに使用可能な、キットを提供する。ある種の態様において、キットは、1つまたは複数の容器に入れられた、METに対する少なくとも1種の精製された抗体またはMETおよびWNT経路の1種もしくは複数種の構成成分を結合する少なくとも1種の精製された二重特異性剤を含む。いくつかの態様において、キットは、全ての対照を含む、検出アッセイ法を行うのに必要および/または十分な成分の全て、アッセイ法を行うための説明書、ならびに分析および結果の表示に必要な任意のソフトウェアを含む。当業者であれば、本発明の開示されたMET結合剤を、当技術分野において周知の確立されたキット形式の1つに容易に組み込むことができることを容易に認識するであろう。
さらに、MET結合剤(例えば、抗体または二重特異性剤)、および少なくとも1つのさらなる治療剤を含むキットが提供される。ある種の態様において、もう1つ(またはそれ以上)の治療剤は、化学療法剤である。ある種の態様において、もう1つ(またはそれ以上)の治療剤は、血管新生阻害剤である。
本開示の態様を、以下の非限定的な実施例を参照してさらに明確にすることができる。実施例は、本開示のある種の抗体の調製および本開示の抗体を用いるための方法を詳述する。本開示の範囲から逸脱することなく、材料と方法の両方に多くの変更を加えることができることは当業者には明らかであろう。
実施例1 MET結合剤の結合親和性
抗MET抗体73R009の一価バージョン、一価抗MET抗体5D5、および抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06のKDを、Biacore LifeSciences (GE Healthcare)のBiacore 2000システムを用いて決定した。ヤギ抗ヒト抗体(Invitrogen H10500)を、標準的なアミンに基づく化学(NHS/EDC)を用いてカルボキシメチル-デキストラン(CM5) SPRチップにカップリングし、エタノールアミンでブロッキングした。抗体をHBS-P-BSA (0.01 M HEPES pH7.4, 0.15 M NaCl, 0.005% v/v Polysorbate 20, 100 ug/ml BSA)中10 μg/mlの濃度に希釈し、抗ヒト抗体を介してチップ上に捕捉した。ヒトMETをHBS-P-BSA中に300 nMから37.5 nMまで連続的に2倍希釈し、捕捉された抗MET抗体上に順に注入した。METの結合および解離を各濃度で測定した。各抗原の注入後、100 mM H3PO4 5 μlを注入して抗原-抗体複合体を除去し、その後の注入を実施した。動的データを経時的に集め、同時全体適合式を用いて適合させ、各剤の親和性定数(KD値)を得た。
二価「親」抗体73R009は1.1 nMの、ヒトMETに対する親和性定数(KD)を有し、73R009の一価バージョンは1.4 nMの、ヒトMETに対するKDを有し、一価抗体5D5は7.2 nMの、ヒトMETに対するKDを有し、二重特異性剤315B06は1.8 nMの、ヒトMETに対するKDを有していた。したがって、一価抗MET抗体73R009および二重特異性剤315B06は両方とも、親抗体が二価であるという事実にもかかわらず、親抗体と非常に似通った結合親和性を実証した。さらに、二重特異性剤315B06は抗MET抗体5D5よりもヒトMETに対して強い親和性を有するように思われた。
抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06は、マウスMETを結合しないことが示された。
抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06は、(a) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、指定番号PTA-13609を割り当てられたプラスミドによってコードされる重鎖、(b) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-13610を割り当てられたプラスミドによってコードされる軽鎖、および(c) ブダペスト条約の条件の下、2013年3月12日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-13611を割り当てられたプラスミドによってコードされる融合タンパク質を含む。
実施例2 肝細胞成長因子とMETとの結合の阻害
標準的な組み換えDNA技法を用いて完全長ヒトMET (FL-MET)構築体を作出した。HEK-293T細胞にMET構築体およびGFPプラスミドを、プラスミドMET:GFP比2:1で一過性にトランスフェクションした。24時間後、トランスフェクション細胞を収集し、2% FBSを含有する氷冷PBSに懸濁した。トランスフェクション細胞を10、5、2.5、1.25、0.625、0.3、または0.16 μg/mlの一価抗MET抗体5D5、抗MET抗体73R009の一価バージョン、または抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06の存在下において1時間氷上でインキュベートした。ビオチンに結合させた肝細胞成長因子(HGF) 30 ngを各サンプルに加え、さらに40分間氷上でインキュベートした。2% FBSを含有するPBSで細胞を洗浄し、PE結合ストレプトアビジンを加え、細胞を1時間インキュベートした。トランスフェクション細胞を陰性対照としてHGFなしでインキュベートし、陽性対照としてHGFとともに、しかし抗体または結合剤なしでインキュベートした。最終のインキュベーション後、細胞を5 μg/ml DAPIで染色し、FACSCanto II機器(BD Biosciences, San Jose, CA)にて分析し、FlowJoソフトウェアを用いてデータを処理した。
図1に示されるように、およそ20%のトランスフェクション細胞がMETを発現し、ヒトHGFによって結合された(図1A)。結合剤によるMETとのHGF結合の阻害は、陽性対照の20%結合に匹敵していた。一価抗MET抗体5D5は、10 μg/mlの最高濃度でおよそ70%だけHGFとMETとの結合を低減し、0.16 μg/mlの最低濃度で用量依存反応が28%の低減まで低下した(図1B)。対照的に、抗MET抗体73R009の一価バージョンは、10 μg/mlの最高濃度でおよそ72%だけHGFとMETとの結合を低減し、0.16 μg/mlの最低濃度で用量依存反応がおよそ56%の低減まで低下した(図1C)。同様に、二重特異性抗MET/FZD8-Fc剤315B06は、10 μg/mlの最高濃度でおよそ80%だけHGFとMETとの結合を低減し、0.16 μg/mlの最低濃度で用量依存反応がおよそ56%の低減まで低下した(図1D)。
これらの結果は、抗MET抗体73R009の一価バージョンおよび二重特異性抗MET/FZD8-Fc剤351B06の両方がMETとのHGF結合の強力な遮断薬であることを示した。さらに、両方とも抗MET抗体5D5よりもHGFとMETとの結合を遮断する能力が高いように思われ、最低濃度で結合を遮断することができた。
実施例3 HGF誘導性のMET活性の阻害
HGF刺激後にMETリン酸化ならびに下流の、分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)およびAKT活性化を分析することにより、ヒト細胞におけるMET活性化を特徴付けることができる。
A549細胞を、10% FBSを含有するDMEM培地中で細胞1.5×105個/ウェルにて12ウェルプレート中に播種し、終夜増殖させた。細胞を無血清培地に移し、およそ18時間後に、細胞を抗MET抗体73R009の一価バージョン、二重特異性抗MET/FZD8-Fc剤5D5/FZD、および二重特異性抗MET/FZD8-Fc剤315B06により50、10、2、および0.4 μg/mlの濃度で1時間、前処理した。その後、細胞を15分間、50 ng/mlのヒトHGF (EMD Millipore, Billerica MA)で刺激した。細胞を溶解させ、細胞溶解物の上清を集めた。細胞溶解物を、4〜12%のNuPAGE Novexゲル(Invitrogen/Life Technologies, Grand Island, NY)を用いてSDS-PAGEにより分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ウエスタンブロット技法によって分析した。使用した抗体は、抗ヒトMET (抗Met mAb, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); 抗ホスホMET (抗ホスホMET (Tyr1234/1235) mAb, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); 抗ホスホAKT (抗ホスホAKT (Ser473) mAb, Cell Signaling Technology, Danvers, MA); 抗ホスホMAPK (抗ホスホp44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204), Cell Signaling Technology, Danvers, MA); and anti-actin (anti-beta actin antibody, Abcam, Cambridge, MA)であった。
図2に示されるように、二重特異性抗MET/FZD8-Fc剤315B06は、二重特異性抗MET/FZD剤5D5/FZDまたは抗MET抗体73R009の一価バージョンよりも高い程度までリン酸化METの量を低減させた。最高濃度で、315B06はリン酸化AKTの量を、他の剤が同じく低減させるよりも高い程度まで低減させるものと思われた。これらの研究から、二重特異性抗MET/FZD8-Fc剤315B06は、HGF誘導性のMET活性化を阻害および/または遮断でき、二重特異性抗MET/FZD剤5D5/FZDまたは抗MET抗体73R009の一価バージョンよりも高い程度までMET活性化を阻害および/または遮断できることが実証された。
実施例4 WNTシグナル伝達の阻害
STF-293細胞を、抗生物質および10% FCSを補充したDMEM中で培養した。STF-293細胞は、8xTCF Lucレポーターベクターおよびウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼレポーターを安定的に組み込まれたHEK-293細胞である。8xTCF Lucレポーターは、カノニカルWNTシグナル伝達レベルを測定するためにホタル・ルシフェラーゼレポーター遺伝子上流のプロモーターに連結されたTCF結合部位のコピー7個を含む(Gazit et al., 1999, Oncogene, 18:5959-66)。ウミシイタケ・ルシフェラーゼレポーター(Promega; Madison, WI)をトランスフェクション効率の内部対照として用いた。抗MET/FZD二重特異性剤315B06ならびに対照剤の抗MET一価剤5D5/FLAGおよび一価剤FZD8/FLAGを20 μg/mlから0.0064 μg/mlまで連続的に5倍希釈し、適切なウェルに加え、終夜インキュベートした。細胞を次に、WNT3aを安定発現するL細胞から調製されたWNT3a馴化培地またはWNT3aを過剰発現していないL細胞由来の対照馴化培地の存在下または非存在下においてインキュベートした。終夜インキュベーションの後、デュアル・ルシフェラーゼアッセイキット(Promega; Madison, WI)を用いてルシフェラーゼレベルを測定し、ホタル・ルシフェラーゼ活性をウミシイタケ・ルシフェラーゼ活性に対して規準化した。
図3に示されるように、抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06はWNT経路シグナル伝達を阻害した。阻害は一価FZD8/FLAG剤と類似しており、予想通り、抗MET 5D5/FLAG剤はWNT経路シグナル伝達を阻害する能力を有していなかった。このように、実施例3において提示された結果と組み合わせて、抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B06は、MET誘導性およびWNT誘導性の両方のシグナル伝達および/または活性化を阻害する能力を実証した。
実施例5 インビボでの肺腫瘍成長の阻害
マイクロアレイ分析において観察された高いMET発現レベルに基づき、OMP-LU45腫瘍を選択した。解離されたOMP-LU45肺腫瘍細胞(細胞1×105個)を6〜8週齢のNOD/SCIDマウスへ注射した。腫瘍を、90 mm3の平均容積に達するまで26日間、成長させた。マウスを無作為化し(n = 10/群)、単剤としてまたはタキソールと組み合わせて、一価抗MET抗体(5D5/FLAG)、対照抗体、一価FZD8-Fc (FZD8Fc/FLAG)、二価FZD8-Fc (54F28)、または抗MET/FZD8Fc二重特異性剤で処置した。タンパク質剤を週1回25 mg/kgで投薬し、タキソールを週1回15 mg/kgで投薬した。タンパク質剤およびタキソールの投与は、腹腔への注射を介して行った。腫瘍成長をモニターし、表示した時点で電子キャリパにより腫瘍容積を測定した。データは平均±S.E.Mとして表されている。
単剤療法として用いられた場合、剤の全てが対照抗体と比べてLU45腫瘍成長に及ぼす最小効果または検出不能な効果を有していた(図4A)。対照的に、タキソールと組み合わせたMET/FZD8-Fc二重特異性剤は、OMP-LU45腫瘍成長を顕著に阻害し、この腫瘍成長阻害は、タキソールと組み合わせたその他の剤のいずれかで観察された阻害よりも大きかった(図4B)。
実施例6 MET抗体のヒト化
「親」抗体73R009のヒト化バージョンを作出した。最小限のマウス配列含量を含有し、親抗体の結合特性を保持していたヒト化重鎖および軽鎖の最良の組み合わせを選択した。抗体73R010ともいわれる、ヒト化抗体73R009 H12L7は、ブダペスト条約の条件の下、2013年5月29日付でATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、指定番号PTA-120387を割り当てられたプラスミドによってコードされる重鎖およびブダペスト条約の条件の下、2013年5月29日付でATCCに寄託され、指定番号PTA-120388を割り当てられたプラスミドによってコードされる軽鎖を含む。
抗体73R010を抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤の異形として用いたが、この変種二重特異性剤は315B07といわれる。抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B07は、実施例1において記述されるようにBiacore 2000システムを用いて126.4 pMのKDを有するものと判定された。
SEQ ID NO:97の位置番号234に対応するシステイン残基をセリン残基と置き換えることにより、抗MET抗体73R010の変種を作出した。この変種重鎖をコードするプラスミドは、ブダペスト条約の条件の下、2013年11月6日付でATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、指定番号PTA-120695を割り当てられた。この73R010変種を抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤の異形として用いたが、この二重特異性剤は315B09といわれる。
実施例7 エピトープ・マッピング
抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤によって認識されるMETエピトープを特定するために、エピトープ・マッピングを行った。ヒトおよびマウスSemaドメインのアミノ酸配列はおよそ88%同一であるが、二重特異性剤315B07はマウスMETを結合しない。それゆえ、部位特異的突然変異誘発法を行って、一連のヒトSema変異体を作出した。Kunkel突然変異誘発法を用いて、ヒトSema配列中の特定のアミノ酸を、予測される抗体結合部位に、マウスSema配列において見出される対応したアミノ酸と置き換えた。ヒトSema変異体はMut96,99 (F96L and Q99R)、Mut96 (F96L)、Mut99 (Q99R)、Mut328 (Q328N)、Mut331 (R331K)、ならびにMut337,338 (L337PおよびN338S)であった。
野生型ヒトSema、野生型マウスSema、5'末端がマウスのもの(aa 1〜331)であり、かつ3'末端がヒトのもの(aa 332〜515)であるマウス/ヒトSema変異体、および上記のヒトSema変異体をコードする哺乳動物発現プラスミドベクターを、標準的な組み換え技術によって作出した。これらの構築体は、ヒトCD4タンパク質の膜貫通ドメインおよびGFPを含む(例えば、Sema-hCD4TM-GFP)。これらの発現構築体は、細胞表面上でのSemaドメインの発現、および発現をモニターするのにGFPの発現を可能にする。HEK-293T細胞に、リン酸カルシウムトランスフェクションキット(Clontech, Mountain View, CA)を用いて、Semaドメインをコードする発現ベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションから16時間後に、細胞をVersene溶液(Life Technologies, Grand Island, NY)で引きはがし、4℃で1時間、二重特異性剤315B07または二重特異性剤・抗MET抗体5D5/FZD8-Fcとともにインキュベートした。細胞を洗浄し、結合した二重特異性剤を、アロフィコシアニン(APC)に結合させた二次抗ヒトFc抗体で検出した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、1 ug/mlのDAPIを細胞に加えた。標識された細胞をフローサイトメトリーにより分析して、315B07および5D5/FZD8-Fcの一連のSema変異体への結合を測定した。
図5に示されるように、二重特異性剤315B07は野生型ヒトSemaドメインを結合するが、しかしマウスSemaドメインまたはマウス/ヒトキメラ変異体を結合しない。アミノ酸残基番号96がフェニルアラニンからロイシンに変えられ、かつアミノ酸残基番号99がグルタミンからアルギニンに変えられる場合、315B07のヒトSemaドメインへの結合は検出されない。アミノ酸残基番号96だけがフェニルアラニンからロイシンに変えられる場合、315B07のヒトSemaドメインへの結合は影響を受けない。対照的に、アミノ酸残基番号99だけがグルタミンからアルギニンに変えられる場合、315B07のSemaドメインへの結合は検出されない。アミノ酸番号331がアルギニンからリジンに変えられる場合、315B07の結合は影響を受けない。さらに、アミノ酸番号328がグルタミンからアスパラギンに変えられる場合、315B07の結合は影響を受けない。同様に、アミノ酸番号337がロイシンからプロリンに変えられ、かつアミノ酸番号338がアスパラギンからセリンに変えられる場合、315B07の結合は影響を受けない(データは示されていない)。対照的に、アミノ酸残基番号99がグルタミンからアルギニンに変えられる場合、5D5/FZD8-Fcの結合は影響を受けない。さらに、アミノ酸番号331がアルギニンからリジンに変えられる場合、5D5/FZD8-Fcの結合は検出されない。アミノ酸番号328がグルタミンからアスパラギンに変えられる場合、5D5/FZD8-Fcの結合は検出されず、アミノ酸番号337がロイシンからプロリンに変えられ、かつアミノ酸番号338がアスパラギンからセリンに変えられる場合、5D5/FZD8-Fcの結合は大いに低減される。
これらの結果から、ヒトSEMAドメインのアミノ酸番号99位のグルタミンが315B07の抗MET腕部にとって鍵となるエピトープアミノ酸であることが示される。さらに、これらの結果から、二重特異性剤315B07に対するc-MET上のエピトープが、ヒトMETの少なくともアミノ酸番号328、331、337、および338を含む抗MET抗体5D5に対するc-MET上のエピトープとは異なることが明らかに示される。315B07エピトープおよび5D5エピトープの位置は、図6のリボンダイアグラムにおいて描かれている。
実施例8 インビボでのMMTV-Wnt1腫瘍成長の阻害
MMTV-Wnt1乳がんモデルを研究用に選んだ。というのは、この腫瘍モデルは、抗FZD抗体OMP-18R5 (バンチクツマブ)またはOMP-54F28 (FZD8-Fc)を用いたWNT経路阻害に対して極めて感受性であることが以前に示されているからである。MMTV-Wnt1腫瘍細胞(細胞25,000個)をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍を、110 mm3の平均容積に達するまで17日間成長させた。腫瘍担持マウスを無作為に選び(n = 12/群)、対照抗体(30 mg/kg)、OMP-54F28 (5 mg/kg)、または315B07 (抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤) (30もしくは60 mg/kg)のいずれかで週1回処置した。腫瘍成長をモニターし、表示した時点で電子キャリパにより腫瘍容積を測定した。データは平均±S.E.Mとして表されている。
図7に示されるように、抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤315B07は、対照抗体と比べてMMTV-Wnt腫瘍成長を顕著に阻害したことから、それがインビボで有効なWntアンタゴニストであることが示唆された。
実施例9 インビボでのKP4膵臓腫瘍成長の阻害
KP4膵臓細胞株は、自己分泌の形で高レベルのヒト成長因子(HGF)およびMETの両方を発現し、インビボで抗MET抗体(5D5)処置に対して感受性であることが示されている(Jin et al., 2008, Cancer Res. 68:4360-4368)。KP4腫瘍細胞(1×106)をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍を、125 mm3の平均容積に達するまで15日間成長させた。腫瘍担持マウスを無作為に5群へ分け(n = 10/群)、対照抗体(25 mg/kg、毎週)、OMP-18R5 (25 mg/kg、毎週)、FZD8-Fc/FLAG (30 mg/kg)、抗MET 5D5/FLAG (30 mg/kg)または抗MET/FZD8-Fc (5D5/FZD8-Fc、30 mg/kg)で処置した。後者の3つのタンパク質は、週2回投与した。腫瘍成長をモニターし、表示した時点で電子キャリパにより腫瘍容積を測定した。データは平均±S.E.Mとして表されている。
図8に示されるように、抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤はKP4腫瘍成長を阻害したことから、それがインビボで有効なMETアンタゴニストであることが示唆された。
実施例10 インビボでのOMP-LIV1 HCC腫瘍成長の阻害
OMP-LIV1は、親由来の肝細胞がん(HCC)腫瘍である。OMP-LIV1腫瘍細胞(50,000)をNOD/SCIDマウスへ皮下注射した。腫瘍を、220 mm3の平均容積に達するまでおよそ50日間成長させた。腫瘍担持マウスを無作為に4群へ分け(n = 9〜11/群)、ソラフェニブだけ、片腕MET抗体と組み合わせてソラフェニブ、FZD8-Fc/FLAGと組み合わせてソラフェニブ、または抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤OMP-315B07と組み合わせてソラフェニブで処置した。抗体または二重特異性剤は週2回、30 mg/kgで毎週投薬した。ソラフェニブは60 mg/kgで投薬し、週5回、毎日投与した。腫瘍成長をモニターし、表示した時点で電子キャリパにより腫瘍容積を測定した。データは平均±S.E.Mとして表されている。
抗MET/FZD8-Fc二重特異性剤OMP-315B07はOMP-LIV1 HCC腫瘍成長を、ソラフェニブだけよりも大きな程度まで(p = 0.02)、および片腕抗METまたは片腕FZD8-Fcのいずれかと組み合わせたソラフェニブよりも大きな程度までソラフェニブとの組み合わせで阻害した(図9)。
本明細書において記述された実施例および態様は例示する目的のためだけのものであると、ならびにそれらを踏まえてさまざまな修正または変更が当業者に示唆されるであろうが、それらは本出願の趣旨および範囲内に含まれるものと理解される。
本明細書において引用された、全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにアクセッション番号/ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含むデータベース配列は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号/データベース配列が参照により本明細書に組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
以下は、本出願において開示される配列である。
73R009重鎖CDR1 (SEQ ID NO:1)
Figure 2016512533
73R009重鎖CDR2 (SEQ ID NO:2)
Figure 2016512533
73R009重鎖CDR3 (SEQ ID NO:3)
Figure 2016512533
73R009軽鎖CDR1 (SEQ ID NO:4)
Figure 2016512533
73R009軽鎖CDR2 (SEQ ID NO:5)
Figure 2016512533
73R009軽鎖CDR3 (SEQ ID NO:6)
Figure 2016512533
73R009重鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:7)
Figure 2016512533
73R009軽鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:8)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列に下線を引いた73R009重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:9)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列に下線を引いた73R009 (13A変種)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:10)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列に下線を引いた73R009軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:11)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R009重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:12)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R009 (13A変種)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:13)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R009軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:14)
Figure 2016512533
73R009重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:15)
Figure 2016512533
ここでR = AまたはG
ここでY = CまたはT
73R009 (13A変種)重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:16)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R009重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:17)
Figure 2016512533
ここでR = AまたはG
ここでY = CまたはT
予測されるシグナル配列を有しない73R009 (13A変種)重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:18)
Figure 2016512533
73R009軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:19)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R009軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:20)
Figure 2016512533
ヒトFZD1 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:21)
Figure 2016512533
ヒトFZD2 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:22)
Figure 2016512533
ヒトFZD3 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:23)
Figure 2016512533
ヒトFZD4 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:24)
Figure 2016512533
ヒトFZD5 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:25)
Figure 2016512533
ヒトFZD6 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:26)
Figure 2016512533
ヒトFZD7 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:27)
Figure 2016512533
ヒトFZD8 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:28)
Figure 2016512533
ヒトFZD8 Friドメインアミノ酸配列(変種) (SEQ ID NO:29)
Figure 2016512533
ヒトFZD9 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:30)
Figure 2016512533
ヒトFZD10 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:31)
Figure 2016512533
ヒトFZD1アミノ酸番号116〜227 (SEQ ID NO:32)
Figure 2016512533
ヒトFZD2アミノ酸番号39〜150 (SEQ ID NO:33)
Figure 2016512533
ヒトFZD3アミノ酸番号28〜133 (SEQ ID NO:34)
Figure 2016512533
ヒトFZD4アミノ酸番号48〜161 (SEQ ID NO:35)
Figure 2016512533
ヒトFZD5アミノ酸番号33〜147 (SEQ ID NO:36)
Figure 2016512533
ヒトFZD6アミノ酸番号24〜129 (SEQ ID NO:37)
Figure 2016512533
ヒトFZD7アミノ酸番号49〜160 (SEQ ID NO:38)
Figure 2016512533
ヒトFZD8アミノ酸番号35〜148 (SEQ ID NO:39)
Figure 2016512533
ヒトFZD9アミノ酸番号39〜152 (SEQ ID NO:40)
Figure 2016512533
ヒトFZD10アミノ酸番号34〜147 (SEQ ID NO:41)
Figure 2016512533
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:42)
Figure 2016512533
ヒトIgG1 Fc領域(変種) (SEQ ID NO:43)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域(SEQ ID NO:44)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域(SEQ ID NO:45)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域変種(SEQ ID NO:46)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域(変種13A) (SEQ ID NO:47)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域(変種13B) (SEQ ID NO:48)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域(変種13A) (SEQ ID NO:49)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域変種(変種13A) (SEQ ID NO:50)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域(変種13B) (SEQ ID NO:51)
Figure 2016512533
ヒトIgG2 Fc領域変種(変種13B) (SEQ ID NO:52)
Figure 2016512533
FZD8-Fc変種54F28アミノ酸配列(予測されるシグナル配列を有しない) (SEQ ID NO:53)
Figure 2016512533
シグナル配列を有するFZD8-Fc変種54F28アミノ酸配列(SEQ ID NO:54)
Figure 2016512533
シグナル配列を有するFZD8-Fc変種(13B変種)アミノ酸配列(SEQ ID NO:55)
Figure 2016512533
シグナル配列を有しないFZD8-Fc変種(13B変種)アミノ酸配列(SEQ ID NO:56)
Figure 2016512533
ヒトWNT1 C末端システインリッチドメイン(aa 288〜370) (SEQ ID NO:57)
Figure 2016512533
ヒトWNT2 C末端システインリッチドメイン(aa 267〜360) (SEQ ID NO:58)
Figure 2016512533
ヒトWnt2b C末端システインリッチドメイン(aa 298〜391) (SEQ ID NO:59)
Figure 2016512533
ヒトWNT3 C末端システインリッチドメイン(aa 273〜355) (SEQ ID NO:60)
Figure 2016512533
ヒトWNT3a C末端システインリッチドメイン(aa 270〜352) (SEQ ID NO:61)
Figure 2016512533
ヒトWNT7a C末端システインリッチドメイン(aa 267〜359) (SEQ ID NO:62)
Figure 2016512533
ヒトWNT7b C末端システインリッチドメイン(aa 267〜349) (SEQ ID NO:63)
Figure 2016512533
ヒトWNT8a C末端システインリッチドメイン(aa 248〜355) (SEQ ID NO:64)
Figure 2016512533
ヒトWNT8b C末端システインリッチドメイン(aa 245〜351) (SEQ ID NO:65)
Figure 2016512533
ヒトWNT10a C末端システインリッチドメイン(aa 335〜417) (SEQ ID NO:66)
Figure 2016512533
ヒトWNT10b C末端システインリッチドメイン(aa 307〜389) (SEQ ID NO:67)
Figure 2016512533
リンカー(SEQ ID NO:68)
Figure 2016512533
リンカー(SEQ ID NO:69)
Figure 2016512533
リンカー(SEQ ID NO:70)
Figure 2016512533
リンカー(SEQ ID NO:71)
Figure 2016512533
リンカー(SEQ ID NO:72)
Figure 2016512533
FLAGペプチド(SEQ ID NO:73)
Figure 2016512533
ヒトIgG1重鎖定常領域(SEQ ID NO:74)
Figure 2016512533
ヒトIgG2重鎖定常領域(SEQ ID NO:75)
Figure 2016512533
ヒトIgG3重鎖定常領域(SEQ ID NO:76)
Figure 2016512533
ヒトIgG4重鎖定常領域(SEQ ID NO:77)
Figure 2016512533
MET抗体重鎖CDR1 (SEQ ID NO:78)
Figure 2016512533
MET抗体重鎖CDR2 (SEQ ID NO:79)
Figure 2016512533
MET重鎖CDR3 (SEQ ID NO:80)
Figure 2016512533
ここでXがRではない
MET重鎖CDR3 (SEQ ID NO:81)
Figure 2016512533
MET重鎖CDR3 (SEQ ID NO:82)
Figure 2016512533
MET重鎖CDR3 (SEQ ID NO:83)
Figure 2016512533
MET軽鎖CDR1 (SEQ ID NO:84)
Figure 2016512533
MET軽鎖CDR2 (SEQ ID NO:85)
Figure 2016512533
MET軽鎖CDR3 (SEQ ID NO:86)
Figure 2016512533
シグナル配列を有しないFZD8-Fc変種(13A変種)アミノ酸配列(SEQ ID NO:87)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R009 (13B変種)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:88)
Figure 2016512533
シグナル配列を有するFZD8-Fc変種(13B変種)ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:89)
Figure 2016512533
シグナル配列を有しないFZD8-Fc変種(13B変種)ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:90)
Figure 2016512533
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:91)
Figure 2016512533
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:92)
Figure 2016512533
ヒトMET (SEQ ID NO:93)
Figure 2016512533
ヒト化抗体
73R010 (73R009 H12)重鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:94)
Figure 2016512533
73R010 (73R009 L7)軽鎖可変領域アミノ酸配列(SEQ ID NO:95)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列に下線を引いた73R010 (73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:96)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列に下線を引いた73R010 13A変種(73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:97)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列に下線を引いた73R010 (73R009 L7)軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:98)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 (73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:99)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 13A変種(73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:100)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 (73R009 L7)軽鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:101)
Figure 2016512533
73R010 (73R009 H12)重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:102)
Figure 2016512533
ここでR = AまたはG
ここでY = CまたはT
73R010 13A変種(73R009 H12)重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:103)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 (73R009 H12)重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:104)
Figure 2016512533
ここでR = AまたはG
ここでY = CまたはT
予測されるシグナル配列を有しない73R010 13A変種(73R009 H12)重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:105)
Figure 2016512533
73R010 (73R009 L7)軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:106)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 (73R009 L7)軽鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:107)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 13B変種(73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:108)
Figure 2016512533
73R010 13A変種(Cys/Ser) (73R009 H12)重鎖ヌクレオチド配列(SEQ ID NO:109)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列に下線を引いた73R010 13A変種(Cys/Ser) (73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:110)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 13A変種(Cys/Ser) (73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:111)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 (Cys/Ser) (73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:112)
Figure 2016512533
MET (SEQ ID NO:93のアミノ酸番号97〜101) (SEQ ID NO:113)
Figure 2016512533
予測されるシグナル配列を有しない73R010 13B変種(Cys/Ser) (73R009 H12)重鎖アミノ酸配列(SEQ ID NO:114)
Figure 2016512533

Claims (30)

  1. a) ヒトMETを特異的に結合する第1の結合部位、および
    b) WNT経路の1種または複数種の構成成分を特異的に結合する第2の結合部位
    を含む二重特異性剤。
  2. 第1の結合部位が、ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
    Figure 2016512533
    を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3; ならびに
    Figure 2016512533
    を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
    Figure 2016512533
    を含んだ軽鎖CDR3を含む、ヒトMETを特異的に結合する抗体の抗原結合部位を含む、請求項1記載の二重特異性剤。
  3. 第2の結合部位が、(i) 1種もしくは複数種のFrizzled (FZD)タンパク質を特異的に結合する、または(ii) 1種もしくは複数種のヒトWNTタンパク質を特異的に結合する、請求項1または請求項2記載の二重特異性剤。
  4. 1種もしくは複数種のFZDタンパク質が、FZD8、FZD1、FZD2、FZD5、およびFZD7からなる群より選択されるか、または1種もしくは複数種のWNTタンパク質が、WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT10a、およびWNT10bからなる群より選択される、請求項3記載の二重特異性剤。
  5. 二重特異性抗体である、請求項1〜4のいずれか一項記載の二重特異性剤。
  6. 可溶性FZD受容体を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載の二重特異性剤。
  7. 可溶性FZD受容体がヒトFZDタンパク質のFriドメインを含む、請求項6記載の二重特異性剤。
  8. ヒトFZDタンパク質がヒトFZD8である、請求項6または請求項7記載の二重特異性剤。
  9. ヒトFZDタンパク質のFriドメインが、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、およびSEQ ID NO:41からなる群より選択される配列を含む、請求項7記載の二重特異性剤。
  10. ヒトFZDタンパク質のFriドメインが異種ポリペプチドに連結される、請求項7〜9のいずれか一項記載の二重特異性剤。
  11. 異種ポリペプチドがヒトFc領域を含む、請求項10記載の二重特異性剤。
  12. 可溶性FZD受容体がSEQ ID NO:56またはSEQ ID NO:53を含む、請求項6記載の二重特異性剤。
  13. 第1の結合部位が、SEQ ID NO:7を含んだ重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8を含んだ軽鎖可変領域を含む、請求項1〜12のいずれか一項記載の二重特異性剤。
  14. 第2の結合部位が、ATCCに寄託され、PTA-13611を割り当てられたプラスミドによってコードされるポリペプチドを含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の二重特異性剤。
  15. 第1の結合部位が、ATCCに寄託され、PTA-13609を割り当てられたプラスミドによってコードされる重鎖可変領域およびATCCに寄託され、PTA-13610を割り当てられたプラスミドによってコードされる軽鎖可変領域を含み; かつ第2の結合部位が、ATCCに寄託され、PTA-13611を割り当てられたプラスミドによってコードされるポリペプチドを含む、請求項1記載の二重特異性剤。
  16. 第1のCH3ドメインおよび第2のCH3ドメインを含み、この各々がヘテロ二量体の形成を促進するように修飾される、請求項1〜15のいずれか一項記載の二重特異性剤。
  17. 第1および第2のCH3ドメインが静電効果に基づいて修飾される、請求項16記載の二重特異性剤。
  18. (i) METの肝細胞成長因子への結合を阻害する;
    (ii) METの内部移行を促進する;
    (iii) METの分解を刺激する;
    (iv) METの二量体化を阻害する;
    (v) METの活性化を阻害する;
    (vi) 1種もしくは複数種のWNTタンパク質の少なくとも1種のFZDへの結合を阻害する;
    (vii) カノニカルWNTシグナル伝達を阻害する;
    (viii) 腫瘍もしくは腫瘍細胞の成長を阻害する;
    (ix) 腫瘍における分化マーカーの発現を誘導する;
    (x) 腫瘍内の細胞を分化誘導する;
    (xi) 腫瘍内のがん幹細胞の頻度を低減させる; および/または
    (xii) 上皮間葉移行(EMT)を阻害する、
    請求項1〜17のいずれか一項記載の二重特異性剤。
  19. アミノ酸PCQDC (SEQ ID NO:113)を含むエピトープを結合する、ヒトMETを特異的に結合する二重特異性剤または抗体。
  20. ASYAWS (SEQ ID NO:1)を含んだ重鎖CDR1、
    Figure 2016512533
    を含んだ重鎖CDR2、およびKGAY (SEQ ID NO:3)を含んだ重鎖CDR3; ならびに
    Figure 2016512533
    を含んだ軽鎖CDR1、STSNLAS (SEQ ID NO:5)を含んだ軽鎖CDR2、および
    Figure 2016512533
    を含んだ軽鎖CDR3を含む、ヒトMETを特異的に結合する単離された抗体。
  21. SEQ ID NO:7と少なくとも約80%の配列同一性を有する重鎖可変領域およびSEQ ID NO:8と少なくとも約80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む、請求項20記載の抗体。
  22. モノクローナル抗体、組み換え抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、または抗原結合部位を含む抗体断片である、請求項19〜21のいずれか一項記載の抗体。
  23. 請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性剤または抗体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
  24. 請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性剤または抗体を産生する細胞。
  25. 請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性剤または抗体をコードするポリヌクレオチド。
  26. がんの処置で用いるための請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性剤または抗体。
  27. 腫瘍の成長の阻害で用いるための請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性剤または抗体。
  28. がんの処置のための請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性剤または抗体の使用。
  29. 腫瘍の成長を阻害するための請求項1〜22のいずれか一項記載の二重特異性剤または抗体の使用。
  30. 任意で治療剤が化学療法剤であってもよい、少なくとも1つのさらなる治療剤の使用を含む、請求項28または請求項29記載の使用。
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