CN105492024A - Met结合剂及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合人MET的结合剂、特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的结合剂、结合人MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂以及使用该试剂治疗疾病例如癌症的方法。

Description

MET结合剂及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请No.61/783552、2013年5月31日提交的美国临时申请No.61/829477和2013年11月1日提交的美国临时申请No.61/898851的优先权，每一项申请在此通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明一般地涉及结合MET、WNT信号通路的一个或更多个组件或者MET和WNT信号通路的一个或更多个组件二者的抗体、双特异性试剂以及其它结合剂，特别是结合MET和一个或更多个WNT蛋白二者的双特异性试剂以及利用所述结合剂用于治疗疾病例如癌症的方法。
背景技术
癌症是发达国家的主要死亡原因之一，其中超过100万人被诊断为癌症，并且仅在美国每年就有500000人死亡。总的说来，估计超过1/3的人将在其一生中患有某种形式的癌症。存在超过200种不同类型的癌症，其中乳腺、肺、结直肠和前列腺四种癌症占所有新病例的约一半(Siegel等人，2011,CA:ACancerJ.Clin.61:212-236)。
信号传导通路正常使细胞外信号与导致直接或间接控制细胞生长、分化、存活和死亡的基因表达的核相连接。在各种癌症中，信号传导通路是失调的并且可能与肿瘤启动和/或进展相关。与人类肿瘤形成相关的信号传导通路包括但不限于WNT通路、Ras-Raf-MEK-ERK或MAPK通路、PI3K-AKT通路、MET/HGF通路、CDKN2A/CDK4通路、Bcl-2/TP53通路和NOTCH通路。
MET/HGF(肝细胞生长因子)通路已经显示出在早期胚胎发育中发挥关键作用。然而，在成人组织中，MET通路被严格控制并且在其生长信号传导程序中主要是静止的，除了例如伤口修复过程之外。MET通路失调可导致细胞增殖，保护免受凋亡、血管生成、浸入和转移。多种不同的机制可使MET失调，包括蛋白过度表达、组成型活化、配体依赖性活化、基因扩增、基因突变和/或MET修饰(例如磷酸化)。已证明MET通路在许多肿瘤类型中失调，包括但不限于肺癌、结肠直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌和脑癌。
WNT信号传导通路是胚胎模式形成、胚后组织维持和干细胞生物学的几个关键调节剂之一。更具体地，WNT信号传导在细胞极性和细胞命运特化的生成包括由干细胞群自我更新中起重要作用。未经调节的WNT通路激活与其中据信激活可改变细胞发育命运的许多人类癌症相关。WNT通路的激活可维持肿瘤细胞处于未分化的状态和/或导致不可控的增殖。因此，致癌作用可通过超越控制正常发育和组织修复的稳态机制而进行(在Reya&Clevers,2005,Nature,434:843-50；Beachy等人，2004,Nature,432:324-31中进行了综述)。
MET通路和WNT通路两者已被确定为癌症治疗的潜在靶标。本发明的一个目的是提供用于癌症治疗的改进的分子，特别是特异性结合人MET和WNT通路的一个或更多个WNT组件(例如WNT蛋白)的双特异性试剂。本发明的另一个目的是利用这些新的双特异性试剂来调节MET通路和WNT通路并抑制肿瘤生长。
发明内容
本发明提供结合MET、WNT通路的一个或更多个组件或者MET和WNT通路的一个或更多个组件两者的结合剂，例如抗体、可溶性受体或双特异性试剂，以及包含所述结合剂的组合物，例如药物组合物。还提供了结合MET、结合WNT通路的一个或更多个组件，或结合MET和WNT通路的一个或更多个组件两者的结合剂以及这样的结合剂的药物组合物。在某些实施方案中，所述结合剂是新的多肽，例如抗体、抗体片段以及与这样的抗体相关的其它多肽。在某些实施方案中，所述结合剂是新的多肽，例如可溶性受体以及与这样的可溶性受体相关的其它多肽。在某些实施方案中，所述结合剂是特异性结合人MET的抗体。在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合一个或更多个人WNT蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合一个或更多个人Frizzled(FZD)蛋白的抗体。在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合一个或更多个人WNT蛋白的可溶的FZD受体。在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合人MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合人MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合人MET和一个或更多个人FZD蛋白的双特异性分子。本发明还提供通过向肿瘤受试者施用所述结合剂抑制肿瘤生长的方法。本发明还提供通过向有需要的受试者施用所述结合剂来治疗癌症的方法。在一些实施方案中，治疗癌症或抑制肿瘤生长的方法包括利用所述结合剂靶向癌症干细胞。在某些实施方案中，所述方法包括减少肿瘤中癌症干细胞的频率、减少肿瘤中癌症干细胞的数量、降低肿瘤的致瘤性和/或通过减少肿瘤中癌症干细胞的数量或频率来减少肿瘤的致瘤性。
在一个方面，本发明提供了特异性结合人MET的结合剂，例如抗体。在一些实施方案中，所述结合剂抑制MET结合于肝细胞生长因子上。在一些实施方案中，所述结合剂抑制MET激活。在某些实施方案中，所述结合剂(例如双特异性试剂)除了结合人MET之外还特异性结合人WNT通路的一个或更多个组件。在某些实施方案中，所述结合剂(例如双特异性试剂)除了结合人MET之外还特异性结合一个或更多个人FZD蛋白。在某些实施方案中，所述结合剂(例如双特异性试剂)除了结合人MET之外还特异性结合一个或更多个人WNT蛋白。
在某些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的Sema结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的Sema结构域内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的PSI(神经丛蛋白-脑信号蛋白-整合素)结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的IPT(免疫球蛋白样折叠、神经丛蛋白、转录因子)结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的一个或更多个IPT重复结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合所述Sema结构域、所述PSI结构域和/或人MET的一个或更多个IPT重复结构域。
在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸25-932(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸25-836(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸25-515(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸50-130(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸70-110(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的包含氨基酸97-101的表位(SEQIDNO:93)。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合包含SEQIDNO:93的99位上的谷氨酰胺的表位。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸519-562(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸563-950(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸563-836(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸563-656(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸657-740(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸741-855(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合在人MET的氨基酸856-950(SEQIDNO:93)内。
在一些实施方案中，所述结合剂是特异性结合人MET的抗体。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗体，其包括含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是抗体，其包括与SEQIDNO:7具有至少约80％序列同一性的重链可变区和/或与SEQIDNO:8具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述结合剂包括与SEQIDNO:7具有至少约90％序列同一性的重链可变区和/或与SEQIDNO:8具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述结合剂包括与SEQIDNO:7具有至少约95％序列同一性的重链可变区和/或与SEQIDNO:8具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述结合剂是抗体，其包括SEQIDNO:7的重链可变区和/或SEQIDNO:8的轻链可变区。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是抗体，其包括与SEQIDNO:94具有至少约80％序列同一性的重链可变区和/或与SEQIDNO:95具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述结合剂包括与SEQIDNO:94具有至少约90％序列同一性的重链可变区和/或与SEQIDNO:95具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述结合剂包括与SEQIDNO:94具有至少约95％序列同一性的重链可变区和/或与SEQIDNO:95具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述结合剂是抗体，其包括SEQIDNO:94的重链可变区和/或SEQIDNO:95的轻链可变区。在某些实施方案中，所述结合剂是抗体，其包括SEQIDNO:94的重链可变区和SEQIDNO:95的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗体，其包括SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:88、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111或SEQIDNO:112的重链和/或SEQIDNO:11、SEQIDNO:14、SEQIDNO:98或SEQIDNO:101的轻链。
在一些实施方案中，所述结合剂是抗体73R009。在一些实施方案中，所述结合剂是抗体73R009的变体。在一些实施方案中，所述结合剂是73R009的单价变体。在一些实施方案中，所述结合剂是抗体73R009的人源化变体。在一些实施方案中，所述结合剂是抗体73R009H12L7，也被称为73R010。在一些实施方案中，所述结合剂是抗体73R010的变体，其包括半胱氨酸残基被丝氨酸残基替代以减少不希望的二硫键形成。参照抗体“73R010”，包括用半胱氨酸替代的变体。
在另一个方面，本发明提供是双特异性试剂的结合剂，其中所述双特异性试剂特异性结合人MET。在一些实施方案中，所述双特异性试剂特异性结合人MET和第二靶标。在一些实施方案中，所述双特异性试剂结合人MET和人WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，所述双特异性试剂结合人MET和一种或多种人WNT蛋白两者。在一些实施方案中，所述双特异性试剂是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体结合人MET和人WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，所述双特异性抗体结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性抗体结合人MET和一个或更多个人FZD蛋白。在某些实施方案中，所述双特异性抗体包含两条相同的轻链。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG1抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是IgG2抗体。
在另一个方面，本发明提供了双特异性试剂，其包括包含第一结合位点的第一臂和包含第二结合位点的第二臂。在一些实施方案中，所述第一结合位点包括来自第一抗体的第一抗原结合位点并且所述第二结合位点包括来自第二抗体的第二抗体结合位点。在一些实施方案中，所述第一结合位点包括来自抗体的抗原结合位点并且所述第二结合位点包括不是来自抗体的结合位点。在一些实施方案中，所述第一臂包括单价抗体并且所述第二臂包括可溶性受体。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括包含ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、包含YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和包含KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3。在一些实施方案中，所述双特异性试剂还包括：包含SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、包含STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和包含HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：特异性结合人MET的第一结合位点，其中所述第一结合位点包括(a)包含ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、包含YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和包含KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3以及包含SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、包含STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和包含HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括包含GYTFTSYWLH(SEQIDNO:78)的重链CDR1、包含GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQIDNO:79)的重链CDR2和包含TYGSYVSPLDY(SEQIDNO:81)、SYGSYVSPLDY(SEQIDNO:82)、ATYGSYVSPLDY(SEQIDNO:83)或XYGSYVSPLDY(SEQIDNO:80)的重链CDR3，其中X不是R；以及包含KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQIDNO:84)的轻链CDR1、含有WASTRES(SEQIDNO:85)的轻链CDR2和包含QQYYAYPWT(SEQIDNO:86)的轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括来自第一抗体的第一抗原结合位点，并且第二结合位点包括来自第二抗体的第二抗原结合位点。因此，在一些实施方案中，所述双特异性试剂是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述第二结合位点特异性地结合一个或更多个人WNT蛋白。在一些实施方案中，所述一个或更多个WNT蛋白选自由WNT1、WNT2、WNT2B、WNT3、WNT3a、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT10a和WNT10b所组成的组。在一些实施方案中，所述第二结合位点特异性结合一个或更多个Frizzled(FZD)蛋白。在一些实施方案中，所述一个或更多个FZD蛋白选自由FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10所组成的组。在一些实施方案中，所述一个或更多个FZD蛋白选自FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或多个组件的第二结合位点，其中所述第二结合位点包括可溶性受体。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括人FZD蛋白的细胞外结构域(ECD)。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括人FZD蛋白的ECD片段。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括人FZD蛋白的Fri结构域。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括人FZD1的Fri结构域、人FZD2的Fri结构域、人FZD3的Fri结构域、人FZD4的Fri结构域、人FZD5的Fri结构域、人FZD6的Fri结构域、人FZD7的Fri结构域、人FZD8的Fri结构域、人FZD9的Fri结构域或人FZD10的Fri结构域。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括人FZD8的Fri结构域。在一些实施方案中，所述可溶性受体包含人FZD蛋白的Fri结构域，其包括选自由SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30和SEQIDNO:31所组成的组中的序列。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括人FZD蛋白的最小核Fri结构域，其包括选自由SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40和SEQIDNO:41所组成的组中的序列。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:39的人FZD蛋白的Fri结构域。在一些实施方案中，所述人FZD蛋白的Fri结构域直接连接至异源多肽(即非FZD多肽)。在一些实施方案中，所述人FZD蛋白的Fri结构域通过接头连接至异源多肽。在一些实施方案中，所述异源多肽包括人Fc区。在一些实施方案中，所述异源多肽包括：SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:91或SEQIDNO:92。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括：(a)SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40或SEQIDNO:41的第一多肽；以及(b)SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:91或SEQIDNO:92的第二多肽，其中所述第一多肽直接连接至第二多肽。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括：(a)SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40或SEQIDNO:41的第一多肽；以及(b)SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:91或SEQIDNO:92的第二多肽，其中所述第一多肽通过接头连接至所述第二多肽。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括包含SEQIDNO:28的第一多肽。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括SEQIDNO:28的第一多肽。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括SEQIDNO:28的第一多肽和SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括包含SEQIDNO:29的第一多肽。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括SEQIDNO:29的第一多肽。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括SEQIDNO:29的第一多肽和第二多肽SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47或SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括SEQIDNO:52或SEQIDNO:50。在一些实施方案中，所述可溶性受体包括SEQIDNO:52。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一臂和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二臂，其中所述第一臂包括包含ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和包含KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3以及包含SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、包含STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和包含HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3，并且其中所述第二臂包括SEQIDNO:56或SEQIDNO:87。
在一些实施方案中，双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括与SEQIDNO:7具有至少约90％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一抗原结合位点包括与SEQIDNO:7具有至少约95％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一抗原结合位点包括SEQIDNO:7的重链可变区和SEQIDNO:8的轻链可变区。
在一些实施方案中，双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一臂和特异性结合WNT通路的一个或多个组件的第二臂，其中所述第一臂包括与SEQIDNO:7具有至少约90％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8具有至少约90％序列同一性的轻链可变区，并且其中所述第二臂包括SEQIDNO:56或SEQIDNO:87。
在一些实施方案中，双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括与SEQIDNO:94具有至少约90％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:95具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一抗原结合位点包括与SEQIDNO:94具有至少约95％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:95具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在一些实施方案中，所述第一抗原结合位点包括SEQIDNO:94的重链可变区和SEQIDNO:95的轻链可变区。
在一些实施方案中，双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一臂和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二臂，其中所述第一臂包括与SEQIDNO:94具有至少约90％序列同一性的的重链可变区和与SEQIDNO:95具有至少约90％序列同一性的轻链可变区，并且其中所述第二臂包括SEQIDNO:56或SEQIDNO:87。
在一些实施方案中，双特异性试剂包括(a)结合人MET的KD为约0.1nM至约1.0nM的第一结合位点以及(b)特异性结合人WNT通路的一个或更多个组件的KD为约0.1nM至约20nM的第二结合位点。
在上述各方面的某些实施方案中以及本文别处所述其它方面和/或实施方案中，所述结合剂是分离的。在上述各方面的实施方案中以及本文别处所述其它方面和/或实施方案中，所述结合剂是基本上纯的。
在另一个方面，本发明提供选自SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNONO:111和SEQIDNO:112所组成的组中的多肽。在一些实施方案中，所述多肽是分离的。在某些实施方案中，所述多肽是基本上纯的。在某些实施方案中，所述多肽是抗体或抗体的一部分，例如抗体片段。在一些实施方案中，所述多肽是可溶性受体或可溶性受体的片段。在一些实施方案中，所述多肽是融合蛋白。
本发明进一步提供包含本文所述的双特异性试剂、抗体、可溶性受体和/或多肽的细胞。本发明进一步提供产生本文所述的双特异性试剂、抗体、可溶性受体和/或多肽的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。
在另一个方面，本发明提供分离的多核苷酸分子，其包含编码上述各方面以及本文所述其它方面和/或实施方案的结合剂和/或多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含编码选自以下所组成的组中的序列的多核苷酸：SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、SEQIDNO:108、SEQIDNO::110、SEQIDNO:111和SEQIDNO:112。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含选自以下所组成的组中的序列：SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107和SEQIDNO:109。
本发明进一步提供包含所述多核苷酸的表达载体以及包含所述表达载体和/或所述多核苷酸的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述细胞是真核细胞。
进一步提供包含本文所述的结合剂、双特异性试剂、抗体、可溶性受体和/或多肽以及药学上可接受的载体的药物组合物。
在另一个方面，本发明提供使用本文所述的结合剂、双特异性试剂、抗体、可溶性受体和/或多肽的方法。在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤与本文所述的有效量的双特异性试剂或抗体相接触。在一些实施方案中，抑制受试者中肿瘤生长的方法包括向受试者施用本文所述的治疗有效量的双特异性试剂或抗体。在一些实施方案中，通过降低肿瘤中癌症干细胞的频率降低受试者中肿瘤的致瘤性的方法包括向受试者施用本文所述的治疗有效量的双特异性试剂或抗体。在一些实施方案中，降低受试者中肿瘤的癌症干细胞的频率的方法包括向受试者施用本文所述的治疗有效量的双特异性试剂或抗体。在一些实施方案中，抑制受试者中肿瘤的上皮-间质转化(EMT)的方法包括向受试者施用本文所述的治疗有效量的双特异性试剂或抗体。在一些实施方案中，所述肿瘤选自由结直肠肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾脏肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤以及头颈肿瘤所组成的组。
在一些实施方案中，治疗受试者中癌症的方法包括向受试者施用本文所述的治疗有效量的双特异性试剂或抗体。本发明还提供用于治疗癌症的方法中的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体是本文所述的试剂或抗体。本发明还提供了本文所述的双特异性试剂或抗体用于制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，所述癌症选自由结肠直肠癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠道癌、黑色素瘤、宫颈癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤以及头颈癌所组成的组。在一些实施方案中，方法进一步包括施用至少一种另外的治疗剂。
本发明还提供用于治疗癌症的方法中的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体是本文所述的试剂或抗体。本发明还提供本文所述的双特异性试剂或抗体用于制备用于治疗癌症的药物中的用途。
还提供了治疗方法，包括向受试者(例如人)施用本文所述的有效量的结合剂、双特异性试剂、抗体、可溶性受体或多肽，其中所述结合剂、双特异性试剂、抗体、可溶性受体或多肽是药物组合物的一部分。
在另一个方面，本发明提供了识别或选择利用本文所述的粘合剂、双特异性试剂、抗体、可溶性受体或多肽治疗的人受试者的方法。在一些实施方案中，所述方法包括确定受试者是否具有相比于参比样品或预先确定的水平的升高的MET表达水平的肿瘤。在一些实施方案中，所述方法包括识别用于治疗或选择用于治疗的受试者，如果肿瘤的MET表达水平升高的话。
当本发明的方面或实施方案以马库什组或其它替代的分组进行描述时，本发明不仅包括作为整体列出的的整个组，而且单独地包括该组的每个成员以及主要组的所有可能的亚组，并且还有缺少组成员中的一个或更多个的所述主组。本发明还设想本发明要求保护的任何组成员中的一个或更多个。
附图说明
图1A。抑制肝细胞生长因子与人MET相结合。将仅利用HGF处理的细胞用作阳性对照并将未处理的转染细胞用作阴性对照。
图1B。抑制肝细胞生长因子与人MET相结合。利用人MET构建体瞬时转染HEK-293T细胞，然后随后与抗MET抗体5D5和肝细胞生长因子(HGF)相混合。特异性结合通过每个FACS图上的框覆盖层内信号的存在表示。以每个FACS图下显示结合百分率。每个FACS图下显示相比于两个阳性对照的结合百分率平均值而言的结合抑制百分率。
图1C。抑制肝细胞生长因子与人MET相结合。HEK-293T细胞被利用人MET构建体瞬时转染，然后随后与抗MET抗体73R009的单价变体和肝细胞生长因子(HGF)相混合。特异性结合通过每个FACS图上的框覆盖层内信号的存在表示。在每个FACS图下显示结合百分率。在每个FACS图下显示相比于两个阳性对照的结合百分率平均值而言的结合抑制百分率。
图1D。抑制肝细胞生长因子与人MET相结合。HEK-293T细胞被利用人MET构建体瞬时转染，然后随后与抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B06和肝细胞生长因子(HGF)相混合。特异性结合通过每个FACS图上的框覆盖层内信号的存在表示。在每个FACS图下显示结合百分率。在每个FACS图下显示相比于两个阳性对照的结合百分率平均值而言的结合抑制百分率。
图2。肝细胞生长因子诱导抑制MET活性。利用抗MET抗体73R009的单价变体、抗MET/FZD8双特异性试剂5D5/FZD8-Fc或抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B06将A549细胞预处理1小时，然后利用人肝细胞生长因子刺激。细胞裂解物通过Western印迹进行分析。
图3。抑制WNT信号传导。8xTCF-荧光素酶报告检测用于测定STF-293细胞中的WNT信号传导。利用抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B06(-◆-)或对照结合剂单价抗MET抗体5D5/FLAG(-X-)和单价FZD8-Fc/FLAG(-▲-)处理STF-293细胞。将细胞暴露于含有WNT3aL细胞条件培养基()或来自未过表达WNT3a的细胞的对照培养基(-●-)的培养基中。
图4A。抑制OMP-LU45肺肿瘤的生长。将LU45肺肿瘤细胞皮下注射给NOD/SCID小鼠。利用对照抗体(-●-)、单价抗MET抗体5D5(-□-)、单价FZD8-Fc/FLAG(-▲-)、二价FZD8-Fc(54F28)(-◆-)或抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂(-▼-)处理小鼠。数据显示为处理后随天数推移的肿瘤体积(mm3)。
图4B。抑制OMP-LU45肺肿瘤的生长。将LU45肺肿瘤细胞皮下注射给NOD/SCID小鼠。利用对照抗体(-●-)、单价抗MET抗体5D5(-□-)、单价FZD8-Fc/FLAG(-▲-)、二价FZD8-Fc(54F28)(-◆-)或抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂(-▼-)与紫杉醇的组合处理小鼠。数据显示为处理后随天数推移的肿瘤体积(mm3)。
图5。315B07的表位定位。HEK-293T细胞被利用sema构建体瞬时转染，然后随后与抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B07或抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂5D5/FZD8-Fc相混合。特异性结合通过FACS分析来测定。
图6。MET丝带结构表示抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B07的预测表位和抗MET抗体5D5的预测表位。
图7。抑制MMTV-WNT1乳腺肿瘤的生长。将MMTV-WNT1肿瘤细胞皮下注射给NOD/SCID小鼠。利用对照抗体(-■-)、二价FZD8-Fc(54F28)(-▼-)、抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B07(-○-)以30mg/kg或利用抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B07以60mg/kg(-Δ-)处理小鼠。数据显示为处理后随天数推移的肿瘤体积(mm3)。
图8。抑制KP4胰腺肿瘤的生长。将KP4胰腺肿瘤细胞皮下注射给NOD/SCID小鼠。利用对照抗体(-■-)、抗FZD抗体18R5(-▼-)、单价FZD8-Fc/FLAG(-Δ-)、单价抗MET抗体5D5/FLAG(-●-)或抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂(-○-)处理小鼠。数据显示为处理后随天数推移的肿瘤体积(mm3)。
图9。抑制OMP-LIV1肝细胞癌肿瘤的生长。将OMP-LIV1肝细胞癌(HCC)肿瘤细胞皮下注射给NOD/SCID小鼠。利用索拉非尼(-■-)、单价抗MET/FLAG与索拉非尼的组合(-▼-)、单价FZD8-Fc/FLAG与索拉非尼的组合(-●-)或抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B07与索拉非尼的组合(-Δ-)处理小鼠。数据显示为处理后随天数推移的肿瘤体积(mm3)。
具体实施方式
本发明提供结合MET、结合WNT通路的一个或更多个组件或结合MET和WNT通路的一个或更多个组件两者的新结合剂。如本文所使用的短语“WNT通路的组件”一般是指一个或更多个WNT蛋白和/或一个或更多个FZD蛋白。还提供了相关的多肽和多核苷酸、包含所述结合剂的组合物以及制备所述结合剂的方法。进一步提供使用所述新结合剂的方法，例如抑制肿瘤生长的方法、治疗癌症的方法、降低肿瘤的致瘤性的方法、降低肿瘤中癌症干细胞的频率的方法、抑制EMT的方法、抑制血管生成的方法和/或识别和/或选择用于治疗的受试者的方法。
已鉴别出特异性结合人MET的单克隆抗体即抗体73R009。制备了抗体73R009的人源化变体即抗体73R010。抗体73R009对人MET的结合亲和力为约1.1nM，而不结合小鼠MET。已制备了所述抗体的单价变体，其对人MET的结合亲和力为1.4nM。已制备了特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂315B06、315B07和315B09。双特异性试剂315B06对人MET的结合亲和力为1.8nM，而不结合小鼠MET。双特异性试剂315B07对人MRT的结合亲和力为约125pM，而不结合小鼠MET。双特异性试剂315B06抑制人肝细胞生长因子(HGF)与人MET相结合(实施例2，图1)。双特异性试剂315B06抑制HGF诱导的MET的活性(实施例3，图2)。双特异性试剂315B06抑制WNT通路信号传导(实施例4，图3)。测定了双特异性试剂315B07的人MET表位并显示其与抗Met抗体5D5的单价表位不同(实施例7，图5和6)。包含抗MET抗体和FZD8-Fc的双特异性试剂当与紫杉醇组合时抑制人肺肿瘤的生长(实施例5，图4)。包含抗MET抗体和FZD8-Fc的双特异性试剂抑制人乳腺肿瘤(实施例8，图7)、人胰腺肿瘤(实施例9，图8)以及人肝肿瘤(实施例10，图9)的生长。
I、定义
为了便于理解本发明，对一些术语和短语定义如下。
如本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子，其识别并通过该免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原结合位点特异性结合靶标，例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或其组合。如本文所用的所述术语包括含有抗体的抗原结合位点的完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、单链抗体、抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体例如双特异性抗体、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、融合蛋白以及含有抗原结合位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子，只要所述抗体表现出所希望的生物活性即可。抗体可以是五个主要类别的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM中的任何一种或其亚型(同型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)，基于其重链恒定结构域的标识分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和众所周知的亚基结构和三维构型。抗体可以是裸露的或缀合至其它分子上，包括但不限于毒素和放射性同位素。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。如本文所用的“抗体片段”包括至少一个抗原结合位点或表位结合位点。
术语抗体“可变区”是指抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区，单独或相组合。重链或轻链的可变区通常由通过3个互补决定区(CDR)连接的四个框架区(FR)组成，也被称为“超变区”。每条链中的CDR通过框架区紧密保持在一起，并与来自另一条链的CDR一起促进形成抗体的抗原结合位点。有至少两种技术用于决定CDR：(1)基于跨物种序列变异性的方法(即Kabat等人，1991,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEdition,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD)，和(2)基于抗原-抗体复合物的晶体学研究的方法(Al-Lazikani等人，1997，J.Mol.Biol.,273:927-948)。此外，这两种方法的组合有时在本技术领域中用于确定CDR。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指涉及高度特异性识别并结合单个抗原决定簇或表位的同源抗体群。这与通常包括针对各种不同抗原决定簇的不同抗体的混合物的多克隆抗体形成对比。术语“单克隆抗体”包括完整的全长单克隆抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv)、单链(scFv)抗体、包含抗体部分的融合蛋白以及包含抗原结合位点的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单克隆抗体”是指通过任何数目的技术包括但不限于杂交瘤制备、噬菌体选择、重组表达和转基因动物制备的这样的抗体。
如本文所使用的术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠科动物)抗体形式，其是特异性的免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其包含最小非人序列的片段。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中CDR残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠)的具有所希望的特异性、亲和力和/或结合能力的CDR残基替代(Jones等人，1986,Nature,321:522-525；Riechmann等人，1988,Nature,332:323-327；Verhoeyen等人，1988,Science,239:1534-1536)。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人物种的具有所希望的特异性、亲和力和/或结合能力的抗体中的对应的残基替代。人源化抗体可以通过替代Fv框架区和/或替代的非人残基内的其它残基而进一步被修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和性和/或结合能力。一般情况下，所述人源化抗体将包括基本上所有的至少一个并且通常两个可变结构域，该可变结构域包括所有或基本上所有对应于非人免疫球蛋白的CDR，而所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。所述人源化抗体也可包括通常是人免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。用于制备人源化抗体的方法是本领域中众所周知的。
如本文所用的术语“人抗体”是指由人产生的抗体或具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。可以使用本领域中已知的任何技术制备人抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人CDR的人源化抗体。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指其中所述免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自两个或更多个物种的抗体。通常，轻链和重链两者的可变区对应于衍生自一种具有所希望的特异性、亲和力和/或结合能力的哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔等)物种的抗体可变区，而恒定区对应于衍生自另一物种(通常是人)的抗体序列。
如本文所用的短语“亲和力成熟的抗体”是指其一个或更多个CDR中具有一个或更多个改变的抗体，相比于不具有这些改变的亲本抗体而言导致抗体对抗原的亲和力增加。该定义还包括非CDR残基中的改变，与CDR残基改变相结合。优选的亲和力成熟的抗体对靶抗原的亲和力将为纳摩尔或甚至皮摩尔量级。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知的方法制备。例如，Marks等人，1992,Bio/Technology10:779-783通过VH和VL结构域混编描述亲和力成熟。CDR和/或框架残基的随机突变在Barbas等人，1994,PNAS,91:3809-3813；Schier等人，1995,Gene,169:147-155；Yelton等人，1995,J.Immunol.155:1994-2004；Jackson等人，1995,J.Immunol.,154:3310-9以及Hawkins等人，1992,J.Mol.Biol.,226:889-896中进行了描述。定点突变也可用于获得亲和力成熟的抗体。
术语“表位”和“抗原决定子”在本文可互换使用并且是指能被识别并特异性结合特定抗体的抗原部分。当所述抗原是多肽时，表位可由相邻的氨基酸和通过蛋白质的三级折叠而并列的非相邻的氨基酸两者形成。由相邻氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位(还称为构象表位)通常在蛋白质变性时失去。在一个独特的空间构象中，表位通常包括至少3个，更通常至少5个或8-10个氨基酸。
术语“异源多聚体分子”或“异源多聚体”或“异源多聚体复合物”或“异源多聚体多肽”在本文可互换使用，是指包括至少第一多肽和第二多肽的分子，其中在氨基酸序列方面，所述第二多肽与所述第一多肽至少有一个氨基酸残基不同。所述异源多聚体分子可包括由第一和第二多肽形成的“异二聚体”或“异二聚体剂”或者可在存在其它多肽时形成更高阶的三级结构。
如本文所用的术语“拮抗剂”和“拮抗”是指部分或完全阻断、抑制、降低或中和靶标和/或信号传导通路(例如WNT通路或MET通路)的生物活性的任何分子。如本文所用的术语“拮抗剂”包括部分或完全阻断、抑制、降低或中和蛋白质活性的任何分子。合适的拮抗剂分子具体包括但不限于拮抗剂抗体、抗体片段、可溶性受体或可溶性受体片段。
如本文所用的术语“调节”和“调控”是指生物学活性的变化或改变。调节包括但不限于刺激或抑制活性。调节可以是活性增强或降低(例如通路信号传导减少)、结合特征改变或者与蛋白质活性、通路或所研究的其它生物学观点相关的生物学、功能或免疫学特性的任何其它变化。
术语“选择性结合”或“特异性结合”意指结合剂或抗体与所述表位、蛋白质或靶分子反应或关联相比于可替代物质(包括不相关或相关的蛋白质)更频繁、更迅速、更持久、亲和力更大或它们的一些组合。在某些实施方案中，“特异性结合”意指例如抗体与KD为约0.1mM或更小但更通常小于约1μM的蛋白质结合。在某些实施方案中，“特异性结合”意指抗体有时与KD为至少约0.1μM或更小、有时与KD为至少约0.01μM或更小以及有时与KD为至少约1nM或更小的靶标结合。由于不同物种中同源蛋白之间的序列同一性，特异性结合可包括识别多于一个物种的蛋白质(例如人MET和小鼠MET)的抗体。同样，由于不同蛋白质的多肽序列的某些区域内的同源性，特异性结合可包括识别多于一种蛋白质(例如人WNT1和人WNT7)的抗体(或其它多肽或结合剂)。可以理解的是，在某些实施方案中，特异性结合第一靶标的抗体或结合剂可以或不可特异性结合第二靶标。因此，“特异性结合”不一定需要(虽然其可包括)专一性结合，即不一定需要结合单个靶标。因此，在某些实施方案中，结合剂可特异性结合多于一个的靶标。在某些实施方案中，多个靶标可通过试剂或抗体上的相同结合位点相结合。例如，在某些情况下，抗体可包括两个相同的抗原结合位点，其中每一个特异性结合两个或更多个蛋白质上的相同表位。在某些可替代的实施方案中，抗体可以是双特异性的或多特异性的并且包括具有不同特异性的至少两个抗原结合位点。举非限制性实施例而言，双特异性试剂可包括识别一种蛋白质上的靶标(例如人MET)的一个结合位点并进一步包括识别第二蛋白质上不同靶标的第二不同结合位点(例如人WNT蛋白质)。通常，但不必需地，所提到的结合意指特异性结合。
术语“多肽”和“肽”以及“蛋白质”在本文可互换使用并且是指任何长度的氨基酸聚合物。所述聚合物可以是线性的或分支的，其可包括改性氨基酸并且可被非氨基酸中断。所述术语还包括已天然改性或通过插入改性的氨基酸聚合物；例如通过插入二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或改性(例如与标记组分缀合)而改性。还包括在所述定义内的是例如含有一种或更多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽以及本领域已知的其它改性的多肽。可以理解的是，由于本发明的多肽可以基于抗体，因此，在某些实施方案中，所述多肽可以单链或结合链(例如二聚物)存在。
术语“多核苷酸”和“核酸”在本文可互换使用并且是指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、改性核苷酸或碱基和/或其类似物或者可以通过DNA或RNA聚合酶掺入到聚合物中的任何底物。
“高严格条件”可通过这些条件定义：(1)采用低离子强度和高温清洗，例如15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)在杂交过程中采用变性剂例如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺，含有0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液，pH6.5，5×SSC(0.75M氯化钠，75mM柠檬酸钠)，42℃；或(3)在杂交过程中采用50％甲酰胺，5×SSC，50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt溶液，超声处理的鲑鱼精子DNA(50μg/ml)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，42℃，在42℃下在0.2×SSC和50％甲酰胺中清洗，然后在55℃通过由含有EDTA的0.1×SSC组成的清洗液进行高严格清洗。
在两个或更多个核酸或多肽的背景中，术语“相同的”或百分比“同一性”是指当相比和比对最大对应情形(引入缺口，如果需要的话)时，两个或更多个序列或子序列相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基，不考虑作为序列同一性的一部分的任何保守氨基酸替代。所述百分比同一性可以使用序列比对软件或算法或通过视觉观察来测定。可用于获得氨基酸或核苷酸序列比对的各种算法和软件是本领域中众所周知的。这些包括但不限于BLAST、ALIGN、Megalign、BestFit、GCGWisconsin软件包及其变体。在一些实施方案中，本发明的两个核酸或多肽是基本上相同的，意指当相比和比对最大对应情形时，使用序列比对算法或通过视觉观察测定时，它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、并且在一些实施方案中至少95％、96％、97％、98％、99％的核苷酸或氨基酸残基同一性。在一些实施方案中，同一性存在于至少约10个、至少约20个、至少约40-60个残基、至少约60-80个残基长度或介于其间的任何整数值的序列区域中。在一些实施方案中，同一性存在于大于60-80个残基，例如至少约80-100个残基的区域中，并且在一些实施方案中，所述序列的比对序列例如核苷酸序列的编码区的全长基本上相同。
“保守氨基酸替代”是指其中一个氨基酸残基被具有相似侧链的另一个氨基酸残基替代。具有相似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸替代酪氨酸是保守替代。优选地，本发明的多肽和抗体的序列中的保守替代不排除含有氨基酸序列的多肽或抗体与抗原的结合，所述多肽或抗体与该抗原结合。识别不排除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守替代的方法是本领域中众所周知的。
本文所用的术语“载体”意指构建体，其能递送并且通常表达宿主细胞中所研究的一个或更多个基因或序列。载体的实例包括但不限于病毒载体、裸露的DNA或RNA表达载体、质粒、粘粒或噬菌体载体、与阳离子缩合剂相关的DNA或RNA表达载体和包封在脂质体中的DNA或RNA表达载体。
如本文所用的术语“可溶性受体”是指在可由可溶形式细胞分泌的受体的第一跨膜结构域之前的受体蛋白的细胞外结构域(或其片段)。通常，这是所述受体蛋白的N末端部分。
如本文所用的术语“FZD可溶性受体”或“可溶性FZD受体”是指在可由可溶形式细胞分泌的受体的第一跨膜结构域之前的FZD受体蛋白的N末端细胞外片段。包括整个N-末端细胞外结构域(ECD)的FZD可溶性受体以及较小的片段包括在所述术语中。因此，包括FZDFri结构域的FZD可溶性受体也包括在该术语中。
“分离的”多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是自然界中不存在的形式的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物。分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物包括那些已纯化至它们不再以其自然界中发现的形式存在的程度。在一些实施方案中，分离的多肽、抗体、多核苷酸、载体、细胞或组合物是基本上纯的。
如本文所用的术语“基本上纯的”是指至少50％纯(即不含污染物)、至少90％纯、至少95％纯、至少98％纯或至少99％纯度的材料。
如本文所用的术语“癌症”和“癌的”是指或描述哺乳动物的生理状况，其中细胞群的特征在于不受调节的细胞生长。癌症的实例包括但不限于癌、母细胞瘤、肉瘤和血癌例如淋巴瘤和白血病。
如本文所用的术语“肿瘤”和“赘生物”是指由过度细胞生长或增殖导致的任何组织块，其是良性的(非癌的)或恶性的(癌的)，包括癌前病变。
如本文所用的术语“转移”是指其中癌症从起始位置扩散或转移至具有相似癌病变发展的身体其它区域的新位置的过程。“转移的”或“正转移的”细胞是失去与相邻细胞的粘附接触并从疾病的起始位置迁移(例如通过血液或淋巴)至第二位置。
术语“癌症干细胞”和“CSC”和“肿瘤干细胞”以及“肿瘤起始细胞”在本文可互换使用并且是指来自癌症或肿瘤的细胞，其：(1)具有广泛的增殖能力；(2)能进行不对称细胞分裂以产生一个或更多个类型的分化细胞后代，其中所述分化细胞具有降低的和/或有限的增殖或发育潜能；以及(3)能进行自我更新或自我维持的对称细胞分裂。与不能形成肿瘤的大多数肿瘤细胞相比较，这些属性赋予癌症干细胞在连续移植到免疫受损的宿主(例如小鼠)中时形成或建立肿瘤或癌症的能力。癌症干细胞进行混乱形式的自我更新与分化，以形成异常细胞类型的肿瘤，其可随着时间的推移在发生突变时变化。
术语“癌细胞”和“肿瘤细胞”是指由癌症或肿瘤或癌前期病变衍生的总细胞群，包括非致瘤性细胞(其包括大部分癌细胞群)和致瘤性干细胞(癌干细胞)。如本文所用的术语“癌细胞”或“肿瘤细胞”当仅仅是指缺乏更新和分化以区分那些肿瘤细胞与癌症干细胞的能力的那些细胞时，将利用术语“非致瘤性”进行修饰。
如本文所用的术语“致瘤性的”是指癌症干细胞的功能特征，包括自我更新(产生其它致瘤性癌症干细胞)和增殖以产生所有其它肿瘤细胞(产生分化的并因此非致瘤性的肿瘤细胞)的性质。
如本文所用的术语“致瘤性”是指来自肿瘤的随机细胞样品在连续移植到免疫受损的宿主(例如小鼠)时而形成可触及的肿瘤的能力。该定义还包括在连续移植到免疫受损的宿主(例如小鼠)时而形成可触及的肿瘤的富集和/或分离的癌症干细胞群。
术语“受试者”是指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、啮齿动物等等，其将成为特别治疗的接受者。典型地，术语“受试者”和“患者”在本文可参照人受试者互换使用。
术语“药学上可接受的”是指由联邦政府或州政府的管理机构批准的(或可批准的)或列于美国药典或其它公认的药典中用于包括人在内的动物的产品或化合物。
术语“药学上可接受的赋形剂、载体或佐剂”或“可接受的药物载体”是指可与本发明公开内容的至少一种结合剂一起施用给受试者而不破坏所述结合剂活性的赋形剂、载体或佐剂。当以足以递送治疗效果的剂量与结合剂一起施用时，所述赋形剂、载体或佐剂应是无毒的。
术语“有效量”或“治疗有效量”或“治疗作用”是指有效“治疗”受试者或哺乳动物的疾病或病症的结合剂、抗体、多肽、多核苷酸、有机小分子或其它药物的量。在癌症情形下，治疗有效量的药物(例如抗体)具有治疗效果，并且因此可减少癌细胞的数量；降低致瘤性、致瘤频率或致瘤能力；减少癌干细胞的数量或频率；减小肿瘤体积；减少癌症细胞群；抑制和/或停止癌细胞浸润到周围器官中，包括例如癌症扩散到软组织和骨中；抑制和/或阻止肿瘤或癌细胞转移；抑制和/或阻止肿瘤或癌细胞生长；在某种程度上减轻一种或更多种与癌症相关的症状；降低发病率和死亡率；提高生活质量；或者这样的效果的组合。在试剂例如抗体防止生长和/或杀死现有癌细胞的程度上，它可以被称为抑制细胞的和/或细胞毒的。
术语“正治疗”或“治疗”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解”是指1)治愈、减慢、减轻症状和/或停止诊断的病理状况或病症的进展的治疗措施和2)防止或减缓靶标病理状况或病症的发展的预防性或防止措施。因此，需要治疗的那些包括已患有所述病症的那些；倾向于患所述病症的那些和其中所述病症将被预防的那些。在一些实施方案中，如果患者出现以下一种或更多种情形，则受试者被根据本发明的方法成功“治疗”：癌细胞数量减少或完全不存在；肿瘤尺寸减小；肿瘤生长被抑制；浸润到周围器官中的癌细胞(包括癌细胞扩散到软组织和骨中)被抑制或不存在；肿瘤或癌细胞转移被抑制或不存在；癌症生长或被抑制不存在；与特定癌症相关的一种或更多种症状减轻；发病率和死亡率降低；生活质量改善；致瘤性降低；癌干细胞的数量或频率减少或一些效果的组合。
本发明公开内容和权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式，除非上下文另有明确说明。
应当理解的是，当在本文中以语言“包括”描述实施方案时，还提供“由......组成”和/或“基本上由......组成”来描述其它类似的实施方案。还应当理解的是，当在本文中以语言“基本上由......组成”描述实施方案时，还提供以术语“由......组成”来描述其它类似的实施方案。
本文中的术语“和/或”以短语“A和/或B”使用时是指包括A和B两者；A或B；A(单独)和B(单独)。同样，术语“和/或”以短语例如“A、B和/或C”使用时旨在包括以下每个实施方案：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)和C(单独)。
II、MET结合剂
本发明提供特异性结合人MET的试剂。这些试剂在本文中称为“MET结合剂”。短语“MET结合剂”包括仅结合MET的试剂以及结合MET和至少一种其它靶标或抗原二者的双特异性试剂。因此，在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合人MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合MET和至少一种其它靶标或抗原。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET和WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET和一个或更多个WNT蛋白。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET和一个或更多个FZD蛋白。在一些实施方案中，所述MET结合剂是多肽。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗体。在一些实施方案中，所述MET结合剂是单价抗体。在一些实施方案中，所述MET结合剂是异二聚体。在某些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性抗体。在某些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是包括可溶性受体的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性地结合MET的包括单价抗体的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是包括特异性结合MET的单价抗体以及特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的单价抗体的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是包括特异性结合MET的单价抗体和特异性结合一个或更多个WNT蛋白的可溶性受体的双特异性试剂(例如异二聚体试剂)。
在某些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合人MET的细胞外结构域。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合人MET的Sema结构域。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的Sema结构域内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合人MET的Sema结构域的α链。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合人MET的Sema结构域的β链。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的PSI(神经丛蛋白-脑信号蛋白-整合素)结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的IPT(免疫球蛋白样折叠、神经丛蛋白、转录因子)结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的一个或更多个IPT重复结构域。在一些实施方案中，所述结合剂特异性结合人MET的Sema结构域、PSI结构域和/或一个或更多个IPT重复结构域。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合人MET的Sema结构域而不特异性结合小鼠MET的Sema结构域。
在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸25-932(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸25-836(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸25-515(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸25-307(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸308-515(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸50-130(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸70-110(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸90-110(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合包括在人MET的氨基酸97-101(SEQIDNO:93)的表位。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合包括对应于SEQIDNO:93的99位的谷氨酰胺的表位。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合包括氨基酸PCQDC(SEQIDNO:113)的表位。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸519-562(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸563-950(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸563-836(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸563-656(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸657-740(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合在人MET的氨基酸741-855(SEQIDNO:93)内。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性在人结合MET的氨基酸856-950(SEQIDNO:93)内。
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合人MET的MET结合剂，其中所述MET结合剂包括含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3。在一些实施方案中，所述MET结合剂还包括含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括：(a)含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3，以及(b)含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合人MET的MET结合剂，其中所述MET结合剂包括：(a)含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1或其包括1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(b)含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2或其包括1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(c)含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3或其包括1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(d)含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1或者其包括1、2、3或4个氨基酸取代的变体；(e)含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2或其包括1、2、3或4个氨基酸取代的变体；以及(f)含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3或其包括1、2、3或4个氨基酸取代的变体。在某些实施方案中，所述氨基酸取代是保守取代。在一些实施方案中，所述取代是识别和/或制备种系人源化过程的一部分。
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合MET的MET结合剂，其中所述MET结合剂包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约80％序列同一性的重链可变区以及与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的重链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括与IDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括与SEQIDNO:7具有至少约95％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括与SEQIDNO:94具有至少约95％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:95具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:7的重链可变区和含有SEQIDNO:8的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:94的重链可变区和含有SEQIDNO:95的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括基本上由SEQIDNO:7组成的重链可变区和基本上由SEQIDNO:8组成的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括基本上由SEQIDNO:94组成的重链可变区和基本上由SEQIDNO:95组成的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:7的重链可变区和SEQIDNO:8的轻链可变区。在某些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:94的重链可变区和SEQIDNO:95的轻链可变区。
在一些实施方案中，本发明提供特异性结合MET的MET结合剂，其中所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:12的重链和含有SEQIDNO:14的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:12的重链和SEQIDNO:14的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:13的重链和含有SEQIDNO:14的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:13的重链和SEQIDNO:14的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:88的重链和含有SEQIDNO:14的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:88的重链和SEQIDNO:14的轻链。
在一些实施方案中，本发明提供特异性结合MET的MET结合剂，其中所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:99的重链和含有SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:99的重链和SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:100的重链和含有SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:100的重链和SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:108的重链和含有SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:108的重链和SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:112的重链和含有SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:112的重链和SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括含有SEQIDNO:111的重链和含有SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括SEQIDNO:111的重链和SEQIDNO:101的轻链。
在某些实施方案中，本发明提供特异性结合人MET的MET结合剂，其中所述MET结合剂包括抗体73R009(见表1)或73R009人源化变体(即73R010或其变体)的1、2、3、4、5和/或6个CDR。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括73R009或73R009人源化变体的一个或更多个CDR、73R009或73R009人源化变体的两个或更多个CDR、73R009或73R009人源化变体的三个或更多个CDR、73R009或73R009人源化变体的四个或更多个CDR、73R009或73R009人源化变体的五个或更多个CDR或者73R009或73R009人源化变体的所有六个CDR。
表1
在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R009的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R009人源化变体的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R010的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R009或抗体73R010(含有或不含先导序列)的重链和轻链。在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R009或抗体73R010(含有或不含前导序列)的重链和轻链，其中所述重链被改性以促进形成异二聚体(例如双特异性试剂)或异多聚体。在某些实施方案中，MET结合剂是抗体73R009。在某些实施方案中，MET结合剂是抗体73R010(73R009H12L7)。在某些实施方案中，MET结合剂是抗体73R010的变体。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括美国菌种保藏中心(ATCC)保藏并指定为PTA-13609的质粒编码的重链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括ATCC保藏并指定为PTA-120387的质粒编码的重链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括ATCC保藏并指定为PTA-120695的质粒编码的重链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括ATCC保藏并指定为PTA-13610的质粒编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂包括ATCC保藏并指定为PTA-120388的质粒编码的轻链可变区。
在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R009、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R009人源化变体、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方案中，MET结合剂包括抗体73R010、基本上由其组成或由其组成。
在某些实施方案中，MET结合剂与本发明的结合剂结合在MET上的相同的表位或基本上相同的表位。在另一个实施方案中，MET结合剂是结合MET上的表位的抗体或双特异性试剂，其与本发明结合剂所结合的MET上的表位重叠。在某些实施方案中，MET结合剂与抗体73R009或抗体73R009人源化变体结合在MET上的相同的表位或基本上相同的表位。在某些实施方案中，MET结合剂与抗体73R010结合在MET上的相同的表位或基本上相同的表位。在另一个实施方案中，MET结合剂是结合在MET上的表位的抗体或双特异性试剂，其与抗体73R009或抗体73R009人源化变体所结合的在MET上的表位重叠。在另一个实施方案中，MET结合剂是结合MET上的表位的抗体或双特异性试剂，其与抗体73R010所结合的在MET上的表位重叠。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗体是重组抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在某些实施方案中，所述抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在某些实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在某些实施方案中，所述抗体是IgG2抗体。在某些实施方案中，所述抗体是包括抗原结合位点的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单价抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单特异性的。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性的。
在一些实施方案中，所述MET结合剂抑制MET与肝细胞生长因子结合。在一些实施方案中，所述MET结合剂阻止MET与肝细胞生长因子结合。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合MET并有利于MET内化。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合MET并刺激MET降解。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合MET并抑制MET二聚化。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合MET并抑制MET活化。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合MET并抑制和/或减少MET磷酸化。在一些实施方案中，所述MET结合剂特异性结合MET并抑制肿瘤生长。
在一些实施方案中，所述MET结合剂结合KD为约100nM或更小的MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合KD为约10nM或更小的MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合KD为约1nM或更小的MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合KD为约0.1nM或更小的MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合KD为约0.01nM或更小的MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂的至少一个CDR中的至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸替代，使所述MET结合剂对MET的亲和力改变。在一些实施方案中，所述MET结合剂对MET的亲和力增强。在一些实施方案中，所述MET结合剂对MET的亲和力降低。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合人MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合人MET和小鼠MET。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合人MET而不结合小鼠MET。
在某些实施方案中，本发明提供了是双特异性试剂的MET结合剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括第一臂和第二臂的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括第一臂和第二臂的双特异性试剂，其中所述第一臂包括特异性结合MET的第一结合位点。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括第一臂和第二臂的双特异性试剂，其中所述第一臂包括特异性结合MET的第一结合位点并且所述第二臂包括特异性结合第二靶标或抗原的第二结合位点。在一些实施方案中，所述第一结合位点包括抗原结合位点。在一些实施方案中，所述第二结合位点包括抗原结合位点。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其中所述第一臂包括特异性结合人MET的第一结合位点并且所述第二臂包括结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和一个或更多个人FZD蛋白的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述双特异性试剂是同时特异性结合人MET和一个或更多个人FZD蛋白两者的双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个FZD蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性抗体结合选自由FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10所组成的组中的一个或更多个FZD蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性抗体结合包括FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的一个或更多个FZD蛋白。在某些实施方案中，所述双特异性抗体结合FZD7。在某些实施方案中，所述双特异性抗体结合FZD5和/或FZD8。在某些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8。FZD结合剂的非限制性实例可见于美国专利No.7982013。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合MET和一个或更多个人FZD蛋白的细胞外结构域(ECD)。在某些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合MET和一个或更多个人FZD蛋白的细胞外结构域(ECD)的片段。在某些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合一种或更多种人FZD蛋白的Fri结构域(也称为富含半胱氨酸的结构域(CRD))内。每种所述人FZD蛋白的Fri结构域的序列是本领域中已知的并且提供为SEQIDNO:21(FZD1)、SEQIDNO:22(FZD2)、SEQIDNO:23(FZD3)、SEQIDNO:24(FZD4)、SEQIDNO:25(FZD5)、SEQIDNO:26(FZD6)、SEQIDNO:27(FZD7)、SEQIDNO:28(FZD8)、SEQIDNO:29(FZD8)、SEQIDNO:30(FZD9)和SEQIDNO:31(FZD10)。预测的最小Fri结构域的序列提供为SEQIDNO:32(FZD1)、SEQIDNO:33(FZD2)、SEQIDNO:34(FZD3)、SEQIDNO:35(FZD4)、SEQIDNO:36(FZD5)、SEQIDNO:37(FZD6)、SEQIDNO:38(FZD7)、SEQIDNO:39(FZD8)、SEQIDNO:40(FZD9)和SEQIDNO:41(FZD10)。在某些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合人FZD蛋白的生物学结合位点(BBS)。FZD蛋白的BBS已在美国专利No.7982013中进行了描述。在一些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合人FZD蛋白的BBS的至少一部分。在一些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合人FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和/或FZD8的BBS的至少一部分。
在某些实施方案中，所述双特异性抗体结合人MET并结合1、2、3、4、5或更多个FZD蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合人MET并结合选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、FZD8所组成的组中的1、2、3、4或5个FZD蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合MET并结合至少FZD5和FZD8。
在某些实施方案中，结合人MET以及一个或更多个人FZD蛋白的所述双特异性抗体是FZD拮抗剂。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是WNT通路拮抗剂。在某些实施方案中，所述双特异性抗体抑制WNT信号传导。在一些实施方案中，所述双特异性抗体抑制经典的WNT信号传导。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述双特异性试剂是特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性抗体。在某些实施方案中，所述双特异性抗体特异性结合人MET并结合1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个WNT蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性抗体结合人MET并结合选自由WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT4、WNT5a、WNT5b、WNT6、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT9a、WNT9b、WNT10a、WNT10b、WNT11和WNT16所组成的组中的一个或更多个WNT蛋白。在某些实施方案中，所述双特异性抗体结合人MET并结合选自由WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT10a和Wnt10b所组成的组中的一个或更多个(或两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个等等)WNT蛋白。在某些实施方案中，所述一个或更多个(或两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个等等)WNT蛋白选自由WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT8a、WNT8b、WNT10a和WNT10b所组成的组。WNT结合剂的非限制性实例可见于国际公开WO2011/088127。
在某些实施方案中，双特异性抗体特异性结合MET和一个或更多个人WNT蛋白的C-末端半胱氨酸富集结构域(CRD)。在某些实施方案中，所述双特异性抗体结合选自由SEQIDNO:57(WNT1)、SEQIDNO:58(WNT2)、SEQIDNO:59(WNT2b)、SEQIDNO:60(WNT3)、SEQIDNO:61(WNT3a)、SEQIDNO:62(WNT7a)、SEQIDNO:63(WNT7b)、SEQIDNO:64(WNT8a)、SEQIDNO:65(WNT8b)、SEQIDNO:66(WNT10a)和SEQIDNO:67(WNT10b)所组成的组中的一个或更多个WNT蛋白中的结构域。
在某些实施方案中，结合人MET和一个或多个WNT蛋白的双特异性抗体是WNT拮抗剂。在某些实施方案中，所述双特异性抗体是WNT通路拮抗剂。在某些实施方案中，所述双特异性抗体抑制WNT信号传导。在一些实施方案中，所述双特异性抗体抑制经典的WNT信号传导。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂。在某些实施方案中，特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂是异源二聚体试剂。在某些实施方案中，特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白质的双特异性试剂是包含可溶性受体的异源二聚体试剂。在某些实施方案中，特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂是包含融合蛋白的异源二聚体试剂。在某些实施方案中，特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂是异源二聚体试剂，该异源二聚体试剂包括含有单价抗体的第一臂和含有可溶性受体的第二臂。在某些实施方案中，特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂是异源二聚体试剂，该异源二聚体试剂包括含有单价抗体的第一臂和含有融合蛋白的第二臂。在一些实施方案中，所述融合蛋白是免疫粘附素。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和一个或更多个人WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂包括FZD受体蛋白的细胞外结构域(ECD)(例如可溶性受体)。在某些实施方案中，所述FZD蛋白是人FZD蛋白。在某些实施方案中，所述人FZD蛋白是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。在某些实施方案中，所述人FZD蛋白是FZD8。可溶性FZD受体的非限制性实例可见于美国专利No.7723477和7947277以及美国专利公开No.2011/0305695。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括FZD蛋白的ECD的Fri结构域。每个所述人FZD1-10蛋白的Fri结构域提供作为SEQIDNO:21-31。每个所述人FZD1-10蛋白的最小(或核心)Fri结构域提供作为SEQIDNO:32-41。本领域技术人员在理解对应于各个Fri结构域的确切氨基酸方面可能不同。因此，上文和本文列出的结构域的N-末端和/或C-末端可以延伸或缩短1、2、3、4、5、6、7、8、9或甚至10个氨基酸。
在一些实施方案中，相比于包括整个FZDECD的可溶性受体而言，包括FZDFri结构域的可溶性受体可显示出生物活性改变(例如蛋白质半衰期延长)。在一些实施方案中，蛋白质半衰期可通过利用聚乙二醇(PEG)或聚环氧乙烷(PEO)共价修饰进一步延长。
在某些实施方案中，所述双特异性试剂包括人FZD蛋白的Fri结构域或结合一个或更多个人WNT蛋白的Fri结构域的片段或变体。在某些实施方案中，所述人FZD蛋白是FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9或FZD10。在某些实施方案中，所述人FZD蛋白是FZD8。在某些实施方案中，所述人FZD蛋白是FZD4。在某些实施方案中，所述人FZD蛋白是FZD5。在某些实施方案中，所述人FZD蛋白是FZD10。在某些实施方案中，所述FZD蛋白是FZD4并且所述双特异性试剂包括SEQIDNO:24。在某些实施方案中，所述FZD蛋白是FZD5并且所述双特异性试剂包括SEQIDNO:25。在某些实施方案中，所述FZD蛋白是FZD7并且所述双特异性试剂包括SEQIDNO:27。在某些实施方案中，所述FZD蛋白是FZD8并且所述双特异性试剂包括SEQIDNO:28或SEQIDNO:29。在某些实施方案中，所述FZD蛋白是FZD10并且所述双特异性试剂包括SEQIDNO:31。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有FZD1的最小Fri结构域(SEQIDNO:32)、FZD2的最小Fri结构域(SEQIDNO:33)、FZD3的最小Fri结构域(SEQIDNO:34)、FZD4的最小Fri结构域(SEQIDNO:35)、FZD5的最小Fri结构域(SEQIDNO:36)、FZD6的最小Fri结构域(SEQIDNO:37)、FZD7的最小Fri结构域(SEQIDNO:38)、FZD8的最小Fri结构域(SEQIDNO:39)、FZD9的最小Fri结构域(SEQIDNO:40)或FZD10的最小Fri结构域(SEQIDNO:41)。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有FZD8的最小Fri结构域的Fri结构域(SEQIDNO:39)。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括基本上由FZD1的Fri结构域、FZD2的Fri结构域、FZD3的Fri结构域、FZD4的Fri结构域、FZD5的Fri结构域、FZD6的Fri结构域、FZD7的Fri结构域、FZD8的Fri结构域、FZD9的Fri结构域或FZD10的Fri结构域组成的Fri结构域。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括基本上由FZD8的Fri结构域组成的Fri结构域。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括选自由SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40和SEQIDNO:41所组成的组中的序列。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有SEQIDNO:39的Fri结构域。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括SEQIDNO:39的Fri结构域。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有SEQIDNO:28的Fri结构域。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括SEQIDNO:28的Fri结构域。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有SEQIDNO:29的Fri结构域。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括SEQIDNO:29的Fri结构域。
在某些实施方案中，所述双特异性试剂包括任意一个前述FZDFri结构域序列的变体，其含有一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等等)保守取代并且能结合WNT蛋白。
在某些实施方案中，双特异性试剂(例如包括可溶性FZD受体的试剂)进一步包括异源多肽(即非FZD多肽)。在一些实施方案中，可溶性FZD受体可包括连接其它异源的功能和结构多肽的FZDECD或Fri结构域，包括但不限于人Fc区、蛋白标签(例如myc、FLAG、GST)、其它内源性蛋白质或蛋白质片段或任何其它有用的蛋白质序列，包括FZDECD或Fri结构域和第二条多肽之间的任何接头区。在某些实施方案中，所述异源多肽包括人Fc区。所述Fc区可从任何免疫球蛋白种类IgG、IgA、IgM、IgD和IgE获得。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG1Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是人IgG2Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区是野生型Fc区(包括自然界中存在的Fc区变体)。在一些实施方案中，所述Fc区是突变的Fc区。在一些实施方案中，所述Fc区在N末端被截短1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸(例如铰链结构域中)。在一些实施方案中，铰链结构域中的氨基酸被改变以阻碍不希望的二硫键形成。在一些实施方案中，半胱氨酸被丝氨酸替代以阻碍或阻止不希望的二硫键形成。在一些实施方案中，所述Fc区在C末端被截短1、2、3或更多个氨基酸。在一些实施方案中，所述Fc区在C-末端被截短1个氨基酸。在某些实施方案中，所述异源多肽包括SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:91或SEQIDNO:92。在某些实施方案中，所述异源多肽是SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:91或SEQIDNO:92。在某些实施方案中，所述异源多肽包括SEQIDNO:48、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52。在某些实施方案中，所述异源多肽是SEQIDNO:48、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52。
在某些实施方案中，双特异性试剂包括含有至少FZD受体的最小Fri结构域和Fc区的融合蛋白。如本文所用的“融合蛋白”是由包括至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子表达的杂合蛋白。在一些实施方案中，所述第一多肽的C-末端与免疫球蛋白Fc区的N末端连接。在一些实施方案中，所述第一多肽(例如FZDFri结构域)直接连接至所述Fc区(即没有插入接头)。在一些实施方案中，所述第一多肽通过接头连接至所述Fc区。
如本文所用的术语“接头”是指插入到第一多肽(例如FZD成分)和第二多肽(例如Fc区)之间的接头。在一些实施方案中，所述接头是肽接头。接头不应不利地影响所述多肽的表达、分泌或生物活性。接头不应是抗原性的并且不应引起免疫反应。合适的接头是本领域中技术人员已知的，并且通常包括甘氨酸和丝氨酸残基的混合物，并且通常包括无空间位阻的氨基酸。可被并入到有用的接头中的其它氨基酸包括苏氨酸和丙氨酸残基。接头的长度范围可为例如1-50个氨基酸长度、1-22个氨基酸长度、1-10个氨基酸长度、1-5个氨基酸长度或1-3个氨基酸长度。接头可包括但不限于SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n(其中n是1-7)、GRA、聚(Gly)、聚(Ala)、ESGGGGVT(SEQIDNO:68)、LESGGGGVT(SEQIDNO:69)、GRAQVT(SEQIDNO:70)、WRAQVT(SEQIDNO:71)和ARGRAQVT(SEQIDNO:72)。如本文所使用的接头是不包括来自第一多肽的C端(例如FZDFri结构域)或所述第二多肽的N-末端(例如所述Fc区域)的氨基酸残基的间插肽序列。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括FZDFri结构域、Fc区和使所述FZDFri结构域连接至所述Fc区的接头。在一些实施方案中，所述FZDFri结构域包括SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:39。在一些实施方案中，所述接头包括ESGGGGVT(SEQIDNO:68)或LESGGGGVT(SEQIDNO:69)。
FZD受体和免疫球蛋白蛋白质包括引导所述蛋白质转运的信号序列。信号序列(也称为信号肽或前导序列)位于新生多肽的N-末端。它们使所述多肽靶向内质网并且所述蛋白质通过分泌被分类到它们的目的地，例如细胞器的内部空间、内膜、细胞外膜或细胞外部。在所述蛋白质被转运至内质网之后，大多数信号序列通过信号肽从所述蛋白质切割。信号序列从多肽切割通常发生在所述氨基酸序列的特定位点并取决于所述信号序列内的氨基酸残基。尽管通常具有一个具体的切割位点，但是多于一个的切割位点可被信号肽酶识别和/或使用，从而产生所述多肽的非均匀N-末端。例如，使用信号序列内不同的切割位点可产生利用不同的N-末端氨基酸表达的多肽。因此，在一些实施方案中，如本文所述的多肽可包括具有不同N末端的多肽混合物。在一些实施方案中，所述N-末端的长度相差1、2、3、4、或5个氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽是基本上均匀的，即所述多肽具有相同的N末端。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包括一个或更多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个等等)氨基酸取代和/或缺失。在一些实施方案中，所述多肽的信号序列包括氨基酸取代和/或缺失，允许一个切割位点占主导地位，从而产生含有一个N-末端的基本上均匀的多肽。
在一些实施方案中，特异性结合MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂包括：包括SEQIDNO:28的第一多肽和包括SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:28的第一多肽和包括SEQIDNO:47或SEQIDNO:48的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:28的第一多肽和包括SEQIDNO:49或SEQIDNO:51的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:28的第一多肽和包括SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:28的第一多肽和包括SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，特异性结合MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:29的第一多肽和包括SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:29的第一多肽和包括SEQIDNO:47或SEQIDNO:48的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:29的第一多肽和包括SEQIDNO:49或SEQIDNO:51的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：包括SEQIDNO:29的第一多肽和包括SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：包括SEQIDNO:29的第一多肽和包括SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，特异性结合MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂包括:包括SEQIDNO:39的第一多肽和包括SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：包括SEQIDNO:39的第一多肽和包括SEQIDNO:47或SEQIDNO:48的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：包括SEQIDNO:39的第一多肽和包括SEQIDNO:49或SEQIDNO:51的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：包括SEQIDNO:39的第一多肽和包括SEQIDNO:50或SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括：包括SEQIDNO:39的第一多肽和包括SEQIDNO:52的第二多肽。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括SEQIDNO:55或SEQIDNO:56。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括SEQIDNO:56。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括SEQIDNO:87。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括:(a)特异性结合人MET的第一结合位点，和(b)结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括(a)含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3，以及(b)含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括：(a)特异性结合人MET的第一结合位点，和(b)结合一个或更多个WNT蛋白的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括(a)含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3，以及(b)含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括(a)特异性结合人MET的第一结合位点和(b)结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括含有GYTFTSYWLH(SEQIDNO:78)的重链CDR1、含有GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQIDNO:79)的重链CDR2和含有TYGSYVSPLDY(SEQIDNO:81)、SYGSYVSPLDY(SEQIDNO:82)、ATYGSYVSPLDY(SEQIDNO:83)或XYGSYVSPLDY(SEQIDNO:80)并且其中X不是R的重链CDR3；以及含有KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQIDNO:84)的轻链CDR1、含有WASTRES(SEQIDNO:85)的轻链CDR2和含有QQYYAYPWT(SEQIDNO:86)的轻链CDR3。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括：(a)特异性结合人MET的第一结合位点和(b)结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约80％序列同一性的重链可变区。在一些实施方案中，所述第一结合位点还包括与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。在某些实施方案中，所述第一结合位点包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的轻链可变区。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括(a)包括特异性结合人MET的第一结合位点的第一臂，和(b)包括结合一个或更多个WNT蛋白的第二结合位点的第二臂，其中所述第一臂包括含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3，以及含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3；并且所述第二臂包括FZD8Fri结构域。在一些实施方案中，所述第二臂包括SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:39。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合WNT通路的一个或多个组件的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:88、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:108、SEQIDNO:111或SEQIDNO:112的重链和/或SEQIDNO:14或SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:13的重链和SEQIDNO:14的轻链。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:100的重链和SEQIDNO:101的轻链。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:111的重链和SEQIDNO:101的轻链。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:88、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:108、SEQIDNO:111或SEQIDNO:112的重链和SEQIDNO:14或SEQIDNO:101的轻链，并且其中所述双特异性试剂的第二臂包括含有FZD8Fri结构域的第一多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第二臂包括含有FZD8Fri结构域的第一多肽和包括人Fc区的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第二臂包括含有FZD8Fri结构域的第一多肽和含有人IgG1Fc区的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第二臂包括含有FZD8Fri结构域的第一多肽和含有人IgG2Fc区的第二多肽。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:39。在一些实施方案中，所述双特异性试剂的第二臂包括含有SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:39的第一多肽和含有SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52的第二多肽。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:13的重链和SEQIDNO:14的轻链，并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:28的第一多肽和SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:100的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:28的第一多肽和SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:111的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:28的第一多肽和SEQIDNO:52的第二多肽。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:13的重链和SEQIDNO:14的轻链，并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:56。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:100的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:56。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:111的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:56。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂被称为双特异性试剂315B06。双特异性试剂315B06包括(a)由含有2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801的ATCC并分配指定编号为PTA-13609的SEQIDNO:16的质粒编码的重链；(b)由含有2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13610的SEQIDNO:19的质粒编码的轻链；和(c)由含有2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13611的SEQIDNO:89的质粒编码的多肽。双特异性试剂315B06包括(a)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13609的质粒编码的SEQIDNO:13的重链；(b)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13610的质粒编码的SEQIDNO:14的轻链；和(c)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13611的质粒编码的SEQIDNO:56的多肽。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂被称为双特异性试剂315B07。在一些实施方案中，双特异性试剂315B07包括(a)由含有2013年5月30日按照布达佩斯条约的条件保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801的ATCC并分配指定编号为PTA-120387的SEQIDNO:103的质粒编码的重链；(b)由含有2013年5月30日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-120388的SEQIDNO:106的质粒编码的轻链；和(c)由含有2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13611的SEQIDNO:89的质粒编码的多肽。在一些实施方案中，双特异性试剂315B07包括(a)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-120387的质粒编码的SEQIDNO:100的重链；(b)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-120388的质粒编码的SEQIDNO:101的轻链；和(c)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13611的质粒编码的SEQIDNO:56的多肽。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂被称为双特异性试剂315B09。双特异性试剂315B09包括(a)由含有2013年11月6日按照布达佩斯条约的条件保藏于美国弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801的ATCC并分配指定编号为PTA-120695的SEQIDNO:109的质粒编码的重链；(b)由含有2013年5月30日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-120388的SEQIDNO:106的质粒编码的轻链；和(c)由含有2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13611的SEQIDNO:89的质粒编码的多肽。在一些实施方案中，双特异性试剂315B09包括(a)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-120695的质粒编码的SEQIDNO:111的重链；(b)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-120388的质粒编码的SEQIDNO:101的轻链；和(c)含有由保藏于ATCC并分配指定编号为PTA-13611的质粒编码的SEQIDNO:56的多肽。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有由保藏于ATCC并指定为PTA-13609的质粒编码的重链可变区的重链和含有由保藏于ATCC并指定为PTA-13610的质粒编码的轻链可变区的轻链。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有由保藏于ATCC并指定为PTA-120387的质粒编码的重链可变区的重链和含有由保藏于ATCC并指定为PTA-120388的质粒编码的轻链可变区的轻链。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括含有由保藏于ATCC并指定为PTA-120695的质粒编码的重链可变区的重链和含有由保藏于ATCC并指定为PTA-120388的质粒编码的轻链可变区的轻链。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括由保藏于ATCC并指定为PTA-13611的质粒编码的多肽。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:88的重链和SEQIDNO:14的轻链，并且其中所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:28的第一多肽和SEQIDNO:50的第二多肽。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:88的重链和SEQIDNO:14的轻链，并且其中所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:87。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:108的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且其中所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:28的第一多肽和SEQIDNO:50的第二多肽。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:108的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且其中所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:87。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:114的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且其中所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:28的第一多肽和SEQIDNO:50的第二多肽。在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:114的重链和SEQIDNO:101的轻链，并且其中所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:87。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET并结合一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约80％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约80％的序列同一性的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。在某些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％或至少约99％的序列同一性的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。在某些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括与SEQIDNO:7具有至少约95％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8具有至少约95％序列同一性的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。在某些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括与SEQIDNO:94具有至少约95％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:95具有至少约95％序列同一性的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。在某些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括含有SEQIDNO:7的重链可变区和含有SEQIDNO:8的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。在某些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括含有SEQIDNO:94的重链可变区和含有SEQIDNO:95的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。在某些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:7的重链可变区和SEQIDNO:8的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。在某些实施方案中，所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:94的重链可变区和SEQIDNO:95的轻链可变区，并且所述双特异性试剂的第二臂包括FZD8Fri结构域。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其中所述双特异性臂的第一臂包括第一CH3结构域并且所述双特异性试剂的第二臂包括第二CH3结构域，并且每个CH3结构域被修饰以促进形成异源二聚体或异多聚体。在一些实施方案中，所述第一和第二CH3结构域利用杵臼结构技术进行修饰。在一些实施方案中，所述第一和第二CH3结构域包括氨基酸的改变或替代而导致静电相互作用改变。在一些实施方案中，所述第一和第二CH3结构域包括氨基酸的改变而导致疏水/亲水相互作用改变。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括选自以下所组成的组中的两个重链恒定区：(a)第一人IgG1恒定区，其中对应于SEQIDNO:74的253和292位的位置中的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替代或替换，和第二人IgG1恒定区，其中对应于SEQIDNO:74的240和282位的位置中的氨基酸被赖氨酸替代或替换；(b)第一人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的249和288位的位置中的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替代或替换，和第二人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的236和278位的位置中的氨基酸被赖氨酸替代或替换；(c)第一人IgG3恒定区，其中对应于SEQIDNO:76的300和339位的位置中的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替代或替换，和第二人IgG3恒定区，其中对应于SEQIDNO:76的287和329位的位置中的氨基酸被赖氨酸替代或替换；以及(d)第一人IgG4恒定区，其中对应于SEQIDNO:77的250和289位的位置中的氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替代或替换，和第二IgG4恒定区，其中对应于SEQIDNO:77的237和279位的位置中的氨基酸被赖氨酸替代或替换。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括第一人IgG1恒定区，其中对应于SEQIDNO:74的253和292位的位置中具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换，和第二人IgG1恒定区，其中对应于SEQIDNO:74的240和282位的位置中具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被赖氨酸替换。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括第一人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的249和288位的位置中具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换，和第二人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的236和278位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被赖氨酸替换。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括第一人IgG3恒定区，其中对应于SEQIDNO:76的300和339位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换，和第二人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:76的287和329位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被赖氨酸替换。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括第一人IgG4恒定区，其中对应于SEQIDNO:77的250和289位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被谷氨酸或天冬氨酸替换，和第二人IgG4恒定区，其中对应于SEQIDNO:77的237和279位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被赖氨酸替换。
在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括第一人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的249和288位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被谷氨酸替换，和第二人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的236和278位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被赖氨酸替换。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括第一人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的249和288位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被天冬氨酸替换，和第二人IgG2恒定区，其中对应于SEQIDNO:75的236和278位的位置具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被赖氨酸替换。
在某些实施方案中，MET结合剂结合MET和/或WNT通路的一个或更多个组件，其解离常数(KD)为约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小或者约0.1nM或更小。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约20nM或更小的MET和/或WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约10nM或更小的MET和/或WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约1nM或更小的MET和/或WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约0.1nM或更小的MET和/或WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约100nM或更小的人MET和小鼠MET。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约50nM或更小的人MET和小鼠MET。在一些实施方案中，MET结合剂结合人MET而不结合小鼠MET。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约100nM或更小的一个或更多个人WNT蛋白。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约50nM或更小的一个或更多个人WNT蛋白。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约20nM或更小的一个或更多个人WNT蛋白。在一些实施方案中，所述MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)的解离常数是使用包括固定在Biacore芯片上的MET的至少一部分的MET融合蛋白测定的解离常数。在一些实施方案中，所述WNT蛋白结合剂(例如抗体或双特异性试剂)的解离常数是使用包括固定在Biacore芯片上的WNT蛋白的至少一部分的WNT-融合蛋白测定的解离常数。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括特异性结合MET的第一结合位点和特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点的双特异性试剂。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约100nM或更小的MET和WNT通路的一个或更多个组件(例如WNT蛋白或FZD蛋白)。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约50nM或更小的MET和WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约20nM或更小的MET和WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，MET结合剂结合KD为约10nM或更小的MET和WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，MET结合剂或抗体结合KD为约1nM或更小的MET和WNT通路的一个或更多个组件。
在一些实施方案中，MET结合剂是包括第一结合位点的结合亲和力比所述第二结合位点的结合亲和力弱的双特异性试剂。例如，在一些实施方案中，所述双特异性试剂可结合KD范围为约0.1nM至1nM的MET并且可结合KD范围为约1nM至10nM的WNT通路的一个或更多个组件。或者所述双特异性试剂可结合KD范围为约1nM至10nM的MET并且可结合KD为约0.1nM至1nM的WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，所述双特异性试剂可结合KD范围为约0.1nM至1nM的WNT通路的一个或更多个组件并且可结合KD范围为约1nM至10nM的MET。或者所述双特异性试剂可结合KD范围为约1nM至10nM的WNT通路的一个或更多个组件并且可结合KD范围为约为0.1nM至1nM的MET。在一些实施方案中，所述两个结合位点之间的亲和力差异可以是约2倍或更多、约3倍或更多、约5倍或更多、约8倍或更多、约10倍或更多、约15倍或更多、约30倍或更多、约50倍或更多或约100倍或更多。在一些实施方案中，MET抗原结合位点的至少一个CDR中的至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸替代，使得MET结合位点的亲和力被改变。在一些实施方案中，MET结合位点的亲和力增强。在一些实施方案中，MET结合位点的亲合力降低。在一些实施方案中，MET和WNT通路的一个或更多个组件的结合位点的亲和力被改变。所述两个结合位点的亲和力调节可影响所述双特异性试剂的生物活性。例如，降低MET或WNT通路的一个或更多个组件的结合位点的亲和力可具有理想的效果，例如降低所述结合剂的毒性或提高所述结合剂的治疗指数。
作为非限制性实施例，所述双特异性试剂可包括(a)结合KD为约0.1nM至约10nM的人MET的第一结合位点，以及(b)特异性结合KD为约0.1nM至约20nM、约0.5nM至约20nM、约1.0nM至约10nM的一个或更多个WNT蛋白的第二结合位点。
在某些实施方案中，MET结合剂结合半数最大有效浓度(EC50)为约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小或约0.1nM或更小的MET和WNT通路(例如WNT蛋白或FZD蛋白)的一个或更多个组件。在某些实施方案中，MET结合剂结合半数最大有效浓度(EC50)为约1μM或更小、约100nM或更小、约40nM或更小、约20nM或更小、约10nM或更小、约1nM或更小或约0.1nM或更小的MET和WNT通路(例如WNT蛋白或FZD蛋白)的一个或更多个组件。
在某些实施方案中，所述MET结合剂包括抗体。在一些实施方案中，所述抗体是重组抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述抗体是人抗体。在某些实施方案中，所述抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体。在某些实施方案中，所述抗体是IgG1抗体。在某些实施方案中，所述抗体是IgG2抗体。在某些实施方案中，所述抗体是包括抗原结合位点的抗体片段。在一些实施方案中，所述抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单价抗体。在一些实施方案中，所述抗体是单特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是多特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗体是缀合至细胞毒性部分。在一些实施方案中，所述抗体是分离的。在一些实施方案中，所述抗体是基本上纯的。
本发明结合剂的特异性结合可通过本领域中已知的任何方法来测定。可使用的免疫测定法包括但不限于利用例如Biacore分析、FACS分析、免疫荧光、免疫细胞化学、Western印迹分析、放射免疫测定法、ELISA、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、凝集测定法、补体结合测定法、免疫放射分析、荧光免疫分析、均相时间分辨荧光测定(HTRF)法和蛋白A免疫测定法之类的技术的竞争性和非竞争性测定系统。这样的测定法是本领域中常规的和公知的(参见例如Ausubel等人，Editors,1994-present,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY)。
例如，试剂与人MET和/或WNT通路(例如FZD蛋白或WNT蛋白)的组件的特异性结合可利用ELISA进行测定。ELISA测定法包括制备抗原，利用抗原包被96孔微量滴定板的孔，将缀合至可检测的化合物例如酶底物(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)上的结合剂加入到所述孔中，孵育一段时间，并检测结合到所述抗原上的结合剂的存在。在一些实施方案中，所述结合剂不缀合至可检测的化合物上，而是将识别所述结合剂并缀合至可检测的化合物上的第二抗体(例如抗Fc抗体)加入到所述孔中。在一些实施方案中，代替利用抗原包被所述孔，所述结合剂可被包被到所述孔中并且在将所述抗原加入到所述包被的孔中之后可加入缀合至可检测的化合物上的第二抗体。本领域技术人员将认识到可修改参数以增强检测信号以及本领域已知的其它ELISA变型。
在另一个实施例中，试剂与人MET和/或WNT通路(例如FZD蛋白或WNT蛋白)的组件的特异性结合可利用FACS进行测定。FACS筛选测定可包括生成表达抗原作为融合蛋白的cDNA构建体，将所述构建体转染到细胞中，在细胞表面上表达所述抗原，将所述结合剂与转染细胞混合并孵育一段时间。所述结合剂所结合的细胞可通过使用缀合至可检测的化合物上的第二抗体(例如PE缀合的抗Fc抗体)和流式细胞仪来鉴别。本领域技术人员将认识到可修改的参数以优化被检测的信号以及可增强筛选(例如阻断抗体的筛选)的其它FACS变型。
结合剂与抗原(例如MET或WNT通路的组件)的结合亲和力以及结合剂-靶标相互作用的解离速率(off-rate)可通过竞争性结合测定法来测定。竞争性结合测定法的一个实例是放射免疫测定法，其包括在增量的未标记抗原的存在下孵育标记抗原/靶标(例如3H或125I)或其片段或变体和感兴趣的结合剂，然后检测结合至标记抗原/靶标上的抗体。所述结合剂对抗原/靶标的亲和力与结合解离速率可由Scatchard作图分析的数据来测定。在一些实施方案中，Biacore动力学分析用于测定结合抗原(例如MET或WNT通路的组件)的结合剂的结合和解离速率。在一些实施方案中，Biacore动力学分析包括分析结合剂从芯片上与在其表面上的固定抗原/靶标(例如MET或WNT通路的组件)的结合和解离。在一些实施方案中，Biacore动力学分析包括分析抗原或靶标(例如MET或WNT通路的组件)从芯片上与在其表面上的固定结合剂的结合和解离。
本发明提供特异性结合MET、结合WNT通路的至少一个组件或结合MET和WNT通路的至少一个组件的多肽。在一些实施方案中，多肽结合人MET。在一些实施方案中，多肽结合人MET和小鼠MET。在一些实施方案中，多肽结合人MET而不结合小鼠MET。在一些实施方案中，多肽结合人WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，多肽结合一个或更多个人FZD蛋白。在一些实施方案中，多肽结合一个或更多个人WNT蛋白。在一些实施方案中，多肽多聚体结合MET和人WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，多肽多聚体结合MET和一个或更多个人FZD蛋白。在一些实施方案中，多肽多聚体结合MET和一个或更多个人WNT蛋白。
在一些实施方案中，MET结合剂包括含有选自以下所组成的组中的序列的多肽：SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:39、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111和SEQIDNO:114。在一些实施方案中，所述MET结合剂还包括含有选自以下所组成的组中的序列的多肽：SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51和SEQIDNO:52。
在某些实施方案中，MET结合剂与包括含有SEQIDNO:7的重链可变区和含有SEQIDNO:8的轻链可变区的抗体或双特异性试剂竞争与MET的特异性结合。在某些实施方案中，MET结合剂与包括含有SEQIDNO:94的重链可变区和含有SEQIDNO:95的轻链可变区的抗体或双特异性试剂竞争与MET的特异性结合。在某些实施方案中，MET结合剂与抗体73R009竞争与人MET的特异性结合。在某些实施方案中，MET结合剂与抗体73R009的人源化变体竞争与人MET的特异性结合。在某些实施方案中，MET结合剂与抗体73R010(73R009H12L7)竞争与人MET的特异性结合。在某些实施方案中，MET结合剂与抗体73R009的单价变体竞争与人MET的特异性结合。在一些实施方案中，MET结合剂与包括抗体73R009的重链可变区和轻链可变区的双特异性试剂竞争与人MET的特异性结合。在一些实施方案中，MET结合剂与包括抗体73R009人源化变体的重链可变区和轻链可变区的双特异性试剂竞争与人MET的特异性结合。在一些实施方案中，MET结合剂与包括抗体73R010(73R009H12L7)的重链可变区和轻链可变区的双特异性试剂竞争与人MET的特异性结合。在一些实施方案中，MET结合剂在体外竞争性结合测定法中与本文所述的MET结合剂竞争与MET的特异性结合。在一些实施方案中，所述MET是人MET。在一些实施方案中，所述MET是小鼠MET。
在某些实施方案中，MET结合剂结合作为本发明的抗体或双特异性试剂的MET上相同的表位或基本上相同的表位。在另一个实施方案中，MET结合剂是结合MET上的表位的抗体，所述表位与本发明的抗体或双特异性试剂结合的MET上的表位重叠。在某些实施方案中，MET结合剂结合作为抗体73R009、73R009人源化变体或抗体73R010(73R009H12L7)的MET上相同的表位或基本上相同的表位。在另一个实施方案中，所述MET结合剂是结合MET上的表位的抗体或结合剂，所述表位与抗体73R009、73R009人源化变体或抗体73R010(73R009H12L7)结合的MET上的表位重叠。在某些实施方案中，MET结合剂结合作为双特异性试剂315B06、315B07或315B09的MET上相同的表位或基本上相同的表位。在另一个实施方案中，所述MET结合剂是结合MET上的表位的抗体或结合剂，所述表位与双特异性试剂315B06、315B07或315B09结合的MET上的表位重叠。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是与抗体73R009、73R009单价变体、抗体73R009人源化变体或抗体73R010(73R009H12L7)竞争与MET的特异性结合的试剂(例如在竞争性结合测定法中)。在某些实施方案中，所述MET结合剂是与双特异性试剂315B06、315B07或315B09竞争与MET的特异性结合的试剂(例如在竞争性结合测定法)。
在某些实施方案中，结合剂与双特异性试剂315B06、315B07或315B09竞争与一个或更多个WNT蛋白的特异性结合。在一些实施方案中，结合剂或抗体在体外竞争性结合测定法中与与本文所述的试剂竞争与一个或更多个WNT蛋白的特异性结合。在一些实施方案中，所述一个或更多个WNT蛋白是人WNT蛋白。
在某些实施方案中，结合剂(例如抗体)结合作为本发明双特异性试剂的一个或更多个WNT蛋白上相同的靶标或基本相同的靶标。在一些实施方案中，结合剂结合一个或更多个WNT蛋白上的靶标，所述靶标与本发明的双特异性试剂结合的一个或更多个WNT蛋白上的靶标重叠。在某些实施方案中，结合剂结合作为特异性试剂315B06、315B07或315B09的一个或更多个WNT蛋白上相同的靶标或基本相同的靶标。在另一个实施方案中，结合剂结合一个或更多个WNT蛋白上的靶标，所述靶标与双特异性试剂315B06、315B07或315B09结合的靶标重叠。
在某些实施方案中，所述结合剂是与所述双特异性试剂315B06、315B07或315B09竞争与一个或更多个WNT蛋白的特异性结合的试剂(例如在竞争性结合测定法中)。
在某些实施方案中，所述结合剂是与双特异性试剂315B06、315B07或315B09竞争与MET和/或一个或更多个WNT蛋白的特异性结合的试剂(例如在竞争性结合测定法中)。
在某些实施方案中，本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)结合MET并调节MET的活性。在某些实施方案中，所述MET结合剂是MET拮抗剂并抑制MET的活性。在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制MET的活性。MET的活性可被几种不同的机制抑制，包括但不限于抑制或阻断MET/HGF相互作用、抑制或阻断MET二聚化、增加MET脱离、增加MET内化和/或增加MET降解。在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制MET激活。在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制和/或减少MET磷酸化。在某些实施方案中，所述MET结合剂是MET拮抗剂并抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂抑制肿瘤生长。在某些实施方案中，所述MET结合剂是MET拮抗剂并抑制血管生成。在某些实施方案中，所述MET结合剂可抑制血管生成。在一些实施方案中，所述MET结合剂是MET拮抗剂并抑制EMT。在一些实施方案中，所述MET结合剂抑制EMT。
在某些实施方案中，本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)结合一个或更多个人WNT蛋白并调节WNT通路的活性。在一些实施方案中，MET结合剂是WNT通路拮抗剂并抑制WNT通路的活性。在一些实施方案中，MET结合剂抑制WNT通路的活性。在一些实施方案中，MET结合剂是WNT通路的拮抗剂并抑制β-链蛋白的活性。在一些实施方案中，MET结合剂抑制β-链蛋白的活性。在一些实施方案中，MET结合剂是WNT通路的拮抗剂并抑制肿瘤生长。在一些实施方案中，MET结合剂是WNT通路拮抗剂并诱导肿瘤细胞分化。在某些实施方案中，MET结合剂诱导肿瘤细胞分化。在一些实施方案中，MET结合剂是WNT通路的拮抗剂并诱导癌症干细胞分化。在某些实施方案中，MET结合剂诱导癌症干细胞分化。在一些实施方案中，MET结合剂是WNT通路的拮抗剂并诱导分化标志物在肿瘤细胞上表达。在某些实施方案中，MET结合剂诱导分化标志物在肿瘤细胞上表达。在一些实施方案中，MET结合剂是WNT通路的拮抗剂并诱导分化标志物在癌症干细胞上表达。在一些实施方案中，MET结合剂诱导分化标志物在癌症干细胞上表达。
在某些实施方案中，本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)是结合人MET并调节MET活性的双特异性试剂。在某些实施方案中，本文所述的MET结合剂均是结合人WNT通路的一个或更多个组件并调节WNT活性的双特异性试剂。在某些实施方案中，本文所述的MET结合剂是结合人MET和人WNT通路的一个或更多个组件并调节MET活性和WNT通路活性的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述双特异性试剂是MET拮抗剂和WNT通路的拮抗剂并抑制MET活性和WNT通路的活性。在一些实施方案中，所述双特异性试剂是MET拮抗剂和WNT通路的拮抗剂并抑制MET的信号传导和WNT通路的信号传导。在一些实施方案中，所述双特异性试剂是MET拮抗剂和WNT通路的拮抗剂并抑制肿瘤生长。
在某些实施方案中，所述MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)是MET的拮抗剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是MET的拮抗剂并抑制MET的活性。在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制MET活性的至少10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或约100％。在某些实施方案中，抑制人MET活性的MET结合剂包括抗体73R009、抗体73R009的人源化变体或抗体73R010(73R009H1217)。在某些实施方案中，抑制人MET活性的MET结合剂包括抗体73R009或抗体73R010(73R009H1217)的单价变体。在某些实施方案中，抑制人MET活性的MET结合剂包括抗体73R009的重链可变区和轻链可变区、抗体73R009的人源化变体的重链可变区和轻链可变区或抗体73R010(73R009H1217)的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，抑制人MET活性的MET结合剂是双特异性试剂315B06、315B07或315B09。
在某些实施方案中，所述MET结合剂是WNT通路的拮抗剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是WNT通路的拮抗剂并抑制WNT通路的活性。在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制WNT通路活性的至少约10％、至少约20％、至少30％、至少50％、至少75％、至少约90％或约100％。在某些实施方案中，抑制人WNT通路活性的MET结合剂包括抗体73R009、抗体73R009的人源化变体或抗体73R010(73R009H1217)。在某些实施方案中，抑制人WNT通路活性的MET结合剂包括抗体73R009或抗体73R010(73R009H1217)的单价变体。在某些实施方案中，抑制人WNT通路活性的MET结合剂包括抗体73R009的重链可变区和轻链可变区、抗体73R009的人源化变体的重链可变区和轻链可变区或抗体73R010(73R009H1217)的重链可变区和轻链可变区。在某些实施方案中，抑制人WNT通路活性的MET结合剂是包括抗体73R009的抗原结合位点、抗体73R009的人源化变体的抗原结合位点或抗体73R010(73R009H1217)的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，抑制人WNT通路活性的MET结合剂是双特异性试剂315B06、315B07或315B09。
在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制MET与肝细胞生长因子(HGF)的结合。在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制MET与HGF的结合至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方案中，抑制人MET与HGF结合的MET结合剂是抗体73R009、抗体73R009的人源化变体或抗体73R010(73R009H1217)。在某些实施方案中，抑制人MET与HGF结合的MET结合剂是抗体73R009或抗体73R010(73R009H1217)的单价变体。在某些实施方案中，抑制人MET与HGF结合的MET结合剂是包括抗体73R009的抗原结合位点、抗体73R009人源化变体的抗原结合位点或抗体73R010(73R009H1217)的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，抑制人MET与HGF结合的MET结合剂是包括抗体73R009的重链可变区和轻链可变区、抗体73R009的人源化变体的重链可变区和轻链可变区或抗体73R010(73R009H1217)的重链可变区和轻链可变区的双特异性试剂。在某些实施方案中，抑制人MET与HGF结合的MET结合剂是双特异性试剂315B06、315B07或315B09。
在某些实施方案中，所述MET结合剂(例如双特异性试剂)抑制一个或更多个WNT蛋白与一个或更多个FZD蛋白的结合。在一些实施方案中，所述MET结合剂(例如双特异性试剂)抑制一个或更多个WNT蛋白质与FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9和/或FZD10的结合。在一些实施方案中，所述MET结合剂(例如双特异性试剂)抑制一个或更多个WNT蛋白与FZD8的结合。在某些实施方案中，所述MET结合剂抑制一个或更多个WNT蛋白与至少一个FZD受体的结合至少约10％、至少约25％、至少约50％、至少约75％、至少约90％或至少约95％。在某些实施方案中，抑制一个或更多个人WNT蛋白与至少一个FZD受体结合的MET结合剂是双特异性试剂315B06、315B07或315B09。
用于测定MET结合剂(或候选MET结合剂)是否抑制MET活性的体内和体外测定法是本领域已知的。例如，人HGF与MET结合导致MET酪氨酸磷酸化和MET信号传导通路的激活。因此，响应于HGF的人细胞可用于通过分析MET磷酸化和下游MET通路组件例如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和AKT的磷酸化评估HGF诱导的MET活化的抑制。测定MET结合剂(或候选MET结合剂)是否抑制MET二聚化、促进MET降解和/或促进MET“脱离”的测定法也是本领域已知的。
用于测定MET结合剂(或候选MET结合剂)是否抑制WNT通路活化或信号传导的体内和体外测定法是本领域已知的。例如，使用包括萤火虫荧光素酶报告基因上游的TCF结合结构域的多个拷贝的TCF/Luc报道矢量的基于细胞的萤光素酶报告检测法可用于测量体外β-链蛋白信号传导水平(Gazit等人，1999,Oncogene,18；5959-66；TOPflash,Millipore,BillericaMA)。在结合剂的存在下在一个或更多个WNT蛋白(例如由转染细胞表达的或WNT条件培养基提供的WNT)存在下β-链蛋白信号传导水平与不存在所述结合剂时的信号传导水平进行比较。除了所述TCF/Luc报告检测法，结合剂(或候选剂)对β-链蛋白信号传导的影响可在体外或体内通过测量所述试剂对β链蛋白所调节的基因例如c-myc基因(He等人，1998,Science,281:1509-12)、细胞周期蛋白D1(Tetsu等人，1999,Nature,398:422-6)和/或纤链蛋白(Gradl等人，1999,Mol.CellBiol.,19:5576-87)的表达水平的影响来测定。在某些实施方案中，结合剂对β-链蛋白信号传导的影响也可通过测量所述试剂对Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3的磷酸化状态、LRP5、LRP6和/或β链蛋白的影响来测定。
在某些实施方案中，所述MET结合剂具有以下一个或更多个效果：抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤生长、降低肿瘤的致瘤性、降低肿瘤中癌症干细胞的频率、通过降低肿瘤中癌症干细胞的频率而降低肿瘤的致瘤性、触发肿瘤细胞的细胞死亡、诱导肿瘤中细胞分化、使致瘤性细胞向非致瘤性状态分化、癌症干细胞分化、诱导分化标志物在肿瘤细胞中的表达、诱导分化标志物在癌症干细胞中的表达、防止肿瘤细胞的转移、抑制血管生成、减少肿瘤细胞的存活或上述的任意组合。
在某些实施方案中，所述MET结合剂能抑制肿瘤生长。在某些实施方案中，所述MET结合剂能体内抑制肿瘤生长(例如在异种移植小鼠模型和/或在患有癌症的人中)。在某些实施方案中，肿瘤生长与未处理的肿瘤相比被抑制至少约2倍、约3倍、约5倍、约10倍、约50倍、约100倍或约1000倍。
在某些实施方案中，所述MET结合剂能降低肿瘤的致瘤性。在某些实施方案中，所述MET结合剂能降低动物模型例如小鼠异种移植模型中包含癌症干细胞的肿瘤的致瘤性。在某些实施方案中，所述MET结合剂能通过降低肿瘤中癌症干细胞的数量或频率来降低肿瘤的致瘤性。在某些实施方案中，肿瘤中癌症干细胞的数量或频率至少降低到约1/2、约1/3、约1/5、约1/10、约1/50、约1/100或约1/1000。在某些实施方案中，利用动物模型通过有限稀释测定法测定癌症干细胞的数量或频率的降低。关于使用有限稀释测定法测定肿瘤中癌症干细胞的数量或频率的降低的其它实施例和指导可见于例如国际公开号WO2008/042236、美国专利公开号2008/0064049和美国专利公开号2008/0178305。
在某些实施方案中，本文所述的MET结合剂在小鼠、食蟹猴或人中的循环半衰期为至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。在某些实施方案中，所述MET结合剂是IgG(例如IgG1或IgG2)抗体，其在小鼠、食蟹猴或人中的循环半衰期为至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。在某些实施方案中，所述MET结合剂是包含至少一种IgG(例如IgG1或IgG2)恒定区的试剂，其在小鼠、食蟹猴或人中的循环半衰期为至少约2小时、至少约5小时、至少约10小时、至少约24小时、至少约3天、至少约1周或至少约2周。递增(或递减)试剂例如多肽、可溶性受体和/或抗体的半衰期的方法是本领域已知的。例如，已知的延长IgG抗体的循环半衰期的方法包括在Fc区引入突变以在pH6.0增强抗体与新生儿Fc受体(FcRn)的pH依赖性结合(参见例如美国专利公开号2005/0276799、2007/0148164和2007/0122403)。延长不具有Fc区的抗体片段的循环半衰期的已知方法包括例如PEG化的技术。
在一些实施方案中，本文所述的结合剂是抗体。多克隆抗体可通过任何已知的方法来制备。在一些实施方案中，多克隆抗体是通过多次皮下或腹膜内注射而使动物(例如兔、大鼠、小鼠、山羊或驴)对所研究的抗原(例如纯化的肽片段、全长重组蛋白或融合蛋白)免疫而产生的。所述抗原可任选地缀合至载体例如匙孔血蓝蛋白(KLH)或血清白蛋白上。将所述抗原(含有或不含载体蛋白)稀释在无菌盐水中，并且通常与佐剂(例如完全或不完全弗氏佐剂)组合形成稳定的乳液。足够的一段时间之后，从经免疫处理的动物通常从血液或腹水回收多克隆抗体。所述多克隆抗体可根据本领域的标准方法从血清或腹水进行纯化，包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析。
在一些实施方案中，所述结合剂是单克隆抗体。单克隆抗体可利用本领域技术人员已知的杂交瘤方法来制备(参见例如KohlerandMilstein,1975,Nature,256:495-497)。在一些实施方案中，利用所述杂交瘤方法，如上文所述免疫处理小鼠、仓鼠或其它适当的宿主动物，以诱导由淋巴细胞产生特异性结合免疫抗原的抗体。在一些实施方案中，淋巴细胞可在体外进行免疫处理。在一些实施方案中，所述免疫抗原可以是人蛋白质或其一部分。在一些实施方案中，所述免疫抗原可以是小鼠蛋白质或其一部分。
在免疫之后，将淋巴细胞分离出来并使用例如聚乙二醇使其与合适的骨髓瘤细胞系融合。使用本领域已知的专用介质对杂交瘤细胞进行选择，未融合的淋巴细胞和骨髓瘤细胞在选择过程中不能存活。可通过多种方法包括但不限于免疫沉淀法、免疫印迹法和体外结合测定法(例如流式细胞术、FACS、ELISA和放射免疫测定法)确定产生特异性针对所选抗原的单克隆抗体的杂交瘤。可以或者使用标准方法通过体外培养(J.W.Goding,1996,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,3rdEdition,AcademicPress,SanDiego,CA)或者以动物体内的腹水瘤对杂交瘤进行传代。所述单克隆抗体可根据本领域的标准方法从培养基或腹水流体进行纯化，所述标准方法包括但不限于亲和色谱、离子交换色谱、凝胶电泳和透析。
在某些实施方案中，单克隆抗体可使用本领域技术人员已知的重组DNA技术来制备。编码单克隆抗体的多核苷酸例如通过RT-PCR利用特异性扩增编码所述抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸引物从成熟的B细胞或杂交瘤细胞分离，并且使用标准技术测定它们的序列。然后将分离的编码重链和轻链的多核苷酸克隆到合适的表达载体中，该合适的表达载体在转染到不另外产生免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞例如大肠杆菌、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞中时产生单克隆抗体。
在某些其它实施方案中，重组单克隆抗体或其片段可从表达所希望的物种的可变结构域或CDR的噬菌体展示文库中分离(参见例如McCafferty等人，1990,Nature,348:552-554；Clackson等人，1991,Nature,352:624-628；以及Marks等人，1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。在一些实施方案中，重组单克隆抗体或其片段可从表达所希望的物种的可变结构域或CDR的哺乳动物细胞展示文库中分离(参见例如美国专利公开No.2011/0287979)。
编码单克隆抗体的多核苷酸可例如通过使用重组DNA技术进行修饰以产生可替代的抗体或可替代的双特异性试剂。在一些实施方案中，例如小鼠单克隆抗体的轻链和重链的恒定结构域可替代例如人抗体的那些区域以产生嵌合抗体或者用于非免疫球蛋白多肽以产生融合抗体。在一些实施方案中，所述恒定区被截短或去除以产生单克隆抗体的所希望的抗体片段。所述可变区的定点或高密度突变可用于优化单克隆抗体的特异性、亲和力等等。
在一些实施方案中，所述结合剂是人源化抗体。通常，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自CDR的残基利用本领域技术人员已知的方法被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠等等)的具有所希望的特异性、亲和力和/或结合能力的CDR的残基替换。在一些实施方案中，人免疫球蛋白的Fv框架区残基被来自非人物种的具有所希望的特异性、亲和力和/或结合能力的抗体中相应的残基替代。在一些实施方案中，人源化抗体可进一步通过所述Fv框架区中和/或所替代的非人残基内的其它残基替代进行修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和性和/或能力。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有的至少一个、通常两个或三个可变结构域，其包含所有或基本上所有的对应于所述非人免疫球蛋白的CDR，而所有或基本上所有的框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一些实施方案中，人源化抗体也可包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的那些。在某些实施方案中，这样的人源化抗体用于治疗，因为当施用给人受试者时它们可降低抗原性和HAMA(人抗小鼠抗体)响应。本领域技术人员利用下述已知技术将能够获得具有降低的免疫原性的功能化人源化抗体(参见例如美国专利No.5225539；5585089；5693761和5693762)。
在某些实施方案中，所述结合剂是人抗体。人抗体可使用本领域中已知的各种技术直接制备。在一些实施方案中，人抗体可由体外经免疫处理的永生化人B淋巴细胞或从经免疫处理的个体分离的淋巴细胞制备。在这两种情况的任一情况下，可制备并分离产生针对靶标抗原的抗体的细胞(参见例如Cole等人，1985,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77；Boemer等人，1991,J.Immunol.,147:86-95以及美国专利No.5,750,373；5,567,610和5,229,275)。在一些实施方案中，所述人抗体可选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等人，1996,NatureBiotechnology,14:309-314；Sheets等人，1998,PNAS,95:6157-6162；HoogenboomandWinter,1991,J.Mol.Biol.,227:381；Marks等人，1991,J.Mol.Biol.,222:581)。或者，噬菌体展示技术可用于由来自未经免疫处理的供体的免疫球蛋白的可变结构域基因总数体外产生人抗体和抗体片段。用于产生和使用抗体噬菌体文库的技术还描述在美国专利No.5,969,108；6,172,197；5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484和7,264,963以及罗特等人，2008,J.Mol.Bio.,376:1182-1200中。一旦抗体被识别，本领域已知的亲和力成熟的策略，包括但不限于链替代(Marks等人，1992,Bio/Technology,10:779-783)和定点突变，可用于产生高亲和力的人抗体。
在一些实施方案中，人抗体可在包含人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠中制备。一旦免疫化，这些小鼠能产生全部总数的人抗体而不存在内源性免疫球蛋白的产生。这种方法描述在美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425和5,661,016中。
本发明还包括双特异性试剂和双特异性抗体。双特异性试剂能特异性识别并结合至少两个不同的靶标或表位。不同的靶标可以在同一分子内(例如单个蛋白质上的两个靶标)或在不同的分子上(例如一个蛋白质上的一个靶标和第二蛋白质上的第二靶标)。在一些实施方案中，双特异性试剂或双特异性抗体相比于单个试剂或抗体或多个一个的试剂的混合物而言效力增强。在一些实施方案中，双特异性试剂或双特异性抗体相比于单个试剂或多个一个的试剂的组合而言毒性降低。本领域技术人员已知任何结合剂可具有独特的药代动力学(PK)(例如循环半衰期)。在一些实施方案中，双特异性试剂或双特异性抗体具有使两个活性结合剂的PK同步的能力，其中所述两个单独的结合剂具有不同的PK特性。在一些实施方案中，双特异性试剂或双特异性抗体具有使两个结合剂的作用集中在共有区域(例如肿瘤和/或肿瘤环境中)中的能力。在一些实施方案中，双特异性试剂或双特异性抗体具有使两个结合剂的作用集中在共有靶标(例如肿瘤或肿瘤细胞)中的能力。在一些实施方案中，双特异性试剂或双特异性抗体具有使两个结合剂的作用靶向多于一个的生物学通路或功能的能力。
在某些实施方案中，双特异性抗体特异性结合MET和第二靶标。在某些实施方案中，双特异性抗体特异性结合MET和WNT通路的一个或更多个组件。在一些实施方案中，双特异性抗体特异性结合人MET和一种或多种人WNT蛋白质。在一些实施方案中，双特异性抗体特异性结合人MET和一个或更多个人FZD蛋白。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是人抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是嵌合抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体降低癌症干细胞的数量或频率。在一些实施方案中，所述双特异性抗体具有降低的毒性和/或副作用。在一些实施方案中，所述双特异性抗体相比于两个单个抗体的混合物或所述抗体作为单个试剂而言具有降低的毒性和/或副作用。在一些实施方案中，所述双特异性抗体的治疗指数提高。在一些实施方案中，所述双特异性抗体相比于两个单个抗体的混合物或所述抗体作为单个试剂而言治疗指数提高。
在一些实施方案中，双特异性抗体可特异性识别并结合人MET以及第二抗原靶标例如白细胞(例如CD2、CD3、CD28、CD80或CD86)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)上的效应子分子，以便使细胞防御机制集中到表达MET的细胞上。在一些实施方案中，双特异性抗体可用于使细胞毒性剂靶向表达特定靶标抗原的细胞。这些抗体具有抗原结合位点(例如对于人MET)和结合细胞毒剂或放射性核素螯合剂例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的第二位点。
制备双特异性抗体的技术是本领域技术人员已知的，参见例如Millstein等人，1983,Nature,305:537-539；Brennan等人，1985,Science,229:81；Suresh等人，1986,MethodsinEnzymol.,121:120；Traunecker等人，1991,EMBOJ.,10:3655-3659；Shalaby等人，1992,J.Exp.Med.,175:217-225；Kostelny等人，1992,J.Immunol.,148:1547-1553；Gruber等人，1994,J.Immunol.,152:5368；美国专利No.5,731,168；国际公开No.WO2009/089004以及美国专利公开No.2011/0123532。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包括所述氨基酸中具有修饰的重链恒定区，其是所述两个重链之间界面的一部分。在一些实施方案中，所述双特异性抗体可利用“杵臼”的策略来产生(参见例如美国专利No.5731168；Ridgway等人，1996,Prot.Engin.,9:617-621)。有时“杵”和“臼”术语被替换为术语“突起”和“气孔”。在一些实施方案中，所述双特异性抗体可包括不能在重链之间形成二硫键的变体绞链区(参见例如WO2006/028936)。在一些实施方案中，所述修饰可包括导致静电相互作用改变的氨基酸改变。在一些实施方案中，所述修饰可包括导致疏水/亲水相互作用改变的氨基酸改变(参见例如美国专利申请No.2011/0123532)。
双特异性抗体可以是包括抗原结合位点的完整抗体或抗体片段。也可包括效价大于2的抗体。例如，可制备三特异性抗体(Tutt等人，1991,J.Immunol.,147:60)。因此，在某些实施方案中，抗MET和/或WNT通路的一个或更多个组件的抗体是多特异性的。
在某些实施方案中，本文所述的抗体(或其它多肽)可以是单特异性的。在某些实施方案中，抗体包含的一个或更多个抗原结合位点中的每一个均能结合不同蛋白质上的同源表位。
在某些实施方案中，所述结合剂包括抗体片段。抗体片段可具有与完整抗体不同的功能或能力；例如，抗体片段的肿瘤透过性可增强。已知多种技术用于制备抗体片段，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化。在一些实施方案中，抗体片段包括通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab’)2片段。在一些实施方案中，抗体片段包括通过减少F(ab’)2片段的二硫键桥产生的Fab片段。在其它实施方案中，抗体片段包括通过利用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生的Fab片段。在某些实施方案中，抗体片段是利用重组技术产生的。在一些实施方案中，抗体片段包括Fv或单链Fv(scFv)片段。Fab、Fv和scFv抗体片段可在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达并由其分泌，允许产生大量的这些片段。在一些实施方案中，抗体片段是从本文所述的抗体噬菌体文库中分离的。例如，方法可用于Fab表达文库的构建(Huse等人，1989,Science,246:1275-1281)，以允许快速并有效地识别对MET和/或WNT通路的一个或更多个组件或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所希望的特异性的单克隆Fab片段。在一些实施方案中，抗体片段是线性抗体片段。在某些实施方案中，抗体片段是单特异性的或双特异性的。在某些实施方案中，所述结合剂是scFv。多种技术可用于制备对MET或WNT通路的一个或更多个组件具有特异性的单链抗体。
修饰抗体以为了改变(例如延长或缩短)其血清半衰期还可能是所希望的(特别是在抗体片段的情况下)。这可例如通过经由在抗体片段中的合适区域突变将补救受体结合表位引入到抗体片段中或通过将表位掺入到随后融合至抗体片段的任一端或中间的肽标签上(例如通过DNA或肽合成)来实现。
异源缀合抗体也在本发明的范围内。异源缀合抗体包括两个共价连接的抗体。这样的抗体已例如被建议将免疫细胞靶向不想要的细胞(参见例如美国专利No.4676980)。还可以预计可使用合成蛋白质化学中已知的方法包括涉及交联剂的那些在体外制备所述异源缀合抗体。例如，使用二硫键交换反应来或通过形成硫醚键可构建免疫毒素。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇酯和甲基-4-巯基丁酰亚氨酸酯。
为了本发明的目的，应该理解的是修饰剂可包括任何类型的提供所述试剂与靶标(即人MET或人WNT蛋白)相关的区域。在一些实施方案中，所述区域是可包括可被诱导以启动体液应答并产生针对所希望的抗原的免疫球蛋白的任何类型哺乳动物或由其衍生的可变区。同样，修饰抗体的可变区可以是例如人、鼠科动物、非人灵长类动物(例如食蟹猴、猕猴等等)或兔来源。在一些实施方案中，修饰免疫球蛋白的可变区和恒定区都是人的。在其它实施方案中，相容的抗体(通常来源于非人来源)的可变区可设计或专门定做以改善结合特性或降低分子的免疫原性。在这方面，用于本发明的可变区中可以是人源化的或另外通过引入进口氨基酸序列进行改变。
在某些实施方案中，重链和轻链两者的可变结构域通过至少部分替代一个或更多个CDR而改变，并且如果需要的话，通过部分框架区替代和序列修饰和/或改变而改变。虽然CDR可来自与衍生所述框架区的抗体种类或甚至亚型相同的抗体，但可以设想的是所述CDR可来自不同种类的抗体并且通常来自不同物种的抗体。可能不需要利用来自供体可变区的所有CDR替代所有CDR，以使一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个。相反，可能只需要转移维持抗原-结合位点的活性所需的那些残基。
尽管可变区改变，可是本领域技术人员应理解的是，本发明的修饰抗体将包括抗体(例如全长抗体或其免疫反应性片段)或双特异性试剂，其中一个或更多个恒定区结构域的至少一小部分已缺失或以另外的方式改变以至于当与包括天然或未改变的恒定区的免疫原性大约相同的抗体相比时提供所希望的生化特性，例如提高肿瘤定位或延长血清半衰期。在一些实施方案中，修饰抗体的恒定区将包括人恒定区。与本发明兼容的恒定区修饰包括一个或更多个结构域中的一个或更多个氨基酸的添加、缺失或替代。本文公开的修饰抗体和/或双特异性试剂可包括所述三个重链恒定结构域(CH1、CH2或CH3)中一个或更多个和/或轻链恒定结构域(CL)的改变或修饰。在一些实施方案中，一个或更多个结构域被部分或完全从修饰抗体的恒定区中缺失。在一些实施方案中，修饰抗体将包括结构域缺失的构建体或变体，其中整个CH2结构域已除去(ΔCH2构建体)。在一些实施方案中，删去的恒定区结构域被替代为短的氨基酸间隔区(例如10个氨基酸残基)，其提供了通常由不存在的恒定区赋予的一些分子灵活性。
在一些实施方案中，所述修饰抗体或双特异性试剂设计成所述CH3结构域直接融合至所述抗体的铰链区。在其它实施方案中，肽间隔区被插入在所述铰链区和所述修饰CH2和/或CH3结构域之间。例如，构建体可表达，其中所述CH2结构域已缺失并且利用5-20个氨基酸间隔区将剩余的CH3结构域(修饰的或未修饰的)连接至所述铰链区。可加入这样的间隔区以确保恒定结构域的调控元件保持为自由的和可接近的或者所述铰链区保持为易弯曲的。但是，应该指出的是，氨基酸间隔区可在某些情况下证明是免疫原性的并且针对构建体引发不想要的免疫反应。因此，在某些实施方案中，加入到所述构建体中的任何间隔区将是相对非免疫原性的，以便保持所述修饰抗体的所希望的生物学特性。
在一些实施方案中，所述修饰抗体或双特异性试剂可仅部分缺失恒定结构域或替代几个甚至单个氨基酸。例如，所述CH2结构域的所选区域中单个氨基酸的突变可足以基本上降低Fc结合并由此提高癌细胞定位和/或肿瘤透过性。类似地，可希望简单地缺失控制待调节的特定效应子功能(例如补体C1q结合)的一个或更多个恒定区结构域的一部分。所述恒定区的这样的部分缺失可改善所述抗体的所选特性(血清半衰期)，同时留下与完整的主体恒定区结构域相关的其它所希望的功能。此外，如上文所提到的，所公开的抗体和/或双特异性试剂的恒定区可通过增强所得构建体的特性的一个或更多个氨基酸的突变或替代而进行修饰。在这方面，有可能破坏由保守结合位点(例如Fc结合)提供的活性，同时基本上维持所述修饰抗体的构型和免疫原性特性。在某些实施方案中，所述修饰抗体和/或双特异性试剂包括将一个或更多个氨基酸添加到恒定区中以提高所希望的特性，例如降低或提高效应子功能或者提供更多个细胞毒素或碳水化合物连接位点。
本领域中已知恒定区介导几个效应子功能。例如，补体的C1部分与IgG或IgM抗体的Fc区结合(结合至抗原)而激活补体系统。补体的激活对细胞病原体的调理和裂解是重要的。补体的激活还能刺激炎症反应并且也可涉及自身免疫超敏反应。此外，抗体的Fc区或Fc融合蛋白可结合表达Fc受体(FcR)的细胞。许多Fc受体对不同种类的抗体具有特异性，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面的Fc受体结合触发许多重要的和不同的生物反应，包括抗体包被颗粒的吞噬和破坏、免疫复合物的清除、通过杀伤细胞裂解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞毒性或ADCC)、炎性介质的释放、胎盘转移和对免疫球蛋白的产生的控制。
在某些实施方案中，所述修饰抗体和/或双特异性试剂提供改变的效应子功能，其反过来影响所施用的抗体的生物学特性。例如，在一些实施方案中，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它手段)可降低循环修饰抗体的Fc受体结合，从而提高癌症细胞定位和/或肿瘤透过性。在其它实施方案中，所述恒定区修饰延长抗体和/或双特异性试剂的血清半衰期。在其它实施方案中，所述恒定区修饰缩短抗体和/或双特异性试剂的血清半衰期。在一些实施方案中，所述恒定区被修饰以消除二硫键连接或寡糖部分。根据本发明的恒定区的修饰可利用本领域技术人员众所周知的生物化学或分子工程技术容易地实施。
在某些实施方案中，抗体和/或双特异性试剂不具有一个或更多个效应子功能。例如，在一些实施方案中，所述抗体、双特异性试剂无ADCC活性和/或无补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在某些实施方案中，所述抗体和/或双特异性试剂不结合Fc受体和/或补体因子。在某些实施方案中，所述抗体和/或双特异性试剂无效应子功能。
本发明进一步包括与本文所述的嵌合、人源化和人的抗体或其抗体片段或双特异性试剂基本同源的变体和等价物。这些可包括例如保守替代突变，即一个或更多个氨基酸被类似的氨基酸替代。例如，保守替代是指同一普通种类中的一个氨基酸被另一个氨基酸替代，比如例如一个酸性氨基酸被另一个酸性氨基酸替代，一个碱性氨基酸被另一个碱性氨基酸替代或一个中性氨基酸被另一个中性氨基酸替代。保守氨基酸替代的目的是本领域中众所周知的并且如本文所述。
因此，本发明提供用于制备结合MET和/或WNT通路的一个或更多个组件的抗体或双特异性试剂的方法，包括特异性结合MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂。在一些实施方案中，用于制备结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的抗体的方法包括利用杂交瘤技术。在一些实施方案中，制备结合MET或WNT通路的一个或更多个组件的试剂或结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂的方法包括筛选人噬菌体展示文库。在一些实施方案中，制备结合MET或WNT通路的一个或更多个组件的试剂或结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂的方法包括筛选哺乳动物细胞展示文库。本发明进一步提供识别结合MET和/或WNT通路的一个或更多个组件的试剂的方法。在一些实施方案中，所述试剂通过用于结合MET或其片段的FACS筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过用于结合WNT通路的一个或更多个组件或其片段的FACS筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过用于结合MET和WNT通路的一个或更多个组件或其片段的FACS筛选进行确认。在某些实施方案中，所述试剂通过利用用于结合MET的ELISA筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过利用用于结合WNT通路的一个或更多个组件的ELISA筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过利用用于结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的ELISA筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过用于阻断人MET与人肝细胞生长因子的结合的FACS筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过用于阻断一个或更多个WNT蛋白与人FZD蛋白的结合的FACS筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过抑制或阻断WNT通路信号传导的筛选进行确认。在一些实施方案中，所述试剂通过抑制或阻断MET活性的筛选进行确认。
在某些实施方案中，本文所述的抗体和/或双特异性试剂是分离的。在某些实施方案中，本文所述的抗体和/或双特异性试剂是基本上纯的。
在本发明的一些实施方案中，所述MET结合剂是多肽。所述多肽可以是结合MET和/或WNT通路的一个或更多个组件的含有抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。在一些实施方案中，所述多肽是多聚体。在一些实施方案中，所述多肽是二聚体。所述多肽可以是结合WNT通路的一个或更多个组件的含有可溶性受体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。本领域技术人员应认识到的是，本文所述的结合剂的一些氨基酸序列可改变而对蛋白质的结构或功能无显著影响。因此，本发明进一步包括具有明显活性或包括抗人MET和/或WNT通路的一个或更多个组件的抗体或其片段的区域的多肽变体。在一些实施方案中，结合MET的多肽的氨基酸序列变体包括插入、缺失、倒位、重复和/或其它类型的替代。
在一些实施方案中，本文所述的多肽是分离的。在一些实施方案中，本文所述的多肽是基本上纯的。
所述多肽、类似物及其变体可进一步修饰以包括通常不是多肽的一部分的其它化学部分。衍生部分可改善或者以其他方式调节多肽的溶解度、生物半衰期和/或吸收。该部分还可减少或消除多肽和变体的不良副作用。化学部分的概述可见于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London。
本文所述的多肽可通过本领域中已知的任何合适的方法制备。这样的方法的范围从直接蛋白质合成法至构建编码多肽序列并在合适的宿主中表达这些序列的DNA序列。在一些实施方案中，DNA序列是利用重组技术通过分离或合成编码所研究的野生型蛋白质的DNA序列而构建的。任选地，所述序列可通过定点突变进行突变以提供其功能类似物。参见例如Zoeller等人，1984,PNAS,81:5662-5066和美国专利号4,588,585。
在一些实施方案中，编码所研究的多肽的DNA序列可通过化学合成使用寡核苷酸合成仪来构建。寡核苷酸可基于所希望的多肽的氨基酸序列和选择其中将产生所研究的重组多肽的宿主细胞中有利的那些密码子来设计。标准方法可用于合成编码所研究的分离多肽的多核苷酸序列。例如，完整的氨基酸序列可用于构建反翻译基因(back-translatedgene)。此外，可合成包含编码特定的分离多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可合成并然后连接编码所希望的多肽的一部分的几个小寡核苷酸。单个寡核苷酸通常含有用于补充组件的5’或3’悬挂物。
一旦组装(通过合成、定点突变或其它方法)，编码所研究的特定多肽的多核苷酸序列可被插入到表达载体中并可操作性地连接至适于在所希望的宿主中表达蛋白质的表达调控序列。正确的组装可通过核苷酸测序、限制性内切酶图谱分析和/或生物活性多肽在合适宿主中的表达来确认。如本领域众所周知的是，为了在宿主中获得高表达水平的转染基因，所述基因必须可操作地连接至在所选的表达宿主中是功能性的转录和翻译表达调控序列。
在某些实施方案中，重组表达载体用于扩增和表达编码结合人MET和/或WNT通路的一个或更多个组件的抗体或其片段或双特异性试剂的DNA。例如，重组表达载体可以是可复制型DNA构建体，其具有合成的或cDNA衍生的DNA片段，编码MET结合剂例如抗MET抗体或含有抗Met抗体和FZD可溶性受体的双特异性试剂或其片段的多肽链，可操作地连接至来自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适的转录和/或翻译调控元件。转录单元通常包括组件(1)在基因表达中具有调控作用的遗传元件，例如转录启动子或增强子，(2)转录到mRNA中并翻译成蛋白质的结构或编码序列，和(3)合适的转录和翻译起始和终止序列。调控元件可包括控制转录的操纵子序列。在宿主中复制的能力通常由复制起点赋予并且可另外引入便于识别转化子的选择基因。当DNA区在功能上彼此相关时，它们是“可操作地连接的”。例如，用于信号肽(分泌前导)的DNA可操作地连接至用于多肽的DNA，如果它被表示为参与多肽分泌的前体时；启动子可操作地连接至编码序列，如果它控制序列的转录时；或者核糖体结合位点可操作地连接至编码序列，如果它被定位以便允许翻译时。在一些实施方案中，旨在用于酵母表达系统中的结构元件包括能使宿主细胞经细胞外分泌翻译蛋白的前导序列。在其它实施方案中，在重组蛋白在不具有前导或传递序列的情况下进行表达时，它可包括N-末端蛋氨酸残基。此残基可任选地随后从所表达的重组蛋白中裂解下来以提供最终产物。
表达调控序列和表达载体的选择取决于对宿主的选择。可使用各种各样的表达宿主/载体组合。有用的真核宿主表达载体包括例如含有来自SV40、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和巨细胞病毒的表达调控序列的载体。有用的细菌宿主表达载体包括已知的细菌质粒例如来自大肠杆菌包括pCR1、pBR322、pMB9的质粒及其衍生物，以及更广泛的宿主范围质粒，例如M13和其它丝状单链DNA噬菌体。
本发明的结合剂(例如多肽)可由一个或更多个载体表达。例如，在一些实施方案中，重链多肽由第一载体表达而轻链多肽由第二载体表达。在一些实施方案中，重链多肽和轻链多肽由一个载体表达。在一些实施方案中，重链多肽由一个载体表达而轻链多肽由第二载体并且包含可溶性受体的多肽由第三载体表达。在一些实施方案中，重链多肽和轻链多肽由一个载体表达而包含可溶性受体的多肽由第二载体表达。在一些实施方案中，三条多肽由一个载体表达。因此，在一些实施方案中，重链多肽、轻链多肽和包含可溶性受体的多肽由单个载体表达。
在合适的启动子的控制下用于表达MET结合多肽或试剂(或MET、WNT或FZD蛋白用作抗原)的合适的宿主细胞包括原核生物、酵母细胞、昆虫细胞或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或芽孢杆菌。高等真核细胞包括建立的哺乳动物来源的细胞系，如下文所述。也可使用无细胞翻译系统。用于细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主的合适的克隆和表达载体描述于Pouwels等人，1985,CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,NewYork,NY。关于蛋白质制备(包括抗体制备)的方法的其它信息可见于例如美国专利公开No.2008/0187954；美国专利No.6413746；6660501和国际专利公开No.WO04/009823中。
许多哺乳动物细胞培养系统可用于表达重组多肽。在哺乳动物细胞中表达重组蛋白可能是所希望的，因为这些蛋白通常正确折叠、适当修饰并具有生物学功能。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括但不限于COS-7(猴肾来源的)、L-929(鼠成纤维细胞来源的)、C127(鼠科乳腺肿瘤来源的)、3T3(鼠科成纤维细胞来源的)、CHO(中国仓鼠卵巢来源的)、HeLa细胞(人子宫颈癌来源的)、BHK(仓鼠肾成纤维细胞来源的)、HEK-293(人胚肾来源的)细胞系和这些细胞系的变体。哺乳动物表达载体可包括非转录元件，例如复制起点、连接至待表达基因的合适的启动子和增强子、其它5’或3’侧翼非转录序列以及5’或3’非翻译序列，例如必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点以及转录终止序列。
在昆虫细胞培养系统(例如杆状病毒)中表达重组蛋白还提供制备正确折叠和具有生物学功能的蛋白质的稳健方法。用于在昆虫细胞中制备异源蛋白质的杆状病毒系统是本领域技术人员众所周知的(参见例如LuckowandSummers,1988,Bio/Technology,6:47)。
因此，本发明提供包含本文所述的结合剂的细胞。在一些实施方案中，所述细胞产生本文所述的结合剂。在某些实施方案中，所述细胞产生抗体。在一些实施方案中，所述细胞产生MET结合剂，例如抗MET抗体。在一些实施方案中，所述细胞产生结合MET的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述细胞产生结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述细胞产生结合MET和一个或更多个FZD蛋白的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述细胞产生结合MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生抗体73R009。在某些实施方案中，所述细胞产生抗体73R009的人源化变体。在某些实施方案中，所述细胞产生抗体73R010(73R009H12L7)。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R009的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R009人源化变体的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R010(73R009H12L7)的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R009和FZDFri结构域的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R009人源化变体和FZDFri结构域的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R010(73R009H12L7)和FZDFri结构域的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R009和FZD8Fri结构域的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R009人源化变体和FZD8Fri结构域的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生包括来自抗体73R010(73R009H12L7)和FZD8Fri结构域的抗原结合位点的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述细胞产生双特异性试剂315B06。在某些实施方案中，所述细胞产生双特异性试剂315B07。在某些实施方案中，所述细胞产生双特异性试剂315B09。
可根据任何合适的方法纯化由转化宿主产生的蛋白质，包括双特异性试剂。标准方法包括色谱法(例如离子交换、亲和和尺寸柱色谱)、离心、差异溶解度或任何其它标准蛋白质纯化技术。亲和标签例如六聚组氨酸、麦芽糖结合结构域、流感外壳序列和谷胱甘肽-S-转移酶可连接至蛋白质，以允许通过合适的亲和柱上的通路容易纯化。用于纯化免疫球蛋白的亲和色谱法可包括蛋白A、蛋白G和蛋白L色谱法。分离的蛋白质可利用这样的技术例如蛋白水解、尺寸排阻色谱法(SEC)、质谱(MS)、核磁共振(NMR)、等电聚焦(IEF)、高效液相色谱(HPLC)和X射线晶体学进行物理表征。分离的蛋白质的纯度可利用本领域技术人员已知的技术进行测定，包括但不限于SDS-PAGE、SEC、毛细管凝胶电泳、IEF和毛细管等电聚焦(cIEF)。
在一些实施方案中，来自将重组蛋白分泌到培养基中的表达系统的上清液可首先利用市售的蛋白质浓缩过滤器例如Amicon或Millipore的Pellicon超滤单元进行浓缩。浓缩步骤之后，浓缩物可用于合适的纯化基质。在一些实施方案中，可利用阴离子交换树脂，例如具有侧链二乙基氨基乙基(DEAE)基团的基质或底物。所述基质可以是丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或蛋白质纯化中常用的其它类型。在一些实施方案中，可使用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换剂包括包含磺丙基或羧甲基基团的各种不溶性基质。在一些实施方案中，可使用羟基磷灰石介质，包括但不限于陶瓷羟基磷灰石(CHT)。在某些实施方案中，使用疏水性RP-HPLC介质例如具有侧链甲基或其它脂肪族基团的硅胶的一个或更多个反相HPLC步骤可用于进一步纯化重组蛋白(例如MET结合剂)。一些或所有上述纯化步骤可以以多种组合用于提供均匀的重组蛋白。
在一些实施方案中，根据本文所述的任何方法纯化异源二聚体蛋白质，例如本文所述的双特异性试剂。在一些实施方案中，双特异性试剂是分离的和/或使用至少一个色谱步骤纯化的。在一些实施方案中，所述至少一个色谱步骤包括亲和色谱。在一些实施方案中，所述至少一个色谱步骤进一步包括阴离子交换色谱。在一些实施方案中，所述分离的和/或纯化的抗体产物包含至少90％的异二聚体。在一些实施方案中，所述分离的和/或纯化的产物包含至少95％、96％、97％、98％或99％的异二聚体。在一些实施方案中，所述分离的和/或纯化的产物包含约100％的异二聚体。
在一些实施方案中，细菌培养物中产生的重组蛋白可被分离出来，例如通过从细胞沉淀物提取开始，然后一次或更多次浓缩、盐析、水性离子交换或尺寸排阻色谱步骤。HPLC可用于最终的纯化步骤。可用在重组蛋白表达中的微生物细胞可通过任何常规的方法破碎，包括冻融循环、超声处理、机械破碎或使用细胞裂解剂。
本领域已知的用于纯化抗体和其它蛋白质的方法还包括例如美国专利公开No.2008/0312425、2008/0177048和2009/0187005中描述的那些。
在某些实施方案中，MET结合剂是多肽，其不是抗体。用于确认和生产与蛋白质靶标具有高亲和力的非抗体多肽的多种方法是本领域已知的。参见例如Skerra,2007,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304；Hosse等人，2006,ProteinScience,15:14-27；Gill等人，2006,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658；Nygren,2008,FEBSJ.,275:2668-76以及Skerra,2008,FEBSJ.,275:2677-83。在某些实施方案中，噬菌体或哺乳动物细胞展示技术可用于制备和/或确认不是抗体的MET结合多肽。在某些实施方案中，所述多肽包括选自由蛋白质A、蛋白G、载脂蛋白、纤连蛋白结构域、锚定蛋白共有重复结构域和硫氧还蛋白所组成的组中的类型的蛋白支架。
在某些实施方案中，MET结合剂可用在若干缀合(即免疫缀合物或放射缀合物)或非缀合形式的任何一种中。在某些实施方案中，所述试剂可用在非缀合形式中以利用受试者的天然防御机制(包括补体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞毒性)来消除恶性或癌细胞。
在一些实施方案中，MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)缀合至细胞毒性剂上。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是化疗剂，包括但不限于甲氨蝶呤、阿霉素、多柔比星、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、柔红霉素或其它嵌入剂。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段，包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链、蓖麻毒素A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒素A链、α-sarcin、油桐蛋白、石竹素蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒素、石碱草抑制剂、白树毒素、蜜桃格林(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素、新霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。在一些实施方案中，所述细胞毒性剂是产生放射缀合物或放射缀合抗体的放射性同位素。多种放射性核素可用于制备放射缀合抗体，包括但不限于90Y、125I、131I、123I、111In、131In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、188Re和212Bi。在一些实施方案中，也可使用本文所述的结合剂的缀合物与一种或更多种小分子毒素，例如卡奇霉素、美登素类、单端孢霉烯族化合物和CC1065及这些毒素的具有毒素活性的衍生物。在一些实施方案中，本文所述的结合剂缀合至美登素类上。在一些实施方案中，本文所述的结合剂缀合至mertansine(DM1)上。本文所述的结合剂的缀合物和细胞毒剂可使用多种双功能蛋白质偶联剂制备，包括但不限于N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(例如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(例如双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双叠氮化合物(例如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(例如双-(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。
III.多核苷酸
在某些实施方案，本发明包括多核苷酸，其包括编码多肽(或多肽片段)的多核苷酸，其特异性结合MET、WNT通路的一个或更多个组件或者MET和WNT通路的一个或更多个组件两者。术语“编码多肽的多核苷酸”包括仅含有编码所述多肽的序列的多核苷酸以及含有其它编码和/或非编码序列的多核苷酸。例如，在一些实施方案中，本发明提供包括编码抗人MET的抗体的多核苷酸序列或编码这样的抗体的片段(例如包括所述抗原结合位点的片段)的多核苷酸序列。在一些实施方案中，本发明提供包括编码多肽(其结合一个或更多个人FZD蛋白)的多核苷酸序列的多核苷酸，或编码这样的多肽的片段(例如包括所述结合位点的片段)的多核苷酸序列的多核苷酸。在一些实施方案中，本发明提供包括编码多肽(其结合一个或更多个人WNT蛋白质)的多核苷酸序列的多核苷酸，或编码这样的多肽的片段(例如包括所述结合位点的片段)。本发明的多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式。DNA包括cDNA、基因组DNA和合成DNA；并且可以是双链的或单链的，并且如果是单链的，则可以是编码链或非编码(反义)链。
在某些实施方案中，所述多核苷酸包括多核苷酸，其编码含有选自由以下所组成的组中的序列的多肽：SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:55、SEQIDNONO:56、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111，和SEQIDNO:114。在一些实施方案中，所述多核苷酸包括选自以下所组成的组中的多核苷酸序列：SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107和SEQIDNO:109。在一些实施方案中，所述多核苷酸包括选自由以下所组成的组中的多核苷酸序列：SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107和SEQIDNO:109。
在某些实施方案中，所述多核苷酸包括与包含选自由以下序列所组成的组中的序列的多核苷酸至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同，并且在一些实施方案中，至少约96％、97％、98％或99％相同的具有核苷酸序列的多核苷酸：SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107和SEQIDNO:109。还提供了多核苷酸，其包括与SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107或SEQIDNO:109杂交的多核苷酸。还提供了多核苷酸，其包括与SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107或SEQIDNO:109的互补链杂交的多核苷酸。在某些实施方案中，所述杂交是在高度严格的条件下进行的。
本发明的结合剂可由一个或更多个多核苷酸编码。例如，在一些实施方案中，重链多肽由一个多核苷酸编码而轻链多肽由第二多核苷酸编码。在一些实施方案中，重链多肽和轻链多肽由一个多核苷酸编码。在一些实施方案中，重链多肽由一个多核苷酸编码而轻链多肽由第二多核苷酸编码并且包括可溶性受体的多肽由第三多核苷酸编码。在一些实施方案中，重链多肽和轻链多肽由一个多核苷酸编码并且包括可溶性受体的多肽由第二多核苷酸编码。在一些实施方案中，三条多肽由一个多核苷酸编码。因此，在一些实施方案中，重链多肽、轻链多肽和包括可溶性受体的多肽由单个多核苷酸编码。
在某些实施方案中，所述多核苷酸包括融合在与有助于例如来自宿主细胞的多肽的表达和分泌(例如起到分泌序列的作用的前导序列，用于控制来自细胞的多肽的转运)的多核苷酸相同的阅读框中的成熟多肽的编码序列。具有前导序列的多肽是前蛋白并且前导序列可由宿主细胞切割以形成多肽的成熟形式。所述多核苷酸还可编码前蛋白，其是具有附加的5’氨基酸残基的成熟蛋白。具有前序列的成熟蛋白是前蛋白并且是蛋白的非活性形式。一旦所述前序列被切割，就存在活性成熟蛋白。
在某些实施方案中，所述多核苷酸包括融合在与标记序列相同的阅读框中的成熟多肽的编码序列，允许例如纯化所编码多肽。例如，所述标记序列可以是由pQE-9载体提供的六聚组氨酸标签，以提供在细菌宿主的情形下纯化融合至所述标记物上的成熟多肽，或者当使用哺乳动物宿主(例如COS-7细胞)时所述标记序列可以是来源于流感红细胞凝集素蛋白的红细胞凝集素(HA)标签。在一些实施方案中，所述标记序列是FLAG标签，可与其它亲和标签组合使用的序列DYKDDDDK(SEQIDNO:73)的肽。
本发明还涉及上文所述的多核苷酸编码的变体，例如片段、类似物和/或衍生物。
在某些实施方案中，本发明提供了多核苷酸，其包括具有与编码含有MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)的多肽或其片段的多核苷酸具有至少约80％相同、至少约85％相同、至少约90％相同、至少约95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，并且在一些实施方案中，至少约96％、97％、98％或99％相同，如本文所述。
如本文使用的，含有与参比核苷酸序列至少例如95％“相同的”核苷酸序列的短语多核苷酸旨在意指所述多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同，不同的是所述多核苷酸序列可包括参比核苷酸序列的每100个核苷酸最多5个点的突变。换句话说，为了获得含有与参比核苷酸序列具有至少95％相同的核苷酸序列的多核苷酸，参比序列中最多5％的核苷酸可被缺失或被另一核苷酸替代，或者所述参比序列中总核苷酸的最多5％的若干个核苷酸可被插入到所述参比序列中。所述参比序列的这些突变可发生在所述参比核苷酸序列的5’或3’的末端位置或者这些末端位置的之间的任何位置，单独穿插在所述参比序列中的核苷酸之间或者所述参比序列内的一个或更多个连续基团中。
所述多核苷酸变体的编码区、非编码区或两者中可包括改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包括产生沉默替代、添加或缺失而不改变所述编码多肽的性质或活性的改变。在一些实施方案中，多核苷酸变体包括沉默替代，其导致不改变多肽的氨基酸序列(由于遗传密码的简并)。多核苷酸变体可因各种原因而制备，例如以优化特定宿主的密码子表达(即人mRNA中的密码子变为由细菌宿主例如大肠杆菌优选的那些)。在一些实施方案中，多核苷酸变体在序列的非编码区或编码区中包括至少一个沉默突变。
在一些实施方案中，制备多核苷酸变体以调节或改变所述编码多肽的表达(或表达水平)。在一些实施方案中，制备多核苷酸变体以增加所编码多肽的表达。在一些实施方案中，制备多核苷酸变体以减少所述编码多肽的表达。在一些实施方案中，多核苷酸变体相比于亲本多核苷酸序列而言已增加所述编码多肽的表达。在一些实施方案中，多核苷酸变体相比于亲本多核苷酸序列而言已减少所述编码多肽的表达。
在一些实施方案中，制备至少一个多核苷酸变体(不改变所述编码多肽的氨基酸序列)以增加异源二聚体或异源多聚分子的产生。在一些实施方案中，制备至少一个多核苷酸变体(不改变所述编码多肽的氨基酸序列)以增加双特异性试剂的产生。
在某些实施方案中，所述多核苷酸是分离的。在某些实施方案中，所述多核苷酸是基本上纯的。
还提供了包括本文所述的多核苷酸的载体和细胞。在一些实施方案中，表达载体包含多核苷酸。在一些实施方案中，宿主细胞包含含有所述多核苷酸的表达载体。在一些实施方案中，宿主细胞包含多核苷酸。
IV.使用方法和药物组合物
结合MET或结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的本发明MET结合剂(包括抗体和双特异性试剂)用于各种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，例如癌症的治疗。在某些实施方案中，所述试剂用于抑制MET活性、抑制WNT通路活性、抑制肿瘤生长、减少肿瘤体积、降低肿瘤中癌症干细胞的频率、降低肿瘤的致瘤性、诱导肿瘤细胞分化、诱导癌症干细胞分化、诱导分化标记物在肿瘤细胞上的表达、诱导分化标记物在癌症干细胞上的表达、抑制血管生成和/或抑制EMT。使用方法可在体外、离体或在体内。在某些实施方案中，MET结合剂是人MET的拮抗剂。在某些实施方案中，MET结合剂是WNT通路的一个或更多个组件的拮抗剂。在某些实施方案中，MET结合剂是MET和WNT通路的一个或更多个组件两者的拮抗剂。
本发明提供使用本文所述的MET结合剂抑制肿瘤生长的方法。在某些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤细胞与MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)在体外接触。例如，永生化细胞系或癌细胞系在向其中加入本文所述的抗体或双特异性试剂以抑制肿瘤细胞生长的培养基中培养。在一些实施方案中，肿瘤细胞是从患者样品比如例如组织活检、胸腔积液或血液样品中分离出的并在向其中加入MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)以抑制肿瘤细胞生长的培养基中培养。
在一些实施方案中，抑制肿瘤生长的方法包括使肿瘤或肿瘤细胞与MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)在体内接触。在某些实施方案中，使肿瘤或肿瘤细胞与MET结合剂在动物模型中进行接触。例如，本文所述的抗体或双特异性试剂可施用给含有肿瘤异种移植物的免疫受损的宿主动物(例如NOD/SCID小鼠)。在一些实施方案中，肿瘤细胞和/或癌症干细胞是从患者样品比如例如组织活检、胸腔积液或血液样品中分离出的并注射到免疫受损的宿主动物(例如NOD/SCID小鼠)中，然后向该动物施用结合剂以抑制肿瘤细胞的生长。在一些实施方案中，将致瘤性细胞引入到防止肿瘤生长的动物(“预防性模型”)中的同时或之后施用所述MET结合剂。在一些实施方案中，在肿瘤已经生长到指定尺寸(“治疗性模型”)之后施用所述MET结合剂用作治疗剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和WNT通路的一个或更多个组件的本文所述的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是本文所述的特异性结合人MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂。
在某些实施方案中，抑制受试者中肿瘤生长的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者具有肿瘤或肿瘤已被切除。在某些实施方案中，所述肿瘤包含癌症干细胞。在某些实施方案中，肿瘤中癌症干细胞的频率通过施用所述MET结合剂而降低。本发明还提供降低肿瘤中癌症干细胞的频率的方法，其包括使肿瘤与有效量的本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)接触。在一些实施方案中，降低受试者的肿瘤中癌症干细胞的频率的方法包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和WNT通路的一个或更多个组件的本文所述的双特异性试剂。在某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和一个或更多个WNT蛋白的本文所述的双特异性试剂。
本发明进一步提供抑制受试者中血管生成的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。在一些实施方案中，所述血管生成是肿瘤血管生成。
本发明进一步提供抑制肿瘤细胞的上皮-间质转化(EMT)的方法，其包括使肿瘤细胞与有效量的本文所述的MET结合剂接触。本发明进一步提供了抑制受试者中肿瘤细胞的EMT的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。
本发明进一步提供诱导肿瘤细胞分化的方法，其包括使肿瘤细胞与有效量的本文所述的MET结合剂接触。在一些实施方案中，所述方法包括通过使包含癌症干细胞的肿瘤细胞与有效量的本文所述的MET结合剂接触而诱导癌症干细胞分化。本发明进一步提供诱导受试者中肿瘤细胞分化的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。在一些实施方案中，所述方法包括通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂而诱导癌症细胞干细胞分化。
在一些实施方案中，所述肿瘤是实体瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是选自结肠直肠肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、卵巢肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、成胶质细胞瘤以及头颈肿瘤所组成的组的肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是结肠直肠肿瘤或结肠肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是卵巢肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是肺肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是胰腺肿瘤。在某些实施方案中，所述肿瘤是乳腺肿瘤，包括三阴性乳腺肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤是成胶质细胞瘤。
本发明进一步提供治疗受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合WNT通路的一个或更多个组件并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂是结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂是结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂并对癌症相关的信号传导通路提供双重抑制。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET、干扰MET/HGF相互作用并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET、阻断MET与HGF结合并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET、抑制血管生成并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合WNT通路的一个或更多个组件、干扰WNT/FZD相互作用并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合MET和WNT通路的一个或更多个组件、干扰MET/HGF相互作用和WNT/FZD相互作用并抑制或减少肿瘤生长。在一些实施方案中，所述MET结合剂结合一个或更多个WNT蛋白并降低癌症中癌症干细胞的频率。
本发明提供治疗受试者(例如需要治疗的受试者)中癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者具有癌性肿瘤。在某些实施方案中，所述受试者的肿瘤已被去除。本发明还提供了用于治疗癌症的方法中的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体是本文所述的试剂或抗体。本发明还提供了使用本文所述的双特异性试剂或抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在某些实施方案中，所述癌症是选自由结肠直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、成胶质细胞瘤以及头颈癌所组成的组。在某些实施方案中，所述癌症是卵巢癌。在某些实施方案中，所述癌症是结肠直肠癌或结肠癌。在某些实施方案中，所述癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是乳腺癌，包括三阴性乳腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是前列腺癌。在某些实施方案中，所述癌症是肺癌，包括非小细胞肺癌和小细胞肺癌。
在一些实施方案中，所述受试者的癌症/肿瘤可以是某些治疗难以治疗的。作为非限制性实例，所述受试者的癌症(或肿瘤)可以是化疗难以治疗的。在一些实施方案中，所述受试者的癌症可以是抗EGFR抑制剂的。
进一步提供治疗受试者中疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于干细胞和/或祖细胞的水平增加。在一些实施方案中，所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂、多肽、抗体或双特异性试剂。
在本文所述的任何方法的某些实施方案中，所述MET结合剂是特异性结合人MET和WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合人WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一结合位点包括含有ASYAWS的(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3以及含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。在一些实施方案中，所述双特异性试剂包括特异性结合人MET的第一结合位点和特异性结合人WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点，其中所述第一抗原结合位点包括含有GYTFTSYWLH(SEQIDNO:78)的重链CDR1、含有GMIDPSNSDTRFNPNFKD(SEQIDNO:79)的重链CDR2和含有TYGSYVSPLDY(SEQIDNO:81)、SYGSYVSPLDY(SEQIDNO:82)、ATYGSYVSPLDY(SEQIDNO:83)或XYGSYVSPLDY(SEQIDNO:80)的重链CDR3，其中X不是R；以及含有KSSQSLLYTSSQKNYLA(SEQIDNO:84)的轻链CDR1、含有WASTRES(SEQIDNO:85)的轻链CDR2和含有QQYYAYPWT(SEQIDNO:86)的轻链CDR3。
在本文所述的任何方法的某些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约80％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。
在本文所述的任何方法的一些实施方案中，所述MET结合剂是抗体。在一些实施方案中，所述抗MET抗体包括抗体73R009、抗体73R009人源化变体或抗体73R010(73R009H12L7)的重链可变区和轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体73R009。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体73R009的人源化变体。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体73R010(73R009H12L7)或其变体。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体73R009或抗体73R010(73R007H12L7)的单价变体。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体，其包括由保藏于ATCC指定为PTA-13609的质粒编码的重链可变区和由保藏于ATCC指定为PTA-13610的质粒编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体，其包括由保藏于ATCC指定为PTA-120387的质粒编码的重链可变区和由保藏于ATCC指定为PTA-120388的质粒编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体，其包括由保藏于ATCC指定为PTA-120695的质粒编码的重链可变区和由保藏于ATCC指定为PTA-120388的质粒编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括来自抗体73R009的抗原结合位点、来自抗体73R009人源化变体的抗原结合位点或者来自抗体73R010(73R009H12L7)的抗原结合位点。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括由保藏于ATCC指定为PTA-13609的质粒编码的重链可变区和由保藏于ATCC指定为PTA-13610的质粒编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括由保藏于ATCC指定为PTA-120387的质粒编码的重链可变区和由保藏于ATCC指定为PTA-120388的质粒编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括由保藏于ATCC指定为PTA-120695的质粒编码的重链可变区和由保藏于ATCC指定为PTA-120388的质粒编码的轻链可变区。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括含有抗体73R009的重链可变区和轻链可变区、抗体73R009人源化变体的重链可变区和轻链可变区或抗体73R010(73R009H12L7)的重链可变区和轻链可变区的第一臂和包括FZD8Fri结构域的第二臂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其包括抗体73R009的重链可变区和轻链可变区、抗体73R009人源化变体的重链可变区和轻链可变区或抗体73R010(73R009H12L7)的重链可变区和轻链可变区的第一臂和包括FZD8Fri结构域和人Fc区的第二臂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂315B06。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂315B07。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂315B09。
在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:28的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:29的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:7、SEQIDNO:8和SEQIDNO:39的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:13、SEQIDNO:14和SEQIDNO:56的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:13和SEQIDNO:14；并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:56。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:94、SEQIDNO:95和SEQIDNO:28的双特异性试剂。在一些实施方案中，MET结合剂是包括SEQIDNO:94、SEQIDNO:95和SEQIDNO:29的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:94、SEQIDNO:95和SEQIDNO:39的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:100、SEQIDNO:101和SEQIDNO:56的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:100和SEQIDNO:101；并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:56。在一些实施方案中，所述MET结合剂是包括SEQIDNO:111、SEQIDNO:101和SEQIDNO:56的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂，其中所述双特异性试剂的第一臂包括SEQIDNO:111和SEQIDNO:101；并且所述双特异性试剂的第二臂包括SEQIDNO:56。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括测定肿瘤或癌症中MET表达水平的步骤。在一些实施方案中，所述“MET表达水平”是蛋白质水平。在一些实施方案中，所述“MET表达水平”是核酸水平(DNA或RNA)。在一些实施方案中，将肿瘤或癌症中的MET表达水平与参比样品中的MET表达水平进行比较。如本文所使用的“参比样品”包括但不限于正常组织、相同组织类型的非癌性组织、相同组织类型的肿瘤组织以及不同组织类型的肿瘤组织。因此，在一些实施方案中，将肿瘤或癌症中的MET表达水平与正常组织中的MET表达水平进行比较。在一些实施方案中，将肿瘤或癌症中的MET表达水平与相同组织类型的非癌性组织中的MET表达水平进行比较。在一些实施方案中，将肿瘤或癌症中的MET表达水平与相同组织类型的肿瘤或癌症中的MET表达水平进行比较。在一些实施方案中，将肿瘤或癌症中的MET表达水平与不同组织类型的肿瘤或癌症中的MET表达水平进行比较。在一些实施方案中，将肿瘤或癌症中的MET表达水平与预定的MET水平进行比较。在一些实施方案中，在治疗之前测定MET表达水平。在一些实施方案中，通过免疫组织化学测定MET表达水平。在一些实施方案中，如果与正常组织或相同组织类型的非癌性组织中的MET表达进行比较，肿瘤或癌症中有升高的MET表达水平，则向所述受试者施用本文所述的MET结合剂。例如，在一些实施方案中，如果与参比样品的MET表达水平进行比较，肿瘤或癌症中升高的MET表达水平，则向所述受试者施用MET结合剂(例如双特异性试剂315B06、315B07或315B09)。在一些实施方案中，如果与预定的MET水平进行比较，肿瘤或癌症中有升高的MET表达水平，则向所述受试者施用本文所述的MET结合剂。
此外，本发明提供确定利用MET结合剂治疗人受试者的方法，其包括确定与参比样品中MET表达进行比较，所述受试者是否有具有升高的MET表达水平的肿瘤。在一些实施方案中，所述参比样品是正常组织或相同组织类型的非癌性组织。在一些实施方案中，所述参比样品是相同组织类型的肿瘤/癌症组织。在一些实施方案中，所述参比样品是不同组织类型的肿瘤/癌症组织。在一些实施方案中，肿瘤或癌症中的MET表达水平与预定的MET水平进行比较。在一些实施方案中，如果肿瘤的MET表达水平升高，则受试者被选择利用特异性结合MET的试剂进行治疗。在一些实施方案中，如果选择用于治疗，则向受试者施用本文所述的MET结合剂。例如，在一些实施方案中，测定肿瘤中的MET表达水平，如果与参比样品中的MET水平或预定的水平进行比较，肿瘤具有升高的MET表达水平，则受试者被选择利用特异性结合MET的试剂进行治疗。如果选择用于治疗，则向所述受试者施用本文所述的MET结合剂。在某些实施方案中，所述受试者的肿瘤已被去除。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗体73R009或其单价变体。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗体73R009人源化变体或其单价变体。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗体73R010(73R009H12L7)或其单价变体。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗MET/FZD-Fc的双特异性试剂。在一些实施方案中，MET结合剂是抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂315B06。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂315B07。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂315B09。
本发明提供选择利用MET结合剂治疗的人受试者的方法，其包括测定受试者是否有具有升高的MET表达水平的肿瘤。在一些实施方案中，选择利用MET结合剂治疗的人受试者的方法包括测定受试者是否有具有升高的MET表达水平的肿瘤，其中如果肿瘤的MET表达水平升高，受试者被选择用于利用特异性结合MET的试剂进行治疗。本发明提供选择利用MET结合剂进行治疗的人受试者的方法，其包括测定受试者是否有具有高的MET表达水平的肿瘤。在一些实施方案中，选择利用MET结合剂治疗的人受试者的方法包括测定受试者是否有具有高的MET表达水平的肿瘤，其中如果肿瘤具有高的MET表达水平，则受试者被选择利用特异性结合MET的试剂进行治疗。在一些实施方案中，“升高的”或者“高的”表达水平是与相同组织类型的正常组织中的MET表达水平进行比较。在一些实施方案中，“升高的”或者“高的”表达水平是与相同组织类型的其它肿瘤中的MET表达水平进行比较。在一些实施方案中，“升高的”或者“高的”表达水平是与参比样品中的MET表达水平进行比较。在一些实施方案中，“升高的”或者“高的”表达水平是与预定的MET水平进行比较。在一些实施方案中，如果选择用于治疗，则向所述受试者施用本文所述的MET结合剂。在某些实施方案中，所述受试者的肿瘤已被去除。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗MET抗体。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体73R009或其单价变体。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体73R009的人源化变体或其单价变体。在一些实施方案中，所述抗MET抗体是抗体73R010(73R009H12L7)或其单价变体。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗MET/FZD-Fc的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述MET结合剂是抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂。在一些实施方案中，所述抗MET/FZD-Fc的双特异性试剂是315B06。在一些实施方案中，所述抗MET/FZD-Fc的双特异性试剂是315B07。在一些实施方案中，所述MET结合剂是双特异性试剂315B09。
本发明还提供治疗人受试者的癌症的方法，其包括：(a)至少部分基于有具有升高或高的MET表达水平的癌症的受试者，选择用于治疗的受试者，和(b)向受试者施用治疗有效量的本文所述的MET结合剂。
用于测定细胞、肿瘤或癌症的MET表达水平的方法是本领域技术人员已知的。对于核酸表达而言，这些方法包括但不限于基于PCR的测定法、微阵列分析和核苷酸测序(例如NextGen测序)。对于蛋白质表达而言，这些方法包括但不限于Western印迹分析、蛋白质阵列、ELISA、免疫组织化学(IHC)测定法和FACS分析。
用于测定肿瘤或癌症的MET表达水平是否升高或高的方法可使用多种样品。在一些实施方案中，样品取自具有肿瘤或癌症的受试者。在一些实施方案中，样品是新鲜的肿瘤/癌症样品。在一些实施方案中，样品是冷冻的肿瘤/癌症样品。在一些实施方案中，样品是福尔马林固定的石蜡包埋的样品。在一些实施方案中，样品被处理成细胞裂解物。在一些实施方案中，样品被处理成DNA。在一些实施方案中，样品被处理成RNA。
本发明进一步提供包含本文所述的结合剂的药物组合物。在某些实施方案中，所述药物组合物进一步包含药学上可接受的载体。发现这些药物组合物用于抑制受试者(例如人患者)中的肿瘤生长和/或治疗其癌症。
在某些实施方案中，本发明提供包含双特异性试剂的药物组合物，其中所述组合物中的试剂的至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％是双特异性试剂或异二聚体。在某些实施方案中，所述双特异性试剂是基于IgG(例如IgG2或IgG1)的试剂。在某些实施方案中，所述双特异性试剂是基于IgG2的试剂。在某些实施方案中，所述组合物中的总试剂的小于约10％、小于约5％、小于约2％或小于约1％是单特异性试剂或同源二聚体。在某些实施方案中，所述组合物中的试剂的至少约98％是异二聚体。
在某些实施方案中，通过组合本发明的纯化抗体或试剂与药学上可接受的载体(例如载体或赋形剂)制备制剂，用于储存和使用。合适的药学上可接受的载体包括但不限于无毒的缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐，例如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵、氯化六甲双胺、苯扎氯铵、苄索氯铵、苯酚、丁基或苄基醇、对羟基苯甲酸烷基酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇、3-戊醇和间甲酚；低分子量多肽(例如小于约10个氨基酸残基)；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物，例如单糖、二糖、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的反离子，例如钠；金属配合物，例如锌-蛋白质复合物和非离子型表面活性剂，例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London)。
本发明的药物组合物可以局部或全身治疗的任何数量的方式施用。施用可以是局部的，通过表皮或透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉剂；经肺，通过吸入或吹入粉末或喷雾剂，包括通过喷雾器、经气管内和经鼻内；口服；或经肠胃外，包括静脉内、动脉内、肿瘤内、皮下、腹膜内、肌内(例如注射或输注)或颅内(例如鞘内或心室内)。
治疗制剂可以是单位剂型。这样的制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、粉末剂、颗粒剂、在水或非水性介质中的溶液或混悬剂或者栓剂。在固体组合物例如片剂中，将主要的活性成分与药物载体混合。常规的压片成分包括玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶以及稀释剂(例如水)。这些可用于形成含有本发明化合物的均匀混合物或其无毒的药学上可接受的盐的固体预配制组合物。然后将固体预配制组合物再分成上述类型的单位剂型。制剂或组合物的片剂、丸剂等可被包衣或者通过其它方式混合以提供具有长效优点的剂型。例如，片剂或丸剂可包括由外部组分覆盖的内组合物。此外，这两个组分可通过肠溶层分开，所述肠溶层用于抵抗崩解并允许内部组分完整通过胃或延迟释放。多种材料可用于这样的肠溶层或包衣，这样的材料包括许多聚合酸和聚合酸与这样的材料例如虫胶、十六醇和醋酸纤维素的混合物。
本文所述的MET结合剂也可包在微胶囊中。这样的微胶囊例如通过凝聚技术或通过界面聚合分别在胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳剂中制备，例如羟甲基纤维素或明胶的微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，如Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,22stEdition,2012,PharmaceuticalPress,London中所述。
在某些实施方案中，药物制剂包括本发明的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)与脂质体的复合物。制备脂质体的方法是本领域技术人员已知的。例如，一些脂质体可利用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发制备。脂质体可通过限定孔径的过滤器挤出以得到具有所希望的直径的脂质体。
在某些实施方案中，可制备持续释放的制剂。持续释放制剂的合适的实例包括含有MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)的固体疏水性聚合物的半透性基质，其中所述基质是成形制品(例如膜或微胶囊)的形式。持续释放基质的其它实例包括聚酯，水凝胶，例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)，聚交酯，L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸的共聚物，不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯，可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，例如LUPRONDEPOTTM(乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)，乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
在某些实施方案中，除了施用本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)之外，方法或治疗进一步包括施用至少一种另外的治疗剂。另外的治疗剂可在施用MET结合剂之前、同时和/或之后施用。还提供了包含MET结合剂和另外的治疗剂的药物组合物。在一些实施方案中，所述至少一种另外的治疗剂包括1、2、3或更多种另外的治疗剂。
与至少两种治疗剂的组合疗法通常使用通过不同的作用机制起效的药剂，但这不是必需的。使用具有不同作用机制的药剂的组合疗法可导致加和或协同效应。组合疗法可允许每一药剂的使用剂量低于单一治疗，从而降低至少一种药剂的毒性副作用和/或提高其治疗指数。组合疗法可降低发展成抗性癌细胞的可能性。在一些实施方案中，组合疗法包括主要影响(例如抑制或杀死)非致瘤性细胞的治疗剂和主要影响(例如抑制或杀死)致瘤性CSC的治疗剂。
有用的治疗剂种类包括例如抗微管蛋白剂、auristatin、DNA小沟结合剂、DNA复制抑制剂、烷化剂(例如铂配合物，比如顺铂、单(铂)、双(铂)和三-核铂配合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸剂、抗代谢物、化学疗法增敏剂、多卡米星、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、lexitropsin、亚硝基脲、顺氯氨铂、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、辐射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等等。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是烷化剂、抗代谢物、抗有丝分裂剂、拓扑异构酶抑制剂或血管生成抑制剂。在一些实施方案中，所述第二治疗剂是铂配合物，例如卡铂或顺铂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是铂配合物与紫杉烷的组合。
可与所述MET结合剂组合施用的治疗剂包括化疗剂。因此，在一些实施方案中，所述方法或治疗包括施用本发明的MET结合剂与化疗剂或多种不同化疗剂的混合物的组合。在一些实施方案中，所述方法或治疗包括施用本发明的结合MET和一个或更多个WNT蛋白的双特异性试剂与化疗剂或多种不同化疗剂的混合物的组合。
用于本发明的化疗剂包括但不限于烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN)；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙撑亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、trietylenephosphoramide、triethylenethiophosphaoramide和trimethylolomelamime；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、氮芥氧化物盐酸盐、美法仑、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀、氯乙环磷酰胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如aclacinomysin、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博莱霉素、cactinomycin、加利车霉素、carabicin、caminomycin、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素类(chromomycins)、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星(esorubicin)、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素类(olivomycins)、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素，例如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸酯、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素类，例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；蒽双咪腙；edatraxate；defofamine；地美可辛；地吖醌；elformithine；醋酸羟吡咔唑；乙环氧啶；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；单哌潘生丁；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；足叶草酸；2-乙酰肼；甲基苄肼；PSK；雷佐生；sizofuran；螺环锗；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2,2’,2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(ARA-C)；紫杉烷类，例如紫杉醇(泰素)和多西他赛(泰索帝)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺肖林；替尼泊苷；柔红霉素；氨基蝶呤；伊班膦酸钠；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟(DMFO)；维甲酸；esperamicins；卡培他滨(希罗达)和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。化学治疗剂还包括用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、抑制4(5)-咪唑的芳香酶、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(FARESTON)；以及抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林和上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是顺铂。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是卡铂。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是紫杉醇。
在某些实施方案中，所述化疗剂是拓扑异构酶抑制剂。拓扑异构酶抑制剂是干扰拓扑异构酶酶(例如拓扑异构酶I或II)的作用的化疗剂。拓扑异构酶抑制剂包括但不限于盐酸阿霉素、柠檬酸柔红霉素、盐酸米托蒽醌、放线菌素D、依托泊甙、盐酸托泊替康、替尼泊苷(VM-26)和伊立替康以及任何这些物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是伊立替康。
在某些实施方案中，所述化疗剂是抗代谢物。抗代谢物是结构与正常生化反应所需的代谢物相似但不同并足以干扰细胞的一个或更多个正常功能(例如细胞分裂)的化学品。抗代谢物包括但不限于吉西他滨、氟尿嘧啶、卡培他滨、氨甲蝶呤钠、雷替曲噻、培美曲塞、替加氟、阿糖胞苷、硫鸟嘌呤、5-氮杂胞苷、6-巯基嘌呤、硫唑嘌呤、6-硫鸟嘌呤、喷司他丁、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨以及任何这些物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，所述第二治疗剂是吉西他滨。
在某些实施方案中，所述化疗剂是抗有丝分裂剂，包括但不限于结合微管蛋白的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是紫杉烷。在某些实施方案中，所述试剂是紫杉醇或多西紫杉醇、或紫杉醇或多西紫杉醇的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在某些实施方案中，所述试剂是紫杉醇(TAXOL)、多西紫杉醇(TAXOTERE)、白蛋白结合型紫杉醇(ABRAXANE)、DHA-紫杉醇或PG-紫杉醇。在某些可替代的实施方案中，所述抗有丝分裂剂包括长春花生物碱，例如长春新碱、长春碱、长春瑞滨或长春地辛或其其药学上可接受的盐、酸或衍生物。在一些实施方案中，所述抗有丝分裂剂是驱动蛋白Eg5的抑制剂或有丝分裂激酶的抑制剂，例如AuroraA或Plk1。在某些实施方案中，其中与MET结合剂组合施用的化疗剂是抗有丝分裂剂，待治疗的癌症或肿瘤是乳腺癌或乳腺肿瘤。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括例如小分子之类的试剂。例如，治疗可涉及组合施用本发明的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)与用作抗另外的肿瘤相关蛋白抑制剂(包括但不限于EGFR、ErbB2、HER2和/或MET)的小分子。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂是抑制癌干细胞通路的小分子。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是NOTCH通路的小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是WNT通路的小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是BMP通路的小分子抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是抑制β-链蛋白信号传导的小分子。
在一些实施方案中，另外的治疗剂包括生物分子，例如抗体。例如，治疗可涉及组合施用本发明的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)与抗另外的肿瘤相关蛋白的其它抗体，包括但不限于结合EGFR、EvbB2和/或HER2的抗体。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂为抗癌症干细胞标记物抗体的抗体。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是结合NOTCH通路的组件的抗体。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是结合WNT通路的组件的抗体。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂是抑制癌症干细胞通路的抗体。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是NOTCH通路的抗体抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是WNT通路的抗体抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是BMP信号通路的抗体抑制。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是抑制β-链蛋白信号传导的抗体。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂是为血管生成抑制剂或调节器(例如抗VEGF或VEGF受体抗体)的抗体。在某些实施方案中，所述另外的治疗剂是贝伐单抗(AVASTIN)、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)、panitumumab(VECTIBIX)或西妥昔单抗(ERBITUX)。
此外，利用本文所述的MET结合剂进行治疗可包括与其它生物分子例如一种或更多种细胞因子(例如淋巴因子、白细胞介素、肿瘤坏死因子和/或生长因子)组合治疗或可伴随手术除去肿瘤、癌细胞或通过治疗医师认为必需的任何其它疗法。
在某些实施方案中，所述治疗涉及组合施用本发明的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)与放射治疗。利用MET结合剂进行治疗可发生在施用放射治疗之前、同时或之后。用于这样的放射治疗的给药方案可由熟练的开业医生来确定。
应当理解的是，MET结合剂和另外的治疗剂的组合可以以任何顺序或同时施用。利用MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)进行治疗可发生在施用化疗之前、同时或之后。组合施用可包括以单一的药物制剂或使用单独的制剂进行共施用，或者以任一顺序但通常在使所有活性剂可同时发挥其生物学活性的时间周期内连续施用。这样的化疗剂的制备和给药方案可根据生产商的说明书或由熟练的从业人员凭经验确定而使用。这样的化疗的制备和给药方案还描述在TheChemotherapySourceBook,4thEdition,2008,M.C.Perry,Editor,Lippincott,Williams&Wilkins,Philadelphia,PA。
在一些实施方案中，所述MET结合剂将在接受治疗剂治疗之前施用于患者。在某些其它实施方案中，所述MET结合剂和另外的治疗剂将基本上同时或并行施用。例如，可在接受第二治疗剂(例如化疗)治疗的过程中向受试者施用MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)。在某些实施方案中，MET结合剂将在利用第二治疗剂治疗的1年内施用。在某些可替代的实施方案中，MET结合剂将在利用第二治疗剂进行任何治疗的10、8、6、4或2个月内施用。在某些其它实施方案中，MET结合剂将在利用第二治疗剂进行任何治疗的4、3、2或1个星期内施用。在一些实施方案中，MET结合剂将在利用第二治疗剂进行任何治疗的5、4、3、2或1天内施用。进一步应当理解的是，可在小时或分钟(即基本上同时地)的时间段内将两种(或更多种)试剂或治疗施用给受试者。
对于疾病的治疗，本发明的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)的合适剂量依赖于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、疾病的响应、MET结合剂是否被施用用于治疗或预防的目的、先前的治疗、患者的临床病史等等，所有均由治疗医生酌情自行处理。所述MET结合剂可施用一次或作为一系列治疗分布在数天至数月，或直至实现治愈或实现疾病状态减轻(例如减少肿瘤大小)，或实现稳定的疾病状态。最佳给药方案可由患者体内的药物累积的测量值来计算并将根据个体抗体或试剂的相对效力而变化。施用医生可确定最佳剂量、给药方法和重复率。在某些实施方案中，MET结合剂的剂量为约0.01μg至约100mg/kg体重、约0.1μg至约100mg/kg体重、约1μg至约100mg/kg体重、约1mg至约100mg/kg体重、约1mg至约80mg/kg体重、约10mg至约100mg/kg体重、约10mg至约75mg/kg体重或约10mg至约50mg/kg体重。在某些实施方案中，所述MET结合剂的剂量为约0.1mg至约20mg/kg体重。在某些实施方案中，剂量可每日、每周、每月或每年给予一次或更多次。在某些实施方案中，所述MET结合剂每周给予一次、每两周一次、每三周一次或每月一次。
在一些实施方案中，MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)可以较高的“负载”剂量开始施用，然后是一个或更多个较低剂量。在一些实施方案中，施用频率也可以改变。在一些实施方案中，给药方案可包括施用初始剂量，然后是其它剂量(或“维持”剂量)，每周一次、每两周一次、每三周一次或每月一次。例如，给药方案可包括施用初始负载剂量，然后每周一次施用维持剂量，例如，施用初始剂量的二分之一。或者给药方案可包括施用初始负载剂量，然后施用维持剂量，例如每隔一周施用初始剂量的二分之一。或者给药方案可包括施用三个初始剂量，连续3周，然后施用维持剂量，例如每隔一周施用相同量。或者给药方案可包括施用初始剂量，然后施用每3周或每月一次其它剂量。治疗医生可基于所测量的停留时间和在体液或组织中的药物浓度评估给药的重复率。治疗的进展可通过常规技术和测定法来监测。
正如本领域技术人员已知的，任何治疗剂的施用可导致副作用和/或毒性。在一些情况下，副作用和/或毒性是如此严重以至于排除以治疗有效剂量施用特定药剂。在一些情况下，药物治疗必须停止，并且可尝试其它试剂。然而，相同的治疗种类中的许多试剂通常显示类似的副作用和/或毒性，这意味着患者要么必须停止治疗，或者如果可能的话遭受与治疗剂相关的令人不快的副作用。
治疗剂的副作用可能包括但不限于荨麻疹、皮疹、瘙痒、恶心、呕吐、食欲下降、腹泻、畏寒、发热、乏力、肌肉酸痛和疼痛、头痛、低血压、高血压、低血钾症、骨效应、低血球计数、出血和心血管问题。
因此，本发明的一个方面涉及治疗患者中癌症的方法，包括使用间歇给药方案施用本文所述的MET结合剂，这可降低与施用试剂相关的副作用和/或毒性。如本文所用的“间歇给药”是指使用超过每周一次的给药间隔例如每2周给药一次，每3周给药一次，每4周给药一次等等的给药方案。在一些实施方案中，用于治疗人患者中的癌症的方法包括根据间歇给药方案向患者施用有效剂量的本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)。在一些实施方案中，用于治疗人患者中的癌症的方法包括根据间歇给药方案向患者施用有效剂量的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)并提高MET结合剂的治疗指数。在一些实施方案中，间歇给药方案包括向患者施用初始剂量的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)，并且约每2周一次施用后续剂量的MET结合剂。在一些实施方案中，所述间歇给药方案包括向患者施用初始剂量的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)，并且约每3周一次施用后续剂量的MET结合剂。在一些实施方案中，所述间歇给药方案包括向患者施用初始剂量的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)，并且约每4周一次施用后续剂量MET结合剂。
在一些实施方案中，间歇给药方案中的后续剂量是与初始剂量约相同的量或少于初始剂量的量。在其它实施方案中，所述后续剂量是大于初始剂量的量。如本领域中技术人员已知的，所用的剂量将根据待实现的临床目标而变化。在一些实施方案中，所述初始剂量为约0.25mg/kg至约20mg/kg。在一些实施方案中，所述初始剂量为约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约0.5mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约1mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约2.5mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约5mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约7.5mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量是约10mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约12.5mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约15mg/kg。在某些实施方案中，所述初始剂量为约20mg/kg。在一些实施方案中，所述后续剂量为约0.25mg/kg至约15mg/kg。在某些实施方案中，所述后续剂量为约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15mg/kg。在某些实施方案中，所述后续剂量为约0.5mg/kg。在某些实施方案中，所述后续剂量为约1mg/kg。在某些实施方案中，所述后续剂量为约2.5mg/kg。在某些实施方案中，所述后续剂量为约5mg/kg。在一些实施方案中，所述后续剂量为约7.5mg/kg。在一些实施方案中，所述后续剂量为约10mg/kg。在一些实施方案中，所述后续剂量为约12.5mg/kg。
在一些实施方案中，所述给药方案可被限制为特定数量的施用或“循环”。在一些实施方案中，所述MET结合剂施用3、4、5、6、7、8或更多个循环。例如，所述MET结合剂每2周施用6个循环，所述MET结合剂每3周施用6个循环，所述MET结合剂每2周施用4个循环，所述MET结合剂每3周施用4个循环等等。给药方案可取决于并随后由本领域的技术人员进行修改。
因此，本发明提供用于降低本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)在人患者中的毒性的方法，其包括使用间歇给药方案向患者施用MET结合剂。还提供用于降低MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)在人患者中的副作用的方法，其包括使用间歇给药方案向患者施用MET结合剂。还提供用于提高MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)在人患者中的治疗指数的方法，其中所述方法包括使用间歇给药方案向患者施用MET结合剂。
根据动物或人患者耐受将MET结合剂引入到体内的能力来选择初始和后续剂量的递送方法。因此，在本文所述的任何方面和/或实施方案中，MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)的施用可通过静脉内注射或静脉注射进行。在一些实施方案中，所述施用是通过静脉内输注进行。在本文所述的任何方面和/或实施方案中，MET结合剂的施用可通过非静脉内途径进行。
V.包含MET/WNT结合剂的试剂盒
本发明提供包含本文所述的MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)并且可用于实施本文所述的方法的试剂盒。在某些实施方案中，试剂盒包含在一个或更多个容器中的抗MET的至少一种纯化抗体或结合MET和WNT通路的一个或更多个组件的至少一种纯化双特异性试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒包含必需的和/或足以实施检测分析的所有组件，包括所有对照、用于实施测定法的指示以及用于分析和呈现结果的任何必需的软件。本领域技术人员将容易认识到，本发明所公开的MET结合剂可容易地掺入到本领域中众所周知的所建立的试剂盒格式之一中。
进一步提供包含MET结合剂(例如抗体或双特异性试剂)和至少一种其它治疗剂的试剂盒。在某些实施方案中，所述第二(或更多)的治疗剂是化疗剂。在某些实施方案中，所述第二(或更多)的治疗剂是血管生成抑制剂。
本发明公开内容的实施方案可通过参考以下非限制性实施例进一步定义，其详细描述了本发明公开内容的某些抗体的制备和使用本发明公开内容的抗体的方法。对于本领域技术人员而言将显而易见的是可在不背离本发明公开内容的范围的情形下对材料和方法进行许多修改。
实施例
实施例1
MET结合剂的结合亲和力
抗MET抗体73R009、单价抗MET抗体5D5和抗MET/FZD8-Fc双特异性试剂315B06的单价变体的KD使用BiacoreLifeSciences(GEHealthcare)的Biacore2000系统进行测定。使用标准的基于胺的化学过程(NHS/EDC)将山羊抗人抗体(InvitrogenH10500)缀合至羧甲基葡聚糖(CM5)SPR芯片上并利用乙醇胺封闭。将抗体在HBS-P-BSA(0.01MHEPESpH7.4，0.15MNaCl，0.005％v/v吐温20，100μg/mlBSA)中稀释至浓度为10μg/ml，并通过所述抗人抗体捕获到芯片上。将人MET在HBS-P-BSA中连续稀释2倍，从300nM稀释至37.5nM并顺序注射至所捕获的抗MET抗体上。测定各浓度下MET结合和解离。注射每种抗原之后，注入5μl100mMH3PO4以除去抗原-抗体复合物并进行随后的注射。随时间推移收集动力学数据并使用同步通用拟合方程进行拟合，得到每种试剂的亲和常数(KD值)。
二价“亲本”抗体73R009具有对人MET的为1.1nM的亲和常数(KD)，73R009单价变体具有对人MET的为1.4nM的KD，单价抗体5D5具有对人MET的为7.2nM的KD，并且双特异性试剂315B06具有对人MET的为1.8nM的KD。因此，单价抗MET抗体73R009和双特异性试剂315B06均表现出非常相似于亲本抗体的结合亲和力，尽管事实上亲本抗体是二价的。此外，相比于抗MET抗体5D5，双特异性试剂315B06似乎具有对人MET的较强的亲和力。
抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06已显示不结合小鼠MET。
抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06包括(a)由2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,USA并指定编号为PTA-13609的质粒编码的重链，(b)由2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并指定编号为PTA-13610的质粒编码的轻链，和(c)由2013年3月12日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并指定编号为PTA-13611的质粒编码的融合蛋白。
实施例2
抑制肝细胞生长因子与MET的结合
利用标准的重组DNA技术制备全长人MET(FL-MET)构建体。利用所述MET构建体和GFP质粒以质粒MET:GFP为2:1的比例瞬时转染HEK-293T细胞。24小时后，收获转染的细胞并混悬在含有2％FBS的冰冷PBS中。在10、5、2.5、1.25、0.625、0.3或0.16μg/ml单价抗MET抗体5D5、抗MET抗体73R009的单价变体或抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06的存在下在冰上将转染细胞孵育1小时。将30ng缀合至生物素上的肝细胞生长因子(HGF)加入到每个样品并在冰上另外孵育40分钟。利用含2％FBS的PBS清洗细胞，加入PE缀合的链霉素并将细胞孵育1小时。孵育不含HGF的转染细胞作为阴性对照，孵育含有HGF而不含抗体也不含结合剂的转染细胞作为阳性对照。最后孵育之后，将细胞用5μg/mlDAPI染色并在FACSCantoII仪器(BDBiosciences,SanJose,CA)上进行分析且使用FlowJo软件处理数据。
如图1所示，约20％的转染细胞表达MET并与人HGF结合(图1A)。通过所述结合剂抑制HGF与MET的结合，与20％结合的阳性对照进行比较。所述单价抗MET抗体5D5在10μg/ml的最高浓度下使HGF与MET的结合降低约70％，并且在0.16μg/ml的最低浓度下剂量依赖性响应降低28％(图1B)。相比而言，抗MET抗体73R009的单价变体在10μg/ml的最高浓度下使HGF与MET的结合降低约72％，并且在0.16μg/ml的最低浓度下剂量依赖性响应降低约56％(图1C)。相似地，抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06在10μg/ml的最高浓度下使HGF与MET的结合降低约80％，并且在0.16μg/ml的最低浓度下剂量依赖性响应降低约56％(图1D)。
这些结果表明，抗MET抗体73R009的单价变体和抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂351B06是HGF与MET结合的强阻滞剂。此外，似乎这两种试剂阻滞HGF与MET的结合的能力大于抗MET抗体5D5，并能在较低浓度下阻滞结合。
实施例3
HGF诱导MET活性的抑制
人体细胞中MET活化通过以下方式表征：在HGF刺激之后分析MET磷酸化和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和AKT的下游活化。
将A549细胞以1.5×105个细胞/孔接种在含有10％FBS的DMEM培养基的12孔板中并生长过夜。将细胞转移到无血清培养基中，约18小时后利用抗MET抗体73R009单价变体、抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂5D5/FZD和抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06以50、10、2和0.4μg/ml的浓度将细胞预处理1小时。随后将细胞用50ng/ml人HGF(EMDMillipore,BillericaMA)刺激15分钟。将细胞裂解并收集细胞裂解物的上清液。细胞裂解物通过SDS-PAGE使用4-12％NuPAGENOVEX凝胶(Invitrogen/LifeTechnologies,GrandIsland,NY)解析(resolve)，转移到硝酸纤维素膜上，并通过Western印迹技术进行分析。所用的抗体是抗人MET(抗-MetmAb，CellSignalingTechnology,Danvers,MA)；抗-磷酸化-MET(抗-磷酸化-MET(Tyr1234/1235)mAb，CellSignalingTechnology,Danvers,MA)；抗-磷酸化-AKT(抗-磷酸化-AKT(Ser473)mAb，CellSignalingTechnology,Danvers,MA)；抗-磷酸化-MAPK(抗-磷酸化-p44/42MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)，CellSignalingTechnology,Danvers,MA)和抗-肌动蛋白(抗β肌动蛋白抗体，Abcam,Cambridge,MA)。
如图2所示，相比于抗MET/FZD的双特异性试剂5D5/FZD或抗MET抗体73R009单价变体，抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06降低磷酸化MET的量至更大的程度。相比于其它试剂，在最高浓度下，似乎315B06降低磷酸化AKT的量至更大的程度。这些研究表明所述抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06能够抑制和/或阻滞HGF诱导的MET活化，并相比于抗MET/FZD双特异性试剂5D5/FZD或抗MET抗体73R009单价变体，能够抑制和/或阻滞MET活化至更大的程度。
实施例4
WNT信号传导的抑制
在补充有抗生素和10％FCS的DMEM中培养STF-293细胞。所述STF-293细胞是与8×TCFLuc报告基因载体和海肾萤光素酶报告基因稳定整合的HEK-293细胞。所述8×TCFLuc报告基因包括7份TCF结合位点，其连接至萤火虫荧光素酶报告基因的启动子上游以测量经典WNT信号传导的水平(Gazit等人，1999,Oncogene,18:5959-66)。海肾荧光素酶报告基因(Promega；Madison,WI)用作转染效率的内部对照。抗MET/FZD双特异性试剂315B06和对照试剂抗MET单价试剂5D5/FLAG和单价试剂FZD8/FLAG连续稀释5倍，从20μg/ml至0.0064μg/ml，加入到合适的孔中并孵育过夜。然后在存在或不存在由L细胞制备的稳定地表达WNT3a的WNT3a条件培养基或由未过表达WNT3a的L细胞制备的对照条件培养基的情况下孵育所述细胞。过夜孵育后，利用双荧光素酶测定试剂盒(Promega；Madison,WI)测定荧光素酶水平，其中萤火虫萤光素酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。
如图3所示，抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06抑制WNT通路信号传导。所述抑制类似于单价FZD8/FLAG试剂并如预期所述抗MET5D5/FLAG试剂不能抑制WNT通路信号传导。因此，与实施例3中给出的结果相组合，已证明所述抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B06能抑制MET诱发和WNT诱导的信号传导和/或活化。
实施例5
肺肿瘤体内生长的抑制
基于微阵列分析中观察到的高水平的MET表达选择OMP-LU45肿瘤。将解离的OMP-LU45肺肿瘤细胞(1×105个细胞)注射给6-8周龄NOD/SCID小鼠。允许肿瘤生长26天直到它们的平均体积达到90mm3。将小鼠随机分组(每组n＝10)并利用单价抗MET抗体(5D5/FLAG)、对照抗体、单价FZD8-Fc(FZD8Fc/FLAG)、二价FZD8-Fc(54F28)或抗MET/FZD8Fc双特异性试剂或单一试剂或与紫杉醇的组合处理。蛋白质试剂的剂量为25mg/kg，每周一次，而紫杉醇的剂量为15mg/kg，每周一次。通过注射到腹腔内腔内施用蛋白质试剂和紫杉醇。监测肿瘤生长并利用电子数显卡尺在指定的时间点测量肿瘤体积。数据表示为平均值±S.E.M。
当以单一治疗使用时，所有试剂相比于对照抗体而言对LU45肿瘤生长的影响最小或没有可检测的影响(图4A)。相比较而言，所述MET/FZD8-Fc双特异性试剂与紫杉醇的组合显著抑制OMP-LU45肿瘤生长，并且肿瘤生长的这个抑制大于利用任何其它试剂与紫杉醇的组合所观察的抑制(图4B)。
实施例6
MET抗体的人源化
制备“亲本”抗体73R009的人源化变体。选择包含最小的鼠科序列内容并保留亲本抗体的结合特性的人源化重链和轻链的最佳组合。人源化抗体73R009H12L7也被称为抗体73R010，其包含由2013年5月30日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,USA并指定编号为PTA-120387的质粒编码的重链和由2013年5月30日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC并指定编号为PTA-120388的质粒编码的轻链。
抗体73R010被用在抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂的变异中，并且这种变异的双特异性试剂被称为315B07。如实施例1所述的，使用Biacore2000系统测量所述抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B07的KD为126.4pM。
通过利用丝氨酸残基取代对应于SEQIDNO:97的234位的半胱氨酸残基制备抗MET抗体73R010的变体。编码此变异重链的质粒于2013年11月6日按照布达佩斯条约的条件保藏于ATCC，10801UniversityBoulevard,Manassas,VA,USA并指定编号为PTA-120695。此73R010变体用在抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂的变异中并且该双特异性试剂被称为315B09。
实施例7
表位作图
为了确认由抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂识别的MET表位，进行表位作图。尽管人和小鼠Sema结构域的氨基酸序列约88％相同，但是双特异性试剂315B07不结合小鼠MET。因此，进行定点突变以创建一系列人Sema突变体。Kunkel突变用于利用预测的抗体结合位点中的小鼠Sema序列中存在的相应氨基酸替换人Sema序列中的特定氨基酸。人Sema突变体是：Mut96,99(F96L和Q99R)、Mut96(F96L)、Mut99(Q99R)、Mut328(Q328N)、Mut331(R331K)和Mut337,338(L337P和N338S)。
通过标准的重组技术制备编码野生型人Sema、野生型小鼠Sema、小鼠/人Sema突变体(其中5’端是小鼠(aa1-331)和3’末端是人(aa332-515))和如上文所列出的人Sema突变体的哺乳动物表达质粒载体。这些构建体包括人CD4蛋白和GFP(例如Sema-hCD4TM-GFP)的跨膜结构域。这些表达构建体允许Sema结构域在细胞表面上表达以及GFP的表达以监测表达。使用磷酸钙转染试剂盒(Clontech,MountainView,CA)利用编码Sema结构域的表达载体转染HEK-293T细胞。转染16个小时后，利用Versene溶液(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)分离细胞，并在4℃下与双特异性试剂315B07或双特异性试剂抗MET抗体5D5/FZD8-Fc一起孵育1小时。将细胞清洗并利用缀合至藻蓝蛋白(APC)的次级抗-人Fc抗体分离结合的双特异性试剂。孵育后，将细胞清洗并将1μg/mlDAPI加入到细胞中。通过流式细胞仪分析标记的细胞以测量315B07和5D5/FZD8-Fc与一系列Sema突变体的结合。
如图5所示，双特异性试剂315B07结合野生型人Sema结构域而不结合小鼠Sema结构域也不结合鼠/人嵌合突变体。当氨基酸残基96从苯丙氨酸改变为亮氨酸并且氨基酸残基99从谷氨酰胺改变为精氨酸时，未检测到315B07与人Sema结构域的结合。当只有氨基酸残基96从苯丙氨酸改变为亮氨酸时，315B07与人Sema结构域的结合不受影响。相比较而言，当只有氨基酸残基99从谷氨酰胺变为精氨酸时，未检测到315B07与Sema结构域的结合。当氨基酸331从精氨酸改变为赖氨酸时，315B07的结合不受影响。此外，当氨基酸328从谷氨酰胺改变为天冬酰胺时，315B07的结合不受影响。相似地，当氨基酸337从亮氨酸改变为脯氨酸并且氨基酸338从天冬酰胺改变为丝氨酸时，315B07的结合不受影响(数据未显示)。相比较而言，当氨基酸残基99从谷氨酰胺改变为精氨酸时，5D5/FZD8-Fc的结合不受影响。此外，当氨基酸331从精氨酸改变为赖氨酸时，未检测到5D5/FZD8-Fc的结合。当氨基酸328从谷氨酰胺改变为天冬酰胺时，未检测到5D5/FZD8-Fc的结合，当氨基酸337从亮氨酸改变为脯氨酸并且氨基酸338从天冬酰胺改变为丝氨酸时，5D5/FZD8-Fc的结合大大降低。
这些结果表明，人SEMA结构域的氨基酸99的谷氨酰胺是315B07的抗MET臂的表位的关键氨基酸。此外，这些结果清楚地表明，双特异性试剂315B07的c-MET上的表位与抗MET抗体5D5的c-MET上的表位不同，其包含人MET的至少氨基酸328、331、337和338。所述315B07表位和5D5表位的位置被描述在图6的带状图中。
实施例8
MMTV-Wnt1体内肿瘤生长的抑制
MMTV-Wnt1乳腺癌模型被选择用于研究，因为之前已证明该肿瘤模型对使用抗FZD抗体OMP-18R5(vantictumab)或OMP-54F28(FZD8-Fc)的WNT通路抑制高度敏感。将MMTV-Wnt1肿瘤细胞(25,000个细胞)皮下注射给NOD/SCID小鼠。允许肿瘤生长17天直到它们的平均体积达到110mm3。将荷瘤小鼠随机分组(每组n＝12)并用对照抗体(30mg/kg)、OMP-54F28(5mg/kg)或315B07(抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂)(30或60mg/kg)处理，每周一次。监测肿瘤生长并用电子数显卡尺在指定的时间点测量肿瘤体积。数据表示为平均值±S.E.M。
如图7所示，抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂315B07相比于对照抗体而言显著抑制MMTV-Wnt肿瘤生长，表明其是体内有效的Wnt拮抗剂。
实施例9
KP4胰腺肿瘤生长的体内抑制
KP4胰腺细胞系以自分泌的方式表达高水平的人生长因子(HGF)和MET，并已被证明在体内对抗MET抗体(5D5)的治疗敏感(Jin等人，2008,CancerRes.68:4360-4368)。KP4肿瘤细胞(1×106)皮下注射给NOD/SCID小鼠。允许肿瘤生长15天直到它们的平均体积达到125mm3。将荷瘤小鼠随机分为5组(每组n＝10)并用对照抗体(25mg/kg，每周)、OMP-18R5(25mg/kg，每周)、FZD8-Fc/FLAG(30mg/kg)、抗MET5D5/FLAG(30mg/kg)或抗MET/FZD8-Fc(5D5/FZD8-Fc，30mg/kg)处理。每周两次施用后3种蛋白质。监测肿瘤生长并用电子数显卡尺在指定的时间点测量肿瘤体积。数据表示为平均值±S.E.M。
如图8所示，抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂抑制KP4肿瘤生长，表明其是在体内有效的MET拮抗剂。
实施例10
OMP-LIV1肝癌肿瘤生长体内的抑制
OMP-LIV1是源自患者的肝细胞癌(HCC)肿瘤。OMP-LIV1肿瘤细胞(50,000)皮下注射给NOD/SCID小鼠。允许肿瘤生长约50天直到它们的平均体积达到220mm3。将荷瘤小鼠随机分为4组(每组n＝9-11)并用单一的索拉非尼、索拉非尼与单臂MET抗体的组合、索拉非尼与FZD8-Fc/FLAG的组合或索拉非尼与抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂OMP-315B07的组合处理。抗体或双特异性试剂的剂量为每周30mg/kg，每周2次。索拉非尼的剂量为60mg/kg，每日施用，每周5次。监测肿瘤生长并用电子数显卡尺在指定的时间点测量肿瘤体积。数据表示为平均值±S.E.M。
抗MET/FZD8-Fc的双特异性试剂OMP-315B07与索拉非尼组合抑制OMP-LIV1肿瘤生长的程度比单一的索拉非的程度更强(p＝0.02)，并且比索拉非尼与单臂抗MET或单臂FZD8-Fc的组合的程度更强(图9)。
应当理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且对其进行的各种修改或变化对于本领域的技术人员将是启发性的并且包括在本申请的精神和范围内。
本文引用的包括多核苷酸和多肽序列的所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列均通过引用以整体并入本文用于所有目的，其程度与每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列被具体和单独地指明被引入作为参考相同。
下面是应用中公开的序列：
73R009重链CDR1(SEQIDNO:1)
ASYAWS
73R009重链CDR2(SEQIDNO:2)
YISYSGGTDYNPSLKS
73R009重链CDR3(SEQIDNO:3)
KGAY
73R009轻链CDR1(SEQIDNO:4)
SASSSVSSSYLY
73R009轻链CDR2(SEQIDNO:5)
STSNLAS
73R009轻链CDR3(SEQIDNO:6)
HQWSSYPYT
73R009重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:7)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRITISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARKGAYWGQGTLVTVSS
73R009轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:8)
DIVLTQSPATLSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSLEPEDFATYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIK
含有下划线表示的预测信号序列的73R009重链氨基酸序列(SEQIDNO:9)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRITISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含有下划线表示的预测信号序列的73R009(13A变体)重链氨基酸序列(SEQIDNO:10)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRITISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含有下划线表示的预测信号序列的73R009轻链氨基酸序列(SEQIDNO:11)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSDIVLTQSPATLSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSLEPEDFATYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
不含预测的信号序列的73R009重链氨基酸序列(SEQIDNO:12)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRITISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测的信号序列的73R009(13A变体)重链氨基酸序列(SEQIDNO:13)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRITISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测的信号序列的73R009轻链氨基酸序列(SEQIDNO:14)
DIVLTQSPATLSASPGEKVTLTCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSLEPEDFATYYCHQWSSYPYTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
73R009重链核苷酸序列(SEQIDNO:15)
ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTCGTGGCTGCTCCCCGGTGGGTCCTGTCTCAGGTCCAATTGCAAGAGTCAGGACCAGGGCTTGTGAAGCCCTCAGAGACTCTGTCACTCACTTGTACCGTGACCGGAACTACCATCACTGCCTCCTACGCCTGGAGCTGGATCAGGCAGCCTCCGGGAAAAGGCCTGGAATGGATGGGTTACATCTCCTATTCAGGCGGAACCGACTACAATCCTAGCCTGAAGTCTCGCATCACCATTTCACGCGATACCTTCAAGAACCAATTCAGCCTTAAACTCTCCAGCGTGACCGCTGCAGACACTGCCACCTACTACTGCGCAAGAAAGGGAGCCTATTGGGGTCAGGGGACCCTTGTGACCGTGAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGGARATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGAYTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
其中R＝A或G
其中Y＝C或T
73R009(13A变体)重链核苷酸序列(SEQIDNO:16)
ATGAAGCATCTGTGGTTTTTCCTGCTGCTCGTGGCTGCTCCCCGGTGGGTCCTGTCTCAGGTCCAATTGCAAGAGTCAGGACCAGGGCTTGTGAAGCCCTCAGAGACTCTGTCACTCACTTGTACCGTGACCGGAACTACCATCACTGCCTCCTACGCCTGGAGCTGGATCAGGCAGCCTCCGGGAAAAGGCCTGGAATGGATGGGTTACATCTCCTATTCAGGCGGAACCGACTACAATCCTAGCCTGAAGTCTCGCATCACCATTTCACGCGATACCTTCAAGAACCAATTCAGCCTTAAACTCTCCAGCGTGACCGCTGCAGACACTGCCACCTACTACTGCGCAAGAAAGGGAGCCTATTGGGGTCAGGGGACCCTTGTGACCGTGAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGAAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
不含预测的信号序列的73R009重链核苷酸序列(SEQIDNO:17)
CAGGTCCAATTGCAAGAGTCAGGACCAGGGCTTGTGAAGCCCTCAGAGACTCTGTCACTCACTTGTACCGTGACCGGAACTACCATCACTGCCTCCTACGCCTGGAGCTGGATCAGGCAGCCTCCGGGAAAAGGCCTGGAATGGATGGGTTACATCTCCTATTCAGGCGGAACCGACTACAATCCTAGCCTGAAGTCTCGCATCACCATTTCACGCGATACCTTCAAGAACCAATTCAGCCTTAAACTCTCCAGCGTGACCGCTGCAGACACTGCCACCTACTACTGCGCAAGAAAGGGAGCCTATTGGGGTCAGGGGACCCTTGTGACCGTGAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGGARATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGAYTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
其中R＝A或G
其中Y＝C或T
不含预测的信号序列的73R009(13A变体)重链核苷酸序列(SEQIDNO:18)
CAGGTCCAATTGCAAGAGTCAGGACCAGGGCTTGTGAAGCCCTCAGAGACTCTGTCACTCACTTGTACCGTGACCGGAACTACCATCACTGCCTCCTACGCCTGGAGCTGGATCAGGCAGCCTCCGGGAAAAGGCCTGGAATGGATGGGTTACATCTCCTATTCAGGCGGAACCGACTACAATCCTAGCCTGAAGTCTCGCATCACCATTTCACGCGATACCTTCAAGAACCAATTCAGCCTTAAACTCTCCAGCGTGACCGCTGCAGACACTGCCACCTACTACTGCGCAAGAAAGGGAGCCTATTGGGGTCAGGGGACCCTTGTGACCGTGAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGAAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
73R009轻链核苷酸序列(SEQIDNO:19)
ATGAAGCACCTCTGGTTCTTCCTTCTTCTTGTGGCCGCTCCCCGCTGGGTCCTCAGCGATATCGTGCTGACCCAGTCACCCGCCACCCTCTCAGCTTCACCTGGCGAGAAGGTCACTCTGACTTGCTCTGCCTCATCTAGCGTGTCATCTTCATATCTGTACTGGTATCAGCAAAAACCGGGACAAGCCCCGAAGCTCCTGATCTACAGCACCAGCAACCTTGCATCCGGAGTGCCTGCCAGGTTTAGCGGGTCCGGGTCCGGTACCTCATATTCACTGACCATTTCTTCTCTTGAACCCGAAGATTTCGCTACCTACTACTGTCATCAGTGGTCTAGCTACCCATACACTTTCGGCGGAGGAACCAAACTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCAGCCCCTTCTGTCTTTATCTTCCCTCCATCCGACGAGCAGCTCAAATCAGGAACCGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTTAACAATTTCTACCCACGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAATCAGGTAATTCCCAAGAGTCAGTGACTGAACAGGATAGCAAGGACAGCACCTATTCACTCTCCAGCACTCTGACCCTGTCCAAGGCTGACTACGAAAAGCATAAGGTGTACGCATGCGAGGTGACCCACCAGGGTCTGAGCAGCCCCGTCACCAAGTCTTTCAACAGAGGGGAGTGT
不含预测的信号序列的73R009轻链核苷酸序列(SEQIDNO:20)GATATCGTGCTGACCCAGTCACCCGCCACCCTCTCAGCTTCACCTGGCGAGAAGGTCACTCTGACTTGCTCTGCCTCATCTAGCGTGTCATCTTCATATCTGTACTGGTATCAGCAAAAACCGGGACAAGCCCCGAAGCTCCTGATCTACAGCACCAGCAACCTTGCATCCGGAGTGCCTGCCAGGTTTAGCGGGTCCGGGTCCGGTACCTCATATTCACTGACCATTTCTTCTCTTGAACCCGAAGATTTCGCTACCTACTACTGTCATCAGTGGTCTAGCTACCCATACACTTTCGGCGGAGGAACCAAACTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCAGCCCCTTCTGTCTTTATCTTCCCTCCATCCGACGAGCAGCTCAAATCAGGAACCGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTTAACAATTTCTACCCACGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAATCAGGTAATTCCCAAGAGTCAGTGACTGAACAGGATAGCAAGGACAGCACCTATTCACTCTCCAGCACTCTGACCCTGTCCAAGGCTGACTACGAAAAGCATAAGGTGTACGCATGCGAGGTGACCCACCAGGGTCTGAGCAGCCCCGTCACCAAGTCTTTCAACAGAGGGGAGTGT
人FZD1Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:21)
QQPPPPPQQQQSGQQYNGERGISVPDHGYCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELCVGQNTSDKGT
人FZD2Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:22)
QFHGEKGISIPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQICVGQNHSEDG
人FZD3Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:23)
HSLFSCEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDCDEPYPRLVDL
人FZD4Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:24)
FGDEEERRCDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMCMEGPGDEEV
人FZD5Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:25)
ASKAPVCQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLCMDYNRSEATT
人FZD6Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:26)
HSLFTCEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYCDETVPVTFDPHTEFLG
人FZD7Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:27)
QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSG
人FZD8Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:28)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTT
人FZD8Fri结构域氨基酸序列(变体)(SEQIDNO:29)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDL
人FZD9Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:30)
LEIGRFDPERGRGAAPCQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALCMEAPENA
人FZD10Fri结构域氨基酸序列(SEQIDNO:31)
ISSMDMERPGDGKCQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLCMEAPNNG
人FZD1氨基酸116-227(SEQIDNO:32)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSAELKFFLCSMYAPVCTVLEQALPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPDTLKCEKFPVHGAGELC
人FZD2氨基酸39-150(SEQIDNO:33)
CQPISIPLCTDIAYNQTIMPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLEQAIPPCRSICERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCEHFPRHGAEQIC
人FZD3氨基酸28-133(SEQIDNO:34)
CEPITLRMCQDLPYNTTFMPNLLNHYDQQTAALAMEPFHPMVNLDCSRDFRPFLCALYAPICMEYGRVTLPCRRLCQRAYSECSKLMEMFGVPWPEDMECSRFPDC
人FZD4氨基酸48-161(SEQIDNO:35)
CDPIRISMCQNLGYNVTKMPNLVGHELQTDAELQLTTFTPLIQYGCSSQLQFFLCSVYVPMCTEKINIPIGPCGGMCLSVKRRCEPVLKEFGFAWPESLNCSKFPPQNDHNHMC
人FZD5氨基酸33-147(SEQIDNO:36)
CQEITVPMCRGIGYNLTHMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLRFFLCSMYTPICLPDYHKPLPPCRSVCERAKAGCSPLMRQYGFAWPERMSCDRLPVLGRDAEVLC
人FZD6氨基酸24-129(SEQIDNO:37)
CEPITVPRCMKMAYNMTFFPNLMGHYDQSIAAVEMEHFLPLANLECSPNIETFLCKAFVPTCIEQIHVVPPCRKLCEKVYSDCKKLIDTFGIRWPEELECDRLQYC
人FZD7氨基酸49-160(SEQIDNO:38)
CQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEIC
人FZD8氨基酸35-148(SEQIDNO:39)
CQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLC
人FZD9氨基酸39-152(SEQIDNO:40)
CQAVEIPMCRGIGYNLTRMPNLLGHTSQGEAAAELAEFAPLVQYGCHSHLRFFLCSLYAPMCTDQVSTPIPACRPMCEQARLRCAPIMEQFNFGWPDSLDCARLPTRNDPHALC
人FZD10氨基酸34-147(SEQIDNO:41)
CQPIEIPMCKDIGYNMTRMPNLMGHENQREAAIQLHEFAPLVEYGCHGHLRFFLCSLYAPMCTEQVSTPIPACRVMCEQARLKCSPIMEQFNFKWPDSLDCRKLPNKNDPNYLC
人IgG1Fc区(SEQIDNO:42)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(变体)(SEQIDNO:43)
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(SEQIDNO:44)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(SEQIDNO:45)
TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区变体(SEQIDNO:46)
TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(变体13A)(SEQIDNO:47)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(变体13B)(SEQIDNO:48)
CVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(变体13A)(SEQIDNO:49)
TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区变体(变体13A)(SEQIDNO:50)
TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区(变体13B)(SEQIDNO:51)
TKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2Fc区变体(变体13B)(SEQIDNO:52)
TKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
FZD8-Fc变体54F28氨基酸序列(不含预测的信号序列)(SEQIDNO:53)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含有信号序列的FZD8-Fc变体54F28氨基酸序列(SEQIDNO:54)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPFVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含有信号序列的FZD8-Fc变体(13B变体)氨基酸序列(SEQIDNO:55)
MEWGYLLEVTSLLAALLLLQRSPIVHAASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含信号序列的FZD8-Fc变体(13B变体)氨基酸序列(SEQIDNO:56)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人WNT1C-末端半胱氨酸富集区(aa288-370)(SEQIDNO:57)
DLVYFEKSPNFCTYSGRLGTAGTAGRACNSSSPALDGCELLCCGRGHRTRTQRVTERCNCTFHWCCHVSCRNCTHTRVLHECL
人WNT2C-末端半胱氨酸富集区(aa267-360)(SEQIDNO:58)
DLVYFENSPDYCIRDREAGSLGTAGRVCNLTSRGMDSCEVMCCGRGYDTSHVTRMTKCGCKFHWCCAVRCQDCLEALDVHTCKAPKNADWTTAT
人Wnt2bC-末端半胱氨酸富集区(aa298-391)(SEQIDNO:59)
DLVYFDNSPDYCVLDKAAGSLGTAGRVCSKTSKGTDGCEIMCCGRGYDTTRVTRVTQCECKFHWCCAVRCKECRNTVDVHTCKAPKKAEWLDQT
人WNT3C-末端半胱氨酸富集区(aa273-355)(SEQIDNO:60)
DLVYYENSPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVTSHGIDGCDLLCCGRGHNTRTEKRKEKCHCIFHWCCYVSCQECIRIYDVHTCK
人WNT3aC-末端半胱氨酸富集区(aa270-352)(SEQIDNO:61)
DLVYYEASPNFCEPNPETGSFGTRDRTCNVSSHGIDGCDLLCCGRGHNARAERRREKCRCVFHWCCYVSCQECTRVYDVHTCK
人WNT7aC-末端半胱氨酸富集区(aa267-359)(SEQIDNO:62)
DLVYIEKSPNYCEEDPVTGSVGTQGRACNKTAPQASGCDLMCCGRGYNTHQYARVWQCNCKFHWCCYVKCNTCSERTEMYTCK
人WNT7bC-末端半胱氨酸富集区(aa267-349)(SEQIDNO:63)
DLVYIEKSPNYCEEDAATGSVGTQGRLCNRTSPGADGCDTMCCGRGYNTHQYTKVWQCNCKFHWCCFVKCNTCSERTEVFTCK
人WNT8aC-末端半胱氨酸富集区(aa248-355)(SEQIDNO:64)
ELIFLEESPDYCTCNSSLGIYGTEGRECLQNSHNTSRWERRSCGRLCTECGLQVEERKTEVISSCNCKFQWCCTVKCDQCRHVVSKYYCARSPGSAQSLGRVWFGVYI
人WNT8bC-末端半胱氨酸富集区(aa245-351)(SEQIDNO:65)
ELVHLEDSPDYCLENKTLGLLGTEGRECLRRGRALGRWELRSCRRLCGDCGLAVEERRAETVSSCNCKFHWCCAVRCEQCRRRVTKYFCSRAERPRGGAAHKPGRKP
人WNT10aC-末端半胱氨酸富集区(aa335-417)(SEQIDNO:66)
DLVYFEKSPDFCEREPRLDSAGTVGRLCNKSSAGSDGCGSMCCGRGHNILRQTRSERCHCRFHWCCFVVCEECRITEWVSVCK
人WNT10bC-末端半胱氨酸富集区(aa307-389)(SEQIDNO:67)
ELVYFEKSPDFCERDPTMGSPGTRGRACNKTSRLLDGCGSLCCGRGHNVLRQTRVERCHCRFHWCCYVLCDECKVTEWVNVCK
接头(SEQIDNO:68)
ESGGGGVT
接头(SEQIDNO:69)
LESGGGGVT
接头(SEQIDNO:70)
GRAQVT
接头(SEQIDNO:71)
WRAQVT
接头(SEQIDNO:72)
ARGRAQVT
FLAG肽(SEQIDNO:73)
DYKDDDDK
人IgG1重链恒定区(SEQIDNO:74)
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG2重链恒定区(SEQIDNO:75)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG3重链恒定区(SEQIDNO:76)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYTCNVNHKPSNTKVDKRVELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK
人IgG4重链恒定区(SEQIDNO:77)
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
MET抗体重链CDR1(SEQIDNO:78)
GYTFTSYWLH
MET抗体重链CDR2(SEQIDNO:79)
GMIDPSNSDTRFNPNFKD
MET重链CDR3(SEQIDNO:80)
XYGSYVSPLDY
其中X不是R
MET重链CDR3(SEQIDNO:81)
TYGSYVSPLDY
MET重链CDR3(SEQIDNO:82)
SYGSYVSPLDY
MET重链CDR3(SEQIDNO:83)
ATYGSYVSPLDY
MET轻链CDR1(SEQIDNO:84)
KSSQSLLYTSSQKNYLA
MET轻链CDR2(SEQIDNO:85)
WASTRES
MET轻链CDR3(SEQIDNO:86)
QQYYAYPWT
不含信号序列的FZD8-Fc变体(13A变体)氨基酸序列(SEQIDNO:87)
ASAKELACQEITVPLCKGIGYNYTYMPNQFNHDTQDEAGLEVHQFWPLVEIQCSPDLKFFLCSMYTPICLEDYKKPLPPCRSVCERAKAGCAPLMRQYGFAWPDRMRCDRLPEQGNPDTLCMDYNRTDLTTTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测的信号序列的73R009(13B变体)重链氨基酸序列(SEQIDNO:88)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVTGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRITISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTATYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含有信号序列的FZD8-Fc变体(13B变体)核苷酸序列(SEQIDNO:89)
ATGGAGTGGGGTTATCTTTTAGAAGTGACCTCGCTGCTAGCCGCCTTGCTACTGCTGCAGCGCTCTCCGATCGTGCACGCCGCCTCGGCCAAGGAGCTGGCATGCCAAGAGATCACCGTGCCGCTATGCAAGGGCATCGGCTACAACTACACCTACATGCCCAATCAATTCAACCACGACACGCAAGACGAGGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTGGCCGCTGGTGGAGATCCAGTGCTCGCCCGATCTCAAGTTCTTCCTGTGCAGCATGTACACGCCCATCTGCCTAGAGGACTACAAGAAGCCGCTGCCGCCCTGCCGCTCGGTGTGCGAGCGCGCCAAGGCCGGCTGCGCGCCGCTCATGCGCCAGTACGGCTTCGCCTGGCCCGACCGCATGCGCTGCGACCGGCTGCCCGAGCAAGGCAACCCTGACACGCTGTGCATGGACTACAACCGCACCGACCTAACCACCACCAAAGTTGACAAGACTGTTGAGCGAAAGAGCTGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAACCTAAAGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTTGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTTTCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCTAACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTACACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTATCTCCTGGCAAGTAG
不含信号序列的FZD8-Fc变体(13B变体)核苷酸序列(SEQIDNO:90)
CGCTCTCCGATCGTGCACGCCGCCTCGGCCAAGGAGCTGGCATGCCAAGAGATCACCGTGCCGCTATGCAAGGGCATCGGCTACAACTACACCTACATGCCCAATCAATTCAACCACGACACGCAAGACGAGGCGGGCCTGGAGGTGCACCAGTTCTGGCCGCTGGTGGAGATCCAGTGCTCGCCCGATCTCAAGTTCTTCCTGTGCAGCATGTACACGCCCATCTGCCTAGAGGACTACAAGAAGCCGCTGCCGCCCTGCCGCTCGGTGTGCGAGCGCGCCAAGGCCGGCTGCGCGCCGCTCATGCGCCAGTACGGCTTCGCCTGGCCCGACCGCATGCGCTGCGACCGGCTGCCCGAGCAAGGCAACCCTGACACGCTGTGCATGGACTACAACCGCACCGACCTAACCACCACCAAAGTTGACAAGACTGTTGAGCGAAAGAGCTGCGTTGAGTGCCCTCCATGTCCTGCACCTCCTGTGGCTGGCCCTTCTGTGTTCCTGTTCCCTCCAAAACCTAAAGACACTCTAATGATCTCTCGGACTCCTGAGGTGACTTGCGTGGTTGTGGACGTGTCCCACGAGGACCCTGAGGTGCAGTTTAATTGGTACGTGGACGGAGTCGAGGTGCACAATGCAAAGACCAAGCCTCGGGAGGAACAGTTCAACTCCACCTTCCGGGTGGTTTCTGTGTTGACCGTTGTGCACCAAGACTGGCTGAACGGCAAAGAATACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTGCCCCTATCGAAAAGACCATCAGCAAGACCAAGGGCCAGCCTCGCGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCGGGAAGAAATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGGAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTTGAGTGGGAGTCTAACGGACAGCCGGAGAACAACTACAAGACTACGCCTCCAATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTGTACTCCGAACTGACCGTGGACAAGTCCCGGTGGCAGCAGGGCAACGTGTTCTCATGCTCCGTAATGCACGAAGCCTTACACAATCACTACACTCAAAAGTCCCTATCCTTATCTCCTGGCAAGTAG
人IgG1Fc区(SEQIDNO:91)
KSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人IgG1Fc区(SEQIDNO:92)
EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
人MET(SEQIDNO:93)
MKAPAVLAPGILVLLFTLVQRSNGECKEALAKSEMNVNMKYQLPNFTAETPIQNVILHEHHIFLGATNYIYVLNEEDLQKVAEYKTGPVLEHPDCFPCQDCSSKANLSGGVWKDNINMALVVDTYYDDQLISCGSVNRGTCQRHVFPHNHTADIQSEVHCIFSPQIEEPSQCPDCVVSALGAKVLSSVKDRFINFFVGNTINSSYFPDHPLHSISVRRLKETKDGFMFLTDQSYIDVLPEFRDSYPIKYVHAFESNNFIYFLTVQRETLDAQTFHTRIIRFCSINSGLHSYMEMPLECILTEKRKKRSTKKEVFNILQAAYVSKPGAQLARQIGASLNDDILFGVFAQSKPDSAEPMDRSAMCAFPIKYVNDFFNKIVNKNNVRCLQHFYGPNHEHCFNRTLLRNSSGCEARRDEYRTEFTTALQRVDLFMGQFSEVLLTSISTFIKGDLTIANLGTSEGRFMQVVVSRSGPSTPHVNFLLDSHPVSPEVIVEHTLNQNGYTLVITGKKITKIPLNGLGCRHFQSCSQCLSAPPFVQCGWCHDKCVRSEECLSGTWTQQICLPAIYKVFPNSAPLEGGTRLTICGWDFGFRRNNKFDLKKTRVLLGNESCTLTLSESTMNTLKCTVGPAMNKHFNMSIIISNGHGTTQYSTFSYVDPVITSISPKYGPMAGGTLLTLTGNYLNSGNSRHISIGGKTCTLKSVSNSILECYTPAQTISTEFAVKLKIDLANRETSIFSYREDPIVYEIHPTKSFISGGSTITGVGKNLNSVSVPRMVINVHEAGRNFTVACQHRSNSEIICCTTPSLQQLNLQLPLKTKAFFMLDGILSKYFDLIYVHNPVFKPFEKPVMISMGNENVLEIKGNDIDPEAVKGEVLKVGNKSCENIHLHSEAVLCTVPNDLLKLNSELNIEWKQAISSTVLGKVIVQPDQNFTGLIAGVVSISTALLLLLGFFLWLKKRKQIKDLGSELVRYDARVHTPHLDRLVSARSVSPTTEMVSNESVDYRATFPEDQFPNSSQNGSCRQVQYPLTDMSPILTSGDSDISSPLLQNTVHIDLSALNPELVQAVQHVVIGPSSLIVHFNEVIGRGHFGCVYHGTLLDNDGKKIHCAVKSLNRITDIGEVSQFLTEGIIMKDFSHPNVLSLLGICLRSEGSPLVVLPYMKHGDLRNFIRNETHNPTVKDLIGFGLQVAKGMKYLASKKFVHRDLAARNCMLDEKFTVKVADFGLARDMYDKEYYSVHNKTGAKLPVKWMALESLQTQKFTTKSDVWSFGVLLWELMTRGAPPYPDVNTFDITVYLLQGRRLLQPEYCPDPLYEVMLKCWHPKAEMRPSFSELVSRISAIFSTFIGEHYVHVNATYVNVKCVAPYPSLLSSEDNADDEVDTRPASFWETS
人源化抗体
73R010(73R009H12)重链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:94)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSS
73R010(73R009L7)轻链可变区氨基酸序列(SEQIDNO:95)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIK
含有下划线表示的预测信号序列的73R010(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:96)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含有下划线表示的预测信号序列的73R01013A变体(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:97)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
含有下划线表示的预测信号序列的73R010(73R009L7)轻链氨基酸序列(SEQIDNO:98)
METPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
不含预测的信号序列的73R010(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:99)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测的信号序列的73R01013A变体(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:100)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测的信号序列的73R010(73R009L7)轻链氨基酸序列(SEQIDNO:101)
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCSASSSVSSSYLYWYQQKPGQAPRLLIYSTSNLASGIPARFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCHQWSSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
73R010(73R009H12)重链核苷酸序列(SEQIDNO:102)
ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCTGCTCCCCGCTGGGTCCTGTCCCAAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTCTCTGGAACTACCATCACTGCCTCCTATGCCTGGAGCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTACATAAGCTACTCCGGGGGCACTGACTACAACCCATCTCTCAAATCCCGGGTCACAATATCACGGGACACATTCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTCTCCTCTGTGACCGCTGCTGACACCGCCGTCTATTACTGTGCAAGAAAGGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGGARATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGAYTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
其中R＝A或G
其中Y＝C或T
73R01013A变体(73R009H12)重链核苷酸序列(SEQIDNO:103)
ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCTGCTCCCCGCTGGGTCCTGTCCCAAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTCTCTGGAACTACCATCACTGCCTCCTATGCCTGGAGCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTACATAAGCTACTCCGGGGGCACTGACTACAACCCATCTCTCAAATCCCGGGTCACAATATCACGGGACACATTCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTCTCCTCTGTGACCGCTGCTGACACCGCCGTCTATTACTGTGCAAGAAAGGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGAAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
不含预测的信号序列的73R010(73R009H12)重链核苷酸序列(SEQIDNO:104)
CAAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTCTCTGGAACTACCATCACTGCCTCCTATGCCTGGAGCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTACATAAGCTACTCCGGGGGCACTGACTACAACCCATCTCTCAAATCCCGGGTCACAATATCACGGGACACATTCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTCTCCTCTGTGACCGCTGCTGACACCGCCGTCTATTACTGTGCAAGAAAGGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGGARATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGAYTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
其中R＝A或G
其中Y＝C或T
不含预测的信号序列的73R01013A变体(73R009H12)重链核苷酸序列(SEQIDNO:105)
CAAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTCTCTGGAACTACCATCACTGCCTCCTATGCCTGGAGCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTACATAAGCTACTCCGGGGGCACTGACTACAACCCATCTCTCAAATCCCGGGTCACAATATCACGGGACACATTCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTCTCCTCTGTGACCGCTGCTGACACCGCCGTCTATTACTGTGCAAGAAAGGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCAGCTCAGCCTCTACCAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGAAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAA
73R010(73R009L7)轻链核苷酸序列(SEQIDNO:106)
ATGGAAACCCCAGCTCAACTCCTCTTCCTCCTGCTCCTCTGGCTCCCCGATACCACCGGAGAAATTGTGCTCACTCAGTCTCCCGCTACCCTGTCTCTCTCTCCTGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCTCTGCCTCCTCATCCGTTTCTTCCTCCTACCTCTACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCTAGGTTCTCTGGCTCTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCATCAGTGGTCATCCTACCCATACACATTCGGCCAGGGAACCAAACTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCAGCCCCTTCTGTCTTTATCTTCCCTCCATCCGACGAGCAGCTCAAATCAGGAACCGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTTAACAATTTCTACCCACGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAATCAGGTAATTCCCAAGAGTCAGTGACTGAACAGGATAGCAAGGACAGCACCTATTCACTCTCCAGCACTCTGACCCTGTCCAAGGCTGACTACGAAAAGCATAAGGTGTACGCATGCGAGGTGACCCACCAGGGTCTGAGCAGCCCCGTCACCAAGTCTTTCAACAGAGGGGAGTGT
不含预测的信号序列的73R010(73R009L7)轻链核苷酸序列(SEQIDNO:107)
GAAATTGTGCTCACTCAGTCTCCCGCTACCCTGTCTCTCTCTCCTGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCTCTGCCTCCTCATCCGTTTCTTCCTCCTACCTCTACTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATAGCACATCCAACCTGGCTTCTGGCATCCCAGCTAGGTTCTCTGGCTCTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCATCAGTGGTCATCCTACCCATACACATTCGGCCAGGGAACCAAACTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCAGCCCCTTCTGTCTTTATCTTCCCTCCATCCGACGAGCAGCTCAAATCAGGAACCGCTTCTGTCGTGTGCCTGCTTAACAATTTCTACCCACGGGAAGCCAAGGTGCAGTGGAAGGTGGACAATGCCCTGCAATCAGGTAATTCCCAAGAGTCAGTGACTGAACAGGATAGCAAGGACAGCACCTATTCACTCTCCAGCACTCTGACCCTGTCCAAGGCTGACTACGAAAAGCATAAGGTGTACGCATGCGAGGTGACCCACCAGGGTCTGAGCAGCCCCGTCACCAAGTCTTTCAACAGAGGGGAGTGT
不含预测的信号序列的73R01013B变体(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:108)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
73R01013A变体(Cys/Ser)(73R009H12)重链核苷酸序列(SEQIDNO:109)
ATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCTGCTCCCCGCTGGGTCCTGTCCCAAGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCCGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACCGTCTCTGGAACTACCATCACTGCCTCCTATGCCTGGAGCTGGATTCGGCAGCCCCCTGGCAAGGGACTGGAGTGGATGGGGTACATAAGCTACTCCGGGGGCACTGACTACAACCCATCTCTCAAATCCCGGGTCACAATATCACGGGACACATTCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTCTCCTCTGTGACCGCTGCTGACACCGCCGTCTATTACTGTGCAAGAAAGGGGGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCAGCTCAGCCTCAACTAAGGGCCCTAGCGTCTTCCCTCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCAGCGAGAGCACAGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCTGTGACAGTGTCCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTCCAGTCCTCCGGACTCTACTCCCTCTCCTCCGTGGTGACAGTGCCCTCCTCCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTCGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTTGATAAGACAGTTGAGCGCAAATCTTGTGTCGAGTGCCCTCCTTGCCCAGCCCCTCCTGTGGCTGGACCTTCCGTCTTCCTCTTCCCCCCTAAACCCAAAGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACATTCCGGGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTCTCCAACAAAGGCCTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCAGGGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCTTCCCGGGAGAAGATGACCAAGAACCAAGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGAAGTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACTCCAAACTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCCTGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGTCCCTCTCCCTGTCTCCTGGAAAATGA
含有下划线表示的预测信号序列的73R01013A变体(Cys/Ser)(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:110)
MKHLWFFLLLVAAPRWVLSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测的信号序列的73R01013A变体(Cys/Ser)(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:111)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREKMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLKSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
不含预测的信号序列的73R010(Cys/Ser)(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:112)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
MET(SEQIDNO:93的氨基酸97-101)(SEQIDNO:113)
PCQDC
不含预测的信号序列的73R01013B变体(Cys/Ser)(73R009H12)重链氨基酸序列(SEQIDNO:114)
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGTTITASYAWSWIRQPPGKGLEWMGYISYSGGTDYNPSLKSRVTISRDTFKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARKGAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSNFGTQTYTCNVDHKPSNTKVDKTVERKSCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVEGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSELTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
最初的(用于提交)
仅仅用于接收局使用
PCT/RO/134表
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种双特异性试剂，其包括：
a)特异性结合人MET的第一结合位点，和
b)特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点。
2.根据权利要求1所述的双特异性试剂，其中所述第一结合位点包括特异性结合人MET的抗体的抗原结合位点，其中所述抗原结合位点包括含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的双特异性试剂，其中所述第二结合位点：(i)特异性结合一个或更多个Frizzled(FZD)蛋白，或(ii)特异性地结合一个或更多个人WNT蛋白。
4.根据权利要求3所述的双特异性试剂，其中所述一个或更多个FZD蛋白选自由FZD8、FZD1、FZD2、FZD5和FZD7所组成的组，或者其中所述一个或更多个WNT蛋白选自由WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT10a和WNT10b所组成的组。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的双特异性试剂，其是双特异性抗体。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的双特异性试剂，其包括可溶性FZD受体。
7.根据权利要求6所述的双特异性试剂，其中所述可溶性FZD受体包括人FZD蛋白的Fri结构域。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白是人FZD8。
9.根据权利要求7所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白的Fri结构域包括选自由SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:39、SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:40和SEQIDNO:41所组成的组中的序列。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白的Fri结构域连接至异源多肽上。
11.根据权利要求10所述的双特异性试剂，其中所述异源多肽包括人Fc区。
12.根据权利要求6所述的双特异性试剂，其中所述可溶性FZD受体包括SEQIDNO:56或SEQIDNO:53。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的双特异性试剂，其中所述第一结合位点包括含有SEQIDNO:7的重链可变区和含有SEQIDNO:8的轻链可变区。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的双特异性试剂，其中所述第二结合位点包括由保藏于ATCC的指定编号为PTA-13611的质粒编码的多肽。
15.根据权利要求1所述的双特异性试剂，其中所述第一结合位点包括由保藏于ATCC的指定编号为PTA-13609的质粒编码的重链可变区和由保藏于ATCC的指定编号为PTA-13610的质粒编码的轻链可变区；并且所述第二结合位点包括由保藏于ATCC的指定编号为PTA-13611的质粒编码的多肽。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的双特异性试剂，其包括第一CH3结构域和第二CH3结构域，对其中的每一个进行改性以促进形成异二聚体。
17.根据权利要求16所述的双特异性试剂，其中基于静电效应对所述第一和第二CH3结构域进行改性。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的双特异性试剂，其：
(i)抑制MET与肝细胞生长因子的结合；
(ii)促进MET内化；
(iii)刺激MET降解；
(iv)抑制MET二聚化；
(v)抑制MET的活化；
(vi)抑制一个或更多个WNT蛋白与至少一个FZD的结合；
(vii)抑制经典的WNT信号传导；
(viii)抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长；
(ix)诱导肿瘤中分化标记物的表达；
(x)诱导肿瘤中的细胞分化；
(xi)降低肿瘤中癌症干细胞的频率；和/或
(xii)抑制上皮-间质转化(EMT)。
19.一种特异性结合人MET的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体结合包含氨基酸PCQDC(SEQIDNO:113)的表位。
20.一种特异性结合人MET的分离抗体，其包括：
含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
21.根据权利要求20所述的抗体，其包括：与SEQIDNO:7具有至少约80％序列同一性的重链可变区以及与SEQIDNO:8具有至少约80％序列同一性的轻链可变区。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体、重组抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或包括抗原结合位点的抗体片段。
23.一种包含权利要求1-22中任一项所述的双特异性试剂或抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
24.一种生产权利要求1-22中任一项所述的双特异性试剂或抗体的细胞。
25.一种编码权利要求1-22中任一项所述的双特异性试剂或抗体的多核苷酸。
26.根据权利要求1-22中任一项所述的双特异性试剂或抗体，其用于治疗癌症。
27.根据权利要求1-22中任一项所述的双特异性试剂或抗体，其用于抑制肿瘤的生长。
28.根据权利要求1-22中任一项所述的双特异性试剂或抗体用于治疗癌症的用途。
29.根据权利要求1-22中任一项所述的双特异性试剂或抗体用于抑制肿瘤的生长的用途。
30.根据权利要求28或29所述的用途，其包括至少所述一种另外的治疗剂的使用，任选地其中所述治疗剂是化疗剂。

Claims (112)

1.一种双特异性试剂，其包括：
a)特异性结合人MET的第一结合位点，和
b)特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点。
2.根据权利要求1所述的双特异性试剂，其中所述第一结合位点包括特异性结合人MET的抗体的抗原结合位点。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的双特异性试剂，其中所述第一结合位点包括含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的双特异性试剂，其中所述第二结合位点包括特异性结合所述WNT通路的一个或更多个组件的抗体的抗原结合位点。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的双特异性试剂，其是双特异性抗体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的双特异性试剂，其中所述第二结合位点特异性地结合一个或更多个人WNT蛋白。
7.根据权利要求6所述的双特异性试剂，其中所述一个或更多个WNT蛋白选自由WNT1、WNT2、WNT2b、WNT3、WNT3a、WNT7a、WNT7b、WNT8a、WNT8b、WNT10a和WNT10b所组成的组。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的双特异性试剂，其中所述第二结合位点特异性结合一个或更多个Frizzled(FZD)蛋白。
9.根据权利要求8所述的双特异性试剂，其中所述第二结合位点特异性结合选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8所组成的组中的一个或更多个FZD蛋白。
10.根据权利要求1、2、3、6或7中任一项所述的双特异性试剂，其包括可溶性FZD受体。
11.根据权利要求10所述的双特异性试剂，其中所述可溶性受体包括人FZD蛋白的Fri结构域。
12.根据权利要求10所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白是人FZD8。
13.根据权利要求11所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白的Fri结构域包括选自由SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40和SEQIDNO:41所组成的组中的序列。
14.根据权利要求13所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白的Fri结构域包括SEQIDNO:28、SEQIDNO:29或SEQIDNO:39。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白的Fri结构域直接连接至异源多肽上。
16.根据权利要求10-14中任一项所述的双特异性试剂，其中所述人FZD蛋白的Fri结构域通过接头连接至异源多肽上。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的双特异性试剂，其中所述异源多肽包括人Fc区。
18.根据权利要求15-17中任一项的双特异性试剂，其中所述异源多肽包括SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51、SEQIDNO:52、SEQIDNO:42、SEQIDNO:43、SEQIDNO:91或SEQIDNO:92。
19.根据权利要求10所述的双特异性试剂，其中所述可溶性FZD受体包括：
(a)基本由SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40或SEQIDNO:41组成的第一多肽；以及
(b)包括SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52的第二多肽；
其中所述第一多肽直接连接至所述第二多肽上。
20.根据权利要求10所述的双特异性试剂，其中所述可溶性FZD受体包括：
(a)包括SEQIDNO:21、SEQIDNO:22、SEQIDNO:23、SEQIDNO:24、SEQIDNO:25、SEQIDNO:26、SEQIDNO:27、SEQIDNO:28、SEQIDNO:29、SEQIDNO:30、SEQIDNO:31、SEQIDNO:32、SEQIDNO:33、SEQIDNO:34、SEQIDNO:35、SEQIDNO:36、SEQIDNO:37、SEQIDNO:38、SEQIDNO:39、SEQIDNO:40或SEQIDNO:41的第一多肽；以及
(b)包括SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52的第二多肽；
其中所述第一多肽通过接头连接至所述第二多肽上。
21.根据权利要求19或权利要求20所述的双特异性试剂，其中所述第一多肽由SEQIDNO:28组成。
22.根据权利要求21所述的双特异性试剂，其中所述第二多肽由SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52组成。
23.根据权利要求19或权利要求20所述的双特异性试剂，其中所述第一多肽由SEQIDNO:29组成。
24.根据权利要求23所述的双特异性试剂，其中所述第二多肽由SEQIDNO:44、SEQIDNO:45、SEQIDNO:46、SEQIDNO:47、SEQIDNO:48、SEQIDNO:49、SEQIDNO:50、SEQIDNO:51或SEQIDNO:52组成。
25.根据权利要求10所述的双特异性试剂，其中所述可溶性FZD受体包括SEQIDNO:53或SEQIDNO:56。
26.根据权利要求10所述的双特异性试剂，其中所述可溶性FZD受体包括SEQIDNO:56。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的双特异性试剂，其中所述第一结合位点包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约90％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。
28.根据权利要求27所述的双特异性试剂，其中所述第一结合位点包括与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少95％序列同一性的重链可变区和与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少95％序列同一性的轻链可变区。
29.根据权利要求27所述的双特异性试剂，其中所述第一抗原结合位点包括：
(a)包括SEQIDNO:7的重链可变区和包括SEQIDNO:8的轻链可变区；或者
(b)包括SEQIDNO:94的重链可变区和包括SEQIDNO:95的轻链可变区。
30.根据权利要求1-29中任一项所述的双特异性试剂，其包括第一CH3结构域和第二CH3结构域，其中对每一个进行改性以促进形成异二聚体。
31.根据权利要求30所述的双特异性试剂，其中基于静电效应对第一和第二CH3结构域进行改性。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的双特异性试剂，其包括第一人IgG2恒定区，其在对应于SEQIDNO:75的249和288位具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被替代为谷氨酸或天冬氨酸；以及第二人IgG2恒定区，其在对应于SEQIDNO:75的236和278位具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被替代为赖氨酸。
33.根据权利要求1-31中任一项所述的双特异性试剂，其包括第一人IgG2恒定区，其在对应于SEQIDNO:75的236和278位具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被替代为赖氨酸；以及第二人IgG2恒定区，其在对应于SEQIDNO:75的249和288位具有氨基酸替代，其中所述氨基酸被替代为谷氨酸或天冬氨酸。
34.根据权利要求30所述的双特异性试剂，其中使用杵臼技术对所述第一和第二CH3结构域进行改性。
35.一种特异性结合人MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂，其包括：
(a)SEQIDNO:13的重链和SEQIDNO:14的轻链；
(b)SEQIDNO:100的重链和SEQIDNO:101的轻链；或者
(c)SEQIDNO:111的重链和SEQIDNO:101的轻链。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的双特异性试剂，其结合KD为约100nM或更小的人MET并结合KD为约100nM或更小的WNT通路的一个或更多个组件。
37.一种双特异性试剂，其是315B06、315B07或315B09。
38.根据权利要求1-37中任一项所述的双特异性试剂，其抑制MET与肝细胞生长因子的结合。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的双特异性试剂，其促进MET内化。
40.根据权利要求1-39中任一项所述的双特异性试剂，其刺激MET降解。
41.根据权利要求1-38中任一项所述的双特异性试剂，其抑制MET二聚化。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的双特异性试剂，其抑制MET的活化。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的双特异性试剂，其抑制一个或更多个WNT蛋白与至少一个FZD的结合。
44.根据权利要求43所述的双特异性试剂，其中所述FZD选自由FZD1、FZD2、FZD5、FZD7和FZD8所组成的组。
45.根据权利要求44所述的双特异性试剂，其中所述FZD是FZD8。
46.根据权利要求1-45中任一项所述的双特异性试剂，其抑制WNT信号传导。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的双特异性试剂，其抑制经典的WNT信号传导。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的双特异性试剂，其抑制肿瘤或肿瘤细胞的生长。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的双特异性试剂，其诱导肿瘤中分化标记物的表达。
50.根据权利要求1-49中任一项的双特异性试剂，其诱导肿瘤中的细胞分化。
51.根据权利要求1-50中任一项的双特异性试剂，其降低肿瘤中癌症干细胞的频率。
52.根据权利要求1-51中任一项的双特异性试剂，其抑制上皮-间质转化(EMT)。
53.一种特异性结合人MET的分离抗体，其包括：
含有ASYAWS(SEQIDNO:1)的重链CDR1、含有YISYSGGTDYNPSLKS(SEQIDNO:2)的重链CDR2和含有KGAY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及含有SASSSVSSSYLY(SEQIDNO:4)的轻链CDR1、含有STSNLAS(SEQIDNO:5)的轻链CDR2和含有HQWSSYPYT(SEQIDNO:6)的轻链CDR3。
54.一种特异性结合人MET的分离抗体，其包括：
(a)与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约90％序列同一性的重链可变区；以及
(b)与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约90％序列同一性的轻链可变区。
55.根据权利要求54所述的抗体，其包括：
(a)与SEQIDNO:7或SEQIDNO:94具有至少约95％序列同一性的重链可变区；以及
(b)与SEQIDNO:8或SEQIDNO:95具有至少约95％序列同一性的轻链可变区。
56.根据权利要求54所述的抗体，其包括：
(a)包括SEQIDNO:7的重链可变区和包括SEQIDNO:8的轻链可变区；或者
(b)包括SEQIDNO:94的重链可变区和包括SEQIDNO:95的轻链可变区。
57.一种特异性结合人MET的分离抗体，其包括：
(a)包括SEQIDNO:12的重链和包括SEQIDNO:14的轻链；
(b)包括SEQIDNO:99的重链和包括SEQIDNO:101的轻链；或者
(c)包括SEQIDNO:112的重链和包括SEQIDNO:101的轻链。
58.根据权利要求53-57中任一项所述的抗体，其是单克隆抗体、重组抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、双特异性抗体、IgG1抗体、IgG2抗体或包括抗原结合位点的抗体片段。
59.根据权利要求53-57中任一项所述的抗体，其是单价抗体。
60.根据权利要求53-57中任一项所述的抗体，其是双特异性抗体。
61.根据权利要求53-60中任一项所述的抗体，其抑制MET与肝细胞生长因子的结合。
62.一种多肽，其包括选自由SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:55、SEQIDNO:56、SEQIDNO:87、SEQIDNO:88、SEQIDNO:94、SEQIDNO:95、SEQIDNONO:96、SEQIDNO:97、SEQIDNO:98、SEQIDNO:99、SEQIDNO:100、SEQIDNO:101、SEQIDNO:108、SEQIDNO:110、SEQIDNO:111和SEQIDNO:112所组成的组中的序列。
63.一种包含根据权利要求1-62中任一项所述的双特异性试剂、抗体或多肽的细胞。
64.一种产生根据权利要求1-62中任一项所述的双特异性试剂、抗体或多肽的细胞。
65.一种包含编码权利要求1-62中任一项所述的双特异性试剂、抗体或多肽的多核苷酸的分离的多核苷酸分子。
66.一种包含选自由SEQIDNO:15、SEQIDNO:16、SEQIDNO:17、SEQIDNO:18、SEQIDNO:19、SEQIDNO:20、SEQIDNO:89、SEQIDNO:90、SEQIDNO:102、SEQIDNO:103、SEQIDNO:104、SEQIDNO:105、SEQIDNO:106、SEQIDNO:107和SEQIDNO:109所组成的组中的多核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。
67.一种包含权利要求65或权利要求66的多核苷酸的载体。
68.一种包含权利要求65或权利要求66所述的多核苷酸或权利要求67所述的载体的细胞。
69.一种包含权利要求1-61中任一项所述的双特异性试剂或抗体和药学上可接受的载体的药物组合物。
70.一种抑制肿瘤生长的方法，其中所述方法包括使肿瘤与有效量的权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体接触。
71.一种抑制受试者中肿瘤生长的的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体。
72.一种降低受试者中的肿瘤中癌症干细胞的频率的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体。
73.一种抑制受试者中肿瘤中EMT的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体。
74.一种抑制受试者中血管生成的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述血管生成是肿瘤血管生成。
76.根据权利要求70-75中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由结直肠肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤和头颈肿瘤所组成的组。
77.一种治疗受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述癌症选自由结肠直肠癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌、胃肠癌、黑色素瘤、子宫颈癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤、头颈部癌、淋巴瘤和白血病。
79.根据权利要求79-78中任一项所述的方法，其进一步包括施用至少一种另外的治疗剂。
80.根据权利要求79所述的方法，其中所述另外的治疗剂是化疗剂。
81.根据权利要求79所述的方法，其中所述另外的治疗剂是第二抗体。
82.根据权利要求70或72-81中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。
83.一种用于生产双特异性试剂或抗体的方法，其包括在细胞中表达权利要求65或权利要求66所述的至少一种多核苷酸。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述细胞是原核细胞或真核细胞。
85.根据权利要求83或权利要求84所述的方法，其进一步包括从细胞或细胞培养物上清液中分离所述双特异性试剂或抗体。
86.一种双特异性试剂，其包括(a)结合KD为约0.1nM至约5.0nM的人MET的第一抗原结合位点和(b)特异性结合KD为约0.1nM至约20nM的WNT通路的一个或更多个组件的第二结合位点。
87.一种药物组合物，其包含权利要求86所述的双特异性试剂和药学上可接受的载体。
88.一种治疗受试者中癌症的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的权利要求86所述的双特异性试剂。
89.一种确定利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括确定所述受试者是否有具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平的肿瘤。
90.一种确定利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括：
(a)获得来自所述受试者的肿瘤样品，以及
(b)确定肿瘤是否具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平。
91.一种确定利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括确定所述受试者是否有具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平的肿瘤，其中如果肿瘤具有升高的MET表达水平，那么所述受试者则被选择用于利用所述双特异性试剂进行治疗。
92.一种确定利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括：
(a)获得来自所述受试者的肿瘤样品，以及
(b)确定肿瘤是否具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平，
其中如果肿瘤具有升高的MET表达水平，那么所述受试者被选择利用所述双特异性试剂进行治疗。
93.一种选择利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括确定所述受试者是否有具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平的肿瘤。
94.一种选择利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括：
(a)获得来自所述受试者的肿瘤样品，以及
(b)确定肿瘤是否具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平。
95.一种选择利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括确定受试者是否有具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平的肿瘤，其中如果肿瘤具有升高的MET表达水平，那么所述受试者则被选择利用所述双特异性试剂进行治疗。
96.一种选择利用特异性结合MET并特异性结合WNT通路的一个或更多个组件的双特异性试剂治疗的人受试者的方法，其包括：
(a)获得来自所述受试者的肿瘤样品，以及
(b)确定肿瘤是否具有与参比样品或预先确定的MET水平相比较而言的升高的MET表达水平，
其中如果肿瘤具有升高的MET表达水平，那么所述受试者被选择利用所述双特异性试剂进行治疗。
97.根据权利要求89-96中任一项所述的方法，其中所述双特异性试剂是权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂。
98.根据权利要求89-97中任一项所述的方法，其中所述肿瘤选自由结直肠肿瘤、结肠肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、肺肿瘤、肝肿瘤、乳腺肿瘤、肾肿瘤、前列腺肿瘤、胃肠道肿瘤、黑色素瘤、宫颈肿瘤、膀胱肿瘤、胶质母细胞瘤和头颈肿瘤所组成的组。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述肿瘤是肺肿瘤。
100.根据权利要求98所述的方法，其中所述肿瘤是胰腺肿瘤。
101.根据权利要求89-100中任一项所述的方法，其中样品中MET的表达水平通过基于PCR的测定法、微阵列分析或免疫组织化学进行测定。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述样品是新鲜的肿瘤样品、冷冻的肿瘤样品或福尔马林固定的石蜡包埋的样品。
103.根据权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
104.一种在治疗癌症的方法中使用的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂是权利要求1-52中任一项所述的双特异性试剂或权利要求53-61中任一项所述的抗体。
105.一种特异性结合人MET的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体结合人MET的Sema结构域。
106.根据权利要求105所述的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体结合人MET的Sema结构域的α链。
107.根据权利要求105所述的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体结合包含氨基酸PCQDC(SEQIDNO:113)的表位。
108.根据权利要求105所述的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体结合包含人MET的氨基酸97-101(SEQIDNO:93)的表位。
109.根据权利要求105所述的双特异性试剂或抗体，其中所述双特异性试剂或抗体结合包含对应于SEQIDNO:93的99位的谷氨酰胺的表位。
110.一种特异性结合人MET和至少一种WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂包括：
(a)包括SEQIDNO:94的重链可变区；
(b)包括SEQIDNO:95的轻链可变区；以及
(c)包括SEQIDNO:28或SEQIDNO:29的可溶性受体。
111.一种特异性结合人MET和至少一种WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂包括：
(a)包括SEQIDNO:112或SEQIDNO:111的重链；
(b)包括SEQIDNO:101的轻链；以及
(c)包括SEQIDNO:56的可溶性受体。
112.一种特异性结合人MET和至少一种WNT蛋白的双特异性试剂，其中所述双特异性试剂包括：
(a)由保藏于ATCC的指定编号为PTA-120695的质粒编码的重链；
(b)由保藏于ATCC的指定编号为PTA-120388的质粒编码的轻链；以及
(c)由保藏于ATCC的指定编号为PTA-13611的质粒编码的可溶性受体。
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