CN102378768A

CN102378768A - 双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体

Info

Publication number: CN102378768A
Application number: CN2010800150723A
Authority: CN
Inventors: 比吉特·博森梅尔; 乌尔里希·布林克曼; 维尔马·劳; 埃克·霍夫曼; 克里斯蒂安·克莱因; 格哈德·尼德费尔纳; 于尔根·迈克尔·尚策; 扬·奥拉夫·斯特拉克; 克劳迪奥·祖斯特曼; 巴勃罗·乌马纳
Original assignee: Roche Glycart AG
Current assignee: Roche Glycart AG
Priority date: 2009-04-07
Filing date: 2010-03-30
Publication date: 2012-03-14
Also published as: US20140135482A1; US20100256339A1; JP2012522524A; TW201039851A; BRPI1012589A2; AU2010233994A1; IL215062A0; PE20120550A1; CA2757531A1; EP2417159A1; AU2010233994A8; KR20110124369A; RU2011144312A; AR076196A1; SG175081A1; MX2011010166A; JP5587975B2; WO2010115552A1; ECSP11011387A; CL2011002482A1

Abstract

本发明涉及针对人ErbB-3和针对人c-Met的双特异性抗体，制备它们的方法，含有所述抗体的药物组合物，及其用途。

Description

双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体

本发明涉及针对人ErbB-3和针对人c-Met的双特异性抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其用途。

发明背景

ErbB蛋白质家族

ErbB蛋白质家族由4个成员组成：ErbB-1，也称为表皮生长因子受体(EGFR)，ErbB-2，在人中也称为HER2和在啮齿动物中也称为neu，ErbB-3，也称为HER3，和ErbB-4，也称为HER4。

ErbB-3和抗-ErbB-3抗体

ErbB-3(也已知为V-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3(禽类)，ERBB3，HER3；SEQ ID NO：46)是膜结合蛋白，其具有神经调节蛋白结合结构域但是没有活性激酶结构域(Kraus，M.H，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86(1989)9193-7；Plowman，G.D.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87(1999)4905-9；Katoh，M.，等，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)192(1993)1189-97)。因此，其可以结合该配体，但是不通过蛋白磷酸化将信号传送到细胞中。然而，其的确与确实具有激酶活性的其它EGF受体家族成员形成异二聚体。异二聚化导致引起细胞增殖或分化的途径的激活。该基因的扩增和/或其蛋白的过表达已在多种癌症中得以报道，包括前列腺肿瘤、膀胱肿瘤、和乳腺肿瘤。已经表征了编码不同同种型的可变转录剪接变体。一种同种型缺少膜间区，并且分泌到细胞外。这种形式起作用调节膜结合形式的活性(Corfas，G.，等，7(6)(2004)575-80)。认为ERBB3被活化时成为二聚化的底物并且随后被ERBB1，ERBB2和ERBB4磷酸化。与多种受体酪氨酸-激酶相似，ERBB3被细胞外配体激活。已知结合ERBB3的配体包括调蛋白。

例如，由WO 97/35885，WO 2007/077028或WO 2008/100624可知用于抗癌治疗的抗-ErbB-3抗体。

c-Met和抗-c-Met抗体

MET(间充质-上皮转变因子)是一种原癌基因，其编码蛋白质MET，(也已知为c-Met；肝细胞生长因子受体HGFR；HGF受体；分散因子受体；SF受体；SEQ ID NO：45)(Dean，M.，等，自然(Nature)318(1985)385-8(1985)；Chan，A.M.，等，癌基因(Oncogene)1(1987)229-33；Bottaro，D.P.，等，科学(Science)251(1991)802-4；Naldini，L.，等，EMBO杂志(EMBOJ.)10(1991)2867-78；Maulik，G.，等，细胞因子生长因子综述(CytokineGrowth Factor Rev.)13(2002)41-59)。MET是胚胎发育和伤口愈合必需的膜受体。肝细胞生长因子(HGF)是MET受体仅有的已知配体。MET被上皮来源的细胞正常表达，而HGF的表达局限于间充质来源的细胞。经HGF刺激，MET诱导数种生物学反应，它们共同产生已知为侵袭性生长的程序。癌症中异常的MET活化与差的预后相关，在此异常活性的MET引发肿瘤生长，形成向肿瘤供应营养素的新血管(血管生成)，以及癌症扩散到其它器官(转移)。MET在许多类型的人恶性肿瘤中下调，所述人恶性肿瘤包括肾癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和脑癌。通常，仅有干细胞和祖细胞表达MET，其允许这些细胞侵袭性生长以便在胚胎中产生新组织或在成人中再生受损伤的组织。然而，认为癌症干细胞劫持了正常干细胞表达MET的能力，因此成为癌症持续和扩散到身体中的其它部位的原因。

原癌基因MET产物是肝细胞生长因子受体并且编码酪氨酸-激酶活性。初级单链前体蛋白质被翻译后分解以产生α和β亚基，其被二硫键连接以形成成熟的受体。MET基因的多种突变与乳头状肾癌相关。

抗-c-Met抗体是已知的，例如，从US 5686292，US 7476724，WO 2004072117，WO 2004108766，WO 2005016382，WO 2005063816，WO 2006015371，WO 2006104911，WO 2007126799，或WO 2009007427中得知。

C-Met结合肽是已知的，例如，从Matzke，A.，等，癌症研究(CancerRes)2005；65：(14)和Tam，E.M，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)385(2009)79-90中得知。

双特异性抗体

最近已经开发了广泛多样的重组抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(参见例如Coloma，M.J.，等，自然生物技术(Nature Biotech)15(1997)159-163；WO 2001/077342；和Morrison，S.L.，等，自然生物技术(Nature Biotech)25(2007)1233-1234)。

此外，开发了能够结合两种以上抗原的若干其他新型形式，其中抗体核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再保持，诸如双抗体(diabodies)、三链抗体或四链抗体(tetrabodies)、微型抗体(minibodies)、若干单链形式(scFv，双-scFv)(Holliger P，等，自然生物技术(Nature Biotech)23(2005)1126-1136；Fischer，N.，和Léger，O.，病理学(Pathobiology)74(2007)3-14；Shen，J，等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)318(2007)65-74；Wu，C.，等，自然生物技术(Nature Biotech.)25(2007)1290-1297)。

所有这样的形式使用接头将抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFvs(Fischer，N.，Léger，O.，病理学(Pathobiology)74(2007)3-14)。人们一直希望可以通过保持与天然存在的抗体的高度相似性而保持效应子功能，诸如例如通过Fc受体结合介导的补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。

在WO 2007/024715中，报道了双重可变的结构域免疫球蛋白作为改造的多价和多特异性结合蛋白。在US 6,897,044中报道了用于制备生物活性的抗体二聚体的方法。在US 7,129,330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价FV抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6,511,663中报道了三价或四价单特异性抗原结合蛋白，其包含通过连接结构彼此共价结合的三个或四个Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了这样的四价双特异性抗体，其可以在原核细胞和真核细胞中有效表达，并且用于治疗和诊断方法中。在US 2005/0163782中报道了在包含两种类型的多肽二聚体的混合物中，将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报道了双特异性四价受体。在WO 2001/077342中报道了具有三个或多个功能性抗原结合位点的改造的抗体。

在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价抗原结合多肽。WO 1992/004053报道了均缀合物(homoconjugate)，其典型地由结合相同抗原决定簇的IgG类的单克隆抗体制备，其通过合成交联共价连接。在WO 1991/06305中报道了对于抗原具有高抗体亲抗原性的低聚单克隆抗体，其中分泌典型地是IgG类的低聚物，其具有缔合在一起的两种以上的免疫球蛋白单体，以形成四价或六价IgG分子。在US 6,350,860中报道了绵羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中γ干扰素活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中，报道了可靶向的构建体，所述构建体是双特异性抗体的多价载体，即可靶向的构建体的每个分子可以作为两种以上双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报道遗传改造的双特异性四价抗体。在WO 2007/109254中，报道了由稳定的scFv组成或包含稳定的scFv的稳定的结合分子。US 2007/0274985涉及包含单链Fab(scFab)片段的抗体形式。

WO2009111707(A1)涉及使用Met和HER拮抗剂的联合治疗。WO2009111691(A2A3)涉及使用Met和EGFR拮抗剂的联合治疗。

WO 2008/100624涉及具有增加的ErbB-3受体内在化的抗-ErbB-3抗体及其特别与作为第二抗原的c-Met在双特异性抗体中的应用。

发明概述

本发明第一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过15％的ErbB-3的内在化。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价或三价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个或两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的一个抗原结合位点。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体优选是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的三价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第三抗原结合位点。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的一个抗原结合位点。

本发明的一个方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，

i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：53的CDR3H区，SEQ ID NO：54的CDR2H区和SEQ ID NO：55的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：56的CDR3L区，SEQ ID NO：57的CDR2L区和SEQ ID NO：58的CDR1L区或SEQ ID NO：59的CDR1L区；和

所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：66的CDR3H区，SEQ ID NO：67的CDR2H区和SEQ ID NO：68的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：69的CDR3L区，SEQ ID NO：70的CDR2L区和SEQ ID NO：71的CDR1L区；

ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：60的CDR3H区，SEQ ID NO：61的CDR2H区和SEQ ID NO：62的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：63的CDR3L区，SEQ ID NO：64的CDR2L区和SEQ ID NO：65的CDR1L区或SEQ ID NO：66的CDR1L区；和

所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：66的CDR3H区，SEQ ID NO：67的CDR2H区和SEQ ID NO：68的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：69的CDR3L区，SEQ ID NO：70的CDR2L区和SEQ ID NO：71的CDR1L区。

所述双特异性抗体优选地特征在于，

i)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：47和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：48；和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的序列SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的序列SEQ ID NO：4；

ii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：50；和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ IDNO：4；

iii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ IDNO：49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：4；

iv)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ IDNO：49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：52，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：4；或

v)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：1和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：2，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：4；或

优选地，所述双特异性抗体特征在于

所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：4；

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体特征在于包含IgG1或IgG3亚类的恒定区。

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体特征在于所述抗体在Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链内岩藻糖的量为65％以下。

本发明另一方面是编码所述双特异性抗体的链的核酸分子。

本发明的其它方面是包含本发明所述的双特异性抗体的药物组合物，所述组合物用于治疗癌症，所述双特异性抗体用于制备用于治疗癌症的药物的应用，治疗患有癌症的患者的方法，所述方法通过给需要所述治疗的患者施用所述双特异性抗体而进行。

本发明所述的抗体表现出高度有价值的特性，如表达两种受体<ErbB3>和<c-Met>的癌细胞的生长抑制，给患有癌症的患者带来益处的抗肿瘤功效。本发明所述的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体在与它们的亲本单特异性<ErbB3>抗体相比较时，在表达这两种受体<ErbB3>和<c-Met>的癌细胞上，其表现出减少的ErbB3/抗体复合物的内在化。

发明详述

本发明的第一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过15％的ErbB-3的内在化。

因此，本发明涉及特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其中通过流式细胞术测定法测量，在A431细胞-抗体温育1小时后测量时，与不存在抗体时在A431细胞上ErbB-3的内在化相比，所述双特异性抗体引起不超过15％的A431细胞上ErbB-3的内在化的增加。

在一个实施方案中，所述特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过10％的ErbB-3的内在化。

在一个实施方案中，所述特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过7％的ErbB-3的内在化。

在一个实施方案中，所述特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在所述双特异性抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过5％的ErbB-3的内在化。

术语“ErbB-3的内在化”指与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，在A431细胞(ATCC No.CRL-1555)上的抗体-诱导的ErbB-3受体内在化。ErbB-3受体的这种内在化由本发明所述的双特异性抗体诱导，并且如在实施例8中所述，在流式细胞术测定法(FACS)中2小时后测量。与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，本发明所述的双特异性抗体在抗体暴露2小时后表现出在A431细胞上不超过15％的ErbB-3内在化。在一个实施方案中，所述抗体表现出不超过10％的ErbB-3内在化。在一个实施方案中，所述抗体表现出不超过7％的ErbB-3内在化。在一个实施方案中，所述抗体表现出不超过5％的ErbB-3内在化。为了确定双特异性ErbB3/cMet抗体在A431细胞上2小时后是否表现出10％以下的ErbB-3内在化，可以在流式细胞术测定法(FACS)中与下述双特异性ErbB3/cMet抗体MH_TvAb24进行比较。为了确定双特异性ErbB3/cMet抗体在A431细胞上2小时后是否表现出5％以下的ErbB-3内在化，可以在流式细胞术测定法(FACS)中与下述双特异性ErbB3/cMet抗体MH_TvAb29进行比较。

本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，与由(相对应的)单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3内在化相比，当在流式细胞术测定中在A431细胞(ATCC No.CRL-1555)上2小时后测量时，所述双特异性抗体将ErbB-3内在化减少50％以上(在一个实施方案中，减少60％以上；在另一个实施方案中，减少70％以上，在一个实施方案中，减少80％以上)。ErbB-3内在化的减少计算(使用在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量的值)如下：100x(由单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的％ErbB3内在化-由双特异性ErbB-3/cMet抗体诱导的％ErbB3内在化)/由单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的％ErbB3内在化。例如：a)双特异性ErbB-3/cMet抗体MH_TvAb21表现出1％的ErbB-3内在化，并且单特异性亲本ErbB-3抗体Mab 205表现出40％的ErbB-3内在化。因此，双特异性ErbB-3/cMet抗体MH_TvAb21表现出100x(40-1)/40％＝97.5％的ErbB-3内在化减少；b)双特异性ErbB-3/cMet抗体MH_TvAb25表现出11％的ErbB-3内在化，并且单特异性亲本ErbB-3抗体Mab 205表现出40％的ErbB-3内在化。因此，双特异性ErbB-3/cMet抗体MH_TvAb21表现出100x(40-11)/40％＝72.5％的ErbB-3内在化减少；或c)双特异性ErbB-3/cMet抗体HER3/Met_C6表现出11％的ErbB-3内在化，并且单特异性亲本ErbB-3抗体HER3克隆29表现出54％的ErbB-3内在化。因此，双特异性ErbB-3/cMet抗体HER3/Met_C6表现出100x(54-6)/40％＝88.9％的ErbB-3内在化减少。(参见在实施例8中在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量的内在化值)。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的三价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第三抗原结合位点。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点。

在本发明的一个实施方案中，所述抗体是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的四价、双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的两个抗原结合位点，其中所述特异性结合人c-Met的抗原结合位点抑制c-Met二聚化(如例如在WO 2009007427中所述)。

用于本文时，“抗体”指包含抗原结合位点的结合蛋白。术语“结合位点”或“抗原结合位点”用于本文时，指配体实际上结合的抗体分子的区域，所述位点源自抗体。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)或VH/VL配对，并可源自完整抗体或抗体片段如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab)2。在本发明的一个实施方案中，每个抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，和优选地由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的配对形成。

对抗体来源的抗原结合位点进一步看来，例如，Matzke，A.，等，癌症研究(Cancer Res)652005(14).2005年7月15日中所述的结合肽也可以特异性结合抗原(例如，c-Met)。因此，本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性结合分子，其包含特异性结合人ErbB-3的抗原结合位点和特异性结合人c-Met的结合肽。因此，本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性结合分子，其包含特异性结合人c-Met的抗原结合位点和特异性结合人ErbB-3的结合肽。

ErbB-3(也已知为V-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3(禽类)，ERBB3，HER3；SEQ ID NO：46)是膜结合蛋白，其具有神经调节蛋白结合结构域但是没有活性激酶结构域(Kraus，M.H，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)86(1989)9193-7；Plowman，G.D.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)87(1990)4905-9；Katoh，M.，等，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)192(1993)1189-97)。因此，其可以结合该配体，但是不通过蛋白磷酸化将信号传送到细胞中。然而，其的确与确实具有激酶活性的其它EGF受体家族成员形成异二聚体。异二聚化导致引起细胞增殖或分化的途径的激活。该基因的扩增和/或其蛋白的过表达已在多种癌症中得以报道，包括前列腺肿瘤、膀胱肿瘤、和乳腺肿瘤。已经表征了编码不同同种型的可变转录剪接变体。一种同种型缺少膜间区，并且分泌到细胞外。这种形式起作用调节膜结合形式的活性(Corfas，G.，等，7(6)(2004)575-80)。认为ERBB3被活化时成为二聚化的底物并且随后被ERBB1，ERBB2和ERBB4磷酸化。与多种受体酪氨酸-激酶相似，ERBB3被细胞外配体激活。已知结合ERBB3的配体包括调蛋白。

特异性结合人ErbB-3的抗原结合位点，且特别是重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)可以来源于：a)已知的抗-ErbB-3抗体，如例如在WO 97/35885，WO 2007/077028或WO 2008/100624中所述，b)通过使用特别是人ErbB-3蛋白或核酸或其片段的从头(de novo)免疫法或通过噬菌体展示获得的新的抗-ErbB-3抗体。

MET(间充质-上皮转变因子)是一种原癌基因，其编码蛋白质MET，(也已知为c-Met；肝细胞生长因子受体HGFR；HGF受体；分散因子受体；SF受体；SEQ ID NO：45)(Dean，M.，等，自然(Nature)318(1985)385-8；Chan，A.M.，等，癌基因(Oncogene)1(1987)229-33；Bottaro，D.P.，等，科学(Science)251(1991)802-4；Naldini，L.，等，EMBO杂志(EMBO J.)10(1991)2867-78；Maulik，G.，等，细胞因子生长因子综述(Cytokine GrowthFactor Rev.)13(2002)41-59)。MET是胚胎发育和伤口愈合必需的膜受体。肝细胞生长因子(HGF)是MET受体仅有的已知配体。MET被上皮来源的细胞正常表达，而HGF的表达局限于间充质来源的细胞。经HGF刺激，MET诱导数种生物学反应，它们共同产生已知为侵袭性生长的程序。癌症中异常的MET活化与差的预后相关，在此异常活性的MET引发肿瘤生长，形成向肿瘤供应营养素的新血管(血管生成)，以及癌症扩散到其它器官(转移)。MET在许多类型的人恶性肿瘤中下调，所述人恶性肿瘤包括肾癌、肝癌、胃癌、乳腺癌和脑癌。通常，仅有干细胞和祖细胞表达MET，其允许这些细胞侵袭性生长以便在胚胎中产生新组织或在成人中再生受损伤的组织。然而，认为癌症干细胞劫持了正常干细胞表达MET的能力，因此成为癌症持续和扩散到身体中的其它部位的原因。

特异性结合人c-Met的抗原结合位点，且特别是重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，可以来源于：a)已知的抗-c-Met抗体，如例如在US 5686292，US 7476724，WO 2004072117，WO 2004108766，WO 2005016382，WO 2005063816，WO 2006015371，WO 2006104911，WO 2007126799，或WO 2009007427中所述的抗体，b)例如通过使用特别是人抗-c-Met蛋白或核酸或其片段的从头免疫法或通过噬菌体展示获得的新的抗-c-Met抗体。

本发明的另一个方面是选择本发明所述的双特异性抗体的方法，其包括下述步骤：

a)与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，在流式细胞术测定(FACS)中2小时后，测量由双特异性抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体诱导的A431细胞(ATCC No.CRL-1555)上的ErbB-3内在化，

b)在不存在抗体时，在流式细胞术测定(FACS)中测量A431细胞(ATCC No.CRL-1555)上的ErbB-3内在化，

c)选择与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比，在抗体暴露2小时后在A431细胞上表现出不超过15％的ErbB-3内在化的双特异性抗体。

在一个实施方案中，选择表现出不超过10％的ErbB-3内在化的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择表现出不超过7％的ErbB-3内在化的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择表现出不超过5％的ErbB-3内在化的双特异性抗体。

b)在流式细胞术测定(FACS)中2小时后测量由相对应的单特异性抗-ErbB-3抗体诱导的A431细胞(ATCC No.CRL-1555)上的ErbB-3内在化，

c)选择与由相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3的内在化相比，(在A431细胞上2小时后)将ErbB-3内在化减少50％以上的双特异性抗体。

在一个实施方案中，选择与相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3的内在化相比，将ErbB-3内在化减少60％以上的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择与相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3的内在化相比，将ErbB-3内在化减少70％以上的双特异性抗体。在一个实施方案中，选择与相对应的单特异性亲本ErbB-3抗体诱导的ErbB-3的内在化相比，将ErbB-3内在化减少80％以上的双特异性抗体。

本发明的另一方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，

i)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：53的CDR3H区，SEQ ID NO：54的CDR2H区和SEQ ID NO：55的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：56的CDR3L区，SEQ ID NO：57的CDR2L区和SEQ ID NO：58的CDR1L区或SEQ ID NO：59的CDR1L区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：66的CDR3H区，SEQ ID NO：67的CDR2H区和SEQ ID NO：68的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：69的CDR3L区，SEQ ID NO：70的CDR2L区和SEQ ID NO：71的CDR1L区；

ii)所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：60的CDR3H区，SEQ ID NO：61的CDR2H区和SEQ ID NO：62的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：63的CDR3L区，SEQ ID NO：64的CDR2L区和SEQ ID NO：65的CDR1L区或SEQ ID NO：66的CDR1L区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：66的CDR3H区，SEQ ID NO：67的CDR2H区和SEQ ID NO：68的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：69的CDR3L区，SEQ ID NO：70的CDR2L区和SEQ ID NO：71的CDR1L区。

本发明的另一个方面是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于

所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：53的CDR3H区，SEQ ID NO：54的CDR2H区和SEQ ID NO：55的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：56的CDR3L区，SEQ ID NO：57的CDR2L区和SEQ ID NO：58的CDR1L区或SEQ ID NO：59的CDR1L区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：66的CDR3H区，SEQ ID NO：67的CDR2H区和SEQ ID NO：68的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：69的CDR3L区，SEQ ID NO：70的CDR2L区和SEQ ID NO：71的CDR1L区。

所述第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：60的CDR3H区，SEQ ID NO：61的CDR2H区和SEQ ID NO：62的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：63的CDR3L区，SEQ ID NO：64的CDR2L 区和SEQ ID NO：65的CDR1L区或SEQ ID NO：66的CDR1L区；和所述第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：66的CDR3H区，SEQ ID NO：67的CDR2H区和SEQ ID NO：68的CDR1H区，和在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：69的CDR3L区，SEQ ID NO：70的CDR2L区和SEQ ID NO：71的CDR1L区。

所述双特异性抗体优选地特征在于

i)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：47和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：48，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ IDNO：4；

ii)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：50，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ IDNO：4；

优选地，所述双特异性抗体特征在于

所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：49和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：51，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：4。

抗体特异性指抗体对于抗原特定表位的选择性识别。例如，天然抗体是单特异性的。根据本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如果抗体具有超过一种的特异性，识别的表位可以与单抗原或多于一种的抗原相关。本发明的抗体特异于两种不同的抗原，即作为第一抗原的ErbB-3和作为第二抗原的c-Met。

用于本文时，术语“单特异性”抗体指具有一个或多个分别结合于相同抗原的相同表位的结合位点的抗体。

术语“价”在本申请中使用时指在抗体分子上存在的结合位点的具体数量。因此，术语“二价”、“四价”、和“六价”分别指在抗体分子上存在两个结合位点、四个结合位点、和六个结合位点。本发明所述的双特异性抗体是至少“二价的”，并且可以是“三价”或“多价”的(例如(“四价”或六价)的)。

本发明的抗体的抗原结合位点可包含六个互补性决定区(CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDRs(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDRs(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。此外，还包括在本发明范围内的是包含更少CDRs的功能性抗原结合位点(即，在结合特异性由三个、四个或五个CDRs决定的情形中)。例如，少于6个CDRs的完整组对于结合可能是足够的。在一些情形中，VH或VL结构域是足够的。

如例如，在EP申请号07024867.9，EP申请号07024864.6，EP申请号07024865.3或Ridgway，J.B.，蛋白质工程(Protein Eng.)9(1996)617-621；WO 96/027011；Merchant，A.M，等，自然生物技术(NatureBiotech)16(1998)677-681；Atwell，S.，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)270(1997)26-35和EP 1870459A1中所述，可以使用针对人ErbB-3和人c-Met的包含免疫球蛋白恒定区的IgG样双特异性、二价抗体。

术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。

术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生本发明所述的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。也将这种嵌合抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81(1984)6851-6855；US 5,202,238和US5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与亲本免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见，例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生本发明所述的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的特性。

用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，当前化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见，例如Jakobovits，A.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等，Nature(自然)362(1993)255-258；Brüggemann，M.D.，等，Year Immunol.(免疫学年度)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole，A.，等和Boerner，P.，等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，A.，等，Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Liss，A.L.，p.77(1985)；和Boerner，P.，等，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对本发明所述的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生本发明所述的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合的特性，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变)进行。

用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。本发明所述的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，所述序列尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中。

“可变结构域”(轻链的可变结构域(VL)，重链的可变区(VH))用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDRs可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDRs通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDRs一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在本发明所述的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。

用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分或抗原结合位点”指抗体负责抗原结合的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDRs通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，公众健康服务，全国卫生研究所(PublicHealth Service，National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991))的标准定义来确定CDR和FR区域。

用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在使用纯化的野生型抗原的等离振子共振测定(BIAcore，GE-HealthcareUppsala，瑞典)中，抗体与抗原(人ErbB-3或人c-Met)的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。结合或特异性结合意为10^-8mol/l以下，优选地10^-9M到10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。因此，本发明所述的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体特异性结合每种抗原，对于每种抗原其是特异性的，具有10^-8mol/l以下，优选地10^-9M到10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。抗体与FcγRIII的结合可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare，Uppsala，瑞典)进行研究。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D (解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和或特定的带电特征。表位是被抗体结合的抗原区域。

在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。

术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总和。恒定区不直接参与抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为亚类，如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为κ(kappa)和λ(lambda)。

术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区域。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由Kabat，E.A.，描述(见，例如Johnson，G.和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)72(1975)2785-2788)。

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体包含IgG1或IgG3亚类(优选IgG1亚类)的恒定区，其优选地来自人来源。在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体包含IgG1或IgG3亚类(优选IgG1亚类)的Fc部分，其优选地来自人来源。

抗体的恒定区直接参与ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。C1q与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas，T.J.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917；Burton，D.R.，等，自然(Nature)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等，分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等，病毒学杂志(J.Virol.)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；和EP 0307434所描述。例如，所述恒定区结合位点特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。

术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)”指在存在效应细胞时，由本发明所述的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用本发明所述的抗体在存在效应细胞时处理表达ErbB3和c-Met的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始的过程。C1q与抗体的结合由在所谓的结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。例如，这些Fc部分结合位点特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1，IgG2，和IgG3的抗体通常显示包括C1q和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统并且不结合C1q和/或C3。

单克隆抗体的细胞介导的效应子功能可以通过改造它们的寡糖成分而得以增强，如在Umana，P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17(1999)176-180，和US 6,602,684中所述。IgG1型抗体是最常用的治疗性抗体，其是在每个CH2结构域的Asn297处具有保守的N-连接的糖基化位点的糖蛋白。与Asn297附着的两个复合双分支(biantennary)寡糖包埋在CH2结构域之间，形成了与多肽主链的广泛接触，并且它们的存在对于抗体介导效应子功能诸如抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)是必要的(Lifely，M.R.，等，糖生物学(Glycobiology)5(1995)813-822；Jefferis，R.，等，免疫学综述(Immunol Rev.)163(1998)59-76；Wright，A.，和Morrison，S.L.，生物技术趋势(Trends Biotechnol.)15(1997)26-32)。Umana，P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17(1999)176-180和WO 99/54342显示，β(1，4)-N-乙酰葡糖胺转移酶III(“GnTIII”)，一种催化平分型(bisected)寡糖形成的糖基转移酶，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的过量表达，显著增加了抗体的体外ADCC活性。在Asn297糖的组成上的改变或其消除也影响FcγR和C1q的结合(Umana，P.，等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)17(1999)176-180；Davies，J.，等，生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)74(2001)288-294；Mimura，Y.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)45539-45547；Radaev，S.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)16478-16483；Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604；Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277(2002)26733-26740；Simmons，L.C.，等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)263(2002)133-147)。

通过降低岩藻糖的量增强单克隆抗体的细胞介导的效应子功能的方法例如记述在WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2004/065540，WO 2005/011735，WO 2005/027966，WO 1997/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835，WO 2000/061739，Niwa，R.，等，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)306(2005)151-160；Shinkawa，T.，等，生物化学杂志(J Biol Chem)，278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722中。

令人吃惊地，本发明所述的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体与其亲本<ErbB3>和/或<c-Met>抗体相比表现出ErbB-3受体内在化的强烈减少。(见图18，实施例8和表格)。因此，在本发明的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体是在Asn297处用糖链糖基化的(IgG1或IgG3亚类)，其中在所述糖链中的岩藻糖的量是65％以下(根据Kabat的编号)。在另一个实施方案中，在所述糖链中的岩藻糖量在5％-65％，优选地20％-40％。根据本发明所述的“Asn297”意为在Fc区域中位于约位置297的氨基酸天冬酰胺。基于抗体的微小序列变化，Asn297也可以在定位在位置297上游或下游的一些氨基酸上(通常不超过±3个氨基酸)，即在位置294-300之间。所述糖改造的抗体在本文中也称为异常岩藻糖基化的抗体。

人IgG1或IgG3在Asn297发生糖基化，该糖基化作为核心岩藻糖基化的双分支复合寡糖糖基化，末端为多至两个Gal残基。IgG1或IgG3亚类的人恒定重链区由Kabat，E.A.，等，免疫目的蛋白序列(Sequences ofProteins of Immunological Interest)，第5版.公众健康服务(Public HealthService)，全国卫生研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991)，和由Brüggemann，M.，等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)166(1987)1351-1361；Love，T.W.，等，酶学方法(Methods Enzymol.)178(1989)515-527中详细报道。根据末端Gal残基的量，将这些结构称为G0，G1(α-1，6-或α-1，3-)，或G2聚糖残基(Raju，T.S.，Bioprocess Int.1(2003)44-53)。例如，抗体Fc部分的CHO型糖基化由Routier，F.H.，糖缀合物杂志(Glycoconjugate J.)14(1997)201-207描述。在未进行糖修饰的CHO宿主细胞中重组表达的抗体通常以至少85％的量在Asn297进行岩藻糖基化。全长亲本抗体的修饰的寡糖可以是杂合型的或复合型的。优选地，所述平分型的、减少的/未-岩藻糖基化的寡糖是杂合型的。在另一个实施方案中，所述平分型的、减少的/未-岩藻糖基化的寡糖是复合型的。

根据本发明，“岩藻糖的量”意为与在Asn297附着的所有糖结构的总和(例如，复合型、杂合型和高甘露糖型结构)相比的在Asn297的糖链中所述糖的量，所述糖的量通过MALDI-TOF质谱测量并且计算为平均值。岩藻糖的相对量是包含岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理的样品中由MALDI-TOF鉴定的所有糖结构(例如，分别为复合型、杂合型和低聚-与高甘露糖型结构)的百分比(关于确定岩藻糖量的详细步骤，见实施例14)。

本发明所述的异常岩藻糖基化双特异性抗体可以在糖修饰的宿主细胞中表达，所述糖修饰的宿主细胞被改造以足以部分岩藻糖基化Fc区中的寡糖的量表达至少一种编码具有GnTIII活性的多肽的核酸。在一个实施方案中，所述具有GnTIII活性的多肽是融合多肽。备选地，根据US 6,946,292，宿主细胞的α1，6-岩藻糖基转移酶活性可以减少或消除，从而产生糖修饰的宿主细胞。抗体岩藻糖基化的量可以预先确定，例如，通过发酵条件(例如，发酵时间)或通过组合至少两种具有不同岩藻糖基化量的抗体预先确定。所述异常岩藻糖基化的抗体和各自的糖改造方法记述在WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO 2007/031875，Umana，P.，等，Nature Biotechnol.(自然生物技术)17(1999)176-180，WO 99/154342，WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2005/011735，WO 2005/027966，WO 97/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835，WO 2000/061739中。这些糖改造的抗体具有提高的ADCC。产生本发明所述的异常岩藻糖基化的抗体的其它糖改造法例如记述在Niwa，R.，等，J.Immunol.Methods(免疫学方法杂志)306(2005)151-160；Shinkawa，T.，等，J Biol Chem(生物化学杂志)，278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722中。

一个实施方案是制备IgG1或IgG3亚类的双特异性抗体的方法，所述抗体在Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链中的岩藻糖的量为65％以下，该方法使用在WO 2005/044859，WO 2004/065540，WO 2007/031875，Umana，P.，等，Nature Biotechnol.(自然生物技术)17(1999)176-180，WO 99/154342，WO 2005/018572，WO 2006/116260，WO 2006/114700，WO 2005/011735，WO 2005/027966，WO 97/028267，US 2006/0134709，US 2005/0054048，US 2005/0152894，WO 2003/035835或WO 2000/061739中描述的程序。

一个实施方案是制备IgG1或IgG3亚类的双特异性抗体的方法，所述抗体在Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链中的岩藻糖的量为65％以下，该方法使用在Niwa，R.，等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)306(2005)151-160；Shinkawa，T.，等，生物化学杂志(J Biol Chem)，278(2003)3466-3473；WO 03/055993或US 2005/0249722中描述的程序。

在一个实施方案中，本发明所述的抗体在A549细胞中抑制HGF-诱导的c-Met受体磷酸化(见实施例2中所述)。

在一个实施方案中，本发明所述的抗体在MCF7细胞中以1μg/ml的浓度抑制HRG(Herregulin)-诱导的Her3受体磷酸化至少70％(如在实施例3中所述)(与作为对照的HRG相比)。

在一个实施方案中，本发明所述的抗体以12,5μg/ml的浓度抑制HGF-诱导的HUVEC细胞增殖至少40％(如在实施例4中所述)(与作为对照的单独的HGF相比)。

双特异性抗体形式

本发明的抗体具有两个以上的结合位点，并且是双特异性的。即，即使是在存在多于两个结合位点(即，抗体是三价或多价的)的情形中，所述抗体可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括，例如多价单链抗体、双抗体和三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，另外的抗原结合位点(例如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域，Fab，或(Fab)2)通过一个或多个肽接头连接所述全长抗体的恒定结构域结构。所述抗体可以是来自单一物种的全长抗体，或可以是嵌合化或人源化的。对于具有超过两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要所述蛋白具有对于两个不同抗原的结合位点。即，当第一结合位点特异于ErbB-3时，第二结合位点特异于c-Met，反之亦然。

在一个优选的实施方案中，根据本发明的特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体包含抗体的Fc区。所述抗体保留特性这意味着在一个实施方案中全长的

二价双特异性形式

针对人ErbB-3和人c-Met的包含免疫球蛋白恒定区的双特异性、二价抗体可如，例如WO 2009/080251，WO 2009/080252，WO 2009/080253或Ridgway，J.B.，蛋白质工程(Protein Eng.)9(1996)617-621；WO 96/027011；Merchant，A.M.，等，自然生物技术(Nature Biotech)16(1998)677-681；Atwell，S.，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)270(1997)26-35和EP 1870459A1中的描述进行使用。

因此在本发明的一个实施方案中，本发明所述的双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体是二价、双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合人ErbB-3的全长抗体的轻链和重链；和

b)特异性结合人c-Met的全长抗体的轻链和重链，

其中恒定结构域CL和CH1、和/或可变结构域VL和VH被相互替换。

在本发明的另一个实施方案中，本发明所述的双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体是二价、双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合人c-Met的全长抗体的轻链和重链；和

b)特异性结合人ErbB-3的全长抗体的轻链和重链，

其中恒定结构域CL和CH1、和/或可变结构域VL和VH被相互替换。

对于如下所述的“凸起-进入-孔洞(knob-into-holes)”技术的示例性图解结构，参见图2a-c。

为了提高这种异二聚体的二价的、双特异性的抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体的产量，所述全长抗体的CH3结构域可以通过“凸起-进入-孔洞”技术改变，该技术用例如WO 96/027011，Ridgway J.B.，等，Protein Eng(蛋白质工程)9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等，Nat Biotechnol(自然生物技术)16(1998)677-681中的若干实例详细记述。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面，以增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域之一可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。二硫键的引入稳定该异二聚体(Merchant，A.M，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell，S.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)并增加产率。

因此，在本发明的一个方面，所述二价双特异性抗体进一步特征在于：

一条重链的CH3结构域和另一条重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接；

其中改变所述界面以促进二价双特异性抗体的形成，其中所述改变的特征在于：

a)改变一条重链的CH3结构域，

由此，在与二价双特异性抗体内的另一条重链的CH3结构域的初始界面相接的一条重链的CH3结构域的初始界面内，

氨基酸残基被替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基，由此在一条重链的CH3结构域的界面内生成突起，该突起可以定位在另一条重链的CH3结构域的界面内的凹洞中；

并且

b)改变另一条重链的CH3结构域，

由此，在与二价双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接的第二CH3结构域的初始界面内，

氨基酸残基被替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基，由此在第二CH3结构域的界面内生成凹洞，第一CH3结构域的界面内的突起可以定位在该凹洞中。

优选地，所述具有较大侧链体积的氨基酸残基选自由精氨酸(R)，苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)组成的组。

优选地，所述具有较小侧链体积的氨基酸残基选自由丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，缬氨酸(V)组成的组。

在本发明的一个方面中，通过引入半胱氨酸(C)作为每个CH3结构域相应位置处的氨基酸，进一步改变这两个CH3结构域，从而可以形成两个CH3结构域之间的二硫键。

在优选实施方案中，所述二价双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变。还可以使用在CH3结构域之间的另外的链间二硫键(Merchant，A.M.，等，自然生物技术(Nature Biotech)16(1998)677-681)，例如，通过向“凸起链”CH3结构域中引入Y349C突变和向“孔洞链”CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。因此，在另一个优选的实施方案中，所述二价双特异性抗体在两个CH3结构域中的一个中包含Y349C，T366W突变，在这两个CH3结构域中的另一个中包含E356C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述二价双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的Y349C突变与在另一个CH3结构域中的另外的E356C或S354C突变形成链间二硫键)(总是根据Kabat的EU索引编号)。但是，也可以备选或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技术。所述二价、双特异性抗体的优选实例是在“凸起链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K；E357K突变(总是根据Kabat的EU索引编号)。

在另一个优选的实施方案中，所述二价、双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。

在另一个优选的实施方案中，所述二价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变，或者所述二价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。

表达和纯化的以表5和图7所述的形式存在的二价双特异性抗体的实例记述在下述实施例中(例如，见表5和图7)。

三价双特异性形式

本发明的另一个优选方面是三价、双特异性抗体，其包含：

a)特异性结合人ErbB-3并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成的全长抗体；和

b)特异性结合人c-Met的一个单链Fab片段，

其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端融合到所述全长抗体。

对于如下所述的“凸起-进入-孔洞”技术的示例性图解结构，参见图5a。

本发明的另一个优选方面是三价、双特异性抗体，其包含：

b)特异性结合人c-Met的一个单链Fv片段，

其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端融合到所述全长抗体。

对于如下所述的“凸起-进入-孔洞”技术的示例性图解结构，参见图5b。

因此，表达并纯化具有表1中的scFv-Ab-命名的相对应的三价、双特异性抗体(见下述实施例)。

在一个优选的实施方案中，所述结合人c-Met的单链Fab或Fv片段通过肽连接体在所述全长抗体的重链的C-末端融合到所述全长抗体。

本发明的另一个优选方面是三价、双特异性抗体，其包含：

b)由下述组成的多肽：

ba)抗体重链可变结构域(VH)；或

bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，

其中所述多肽的VH结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的一条重链的C端；

c)由下述组成的多肽：

ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或

cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；

其中所述多肽的VL结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条重链的C端；

并且其中b)中所述多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)中所述多肽的抗体轻链可变结构域(VL)一起形成特异性结合人c-Met的抗原结合位点。

优选地，b)和c)中所述的肽连接体是相同的，并且是至少25个氨基酸的肽，优选在30和50个氨基酸之间的肽。

对于示例性图解结构参见图3a-c。

因此，表达并纯化具有表4中的VHVL-Ab-命名的相对应的三价、双特异性抗体(见下述实施例和图3c)。

任选地，b)中所述多肽的抗体重链可变结构域(VH)和c)中所述多肽的抗体轻链可变结构域(VL)通过链间二硫键连接并得以稳定，所述链间二硫键通过在下述位置之间引入二硫键形成：

i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，

ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat的EU索引编号)。

例如，引入用于稳定的非天然二硫键的技术记述在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，蛋白质工程(Prot.Engin.)(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等，核医学和生物学(Nuclear Medicine & Biology)Vol.25，(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，癌基因(Oncogene)(1999)18，1711-1721中。在一个实施方案中，在b)和c)中所述多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，在b)和c)中所述多肽的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间。(总是根据Kabat的EU索引编号)在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间没有所述任选的二硫化物稳定的三价、双特异性抗体。

通过将单链Fab、Fv片段融合到一条重链上(图5a或5b)或通过将不同多肽融合到全长抗体的两条重链上(图3a-c)，产生异二聚化的、三价双特异性抗体。为了提高这种异二聚化的三价的、双特异性的抗-ErbB-3/抗-c-Met抗体的产量，所述全长抗体的CH3结构域可以通过“凸起-进入-孔洞”技术改变，该技术用例如WO 96/027011，Ridgway J.B.，等，ProteinEng(蛋白质工程)9(1996)617-621；和Merchant，A.M.，等，Nat Biotechnol(自然生物技术)16(1998)677-681中的若干实例详细记述。在该方法中，改变两个CH3结构域的相互作用表面，以增加包含这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域之一可以是“凸起”，而另一个是“孔洞”。二硫键的引入稳定该异二聚体(Merchant，A.M，等，Nature Biotech(自然生物技术)16(1998)677-681；Atwell，S.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)270(1997)26-35)并增加产率。

因此，在本发明的一个方面，所述三价双特异性抗体进一步特征在于：

全长抗体的一条重链的CH3结构域和该全长抗体的另一条重链的CH3结构域分别在包括抗体CH3结构域之间的初始界面的界面处相接；

a)改变一条重链的CH3结构域，

并且

b)改变另一条重链的CH3结构域，

由此，在与三价双特异性抗体内的第一CH3结构域的初始界面相接的第二CH3结构域的初始界面内，

在优选实施方案中，所述三价双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变。还可以使用在CH3结构域之间的另外的链间二硫键(Merchant，A.M.，等，自然生物技术(Nature Biotech)16(1998)677-681)，例如，通过向“凸起链”CH3结构域中引入Y349C突变和向“孔洞链”CH3结构域中引入E356C突变或S354C突变。因此，在另一个优选的实施方案中，所述三价双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的E356C，T366S，L368A，Y407V突变，或所述三价双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变(在一个CH3结构域中的另外的Y349C突变与在另一个CH3结构域中的另外的E356C或S354C突变形成链间二硫键)(总是根据Kabat的EU索引编号)。但是，也可以备选或者另外地使用EP 1870459A1所述的其它凸起-入-孔洞技术。所述三价、双特异性抗体的优选实例是在“凸起链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K；E357K突变(总是根据Kabat的EU索引编号)。

在另一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的T366W突变和在“孔洞链”CH3结构域中的T366S，L368A，Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。

在另一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变，或者所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C，T366S，L368A，Y407V突变，并且额外地，包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。

本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成：

aa)两个抗体重链，其在N-端至C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和

ab)两个抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)(VL-CL)组成；和

b)一个特异性结合人c-Met的单链Fab片段，

其中所述单链Fab片段由抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成，并且其中所述抗体结构域和所述接头在N-端至C-端方向具有下述顺序之一：

ba)VH-CH1-接头-VL-CL，或bb)VL-CL-接头-VH-CH1；

其中所述接头是至少30个氨基酸的肽，优选在32和50个氨基酸残基之间的肽；

并且其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端(优选重链的C-末端)融合到所述全长抗体；

其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选在10和50个氨基酸之间的肽。

在这一实施方案中，优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的T366S，L368A，Y407V突变，并且更优选地，所述三价、双特异性抗体包含在两个CH3结构域中的一个中的Y349C，T366W突变和在这两个CH3结构域中的另一个中的S354C(或E356C)，T366S，L368A，Y407V突变。任选地，在所述实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含在“凸起链”CH3结构域中的R409D；K370E突变和在“孔洞链”CH3结构域中的D399K；E357K突变。

本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成：

b)一个特异性结合人c-Met的单链Fv片段，

其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端(优选重链的C-末端)融合到所述全长抗体；

因此，优选的实施方案是三价、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成：

b)一个特异性结合人c-Met的单链Fv片段，

其中b)中所述单链Fv片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链的C-末端融合到所述全长抗体(产生两抗体重链-单链Fv融合肽)；和

其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：26的多肽作为第一抗体重链-单链Fv融合肽，SEQ ID NO：27的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：28。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：29的多肽作为第一抗体重链-单链Fv融合肽，SEQ ID NO：30的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：31。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：32的多肽作为第一抗体重链-单链Fv融合肽，SEQ ID NO：33的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：34。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：35的多肽作为第一抗体重链-单链Fv融合肽，SEQ ID NO：36的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：37。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：38的多肽作为第一抗体重链-单链Fv融合肽，SEQ ID NO：39的多肽作为第二抗体重链-单链Fv融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：40。

本发明的另一个实施方案是三价、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成：

ab)两个抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成；和

b)由下述组成的多肽：

ba)抗体重链可变结构域(VH)；或

bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，

其中所述多肽的VH结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的一条重链的C端(产生抗体重链-VH融合肽)，其中所述肽连接体是至少5个氨基酸的肽，优选在25和50个氨基酸之间的肽；

c)由下述组成的多肽：

ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或

cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；

其中所述多肽的VL结构域N端通过肽连接体融合到所述全长抗体的两条重链中的另一条重链的C端(产生抗体重链-VL融合肽)；

其中所述肽连接体与b)中所述肽连接体相同；

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：11的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO：12的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：13。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：14的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO：15的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：16。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：17的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO：18的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：19。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：20的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO：21的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：22。

在一个优选的实施方案中，所述三价、双特异性抗体包含SEQ IDNO：23的多肽作为抗体重链-VH融合肽，SEQ ID NO：24的多肽作为抗体重链-VL融合肽，和两个抗体轻链SEQ ID NO：25。

在本发明的另一个方面中，本发明所述的三价、双特异性抗体包含：

a)结合人ErbB-3的全长抗体，其由两个抗体重链VH-CH1-HR-CH2-CH3和两个抗体轻链VL-CL组成；

(其中优选地，两个CH3结构域中的一个包含Y349C，T366W突变，并且这两个CH3结构域中的另一个包含S354C(或E356C)，T366S，L368A，Y407V突变)；

b)由下述组成的多肽：

ba)抗体重链可变结构域(VH)；或

bb)抗体重链可变结构域(VH)和抗体恒定结构域1(CH1)，

c)由下述组成的多肽：

ca)抗体轻链可变结构域(VL)，或

cb)抗体轻链可变结构域(VL)和抗体轻链恒定结构域(CL)；

四价双特异性形式

在一个实施方案中，本发明所述的双特异性抗体是四价的，其中特异性结合人c-Met的抗原结合位点抑制c-Met二聚化(例如，如在WO 2009/007427中所述)。

因此，本发明的另一个优选方面是四价、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成；和

b)特异性结合人c-Met的两个相同的单链Fab片段，

因此，本发明的另一个方面是四价、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合人c-Met并且由两个抗体重链和两个抗体轻链组成；和

b)特异性结合人ErbB-3的两个相同的单链Fab片段，

对于示例性图解结构，参见图6a。

b)特异性结合人c-Met的两个相同的单链Fv片段，

b)特异性结合人ErbB-3的两个相同的单链Fv片段，

对于示例性图解结构，参见图6b。

在一个优选的实施方案中，所述结合人c-Met或人ErbB-3的单链Fab或Fv片段通过肽连接体在所述全长抗体的重链的C-端融合到所述全长抗体。

本发明的另一个实施方案是四价、双特异性抗体，其包含：

a)全长抗体，其特异性结合人ErbB-3并且由下述组成：

aa)两个相同的抗体重链，其在N-端至C-端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成；和

ab)两个相同的抗体轻链，其在N-端至C-端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)(VL-CL)组成；和

b)特异性结合人c-Met的两个单链Fab片段，

ba)VH-CH1-接头-VL-CL，或bb)VL-CL-接头-VH-CH1；

并且其中b)中所述单链Fab片段通过肽连接体在a)中所述全长抗体的重链或轻链的C-或N-末端融合到所述全长抗体；

当用在三价或四价形式中时，术语“全长抗体”指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体(见图1)。“全长抗体重链”是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。优选地，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE。根据本发明所述的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。根据本发明所述的全长抗体包含分别由VH和VL配对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点都特异性结合于相同的抗原。所述全长抗体的重链或轻链的C端指在所述重链或轻链的C端的最后的氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端指在所述重链或轻链的N端的最后的氨基酸。

术语“肽连接体”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。这些本发明所述的肽连接体用于将单链Fab片段融合到全长抗体的C-或N-端，以形成本发明所述的多特异性抗体。优选地，b)中所述肽连接体是具有长度为至少5个氨基酸的氨基酸序列的肽，优选长度为5-100个、更优选长度为10-50个氨基酸的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝3，4，5或6，且m＝0，1，2或3)或(x＝4，n＝2，3，4或5且m＝0，1，2或3)，优选地x＝4且n＝2或3，更优选地x＝4，n＝2。优选地，在三价、双特异性抗体中，其中VH或VH-CH1多肽和VL或VL-CL多肽(图7a-c)通过两个相同的肽连接体融合到全长抗体的C-端，所述肽连接体是至少25个氨基酸的肽，优选是30-50个氨基酸的肽，并且更优选地，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，且(x＝3，n＝6，7或8，且m＝0，1，2或3)或(x＝4，n＝5，6，或7且m＝0，1，2或3)，优选x＝4且n＝5，6，7。

“单链Fab片段”(见图2a)是由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定结构域1(CH1)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头从N端到C端方向具有下列顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；并且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽，优选地32-50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL，通过在CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定。术语“N-端”指N-端的最后的氨基酸。术语“C-端”指C-端的最后的氨基酸。

术语“接头”在本发明中与单链Fab片段联系使用，并且指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。将本发明所述的这些肽用于连接a)VH-CH1与VL-CL，b)VL-CL与VH-CH1，c)VH-CL与VL-CH1或d)VL-CH1与VH-CL，从而形成下列本发明所述的单链Fab片段：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。在所述单链Fab片段中的所述接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列，优选地具有32-50个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8，9或10和m＝0，1，2或3)或(x＝4和n＝6，7或8和m＝0，1，2或3)，优选地其中x＝4，n＝6或7和m＝0，1，2或3，更优选地x＝4，n＝7和m＝2。在一个实施方案中，所述接头是(G₄S)₆G₂。

在一个优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头在N-端至C-端方向具有下述顺序之一：

a)VH-CH1-接头-VL-CL，或b)VL-CL-接头-VH-CH1，更优选地VL-CL-接头-VH-CH1。

在另一个优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头在N-端至C-端方向具有下述顺序之一：

a)VH-CL-接头-VL-CH1或b)VL-CH1-接头-VH-CL。

任选地，在所述单链Fab片段中，除了在CL-结构域和CH1结构域之间的天然二硫键之外，还通过在下列位置之间引入二硫键来对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)进行二硫化物稳定：

i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，

ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或

单链Fab片段的这些另外的二硫化物稳定通过在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间引入二硫键来实现。例如，引入非天然的二硫键来稳定单链Fv的技术描述在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，蛋白质工程(Prot.Engin.)(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等，核医学和生物学(Nuclear Medicine & Biology)，Vol.25，(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，癌基因(Oncogene)(1999)18，1711-1721中。在一个实施方案中，包含在本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，包含在本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat的EU索引编号)。

在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的单链Fab片段。

“单链Fv片段”(见图2b)是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体轻链可变结构域(VL)、和单链Fv接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述单链Fv接头从N端到C端方向具有下列顺序之一：a)VH-单链Fv接头-VL，b)VL-单链Fv接头-VH；优选a)VH-单链Fv接头-VL，并且其中所述单链Fv接头是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列的多肽，在一个实施方案中，是具有至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的多肽。术语“N-端”指N端的最后的氨基酸。术语“C-端”指C端的最后的氨基酸。

当用于单链Fv片段中时，术语“单链Fv接头”指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。所述单链Fv接头是具有至少15个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，在一个实施方案中，是具有至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，且优选是具有15-30个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3且n＝4，5或6)或(x＝4且n＝3，4，5或6)，优选x＝4，n＝3，4或5，更优选x＝4，n＝3或4。在一个实施方案中，所述单链Fv接头是(G₄S)₃或(G₄S)₄。

此外，所述单链Fv片段优选是二硫化物稳定的。单链抗体的这些另外的二硫化物稳定通过在单链抗体的可变结构域之间引入二硫键来实现，并且，例如，在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，蛋白质工程(Prot.Engin.)10(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等，核医学和生物学(Nuclear Medicine& Biology)，Vol.25(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，癌基因(Oncogene)18(1999)1711-1721中所述。

在二硫化物稳定的单链Fv片段的一个实施方案中，对于每种单链Fv片段，包含在本发明所述的抗体中的单链Fv片段的可变结构域之间的二硫键独立地选自：

i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，

ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100。

在一个实施方案中，包含在本发明所述的抗体中的单链Fv片段的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。

本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码本发明所述的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包括在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母，或大肠杆菌(E.coli)细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于抗体重组生产的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S.C.，蛋白表达和纯化(Protein Expr.Purif.)17(1999)183-202；Geisse，S.，等，蛋白表达和纯化(Protein Expr.Purif.)8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-161；Werner，R.G.，药物研究(Drug Res.)48(1998)870-880的综述文章中描述。

通过常规免疫球蛋白纯化方法，将双特异性抗体适当地从培养基中分离，所述纯化方法如，例如蛋白质A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞、CHO细胞、或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。

双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。

术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而不考虑转移数。还理解，由于有意或无意的突变，所有的后代的DNA内容物可能不精确一致。包括具有与在最初转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的变体后代。

在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等，细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Method)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。

适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。

当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中时，其是“可操作地连接的”。例如，前序列(pre-sequence)或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白(pre-protein)；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在阅读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果不存在这样的位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸适体或接头。

通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编，现代分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，GreenePublishing和Wiley Interscience，纽约(1987)。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白质A或蛋白质G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间-氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和性材料)，大小排阻层析法和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.A.，应用生物化学生物技术(Appl.Biochem.Biotech.)75(1998)93-102)。

用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和来源于其的培养物，而不考虑转移数。还理解，由于有意或无意的突变，所有的后代的DNA内容物可能不精确一致。包括具有与在最初转化的细胞中筛选的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的变体后代。在需要不同命名的情形中，其将从上下文中变得清楚。

术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将不具有难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F.L.，和van der Eh，A.J.，Virology(病毒学)52(1973)456-467所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen，F.N，等，PNAS(美国国家科学院学报).69(1972)7110ff所述。

用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和所编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”是一种核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是一种多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。

药物组合物

本发明的一个方面是包含本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是制备包含本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供一种组合物，例如，一种药物组合物，其包含本发明所述的抗体，本发明所述的抗体与药物载体一起配制。

本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的本发明所述的双特异性抗体。

本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。

本发明的另一个方面是本发明所述的抗体用于制备用于治疗癌症的药物的应用。

本发明的另一个方面是治疗患有癌症的患者的方法，其通过向需要所述治疗的患者施用本发明所述的抗体进行。

当用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，所述载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注)。

本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员清楚地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体或稀释剂中施用于受试者，所述载体例如是脂质体。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。

措辞“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞白血病(lymphocytic leukemias)，肺癌(lung cancer)，非小细胞肺(NSCL)癌(non small cell lung(NSCL)cancer)，支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌(bone cancer)，胰腺癌(pancreaticcancer)，皮肤癌(skin cancer)，头或颈癌(cancer of the head or neck)，皮肤或眼内黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直肠癌(rectal cancer)，肛区癌(cancer of the analregion)，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌(colon cancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宫癌(uterine cancer)，输卵管癌(carcinoma of thefallopian tubes)，子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)，子宫颈癌(carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina)，外阴癌(carcinoma of the vulva)，霍奇金病(Hodgkin′s Disease)，食管癌(cancer of theesophagus)，小肠癌(cancer of the small intestine)，内分泌系统癌(cancer ofthe endocrine system)，甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，肾上腺癌(cancer of the adrenal gland)，软组织肉瘤(sarcoma of soft tissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，阴茎癌(cancer of the penis)，前列腺癌(prostate cancer)，膀胱癌(cancer of thebladder)，肾癌或输尿管癌(cancer of the kidney or ureter)，肾细胞癌(renal cellcarcinoma)，肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis)，间皮瘤(mesothelioma)，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胆管癌(biliary cancer)，中枢神经系统(CNS)肿瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS))，脊椎轴肿瘤(spinal axistumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme)，星形细胞瘤(astrocytomas)，神经鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitary adenoma)，和尤因肉瘤(Ewings sarcoma)，包括任一种上述癌症的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。

本发明的另一方面是作为抗-血管生成剂的本发明所述的双特异性抗体或所述药物组合物。这种抗-血管生成剂可用于治疗癌症(特别是实体瘤)和其它血管疾病。

本发明的一个实施方案是用于治疗血管疾病的本发明所述的双特异性抗体。

本发明的另一方面是本发明所述的抗体用于制备用于治疗血管疾病的药物的应用。

本发明的另一方面是治疗患有血管疾病的患者的方法，其通过向需要这种治疗的患者施用本发明所述的抗体进行。

术语“血管疾病(vascular diseases)”包括癌症(Cancer)，炎症疾病(Inflammatory diseases)，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)，缺血(Ischemia)，创伤(Trauma)，脓毒症(Sepsis)，COPD，哮喘(Asthma)，糖尿病(Diabetes)，AMD，视网膜病(Retinopathy)，中风(Stroke)，肥胖(Adipositas)，急性肺损伤(Acute lung injury)，出血(Hemorrhage)，血管渗漏(Vascular leak)(例如细胞因子诱导的血管渗漏)，变态反应(Allergy)，格雷夫斯病(Graves’Disease)，桥本自身免疫性甲状腺炎(Hashimoto’s Autoimmune Thyroiditis)，特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)，巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis)，类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis)，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus(SLE))，狼疮性肾炎(Lupus Nephritis)，局限性回肠炎(Crohn’s Disease)，多发性硬化(Multiple Sclerosis)，溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis)，特别是实体瘤，眼内新血管综合征(intraocularneovascular syndrome)诸如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)或年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration)(AMD)，类风湿关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis)(Folkman，J.，和Shing，Y.，等，J.Biol.Chem.(生物化学杂志)267(1992)10931-10934；Klagsbrun，M.，等，Annu.Rev.Physiol.(生理学年度综述)53(1991)217-239；和Garner，A.，Vascular diseases(血管疾病)，在：Pathobiology of ocular disease，A dynamicapproach(眼科疾病，即动力学途径的病理学)，Garner，A.，和Klintworth，G.K，(编)第2版，Marcel Dekker，纽约(1994)，第1625-1710页)。

这些组合物还可以包含辅药如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法(见上文)和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂来确保，所述抗细菌和抗真菌药剂例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。可能需要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。

不管所选择的施用路径为何，通过本领域技术人员已知的常规方式，将可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物、和/或本发明的药物组合物配制成药用剂型。

在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素，包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域中公知的类似因素。

所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。

适当的流动性可以例如通过使用涂层如磷脂酰胆碱(lecithin)，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小，和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇、和氯化钠。

现在已经可见，本发明所述的针对人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体具有有价值的特征，诸如生物学或药理学活性、药物代理动力学特性。与亲本<ErbB3>和/或<c-Met>抗体相比，本发明所述的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体表现出减少的内在化。

提供下述实施例、序列表和附图来辅助理解本发明，本发明的真正范围在后附的权利要求书中描述。应该理解，在不背离本发明的精神的前提下，可以在所述的方法中进行修改。

氨基酸序列描述

SEQ ID NO：1重链可变结构域<ErbB-3>HER3克隆29

SEQ ID NO：2轻链可变结构域<ErbB-3>HER3克隆29

SEQ ID NO：3重链可变结构域<c-Met>Mab 5D5

SEQ ID NO：4轻链可变结构域<c-Met>Mab 5D5

SEQ ID NO：5重链<ErbB-3>HER3克隆29

SEQ ID NO：6轻链<ErbB-3>HER3克隆29

SEQ ID NO：7重链<c-Met> Mab 5D5

SEQ ID NO：8轻链<c-Met> Mab 5D5

SEQ ID NO：9重链<c-Met>Fab 5D5

SEQ ID NO：10轻链<c-Met>Fab 5D5

SEQ ID NO：11重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS

SEQ ID NO：12重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS

SEQ ID NO：13轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_KHSS

SEQ ID NO：14重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH

SEQ ID NO：15重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH

SEQ ID NO：16轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKH

SEQ ID NO：17重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS

SEQ ID NO：18重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS

SEQ ID NO：19轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_SSKHSS

SEQ ID NO：20重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_1C

SEQ ID NO：21重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_1C

SEQ ID NO：22轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_1C

SEQ ID NO：23重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C

SEQ ID NO：24重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C

SEQ ID NO：25轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_6C

SEQ ID NO：26重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS

SEQ ID NO：27重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS

SEQ ID NO：28轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvSSKHSS

SEQ ID NO：29重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH

SEQ ID NO：30重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH

SEQ ID NO：31轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvSSKH

SEQ ID NO：32重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH

SEQ ID NO：33重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH

SEQ ID NO：34轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKH

SEQ ID NO：35重链1<ErbB3-c-Met> Her3/Me_scFvKHSB

SEQ ID NO：36重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB

SEQ ID NO：37轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Me_scFvKHSB

SEQ ID NO：38重链1<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS

SEQ ID NO：39重链2<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS

SEQ ID NO：40轻链<ErbB3-c-Met>Her3/Met_scFvKHSBSS

SEQ ID NO：41人IgG1的重链恒定区

SEQ ID NO：42人IgG3的重链恒定区

SEQ ID NO：43人轻链κ恒定区

SEQ ID NO：44人轻链λ恒定区

SEQ ID NO：45人c-Met

SEQ ID NO：46人ErbB-3

SEQ ID NO：47重链可变结构域VH，<ErbB3>Mab 205(鼠)

SEQ ID NO：48轻链可变结构域VL，<ErbB3>Mab 205(鼠)

SEQ ID NO：49重链可变结构域VH，<ErbB3>Mab 205.10(人源化的)

SEQ ID NO：50轻链可变结构域VL，<ErbB3>Mab 205.10.1(人源化的)

SEQ ID NO：51轻链可变结构域VL，<ErbB3>Mab 205.10.2(人源化的)

SEQ ID NO：52轻链可变结构域VL，<ErbB3>Mab 205.10.3(人源化的)

SEQ ID NO：53重链CDR3H，<ErbB3>Mab 205.10

SEQ ID NO：54重链CDR2H，<ErbB3>Mab 205.10

SEQ ID NO：55重链CDR1H，<ErbB3>Mab 205.10

SEQ ID NO：56轻链CDR3L，<ErbB3>Mab 205.10

SEQ ID NO：57轻链CDR2L，<ErbB3>Mab 205.10

SEQ ID NO：58轻链CDR1L(变体1)，<ErbB3>Mab 205.10

SEQ ID NO：59轻链CDR1L(变体2)，<ErbB3>Mab 205.10

SEQ ID NO：60重链CDR3H，<ErbB3>HER3克隆29

SEQ ID NO：61重链CDR2H，<ErbB3>HER3克隆29

SEQ ID NO：62重链CDR1H，<ErbB3>HER3克隆29

SEQ ID NO：63轻链CDR3L，<ErbB3>HER3克隆29

SEQ ID NO：64轻链CDR2L，<ErbB3>HER3克隆29

SEQ ID NO：65轻链CDR1L<ErbB3>HER3克隆29

SEQ ID NO：66重链CDR3H，<c-Met>Mab 5D5

SEQ ID NO：67重链CDR2H，<c-Met>Mab 5D5

SEQ ID NO：68重链CDR1H，<c-Met>Mab 5D5

SEQ ID NO：69轻链CDR3L，<c-Met>Mab 5D5

SEQ ID NO：70轻链CDR2L，<c-Met>Mab 5D5

SEQ ID NO：71轻链CDR1L<c-Met>Mab 5D5

附图描述

图1特异性结合第一抗原1的不具有CH4结构域的全长抗体的示意性结构，所述全长抗体具有以典型顺序包含可变结构域和恒定结构域的两对重链和轻链。

图2a-c二价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，所述抗体包含：a)特异性结合人ErbB-3的全长抗体的轻链和重链；和b)特异性结合人c-Met的全长抗体的轻链和重链，其中恒定结构域CL和CH1、和/或可变结构域VL和VH相互替换，其用凸起-进入-孔洞技术修饰。

图3本发明所述的三价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体示意图，所述抗体包含特异性结合第一抗原1的全长抗体，对其

a)图3a：融合两个多肽VH和VL(这两个多肽的VH和VL结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)；

b)图3b：融合两个多肽VH-CH1和VL-CL(这两个多肽的VH和VL结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)；

图3c：具有“凸起和孔洞”的本发明所述的三价双特异性抗体的示意图，所述抗体包含特异性结合第二抗原1的全长抗体，对其融合两个多肽VH和VL(这两个多肽的VH和VL结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点)；

图3d：具有“凸起和孔洞”的本发明所述的三价双特异性抗体示意图，所述抗体包含特异性结合第一抗原1的全长抗体，对其融合两个多肽VH和VL(这两个多肽的VH和VL结构域一起形成特异性结合第二抗原2的抗原结合位点，其中这些VH和VL结构域包含在位置VH44和VL100之间的链间二硫键)。

图44a：四种可能的单链Fab片段的示意性结构；

4b：两种单链Fv片段的示意性结构。

图5三价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，所述抗体包含全长抗体和一个单链Fab片段(图5a)或一个单链Fv片段(图5b)-具有凸起和孔洞的双特异性三价实例。

图6四价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，所述抗体包含全长抗体和两个单链Fab片段(图6a)或两个单链Fv片段(图6b)-c-Met结合位点来源于抑制c-Met二聚化的抗体。

图7二价双特异性<ErbB-3-c-Met>抗体的示意性结构，其中一个Fab臂替换为scFab片段。

图8双特异性抗体与癌细胞细胞表面的结合。

图9通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对HGF-诱导的c-Met受体磷酸化的抑制。

图10通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对HRG-诱导的Her3受体磷酸化的抑制。

图11，12和13通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对HGF-诱导的HUVEC增殖的抑制。

图14通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对癌细胞系A431中增殖的抑制。

图15和16分析双特异性Her3/c-Met抗体形式对癌细胞系A431中HGF-诱导的细胞-细胞散布(分散)的抑制。

图17分析四种不同癌细胞系中的Her3和c-Met细胞表面表达。

图18分析癌细胞系A431，A549，和DU145中的抗体介导的受体内在化。

图19分析A431细胞的HGF-诱导的细胞迁移。A.以存在递增剂量的双特异性抗体MH_TvAb18时阻抗的函数测量A431癌细胞的迁移。显示的是24小时后的终点读数。B.作为对照，以与所述双特异性抗体相似的浓度范围加入非特异性人IgG对照。

图20在HT29细胞中分析双特异性Her3/c-Met_scFv_SSKH抗体的细胞-细胞交联(用PKH26和PKH67(SIGMA)染色)。

图21双特异性Her3/c-Met抗体Her3/Met_scFvSS_KH(左侧)和Her3/Met_scFv_KH(右侧)的SDS page。

图22双特异性Her3/c-Met抗体Her3/Met_scFvSSKH(图22a)和Her3/MetscFv_KH(图22b)的HP SEC分析(纯化的蛋白)。

实验方法

实施例

材料和方法

重组DNA技术

使用标准方法操作DNA，如Sambrook，J.等，Molecular cloning：Alaboratory manual(分子克隆：实验室手册)；Cold Spring Harbor LaboratoryPress(冷泉港实验室出版社)，Cold Spring Harbor(冷泉港)，纽约，1989中所述。分子生物学试剂按照供应商的使用说明使用。

DNA和蛋白序列分析和序列数据管理

关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的通用信息在Kabat，E.A.等，(1991)免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第五版，NIH出版号91-3242中提供。抗体链的氨基酸按照EU编号进行编号(Edelman，G.M.，等，PNAS 63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等，(1991)免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest)，第五版，NIH出版号91-3242)。GCG(Genetics Computer Group(遗传学计算小组)，Madison，威斯康星)的软件包版本10.2和Infomax载体NT1进展组版本8.0(Infomax’s Vector NTI Advance suite version 8.0)用于序列构建、作图、分析、注解和说明。

DNA测序

DNA序列通过在SequiServe(Vaterstetten，德国)和Geneart AG(Regensburg，德国)进行的双链测序来确定。

基因合成

所需基因区段由Geneart AG(Regensburg，德国)从合成的寡核苷酸和通过自动化基因合成的PCR产物来制备。将侧邻单个限制性内切核酸酶裂解位点的基因区段克隆到pGA18(ampR)质粒中。从转化的细菌纯化质粒DNA，并且通过UV光谱法确定浓度。亚克隆基因片段的DNA序列通过DNA测序验证。合成编码在CH3结构域中携带T366W突变的“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(具有通过(G₄S)_n肽连接体连接的C端5D5VH区)的基因区段和编码携带T366S，L368A和Y407V突变的“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(具有通过(G₄S)_n肽连接体连接的C端5D5VL区)的基因区段，所述基因区段具有5’-BamHI和3’-XbaI限制性位点。以相似的方式，通过基因合成制备编码在CH3结构域中携带S354C和T366W突变的“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(其具有由(G₄S)_n肽连接体连接的C-端5D5VH区)的DNA序列和编码携带Y349C，T366S，L368A和Y407V突变的“凸起-进入-孔洞”Her3(克隆29)抗体重链(其具有由(G₄S)_n肽连接体连接的C-端5D5VL区)的DNA序列，所述DNA序列具有侧连的BamHI和XbaI限制性位点。最后，合成编码Her3(克隆29)抗体和5D5抗体的未修饰的重链和轻链的DNA序列，所述DNA序列具有侧连的BamHI和XbaI限制性位点。将所有的构建体设计具有编码前导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’-端DNA序列，所述前导肽靶向用以在真核细胞中分泌的蛋白。使用可变和恒定区的各自的元件(例如，在下述设计部分和表1-5中特定说明的)，类似地进行下述其他双特异性抗体的基因合成。

构建表达质粒

将Roche表达载体用于构建所有编码重链和轻链scFv融合蛋白的表达质粒。所述载体包括下述元件：

-作为选择标记的潮霉素抗性基因，

-埃巴病毒(EBV)的复制起点，oriP，

-来自载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，

-β-内酰胺酶基因，其赋予大肠杆菌氨苄青霉素抗性，

-来自人巨细胞病毒(HCMV)的即时早期增强子和启动子，

-人1-免疫球蛋白聚腺苷酸化(“聚A”)信号序列，和

-特有的BamHI和XbaI限制性位点。

如所描述的，通过基因合成制备免疫球蛋白融合基因，其包含重链或轻链构建体以及具有C端VH和VL结构域的“凸起-进入-孔洞”构建体，将该融合基因克隆进入pGA18(ampR)质粒。带有合成的DNA区段的pG18(ampR)质粒和Roche表达载体用BamHI和XbaI限制性酶(Roche MolecularBiochemicals)消化并进行琼脂糖凝胶电泳。然后将纯化的重链和轻链编码DNA区段连接到分离的Roche表达载体BamHI/XbaI片段，产生最终表达载体。将最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离表达质粒DNA(Miniprep)并进行限制性酶分析和DNA测序。正确的克隆在150mlLB-Amp培养基中生长，再次分离质粒DNA(Maxiprep)并通过DNA测序确认序列完整性。

免疫球蛋白变体在HEK293细胞中的瞬时表达

根据供应商的说明书，使用FreeStyle^TM 293表达系统(Invitrogen，USA)通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。简言之，将混悬的FreeStyle^TM 293-F细胞在FreeStyle^TM 293表达培养基中在37℃/8％CO₂进行培养，并在转染当天将细胞以1-2x10⁶个活细胞/ml的密度接种在新鲜的培养基中。使用325μl的293fectin^TM(Invitrogen，德国)和250μg 1∶1摩尔比率的重链和轻链质粒DNA在

I培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectin^TM复合物，最终转染体积为250ml。“凸起-进入-孔洞”DNA-293fectin复合物如下制备：在

I培养基(Invitrogen，USA)中使用325μl的293fectin^TM(Invitrogen，德国)和250μg的1∶1∶2摩尔比的“凸起-进入-孔洞”重链1和2和轻链质粒DNA(最终转染体积250ml)制备。在转染后7天，通过以14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液。将上清液贮存在-20℃直到纯化。

双特异性抗体和对照抗体的纯化

使用蛋白质A-Sepharose^TM(GE Healthcare，瑞典)和Superdex200大小排阻层析法，通过亲和层析法从细胞培养物上清液中纯化双特异性抗体和对照抗体。简言之，将无菌过滤的细胞培养物上清液应用到用PBS缓冲液(10mM Na₂HPO₄，1mM KH₂PO₄，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的HiTrap蛋白质A HP(5ml)柱上。将未结合的蛋白用平衡缓冲液洗涤下来。抗体和抗体变体用pH 2.8的0.1M柠檬酸缓冲液洗脱，并且用pH 8.5的0.1ml 1 M Tris中和含有蛋白的级分。然后，汇聚洗脱的蛋白级分，将其用Amicon超离心过滤装置(MWCO：30K，Millipore)浓缩至3ml体积，并且上样到用pH 6.0的20mM Histidin，140mM NaCl平衡的Superdex200HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，瑞典)上。汇聚具有少于5％的高分子量聚集物的包含纯化的双特异性抗体和对照抗体的级分，并且以1.0mg/ml的等分试样保存在-80℃。通过木瓜蛋白酶消化纯化的5D5单克隆抗体产生Fab片段，并且随后通过蛋白质A层析法去除污染的Fc结构域。将未结合的Fab片段进一步在用pH 6.0的20mM Histidin，140mMNaCl平衡的Superdex200 HiLoad 120ml 16/60凝胶过滤柱(GE Healthcare，瑞典)上纯化，并且以1.0mg/ml的等分试样保存在-80℃。

纯化的蛋白的分析

利用基于氨基酸序列计算的摩尔消光系数，通过测量280nm的光密度(OD)，来确定纯化的蛋白样品的蛋白浓度。通过在存在和不存在还原剂(5mM 1，4-二硫苏糖醇)条件下的SDS-PAGE并且用考马斯亮蓝染色，分析双特异性抗体和对照抗体的纯度和分子量(示例性的图21，双特异性Her3/c-Met抗体Her3/MetscFvSS_KH(左侧)和Her3/MetscFv_KH(右侧)的SDS-Page)。按照供应商的使用说明使用

Pre-Cast凝胶系统(Invitrogen，USA)(4-20％Tris-甘氨酸凝胶)。使用Superdex 200分析级大小排阻柱(GE Healthcare，瑞典)，在200mM KH₂PO₄，250mM KCl，pH 7.0运行缓冲液中在25℃，通过高效SEC分析双特异性抗体和对照抗体样品的聚集物含量。将25μg蛋白以0.5ml/分钟的流速注射到柱上，并且在50分钟内匀速(isocratic)洗脱。对于稳定性分析，将浓度为1mg/ml的纯化的蛋白在4℃和40℃温育7天，然后通过高效SEC评估(例如，双特异性Her3/c-Met抗体Her3/MetscFvSS_KH(图22a)和Her3/MetscFv_KH(图22b)的HP SEC分析(纯化的蛋白))。在通过用肽-N-糖苷酶F(RocheMolecular Biochemicals)酶处理去除N-聚糖后，通过纳米电喷雾Q-TOF质谱法验证还原的双特异性抗体轻链和重链的氨基酸骨架的完整性。产率如下：例如，对于双特异性Her3/c-Met抗体Her3/MetscFvSS_KH为28.8mg/L(蛋白质A和SEC)，对于Her3/MetscFv_KH为12.3mg/L(蛋白质A和SEC))。

c-Met磷酸化测定

在HGF刺激前一天，将5x10e5个A549细胞接种在6孔板的每个孔中的具有0.5％FCS(胎牛血清)的RPMI中。次日，用含有0.2％BSA(牛血清白蛋白)的RPMI替换生长培养基1小时。然后，向培养基中加入5μg/mL双特异性抗体，并且将细胞温育10分钟，对其加入HGF以50ng/mL的终浓度继续10分钟。将细胞用含有1mM钒酸钠的冰冷PBS洗涤一次，将其置于冰上，在细胞培养板中用100μL裂解缓冲液(50mMTris-Cl pH7.5，150mM NaCl，1％NP40，0.5％DOC，aprotinine，0.5mMPMSF，1mM钒酸钠)裂解。将细胞裂解物转移到eppendorf管中，并且允许裂解在冰上继续进行30分钟。利用BCA法(Pierce)确定蛋白浓度。在4-12％Bis-Tris NuPage凝胶(Invitrogen)上分离30-50μg裂解物，并且将凝胶上的蛋白转移到硝基纤维素膜上。将膜用含有5％BSA的TBS-T封闭1小时，并且用针对Y1230,1234,1235的磷-特异性c-Met抗体(44-888，Biosource)按照供应商的使用说明进行显色。免疫印迹用结合未磷酸化的c-Met的抗体(AF276，R&D)再次探测。

Her3(ErbB3)磷酸化测定

将2x10e5个MCF7细胞接种在12-孔板的每个孔中的完全生长培养基中(RPMI 1640，10％FCS)。允许细胞在两天内生长至90％的汇合。然后，用含有0.5％FCS的饥饿培养基更换培养基。次日，在加入500ng/mLHeregulin(R&D)前1小时，以指定的浓度补充各种抗体。当加入Heregulin时，将细胞进一步培育10分钟，然后收集细胞并裂解。使用BCA法(Pierce)确定蛋白浓度。在4-12％Bis-Tris NuPage凝胶(Invitrogen)上分离30-50μg裂解物，并且将凝胶上的蛋白转移到硝基纤维素膜上。将膜用含有5％BSA的TBS-T封闭1小时，并且用特异性识别Tyr1289的磷-特异性Her3/ErbB3抗体(4791，Cell Signaling)进行显色。

分散测定

在化合物处理前一天，将A549(4000个细胞/孔)或A431(8000个细胞/孔)以200μL的总体积接种在96孔E-板(Roche，05232368001)中的具有0.5％FCS的RPMI中。贴壁和细胞生长用实时细胞分析仪机器监测过夜，每15分钟扫描(sweeps)监测阻抗。次日，将细胞用5μL在PBS中的各自抗体稀释液预先温育，每5分钟扫描。30分钟后，加入产生20ng/mL终浓度的2,5μL的HGF溶液，并且允许实验再继续进行72小时。每分钟扫描持续180分钟监测即时变化，然后其余的时间每15分钟扫描。

迁移测定

迁移测定基于实时细胞分析仪技术(Roche)进行。为了这一目的，将具有8μm孔的CIM装置的下室装满160μL HGF-条件培养基(50ng/mL)。装配该装置，并且将在150μL总体积中的100000个A431细胞接种在上室中。对其加入双特异性抗体或对照抗体。允许迁移继续24小时，在期间每15分钟规律扫描。输出数据并且表示为24小时后的终点读数。

流式细胞术测定(FACS)

a)细胞表面受体状态的相对定量

将细胞保持在对数生长期。将亚汇合的细胞用accutase(Sigma)解离，离心(1500rpm，4℃，5min)并随后用含有2％FCS的PBS洗涤一次。为了确定与其他细胞系相比较的相对受体状态，将1x10e5个细胞在冰上与5μg/mL Her3或c-Met特异性一级抗体温育30分钟。使用非特异性IgG(同种型对照)作为特异性对照。在指定的时间后，将细胞用含有2％FCS的PBS洗涤一次，然后在冰上与荧光团偶联的二级抗体温育30分钟。将细胞如所述进行洗涤并且重悬在适当体积的包含7-AAD(BD Biosciences)的BD CellFix溶液(BD Biosciences)中，以区分活细胞和死细胞。通过流式细胞术(FACS Canto，BD)确定平均荧光强度(mfi)。Mfi以至少两次独立染色的重复确定。使用FlowJo软件(TreeStar)进一步处理流式细胞仪光谱。

a)结合测定

解离并且计数A431。将1.5x10e5个细胞接种在锥形96孔平板的每个孔中。将细胞离心(1500rpm，4℃，5分钟)并且在冰上在具有2％FCS(胎牛血清)的PBS中的50μL各种双特异性抗体的系列稀释液中温育30分钟。将细胞再次离心，并且用200μL含有2％FCS的PBS洗涤一次，然后用针对人Fc的藻红蛋白-偶联的抗体第二次温育30分钟，所述藻红蛋白-偶联的抗体稀释在含有2％FCS的PBS(Jackson Immunoresearch(杰克逊免疫研究)，109116098)中。将细胞离心，用200μL含有2％FCS的PBS洗涤两次，重悬在BD CellFix溶液(BD Biosciences(BD生物科学))中并且在冰上温育至少10分钟。通过流式细胞术(FACS Canto，BD)确定细胞的平均荧光强度(mfi)。至少进行重复的两次独立染色来确定Mfi。使用FlowJo软件(TreeStar)进一步处理流式细胞术光谱。使用XLFit 4.0(IDBS)和剂量反应单位点模型(one site model)205确定半最大结合。

b)内在化测定

解离并且计数细胞。将5x10e5个细胞置于eppendorf管中的50μL完全培养基中，并且在37℃用5μg/mL各种双特异性抗体温育。在指定的时间点后，将细胞保存在冰上，直到时间过程结束。然后，将细胞转移到FACS管中，离心(1500rpm，4℃，5分钟)，用PBS+2％FCS洗涤，并且在50μL针对人Fc的藻红蛋白-偶联的二级抗体中温育30分钟，所述二级抗体稀释在含有2％FCS的PBS(Jackson Immunoresearch(杰克逊免疫研究)，109116098)中。将细胞再次离心，用PBS+2％FCS洗涤，并且通过流式细胞术(FACS Canto，BD)确定荧光强度。

c)交联实验

将HT29细胞解离、计数并分成两个群体，各自用PKH26和PKH67(Sigma)按照供应商的使用说明染色。从每个染色的群体中取5x10e5个细胞，合并并且在完全培养基中用10μg/mL各种双特异性抗体温育30和60分钟。在指定的时间点后，将细胞保存在冰上，直到时间过程结束。将细胞离心(1500rpm，4℃，5分钟)，用PBS+2％FCS洗涤，并且通过流式细胞术(FACS Canto，BD)确定荧光强度。

细胞滴定发光测定(Cell Titer Glow Assay)

使用细胞滴定发光测定(Promega)量化细胞存活力和增殖。该测定按照供应商的使用说明进行。简言之，将细胞在96孔板中以100μL的总体积培养所需要的时间期间。对于增殖测定，将细胞从温箱中取出，并且置于室温下30分钟。加入100μL细胞滴定发光试剂，并且将多孔板放置在定轨摇床上2分钟。15分钟后在微量平板读数仪(Tecan)上定量发光。

Wst-1测定

进行Wst-1存活力和细胞增殖测定作为终点分析，以检测代谢活性细胞的数目。简言之，向200μL培养基中加入20μL Wst-1试剂(Roche，11644807001)。将96孔板进一步温育30分钟-1小时，直到出现染料的强显色。在微量平板读数仪(Tecan)上在450nm波长定量染色强度。

表面等离振子共振

在25℃使用标准结合测定，诸如表面等离振子共振技术(

GE-Healthcare Uppsala，瑞典)，确定结合亲和力。对于亲和力测量，将30μg/ml抗Fcγ抗体(来自山羊，Jackson Immuno Research)在SPR仪器(BiacoreT100)上通过标准的胺-偶联和封闭化学偶联到CM-5传感器芯片的表面上。缀合后，在25℃以5μL/min的流速注射单特异性或双特异性Her3/cMet抗体，然后以30μL/min注射人HER3或c-Met ECD的稀释系列(0nM-1000nM)。对于结合实验，使用PBS/0.1％BSA作为运行缓冲液。然后，用pH 2.0的10mM甘氨酸-HCl溶液的60秒脉冲再生芯片。

表达和纯化的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体的设计

所有下述表达的和纯化的双特异性<ErbB3-c-Met>抗体包括IgG1亚类的恒定区或至少Fc部分(SEQ ID NO：11的人恒定IgG1区)，其最终按下述修饰。

在表1中：具有表1所示的各自的特征的基于全长ErbB-3抗体(HER3克隆29)(通过免疫获得(用人HER3-ECD免疫的NMRI小鼠))和来自c-met抗体(cMet 5D5)的一个单链Fv片段(关于基本结构图见图5----最终并非表中所提及的所有特征都包括在该附图中)的三价双特异性<ErbB3-c-Met>抗体按照上述通用方法表达和纯化。在序列表中提供HER3克隆29和cMet 5D5的相对应的VH和VL。

表1：

在表2中：具有表2所示的各自的特征的基于全长ErbB-3抗体(Mab205，通过免疫获得(用人HER3-ECD免疫的NMRI小鼠))和来自c-met抗体(cMet 5D5)的一个单链Fv或scFab片段(关于基本结构图见图5b和a----对于详细结构见表)的三价双特异性<ErbB3-c-Met>抗体按照上述通用方法表达和纯化。在序列表中提供Mab205和cMet 5D5的相对应的VH和VL。

表2：

在表3中：具有表3所示的各自的特征的基于全长ErbB-3抗体(Mab205.10.2，通过免疫(用人HER3-ECD免疫的NMRI小鼠)和随后的人源化获得)和来自c-met抗体(cMet 5D5)的一个scFab片段(关于基本结构图见图5a)的三价双特异性<ErbB3-c-Met>抗体按照上述通用方法表达和纯化。在序列表中提供Mab 205.10.2和cMet 5D5的相对应的VH和VL。

表3：

在表4中：具有表4所示的各自的特征的基于全长ErbB-3抗体(HER克隆29)和来自c-Met抗体(cMet 5D5)的VH和VL结构域(关于基本结构图见图3a，3c和3d----最终并非表中提及的所有特征都包含在该附图中)的三价双特异性<ErbB3-c-Met>抗体按照上述通用方法表达和纯化。在序列表中提供HER3克隆29和cMet 5D5的相对应的VH和VL。

表4：表达和纯化具有表4中VHVL-Ab-命名的三价双特异性抗体(也参见下述实施例和图3c)

在表5中：具有表5所示的各自的特征的二价双特异性<ErbB3-c-Met>抗体按照上述通用方法表达和纯化，其中一个结合臂基于全长ErbB-3抗体(HER3 Mab 205或人源化版本Mab 205.10.1，Mab205.10.2或Mab 205.10.2)，另一个结合臂基于来自c-met抗体(cMet 5D5)的scFab片段。在序列表中提供HER3 Mab 205和cMet 5D5的相对应的VH和VL。

表5：

实施例1(图8)：

双特异性抗体与癌细胞表面的结合

在基于流式细胞术的测定中，在A431癌细胞上分析双特异性抗体与其在细胞表面上的各自的受体的结合特征。将细胞用单特异性或双特异性一级抗体温育，并且用特异性结合一级抗体的Fc部分的偶联到荧光团上的二级抗体检测这些抗体与其同源受体的结合。将一级抗体稀释系列的平均荧光强度针对抗体浓度绘图，以获得S型结合曲线。通过仅用二价5D5和Her3克隆29抗体温育验证c-Met和Her3的细胞表面表达。Her3/c-Met_KHSS抗体易于结合A431的细胞表面。在这些实验设置下，抗体可以仅通过其Her3部分结合，并且因此平均荧光强度不超过对单独的Her3克隆29的染色。

实施例2(图9)

通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对HGF-诱导的c-Met受体磷酸化的抑制

为了确定双特异性抗体中c-Met部分的功能性，进行c-Met磷酸化测定。在该实验中，在暴露于HGF之前，将A549肺癌细胞或HT29结肠直肠癌细胞用双特异性抗体或对照抗体处理。然后裂解细胞，并且检验c-Met受体的磷酸化。两种细胞系都可以用HGF刺激，这可以通过在免疫印迹中出现磷-c-Met特异性条带而观察到。加入scFv抗体或5D5Fab片段抑制受体磷酸化，这表明c-Met scFv成分的功能性。

实施例3(图10)

通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对HRG-诱导的Her3受体磷酸化的抑制

为了确定双特异性抗体中Her3部分的功能性，进行Her3磷酸化测定。在该实验中，在暴露于HRG(Heregulin)之前，将MCF7细胞用双特异性抗体或对照抗体处理。然后裂解细胞，并且检验Her3受体的磷酸化。Her3/c-Met_scFV_SSKH和Her3/c-Met_KHSS以与亲本Her3克隆29相同的程度抑制Her3受体磷酸化，这表明抗体的Her3结合和功能性不受所述三价抗体形式破坏。

实施例4(图11，12和13)

通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对HGF-诱导的HUVEC增殖的抑制

可以进行HUVEC增殖测定来证明HGF的促有丝分裂的作用。向HUVEC中加入HGF导致增殖的两倍增加。加入与双特异性抗体相同浓度范围的人IgG对照抗体对细胞增殖没有影响，而5D5Fab片段抑制HGF-诱导的增殖。如果以相同的浓度使用，Her3/c-Met_scFv_SSKH抗体与Fab片段一样良好地抑制增殖(图11)。加入单独的Heregulin(HRG)(数据未显示)或与HGF组合没有导致增殖的进一步增加(图12)。这证实该读数允许在没有Her3成分干扰的条件下进行双特异性抗体中的c-Met成分的功能分析。Her3/c-Met_KHSS的滴度表明抗体的弱抑制作用(图13)。对于Her3/Met-6C抗体，该作用更明显，这表明较长的连接体提高了抗体的功效。三种不同的scFv抗体(Her3/c-Met_scFv_SSKH，Her3/c-Met_scFv_KH，Her3/c-Met_scFv_KHSB)表现出相同程度的增殖抑制。这表明三价抗体形式中c-Met成分的功能性。

实施例5(图14)

通过双特异性Her3/c-Met抗体形式对癌细胞系A431中增殖的抑制

如果将A431接种在血清减少的培养基中，加入HGF诱导除分散之外的弱促有丝分裂作用。研究其以分析Her3/c-Met_scFv_SSKH和Her3/c-Met_KHSS对HGF处理的A431增殖的影响。实际上，双特异性抗体可以极大地抑制HGF-诱导的增殖的增加(15％)。Her3/c-Met_scFv_SSKH与5D5Fab片段一样好，而Her3/c-Met_KHSS必须给予较高剂量(12,5μg/mL相对于6,25μg/mL)才能获得相似的作用。对照人IgG1抗体对HGF促进的A431细胞生长没有影响。

实施例6(图15，16)

分析双特异性Her3/c-Met抗体形式对癌细胞系A431中HGF-诱导的细胞-细胞散布(分散)的抑制

HGF-诱导的分散包括细胞的形态变化，导致细胞变圆，丝足样突出，纺锤样结构和特定的细胞运动性。实时细胞分析仪(Roche)测量给定的细胞培养孔的阻抗，并且因此可以间接监测细胞形态和增殖的改变。向A431和A549细胞中加入HGF导致阻抗变化，这可以作为时间的函数进行监测。Her3/c-Met_KHSS和Her3/Met-6C抑制HGF-诱导的分散，其中Her3/Met-6C更有效(20,7％和43,7％分散抑制)(图15)。三种不同的scFv抗体(Her3/c-Met_scFv_SSKH，Her3/c-Met_scFv_KH，Her3/c-Met_scFv_KHSB)在抑制HGF-诱导的分散中表现出中等功效，这可以通过在未处理的对照曲线附近绘制的曲线的斜率减小而观察到(29％，51,9％和49,7％分散抑制)(图16)。如果以相同的浓度12.5μg/mL使用，Her3/c-Met_scFv_KH抗体和Her3/c-Met_scFv_KHSB表现得一样好。

实施例7(图17)

分析在癌细胞系T47D，A549，A431，和H441中的Her3和c-Met受体的细胞表面表达

为了鉴定具有不同比率的细胞表面Her3和c-Met的细胞系，进行基于FACS的测定。T47D没有表现出c-Met细胞表面表达，这与该细胞系中的mRNA水平一致(数据未显示)。A431和A549表现出相似水平的c-Met，而H441(一种过表达c-Met的细胞系)具有非常高的c-Met水平。反之，T47D具有高水平的Her3，而A549仅表现出低的细胞表面表达。

实施例8(图18和下表)

分析癌细胞系A431，A549，和DU145中的抗体介导的受体内在化(用流式细胞术测定(FACS)测量)

已经表明用特异性结合Her3或c-Met的抗体温育细胞引发受体的内在化。为了评估双特异性抗体的内在化能力，设计实验设置来研究抗体诱导的受体内在化。为了这一目的，将细胞在37℃用各种一级抗体温育不同的时间期间(0；30；60和120分钟(＝0h，1/2h，1h和2h))。通过将细胞迅速冷却至4℃而终止细胞过程。使用特异性结合一级抗体的Fc的二级荧光团-偶联的抗体来检测与细胞表面结合的抗体。抗体-受体复合物的内在化消耗细胞表面上的抗体-受体复合物，并且导致减少的平均荧光强度。在三种不同的细胞系(A431，A549，DU145)中研究内在化。用Her3克隆29温育表明该抗体在A431和DU145中诱导受体内在化，而在A549中作用较不明显，其在其细胞表面上几乎没有受体。用5D5温育在A549，DU145中导致良好的受体内在化，在A431中较不明显。Her3/c-Met_scFv_SSKH在A549和DU145中几乎不表现出内在化，在A431中仅表现出适中的内在化(2小时后11％)。总之，scFv抗体形式仅导致非常适中的受体内在化，这表明双特异性抗体与单特异性成分作用不同，这提示双特异性scFv抗体同时与在细胞表面上捕获其的两个受体结合。结果显示在图18和下表中：

表6：与亲本单特异性HER3和cMet抗体相比，在A431细胞上2小时后用FACS测定法测量的双特异性Her3/cMet抗体的ErbB3受体内在化％。将在0小时测量的细胞表面上的ErbB3受体的量度％设定为细胞表面上100％的ErbB3受体。(对于单特异性二价<c-Met>亲本抗体Mab 5D5，类似地计算c-Met的内在化％(见下文关于B)括号中的指示))

实施例10(图19)

分析癌细胞系A431中HGF-介导的迁移的抗体依赖性抑制

活性c-Met信号传导的一个重要的方面是诱导迁移性和侵袭性程序。c-Met抑制性抗体的功效可以通过测量对HGF-诱导的细胞迁移的抑制而确定。为了这一目的，将HGF-可诱导的癌细胞系A431在不存在或存在双特异性抗体或IgG对照抗体时用HGF处理，并且使用具有阻抗读出的CIM板在Acea实时细胞分析仪上以时间依赖性方式测量通过8μm孔迁移的细胞数目。独立地，细胞迁移通过染色迁移的细胞而定性地显现(数据未显示)。该实施例表明对HGF-诱导的细胞迁移的剂量依赖性抑制。

实施例11(下表)

分析重组Her3，cMet和FcγIII受体与双特异性抗体的相继的和同时的结合

为了更好地理解结合Her3和c-Met的双特异性抗体的作用模式，在表面等离振子共振测量(Biacore)的帮助下确定受体结合状态。利用不同的实验设置来评估双特异性抗体与重组Her3或重组c-Met胞外结构域(ECD)的结合或与二者的同时结合。所有所检测的双特异性抗体能够同时结合Her3和c-Met ECD。此外，确定重组FcγIII蛋白与抗体复合物Her3:cMet-ECD的结合。甚至在两种胞外结构域均存在时，所有的抗体都可以结合FcγIII受体，这为糖改造双特异性抗体以增强NK依赖性效应子功能提供了强有力的基本原理。

表7：

实施例12(图20)

在HT29细胞中分析双特异性Her3/c-Met_scFv_SSKH抗体的细胞-细胞交联

由于双特异性抗体形式的多价性，细胞-细胞交联是可能的作用模式，其还将解释减少的受体内在化。为了更详细地研究这一现象，设计解释这一问题的实验设置。为了这一目的，将在细胞表面上表达Her3和c-Met的HT29细胞分成两个群体。一个用PKH26(SIGMA)染色，另一个用PKH67(Sigma)染色，两个膜染色，前者是绿色，后者是红色。将染色的细胞混合并与Her3/c-Met_scFv_SSKH温育。在基于流式细胞术的测定中，细胞的广泛交联将导致在上部右侧象限中的双阳性(绿+/红+)细胞群体的增加。基于这一实验，在给定的设置中可能不会观察到细胞-细胞交联的增加。

实施例13

制备糖改造的双特异性Her3/c-Met抗体

将双特异性Her3/c-Met抗体MH_TvAb18，MH_TvAb21MH_TvAb 22，和MH_TvAb 30的DNA序列亚克隆到哺乳动物表达载体中，使其处在MPSV启动子的控制下并且在合成的polyA位点上游，每个载体携带EBVOriP序列。

使用磷酸钙转染方法，用哺乳动物双特异性抗体表达载体共转染HEK293-EBNA细胞产生双特异性抗体。通过磷酸钙法转染指数生长的HEK293-EBNA细胞。为了产生糖改造的抗体，将细胞用两种另外的质粒分别以4∶4∶1∶1的比率共转染，一种质粒用于融合GnTIII多肽表达(GnT-III表达载体)，一种质粒用于甘露糖苷酶II表达(高尔基甘露糖苷酶II表达载体)。使用补充10％FCS的DMEM培养基，细胞在T烧瓶中以贴壁单层培养物生长，并且当它们处于50-80％汇合时进行转染。对于T150烧瓶的转染，在转染前24小时，将15X10⁶个细胞接种在25ml补充FCS(最终10％V/V)的DMEM培养基中，并将细胞置于具有5％CO2气氛的温箱中在37℃过夜。对于每个待转染的T150烧瓶，通过混合在轻链和重链表达载体之间等分的94μg总质粒载体DNA、水至终体积469μl和469μl的1M CaCl2溶液，制备DNA、CaCl2和水的溶液。向该溶液中加入938μl pH7.05的50mM HEPES，280mM NaCl，1.5mM Na2HPO4溶液，立即混合10秒，并且在室温下静置20秒。混悬液用10ml补充2％FCS的DMEM稀释，并且加入T150中替换已有的培养基。然后，加入另外13ml转染培养基。将细胞在37℃，5％CO2温育约17-20小时，然后用25ml DMEM，10％FCS替换培养基。在转染后7天，通过以210x g离心15分钟收获条件培养基，将溶液无菌过滤(0.22μm滤器)，并且加入终浓度为0.01％w/v的叠氮化钠，并且保存在4℃。

分泌的双特异性异常岩藻糖基化的(afocusylated)糖改造的抗体通过下述纯化：蛋白质A亲和层析，然后阳离子交换层析，和在Superdex 200柱(Amersham Pharmacia(安玛西亚法玛西亚))上的最后的大小排阻层析步骤，将缓冲液交换为pH 6.7的25mM磷酸钾，125mM氯化钠，100mM甘氨酸溶液，并且收集纯的单体IgG1抗体。使用分光光度计由280nm处吸光度估算抗体浓度。

如下述(实施例14)，通过MALDI/TOF-MS分析附着到抗体Fc区的寡糖。通过PNGaseF消化由抗体酶促释放寡糖，其中抗体被固定在PVDF膜上或在溶液中。得到的含有释放的寡糖的消化物溶液直接制备用于MALDI/TOF-MS分析或在用于MALDI/TOF-MS分析的样品制备前进一步用EndoH糖苷酶消化。

实施例14

分析双特异性Her3/c-Met抗体的糖结构

为了确定包含岩藻糖的寡糖结构和包含非岩藻糖(异常岩藻糖(a-fucose))的寡糖结构的相对比率，通过MALDI-Tof-质谱法分析纯化的抗体物质释放的聚糖。为此，将抗体样品(约50μg)在pH 6.0的0.1M磷酸钠缓冲液中用5mU N-糖苷酶F(Prozyme#GKE-5010B)在37℃温育过夜，从而从蛋白骨架释放寡糖。随后，将释放的聚糖结构分离，并且用NuTip-碳吸管头(NuTip-Carbon pipet tips)(由Glygen获得：NuTip1-10μl，Cat.Nr#NT1CAR)脱盐。第一步，通过将NuTip-碳吸管头用3μL 1M NaOH洗涤，然后用20μL纯水(例如，来自Baker的HPLC-梯度级别，#4218)洗涤，用3μL 30％v/v乙酸洗涤，再用20μl纯水洗涤，准备NuTip-碳吸管头用于结合寡糖。为此，将各种溶液上样到NuTip-碳吸管头中色谱材料的顶部，并且加压通过。之后，通过来回摇动上述N-糖苷酶F消化物4-5次，将与10μg抗体相对应的聚糖结构结合到NuTip-碳吸管头中的材料上。将结合到NuTip-碳吸管头中材料上的聚糖用20μL纯水以上述方式洗涤，并且分别用0.5μL 10％和2.0μL 20％乙腈逐步洗脱。对于该步，将洗脱液填装在0.5mL反应小瓶中，并且分别来回摇动4-5次。对于通过MALDI-Tof质谱法分析，组合两种洗脱物。对于这种测量，将0.4μL组合的洗脱物在MALDI靶标上用1.6μL SDHB基质溶液(2.5-二氢苯甲酸2-羟基-5-甲氧基苯甲酸[Bruker Daltonics#209813]，其以5mg/ml溶解在20％乙醇/5mMNaCl中)混合，并且用适当调谐的Bruker Ultraflex TOF/TOF仪器分析。常规地，记录50-300次发射，并且总结为单次实验。所得到的光谱通过flex分析软件(Bruker Daltonics)评价，并且对于所检测到的每个峰确定质量。随后，通过比较关于各种结构(例如，分别为复合型的、杂合型的和低聚-或高-甘露糖型，有和无岩藻糖)计算的质量和理论预测的质量，而将峰指定为含有岩藻糖的或含有异常岩藻糖的(非岩藻糖)的二元醇(glycol)结构。

为了确定杂合型结构的比例，将抗体样品同时用N-糖苷酶F和内切糖苷酶H消化。N-糖苷酶F由蛋白骨架释放所有N-连接的聚糖结构(复合型的、杂合型的与低聚-和高甘露糖型结构)，内切糖苷酶H切割另外在聚糖还原端的两个GlcNAc-残基之间的所有杂合型聚糖。随后，将该消化物以上述关于N-糖苷酶F消化样品相同的方式进行处理并通过MALDI-Tof质谱法分析。通过比较N-糖苷酶F消化物和组合的N-糖苷酶F/内切H消化物的模式，将特定的糖结构信号减少的程度用来估算杂合型结构的相对含量。

由单个二元醇结构的峰高与所检测的所有糖结构的峰高总和的比例，计算每种糖结构的相对量。岩藻糖的量是含有岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有糖结构(例如，分别为复合型的、杂合型的与低聚-和高-甘露糖型结构)的百分数。异常岩藻糖基化的量是缺少岩藻糖的结构相对于在N-糖苷酶F处理的样品中鉴定的所有糖结构(例如，分别为复合型的、杂合型的与低聚-和高-甘露糖型结构)的百分数。

实施例15

双特异性Her3/c-Met抗体的体外ADCC

本发明所述的Her3/cMet双特异性抗体在表达这两种受体的细胞上表现出减少的内在化。减少的内在化强烈地支持糖改造这些抗体的基本原理，因为抗体-受体复合物在细胞表面上的延长的暴露更可能被Nk细胞识别。与亲本抗体相比，减少的内在化和糖改造转化为增强的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。使用在细胞表面上表达Her3和cMet二者的癌细胞，例如A431，和效应细胞，如Nk细胞系或PBMC’s，可以设计证明这些作用的体外实验设置。将肿瘤细胞用亲本单特异性抗体或双特异性抗体预先温育至多24小时，然后加入效应细胞系。定量细胞裂解，并且允许单-和双特异性抗体的区别。

用胰蛋白酶/EDTA(Gibco#25300-054)收集指数生长期的靶细胞，例如A431(在RPMI1640+2mM L-谷氨酰胺+10％FCS中培养)(表达Her3和cMet二者)。在洗涤步骤和检查细胞数目和存活力后，将需要的等分试样在细胞培养温箱中在37℃用钙黄绿素(Invitrogen#C3100MP；1小瓶重悬在50μl DMSO中，用于5ml培养基中的5Mio细胞)标记30分钟。然后，将细胞用AIM-V培养基洗涤三次，检查细胞数目和存活力，并且将细胞数目调整为0.3Mio/ml。

同时，按照供应商的方法(洗涤步骤：1x 400g和2x每次350g 10分钟)通过密度梯度离心(Histopaque-1077，Sigma#H8889)制备作为效应细胞的PBMC。检查细胞数目和存活力，并且将细胞数目调整为15Mio/ml。

将100μl钙黄绿素-染色的靶细胞平板接种在圆底96孔板中，加入50μl稀释的抗体和50μl效应细胞。在一些实施方案中，将靶细胞与

NF液体(ZLB Behring)以10mg/ml Redimune的浓度混合。

将通过不用抗体共培养靶细胞和效应细胞确定的自发裂解作为对照，最大裂解仅通过靶细胞的1％Triton X-100裂解确定。将平板在潮湿的细胞培养温箱中在37℃温育4小时。

按照供应商的使用说明，使用细胞毒性检测试剂盒(LDH检测试剂盒，Roche#1644793)，通过测量来自损伤细胞的LDH释放而评估靶细胞的杀伤。简言之，将来自每个孔的100μl上清液与试剂盒的100μl底物在透明的平底96孔板中混合。在ELISA读数仪中在490nm至少10分钟确定底物颜色反应的Vmax值。特异性抗体-介导的杀伤百分数计算如下：((A-SR)/(MR-SR)x100，其中A是特定抗体浓度下的Vmax平均值，SR是自发释放的Vmax平均值，MR是最大释放的Vmax平均值。

实施例16

在具有自分泌HGF环的皮下异种移植模型中，双特异性Her3/cMet抗体的体内功效

皮下U87MG成胶质细胞瘤模型具有自分泌HGF环，并且在细胞表面上展示Her3和c-Met。这两种受体都在肿瘤移出物中被磷酸化，所述肿瘤移出物被裂解并且进行免疫印迹分析(数据未显示)。将U87MG细胞在标准细胞培养条件下保持在对数生长期。将一千万个细胞植入到SCID beige小鼠中。在肿瘤建立且已经达到100-150mm3的尺寸后开始治疗。用20mg/kg抗体/小鼠的负荷剂量，然后用10mg/kg抗体/小鼠每周一次治疗小鼠。肿瘤体积每周测量两次，并且平行地监测动物体重。将单一治疗和单种抗体的组合与使用双特异性抗体的治疗进行比较。

实施例17

在具有旁分泌HGF环的皮下异种移植模型中，双特异性Her3/cMet抗体的体内功效

与Mrc-5细胞共同注射的皮下BxPc-3模型模拟用于c-Met的旁分泌活化环。BxPc-3在细胞表面上表达c-Met和Her3。将BxPc-3和Mrc-5细胞在标准细胞培养条件下保持在对数生长期。以10∶1的比率注射BxPc-3和Mrc-5细胞，其中一千万个BxPc-3细胞和一百万个Mrc-5。将细胞植入到SCID beige小鼠。在肿瘤建立且已经达到100-150mm3的尺寸后，开始治疗。用20mg/kg抗体/小鼠的负荷剂量，然后用10mg/kg抗体/小鼠每周一次治疗小鼠。肿瘤体积每周测量两次，并且平行地监测动物体重。将单一治疗和单种抗体的组合与使用双特异性抗体的治疗进行比较。

实施例18

将对人HGF转基因的免疫损害的小鼠作为系统性HGF的来源。这样的小鼠已经在参考文献中有记述，并且可以从Van Andel Institute获得。皮下注射在细胞表面上表达两种受体的癌细胞系，诸如BxPc-3或A549，可以用来研究靶向Her3和c-Met的双特异性抗体的功效。将细胞在标准细胞培养条件下保持在对数生长期。将一千万个细胞植入到携带HGF的转基因的SCID beige小鼠中。在肿瘤建立且已经达到100-150mm3的尺寸后，开始治疗。用20mg/kg抗体/小鼠的负荷剂量，然后用10mg/kg抗体/小鼠每周一次治疗小鼠。肿瘤体积每周测量两次，并且平行地监测动物体重。将单一治疗和单种抗体的组合与使用双特异性抗体的治疗进行比较。

实施例19

在具有旁分泌HGF环的正位(orthotopic)异种移植模型中，双特异性Her3/cMet抗体的体内功效

A549癌细胞在细胞表面上表达Her3和c-Met。将A549细胞在标准细胞培养条件下保持在对数生长期。将一千万个细胞植入到SCID beige小鼠中。在肿瘤建立且已经达到100-150mm3的尺寸后，开始治疗。用20mg/kg抗体/小鼠的负荷剂量，然后用10mg/kg抗体/小鼠每周一次治疗小鼠。肿瘤体积每周测量两次，并且平行地监测动物体重。将单一治疗和单种抗体的组合与使用双特异性抗体的治疗进行比较。

Claims

1.特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于，当在流式细胞术测定中在A431细胞上2小时后测量时，与不存在抗体时ErbB-3的内在化相比较，所述双特异性抗体显示不超过15％的ErbB-3的内在化。

2.根据权利要求1的抗体，其特征在于是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价的或三价的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个或两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的一个抗原结合位点。

3.根据权利要求1的抗体，其特征在于是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的三价的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的两个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第三抗原结合位点。

4.根据权利要求1的抗体，其特征在于是特异性结合人ErbB-3和人c-Met的二价的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的一个抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点。

5.特异性结合人ErbB-3和人c-Met的双特异性抗体，其包含特异性结合人ErbB-3的第一抗原结合位点和特异性结合人c-Met的第二抗原结合位点，其特征在于

6.根据权利要求5的双特异性抗体，其特征在于

v)所述第一抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：1和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：2，和所述第二抗原结合位点包含作为重链可变结构域的SEQ ID NO：3和作为轻链可变结构域的SEQ ID NO：4。

7.根据权利要求5的双特异性抗体，其特征在于

8.根据权利要求1至7的双特异性抗体，其特征在于包含IgG1或IgG3亚类的恒定区。

9.根据权利要求1至8的双特异性抗体，其特征在于所述抗体在Asn297用糖链糖基化，其中所述糖链内岩藻糖的量为65％以下。

10.编码根据权利要求1至9的双特异性抗体的核酸。

11.药物组合物，其包含根据权利要求1至9的双特异性抗体。

12.根据权利要求11的药物组合物，其用于治疗癌症。

13.根据权利要求1至9的双特异性抗体，其用于治疗癌症。

14.根据权利要求1至9的双特异性抗体用于制备用于治疗癌症的药物的用途。

15.治疗患有癌症的患者的方法，其通过向需要这样的治疗的患者施用根据权利要求1至9的双特异性抗体进行。