KR20180025865A - 다중특이적 항원 결합 분자 및 이의 용도 - Google Patents

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gly
ser
multispecific antigen
leu
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줄리안 안드레예프
니티아 탐비
프랭크 델피노
조엘 마틴
가빈 서스톤
캐서린 시그나
니콜라스 파파도폴로스
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리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 다중특이적 항원 결합 분자 및 이의 용도를 제공한다. 다중특이적 항원 결합 분자는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 내재화 이펙터 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함한다. 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 일부 구현예에서 표적 단백질 및 내재화 이펙터 단백질 둘 다에 결합할 수 있는 이중특이적 항체일 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 표적 분자와 내재화 이펙터 단백질의 동시 결합은 표적 분자 단독의 결합보다 더 큰 정도로 표적 분자의 활성의 약화를 유발한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 표적 분자는 종양 관련 항원이고, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 종양 관련 항원과 내재화 이펙터 단백질의 동시 결합은 종양 세포의 표적화된 사멸을 유발하거나 촉진한다.

Description

다중특이적 항원 결합 분자 및 이의 용도
본 발명은 치료 단백질 분야에 관한 것으로, 구체적으로는 시험관 내 또는 생체 내에서 하나 이상의 표적 분자를 불활성화, 차단, 약화, 제거 및/또는 하나 이상의 표적 분자의 농도를 감소시킬 수 있는 치료 단백질 분야에 관한 것이다.
치료제 처리는 종종 세포에 작용하거나 세포 근처에서 작용하는 하나 이상의 표적 분자의 불활성화 또는 차단을 필요로 한다. 예를 들어, 항체를 기반으로 한 치료제는 종종 세포 표면에 발현된 특정 항원과의 결합 또는 가용성 리간드와의 결합에 의해 이러한 항원의 정상적인 생물학적 활성을 방해함으로써 기능한다. 항체 및 예를 들어, 다양한 사이토카인(예컨대, IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33 등) 또는 그것들의 각각의 수용체를 대상으로 한 기타 결합 구성체는 광범위한 인간의 질환 및 질병을 치료하는 데 유용한 것으로 밝혀졌다. 이러한 유형의 치료제는 전형적으로 세포 신호 전달을 약화시키거나 억제하기 위해 사이토카인과 그 수용체 사이의 상호 작용을 차단함으로써 기능한다. 그러나 일부 맥락에서는 표적 분자의 또 다른 성분과의 물리적 상호 작용을 차단하는 것을 반드시 수반하는 것만은 아닌 방식으로 표적 분자의 활성을 불활성화하거나 억제하는 것이 치료적으로 유익할 것이다. 표적 분자의 그러한 비 차단성 약화를 달성할 수 있는 한 가지 방법은 표적 분자의 세포 외 또는 세포 표면 농도를 감소시키는 것일 것이다. 주어진 표적 분자의 양 또는 농도를 감소시키기 위한 유전자 및 핵산 기반의 전략이 당해 분야에 공지되어 있지만, 그러한 전략들에는 종종 실질적인 기술적 복잡함 및 치료 환경에서의 의도하지 않은 부작용이 뒤따른다. 따라서, 치료 목적을 위해 다양한 표적 분자들의 불활성화 또는 약화를 촉진하기 위해서는 대안적인 비 차단성 전략이 필요하다.
본 발명은 적어도 부분적으로는, 표적 분자와 내재화 이펙터 단백질 사이의 물리적 연결을 촉진하거나 유발하여 표적 분자를 약화시키거나 불활성화하는 개념을 기반으로 한다. 이런 유형의 물리적인 분자간 연결을 통해, 이러한 표적 분자는 내재화 이펙터 단백질과 함께 세포 안으로 내재화되도록 강제되어 세포 내 분해 기구에 의해 처리되거나, 그렇지 않으면 약화, 격리, 또는 불활성화될 수 있다. 이 메커니즘은 표적 분자와 그의 결합 파트너 사이의 상호 작용을 반드시 차단하지는 않으면서 표적 분자의 활성을 불활성화하거나 약화시키기 위한 신규하고 진보적인 전략을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 표적 분자(T) 및 내재화 이펙터 단백질(E)과 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 제1 항원 결합 도메인(D1) 및 제2 항원 결합 도메인(D 2)을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자를 제공하는데, 이때 D1은 T와 특이적으로 결합하고, D2는 E와 특이적으로 결합하며, 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 T와 E의 동시 결합은 D1 단독에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 T의 활성을 약화시킨다. T의 활성의 증대된 약화는 그것의 E와의 물리적 연결을 통한 T의 강제된 내재화/분해로 인한 것일 수 있다. 그러나 다른 작용 메커니즘도 가능하며 이는 본 발명의 범위로부터 배제되지 않는다.
또한, 본 발명은 표적 분자(T)의 활성을 불활성화 또는 약화시키기 위해 이러한 다중특이적 항원 결합 분자를 이용하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 T와 내재화 이펙터 단백질(E)을 다중특이적 항원 결합 분자와 접촉시킴으로써 T의 활성을 불활성화하거나 약화시키는 방법을 제공하는데, 이때 이러한 다중특이적 항원 결합 분자는 제1 항원 결합 도메인(D1) 및 제2 항원 결합 도메인(D2)을 포함하고, D1은 T와 특이적으로 결합하고, D2는 E와 특이적으로 결합하며; 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 T와 E의 동시 결합은 T의 활성을 D1 단독에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 약화시킨다.
본 발명의 특정 구현예에서, D1 및/또는 D2는 적어도 하나의 항체 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 다중특이적 항원 결합 분자는 일부 구현예에서 이중특이적 항체일 수 있는데, 이때 D1은 T와 특이적으로 결합하는 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역(HCVR/LCVR) 쌍을 포함하고, D2는 E에 특이적으로 결합하는 HCVR/LCVR 쌍을 포함한다. 대안적으로는, D1 및/또는 D2는 표적 분자(T) 및/또는 내재화 이펙터 단백질(E)과 특이적으로 상호 작용하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 분자가 세포 표면 수용체인 경우, D1은 이러한 세포 표면 수용체 표적 분자와 특이적으로 결합하는 리간드의 부분을 포함할 수 있다. 마찬가지로, 내재화 이펙터 단백질이 세포 표면 내재화 수용체인 경우, D2는 이러한 세포 표면 내재화 수용체와 특이적으로 결합하는 리간드의 부분을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, D1은 T와 특이적으로 결합하는 항체 가변 영역을 포함하고, D2는 E와 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 또 다른 구현예에서, D1은 T와 특이적으로 결합하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함하고, D2는 E와 특이적으로 결합하는 항체 가변 영역을 포함한다. 그러나 어떠한 구성에서든 최종 결과는 T와 E가 직접적으로 또는 간접적으로, 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 T와 E의 동시 결합을 통해 물리적으로 연결될 수 있다는 것이다.
다른 구현예는 다음의 상세한 설명의 검토로부터 명백해질 것이다.
도 1(패널 A 내지 D)은 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자에 대한 일반적인 4가지의 예시적인 작용 메커니즘에 대한 개략도를 제공한다. 각각의 도시된 구성에서, D1은 제1 항원 결합 도메인이고, D2는 제2 항원 결합 도메인이며, T는 표적 분자이고, E는 내재화 이펙터 단백질이며, R은 E와 결합 시 내재화하는 수용체이다. 패널 A는 T와 E 둘 다 막과 결합되어 있는 상황을 도시한 것이다. 패널 B는 T가 가용성이고 E가 막과 결합되어 있는 상황을 도시한 것이다. 패널 C는 T가 막과 결합되어 있고 E가 세포와 상호 작용하고, E와 R의 상호 작용을 통해 세포 안으로 내재화되는 가용성 단백질인 상황을 도시한 것이다. 패널 D는 T가 가용성이고 E가 세포와 상호 작용하고, E와 R의 상호 작용을 통해 세포 안으로 내재화되는 가용성 단백질인 상황을 도시한 것이다.
도 2는 상이한 양의 시간(0, 15, 30 및 60분) 동안 DKK1-mFc 다중특이적적 항원 결합 분자와의 인큐베이션 후에 두 개의 상이한 세포(FcγR1만을 발현하는 세포-1, 및 Krm2와 FcγR1을 발현하는 세포-2) 상에서 수행한 면역침전 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 IL-4의 다양한 농도에서 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 항원 결합 단백질("ab 접합체") 또는 대조 구성체 ("대조 1" 및 "대조 2")의 존재 및 부재 하에 Stat6-luc 리포터 HEK293 세포에 의해 생성된 상대적인 IL-4 유도성 발광을 나타낸 것이다.
도 4는 CD63을 대상으로 한 siRNA에 의해 리포터 세포주에서 CD63 발현이 상당히 감소되었다는 점을 제외하고는, 도 3에 나타난 실험과 동일한 방식으로 수행된 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 IL-4 리간드를 첨가하기 전에, 리포터 세포를 다중특이적 항원 결합 단백질("Ab 접합체") 또는 대조 구성체("대조 1" 및 "대조 2")과 함께, 시간 0에서(패널 A와 B), 2시간 동안(패널 C와 D), 또는 밤새(패널 E와 F), 인큐베이션시켰다는 점을 제외하고는, 도 3 및 도 4에 나타난 실험과 유사한 방식으로 수행된 실험의 결과를 나타낸 것이다. 막대 그래프의 윗 줄(패널 A, C 및 E)은 정상적인 수준의 CD63을 발현하는("형질전환되지 않음") 세포에서 수행된 실험의 결과를 나타내는 반면, 막대 그래프의 아랫 줄(패널 B, D 및 F)은 CD63 발현이 CD63을 대상으로 한 siRNA에 의해 리포터 세포주에서 상당히 감소된 세포에서 수행된 실험의 결과를 나타낸다.
도 6은 IL-4 리간드를 첨가하기 전 15분(패널 A), 30분(패널 B), 1시간(패널 C) 또는 2시간(패널 D) 동안, 리포터 세포를 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 항원 결합 단백질("Ab 접합체") 또는 대조 구성체("대조 1" 및 "대조 2")와 함께 인큐베이션시켰다는 점을 제외하고는, 도 3 및 도 4에 나타난 실험과 유사한 방식으로 수행된 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 Stat6-luc 리포터 세포를 항-IL-4R x 항-CD63 이중특이적 항체("이중특이적"), 또는 대조 구성체(항- IL-4R 단일특이적, 또는 IL-4R에만 결합하는 모의 이중특이적)의 다양한 희석물의 존재 하에 10pM의 IL-4로 처리한 실험의 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 도시된 바와 같은 다양한 단일특이적 및 이중특이적 항체와 함께, myc 태그 및 (낮은 pH에서 형광 신호를 생성하는) pH 민감성 표지로 표지된 SOST 구성체로 HEK293 세포를 처리한 실험의 결과를 나타낸 것이다. 결과를 세포당 형광 반점(즉 표지된 소포)의 수의 측면에서 표시하였다. 패널 A는 3시간 동안 얼음 위에서 인큐베이션한 후의 결과를 나타낸 것이고, 패널 B는 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후의 결과를 나타낸 것이며, 패널 C는 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후의 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 HEK293 세포를 항-CD63 x 항-리포다당류(LPS) 이중특이적 항체, 대조 항체, 또는 LPS 단독과 함께, 다양한 시간 동안 대장균(패널 A) 또는 S. 미네소타(패널 B)로부터의 형광 표지된 LPS로 처리한 후, 비-내재화된(즉, 표면 결합된) 형광 발색단의 ??칭을 수행한 실험의 결과를 나타낸 것이다. 따라서 형광 신호는 도시된 다양한 조건 하에서의 내재화된 LPS를 반영한다. 결과를 세포당 형광 반점(즉 표지된 소포)의 수의 측면에서 표시하였다.
도 10은 알렉사488 표지된 FelD1-mycv-myc-his으로부터의 평균 형광을 임의 단위로 나타낸 것이다. 청색 막대그래프는 세포 표면 표지를 도시한 것이다. 적색 막대그래프는 내재화된 표지를 도시한 것이다. X축의 그룹 1은 항-HLA-B x 항- FelD1 이중특이적 항체로 처리한 세포를 나타낸다. 그룹 2는 항-HLA-B 2가 단일특이적 모항체로 처리한 세포를 나타낸다. 그룹 3은 igG 동종형 대조군 처리를 나타낸다. 패널 A는 MHC1을 발현하지 않는 C1Rneo B-림프아구성 세포에 의한 FelD1-mmh-488의 결합 및 내재화를 나타낸 것이다. 패널 B는 MHC1을 발현하는 C1Rneo B-림프아구성 세포에 의한 FelD1-mmh-488의 결합 및 내재화를 나타낸 것이다.
도 11은 4℃로부터 37℃로 세포를 옮긴 후 0분 내지 60분에 세포 표면에 남아있는 프로락틴 수용체(PRLR) 또는 HER2의 양을 측정하여 T47D 세포 상에서의 프로락틴 수용체와 HER2의 내재화를 도시한 것이다. 시간에 따라 남아있는 표면 수용체의 백분율을 나타냈다. 사각형은 PRLR을 나타내고, 삼각형은 HER2를 나타낸다.
도 12는 T47D 세포에서 리소좀과 프로락틴 수용체(PRLR) 및 HER2의 공편재화를 도시한 것이다. 시간에 따른 리소좀과 결합된 수용체 백분율을 나타냈다. 사각형은 PRLR을 나타내고, 삼각형은 HER2를 나타낸다.
도 13은 PRLR 및 HER2 절단체 및 키메라를 개략적으로 도시한 것이다.
도 14는 다양한 PRLR 및 HER2 구성체 및 키메라를 발현하는 HEK293 세포들의 형광 현미경 사진을 도시한 것이다. 각 패널의 왼쪽의 서브패널은 내재화 전 4℃에서의 세포를 도시한 것이다. 각 패널의 오른쪽의 서브패널은 37℃에서 1시간 후의 세포를 도시한 것이다. 패널 A는 전체 길이의 PRLR을 발현하는 세포(PRLR FL)를 도시한 것이다. 패널 B는 전체 길이의 HER2를 발현하는 세포(PRLR FL)를 도시한 것이다. 패널 C는 PRLRectoHER2cytoTM 구성체를 발현하는 세포를 도시한 것이다. 패널 D는 HER2ectoPRLRcytoTM 구성체를 발현하는 세포를 도시한 것이다.
도 15는 다양한 PRLR 구성체 및 절단체를 발현하는 HEK293 세포들의 형광 현미경 사진을 도시한 것이다. 패널 A는 4℃에서 1시간 후, PRLR에 대해 염색한, 전체 길이의 PRLR을 발현하는 세포를 도시한 것이다. 패널 B는 37℃에서 I시간 후, PRLR에 대해 염색한, 전체 길이의 PRLR을 발현하는 세포를 도시한 것이다. 패널 C는 4℃에서 1시간 후, PRLR에 대해 염색한, 세포질 도메인의 42개 잔기가 있는 절단된 PRLR을 발현하는 세포를 도시한 것이다. 패널 D는 37℃에서 I시간 후, PRLR에 대해 염색한, 세포질 도메인의 42개 잔기가 있는 절단된 PRLR을 발현하는 세포를 도시한 것이다. 패널 E는 4℃에서 1시간 후, PRLR에 대해 염색한, 세포질 도메인의 21개 잔기만 있는 절단된 PRLR을 발현하는 세포를 도시한 것이다. 패널 F는 37℃에서 I시간 후, PRLR에 대해 염색한, 세포질 도메인의 21개 잔기만 있는 절단된 PRLR을 발현하는 세포를 도시한 것이다.
도 16은 전체 길이의 PRLR을 발현하는 세포(패널 A), 42개 잔기의 세포질 도메인이 남아있는 절단된 PRLR을 발현하는 세포(패널 B) 및 21개 잔기의 세포질 도메인이 남아있는 절단된 PRLR을 발현하는 세포(패널 C)의 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 위의 서브패널은 항-PRLR 항체로 염색한 것이다. 아래 서브패널은 로딩을 제어하기 위해 베타-액틴을 염색한 것이다.
도 17은 PRLR-DM1 또는 HER2-DM1 처리 후의 PRLR 또는 HER2 또는 PRLRectoHER2cytoTM(패널 A), PRLR 또는 HER2ectoPRLRcytoTM(패널 B)의 표면 발현 수준에 대한 초기 유사분열 세포의 백분율을 도시한 것이다.
도 18은 CHX 처리 후 0시간 및 4시간에서의 다양한 PRLR 구성체, 절단체 및 치환체를 발현하는 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 위의 패널은 PRLR을 염색한 것이고, 아래 패널은 로딩을 제어하기 위해 베타-액틴을 염색한 것이다.
도 19는 CHX 처리 후 0시간, 1시간, 2시간 및 4시간에서 전체 길이의 PRLR을 발현하도록 유도된 HEK293 세포의 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 위의 패널은 HER2를 염색한 것이고, 아래 패널은 PRLR을 염색한 것이다.
도 20은 CHX 처리 후 0시간, 2시간 및 4시간에서 PRLR의 세포질 절단 형태를 발현하도록 유도된 HEK293 세포의 전체 세포 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 위의 패널은 HER2를 염색한 것이고, 아래 패널은 PRLR을 염색한 것이다.
도 21은 HER2 x PRLR 이중특이적 항체로 처리한 T47D 세포에서 리소좀과의 HER2의 공편재화를 도시한 것이다. HER2 수용체와 결합된 리소좀 백분율을 시간에 따라 나타냈다. 사각형은 HER2 x PRLR 이중특이적 항체로 처리한 세포를 나타내고, 삼각형은 비 결합성 대조 항체로 처리한 세포를 나타낸다.
도 22는 PRLR-ADC(A), HER2-ADC 플러스 HER2 x PRLR 이중특이적 항체(B), HER2-ADC 단독(C), 비 결합성 대조 ADC(D) 1 nM, 10 nm, 또는 30 nM을 처리하였거나 처리하지 않은(E) 세포 주기 정지된 T47D/HER2 세포의 백분율(Y축)을 도시한 막대그래프이다.
도 23은 증가하는 양의 약물 PRLR-ADC(A; 사각형), HER2-ADC 플러스 HER2 x PRLR 이중특이적 항체(B; 다이아몬드형), HER2-ADC 단독(C; 삼각형), 비 결합성 대조 ADC(D; 원형), 또는 비 결합성 대조 ADC 플러스 HER2 x PRLR 이중특이적 항체(E; 역삼각형)에 대한 HER2를 발현하는 생존 가능한 T47D 세포의 백분율을 도시한 점 블롯이다.
도 24는 항-HLAB x 항-FelD1 이중특이적 항체, 인산염 완충 식염수, 항-FelD1 2가 단일특이적 항체 및 항-HLAB 2가 단일특이적 항체로 처리한 후의 다양한 시간(15분, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일 및 6일)에 항-FelD1 항체로 검사한 마우스 혈청의 웨스턴 블롯 패널을 나타낸 것이다.
도 25는 기저선 수준을 초과하는 마우스 혈청으로부터 제거되어 초기 값으로 정규화된 FelD1-Fc의 비율(Y축)을 나타내는 막대그래프를 도시한 것이다. 항목 1은 항-HLAB x 항-FelD1 이중특이적 항체 처리를 도시한 것이고, 항목 2는 항-FelD1 2가 단일특이적 항체 처리를 도시한 것이며, 항목 3은 항-HLAB 2가 단일특이적 항체 처리를 도시한 것이다(X축).
도 26은 HEK293 세포로의 pHrodo®-hHJV-mmh 흡수를 나타낸 막대그래프이다. Y축은 pHrodo® 신호의 통합 강도(임의 단위)를 나타낸다. X축에서, 항-Myc::PCSK9는 항체 없음(백색 막대), α-Myc::PCSK9FL(흑색 막대), α-Myc::PCSK9LC(수평선 무늬 막대) 및 α-Myc::PCSK9SC(점각 무늬 막대)로 인한 HJV 흡수에 미치는 영향을 도시한 것이다. 항-HJV::PCSK9는 항체 없음(백색 막대), α-HJV-N::PCSK9FL(흑색 막대), α-HJV-N::PCSK9LC(수평선 무늬 막대) 및 α-HJV-N::PCSK9SC (점각 무늬 막대)로 인한 HJV 흡수에 미치는 영향을 도시한 것이다. 어떠한 항체도 배경 흡수를 제어하지 않는다.
도 27은 항-HJV-차단성 2차 단일특이적 항체 (1); 항-Myc::PCSK9 전체 길이 융합 단백질(2); 항-HJV-비 차단성 2가 단일특이적 항체(3); 및 항-HJV-비 차단제::PCSK9 전체 길이 융합 단백질 (4)로 hHLAB 형질전환 마우스를 처리하고 1주 후, 혈청 데시리터당 마이크로그램으로 나타낸 혈청 철 수준을 보여주는 점 블롯이다.
본 발명의 방법을 설명하기 전에, 본 발명은 특정 방법 및 설명된 실험 조건이 다양하여 이러한 방법 및 조건에 제한되지 않는 것으로 이해해야 한다. 또한 본 발명의 범위는 단지 첨부된 청구항에 의해 제한되므로 본 발명에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하고자할 뿐 제한하는 것은 아닌 것으로 이해해야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 당해 기술분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 설명에 사용된 용어 "약"은 인용된 특정 수치와 관련하여 사용될 때, 이러한 값이 인용된 값과 1% 이내에서 다를 수 있음을 의미한다. 예를 들어 본 설명에 사용된 바와 같이, 표현 "약 100"은 99와 101을 포함하고 그 사이의 모든 값(예컨대 99.1, 99.2, 99.3, 99.4 등)을 포함한다.
본 발명에 기재된 방법 및 재료와 유사 또는 동등한 어떠한 방법 및 재료도 본 발명의 실시 또는 검사에 사용될 수 있으나, 바람직한 방법 및 재료를 지금부터 설명한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허, 출원 및 비 특허 공개문헌은 전체가 참조로 본 설명에 포함된다.
다중특이적 항원 결합 분자
본 발명자들은 놀랍게도 다중특이적 항원 결합 분자를 통해 표적 분자를 내재화 이펙터 단백질에 연결시킴으로써 표적 분자의 활성을 약화시킬 수 있음을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 제1 항원 결합 도메인(본 설명에서 "D1"이라고도 지칭됨), 및 제2 항원 결합 도메인(본 설명에서 "D2"라고도 지칭됨)을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자를 제공한다. D1과 D2는 각각 상이한 분 자에 결합한다. D1은 특이적으로 "표적 분자"와 결합한다. 이러한 표적 분자는 본 설명에서 "T"로도 지칭된다. D2는 특이적으로 "내재화 이펙터 단백질"과 결합한다. 이러한 내재화 이펙터 단백질은 본 설명에서 "E"로도 지칭된다. 본 발명에 따르면, 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 T와 E의 동시 결합은 D1 단독에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 T의 활성을 약화시킨다. 본 설명에 사용된 바와 같이, 다중특이적 항원 결합 분자의 맥락에서 "동시 결합"이라는 표현은 이러한 다중특이적 항원 결합 분자가 표적 분자(T)와 내재화 이펙터 단백질(E) 사이의 물리적 연결을 촉진하기 위하여 생리적으로 관련 있는 조건 하에서 적어도 일정 시간 동안 T와 E를 둘 다 접촉할 수 있음을 의미한다. 다중특이적 항원 결합 분자의 T 및 E 성분과의 결합은 순차적일 수 있다. 예컨대, 이러한 다중특이적 항원 결합 분자는 먼저 T에 결합한 후 E에 결합할 수 있거나, 먼저 E에 결합한 후 T에 결합할 수 있다. 어떠한 경우든지, T와 E가 모두 다중특이적 항원 결합 분자에 의해 일정 시간 동안 (결합의 순차적 순서와 관계 없이) 결합되는 한, 이러한 다중특이적 항원 결합 분자는 본 개시의 목적을 위해 T와 E에 "동시에 결합"하는 것으로 간주될 것이다. 이론에 의해 구속되지는 않지만, 이러한 T의 증대된 불활성화는 내재화 및 그것의 E와의 물리적 연결로 인한 세포 내부에서의 T의 분해성 경로 변경에 의해 유발되는 것으로 여겨진다. 그러므로 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 표적 분자의 기능을 직접적으로 차단하거나 길항하지 않으면서 표적 분자의 불활성화 및/또는 표적 분자의 활성 및/또는 세포 외 농도의 감소에 유용하다.
본 발명에 따르면, 다중특이적 항원 결합 분자는 단일한 다중기능성 폴리펩티드일 수 있거나, 상호 간에 공유적으로 또는 비 공유적으로 결합되는 두 개 이상의 폴리펩티드의 다량체 복합체일 수 있다. 본 개시에 의해 명백해질 바와 같이, T 및 E 분자와 동시에 결합하는 능력이 있는 어떠한 항원 결합 구성체는 다중특이적 항원 결합 분자로서 간주된다. 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자 또는 이의 변이체 중 어느 것이나 당업자에게 알려질 것과 같이 표준 분자 생물 기법(예컨대 재조합 DNA 및 단백질 발현 기술)을 이용하여 구성될 수 있다.
항원 결합 도메인
본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 적어도 두 개의 별도의 항원 결합 도메인(D1 및 D2)을 포함한다. 본 설명에서 사용된 표현 "항원 결합 도메인"은 관심 있는 특정 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 펩티드, 폴리펩티드, 핵산 분자, 스캐폴드형 분자, 펩티드 디스플레이 분자, 또는 폴리펩티드를 함유하는 구성체를 의미한다. 본 설명에서 사용된 용어 "특이적으로 결합하는" 등은 이러한 항원 결합 도메인이 500pM 이하의 해리 상수(KD)를 특징으로 하는 특정 항원과 복합체를 형성하고, 통상적인 시험 조건 하에서는 다른 관련 없는 항원과 결합하지 않음을 의미한다. "관련 없는 항원"은 서로에 대해 95% 미만의 아미노산 동일성을 나타내는 단백질, 펩티드 또는 폴리펩티드이다.
본 발명의 맥락에 사용될 수 있는 항원 결합 도메인의 예시적인 범주는 항체, 항체의 항원 결합 부분, 특정 항원(예컨대 펩티바디)과 특이적으로 상호 작용하는 펩티드, 특정 항원과 특이적으로 상호 작용하는 수용체 분자, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 수용체의 리간드 결합 부분을 포함하는 단백질, 항원 결합 스캐폴드(예컨대 설계된 안키린 반복 단백질(DARPin), HEAT 반복 단백질, ARM 반복 단백질, 테트라트라이코펩티드 반복 단백질 및 자연 발생적인 반복 단백질을 토대로 한 다른 스캐폴드 등[예컨대 Boersma and Pluckthun, 2011, Curr . Opin . Biotechnol. 22:849-857, 및 본 설명에 인용된 참고문헌 참조]) 및 앱타머 또는 이의 부분들을 포함한다.
이러한 표적 분자 또는 내재화 이펙터 단백질이 수용체 분자인 일부 구현예에서, 본 발명의 목적을 위한 "항원 결합 도메인"은 이러한 수용체에 대해 특이적인 리간드 또는 리간드의 부분을 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적 분자(T)가 IL-4R이라면, 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 성분은 IL-4 리간드 또는 IL-4R과 특이적으로 상호 작용할 수 있는 IL-4 리간드의 부분을 포함할 수 있고, 또는 이러한 내재화 이펙터 단백질(E)이 트랜스페린 수용체라면, 다중특이적 항원 결합 분자의 D2 성분은 트랜스페린, 또는 트랜스페린 수용체와 특이적으로 상호 작용할 수 있는 트랜스페린의 부분을 포함할 수 있다.
이러한 표적 분자 또는 내재화 이펙터 단백질이 특별한 수용체(예컨대 가용성 표적 분자)에 의해 특이적으로 인지되는 리간드인 특정 구현예에서, 본 발명의 목적을 위한 "항원 결합 도메인"은 이러한 수용체 또는 수용체의 리간드 결합 부분을 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 이러한 표적 분자(T)가 IL-6라면, 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 성분은 IL-6 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있고, 또는 만약 내재화 이펙터 단백질(E)이 간접적으로 내재화되는 단백질(이 용어는 본 설명의 다른 곳에서 정의된 바와 같음)이라면, 다중특이적 항원 결합 분자의 D2 성분은 E에 대해 특이적인 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함할 수 있다.
두 개의 분자가 특이적으로 상호 간에 결합하는지를 결정하는 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있 고, 예를 들어, 평형 투석, 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 맥락에서 사용된 항원 결합 도메인은 특별한 항원(예컨대 표적 분자[T] 또는 내재화 이펙터 단백질[E]) 또는 그것의 부분에, 표면 플라스몬 공명 분석으로 결정되는 바, 약 500pM 미만, 약 400pM 미만, 약 300pM 미만, 약 200pM 미만, 약 100pM 미만, 약 90pM 미만, 약 80pM 미만, 약 70pM 미만, 약 60pM 미만, 약 50pM 미만, 약 40pmM 미만, 약 30pM 미만, 약 20pM 미만, 약 10pM 미만, 약 5pM 미만, 약 4pM 미만, 약 2pM 미만, 약 1pM 미만, 약 0.5pM 미만, 약 0.2pM 미만, 약 0.1pM 미만, 또는 약 0.05pM 미만의 KD로 결합하는 폴리펩티드를 포함한다.
본 설명에서 사용된 용어 "표면 플라스몬 공명"은 예컨대 비아코어(BIAcoreTM) 시스템(GE 헬스케어(Healthcare)의 비아코어 라이프 사이언스 부(Biacore Life Sciences division), 미국 뉴저지 주 피츠카타웨이 소재)을 사용하여, 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도 변경 검출에 의해 실시간 상호 작용 분석을 가능하게 하는 광학 현상을 지칭한다.
본 설명에 사용된 용어 "KD"는 특별한 단백질-단백질 상호 작용(예컨대 항체-항원 상호 작용)의 평형 해리 상수를 의미한다. 달리 표시되지 않는 한, 본 설명에 개시된 KD 값은 25℃에서 표면 플라스몬 공명 분석에 의해 결정된 KD 값을 나타낸다.
항체 및 항체의 항원 결합 단편
위에서 나타낸 바와 같이, "항원 결합 도메인"(D1 및/또는 D2)은 항체 또는 항체의 항원 결합 단편을 포함하거나 이것으로 구성될 수 있다. 본 설명에 사용된 용어 "항체"는 특정 항원(예컨대 T 또는 E)과 특이적으로 결합하거나 상호 작용하는 적어도 하나의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 임의의 항원 결합 분자 또는 분자 복합체를 의미한다. 용어 "항체"는 4개의 폴리펩티드 사슬, 즉 이황화 결합에 의해 상호 연결된 두 개의 무거운(H) 사슬 및 두 개의 가벼운(L) 사슬을 포함하는 면역글로불린 분자뿐만 아니라 이의 다량체(예컨대, IgM)를 포함한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 설명에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨)과 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 세 개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 설명에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨)과 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인을 포함한다(CL1). VH와 VL 영역은 추가적으로, 더 보존적이면서 프레임워크 영역(FR)이라 지칭되는 영역들이 중간에 끼어 있는, 상보성 결정 영역(CDR)이라 지칭되는 초가변성 영역으로 다시 나누어질 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노 말단으로부터 카르복시 말단 쪽으로 다음 순서로 배열된 세 개의 CDR과 네 개의 FR을 포함한다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 본 발명의 상이한 구현예에서, 본 발명의 항체(또는 이의 항원 결합 부분)의 FR은 인간 생식선 서열과 동일하거나, 자연적으로 또는 인공적으로 변형될 수 있다. 아미노산 공통 서열은 둘 이상의 CDR의 병렬 분석을 기초로 하여 정의될 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 및/또는 D2 성분은 전체 항체 분자의 항원 결합 단편을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다. 본 설명에서 사용된 용어 항체의 "항원 결합 부분", 항체의 "항원 결합 단편" 등은 항원에 특이적으로 결합하여 복합체를 형성하는 임의의 자연적으로 발생하는, 또는 효소적으로 얻을 수 있는, 또는 유전자 조작된 폴리펩티드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원 결합 단편은 임의의 적합한 표준 기법, 예컨대 단백질 가수분해성 소화 또는 항체 가변 도메인 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현을 포함하는 재조합 유전자 조작 기법을 사용하여 전체 항체 분자로부터 유도될 수 있다. 그런 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들면 상업적인 출처, DNA 라이브러리(이를테면, 예컨대 파지-항체 라이브 러리)로부터 용이하게 이용할 수 있거나, 또는 합성될 수 있다. 이러한 DNA는 시퀀싱될 수 있고, 예를 들면 하나 또는 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적당한 구성으로 배열하기 위해, 또는 코돈을 도입하고, 시스테인 잔기를 생성하며, 아미노산을 변형, 첨가 또는 결실시키기 위해서 등, 화학적으로 또는 분자 생물학 기법을 사용하여 조작될 수 있다.
항원 결합 단편의 비 제한적인 예는 다음을 포함한다: (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변성 영역을 모방하는 아미노산으로 구성되는 최소 인지 단위(예컨대 분리된 상보성 결정 영역(CDR), 예를 들면 CDR3 펩티드), 또는 제한된 FR3-CDR3-FR4 펩티드 다른 유전자 조작된 분자, 예를 들면 도메인-특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 -결실된 항체, 키메릭 항체, CDR-그래프트된 항체, 이중체, 삼중체, 사중체, 미니바디, 나노바디(예컨대 1가의 나노바디, 2가의 나노바디 등), 작은 모듈의 면역의약품(SMIP) 및 상어 가변성 IgNAR 도메인도 본 설명에서 사용된 표현 "항원 결합 단편"에 포함된다.
항체의 항원 결합 단편은 전형적으로 적어도 하나의 가변 도메인을 포함할 것이다. 이러한 가변 도메인은 임의의 크기 또는 아미노산 조성일 수 있고, 일반적으로 하나 이상의 프레임워크 서열에 인접하거나 그것과 한 프레임에 있는 적어도 하나의 CDR을 포함할 것이다. VL 도메인과 결합된 VH 도메인을 갖는 항원 결합 단편에서, VH 및 VL 도메인은 임의의 적합한 배열로 상호 간에 관련하여 위치할 수 있다. 예를 들어, 가변 영역은 이량체일 수 있고, VH-VH, VH-VL 또는 VL-VL 이량체를 함유할 수 있다. 대안적으로, 항체의 항원 결합 단편은 단량체의 VH 또는 VL 도메인을 함유할 수 있다.
특정 구현예에서, 항체의 항원 결합 단편은 적어도 하나의 불변 도메인에 공유적으로 연결된 적어도 하나의 가변 도메인을 함유할 수 있다. 본 발명의 항체의 항원 결합 단편 내에서 찾아볼 수 있는 가변 및 불변 도메인의 비 제한적인, 예시적인 구성은 다음을 포함한다: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH-CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1-CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; 및 (xiv) VL-CL. 위에서 열거된 임의의 예시적인 구성을 포함하는 가변 및 불변 도메인의 임의의 구성에서, 이러한 가변 및 불변 도메인은 직접적으로 상호간에 연결되거나 또는 전체 또는 부분적인 힌지 또는 링커 영역에 의해 연결될 수 있다. 힌지 영역은 단일 폴리펩티드 분자의 인접한 가변 및/또는 불변 도메인 사이에 가요성 또는 반 가요성 연결을 초래하는 적어도 2개(예컨대 5, 10, 15, 20, 40, 60 이상)의 아미노산으로 구성될 수 있다. 더욱이, 항원 결합 단편은 위에서 열거된 임의의 가변 및 불변 도메인 구성의 동종-이량체 또는 이종-이량체 (또는 다른 다량체)를 상호 간에 및/또는 하나 이상의 단량체 VH 또는 VL 도메인과의 비 공유적 결합으로 (예컨대 이황화 결합(들)에 의하여) 포함할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 인간 항체 및/또는 재조합 인간 항체, 또는 이의 단편을 포함하거나 그것들로 구성될 수 있다. 본 설명에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 그럼에도 인간 항체는 예를 들면 CDR 및 특히 CDR3에 인간 생식선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예컨대, 시험관 내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발에 의해 또는 생체 내 체세포성 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나 본 설명에 사용된 용어 "인간 항체"는 또 다른 포유류 종, 예를 들면 마우스의 생식선으로부터 유도된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열 위로 그래프트되어 있는 항체를 포함하고자 한 것은 아니다.
본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 재조합 인간 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다. 본 설명에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 모든 인간 항체, 예를 들면 숙주 세포 안에 형질전환된 재조합 발현 벡터를 사 용하여 발현된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 재조합된 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체(아래에서 상세하게 설명됨), 인간 면역글로불린 유전자에 대해 유전자가 도입된 동물(예컨대, 마우스)로부터 분리된 항체(예컨대, Taylor et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 참조) 또는 다른 DNA 서열에 대해 인간 면 역글로불린 유전자 서열의 스플라이싱을 포함하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 분리된 항체를 포함하고자 한 것이다. 그런 재조합 인간 항체는 인간 생식선 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나 일부 구현예에서, 그런 재조합 인간 항체는 시험관 내 돌연변이 유발(또는 인간 Ig 서열에 대해 유전자가 도입된 동물이 사용될 때에는 생체 내 체세포성 돌연변이 유발)이 이루어지고, 그로써 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식선 VH 및 VL 서열로부터 유래되고 그것과 관련되지만, 생체 내에서 인간 항체 생식선 레퍼토리 내에 자연적으로 존재할 수 없을 것이다.
이중특이적 항체
특정 구현예에 따르면, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 이중 특이적 항체, 예를 들면 표적 분자(T)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 아암(arm) 및 내재화 이펙터 단백질(E)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 아암을 포함하는 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 알려져 있고, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자를 구성하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 예시적인 이중특이적 형식으로는, 제한 없이 예를 들어, scFv-기초 또는 이중체 이중특이적 형식, IgG-scFv 융합, 이중 가변 도메인(DVD)-Ig, 콰드로마, 놉-인투-홀(knobs-into-holes), 공통 경쇄(예컨대 놉-인투-홀을 가지는 공통 경쇄 등), CrossMab, CrossFab, (SEED)바디, 류신 지퍼, 듀오바디, IgG1/IgG2, 이중으로 작용하는 Fab (DAF)-IgG 및 Mab2 이중특이적 형식(전술한 형식을 검토하려면, 예컨대, Klein et al. 2012, mAbs 4:6, 1-11, 및 여기에 인용된 참고문헌 참조)을 포함한다.
다량체화 성분
특정 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 하나 이상의 다량체화 성분(들)을 포함 할 수도 있다. 다량체화 성분은 항원 결합 도메인들(D1 및 D2) 사이의 결합을 유지하는 기능을 할 수 있다. 본 설명에 사용된 "다량체화 성분"은 동일하거나 유사한 구조 또는 구성의 제2의 다량체화 성분과 결합하는 능력이 있는 임의의 거대분자, 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 아미노산이다. 예를 들어, 다량체화 성분은 면역글로불린 CH3 도메인을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다. 다량체화 성분의 비 제한적 예는 면역글로불린의 Fc 부분, 예컨대 동종형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 각 동종형 그룹 내의 임의의 동종이인자형으로부터 선택된 IgG의 Fc 도메인이다. 특정 구현예에서, 다량체화 성분은 Fc 단편 또는 적어도 하나의 시스테인 잔기를 함유하는 1 내지 약 200개 아미노산 길이의 아미노산 서열이다. 다른 구현예에서, 다량체화 성분 은 시스테인 잔기, 또는 짧은 시스테인을 함유하는 펩티드이다. 다른 다량체화 도메인은 류신 지퍼, 나선-루프 모티프 또는 이중 코일 모티프를 포함하거나 이들로 구성된 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 두 개의 다량체화 도메인 M1 및 M2를 포함하는데, 이때 D1은 M1에 부착되고 D2는 M2에 부착되며, M1의 M2와의 결합은 단일 다중특이적 항원 결합 분 자에서 D1 및 D2의 상호 간의 물리적 연결을 촉진한다. 특정 구현예에서, M1과 M2는 서로 동일하다. 예를 들어, M1은 특정 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인일 수 있고, M2는 M1과 동일한 아미노산 서열을 갖는 Fc 도메인이다. 대안적으로, M1과 M2는 하나 이상의 아미노산 위치에서 서로 다를 수 있다. 예를 들어 M1은 제1 면역글로불린(Ig) CH3 도메인을 포함할 수 있고, M2는 제2 Ig CH3 도메인을 포함할 수 있 는데, 이때 제1 및 제2 Ig CH3 도메인은 서로 적어도 하나의 아미노산이 상이하고, 적어도 하나의 아미노산 차이는 동일한 M1과 M2 서열을 갖는 참조 구성체와 비교하여 단백질 A에 대한 표적화 구성체의 결합을 감소시킨다. 한 구현예에서, M1의 Ig CH3 도메인은 단백질 A에 결합하고, M2의 Ig CH3 도메인은 H95R 변경 (IMGT 엑손 넘버링에 의함; EU 넘버링에 의하면 H435R)과 같은 단백질 A 결합을 감소시키거나 없애는 돌연변이를 함유한다. M2의 CH3은 Y96F 변경(IMGT에 의함; EU에 의하며 Y436F)을 더 포함할 수 있다. M2의 CH3 내에서 발견될 수 있는 추가적인 변경은 다음을 포함한다: IgG1 Fc 도메인의 경우 D16E, L18M, N44S, K52N, V57M 및 V82I (IMGT에 의함; EU에 의하면 D356E, L358M, N384S, K392N, V397M 및 V422I); IgG2 Fc 도메인의 경우 N44S, K52N 및 V82I (IMGT에 의함; EU에 의하면 N384S, K392N 및 V422I); 및 IgG4 Fc 도메인의 경우 Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q 및 V82I (IMGT에 의함; EU에 의하면 Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q 및 V422I).
내재화 이펙터 단백질(E)
본 발명의 맥락에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D2 성분은 내재화 이펙터 단백질("E")과 특이적으로 결합한다. 내재화 이펙터 단백질은 세포 내로 내재화될 수 있거나 그렇지 않으면 역행성 막 수송(trafficking)에 관여하거나 이의 한 원인이 되는 단백질이다. 경우에 따라, 내재화 이펙터 단백질은 통과세포외 배출을 거치는 단백질이다. 즉, 이러한 단백질은 세포의 한 쪽에서 내재화되고, 세포의 다른 쪽으로 운반된다(예컨대, 정점에서 바닥으로). 많은 구현예에서, 내재화 이펙터 단백질은 세포 표면 발현된 단백질 또는 가용성 세포 외 단백질이다. 그러나 본 발명은 또한 내재화 이펙터 단백질이 엔도솜, 소포체, 골지, 리소좀 등과 같은 세포 내 구획 내에서 발현되는 구현예도 고려한다. 예를 들어, 역행성 막 수송(예컨대 초기/재순환 엔도솜으로부터 트랜스-골지 네트워크까지의 경로)에 관련된 단백질은 본 발명의 다양한 구현예에서 내재화 이펙터 단백질로 작용할 수 있다. 어떠한 경우에서든지, D2의 내재화 이펙터 단백질과의 결합은 전체 다중특이적 항원 결합 분자, 및 이와 결합된 임의의 분자(예컨대, D1에 의해 결합된 표적 분자)가 세포 내로 내재화되도록 한다. 아래에서 설명된 바와 같이, 내재화 이펙터 단백질은 세포 내로 직접적으로 내재화되는 단백질뿐 아니라 세포 내로 간접적으로 내재화되는 단백질도 포함한다.
세포 내로 직접적으로 내재화되는 내재화 이펙터 단백질은 적어도 하나의 세포 외 도메인을 갖는 막 결합 분자(예컨대, 막관통 단백질, GPI 닻형 단백질 등)를 포함하는데, 그것들은 세포 내재화를 거치며, 바람직하게는 세포 내 분해 및/또는 재순환 경로를 통해 처리된다. 세포 내로 직접적으로 내재화되는 내재화 이펙터 단백질의 구체적인 비 제한적 예로는 CD63, MHC-I (예컨대, HLA-B27), 크레멘-1, 크레멘-2, LRP5, LRP6, LRP8, 트랜스페린 수용체, LDL-수용체, LDL-관련 단백질 1 수용체, ASGR1, ASGR2, 아밀로이드 전 구체 단백질 유사 단백질-2(APLP2), 아펠린 수용체(APLNR), MAL(미엘린 및 림프구 단백질, VIP17이라고도 알려져 있음), IGF2R, 액포형 H+ ATPase, 디프테리아 독소 수용체, 엽산 수용체, 글루타메이트 수용체, 글루타티온 수용체, 렙틴 수용체, 스캐빈저 수용체(예컨대 SCARA1-5, SCARB1-3, CD36) 등이 포함된다.
일부 구현예에서, 이러한 내재화 이펙터 단백질은 프로락틴 수용체(PRLR)이다. PRLR은 일부 치료적 적용을 위한 표적일 뿐만 아니라 내재화 및 전환(turn-over)의 높은 속도를 기반으로 한 효율적인 내재화 이펙터 단백질이기도 하다는 점이 발견되었다. 내재화 이펙터 단백질로서의 PRLR의 가능성은 예를 들어 WO2015/026907에서 설명되었는데, 그 중에서도 시험관 내에서 항-PRLR 항체가 PRLR을 발현하는 세포에 의해 효과적으로 내재화됨이 증명되었다.
E가 직접적으로 내재화되는 이펙터 단백질인 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D2 성분은 예를 들면 E에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편, 또는 이펙터 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 리간드 또는 리간드의 부분일 수 있다. 예를 들어, E가 크레멘-1 또는 크레멘-2인 경우, D2 성분은 크레멘 리간드(예컨대 DKK1) 또는 이의 크레멘 결합 부분을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다. 다른 예로서, E가 ASGR1과 같은 수용체 분자인 경우, D2 성분은 이러한 수용체에 특이적인 리간드(예컨대, 아시알로오로소뮤코이드 [ASOR] 또는 베타-GalNAc) 또는 이의 수용체 결합 부분을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다.
세포 내로 간접적으로 내재화되는 내재화 이펙터 단백질은, 단독으로 내재화하지 않지만 결합 후에 또는 그렇지 않으면 세포 내로 직접적으로 내재화되는 제2 단백질 또는 폴리펩티드와 결합한 후에 세포 내로 내재화되는 단백질 및 폴리펩티드를 포함한다. 세포 내로 간접적으로 내재화되는 단백질에는 예를 들어, 내재화 세포 표면에 발현된 수용체 분자에 결합할 수 있는 가용성 리간드가 포함된다. 내재화 세포 표면에 발현된 수용체와의 상호 작용을 통하여 세포 내로 (간접적으로) 내재화되는 가용성 리간드의 비 제한적인 예는 트랜스페린이다. E 가 트랜스페린(또는 또 다른 간접적으로 내재화되는 단백질)인 구현예에서, D2의 E에의 결합, 및 E와 트랜스페린 수용체(또는 또 다른 내재화 세포-표면 발현된 수용체 분자)와의 상호 작용은, 전체 다중특이적 항원 결합 분자 및 그것과 결합된 임의의 분자(예컨대, D1에 의해 결합된 표적 분자)로 하여금 E와 그것의 결합 파트너의 내재화와 동시에 세포 내로 내재화되게 한다.
E가 가용성 리간드와 같이 간접적으로 내재화되는 이펙터 단백질인 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D2 성분은 예를 들면, E에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편, 또는 가용성 이펙터 단백질과 특 이적으로 상호 작용하는 수용체 또는 수용체의 일부분일 수 있다. 예를 들어, E가 사이토카인인 경우, D2 성분은 상응하는 사이토카인 수용체 또는 이의 리간드 결합 부분을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다.
표적 분자(T)
본 발명의 맥락 내에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 성분은 특이적으로 표적 분자("T")에 결합한다. 표적 분자는 그것의 활성 또는 세포 외 농도가 약화되거나, 감소되거나 제거되는 것이 바람직한 임의의 단백질, 폴리펩티드 또는 기타 거대분자이다. 많은 경우에, D1과 결합하는 표적 분자는 단백질 또는 폴리펩티드[즉 "표적 단백 질"]이지만, 본 발명은 표적 분자("T")가 탄수화물, 당단백질, 지질, 리포단백질, 리포다당류 또는 D1과 결합하는 다른 비 단백질 중합체 또는 분자인 구현예들도 포함한다. 본 발명에 따르면, T는 세포 표면-발현된 표적 단백질 또는 가용성 표적 단백질일 수 있다. 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 표적 결합은 세포 외에서 또는 세포 표면 환경에서 발생할 수 있다. 그러나 특정 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 분자는 세포 내부에서, 예를 들면 소포체, 골지, 엔도솜, 리소좀 등과 같은 세포 내 구획 내에서 표적 분자와 결합한다.
세포 표면-발현된 표적 분자의 예로는 세포 표면-발현된 수용체, 막-결합 리간드, 이온 채널 및, 세포막에 부착되거나 그것과 결합된 세포 외 부분을 갖는 임의의 기타 단량체 또는 다량체 폴리펩티드 성분을 포함한다. 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자에 의해 표적화될 수 있는 비 제한적이고 예시적인 세포 표면- 발현된 표적 분자로는, 예를 들면 사이토카인 수용체(예컨대 IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33 등에 대한 수용체)뿐만 아니라, 세포 표면 표적, 이를테면 기타 1형 막관통 수용체, 예컨대 PRLR, G-단백질 결합 수용체, 예를 들면 GCGR, 이온 채널, 예를 들면 Nav1.7, ASIC1 또는 ASIC2, 비-수용체 표면 단백질, 예를 들면 MHC-I(예컨대 HLA-B*27) 등이 있다.
T가 세포 표면-발현된 표적 단백질인 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 성분은 예를 들면 T에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편, 또는 세포 표면-발현된 표적 단백질과 특이적으로 상호 작용하는 리간드 또는 리간드의 부분일 수 있다. 예를 들어, 만약 T가 IL-4R이라면, D1 성분은 IL-4 또는 이의 수용체 결합 부분을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다.
가용성 표적 분자의 예로는 사이토카인, 성장 인자 및 기타 리간드 및 신호 전달 단백질이 포함된다. 본 발명의 다중특이성 항원 결합 분자에 의해 표적화될 수 있는 비 제한적인 예시적인 가용성 표적 단백질에는 예를 들어 IL-1, IL-4, IL-6, IL-13, IL-22, IL-25, IL-33, SOST, DKK1 등이 포함된다. 또한, 가용성 표적 분자에는 예를 들면 알레르기 유발 항원과 같은 비 인간 표적 분자(예컨대 Fel D1, Betv1, CryJ1), 병원체(예컨대 칸디다 알비칸스, S. 아우레우스(aureus) 등), 및 병원성 분자(예컨대 리포다당류[LPS], 리포테이콘산[LTA], 단백질 A, 독소 등)가 포함된다. T 가 가용성 표적 분자인 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 D1 성분은 예를 들면 T에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체의 항원 결합 단편, 또는 가용성 표적 분자와 특이적으로 상호 작용하는 수용체 또는 수용체의 부분일 수 있다. 예를 들어 만약 T가 IL-4라면, D1 성분은 IL-4R 또는 이의 리간드 결합 부분을 포함하거나 그것으로 구성될 수 있다.
표적 분자는 본 설명의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 종양 관련 항원도 포함한다.
pH 의존성 결합
본 발명은 제1 항원 결합 도메인(D1) 및 제2 항원 결합 도메인(D2)을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자를 제공하는데, 이때 항원 결합 도메인 중 하나 또는 둘 다(D1 및/또는 D2)는 그것의 항원(T 또는 E)에 pH 의존적인 방식으로 결합한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인(D1 및/또는 D2)은 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 그것의 항원에 대해 감소된 결합을 나타낼 수 있다. 대안적으로는, 항원 결합 도메인(D1 및/또는 D2)은 중성 pH 와 비교하여 산성 pH에서 그것의 항원에 대해 증대된 결합을 나타낼 수 있다. pH-의존성 결합 특징을 나타내는 항원 결합 도메인은, 예를 들면 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 특정 항원에 대한 감소된 (또는 증대된) 결합에 대해 항체의 집단을 선별함으로써 수득할 수 있다. 추가적으로, 아미노산 수준에서의 항원 결합 도메인의 변형은 pH 의존적 특징을 갖는 항원 결합 도메인을 생성할 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 도메인(예컨대 CDR 내부의) 항원 결합 도메인의 하나 이상의 아미노산을 히스티딘 잔기로 치환함으로써, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 감소된 항원 결합을 나타내는 항원 결합 도메인이 얻어질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 중성 pH에서 그것의 각각의 항원(T 또는 E)에의 결합에 대한 D1 및/또는 D2의 KD보다 적어도 약 3, 5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 또는 그 이상의 배수만큼 더 큰 KD로 산성 pH에서 그것의 각각의 항원에 결합하는 D1 및/또는 D2 성분을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자를 포함한다. pH 의존성 결합은 또한 중성 pH에 비교하여 산성 pH에서 그것의 항원에 대한 항원 결합 도메인의 t½의 관점으로 표시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 중성 pH에서 그것의 각각의 항원(T 또는 E)에의 결합에 대한 D1 및/또는 D2 성분의 t½보다 적어도 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 이상의 배수만큼 더 짧은 t½로 산성 pH에서 그것의 각각의 항원에 결합하는 D1 및/또는 D2 성분을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자를 포함한다.
중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 감소된 항원 결합을 나타내는 D1 및/또는 D2 성분을 포함하는 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 동물 대상체에 투여될 때, 특정 구현예에서 pH 의존성 결합 특징을 나타내지 않는 비슷한 분자와 비교하여 순환계로부터 더 느린 제거를 나타낼 수 있다. 본 발명의 이런 측면에 따르면, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 감소된 항원 결합을 나타내지 않는 비슷한 항원 결합 분자와 비교하여 순환계로부터 적어도 2배 더 느린 제거를 나타내는, 중성 pH와 비교하여 산성 pH에서 T 및/또는 E에 감소된 항원 결합을 나타내는 다중특이적 항원 결합 분자가 제공된다. 제거 속도는 항체의 반감기의 관점으로 표시될 수 있는데, 이때 더 느린 제거가 더 긴 반감기와 상관 관계가 있다.
본 설명에서 사용된 표현 "산성 pH"는 6.0 이하의 pH를 의미한다. "산성 pH"란 표현은 약 6.0, 5.95, 5.8, 5.75, 5.7, 5.65, 5.6, 5.55, 5.5, 5.45, 5.4, 5.35, 5.3, 5.25, 5.2, 5.15, 5.1, 5.05, 5.0 또는 그 이하의 pH 값을 포함한다. 본 설명에서 사용된 표현 "중성 pH"는 약 7.0 내지 약 7.4의 pH를 의미한다. 표현 "중성 pH"는 약 7.0, 7.05, 7.1, 7.15, 7.2, 7.25, 7.3, 7.35 및 7.4의 pH 값을 포함한다.
표적 분자 활성의 약화
본 설명의 다른 곳에서 주지된 바와 같이, 그리고 본 설명의 아래 실시예에 의해 증명되는 바와 같이, 본 발명자들은 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 표적 분자(T) 및 내재화 이펙터 단백질(E)의 동시 결합이 T의 활성을 다중특이적 항원 결합 분자 단독의 제1 항원 결합 도메인(D1)에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 약화시킴을 발견하였다. 본 설명에 사용된 표현 "D1 단독에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 T의 활성을 약화시킨다"는 E를 발현하는 세포를 이용하여 T의 활성을 측정할 수 있는 분석에서, 다중특이적 항원 결합 분자의 존재 하에 측정된 T 활성의 수준이 D1 자체만을 함유하는(즉, 제2 항원 결합 도메인(D2)에 물리적으로 연결되지 않은) 대조 구성체의 존재 하에 측정된 T 활성의 수준보다 적어도 10% 더 낮음을 의미한다. 예를 들어, 다중특이적 항원 결합 분자의 존재 하에 측정된 T 활성의 수준은 D1 자체만을 함유하는 대조 구성체의 존재 하에 측정된 T 활성의 수준보다 약 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100% 더 낮을 수 있다.
다중특이적 항원 결합 분자가 D1 도메인 단독에 의한 표적 분자의 결합보다 더 큰 정도로 표적 분자의 활성을 약화시키는지를 결정하기 위한 비 제한적이고 예시적인 분석 형식을 본 설명의 아래 실시예 1 및 2에 나타냈다. 예를 들어, 실시예 1에서, "T"는 인터류킨-4 수용체(IL-4R)이고, "E"는 CD63이다. 실시예 1의 다중특이적 항원 결합 분자는 스트렙트아비딘/비오틴 링커를 통해 항-CD63 mAb에 연결된 항-IL-4R mAb를 포함하는 2-항체 접합체다. 그러므로 이 예시적인 구성체에서 "D1"은 항-IL-4R 항체의 항원 결합 도메인(HCVR/LCVR 쌍)이고, "D2"는 항-CD63 항체의 항원 결합 도메인(HCVR/LCVR 쌍)이다. 실시예 1 및 2의 실험을 위해서, IL-4R 활성이 외인성 IL-4 리간드 첨가에 의해 자극될 때 리포터 신호를 생성하는 세포 기반의 분석 형식을 이용하였다. 다중특이적 항원 결합 분자의 존재 하에 검출된 IL-4 유도성 리포터 활성의 양을, 관련 없는 대조 면역글로불린(대조 1)에 연결된 항-IL-4R 항체를 함유하는 대조 구성체, 또는 물리적으로 연결되지는 않지만 항-CD63 항체(대조 2)와 조합된 항-IL-4R 항체를 함유하는 대조 구성체의 존재 하에 검출된 IL-4 유도성 리포터 활성의 양과 비교하였다. 이렇게 하여 대조 구성체는 T가 D1 단독에 의해 결합되는(즉, D1은 다중특이적 항원 결합 분자 자체의 일부가 아닌) 상태를 유발한다. 만약 다중특이적 항원 결합 분자의 존재 하에 관찰된 (리포터 신호에 의해 나타낸) 표적 분자 활성의 정도가 D2 성분에 물리적으로 연결되지 않은 D1 성분을 포함하는 대조 구성체(예컨대 대조 1 또는 대조 2)의 존재 하에 관찰된 표적 분자 활성의 양보다 적어도 10% 더 적다면, 본 개시의 목적에 대해, "다중특이적 항원 결합 분자에 의한 T와 E의 동시 결합은 D1 단독에 의한 T의 결합보다 더 큰 정도로 T의 활성을 약화시킨다"는 결론이 내려진다.
(리포터 세포의 항-IL-4R 항체 단독[즉 대조 1 및 2] 처리는 미처리 세포과 비교하여 작은 수준의 IL-4 신호 전달 약화를 유발한 실시예 1의 사례에서와 같이) D1 단독에 의한 T의 결합은 일부 구현예에서 T의 활성의 부분적인 약화를 유발한다. 다른 구현예에서, D1 단독에 의한 T의 결합은 검출할 수 없을 정도의 T 활성의 약화를 유발할 것이다. 즉, T의 생물학적 활성은 D1 단독에 의한 T 결합에 의해 영향 받지 않을 수 있다. 그러나 어떤 경우든, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 T와 E의 동시 결합은 D1 단독에 의한 T 결합보다 더 큰 정도로 T의 활성을 약화시킬 것이다.
본 설명에서 예시된 분석 형식(들)에 대한 대안적인 분석 형식 및 변형은, 임의의 주어진 다중특이적 항원 결합 분자가 유도될 수 있는 특이적인 표적 분자 및 이펙터 단백질의 특성을 고려하면, 당업자에게 명백해질 것이다. 임의의 그러한 형식은 본 발명의 맥락에서 다중특이적 항원 결합 분자에 의한 T 및 E의 동시 결합이 D1 단독에 의한 T 결합보다 더 큰 정도로 T의 활성을 약화시키는 지를 확인하는 데 이용될 수 있다.
종양 표적화
본 발명의 또 다른 양태에서, 다중특이적 항원 결합 분자는 종양 세포를 표적화하는 데 유용하다. 본 발명의 이런 양태에 따르면, D1이 결합하는 표적 분자 "T"는 종양 관련 항원이다. 특정한 경우에, 종양 관련 항원은 통상적으로는 내재화되지 않는 항원이다. D2가 결합하는 내재화 이펙터 단백질 "E"는 종양 특이적일 수 있거나, 개체의 종양 세포 및 비 종양 세포 둘 다에서 발현될 수 있다. 본 설명의 다른 곳에서 언급된 어떠한 내재화 이펙터 단백질이든 지 본 발명의 항-종양 적용을 위해 표적화될 수 있다.
본 설명에서 사용된 용어 "종양 관련 항원"은 종양 세포의 표면에서 우선적으로 발현되는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 맥락에서 사용된 표현 "우선적으로 발현되는"은 항원이 비 종양 세포 상에서의 항원의 발현 수준보다 적어도 10% 더 큰 (예컨대 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 150%, 200%, 400% 또는 그 이상) 수준으로 종양 세포상에서 발현됨을 의미한다. 특정 구현예에서, 표적 분자는 망막 종양 세포, 결장 종양 세포, 유방 종양 세포, 난소 종양 세포, 피부 종양 세포, 폐 종양 세포, 전립선 종양 세포, 췌장 종양 세포, 교아세포종 세포, 두경부 종양 세포 및 흑색종 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 종양 세포의 표면상에서 우선적으로 발현되는 항원이다. 특이적인 종양 관련 항원의 비 제한적인 예로는, 예를 들어, AFP, ALK, BAGE 단백질, β-카테닌, brc-abl, BRCA1, BORIS, CA9, 탄산무수화효소 IX, 카스파제-8, CD40, CDK4, CEA, CTLA4, 사이클린-B1, CYP1B1, EGFR, EGFRvIII, ErbB2/Her2, ErbB3, ErbB4, ETV6-AML, EphA2, Fra-1, FOLR1, GAGE 단백질(예컨대 GAGE-1, GAGE-2), GD2, GD3, GloboH, 글리피칸-3, GM3, gp100, Her2, HLA/B-raf, HLA/k-ras, HLA/MAGE-A3, hTERT, LMP2, MAGE 단백질(예컨대, MAGE-1 , MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-6, 및 MAGE-12), MART-1, 메소텔린, ML-IAP, Muc1, Muc 16(CA-125), MUM1, NA17, NY-BR1, NY-BR62, NY-BR85, NY-ESO1, OX40, p15, p53, PAP, PAX3, PAX5, PCTA-1, PLAC1, PRLR, PRAME, PSMA(FOLH1), RAGE 단백질, Ras, RGS5, Rho, SART-1, SART-3, Steap-1, Steap-2, 서바이빈, TAG-72, TGF-β, TMPRSS2, Tn, TRP-1, TRP-2, 티로시나제 및 유로플라킨-3이 포함된다.
본 발명의 이러한 양태에 따른 다중특이적 항원 결합 분자는 약물, 독소, 방사성 동위원소 또는 세포의 생존능에 해로운 기타 물질에 접합될 수 있다. 대안적으로는, 이러한 약물 또는 독소는 세포를 직접적으로 사멸하지는 않지만 세포를 다른 외부 제제에 의한 사멸에 더 취약하게 만드는 물질일 수 있다. 종양 표적화를 포함하는 또 다른 구현예에서, 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자는 그 자체로는 약물, 독소 또는 방사성 동위원소에 접합되지 않지만, 대신 표적(T)에 특이적인 제2 항원 결합 분자(본 설명에서는 "공모 분자(accomplice molecule)"로 언 급됨)와 조합하여 투여되며, 이때 이러한 공모 분자는 약물, 독소 또는 방사성 동위원소에 접합된다. 그러한 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 분자는 바람직하게는 이러한 공모 분자에 의해 인지된 에피토프와 구별되고/구별되거나 중첩되지 않는 표적 분자(T) 상의 에피토프와 결합할 것이다(즉, 다중특이적 항원 결합 분자와 공모 분자의 표적에의 동시 결합을 허용하기 위해).
또한, 관련된 구현예에서, 본 발명은 (a) 종양 관련 항원에 특 이적으로 결합하는 독소- 또는 약물-접합된 항원 결합 분자; 및 (b) (i) 내재화 이펙터 단백질에 특이적으로 (예컨대 낮은 친화성으로) 결합하는 제1 결합 도메인 및 (ii) 독소- 또는 약물-접합된 항원 결합 분자에 특이적으로 결합하는 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자를 포함하는, 항-종양 조합 및 치료 방법을 포함한다. 본 구현예에서, 다중특이적 항원 결합 분자는 독소- 또는 약물-접합된 항원 결합 분자를 내재화 이펙터 단백질에 연결시키는 기 능을 하고, 그로써 종양 관련 항원을 내재화 이펙터 단백질에 물리적으로 연결시키는 기능을 한다. 독소 표지된 항-종양 관련 항원 항체의 내재화 이펙터 단백질에의 연결을 통한 내재화는 결과적으로 표적화된 종양 세포 사멸을 유발할 것이다.
본 발명의 종양-표적화 양태의 특정 구현예에 따르면, 다중특이적 항원 결합 분자(또는 공모 항체)는 칼리케아미신, 에스페라미신, 메쏘트렉세이트, 독소루비신, 멜팔란, 클로르암부실, ARA-C, 빈데신, 미토마이신 C, 시스-플라티늄, 에토포시드, 블레오마이신, 5-플루오로우라실, 에스트라무스틴, 빈크리스틴, 에토포시드, 독소루비신, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 오라탁셀, 도세탁셀, 돌라스타틴 10, 아우리스타틴 E, 아우리스타틴 PHE 및 마이탄신계 화합물(예컨대 DM1, DM4 등)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 세포독성 약물에 접합될 수 있다. 이러한 다중특이적 항원 결합 분자(또는 공모 항체)는 또한, 또는 대안적으로, 디프테리아 독소, 슈도모나스 아에루기노사 외독소 A, 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파- 사르신, 알레유라이테스 포르디이 단백질, 다이안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 단백질 등과 같은 독소에 접합될 수 있다. 다중특이적 항원 결합 분자(또는 공모 항체)는 또한, 또는 대안적으로, 225Ac, 211At, 212Bi, 213Bi, 186Rh, 188Rh, 177Lu, 90Y, 131I, 67Cu, 125I, 123I, 77Br, 153Sm, 166Ho, 64Cu, 121Pb, 224Ra 및 223Ra로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방사성 동위원소에 접합될 수 있다. 그러므로 본 발명의 이러한 양태는 항체-약물 접합체(ADC) 또는 항체-방사성 동위원소 접합체(ARC)인 다중특이적 항원 결합 분자를 포함한다.
종양 사멸 적용의 맥락에서, D2 성분은 특정 상황에서, 내재화 이펙터 단백질 "E"에 낮은 친화성으로 결합할 수 있다. 그러므로 다중특이적 항원 결합 분자는 종양 관련 항원을 발현하는 종양 세포를 우선적으로 표적으로 할 것이다. 본 설명에 사용된 "낮은 친화성" 결합은 내재화 이펙터 단백질(E)에 대한 D2 성분의 결합 친화성이 표적 분자(T)에 대한 D1 성분의 결합 친화성보다 적어도 10% 더 약한 (예컨대 15% 더 약한, 25% 더 약한, 50% 더 약한, 75% 더 약한, 90% 더 약한, 등) 것을 의미한다. 특정 구현예에서, "낮은 친화성" 결합은 D2 성분이 내재화 이펙터 단백질(E)과 약 25℃에서 표면 플라스몬 공명 분석으로 측정한 바에 따라, 약 10 nM 내지 약 1 μM보다 더 큰 KD로 상호 작용함을 의미한다.
내재화 이펙터 단백질과 종양 관련 항원에 대한 다중특이적 항원 결합 분자의 동시 결합은 종양 세포 안으로의 다중특이적 항원 결합 분자의 우선적인 내재화를 유발할 것이다. 만약 예를 들어, 다중특이적 항원 결합 분자가 약물, 독소 또는 방사성 동위원소에 접합된다면 (또는 만약 다중특이적 항원 결합 분자가 약물, 독소 또는 방사성 동위원소에 접합된 공모 항체와 조합하여 투여된다면), 종양 관련 항원의 다중특이적 항원 결합 분자 에의 연결을 통한 종양 세포 안으로의 표적화된 내재화는 매우 특이적인 종양 세포 사멸을 유발할 것이다.
약학적 조성물 및 투여 방법
본 발명은 다중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 본 발명의 약학적 조성물은 적절한 담체, 부형제 및 개선된 수송, 전달, 내성 등을 제공하는 기타 제제와 함께 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명은 표적 분자(T)의 활성을 불활성화 또는 약화시키기 위한 방법을 포함한다. 본 발명의 방법은 본 설명에 기술된 다중특이적 항원 결합 분자와 표적 분자를 접촉시키는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 이러한 양태에 따른 방법은 환자를 위해 표적 분자를 불활성화, 약화, 또는 그렇지 않으면 표적 분자의 세포 외 농도를 감소시키는 것이 바람직하고/바람직하거나 유익한 환자에게 다중특이적 항원 결합 분자를 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
다양한 전달 시스템이 당해 분야에 공지되어 있고, 본 발명의 약학적 조성물을 환자에게 투여하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 사용될 수 있는 투여 방법으로는 피부 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비강 내, 경막 외 및 구강 경로를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 약학적 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면 주입 또는 볼러스 주사에 의해, 상피 또는 점막피부의 내벽(예컨대, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 기타 생물학적 활성 제제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성이거나 국소적일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 약학적 조성물은 표준 바늘 및 주사기를 사용하여 피하로 또는 정맥 내로 전달될 수 있다. 또한 피하 전달과 관련하여, 본 발명의 약학적 조성물을 환자에게 투여하기 위해 펜 전달 장치가 사용될 수 있다.
실시예
다음 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 제조하고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시된 것으로, 본 발명자들이 발명으로 간주하는 것의 범위를 제한하고자 한 것이 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위한 노력을 기울였으나 약간의 실험 오차와 편차에 대해서는 설명되어야 한다. 달리 표시되지 않는 한, 부는 중량 부이고, 분자량은 평균 분자량이며, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압이거나 거의 대기압이다.
실시예 1. 내재화 이펙터 단백질과의 연결을 통하여 세포 표면 수용체의 분해를 유도하기 위한 다중특이적 항원 결합 분자의 이용
초기의 개념 증명 실험으로서, (a) 내재화 이펙터 분자 및 (b) 세포 표면 수용체 표적 분자와 결합할 수 있는 다중특이적 항원 결합 분자를 만들었다. 이 실시예에서, 내재화 이펙터 단백질은 크레멘-2(Krm2)이고, 세포 표면 수용체 표적 분자는 Fc 수용체(FcγR1[Fc-감마-R1])이다.
크레멘 분자(Krm1 및 Krm2)는 WNT 경로 신호전달 분자인 LRP5 및 LRP6의 내재화 및 분해를 유도함으로써 WNT 신호 전달을 매개하는 것으로 알려져 있는 세포 표면 단백질이다. LRP5/6의 내재화는 가용성 상호 작용 단백질 DKK1을 통해 이루어진다. 특히, DKK1은 크레멘을 세포 표면 상에서 LRP5/6에 연결시키고, 이 연결로 인하여 크레멘의 내재화는 LRP5 및 LRP6의 내재화 및 분해를 진행시킨다. (Li et al., PLoS One 5(6):e11014 참조).
본 발명자들은 FcγR1의 내재화를 유도하기 위하여 DKK1의 크레멘 결합 특성과 크레멘의 내재화 특성을 이용하고자 노력하였다. FcγR1의 크레멘 매개성 내재화/분화를 촉진하기 위하여, 마우스 Fc에 융합된 DKK1로 구성된 다중특이적 항원 결합 분자를 구성하였다(DKK1-mFc, 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가짐). 본 설명의 다른 곳에서 설명된 바와 같이, 다중특이적 항원 결합 분자는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인(D1) 및 내재화 이펙터 단백질에 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인(D2)을 포함하는 분자로 정의된다. 이 개념 증명 실시예에서, "제1 항원 결합 도메인"은 표적 분자 FcγR1에 특이적으로 결합하 는 mFc 성분이고, "제2 항원 결합 도메인"은 내재화 이펙터 단백질 크레멘에 특이적으로 결합하는 DKK1 성분이다.
먼저 DKK1-mFc가 크레멘 의존적 방식으로 세포 안으로 흡수될 수 있는지를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. 이 실험을 위하여, 두 개의 세포주를 사용하였다: 세포-1, FcγR1을 발현하지만 크레멘-2는 발현하지 않도록 유전자 조작된 HEK293 세포주, 및 세포-2, FcγR1과 크레멘-2 둘 다를 발현하도록 유전자 조작된 HEK293 세포주. DKK1-mFc 조정 배지의 1:10 희석액을 각각의 세포주에 첨가하고, 37℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 90 분의 인큐베이션 후에, 세포를 알렉사(Alexa)-488이 표지된 항-마우스 IgG 항체로 염색하여 DKK1-mFc 분자를 검출하였다. 형광 현미경을 사용하여 실제로 DKK1-mFc 분자가 (크레멘이 결여된) 세포-1 내부에 편재되지 않았음을 관찰하였다. 그러나 크레멘-2를 발현하는 세포-2 내부에서는 실질적인 양의 DKK1-mFc가 검출되었다. 그러므로 이들 결과는 다중특이적 항원 결합 분자 DKK1-mFc가 크레멘 의존적인 방식으로 세포 내에 내재화될 수 있음을 보여준다.
다음으로, 시간 경과 실험을 수행하여 DKK1-mFc가 크레멘 의존적인 방식으로 FcγR1 분해를 유도할 수 있는지를 측정하였다. 실험 프로토콜을 간단하게 설명하면 다음과 같다: (FcγR1만을 발현하는) 세포-1 및 (크레멘-2와 FcγR1을 발현하는) 세포-2를 2mg/ml의 NHS-설포-비오틴으로 15분 동안 얼음 위에서 처리하여 모든 세포 표면 발현된 단백질을 표지하였다. 그런 다음, 세포를 세척하고 400㎕의 배지에 재현탁하고, 네 개의 100㎕ 분액으로 나누어 다양한 시간 동안(0분, 15분, 30분 및 60분) 37℃에서 DKK1-mFc로 처리하였다. DKK1-mFc 인큐베이션 후에, 세포를 펠릿화하고 단백질 분해효소 억제제로 처리하였다. 상이한 인큐베이션 시점으로부터의 세포 용해물을 FcγR1 면역침전화하였다. FcγR1 면역침전을 위하여, 마우스 항-FcγR1 항체를 세포 용해물에 첨가하고, 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음, 단백질-G 비드를 첨가하고, 그 혼합물을 1시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 그런 다음, 비드를 세척하고 단백질을 용출시킨 후 SDS-PAGE를 수행하였다. 단백질을 막에 옮기고 HRP가 표지된 스트렙트아비딘으로 프로브하여 각 샘플 중에 남아있는 표면 노출된 FcγR1 단백질의 상대적인 양을 밝혔다. 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2에 도시된 바와 같이, (FcγR1은 발현하지만 크레멘-2는 발현하지 않는) 세포-1 샘플 중의 표면 노출된 FcγR1 단백질의 양은 세포가 DKK1-mFc에 노출된 시간의 양과는 무관하게 상대적으로 일정하게 유지되었다. 대조적으로, (크레멘-2와 FcγR1 둘 다를 발현하는) 세포-2 샘플 중의 표면 노출된 FcγR1 단백질의 양은 실질적으로 DKK1-mFc와의 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 감소하였다. 그러므로 이 실험은 DKK1-mFc가 크레멘-2 의존적인 방식으로 세포 표면 발현된 FcγR1의 분해를 유도함을 증명한다.
종합하면, 전술한 결과는 세포 표면 표적 분자(FcγR1)와 내재화 이펙터 단백질(크레멘-2)에 동시에 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자가 이펙터 단백질에 의존적인 방식으로 표적 분자의 분해를 유도할 수 있음을 보여준다.
실시예 2. IL-4R 활성은 IL-4R 및 CD63에 대해 특이성을 나타내는 다중특이적 항원 결합 분자를 이용하여 약화된다
추가적인 개념 증명 실험 세트에서, 세포 표면 발현된 표적 분자(즉, IL-4R) 및 세포 표면 발현된 내재화 이펙터 단백질(즉, CD63)에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 항원 결합 분자를 구성하였다. 이들 실험의 목적은 리소좀 내에서의 분해를 위해 내재화되고 표적화되는 이펙터 분자(이 경우, CD63)에 IL-4R을 물리적으로 연결시킴으로써 세포에서의 IL-4R 활성이 더 큰 정도로 약화될 수 있는지를 측정하는 것이었다. 달리 표현하면, 이 실시예는 CD63의 정상적인 내재화 및 분해가 세포 내에서 IL-4R의 내재화 및 분해 경로 변경을 강제하는 데 사용될 수 있는지를 시험하기 위해 고안되었다.
먼저, IL-4R과 CD63에 둘 다 결합할 수 있는 다중특이적 항원 결합 분자를 구성하였다. 구체적으로, 스트렙트아비딘이 접합된 항-IL-4R 항체와 비오틴이 부착된 항-CD63 항체를 1:1 비율로 조합하여 항-IL-4R:항-CD63 접합체(즉, IL-4R과 CD63 둘 다에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자)를 제조하였다. 이 실험에 사용된 항-IL-4R 항체 는 IL-4R 세포 외 도메인에 대해 발생시킨 완전 인간형 mAb이다. (항-IL-4R 항체는 서열 번호 3을 갖는 중쇄 가변 영역과 서열 번호 4를 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하였다). 이 실험에 사용된 항-CD63 항체는 바이오레전드(Biolegend, 미국 캘리포니아 주 샌디에고 소재), 카탈로그 번호 312002로부터 얻어진 마우스 항-인간 CD63 mAb 클론 MEM-259이다.
두 개의 대조 구성체도 생성하였다: 대조-1 = 비오틴이 부착된 대조 마우스 IgG1카파 항체와 1:1 비율로 조합된 스트렙트아비딘이 접합된 항-IL-4R 항체; 및 대조-2 = 비오틴이 부착되지 않은 항-CD63 항체와 1:1 비율로 조합 된 스트렙트아비딘이 접합된 항-IL-4R 항체. 실험에 사용된 항-IL-4R 항체 및 이 실시예를 위한 대조 구성체는 IL-4R에 특이적으로 결합하고 IL-4 매개성 신호 전달을 부분적으로만 차단하는 것으로 알려져 있는 항체이다.
이 실시예에서 사용된 실험 세포주는 STAT6-루시페라제 리포터 구성체 및 추가적인 STAT6을 함유하는 HEK293 세포주이다("HEK293/STAT6-luc 세포"). 이 실험에 사용된 세포는 그 표면 상에 IL-4R과 CD63을 발현한다. 어떠한 억제제 없이 IL-4로 처리할 때 이 세포주는 IL-4 매개성 신호 전달의 정도를 반영하는, 용량 의존적인 검출 가능한 화학발광 신호를 생산한다.
초기 실험에서, 실험적인 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 분자 또는 대조 구성체를 HEK293/STAT6-luc 세포에 첨가하여 배지 중의 항-IL-4R 항체의 최종 농도가 12.5nM가 되도록 하였다. 리포터 신호를 실험 구성체 및 대조 구성체의 존재 및 부재 시에 IL-4의 증가하는 농도에서 측정하였다(도 3). 도 3에서 보이는 바와 같이, 항-IL-4R/항- CD63 다중특이적 분자("ab 접합체")는 각각의 대조 구성체보다 상당히 큰 정도로 IL-4 매개성 신호 전달을 억제하였다.
도 3에서 관찰된 효과가 CD63에 의존적인지를 확인하기 위하여, 위에서 설명된 것과 동일한 실험을 수행하되, CD63 발현을 CD63에 대해 유도된 siRNA를 사용하여 리포터 세포주에서 상당히 감소시켰다. CD63 발현이 상당히 감소되면, 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 분자의 증대된 억제 활성이 더 이상 관찰되지 않았다(도 4). 이 결과는 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 분자의 IL-4 매개성 신호 전달을 약화시키는 능력이 다중특이적 분자의 IL-4R 및 CD63에의 동시 결합 및 그에 따른 전체 항체-IL-4R-CD63 복합체의 내재화 및 분해로 인한 것임을 시사한다.
다음으로, IL-4 첨가 전에 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 분자 또는 대조 구성체를 다양한 시간 동안 HEK293/STAT6-luc 리포터 세포주와 함께 인큐베이션 하는 유사한 실험을 수행하였다. 그런 실험의 제1 세트에서, 50pM의 IL-4를 첨가하기 전에 분 자를 리포터 세포주와 함께 0시간 동안(즉, IL-4를 동시에 첨가함), 2시간 동안 또는 밤새 인큐베이션 하였다. IL-4를 첨가하고 6시간 후에 루시페라제 활성을 측정하였다. 결과를 도 5, 위의 패널("형질전환되지 않음")에 나타냈다. 추가적인 실험 세트에서, 유사한 프로토콜을 수행하되, 50pM의 IL-4를 첨가하기 전에 실험 또는 대조 분자를 리포터 세포주와 함께 15분, 30분, 1시간 또는 2시간 동안 인큐베이션 하였다. 결과를 도 6에 나타냈다.
도 5 및 도 6에 요약한 결과는 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 분자가 IL-4 매개성 신호 전달을 억제할 수 있고, 이 억제 효과는 인큐베이션 시간이 길어질수록 증대됨을 보여준다. 실험의 초기 세트와 같이, CD63 siRNA를 사용하여 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 분자의 억제 효과가 CD63 발현에 의존적이었음을 확인하였다(도 5 아래 패널["CD63 siRNA"]).
요약하면, 본 실시예는 표적 분자(이 경우 IL-4R)와 내재화 이펙터 단백질(이 경우 CD63) 둘 다에 동시에 결합할 수 있고 그에 의해 세포 내부에서 표적 분자의 내재화 및 분해 경로 변경을 유발하는 다중특이적 항원 결합 분자의 이용을 통해 표적 분자 활성 억제를 위한 추가적인 개념 증명을 제공한다. 다르게 진술하자면, 예시적인 다 중특이적 항원 결합 분자에 의한 IL-4R과 CD63의 동시 결합은, 대조 구성체 단독에 의한 IL-4R의 결합보다 실질적으로 더 큰 정도로 (즉, >10%) IL-4R의 활성을 약화시켰다.
실시예 3. 항-IL-4R x 항-CD63 이중특이적 항체는 CD63 의존적인 방식으로 IL-4R 활성을 약화시킨다
본 설명에서 실시예 2의 실험은 항-IL-4R/항-CD63 다중특이적 분자가 CD63 의존적인 방식으로 IL-4 매개성 신호 전달을 억제함을 보여준다. 그런 실험들에서, 다중특이적 항원 결합 분자는 비오틴-스트렙트아비딘 결합을 통해 연결 된 두 개의 별도의 단일클론성 항체(항-IL-4R 및 항-CD63)로 구성되었다. 그러한 개념 증명 다중특이적 항원 결합 분자로 관찰된 결과가 다른 다중특이적 항원 결합 분자 형식으로 일반화될 수 있음을 확인하기 위하여, 실제 이중특이적 항체를 구성하였다.
표준 이중특이적 항체 기술을 이용하여 IL-4R에 특이적인 제1 아암과 CD63에 특이적인 제2 아암으로 구성되는 이중특이적 항체를 구성하였다. IL-4R에 특이적인 아암은 CD63에 특이적인 경쇄와 짝을 이룬 항-IL-4R 중쇄를 함유하였다. CD63에 특이적인 경쇄는 구성의 편의상 IL-4R 특이적 중쇄와 단독으로 짝을 지었다. 그럼에도, 항-IL-4R 중쇄의 항-CD63 경쇄와의 짝짓기는 IL-4R에 대한 전체 특이성을 보유하였고, CD63에 대한 결합은 나타내지 않았다. CD63에 특이적인 아암은 항-CD63 경쇄(IL-4R 아암에 사용된 것과 동일한 경쇄)와 짝을 이룬 항-CD63 중쇄를 함유하였다. (서열 번호 3을 포함하는) 항-IL-4R 중쇄를 실시예 2에 사용된 바와 같이 전체 항-IL-4R 항체로부터 유도하였다. 그러나 항-CD63 중쇄 및 경쇄는 DSHB(Developmental Studies Hybridoma Bank, 아이오와대학교 생물학과, 미국 아이오와 주 아이오와 시티 소재)로부터 입수한, H5C6로 표시된 항-CD63 항체로부터 유도하였다. 실시예 2에서 사용된 전체 항-IL-4R 항체와 같이, 본 실시예에 사용된 이중특이적 항체의 항-IL-4R 성분은 단독으로 중간 정도의 IL-4R 차단 활성만을 나타냈다.
항-IL-4R x 항-CD63 이중특이적 항체의 차단 활성을 평가하기 위하여 IL-4 루시페라제 분석을 수행하였다. 간단히 설명하자면, 항-IL-4R x 항-CD63 이중특이적 항체 또는 대조 분자의 일련의 희석물을 HEK293/STAT6-luc 리포터 세포에 첨가하였다(실시예 2 참조). 정상적인 조건 하에서, 이들 세포는 IL-4로 처리될 때 검출 가능한 루시페라제 신호를 생성한다. 그런 다음 이 실험을 위해 10pM의 IL-4를 세포에 첨가하고, 사용된 항체의 각 희석액에 대해 루시페라제 활성을 정량하였다. 이 분석에 사용된 대조군은 다음과 같았다: (a) 하나의 아암으로 IL-4R과 결합하 고 비 기능성 항-CD63 아암을 갖는 모의(mock) 이중특이적 항체(즉, 하나의 항-IL-4R 중쇄 및 하나의 항-CD63 중쇄를 함유하고 있으며, 둘 다 항-IL-4R 경쇄와 짝을 이루고 있음); (b) 항-IL-4R 단일특이성 항체; 및 (c) 완충액 (PBS) 단독(항체 없음). 결과를 도 7에 나타냈다. 도 7에 나타낸 바와 같이, 이용된 대조 샘플의 경우 루시페라제 활성은 가장 높은 항체 농도에서도 상대적으로 높게 유지된 반면, 이중특이적 항체의 경우 루시페라제 활성은 항체 농도가 증가함에 따라 상당히 감쇠하였다. 이들 결과는 이중특이적 항체에 의한 IL-4R 및 CD63의 동시 결합이 IL-4R 활성의 상당한 억제를 유발함을 확인해 준다.
실시예 4. SOST 및 CD63에 동시에 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자를 이용하는 SOST의 내재화
본 실시예에서는, 가용성 표적 분자 SOST(스클레로스틴(sclerostin))의 내재화를 촉진하는 다중특이적 항원 결합 분자의 능력을 평가하였다. 이들 실험을 위하여, 표적 분자는 pHrodoTM 모이어티로 태그를 붙인 인간 SOST 단백질 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 미국 캘리포니아 주, 칼즈배드 소재) 및 myc 태그로 구성된 융합 단백질이었다. pHrodo™ 모이어티는 실제로 중성 pH에서는 비 형광성이고 엔도솜과 같은 산성 환경에서는 선명하게 형광을 발하는 pH 민감성 염료이다. 그러므로 형광 신호는 SOST 융합 단백질의 세포 내재화의 표시자로서 이용될 수 있다. 이들 실험을 위한 다중특이적 항원 결합 분자는 아래에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, CD63(내재화 이펙터 단백질) 및 SOST 융합 단백질(가용성 표적 분자) 둘 다에 대해 결합 특이성을 지닌 이중특이적 항체였다.
다음과 같이 실험을 수행하였다: 간단하게 설명하자면, HEK293 세포를 폴리-D-라이신이 코팅된 96 웰 플레이트 (그라이너 바이오원(Greiner Bio-One), 미국 노스캐롤라이나 주 먼로 소재)에 10,000개 세포/웰로 플레이팅하였다. 세포를 밤새 정착할 수 있도록 한 후에, 배지를 (5 μg/mL, 아래에 기술된 바와 같은) 항체, pHrodo™ -myc 태그를 붙인 SOST(5 μg /mL), 헤파린(10 μg /mL) 및 훽스트(Hoechst) 33342를 함유하는 배지로 교체하였다. 그런 다음, 세포를 얼음 위에서 3시간 또는 37℃에서 3시간 인큐베이션 하였다. 그런 다음, PBS에서 영상화하기 전에 모든 세포를 2회 세척하였고, 세포당 형광 반점의 수뿐 아니라 상응하는 형광 강도를 계측하여 다양한 항체 구성체의 존재 하에 pHrodo-myc 태그를 붙인 SOST 세포 내재화 정도를 밝혔다.
본 실시예에 사용된 항체는 다음과 같았다: (1) 항-CD63 단일특이적 항체(클론 H5C6, DSHB(Developmental Studies Hybridoma Bank, 아이오와대학교 생물학과, 미국 아이오와 주 아이오와 시티 소재); (2) 항-myc 항체(클론 9E10, Schiweck et al., 1997, FEBS Lett. 414(1):33-38); (3) 항-SOST 항체(미국 특허번호 7,592,429에서 "Ab-B"로 표시된 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체); (4) 항-CD63 x 항-myc 이중특이적 항체(즉, 항체 H5C6으로 부터 유래된 항-CD63 아암 및 9E10으로부터 유래된 항-myc 아암을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자); (5) 항-CD63 x 항-SOST 이중특이적 항체 #1(즉, 항체 H5C6으로부터 유래된 항-CD63 아암 및 "Ab-B"로부터 유래된 항 -SOST 아암을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자); 및 (6) 항-CD63 x 항-SOST 이중특이적 항체 #2(즉, 항체 H5C6으로부터 유래된 항-CD63 아암 및 미국 특허 번호 7,592,429에서 "Ab-20"으로 표시된 항체로부터 유래된 항- SOST 아암을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자). 이들 실험에 사용된 이중특이적 항체를 소위 "놉-인투-홀(knobs-into-holes)" 방법(예컨대 Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621 참조)을 사용하여 조립하였다.
내재화 실험의 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8은 시험한 다양한 처리 조건 하에서의 세포당 반점(표지된 소포)의 수를 보여준다. 종합하면, (직접적으로 또는 myc 태그를 통해) CD63 및 SOST에 동시에 결합하는 이중특이적 구성체는 37℃에서 시간이 경과함에 따라, 형광 강도 및 세포당 형광 반점의 수로 반영된 바와 같이, 가장 많은 양의 SOST 내재화를 유발하였다. 그러므로 본 실시예에 사용된 다중특이적 항원 결합 분자는 가용성 표적 분자의 내재화를 효과적으로 유도할 수 있다.
실시예 5. CD63 및 SOST에 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자로 처리된 마우스에서의 골 무기물 밀도 변화
다음으로, 실시예 4에 기술된 바와 같은 항-CD63 x 항-SOST 다중특이적 항원 결합 분자를 마우스에서의 골 무기물 밀도를 증가시키는 능력에 대해 시험한다. 이 실험에 5 그룹의 마우스(그룹당 약 6마리의 마우스)를 사용한다. 처리 그룹은 다음과 같다: (I) 미처리 음성 대조군 마우스; (II) 단독으로 골 무기물 밀도를 증가시키는 것 으로 알려져 있는 항-SOST 단일특이적 차단 항체로 처리된 마우스(양성 대조군); (III) CD63과 SOST에 특이적으로 결합하지만 그 자체로 SOST 활성을 억제하지 않거나 그 자체로 SOST 활성을 단지 경미하게 억제하는 이중특이적 항체로 처리된 마우스; (IV) 항-CD63 모항체(즉, 이중특이적 항체에서와 동일한 항-CD63 항원 결합 도메인을 함유하는 단일특이적 항체)로 처리된 마우스; 및 (V) 항-SOST 모항체(즉, 이중특이적 항체에서와 동일한 항-SOST 항원 결합 도메인을 함유하는 단일특이적 항체)로 처리된 마우스. 각 그룹에서 마우스에 투여된 항체의 양은 약 10 내지 25mg/kg이다.
(골 무기물 밀도 증가를 나타내지 않을 것으로 예상되는 그룹 V의 마우스에 의해 확인된 바와 같이) 이중특이적 항체의 항-SOST 성분은 그 자체로는 SOST 활성을 억제하지 않지만, (항-SOST x 항-CD63 이중특이적 항체로 처리 된) 그룹 III의 마우스는, 적어도 (공지된 항-SOST 차단 항체로 처리된) 그룹 II의 마우스에서 관찰된 것과 비슷한 골 무기물 밀도 증가를 나타낼 것으로 예상되었다. 그룹 III의 마우스에서 예상된 골 무기물 밀도의 증가는 위의 실시예 4의 세포 실험에서 관찰된 바와 같이, SOST의 CD63 매개성 내재화에 의해 가동되는 것으로 여겨진다.
실시예 6. 리포다당류(LPS)와 CD63에 동시에 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자에 의해 매개된 LPS의 세포 내재화
본 실시예는 비 단백질 표적 분자, 즉, 리포다당류(LPS)의 내재화를 유도하기 위한 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자의 사용을 예시한다. LPS는 그람 음성 세균의 외막 성분이고, 패혈성 쇼크의 원인이 된다고 알려져 있다. 항-LPS 항체는 패혈증을 위한 가능한 치료제로 연구조사가 이루어졌다. LPS의 내재화를 촉진하는 다중특이적 항원 결합 분자의 능력을 평가하기 위하여 본 실시예의 실험을 설계하였다.
이 실시예에 사용된 다중특이적 항원 결합 분자는 LPS(표적)을 대상으로 한 하나의 아암과 CD63(내재화 이펙터 단백질)을 대상으로 한 다른 아암이 있는 이중특이적 항체였다. 항-LPS 아암은 WN1 222-5로 알려져 있는 항체로부터 유래한 것이다. (DiPadova et al., 1993, Infection and Immunity 61(9):3863-3872; Muller-Loennies et al., 2003, J. Biol . Chem. 278(28):25618-25627; Gomery et al., 2012, Proc . Natl . Acad . Sci USA 109(51):20877-20882; US 5,858,728). 항-CD63 아암은 H5C6 항체로부터 유래한 것이다(실시예 4 참조). 항-LPS x 항-CD63 이중특이적 항체(즉, 다중특이적 항원 결합 분자)를 소위 "놉-인투-홀" 방법(예컨대 Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621 참조)을 사용하여 조립하였다.
이들 실험에 사용한 두 개의 LPS 종이 사용되었다: 대장균 LPS 및 살모넬라 미네소타 LPS. 두 버전을 형광 표지된 분자로서 입수하였다(알렉사-플루오르(ALEXA-FLUOR®)-488이 표지된 LPS, 라이프 테크놀로지스, 미국 캘리포니아 주 칼스배드 소재).
다음과 같이 실험을 수행하였다: HEK293 세포를 96-웰 PDL이 코팅된 영상화 플레이트에 플레이팅하였다. 밤새 둔 후, 배지를 새로운 배지로 교체하였다. 형광 표지된 LPS(대장균 유래 또는 S. 미네소타 유래 LPS 중 어느 하나)를 정규 배지에 첨가하였다. 다음으로, 항-LPS x 항-CD63 이중특이적 항체, 또는 모조 Fc와 짝을 이룬 대조 절반 항체를 샘플에 첨가하였다. 37℃에서 (1시간 및 3시간) 또는 얼음 위에서 (3시간)의 다양한 인큐베이션 시간 후, LPS 처리된 샘플로부터의 세포를 다음과 같이 처리하였다: 세척하고, 항-알렉사-플루오르-488 항체로 ??칭시키고, 세척 및 고정시켰다. 항-알렉사-플루오르-488 항체는 내재화되지 않은(즉, 표면 결합된) 형광 발색단으로부터의 형광을 ??칭한다. 그러므로 ??칭 항체로 처리된 샘플에서 관찰된 임의의 형광은 내재화된 LPS로 인한 것이다. 다양한 시점에서 각 샘플로부터의 형광 수준을 측정하였다.
도 9는 세포당 표지된 소포의 관점에서 이들 실험 결과를 나타낸 것이다. 도 9에 나타난 바와 같이, 항-CD63 x 항-LPS 이중특이적 항체로 처리된 세포만이 시간에 따라 증가한 상당한 수의 표지된 소포를 보여주었다. 표지된 LPS와 대조 항체로 처리된 세포는 주목할만한 수의 형광 소포를 드러내지 않았고, 이는 LPS가 그러한 처리 조건 하에서는 내재화되지 않음을 나타낸다.
그러므로 본 실시예는 항-LPS x 항-CD63 이중특이적 항체가 LPS와 CD63의 동시 결합을 필요로 하는 방식으로 세포 안으로 LPS의 내재화를 유발함을 증명한다. 따라서 이들 결과는 패혈증과 같은 질병 및 장애의 치료를 위해 LPS와 같은 표적 분자의 세포 내재화를 촉진하기 위한 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자 사용을 뒷받침한다.
실시예 7. Her2와 PRLR에 동시에 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자에 의해 매개되는 Her2의 세포 내재화 및 분해
본 실시예는 종양 관련 항원(Her2)의 내재화 및 분해를 유도하기 위한 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자의 용도를 설명하는 세 가지의 별도의 실험을 포함한다. 종양 세포의 표면으로부터 Her2를 제거하는 것은 높은 Her2 발현을 특징으로 하는 일부 유형의 암(예컨대, 유방암, 위암, 위식도암 등) 치료를 위한 바람직한 접근법일 것이다.
본 실시예의 실험에 사용된 다중특이적 항원 결합 분자는 Her2(표적)를 대상으로 하는 한 아암과 PRLR(내재화 이펙터 단백질)을 대상으로 한 다른 아암이 있는 이중특이적 항체였다.
실험 1
초기 실험으로, T47D 유방암 세포에서 내인성 Her2를 분해하는 항-Her2 x 항-PRLR 이중특이적 항체(본 설명에서 "Her2xPRLR bsAb1"라 지칭됨)의 능력을 평가하였다. T47D 유방암 세포는 낮은 수준의 HER2를 발현하며 일반적으로 항-HER2 요법에 대해 저항성이 있다(Horwitz et al., "Variant T47D human breast cancer cells with high progesterone-receptor levels despite estrogen and antiestrogen resistance," Cell. 1982 Mar;28(3):633-42 참조).
항-Her2 아암은 트라스투주맙이라 알려진 항체로부터 유래된 것이다. 항-PRLR 아암은 완전 인간형 항-PRLR 항체로부터 유래된 것이다. 항-Her2 x 항-PRLR 이중특이적 항체(즉, 다중특이적 항원 결합 분자)를 소위 "놉-인투-홀" 방법(예컨대 Ridgway et al., 1996, Protein Eng. 9(7):617-621 참조)을 사용하여 조립하였다. 본 실험에 사용된 다른 구성체는 트라스투주맙(단일특이적 항체), 항-PRLR 항체(단일특이적 항체, 본 설명에 전체가 참조로 포함되는 개시 내용인 미국 특허출원 공개번호 2015/0056221에 기재된 바에 따라 H1H6958N2라 지칭함) 및 (관련 없는 비 인간 항체에 대한) 단일특이적 대조 항체였다.
본 실험을 위해, 내인성 수준의 Her2 수용체 및 PRLR 수용체를 발현하는 T47D 세포를 10% FBS(ATCC, 30-2020), 10mM Hepes, 1mM 피루브산 나트륨 및 10ug/ml 인슐린을 보충한 RPMI(어바인 사이언티픽(Irvine Scientific), 9160)에서 성장시켰다. 단백질 합성을 정지시키기 위해 50ug/ml의 시클로헥시미드(CHX)를 이용하였다. T47D 세포를 시클로헥시미드와 트라스투주맙(CHX/트라스투주맙), 시클로헥시미드와 Her2xPRLR bsAb1 (CHX/bsAb1), 시클로헥시미드와 PRLR Ab (CHX/PRLR Ab), 시클로헥시미드와 대조 Ab(CHX/대조 항체) 중 어느 하나로, 또는 0, 1, 2, 또는 4시간 동안 시클로헥시미드, PRLR Ab 및 트라스투주맙으로 처리하였다.
세포를 단백질 분해효소 억제제 및 인산가수분해 억제제(써모 피셔(Thermo Fischer, 1861280))를 보충한 RIPA 완충액(100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 2% NP-40, 1% 소듐 데옥시콜레이트 및 0.2% SDS)(보스톤 바이오프로덕츠(Boston BioProducts) BP-116X) 중에서 얼음 위에서 용해시킨 다음, 초음파 처리했다(큐소니카(Qsonica) 모델 Q55, 세 가지 펄스). 초음파 처리한 용해물을 2X SDS 샘플 완충액으로 1:1 희석하고, 95℃에서 10분 동안 가열한 다음, 실온에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 4~20% 노벡스(Novex) 트리스(Tris)-글리신 겔 상에서 분리시키고, PVDF 막에 블로팅하였다.
1:300의 Her2 항체(다코(Dako), A0485)와 1:250의 PRLR 항체(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 35-9200)를 막의 1차 표지를 위해 사용한 다음, 1:5000의 HRP-접합 2차 항체를 사용하고, ECL(아머샴(Amersham), RPN2106)로 화학발광을 검출하였다. 케어스트림(CareStream) 소프트웨어(코닥(Kodak))로 밴드의 순 강도를 계산하여 웨스턴 블롯의 정량을 수행하였다. 결과를 표 1에 나타냈다. 배경과 비교한 상대적 단위의 측면에서 값을 표시하였다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 시클로헥시미드로 단백질 합성을 억제할 때, PRLR은 이용했던 모든 처리에서 신속하고도 완벽한 분해를 겪었다. 이러한 과정은 시험한 항체 중 어느 것에 의해서도 영향을 받지 않았다. 이와 대조적으로, 시클로헥시미드 존재 하에서, Her2는 Her2xPRLR bsAb1로 처리한 세포에서 분해되었으나, 트라스투주맙과 항-PRLR Ab의 혼합물, 개별적인 PRLR Ab들, 트라스투주맙, 또는 대조 항체들로 처리된 세포에서는 그렇지 않았다. 이 결과는 Her2xPRLR bsAb1이 세포 표면 상의 PRLR에 Her2를 연결하는 기능을 하며, 뒤이어 Her2-bsAb1-PRLR 복합체의 분해가 이어짐을 시사한다.
Figure pct00001
실험 2
제2의 실험에서는 시험관 내에서 Her2 분해에 미치는 Her2 x PRLR 다중특이적 항원 결합 단백질의 용량 의존적인 영향뿐만 아니라 PRLR 수준에 미치는 잠재적인 영향을 조사하였다. 본 실험에서는 두 가지 상이한 Her2 x PRLR 이중특이적 항체("Her2xPRLR bsAb1"과 "Her2xPRLR bsAb2")를 사용하였다. 두 이중특이적 항체는 놉스-인투-홀 방법을 이용하여 구성하였다. 항-Her2 아암은 두 이중특이적 항체에서 동일하였고, 트라스투주맙이라 알려진 항체로부터 유래된 것이었다. Her2xPRLR bsAb1과 Her2xPRLR bsAb2의 항-PRLR 아암은 두 가지 상이한 완전 인간형 항-PRLR 항체로부터 유래된 것이었다.
본 실험을 위해, 내인성 수준의 Her2 수용체 및 PRLR 수용체를 발현하는 T47D 세포를 10% FBS(ATCC, 30-2020), 10mM Hepes, 1mM 피루브산 나트륨 및 10ug/ml 인슐린을 보충한 RPMI(어바인 사이언티픽, 9160)에서 성장시켰다. T47D 세포를 10ug/ml, 3ug/ml, 1 μg/ml, 0.3 μg/ml, 0.03 μg/ml, 또는 0 μg/ml의 bsAb1 또는 bsAb2 중 어느 하나로 6시간 동안 처리하였다.
세포를 단백질 분해효소 억제제 및 인산가수분해 억제제(써모 피셔(Thermo Fischer, 1861280))를 보충한 RIPA 완충액(100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 2% NP-40, 1% 소듐 데옥시콜레이트 및 0.2% SDS)(보스톤 바이오프로덕츠(Boston BioProducts) BP-116X) 중에서 얼음 위에서 용해시킨 다음, 초음파 처리했다(큐소니카(Qsonica) 모델 Q55, 세 가지 펄스). 초음파 처리한 용해물을 2X SDS 샘플 완충액으로 1:1 희석하고, 95℃에서 10 분 동안 가열한 다음, 실온에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 4~20% 노벡스(Novex) 트리스(Tris)-글리신 겔 상에서 분리시키고, PVDF 막에 블로팅하였다.
1:300의 Her2 항체(다코, A0485)와 1:250의 PRLR 항체(라이프 테크놀로지스, 35-9200), 또는 1:10,000의 베타-액틴 항체(젠텍스(Genetex), GTX100313)를 막의 1차 표지를 위해 사용한 다음, 1:5000의 HRP-접합 2차 항체를 사용하고, ECL(아머샴, RPN2106)로 화학발광을 검출하였다.
케어스트림(CareStream) 소프트웨어(코닥(Kodak))로 밴드의 순 강도를 계산하여 웨스턴 블롯의 정량을 수행하였다. 로딩을 제어하기 위해, 다음과 같이 액틴에 대한 정규화를 사용하였다: 가장 높은 액틴 순 강도를 나타내는 샘플을 정규화 대조군으로 사용했다. 각각의 샘플의 액틴 순 강도를 정규화 대조군 값으로 나누어 샘플의 상대적인 값을 얻었다. 각각의 표적 단백질(Her2 또는 PRLR)의 순 강도를 샘플에 대한 계산된 상대적인 액틴 값으로 나누어 정규화된 Her2 또는 PRLR 값(임의 단위)을 얻었다. 결과를 표 2에 나타냈다.
표 2에 나타낸 바와 같이, Her2xPRLR bsAb1과 Her2xPRLR bsAb2는 T47D 세포에서 용량 의존적인 방식으로 Her2 분해를 유도하였다. 대조적으로, PRLR의 수준은 이중특이적 항체 처리에 의해 영향 받지 않았다. 이 결과는 이들 세포의 표면 상에서 연속적인 표면 전환을 거치는 PRLR과 일치한다.
Figure pct00002
실험 3
전술한 실험들은 Her2xPRLR 이중특이적 항체에 의한 Her2 분해는 이러한 이중특이적 항체가 PRLR(내재화 이펙터 단백질)과 Her2(표적 단백질)에 동시에 결합하는 것을 필요로 함을 시사한다. 이러한 원칙을 확인하기 위해, Her2 내재화 활성에 미치는 Her2xPRLR bsAb1의 PRLR 결합 아암 또는 Her2 결합 아암 차단 효과를 평가하는 제3의 실험을 수행하였다.
본 실험을 위해, 내인성 수준의 Her2 수용체 및 PRLR 수용체를 발현하는 T47D 세포를 10% FBS(ATCC, 30-2020), 10 mM Hepes, 1 mM 피루브산 나트륨 및 10 μg/ml 인슐린을 보충한 RPMI(어바인 사이언티픽(Irvine Scientific), 9160)에서 성장시켰다. Her2xPRLR bsAb1(10 μg/ml)을 미처리 상태로 두거나(즉, 두 아암을 차단하지 않음), 0, 2, 4, 또는 6시간 동안 T47D 세포에 첨가하기 전에 가용성 PRLR 단백질 구성체(PRLR 결합 아암을 차단하기 위한 "PRLR.mmh") 또는 가용성 Her2 단백질 구성체(Her2 결합 아암을 차단하기 위한 "Her2.mmh")와 37℃에서 1시간 동안 (1:2 몰 비율) 인큐베이션 하였다.
인큐베이션 기간 종료 시, 세포를 단백질 분해효소 억제제 및 인산가수분해 억제제(써모 피셔(Thermo Fischer, 1861280))를 보충한 RIPA 완충액(100 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 2% NP-40, 1% 소듐 데옥시콜레이트 및 0.2% SDS)(보스톤 바이오프로덕츠(Boston BioProducts) BP-116X) 중에서 얼음 위에서 용해시킨 다음, 초음파 처리했다(큐소니카(Qsonica) 모델 Q55, 세 가지 펄스). 초음파 처리한 용해물을 2X SDS 샘플 완충액으로 1:1 희석하고, 95℃에서 10분 동안 가열한 다음, 실온에서 10분 동안 13,000 rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 4~20% 노벡스(Novex) 트리스(Tris)-글리신 겔 상에서 분리시키고, PVDF 막에 블로팅하였다.
1:300의 Her2 항체(다코, A0485) 또는 1:10,000의 베타-액틴 항체(젠텍스, GTX100313)를 막의 1차 표지를 위해 사용한 다음, 1:5000의 HRP-접합 2차 항체를 사용하고, ECL(아머샴, RPN2106)로 화학발광을 검출하였다.
케어스트림(CareStream) 소프트웨어(코닥(Kodak))로 밴드의 순 강도를 계산하여 웨스턴 블롯의 정량을 수행하였다. 로딩을 제어하기 위해, 다음과 같이 액틴에 대한 정규화를 사용하였다: 가장 높은 액틴 순 강도를 나타내는 샘플을 정규화 대조군으로 사용했다. 각각의 샘플의 액틴 순 강도를 정규화 대조군 값으로 나누어 샘플의 상대적인 값을 얻었다. Her2 밴드의 순 강도를 샘플에 대한 계산된 상대적인 액틴 값으로 나누어 정규화된 Her2 값(임의 단위)을 얻었다. 결과를 표 3에 나타냈다.
표 3에 나타낸 바와 같이, Her2xPRLR bsAb1이 매개한 Her2 분해는 Her2xPRLR bsAb1의 Her2 아암 또는 PRLR 아암 중 어느 하나를 차단함으로써 T47D 세포에서 완전히 억제되어, Her2 분해가 Her2xPRLR bsAb1 다중특이적 항원 결합 단백질에 의한 동시적 Her2와 PRLR 결합에 의해 매개된 PRLR과의 물리적 연결을 통해 발생했음을 나타냈다.
실시예 8. Her2와 PRLR에 동시에 결합하는 다중특이적 항원 결합 분자에 의해 매개된 트라스투주맙 엠탄신의 증가된 효능
본 실시예는 항체-약물 접합체("ADC")의 효능을 증가시키기 위한 본 발명의 다중특이적 항원 결합 분자의 용도를 설명한다. 더욱 구체적으로는, 본 실시예는 종양 관련 항원 표적에 특이적인 제2 항원 결합 분자(본 설명에서 "수반 분자(accomplice molecule)"라고도 지칭함)와 조합된, 내재화 이펙터 단백질을 대상으로 한 제1 결합 도메인 및 이러한 종양 관련 표적 항원을 대상으로 한 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항원 결합 분자로서, 이러한 수반 분자는 ADC인 것인 다중특이적 항원 결합 분자의 용도를 보여준다. 본 설명의 아래에 기재된 실험에서는 내재화 이펙터 단백질은 프로락틴 수용체(PRLR)이고, 종양 관련 항원 표적은 Her2이며, 수반 분자는 Her2에 특이적인 ADC(즉, 트라스투주맙 엠탄신(T-DM1))이다.
트라스투주맙은 Her2의 세포 외 도메인에 결합하는 재조합 인간화 단일클론 항체이다. 트라스투주맙과 그것의 상응하는 ADC인 트라스투주맙-엠탄신, 또는 T-DM1은 면역조직화학(IHC 3+)으로 평가한 바에 따라 강한 Her2 과발현을 나타내는 환자에서 성공적으로 사용되어 왔다. 그러나 Her2 IHC2+ 종양과 Her2 IHC1+ 종양 환자를 위해 이용할 수 있는 효과적인 치료법은 현재 존재하지 않는다.
Figure pct00003
본 실시예에서는 네 가지 상이한 항-Her2 x 항-PRLR 이중특이적 항체(본 설명에서 "Her2xPRLR bsAb36," "Her2xPRLR bsAb37," "Her2xPRLR bsAb42" 및 "Her2xPRLR bsAb45"라 지칭함)의 Her2 발현 세포에 대한 T-DM1의 세포 사멸 효능을 증가시키는 능력을 평가하였다. 본 실시예에 사용된 이중특이적 항체들은 표 4에 요약된 바와 같이, 네 개의 상이한 항-Her2 아암과 두 개의 상이한 항-PRLR 아암으로부터 구성되었다.
Figure pct00004
표준 방법을 이용하여 항-Her2 x 항-PRLR 이중특이적 항체(즉, 다중특이적 항원 결합 분자)를 구성하였다. 또한, 대조 ADC(즉, DM1에 접합된 관련 없는 비 인간 단백질에 대한 항체를 포함하는 항체-약물 접합체) 또는 항-PRLR-DM1 ADC(본 설명에 전체가 참조로 포함되는 개시 내용인 US 2015/0056221에 H1H6958N2로 지칭된 항체-약물 접합체)를 이용하여 대조 실험도 수행하였다.
T-DM1의 세포 사멸 효과를 증진시키는 Her2xPRLR 이중특이적 항체의 능력을 평가하기 위해, 내인성 수준의 PRLR을 발현하고 Her2를 중간 수준까지 과발현하는 T47D 세포(T47D/Her2)를 10% FBS(ATCC, 30-2020), 10mM Hepes, 1mM 피루브산 나트륨 및 10ug/ml 인슐린을 보충한 RPMI(어바인 사이언티픽, 9160)에서 먼저 성장시켰다. 그런 다음, 세포를 96웰 플레이트에 3000개 세포/웰로 씨딩하였다. 다음 날, 세포를 처리하지 않은 채로 두거나 다양한 농도의 T-DM1, 또는 대조 ADC, 또는 항-PRLR-DM1 중 하나, 또는 10ug/ml의 Her2xPRLR bsAb42, Her2xPRLR bsAb36, Her2xPRLR bsAb37, 또는 Her2xPRLR bsAb45 중 어느 하나와 T-DM1과의 조합물로 3일 동안 3반복(triplicate) 처리하였다.
세포 생존능을 다음과 같이 평가하였다: 처리 후 3일의 세포들을 20분 동안 0.25% PFA, 0.1% 사포닌, 2ug/ml 훽스트로 고정시키고, 전체 웰 영상을 10x의 자동 현미경 이미지엑스프레스 마이크로(ImageXpressMICRO)로 획득하여, 셀 프로리퍼레이션(Cell ProliferationHT) 메쯔엑스프레스(MetzxPressTM) 모듈을 이용하여 분석하였다(핵 수). 결과를 표 5에 요약하였다.
Figure pct00005
표 5에 나타낸 바와 같이, T-DM1의 세포 사멸 효능은 본 발명의 Her2xPRLR 이중특이적 항체의 존재에 의해 상당히 증진되었다. 따라서, 본 실시예는 정상적으로는 세포에 의해 신속하게 내재화되지 않는 표적 단백질을 대상으로 한 면역접합체 분자의 효능 및 효율을 증진시키는 본 발명의 다중특이적 항원 결합 단백질의 능력을 증명한다.
T-DM1은 높은 수준의 HER2를 발현하는 종양에 대해 활성을 나타내는 것으로 알려져 있지만, 낮은 수준 및 중간 수준의 HER2를 발현하는 세포들은 T-DM1 치료에 여전히 저항성을 나타낸다. 이와 대조적으로, 항-PRLR-ADC는 낮은 수준의 PRLR을 발현하는 유방 종양 세포의 강력한 사멸을 유도할 수 있다. 항-PRLR-ADC와 T-DM1 사이의 사멸 효율의 차이는 내재화 속도와 각각의 표적의 리소좀 수송의 차이에서 기인할 가능성이 높다. PRLR과 HER2의 세포 내 수송을 비교하였다.
낮은 표면 수준의 PRLR과 HER2를 발현하는 세포에서, PRLR은 신속한 구성성 리소좀 수송 및 주로 프로락틴 리간드와 독립적인 분해를 거치는 것으로 관찰되었다. 그러나 HER2는 신속한 구성성 리소좀 수송과 분해를 거치지 않았다. 예를 들어, 낮은 수준의 PRLR과 HER2를 발현하는 T47D 세포는 60분 이내에 PRLR의 80%를 내재화하였지만, HER은 내재화되지 않았다(도 11). 이들 실험에서, T47D 세포를 CF™594로 표지된 항-PRLR 1차 항체 또는 CF™594 로 표지된 항-HER2 1차 항체 중 어느 하나와 얼음 위에서 인큐베이션 하였다. 내재화 과정은 세포에 사전에 가온된 (37℃) 배지를 첨가하여 개시하였다. 지정된 시간에 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시켜 내재화를 중단시켰고, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor®) 488이 접합된 염소 항-인간 Fab로 염색하여 세포 표면 상에 남아있는 내재화되지 않은 항체(노란색)를 검출하였다. 공초점 스택의 모든 섹션에 대해 화소 단위를 기반으로 공편재화를 정량하였다. 결과를 도 11)에 도시하였다.
마찬가지로, PRLR은 T47D 세포의 리소좀 구획 내로 신속하게 내재화되는 것이 관찰되었으나, HER2는 그렇지 않았다. CF™594로 표지된 항-PRLR 항체 또는 CF™594로 표지된 항-HER2 항체를 플루오레세인-3 kDa 덱스트란으로 사전에 표지한 T47D 세포에 첨가하였다. 이러한 항체-수용체 복합체를 지정된 시간 동안(도 12의 X축) 37℃에서 내재화되도록 한 다음, 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다. 덱스트란이 표지된 리소좀으로 내재화된 항체의 공편재화를 확인하였다. 결과를 도 12에 도시하였으며, 이는 도 11의 내재화 데이터와 본질적으로 일치한다.
PRLR의 구성성 전환을 제어하는 서열 모티프를 수용체 세포질 도메인에 21개 아미노산 영역으로 매핑하였다. PRLR 전환은 효율적인 ADC 매개성 세포주기 정지 및 세포 사멸을 가능하게 했다. 도 13은 다음을 포함하는, 다음 실험에 사용된 다양한 PRLR 및 HER2 구성체를 도시한 것이다: (1) 전체 길이 PRLR(PRLR FL), (2) 전체 길이 HER2(HER2 FL), (3) HER2의 막관통 부분(TM) 및 세포질 부분(Cyto)에 융합된 PRLR의 세포 외(Ecto) 도메인(PRLRectoHER2cytoTM), (4) PRLR의 막관통 부분(TM) 및 세포질 부분(Cyto)에 융합된 HER2의 세포 외(Ecto) 도메인(HER2ectoPRLRcytoTM), (5) (신호 펩티드가 남아 있는, 처리되지 않은 단백질로 측정한 바에 따른) 아미노산 301~622가 결실된 PRLR(PRLR Cyto42) 및 (6) (신호 펩티드가 남아 있는, 처리되지 않은 단백질로 측정한 바에 따른) 아미노산 280~622가 결실된 PRLR(PRLR Cyto21).
PRLR의 내재화 이펙터 서열들을 그것의 도메인 중 하나(세포 외, 막관통, 세포질)로 매핑하기 위해, HEK293 세포를 24웰 광학 플레이트에서 성장시켰고, PRLR, HER2, HER2ectoPRLRcytoTM, 또는 PRLRectoHER2cytoTM을 암호화하는 포유류 발현 벡터로 24시간 동안 일시적으로 형질전환시켰다. 그런 다음, 형질전환된 세포들을 CF™594로 표지된 1차 항체의 존재 하에 얼음 위에서 인큐베이션 한 다음, 37℃로 가온하여 추가로 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 도 14는 구성체가 내재화되리라 예상되지 않는 경우인 4℃와 신속하게 내재화될 수 있는 구성체가 내재화될 때인 37℃ 후의 장식된 세포를 도시한 것이다. 패널 A는 37℃에서 내재화된 PRLR FL 구성체를 도시한 것이다. 패널 B는 HER2 FL 구성체를 도시한 것으로, 이는 37℃에서 1시간 이내에 내재화하는 데 기본적으로 실패하였다. 패널 C는 PRLRecto-HER2cyto/TM 구성체를 도시한 것으로, 이것 또한 37℃에서 1시간 이내에 내재화하는 데 기본적으로 실패하였다. 패널 D는 37℃에서 내재화된 HER2ectoPRLRcyto/TM 구성체를 도시한 것이다. 이들 결과는 PRLR의 세포질 도메인이 내재화 이펙터 서열을 제공함을 시사한다.
내재화 이펙터 서열을 약 280 내지 약 300의 PRLR 아미노산 잔기들(예컨대, 서열 번호 11의 잔기 280 내지 300; 잔기 DAHLLEKGKSEELLSALGCQD[서열 번호 12])(PRLR Cyto21-42라고도 알려져 있음)로 더 매핑하였다. 표지된 항체-얼음에서 37℃까지로의 실험을 위에 기술된 바와 같이 HEK293 세포에서 수행하였다. 도 15는 PRLR의 전체 세포질 도메인(패널 A와 B), 막 인접 42개 아미노산(PRLR Cyto42)(패널 C와 D) 및 막 인접 21개 아미노산(PRLR Cyto21)(패널 D와 E)을 함유하는 구성체들의 세포 흡수를 도시한 것이다. PRLR Cyto42 구성체는 신속하게 내재화되었지만, PRLR Cyto21 구성체는 그렇지 않았다. 이는 원형질 막에 인접한 21번 아미노산과 42번 아미노산 사이의 PRLR 세포질 도메인 영역(Cyto21-42)이 내재화 및 PRLR의 분해에 필수적인 정보를 함유하고 있음을 보여준다.
내재화된 PRLR 구성체가 분해되었는지(즉, 리소좀으로 표적화되었는지)를 결정하기 위해 형질전환된 HEK293 세포를 단백질 생성을 정지시키기 위한 가온 후에 다양한 시점에서(0시간, 2시간, 4시간, 6시간) 시클로헥시미드(CHX)로 처리했다. 총 세포 용해물의 웨스턴 블롯에 의해 증명한 바와 같이(도 16), PRLR FL과 PRLR Cyto42는 신속하게 분해되었지만, PRLR Cyto21 분해는 거의 검출되지 않았다.
항체 약물 접합체(ADC)로서 항-세포 증식제를 전달하기 위한 내재화 이펙터로서 PRLR 막관통 도메인과 세포질 도메인의 효율성을 형질전환된 HEK293 세포에서 시험하였다. (예컨대, 렌티-엑스(Lenti-X™) 테트온(Tet-On®) 시스템(클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아 주 마운틴뷰 소재)을 이용하여) 테트라사이클린 제어 방식으로 PRLR, HER2, 또는 PRLRectoHER2cyto/TM을 발현하도록 HEK293 세포를 유전자 조작하였다. 수용체의 상이한 발현 수준을 달성하기 위해 0.01 ηg/ml, 또는 0.003 μg/ml, 또는 0.7 μg/ml의 독시사이클린으로 24시간 동안 형질전환된 세포를 유도하였으며, 이를 유동 세포분석법으로 결정하였다. 메르탄신(DM1으로도 알려져 있고, 엠탄신이라고도 알려져 있음)과 접합된 PRLR(1 ηM)(도 17, 패널 A) 또는 HER2-DM1(1 ηM) (도 17, 패널 B)를 각각 형질전환된 세포에 첨가하였고, 이 세포들을 또 다른 24시간 동안 인큐베이션 시켰다. 조기 유사분열 세포를 검출하기 위해 포스포-히스톤 H3(Ser10) 항체를 이용하여 세포 주기 분석을 수행하였다. 이러한 결과를 도 17에 나타냈는데, PRLR의 막관통/세포질 도메인이 효과적으로 약물의 세포로의 전달을 매개함을 보여준다.
내재화에 필수적인 잔기들을 매핑하는 것을 돕기 위해 세포질 도메인, 구체적으로는 Cyto21-24 도메인의 알라닌 돌연변이유발을 수행하였다. Cyto21-42서열에 함유된 두 개의 다이류신(dileucine)의 부위 유도 돌연변이는 형질전환된 HEK293 세포에서 PRLR Cyto42의 전환을 억제하였다. 티렉스(T-REx™) HEK293 세포(즉, 안정적인 테트온을 발현하는 세포, 써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific, 미국 마이애미 주 월섬 소재)를 (예컨대, 점프인(Jump-In™) 세포 엔지니어링 플랫폼(써모피셔 사이언티픽, 미국 마이애미 주 월섬 소재)을 이용하여) 테트라사이클린 조절 방식으로 PRLR Cyto42, PRLR Cyto21, PRLR Cyto42 L283A L284A, PRLR Cyto42 L292A L293A, 또는 PRLR Cyto42 L283A L284A L292A L293A(4LA라고도 알려져 있음)를 발현하도록 유전자 조작하였고, 24시간 동안 독시사이클린(0.7 μg/ml)으로 유도하였으며, 0시간 또는 4시간 동안 CHX(50 μg/ml)로 처리하였다. 이러한 결과를 도 18의 웨스턴 블롯으로 도시하였는데, 이는 Cyto21-42이 결여된 구성체들, 또는 다이류신 반복체의 경우, 단백질 분해 감소를 보여준다. 이러한 결과는 이들 잔기가 리소좀 표적화에 중요하다는 결론을 뒷받침한다.
추가적인 실험은 두 수용체가 HER2(T)xPRLR 이중특이적 항체를 이용하여 가교연결될 때 PRLR의 세포질 도메인에 의해 매개되는 PRLR 전환이 HER2를 리소좀 분해로 유도하는 원동력임을 증명한다. (HER2(T)는 트라스투주맙 아암을 나타낸다). 이러한 이중특이적 항체 및 그것의 단일특이적 모항체들의 동역학적 결합 매개변수들을 평가하였다. 이러한 이중특이적 항체는 HER2와 PRLR의 세포 외 도메인들에 대해 그것의 모항체들과 비슷한 결합 역학을 보여주었다(표 6).
PRLR의 세포질 도메인이 내인성 HER2의 HER2(T)xPRLR bsAb 매개성 분해에 필요하다는 점을 증명하기 위해, T-REx™ HEK293 세포들을 전체 길이의 PRLR, 또는 전체 세포질 도메인이 결여된 절단 PRLR(아래 패널)을 발현하도록 유전자 조작하였다. 점프인 세포 엔지니어링 플랫폼(써모피셔 사이언티픽, 미국 마이애미 주 월섬 소재)을 이용하여 테트라사이클린 제어된 방식으로 단백질을 발현시켰다. 세포를 0.7 μg/ml 독시사이클린으로 24시간 동안 유도한 다음, 상이한 시간 동안 지정된 항체(표 6)와 조합된 CHX와 함께 인큐베이션하고, 용해시키고, 웨스턴 블롯을 위해 처리했다.
Figure pct00006
도 19는 전체 길이의 PRLR 구성체를 발현하는 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. HER2(T) x PRLR 이중특이적 항체는 효과적으로 HER2를 리소좀으로 표적화하는 데 반해, 항-HER2(T) 항체는 그렇지 않아, 저발현 HER2에 대해 PRLR이 내재화 이펙터로서 효과가 있음을 보여준다는 점을 주목해야 한다. 도 20은 세포질의 절단된 PRLR 구성체를 발현하는 세포로부터의 용해물의 웨스턴 블롯을 도시한 것이다. 여기서, 어떠한 처리 하에서도 PRLR 또는 HER2의 분해는 눈에 띄지 않았으며, 따라서 그 수용체 및 그것의 분자 화물(molecular cargo)을 리소좀으로 표적화하기 위해서는 PRLR의 세포질 도메인이 필요하다는 점을 보여준다.
HER2xPRLR 이중특이적 항체는 HER2의 리소좀 수송을 유도하였고, HER2-ADC에 의해 유도된 세포주기 정지를 증진시켰으며, T47D 세포에서 세포 사멸을 촉진하였다. 리소좀 표적화를 측정하기 위해, T47D 세포를 비 결합성 대조 항체 또는 HER2 x PRLR 이중특이적 항체로 처리하였고, 얼음에서 37℃로의 세포 내 섭취(endocytosis) 분석을 하였다. 리소좀과 HER2를 염색하였고, HER2 화소가 차지한 리소좀 마커 화소의 백분율을 측정하였다. 결과를 도 21에 도시하였는데, 이는 대조군의 25% 미만과 비교하여 50% 내지 60%가 넘는 HER2가 가온 60분 이내에 HER2 x PRLR 이중특이적 항체에 의해 리소좀으로 표적화되었음을 보여준다.
HER2 x PRLR 이중특이적 항체가 HER2-DM1 매개성 세포주기 정지를 증진시켰음을 결정하기 위해, HER2를 발현하는 T47D 세포를 1 nM, 10 nm, 또는 30 nM의 PRLR-ADC(A), 또는 HER2-ADC 플러스 HER2 x PRLR 이중특이적 항체 (B), 또는 HER2-ADC 단독(C), 또는 비 결합성 대조 ADC(D)로 처리하였거나, 아무 것도 처리하지 않았다(E). 세포주기 정지 지표인 항-포스포-히스톤(Ser10) 항체로 염색하여 조기 유사분열 세포의 백분율을 확인하였다. 결과를 도 22에 도시하였는데, 이는 HER2-ADC 플러스 HER2 x PRLR 이중특이적 항체(B)가 HER2-ADC 단독(C)보다 더욱 효과적으로 세포를 정지시킴을 보여준다.
HER2 x PRLR 이중특이적 항체가 HER2-DM1 매개성 세포 사멸을 증진시켰음을 확인하기 위해, HER2를 발현하는 T47D 세포를 도 23에 지시된 약물: PRLR-ADC (A), HER2-ADC 플러스 HER2 x PRLR 이중특이적 항체(B), HER2-ADC 단독(C), 비 결합성 대조 ADC(D), 또는 비 결합성 대조 ADC 플러스 HER2 x PRLR 이중특이적 항체(E)로 처리하였다. 도 23은 결과를 도시한 것으로, HER2 x PRLR 이중특이적 항체가 HER2-ADC에 대한 IC50을 상당히 감소시켰음을 보여준다.
실시예 9. 높은 전환율 및 hMHC-1 내재화제를 이용한 표적의 분해
높은 전환 단백질을 이용하여 가용성 및 막관통 표적들을 분해하였다. (i) 신속하게 전환된다고 알려져 있으며, (ii) 2가 항체의 높은 표적 매개성 제거를 나타내며, (iii) 리소좀으로 또는 리소좀으로부터 돌아다닌다고 알려져 있는 "파괴자" 단백질과 표적 분자를 연결하도록 다중특이적 항원 결합 단백질(예컨대, 이중특이적 항체)을 설계하였다. 설계 및 제작의 용이함을 위해, 일반적인 경쇄, "파괴자" 단백질을 대상으로 한 중쇄 및 표적을 대상으로 한 중쇄를 함유하는 이중특이적 항체를 만들었다. 중쇄 중 하나는 H95R 변형을 함유했다.
본 실시예에서, 선택된 파괴자 분자는 주조직적합성 복합체 I MHC-1, 더욱 구체적으로는 I 클래스, B 동종형(HLA-B라고도 알려져 있음)이었다. HLA에 단단히 결합하는 단일클론성 항체는 신속히 제거되는데, 이는 "파괴자" 분자의 전형적인 특징이다. 예시적인 가용성 표적 분자로서, 알레르기 유발 항원 FelD1을 표적 분자로 선택하였다. FelD1은 두 개의 이황화물로 연결된 헤테로이량체를 포함하는 사분자체의 당단백질이다. 두 가지 형태의 가용성 FelD1, FelD1-myc-myc-his 융합 단백질(FelD1-mmh)과 FelD1-Fc 융합 단백질을 구성하고 시험하였다.
한 세트의 실험에서는, FelD1-mmh를 알렉사(Alexa) 488로 표지하여 표적의 내재화를 추적하는 것을 도왔다. (파괴자에 결합하는) HLA-B-특이적 아암과 (표적에 결합하는) FelD1-특이적 아암을 포함하는 이중특이적 항체(α-HLAB27·α-FelD1)를 다중특이적 항원 결합 단백질로 사용하였다. HLA-B를 발현하는 C1Rneo B-림포아구성 세포를 10 μg/ml FelD1-mmh-Alexa 488, 그리고 10 μg/ml α-HLAB27·α-FelD1과 인큐베이션 하였다. 세포를 밤새 인큐베이션하여 FelD1 표적 단백질의 내재화를 위한 시간을 허용하였다. 그런 다음, 세포를 항-알렉사488 항체(알렉사-플루오르-488-항체-다클론성/A-11094, 써모 피셔 사이언티픽, 미국 마이애미 주 월섬 소재)로 염색하였는데, 이 항체는 알렉사488의 형광을 ??칭한다. 항-알렉사488 항체는 내재화된 표지된 표적을 ??칭하지 않을 것이므로, 내재화된 표지는 세포의 표면과 결합된 표지와는 구별될 수 있다. 여기서, 형광을 FAC로 정량하였다.
도 10은 대조군으로 작용하는 MHC1 음성 세포, 그리고 MHC1 양성 세포에 대해, 표면 결합된 표적과 내재화된 표적의 평균 형광(FACS로 정량한 임의 단위)을 도시한 것이다. 사용된 이중특이적 항체는 α-HLAB27·α-FelD1이었다. 대조군으로 α-HLAB27·α-HLAB27 2가 모항체와 비특이적인 IgG 동종형을 이용하였다. MHC1(파괴자)을 발현하는 세포들의 경우, α-HLAB27·α-FelD1과 접촉된 세포들은 표면 결합 표적 단백질에 비해 내재화된 표적 분자에서 대략 네 배의 증가를 나타냈다. 대조군에 대해서는 기본적으로 어떠한 영향도 검출되지 않았다. 결과를 도 10과 아래 표 7에 도시하였다.
인간 HLA-B 대립 형질을 발현하는 마우스의 혈청으로부터 α-HLAB27·α-FelD1 매개성 FelD1-Fc의 제거를 평가하였다. 이중특이적 항체 α-HLAB27·α-FelD1과 대조군(PBS, 항-FelD1 2가 단일특이적, 및 항-HLAB27 2가 단일특이적)을 피하 주사(10 mg/kg)로 인간 HLA-B 대립 형질을 발현하는 마우스에 투여하였다. 다음날, 1.6 mg/kg의 FelD1-Fc를 꼬리 정맥 주사로 투여하였다. (3:1의 항체:표적 비율을 사용하였다.) 15분, 6시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 6일 및 8일에 취한 꼬리 출혈로부터 혈청 샘플을 얻었다. 항-FelD1 항체를 이용하여 FelD1 수준을 검출하고, 웨스턴 블롯팅으로 정량하였다. α-HLAB27·α-FelD1 이중특이적 처리는 < 30시간의 t1/2로 빠른 FelD1 제거를 보여주었는데, FelD1 부재 하의 항-HLAB27의 제거 속도와 비슷했고(즉, 33시간의 t1/2), FelD1 부재 하의 α-HLAB27·α-FelD1의 제거 속도의 두 배가 넘었다(즉, 65시간의 t1/2). 항-FelD1의 투여는 MHC1 매개성 제거를 가져오지 않았으나, 약간의 적정한 제거가 관찰되었는데, 이는 Fc 수용체에 기인한다. 결과를 도 11과 도 12에 도시하였다.
Figure pct00007
실시예 10. APLP2/PCSK9 시스템을 이용한 표적의 분해
프로단백질 전환효소 서브틸린/켁신 9형(PCSK9) 및 그의 세포 표면 파트너(예컨대, LDLR 및 APLP2; DeVay et al., "Characterization of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) trafficking reveals a novel lysosomal targeting mechanism via amyloid precursor-like protein 2 (APLP2)," 288(15) J. Biol. Chem. 10805-18 (Apr 12, 2013) 참조)가 항체 매개성 표적 파괴를 위한 이펙터로 이용될 수 있는지를 평가하기 위해, 항-표적-PCSK9 융합 단백질을 제조하였다. 이러한 융합 단백질은 PCSK9 융합체 대신에 항-PCSK9 또는 항-APLP2 결합 아암을 포함하는 이중특이적 항체의 모델로 간주될 수 있다.
이러한 실험을 위해, 헤모주벨린(HJV)을 부분적으로 모델 표적으로 사용하였는데, 효능의 생체 내 판독, 즉, 처리 시작 후 1주일에 혈청 철의 증가 측정이 용이하고 신뢰할 수 있기 때문이다. HJV는 골 형태발생 단백질 6(BMP6)을 위한 공수용체(co-receptor)이다. HJV 차단은 BMP6 신호 전달을 억제하고 헵시딘 수준을 감소시키는데, 이는 결과적으로 철 운반체인 훼로포리틴(ferroporitin)을 억제한다. 궁극적으로, HJV 차단은 혈청 철을 증가시킨다. (Core et al., "Hemojuvelin and bone morphogenetic protein (BMP) signaling in iron homeostasis," 5 Front. Pharmacol. 104 (1-9), May 13, 2014. 참조)
여섯 가지의 항체::PCSK9 융합 분자들을 생성하였는데, 각각은 3x GGGS 링커(서열 번호 6)를 통해 세 개의 상이한 PCSK9 중 하나(예컨대, 서열 번호 5)에 융합된 hIgG1 백본에 항-HJV 비 차단 항체(α-HJV-n) 또는 항-Myc 항체(α-Myc) 중 하나를 포함한다. 첫 번째 변이체는 신호 서열은 없지만, 프로 도메인을 포함하는 전체 길이의 PCSK9이다(전체 길이 ["PCSK9FL"]; 서열 번호7). 두 번째는 PCSK9의 촉매성 도메인과 c 말단 도메인 사이에 일부 내부 링커 서열을 포함하는, C 말단 도메인 단독이다(긴 C 말단 ["PCSK9LC"]; 서열 번호 8). 세 번째는 이러한 내부 링커 서열을 포함하지 않는 C 말단 도메인의 짧은 변이체이다(짧은 C 말단 ["PCSK9SC"]; 서열 번호 9). 이러한 C 말단 변이체들은 APLP2와만 결합하고 LDL 수용체에는 결합하지 않을 것으로 기대된다.
이러한 항체::PCSK9 융합체들을 CHO 세포에서 발현시키고 분비시켰다. 관련 항체의 중쇄 PCSK9 융합체 및 같은 기원의 경쇄를 함유하는 플라스미드를 10 cm 또는 15 cm 접시의 CHO-K1 세포로 공동 형질감염시켰다. 그런 다음, 세포들을 4~5일 동안 인큐베이션하여 항체::PSCK9를 생성 및 분비시켰고, 그 후, 상층액을 수확하고, 0.2 마이크론 필터로 여과하여 멸균하였다. 이후, 융합 단백질을 함유하는 CHO 세포 상층액을 대상으로 시험관 내에서 가용성 HJV 단백질을 내재화하는 능력에 대해 시험하였다.
형광단 pHrodo로 태그를 붙인 가용성 HJV를 다음과 같이 제조하였다. GPG 링커를 통해 myc-myc-6xhis (mmh) 태그에 융합된 HJV 엑토도메인(ecto-domain)(서열 번호 10)을 CHO sups에서 발현시키고 정제하였다. 이후, 정제된 단백질을 N-하이드록시설포석신이미드(NHS) 화학을 이용하여 pHrodo®(써모 피셔 사이언티픽, 월섬)로 표지하였다.
HepG2 세포를 50% 항체::PSCK9를 함유하는 CHO 상층액, 그리고 5% 리포단백질 결핍 혈청 및 1 μg/ml pHrodo®가 표지된 hHJV-mmh가 있는 50% HepG2 배지와 함께 인큐베이션 하였다. HepG2 세포는 PCSK9를 내재화하는 것으로 알려져 있는 핵심 단백질인 LDLR과 APLP2를 발현하므로 편리한 모델이다. 그러나 PCSK9-융합 다중특이적 항원 결합 단백질을 평가하기 위해, 당업자는 LDLR 및 APLP2 이외의 결합 파트너를 통한 것을 포함하는, PCSK9가 내재화된 어떠한 세포주(천연, 유도형, 이소성 형질전환형 등)도 본 분석에 잠재적으로 이용될 수 있음을 이해할 것이다. 분석 전날 세포를 mL당 1.5x105개 세포로 플레이팅하고, 37°C에서 인큐베이션 하였다. 이미지엑스프레스 고감도 이미저(몰레큐러 디바이스(Molecular Devices), 미국 캘리포니아 주 서니베일 소재)에서의 영상화를 통해 24시간 동안 내재화를 모니터링하였는데, 24시간 시점은 분석 전체에 걸친 세포 내의 pHrodo®-HJV-mmh 축적 때문일 가능성이 높은 구성체와 대조군 사이의 최대 차이를 보여준다. 메타엑스프레스 소프트웨어(몰레큘러 디바이스)를 이용하여 내재화된 형광을 정량하였다.
α-HJV-N::PCSK9F 및 α-Myc::PCSK9FL과의 인큐베이션은 무 항체 대조군과 비교하여 pHrodo® 태그를 붙인 HJV-mmh 단백질의 내재화를 증가시켰다. pHrodo® 태그를 붙인 HJV-mmh는 두 개의 myc 태그를 함유하므로, α-Myc::PCSK9FL은 본 분석에서 α-HJV-N::PCSK9FL과 유사하게 작용할 것이라 예상되었다. 흥미롭게도, PCSK9 C 말단 도메인을 함유하는 융합 단백질(즉, α-HJV-N::PCSK9LC 및 α-HJV-N::PCSK9SC)는 표지된 HJV 단백질을 내재화하기에 실패하였는데, 아마도 약화된 LDLR 결합 때문이다. 결과를 도 26에 도시하였다.
실시예 11. APLP2/PCSK9 시스템을 이용한 생체 내에서의 표적의 분해
α-HJV-N 2가 단일특이적 모항체(이는 HJV와의 BMP 결합을 차단하지 않는다), α-HJV-B 2가 단일특이적 항체(이는 HJV와의 BMP 결합을 차단한다), α-HJV-N::PCSK9FL 융합 단백질 및 α-Myc::PCSK9FL 융합 단백질을 대상으로 생체 내에서 HJV 신호 전달을 차단하는 능력을 시험하였다. 유체역학적 전달(HDD)을 통해 이러한 분자들을 마우스에 투여하였다. 1주일 후에 혈청 샘플을 채취하였다. 내인성 HJV는 myc-myc-his 태그가 없으므로, α-Myc::PCSK9FL 융합 단백질은 생체 내에서 음성 대조군으로 기능한다. 예상대로, α-HJV-N 2가 다중특이적 항체(양성 대조군)의 HDD는 음성 대조군에 비해 혈청 철의 상당한 증가를 초래했다. α-HJV-N::PCSK9FL(시험 분자)의 HDD 또한 차단 항체와 비슷한 규모로 혈청 철의 상당한 증가를 초래하여, 이 분자가 생체 내에서 HJV를 내재화하고, 격리 또는 파괴하는 데 효과적임을 시사하였다(도 27).
본 발명은 본원에 기술된 특정 구현예에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본원에 기술된 것들 외에, 본 발명의 다양한 변형은 전술된 설명 및 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백해질 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위의 범위 이내에 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> MULTISPECIFIC ANTIGEN-BINDING MOLECULES AND USES THEREOF <130> 10172WO01 <150> US 62/188,860 <151> 2015-07-06 <150> US 62/328,900 <151> 2016-04-28 <150> US 62/347,179 <151> 2016-06-08 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 502 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> synthetic <400> 1 Met Met Ala Leu Gly Ala Ala Gly Ala Thr Arg Val Phe Val Ala Met 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Leu Gly Gly His Pro Leu Leu Gly Val Ser Ala Thr 20 25 30 Leu Asn Ser Val Leu Asn Ser Asn Ala Ile Lys Asn Leu Pro Pro Pro 35 40 45 Leu Gly Gly Ala Ala Gly His Pro Gly Ser Ala Val Ser Ala Ala Pro 50 55 60 Gly Ile Leu Tyr Pro Gly Gly Asn Lys Tyr Gln Thr Ile Asp Asn Tyr 65 70 75 80 Gln Pro Tyr Pro Cys Ala Glu Asp Glu Glu Cys Gly Thr Asp Glu Tyr 85 90 95 Cys Ala Ser Pro Thr Arg Gly Gly Asp Ala Gly Val Gln Ile Cys Leu 100 105 110 Ala Cys Arg Lys Arg Arg Lys Arg Cys Met Arg His Ala Met Cys Cys 115 120 125 Pro Gly Asn Tyr Cys Lys Asn Gly Ile Cys 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Arg Glu Val Glu 465 470 475 480 Ser Phe His Ser Glu Thr Asp Gln Asp Thr Pro Trp Leu Leu Pro Gln 485 490 495 Glu Lys Thr Pro Phe Gly Ser Ala Lys Pro Leu Asp Tyr Val Glu Ile 500 505 510 His Lys Val Asn Lys Asp Gly Ala Leu Ser Leu Leu Pro Lys Gln Arg 515 520 525 Glu Asn Ser Gly Lys Pro Lys Lys Pro Gly Thr Pro Glu Asn Asn Lys 530 535 540 Glu Tyr Ala Lys Val Ser Gly Val Met Asp Asn Asn Ile Leu Val Leu 545 550 555 560 Val Pro Asp Pro His Ala Lys Asn Val Ala Cys Phe Glu Glu Ser Ala 565 570 575 Lys Glu Ala Pro Pro Ser Leu Glu Gln Asn Gln Ala Glu Lys Ala Leu 580 585 590 Ala Asn Phe Thr Ala Thr Ser Ser Lys Cys Arg Leu Gln Leu Gly Gly 595 600 605 Leu Asp Tyr Leu Asp Pro Ala Cys Phe Thr His Ser Phe His 610 615 620 <210> 12 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Asp Ala His Leu Leu Glu Lys Gly Lys Ser Glu Glu Leu Leu Ser Ala 1 5 10 15 Leu Gly Cys Gln Asp 20

Claims (58)

  1. 환자에 항체 약물 접합체(ADC) 및 다중특이적 항원 결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 암 환자에서 종양의 성장을 억제하거나 종양 퇴화를 촉진하는 방법으로서, ADC는 약물, 독소, 또는 종양 표적(T)과 특이적으로 결합하는 항원 결합 단백질에 접합된 방사성 동위원소를 포함하고, 다중특이적 항원 결합 단백질은 T와 특이적으로 결합하는 제1 항원 결합 도메인 및 내재화 이펙터 단백질(E)과 특이적으로 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 포함하며, 환자는 T와 E 둘 다를 발현하는 세포를 포함하는 종양에 걸린 환자인 방법.
  2. 제1항에 있어서, ADC의 항원 결합 부분은 다중특이적 항원 결합 도메인의 제1 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 T 상의 에피토프와 중첩되지 않는 T 상의 에피토프와 결합하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 단백질의 E에 대한 결합 친화성은 다중특이적 항원 결합 단백질의 T에 대한 결합 친화성보다 적은 것인 방법.
  4. 표적 분자 및 파괴자 분자를 적어도 하나의 다중특이적 항원 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 분자를 분해하는 방법으로서, 다중특이적 항원 결합 단백질, 표적 분자 및 파괴자 분자는 이후에 세포 내에서 리소좀으로 수송되고, 표적 분자가 분해되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 분자는 제1 에피토프에서 표적 분자와 결합하는 제1 파라토프 및 제2 에피토프에서 파괴자 분자와 결합하는 제2 파라토프를 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, (i) 표적 분자 부재 하에 다중특이적 항원 결합 단백질은 파괴자 분자와 낮은 친화성으로 결합하고, (ii) 표적 분자 존재 하에 다중특이적 항원 결합 단백질은 파괴자 분자와 높은 결합력으로 결합하는 것인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 파괴자 분자는 신속하게 내재화되는 막 단백질, 또는 신속하게 내재화되는 막 단백질과 결합하는 가용성 단백질인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 파괴자 분자는 HLA, APLP2, LDLR, PCSK9, 및 CD63으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  9. 제4항 또는 제5항에 있어서, 표적 분자는 적어도 두 개의 동일한 서브유닛을 포함하는 것인 방법.
  10. 제4항 또는 제5항에 있어서, 표적 분자를 제2의 다중특이적 항원 결합 단백질과 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 이때, 제2의 다중특이적 항원 결합 단백질은 제2 파라토프 및, 제3 에피토프와 결합하는 제3 파라토프를 포함하고, 표적은 제3 파라토프와 결합하는 제3 에피토프를 포함하는 것인 방법.
  11. 제4항 또는 제5항에 있어서, 표적 분자는 막 단백질 또는 가용성 단백질인 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 표적 분자는 표적 분자 리간드와 결합하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 표적 분자 리간드는 분해되는 것인 방법.
  14. 제4항 또는 제5항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체인 것인 방법.
  15. 제10항에 있어서, 제2 다중특이적 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체인 것인 방법.
  16. 제4항 또는 제5항에 있어서, 표적 분자는 알레르기 유발 항원, 알레르기 유발 항원 결합 단백질, 사이토카인, 사이토카인 결합 단백질, 사이토카인 수용체, wnt 단백질, wnt 결합 단백질, 프리즐드(frizzled) 단백질, 성장 인자, 성장 인자 결합 단백질, 성장 인자 수용체, G 단백질 연결 수용체, 리포단백질, 리포단백질 결합 단백질, 리포단백질 수용체, 호르몬, 호르몬 결합 단백질, 호르몬 수용체, 막 채널, 리간드 개폐 이온 채널, 전압 개폐 이온 채널, 병원체 또는 이의 단편, 및 GPI 연결 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 표적 분자는 IL-1, IL-1 수용체, IL-4, IL-4 수용체, VEGF, VEGF 수용체, RSV, NGF, NGF 수용체, 예정 세포사 단백질-1 (PD1), 예정 세포사 단백질 리간드-1(PD-L1), PD-L2, PDGF, PDGF 수용체, 안지오포이에틴-2(Ang2), Ang2 수용체, 미오스타틴(GDF8), GDF8 수용체, CD3 및 CD20으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  18. 제4항 또는 제5항에 있어서, 파괴자 분자는 인간 분자인 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포는 생체 내 세포인 것인 방법.
  20. 표적 분자의 제1 에피토프와 결합하는 제1 파라토프 및 파괴자 분자의 제2 에피토프와 결합하는 제2 파라토프를 포함하는 다중특이적 항원 결합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 항체의 중쇄의 C 말단에 연결된 리간드 또는 가용성 수용체 단편을 포함하는 융합 단백질이고, 항체는 제1 파라토프를 포함하고, 리간드 또는 가용성 수용체는 제2 파라토프를 포함하는 것인 다중특이적 항원 결합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, 리간드 또는 가용성 수용체는 PCSK9 분자 또는 이의 단편을 포함하고, 파괴자 분자는 LDLR 또는 APLP2인 것인 다중특이적 항원 결합 단백질.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 표적 분자는 적어도 두 개의 제1 에피토프를 포함하는 것인 다중특이적 항원 결합 단백질.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 파괴자 분자는 신속하게 전환되는 세포 표면 분자인 것인 다중특이적 항원 결합 단백질.
  25. 제24항에 있어서, 파괴자 분자는 HLA, APLP2, LDLR, PCSK9, 및 CD63으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 다중특이적 항원 결합 단백질.
  26. 제1 다중특이적 항원 결합 단백질 및 제2 다중특이적 항원 결합 단백질을 포함하는 조성물로서, 이때, (a) 제1 다중특이적 항원 결합 단백질은 (i) 표적 분자의 제1 에피토프와 결합하는 제1 파라토프, 및 (ii) 파괴자 분자의 제2 에피토프와 결합하는 제2 파라토프를 포함하고; (b) 제2 다중특이적 항원 결합 단백질은 (i) 표적 분자의 제3 에피토프와 결합하는 제3 파라토프, 및 (ii) 파괴자 분자의 제2 에피토프와 결합하는 제2 파라토프를 포함하는 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 제1 다중특이적 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체이고, 상기 이중특이적 항체의 한 아암은 제1 파라토프를 포함하고, 상기 이중특이적 항체의 다른 아암은 제2 파라토프를 포함하는 것인 조성물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 제2 다중특이적 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체이고, 상기 이중특이적 항체의 한 아암은 제3 파라토프를 포함하고, 상기 이중특이적 항체의 다른 아암은 제2 파라토프를 포함하는 것인 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 파괴자 분자는 신속하게 전환되는 세포 표면 분자인 것인 조성물.
  30. 제29항에 있어서, 파괴자 분자는 HLA, APLP2, LDLR, PCSK9, 및 CD63으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  31. 제26항의 조성물을 환자에 투여하는 것을 포함하는 환자 치료 방법으로서, 치료적 표적 분자는 환자의 혈청으로부터 신속하게 제거되는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 치료적 표적 분자는 다중특이적 항원 결합 단백질이 환자에 투여되고 8일 후에 환자로부터 수집된 혈청에서 검출되지 않고, 이러한 검출은 웨스턴 블롯 분석에 의한 것인 방법.
  33. 표적 분자 및 세포 상의 내재화 이펙터를 적어도 하나의 다중특이적 항원 결합 단백질 및 세포독성제와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 사멸 방법으로서, 다중특이적 항원 결합 단백질, 표적 분자, 내재화 이펙터 및 세포독성제는 이후에 상기 세포 내에서 리소좀으로 수송되고, 약물은 상기 세포의 세포질로 방출되는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포독성제는 다중특이적 항원 결합 단백질 또는 또 다른 항원 결합제에 접합되는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포독성제는 방사성 동위원소, 독소, 또는 약물인 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 세포독성제는 칼리케아미신, 아우리스타틴 또는 메이탄신계 세포독성제인 것인 방법.
  37. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 내재화 이펙터는 신속하게 내재화되는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 내재화 이펙터는 하나 이상의 다이류신 모티프를 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 내재화 이펙터는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 내재화 이펙터는 프로락틴 수용체(PRLR)인 것인 방법.
  41. 제37항에 있어서, 표적 분자는 수용체 티로신-단백질 키나제인 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 표적 분자는 HER2인 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 항-HER2 x PRLR 이중특이적 항체인 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 세포독성제는 항-HER2 x PRLR 이중특이적 항체에 접합된 메이탄시노이드계 독소를 포함하는 것인 방법.
  45. 제43항에 있어서, 세포독성제는 항-HER2 2가 단일특이적 항체에 접합된 메이탄시노이드계 독소를 포함하는 것인 방법.
  46. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 암 세포인 것인 방법.
  47. 제40항 내지 제45항 및 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 유방암 세포인 것인 방법.
  48. 다중특이적 항원 결합 단백질 및 세포독성제를 포함하는 약학적 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 이중특이적 항체인 약학적 조성물.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 신속하게 내재화되는 세포 표면 수용체와 결합하고 서서히 내재화되는 세포 표면 수용체와 결합하는 것인 약학적 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 신속하게 내재화되는 세포 표면 수용체는 하나 이상의 다이류신 모티프를 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  52. 제51항에 있어서, 신속하게 내재화되는 세포 표면 수용체는 서열 번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 세포질 도메인을 포함하는 것인 약학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 신속하게 내재화되는 세포 표면 수용체는 프로락틴 수용체(PRLR)인 약학적 조성물.
  54. 제50항에 있어서, 서서히 내재화되는 세포 표면 수용체는 수용체 티로신-단백질 키나제인 약학적 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 수용체 티로신-단백질 키나제는 HER2인 약학적 조성물.
  56. 제53항 또는 제55항에 있어서, 다중특이적 항원 결합 단백질은 항-HER2 x PRLR 이중특이적 항체인 약학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 세포독성제는 다중특이적 항원 결합 단백질에 접합된 메이탄시노이드계 독소를 포함하는 것인 약학적 조성물.
  58. 제57항에 있어서, 세포독성제는 항-HER2 2가 단일특이적 항체에 접합된 메이탄시노이드계 독소를 포함하는 것인 약학적 조성물.
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