CN113301925A - 用于溶酶体靶向的双官能分子以及相关的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了双官能分子，所述双官能分子包括：第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子；以及第二部分，所述第二部分特异性结合溶酶体靶向分子。所述双官能分子可用于例如经由胞内体/溶酶体途径靶向降解细胞表面分子和细胞外分子(例如，蛋白质)。本发明还提供了包括所述双官能分子的组合物和试剂盒，以及使用所述双官能分子的方法。本发明还提供了制备双官能分子的方法。

Description

用于溶酶体靶向的双官能分子以及相关的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年12月19日提交的美国临时专利申请号62/782,193以及于2019年11月7日提交的美国临时专利申请号62/932,347的权益，这些申请通过引用整体并入本文。
政府支持声明
本发明是在国立卫生研究院授予的合同CA227942、GM059907和GM123636下受政府支持完成的。政府享有本发明的一定权利。
发明内容
本发明提供了双官能分子，所述双官能分子包括：第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子；以及第二部分，所述第二部分特异性结合溶酶体靶向分子。所述双官能分子可用于例如经由胞内体/溶酶体途径靶向降解细胞表面分子和细胞外分子(例如，蛋白质)。本发明还提供了包括所述双官能分子的组合物和试剂盒，以及使用所述双官能分子的方法。本发明还提供了制备双官能分子的方法。
附图说明
图1根据本公开的一个实施方案的双官能分子及其使用的示意图。
图2根据一个实施方案的用于合成甘露糖-6-磷酸酯N-羧酸酐的方案。该路径允许获得与例如丝氨酸残基链接的甘露糖-6-磷酸酯聚糖，以用作N-羧酸酐聚合中的单体。
图3根据一个实施方案的用于合成甘露糖-6-膦酸酯N-羧酸酐的方案。该路径允许获得与例如丝氨酸残基链接的甘露糖-6-膦酸酯聚糖，以用作N-羧酸酐聚合中的单体。膦酸基团是磷酸基团的水解稳定变体，先前已证明，与甘露糖-6-磷酸酯聚糖相比，膦酸基团具有更好的血清稳定性。
图4根据一个实施方案的用于合成甘露糖-6-羧酸酯N-羧酸酐的方案。该路径允许获得与例如丝氨酸残基链接的甘露糖-6-羧酸酯聚糖，以用作N-羧酸酐聚合中的单体。羧酸基团是磷酸基团的水解稳定变体，先前已证明，与甘露糖-6-磷酸酯聚糖相比，羧酸基团具有更好的血清稳定性。先前已证明，与甘露糖-6-磷酸酯聚糖相比，甘露糖-6-羧酸酯聚糖对非阳离子依赖性M6PR(CIM6PR)的相对结合亲和力为0.3。化学调节受体-配体相互作用的能力允许在生物应用中进行更好的控制以减少脱靶结合事件。
图5根据一个实施方案的用于合成甘露糖-6-丙烯酸酯N-羧酸酐的方案。该路径允许获得与例如丝氨酸残基链接的甘露糖-6-丙烯酸酯聚糖，以用作N-羧酸酐聚合中的单体。丙烯酸基团是磷酸基团的水解稳定变体，先前已证明，与甘露糖-6-磷酸酯聚糖相比，丙烯酸基团具有更好的血清稳定性。先前已证明，与甘露糖-6-磷酸酯聚糖相比，甘露糖-6-丙烯酸酯聚糖对CIM6PR的相对结合亲和力为0.7。化学调节受体-配体相互作用的能力允许在生物应用中进行更好的控制以减少脱靶结合事件。
图6根据一个实施方案的用于合成葡萄糖-6-膦酸酯N-羧酸酐的方案。该路径允许获得与例如丝氨酸残基链接的葡萄糖-6-膦酸酯聚糖，以用作N-羧酸酐聚合中的单体。与含甘露糖的聚糖相比，葡萄糖-6-膦酸酯残基对CIM6PR的结合亲和力明显较弱。
图7根据一个实施方案的用于合成甘露糖-6-膦酸酯异硫氰酸酯的方案。该路径允许获得甘露糖-6-膦酸酯异硫氰酸酯(M6Pn-ITC)，其可以直接缀合至例如蛋白质中的赖氨酸残基。多个M6Pn-ITC与给定蛋白质内的多个氨基酸(例如，赖氨酸)的缀合允许M6Pn聚糖的多价呈递。
图8根据一个实施方案的用于合成用于陈列M6P配体的支架的一般NCA聚合方案的图示。与其他氨基酸衍生的NCA的共聚物易于以类似方式合成，并且使得可获得多种具有不同的结构和组成的带有多个M6P配体残基的聚合物。这些材料随后被脱保护以提供完整的多肽/聚糖结构。
图9根据一个实施方案的用于甘露糖-6-膦酸酯肽寡聚体的固相肽合成的方案。如图所示，用于陈列M6P配体的支架也可以从M6P、M6Pn等氨基酸开始使用固相肽合成法合成。这种合成路径与NCA聚合路径相比允许更好地控制多肽长度和组成，并且与NCA聚合衍生材料相比不需要特殊的合成条件。
图10一个实验的示意图(顶部)和荧光成像结果(底部)，该实验证明，已用生物素帽官能化的M6Pn聚合物可以介导细胞外中性抗生物素蛋白-647(NA647——生物素可强结合的一种蛋白质)从细胞外空间向溶酶体的转移以进行降解。观察到蛋白质和溶酶体染色染料的共定位。
图11数据证明几种细胞系以M6Pn聚合物依赖性方式表现出对NA647的吸收。鉴于这些结果，预期任何带有M6PR(例如，CIM6PR)的细胞系都将允许通过这种方法将蛋白质穿梭至溶酶体，并且不限于本研究中测试的细胞系。
图12数据证明天然凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可用于监测M6P聚合物对蛋白质(包括抗体)的官能化。在该实例中，通过以下方式来实施官能化：首先用反应性炔烃(例如，双环[6.1.0]壬炔，BCN)标记目标蛋白质，然后用含叠氮化物的聚合物温育(生物正交无铜应变促进的点击反应)。
图13示意图(顶部)和荧光成像数据(底部)证明聚(M6Pn)标记的抗体可以将其结合配偶体穿梭至溶酶体。在该实例中，在蛋白质和溶酶体染色染料共定位(合并)的情况下，小鼠IgG-488与带有聚(M6Pn)标签的抗小鼠IgG抗体一起温育。
图14示意图(顶部)和数据(底部)证明聚(M6Pn)标记的抗体可以将其结合配偶体穿梭至细胞内区室。在该实例中，重组人apoE4与小鼠来源的抗人apoE4抗体、抗小鼠IgG抗体或带有聚(M6Pn)标签的抗小鼠抗体一起温育。使用含M6Pn的二次抗体观察到明显更多的吸收。
图15数据证明聚(M6Pn)标记的抗体可以穿梭其结合配偶体进行降解。在该实例中，通过将细胞与带有M6Pn标签的西妥昔单抗一起温育来评估EGFR降解。与西妥昔单抗或带有模拟聚合物(GalNAc)的西妥昔单抗相比，所有测试的细胞系都观察到了总EGFR的损失。EGF是EGFR降解的阳性对照。泳道1：对照。泳道2：EGF(100ng/mL，1h，+对照)。泳道3：西妥昔单抗。泳道4：西妥昔单抗-GalNAc缀合物。泳道5：西妥昔单抗-M6P缀合物(长)。泳道6：西妥昔单抗-M6P缀合物(短)。通过光密度测定法计算对照百分比。
图16数据证明聚(M6Pn)标记的抗体片段可以将其结合配偶体穿梭至溶酶体。在该实例中，通过将细胞与带有M6Pn标签的西妥昔单抗衍生的Fab部分一起温育来评估EGFR降解。与单独的西妥昔单抗Fab或带有模拟聚合物(GalNAc)的西妥昔单抗Fab相比，观察到总EGFR的损失。
图17数据证明聚(M6Pn)标记的抗体可以穿梭其结合配偶体进行降解。在该实例中，CD71(转铁蛋白受体)的降解是通过以下方式来评估的：将细胞与抗CD71的主要小鼠来源抗体、抗小鼠IgG抗体或带有聚(M6Pn)标签的抗小鼠抗体一起温育。含有M6P标签的系统会引起明显更多的降解。
图18数据证明聚(M6Pn)标记的抗体片段可以穿梭其结合配偶体进行降解。在该实例中，通过将细胞与抗PDL1抗体或带有M6P标签的抗PDL1抗体一起温育来评估PDL1降解。仅在使用M6P标记的抗PDL1抗体的情况下观察到降解。
图19使用双官能分子(其是双特异性抗体)靶向细胞外蛋白质降解的示意图。在该实例中，针对CIM6PR的双特异性抗体和给定的靶标在降低的胞内体pH下与靶标脱离。这种策略允许给定的双特异性抗体与受体一起循环，并不断地将货物和靶标递送至溶酶体，而不会降解抗体。
图20根据本公开的实施方案的双官能分子的第二部分可以结合的溶酶体靶向分子的示意图。在该实例中，溶酶体靶向分子是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)，其基本上仅在肝脏细胞(例如，肝细胞)上表达。如右图所示，ASGPR在质膜和胞内体之间组成性循环，从而将细胞外糖蛋白带入细胞内以在溶酶体中降解。左下图显示了示例双官能分子，其包括：作为抗体的第一部分(例如，与在肝细胞表面表达的分子或存在于肝细胞的细胞外空间中的分子相结合的抗体)；以及包括用于结合至ASGPR的多价ASGPR配体的第二部分。在该实例中，第二部分包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的聚合物，特别是如图所示的聚(GalNAc-co-Ala)聚合物。
图21示意图和数据证明使用双官能分子将靶标分子导入HEPG2(肝细胞癌)细胞中，该双官能分子包括：与靶标分子结合的第一部分(在该实例中为抗体)；以及包括图20所示的含有GalNAc聚合物的第二部分。
图22示意图和数据证明在HUH7(肝细胞癌)细胞中经由ASGPR进行高效的细胞摄取。
图23示意图和数据证明使用双官能分子高效降解HEP3B(肝细胞癌)细胞中的EGFR，该双官能分子包括与包括图20所示的含有GalNAc的聚合物的第二部分缀合的西妥昔单抗(第一部分)。还显示了包括与包括M6PR配体的第二部分缀合的西妥昔单抗(第一部分)的缀合物的EGFR降解数据。
图24数据证明使用双官能分子在HEPG2细胞中高效降解EGFR，该双官能分子包括与包括图20所示的含有GalNAc的聚合物的第二部分缀合的西妥昔单抗(第一部分)。还显示了包括与包括M6PR配体的第二部分缀合的西妥昔单抗(第一部分)的缀合物的EGFR降解数据。
图25来自时间进程研究的数据，该研究评估了HEP3B细胞中EGFR随时间的降解。
图26免疫荧光数据证明使用上述西妥昔单抗缀合物处理HEP3B细胞会降解大部分膜EGFR，而残留的EGFR位于细胞内部。
图27蛋白质印迹数据显示了在仅存在曲妥珠单抗或与含有GalNAc的聚合物缀合的曲妥珠单抗的情况下HUH7和HEPG2细胞中HER2的降解程度。
具体实施方式
本发明提供了双官能分子，所述双官能分子包括：第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子；以及第二部分，所述第二部分特异性结合溶酶体靶向分子。所述双官能分子可用于例如经由胞内体/溶酶体途径靶向降解细胞表面分子和细胞外分子(例如，蛋白质)。本发明还提供了包括所述双官能分子的组合物和试剂盒，以及使用所述双官能分子的方法。本发明还提供了制备双官能分子的方法。
在更详细地描述本公开的双官能分子、组合物、试剂盒和方法之前，应理解双官能分子、组合物、试剂盒和方法不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以有所不同。还应理解，本文中所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而非旨在进行限制，因为所述双官能分子、组合物、试剂盒和方法的范围将仅受所附权利要求书的限制。
在提供值的范围的情况下，应理解除非上下文另有明确规定，在该范围的上限和下限与在所述范围内的任何其他规定的或中间的值之间至下限单位的十分之一的每个中间值被涵盖在所述双官能分子、组合物、试剂盒和方法内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在较小范围内，并且也被涵盖在所述双官能分子、组合物、试剂盒和方法内，受所述范围内的任何具体排除的限制。当所述范围包括一个或两个限度时，不包括这些所包括的一个或两个限度的范围也被包括在所述双官能分子、组合物、试剂盒和方法中。
本文给出的某些范围的数值前面有术语“约”。术语“约”在本文中用于提供对其之前的确切数字以及接近或近似该术语之前的数字的文字支持。在确定一个数字是否接近或近似一个具体列举的数字时，接近或近似的未列举的数字可以是在其出现的上下文中提供该具体列举的数字的实质等同物的数字。
除非另外定义，否则本文中所使用的所有技术和科学术语均具有与所述双官能分子、组合物、试剂盒和方法所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何双官能分子、组合物、试剂盒和方法也可用于所述双官能分子、组合物、试剂盒和方法的实践或测试，但现在描述具有代表性的说明性双官能分子、组合物、试剂盒和方法。
在本说明书中引用的所有公开和专利通过引用并入本文，如同每个单独的公开或专利被具体和单独地指示通过引用并入并且通过引用并入本文以公开和描述与所引用的公开有关的材料和/或方法。任何出版物的引用均为其在申请日之前的公开，并且不应被解释为承认本发明的双官能分子、组合物、试剂盒和方法无权先于此类出版物，因为所提供的出版日期可能与可能需要独立确认的实际出版日期不同。
注意，如本文和所附权利要求书中所使用的，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。还应当注意，权利要求书可以被起草为排除任何任选的元素。因此，所述陈述旨在用作前置基础，用于结合权利要求要素的叙述使用诸如“单独地”、“仅”等排他性术语或使用“负面”限制。
应当理解，为了清楚起见，在单独的实施方案的上下文中描述的双官能分子、组合物、试剂盒和方法的某些特征也可以以组合形式提供在单个实施方案中。相反，为了简洁起见，在单个实施方案的上下文中描述的双官能分子、组合物、试剂盒和方法的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供。实施方案的所有组合都具体地涵盖在本公开中，并且在本文中公开，就好像每一个组合都是单独地和明确地公开一样，达到此类组合涵盖可操作的过程和/或组合物的程度。另外，描述这种变量的实施方案中列出的所有子组合也由本发明的双官能分子、组合物、试剂盒和方法具体包括，并且在本文中公开，就好像每一个这种子组合在本文中单独和明确地公开。
对于本领域的技术人员来说，在阅读本公开内容后将显而易见的是，本文描述和图示的单独实施方案中的每一个具有分立的组件和特征，在不脱离本方法的范围或精神的情况下，这些组件和特征可以容易地与任何其它几个实施方案的特征分离或组合。任何所述的方法可以以所述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序执行。
双官能分子
本公开提供了双官能分子，所述双官能分子包括：第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子；以及第二部分，所述第二部分特异性结合溶酶体靶向分子。现在将描述双官能分子的某些非限制性实施方案。
如上所述，本公开的双官能分子包括第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子。在一些实施方案中，第一部分特异性结合细胞表面分子。“细胞表面分子”是指与细胞膜相关联的分子，例如，因为该分子具有插入或跨越细胞膜的结构域，例如，细胞膜束缚结构域或跨膜结构域。细胞表面分子可以是经由胞内体/溶酶体途径进行靶向降解所需的任何细胞表面分子。在一些实施方案中，细胞表面分子是细胞表面受体。目标细胞表面受体包括但不限于干细胞受体、免疫细胞受体、生长因子受体、细胞因子受体、激素受体、受体酪氨酸激酶、表皮生长因子受体(EGFR)家族中的受体(例如，HER2(人表皮生长因子受体2)等)、成纤维细胞生长因子受体(FGFR)家族中的受体、血管内皮生长因子受体(VEGFR)家族中的受体、血小板衍生的生长因子受体中的受体(PDGFR)家族中的受体、转染过程中重排(RET)受体家族中的受体、Eph受体家族中的受体、盘状结构域受体(DDR)家族中的受体以及粘蛋白(例如，MUC1)。在一些实施方案中，细胞表面分子是CD71(转铁蛋白受体)。在某些方面，细胞表面受体是选自以下中的免疫细胞受体：T细胞受体、B细胞受体、自然杀伤(NK)细胞受体、巨噬细胞受体、单核细胞受体、嗜中性粒细胞受体、树突细胞受体、肥大细胞受体、嗜碱性粒细胞受体和嗜酸性粒细胞受体。
在一些实施方案中，第一部分特异性结合细胞表面分子，该细胞表面分子不是通过特定的分子相互作用(因此对阻断不敏感)而是通过整体生物物理或聚集效应来介导其作用。这种细胞表面分子的非限制性实例是粘蛋白。粘蛋白的实例包括但不限于MUC1、MUC16、MUC2、MUC5AC、MUC4、CD43、CD45、GPIb等。
在一些实施方案中，当第一部分特异性结合细胞表面分子时，细胞表面分子存在于癌细胞上。“癌细胞”是指表现出赘生性细胞表型的细胞，其特征可以是一种或多种，例如，异常细胞生长、异常细胞增殖、密度依赖性生长抑制的丧失、非贴壁依赖性生长潜能、在免疫受损的非人动物模型中促进肿瘤生长和/或发育的能力，和/或任何合适的细胞转化指标。“癌细胞(cancer cell)”在本文中可以与“肿瘤细胞”、“恶性细胞”或“癌细胞(cancerous cell)”互换使用，并且涵盖实体瘤、半实体瘤、恶性血液肿瘤(例如，白血病细胞、淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞等)、原发性肿瘤、转移性肿瘤等的癌细胞。在一些实施方案中，存在于癌细胞上的细胞表面分子是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
在某些方面，当第一部分特异性结合细胞表面分子时，细胞表面分子存在于免疫细胞上。在一些实施方案中，存在于免疫细胞上的细胞表面分子选自以下：T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。在某些方面，存在于免疫细胞上的细胞表面分子是抑制性免疫受体。如本文中所使用的，“抑制性免疫受体”是存在于免疫细胞上的受体，其负调节免疫应答。可以根据本公开的方法抑制的抑制性免疫受体的实例包含Ig超家族的抑制性免疫受体，包括但不限于：CD200R、CD300a(IRp60；小鼠MAIR-I)、CD300f(IREM-1)、CEACAM1(CD66a)、FcγRIIb、ILT-2(LIR-1；LILRB1；CD85j)、ILT-3(LIR-5；CD85k；LILRB4)、ILT-4(LIR-2；LILRB2)、ILT-5(LIR)-3；LILRB3；小鼠PIR-B)；LAIR-1、PECAM-1(CD31)、PILR-α(FDF03)、SIRL-1和SIRP-α。可以根据本公开的方法抑制的抑制性免疫受体的其他实例包括唾液酸结合性Ig样凝集素(Siglec)受体，例如，Siglec 7、Siglec 9等。可以根据本公开的方法抑制的抑制性免疫受体的额外实例包括C型凝集素，包括但不限于：CLEC4A(DCIR)、Ly49Q和MICL。关于抑制性免疫受体的细节可以在例如Steevels等人(2011年)《欧洲免疫学期刊(Eur.J.Immunol.)》41(3):575-587中找到。在一些实施方案中，存在于免疫细胞上的细胞表面分子是抑制性免疫受体的配体。在某些方面，存在于免疫细胞上的细胞表面分子是免疫检查点分子。第一部分可特异性结合的免疫检查点分子的非限制性实例包括PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、TIGIT和B7族的成员。
如上所述，本公开的双官能分子包括第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子。在一些实施方案中，第一部分特异性结合细胞外分子。“细胞外分子”是指在可溶性分子附近的任何细胞的细胞膜外部的可溶性分子。细胞外分子可以是经由胞内体/溶酶体途径靶向降解所需的任何细胞外分子。在一些实施方案中，细胞外分子是细胞表面受体的配体。目标细胞表面受体配体包括但不限于生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等)、细胞因子(例如，白介素、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子β(TGF-β)，包括此类细胞因子的任何特定亚型)、激素等。在某些方面，第一部分特异性结合载脂蛋白E4(ApoE4)。
在一些实施方案中，第一部分特异性结合细胞外分子，其中细胞外分子是抗体，例如，特异性结合细胞表面分子或不同的细胞外分子的抗体。在一些实施方案中，抗体是自身抗体。自身抗体的非限制性实例包括类风湿因子(RF)、抗核抗体(ANA)、抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、抗双链DNA(抗dsDNA)、抗着丝粒抗体(ACA)、抗组蛋白抗体、环状瓜氨酸肽抗体(CCP)、可提取的核抗原抗体(例如，抗SS-A(Ro)和抗SS-B(La)、抗RNP、抗Jo-1、抗Sm、Scl-70)、心磷脂抗体、β-2糖蛋白1抗体、抗磷脂抗体(APA)、狼疮抗凝剂(LA)、糖尿病相关自身抗体、抗组织转谷氨酰胺酶(抗tTG)、抗麦胶蛋白抗体(AGA)、内在因子抗体、壁细胞抗体、甲状腺自身抗体(例如，抗TPO、TSH受体抗体)、平滑肌抗体(SMA)、抗线粒体抗体(AMA)、肝肾微粒体1型抗体(抗LKM-1)、抗肾小球基底膜(GBM)、乙酰胆碱受体(AChR)抗体等。
在一些实施方案中，第一部分特异性结合细胞外分子，其中细胞外分子是在疾病中积累的分泌蛋白(例如，α-突触核蛋白)、胆固醇载体(例如，ApoB)、传染病毒素(例如，AB毒素、ESAT-6)、感染性颗粒(例如，完整病毒、完整细菌等)、凝血因子(例如，因子IX)、任何FDA批准的与细胞外分子结合的抗体的靶标(例如，TNFα)、任何趋化因子或细胞因子(例如，败血症或慢性炎症的介质，诸如IL-1)、蛋白质激素(例如，胰岛素、ACTH等)、情绪障碍的蛋白质介质、能量稳态的蛋白质介质(例如，瘦素、饥饿素等)、血液中存在的蛋白质过敏原或针对此类过敏原的抗体(例如，针对花生过敏)、蛋白质毒素(例如，蛇毒透明质酸酶等)等。
在某些实施方案中，第一部分特异性结合细胞表面或细胞外分子，其中细胞表面或细胞外分子是突变蛋白质。在一些实施方案中，双官能分子引起突变蛋白质穿梭到溶酶体中，促进其加载到主要组织相容性复合体(MHC)(例如，MHC I或MHC II)上，从而促进免疫系统识别突变蛋白质。在这种情况下，双官能分子可用于产生对突变的和不需要的蛋白质(例如，KIT)具有特异性的抗体。
“特异性结合”是指第一部分和第二部分以例如大于或等于约105M-1的亲和力或Ka(即，与1/M单位的特定结合相互作用的平衡结合常数)结合至它们相应的靶标。在某些实施方案中，第一部分和第二部分以大于或等于约106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka结合至它们相应的靶标。“高亲和力”结合是指以至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更大的Ka进行结合。替代地，亲和力可以定义为以M单位(例如，10-5M至10-13M，或更小)进行的特定结合相互作用的平衡解离常数(KD)。根据某些方面，特异性结合是指第一部分和第二部分以小于或等于约10- 5M、以小于或等于约10-6M、以小于或等于约10-7M、以小于或等于约10-8M、或者以小于或等于约10-9M、10-10M、10-11M或10-12M或更小的KD结合至它们相应的靶标。第一部分和第二部分与它们相应的靶标的结合亲和力可以使用常规技术容易地确定，例如，通过竞争性ELISA(酶联免疫吸附测定法)、平衡透析，通过使用表面等离子体共振(SPR)技术(例如，BIAcore2000仪器，使用制造商概述的一般程序)；通过放射免疫测定法等。
第一部分可以是能够结合细胞表面分子或细胞外分子以经由胞内体/溶酶体途径靶向降解的任何类型的部分。在某些方面，第一部分选自多肽、配体(例如，细胞表面受体的配体，其中细胞表面受体靶向降解)、适体、纳米颗粒和小分子。第二部分可以是能够结合溶酶体靶向分子的任何类型的部分。在某些方面，第二部分选自多肽、配体(例如，溶酶体靶向分子的配体)、适体、纳米颗粒和小分子。
在一些实施方案中，当双官能分子的部分是多肽时，该部分是抗体。术语“抗体”和“免疫球蛋白”包括任何同种型的抗体或免疫球蛋白(例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)、IgE、IgD、IgA、IgM等)、完整抗体(例如，由四聚体构成的抗体，所述四聚体又由重链和轻链多肽的两个二聚体构成)；单链抗体；保持与细胞表面分子或细胞外分子(在第一部分的情况下)或溶酶体靶向分子(在第二部分的情况下)特异性结合的抗体片段(例如，全链或单链抗体片段)，所述抗体片段包括但不限于Fv、单链Fv(scFv)、Fab、F(ab')2、Fab'、(scFv')2、双抗体和纳米抗体；嵌合抗体；单克隆抗体；完整人抗体；人源化抗体(例如，人源化完整抗体、人源化抗体片段等)；以及融合蛋白，所述融合蛋白包括抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白或其片段。可以用例如体内显像剂等将抗体可检测地标记。抗体可以进一步缀合至其它部分，诸如，如聚乙二醇(PEG)等。融合至抗体Fc区(或其片段)、缀合至PEG等可用于例如在向受试者给药时增加抗体的血清半衰期。
“小分子”是指分子量为1000原子质量单位(amu)或更小的化合物。在一些实施方案中，小分子为750amu或更低、500amu或更低、400amu或更低、300amu或更低、或者200amu或更低。在某些方面，小分子不是由重复的分子单元(诸如存在于聚合物中)制成的。
如上所述，第二部分特异性结合溶酶体靶向分子。如本文中所使用的，“溶酶体靶向分子”是细胞表面分子，其在被双官能分子的第二部分结合后，将双官能分子和由第一部分结合的细胞表面分子或细胞外分子穿梭至细胞内的溶酶体。在递送并内化到溶酶体中后，双官能分子和细胞表面分子或细胞外分子被溶酶体酶(例如酸水解酶)降解。通过这种方式，双官能分子靶向由第一部分结合的细胞表面分子或细胞外分子进行降解，这种靶向作用可用于各种体外和体内应用，包括研究和临床应用。
第二部分可以结合至任何合适的溶酶体靶向分子。溶酶体靶向分子的非限制性实例包括甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)、分拣蛋白(sortilin)、叶酸受体、ASPGR、IFITM3、胞内体/溶酶体途径中的分子(例如，LIMP-1、LIMP-2)等。
在一些实施方案中，第二部分结合的溶酶体靶向分子是甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)。M6PR存在于整个身体组织中，并且负责将甘露糖-6-磷酸酯(M6P)标记的货物(诸如酸水解酶)从高尔基体区室和细胞外空间运输至溶酶体。有关M6PR的详细情况可以在例如Gary-Bobo等人(2007年)《当今医药化学(Curr.Med.Chem.)》14:2945-2953、Das等人(2016年)ACS Macro Lett.5:809–813中以及其他地方找到。第二部分可以结合的M6PR的实例包括作为UniProtKB-P20645提供的阳离子依赖性人M6PR以及作为UniProtKB-P11717(也称为胰岛素样生长因子2受体(IGF2R))提供的非阳离子依赖性M6PR。非阳离子依赖性甘露糖-6-磷酸酯受体是一种多官能蛋白，其可在细胞表面与配体结合，诸如带有甘露糖-6-磷酸酯(M6P)的蛋白质、IGF-II、视黄酸、纤溶酶原等。其主要功能是将M6P-酶结合并转运至溶酶体，但它也可以调节各种细胞外M6P-糖蛋白的活性，例如，潜伏的TGFβ前体、尿激酶型纤溶酶原激活子受体、颗粒酶B、生长因子、疱疹病毒等。
在某些方面，当溶酶体靶向分子是M6PR时，第二部分是特异性结合M6PR的抗体。抗M6PR抗体是可获得的，并且包括MOB-1772z重组抗人M6PR抗体(Creative Biolabs)、EPR6599、2G11、MEM-238、EPR6599和EPR7691抗M6PR抗体(Abcam)等。
在一些实施方案中，当溶酶体靶向分子是M6PR时，第二部分包括一个或多个M6PR配体。在某些方面，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)，其中，M6P具有以下结构：
Figure BDA0003147316680000101
替代地或者附加地，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物。“M6P类似物”是指这样的分子，该分子不是M6P但与M6PR的M6P识别位点结合。具有膦酸、羧酸、硫酸、磺酸或丙二酸基团的几种M6P类似物在人血清中显示出比M6P本身更高的亲和力和更强的稳定性。一些结构特征已显示出对于M6P与M6PR的结合很重要。例如，吡喃糖环2位处的羟基是轴向的，观察到与M6PR的强结合。负电荷与吡喃糖环之间的距离也在M6PR识别M6P中起作用。已经表明，合适的类似物：通常应与M6P同配以高效结合M6PR；单个负电荷足以允许与M6PR结合，而磷原子不是确保识别所必需的；并且存在两个负电荷(如M6P的丙二酸酯和膦酸酯同配类似物)有利于与M6PR结合。在一些实施方案中，当所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6PR类似物时，所述一个或多个M6PR类似物包括一个或多个膦酸酯M6P类似物(M6Pn)、丙二酸酯M6P类似物、羧酸酯M6P类似物、磺酸酯M6P类似物、丙烯酸酯M6P类似物等。在一些实施方案中，所述一个或多个M6PR类似物包括一个或多个具有以下结构的膦酸酯M6P类似物(M6Pn)(其中M+是任何抗衡阳离子或氢原子)：
Figure BDA0003147316680000111
在一些实施方案中，所述一个或多个M6PR类似物包括一个或多个具有以下结构之一的羧酸酯M6P类似物(其中M+是任何抗衡阳离子或氢原子)：
Figure BDA0003147316680000112
在一些实施方案中，所述一个或多个M6PR类似物包括一个或多个具有以下结构的丙二酸酯M6P类似物(其中M+是任何抗衡阳离子或氢原子)：
Figure BDA0003147316680000113
有关通过M6PR识别M6P和M6P类似物以及可用于本公开的双官能分子中的M6P类似物的详细情况可以在例如Gary-Bobo等人(2007年)《当今医药化学(Curr.Med.Chem.)》14:2945-2953；以及Jeanjean等人(2008年)《生物有机化学与医药化学通讯(Bioorg Med ChemLett.)》18(23):6240-3中找到，上述文献的公开内容出于所有目的通过引用整体并入本文。
在某些方面，当第二部分包括一个或多个M6PR配体时，第二部分包括1至1000个M6PR配体，诸如1至750个、1至500个、1至250个、1至100个、1至75个、1至50个、1至40个、1至30个、1至20个、1至10个(例如，1至6个)、或者1至5个M6PR配体。在一些实施方案中，当第二部分包括一个或多个M6PR配体时，第二部分包括10至50个、15至45个、20至40个、或者25至35个M6PR配体。在某些方面，当第二部分包括一个或多个M6PR配体时，第二部分包括5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、250个或更多个、500个或更多个、750个或更多个、或者1000个或更多个M6PR配体。
在一些实施方案中，当第二部分包括一个或多个M6PR配体时，第二部分包括陈列所述一个或多个M6PR配体(例如，用所述配体官能化)的聚合物支架。这种双官能分子及其使用的一个实例示意性地示于图1中。在该实例中，双官能分子包括作为第一部分的抗体。该抗体可以结合靶细胞外分子(如左图所示)或靶细胞表面分子(如右图所示)。该抗体与陈列M6P配体(图1中的每个配体表示为“6P”)的聚合物支架缀合。在通过细胞表面M6PR与所陈列的M6P配体结合后，M6PR将双官能分子(以及结合的靶标分子)穿梭至溶酶体进行降解。
当第二部分包括陈列所述一个或多个M6PR配体的聚合物支架时，聚合物支架可以是包括所述一个或多个M6PR配体的含糖聚合物。举例来说，该含糖聚合物可以是包括用一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种氨基酸(例如，天然和/或非天然氨基酸)的糖蛋白。当含糖聚合物是糖蛋白时，该糖蛋白可以是N-羧酸酐(NCA)衍生的糖蛋白。NCA单体的开环聚合(ROP)是一种经过充分研究的合成多肽和多肽杂交体的路径，这些多肽和多肽杂交体具有广泛有用的物理性质。在一些实施方案中，该聚合是金属催化的。用于大规模合成α-氨基酸-N-羧酸酐的合适的方法在例如Semple等人(2016年)《合成通讯(SyntheticCommunications)》47(1):53-61中有描述。
用于合成甘露糖-6-磷酸酯N-羧酸酐的示例方法示意性地示于图2中。用于合成甘露糖-6-膦酸酯N-羧酸酐的示例方法示意性地示于图3中。用于合成甘露糖-6-羧酸酯N-羧酸酐的示例方法示意性地示于图4中。用于合成甘露糖-6-丙烯酸酯N-羧酸酐的示例方法示意性地示于图5中。用于合成葡萄糖-6-膦酸酯N-羧酸酐的示例方法示意性地示于图6中。用于合成甘露糖-6-膦酸酯异硫氰酸酯的示例方法示意性地示于图7中。
在某些实施方案中，本公开的双官能分子包括第二部分，该第二部分特异性结合在肝脏细胞例如肝细胞(包括肝细胞癌(HCC)细胞)表面上表达的溶酶体靶向分子。第二部分可以结合的在肝脏细胞表面表达的溶酶体靶向分子的一个非限制性实例是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)——一种介导从血液中去除糖缀合物的肝受体。该受体包括两种蛋白质，脱唾液酸糖蛋白受体1和2(ASGR1(UniProtKB-P07306-人类)和ASGR2(UniProtKB-P07307-人类))，其由基因ASGR1和ASGR2编码。ASGPR结合脱唾液酸糖蛋白，这是去除唾液酸以暴露半乳糖和半乳糖胺残基的糖蛋白。位于肝脏细胞上的受体从循环中去除目标糖蛋白。ASGPR在肝细胞、几种人类癌细胞系和肝癌的表面高度表达。
当溶酶体靶向分子是ASGPR时，合适的第二部分包括但不限于抗ASGPR抗体、ASGPR配体等。根据一些实施方案，这种第二部分包括一个或多个ASGPR配体。合适的ASGPR配体包括但不限于一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、一个或多个半乳糖、一个或多个葡萄糖以及它们的任何组合。在某些实施方案中，这种第二部分包括1至1000个ASGPR配体，诸如1至750个、1至500个、1至250个、1至100个、1至75个、1至50个、1至40个、1至30个、1至20个、1至10个(例如，1至6个)、或者1至5个ASGPR配体。在一些实施方案中，当第二部分包括一个或多个ASGPR配体时，该第二部分包括10至50个、15至45个、20至40个、或者25至35个ASGPR配体。在某些实施方案中，当第二部分包括一个或多个ASGPR配体时，该第二部分包括3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、40个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、250个或更多个、500个或更多个、750个或更多个、或者1000个或更多个ASGPR配体。
根据一些实施方案，当溶酶体靶向分子是ASGPR并且第二部分包括一个或多个ASGPR配体时，该第二部分包括含有一个或多个ASGPR配体的支架。在一个非限制性实例中，第二部分包括含有GalNAc的聚合物。在某些实施方案中，这种第二部分包括聚(GalNAc-co-Ala)，其结构在下文和图20中提供。
Figure BDA0003147316680000131
在某些实施方案中，当溶酶体靶向分子是ASGPR并且第二部分包括一个或多个ASGPR配体时，第二部分包括树状聚合物支架，该树状聚合物支架包括1个(单价)、2个(二价)、3个(三价)或4个或者更多个ASGPR配体，例如，独立地选自GalNAc、半乳糖和葡萄糖的ASGPR配体。例如，根据一些实施方案，第二部分包括一价、二价或三价的含有GalNAc的树状聚合物支架。可以采用的三价的含有GalNAc的树状聚合物支架的非限制性实例如下(在本文中指定为Tri-GalNAc树状聚合物)：
Figure BDA0003147316680000141
根据一些实施方案，第二部分包括一价、二价或三价的含有半乳糖的树状聚合物支架。可以采用的三价的含有半乳糖的树状聚合物支架的非限制性实例如下(在本文中指定为Tri-Gal树状聚合物)：
Figure BDA0003147316680000142
根据一些实施方案，当第二部分特异性结合在肝脏细胞表面表达的溶酶体靶向分子(例如ASGPR)时，第一部分特异性结合至在肝细胞(包括肝细胞癌(HCC)细胞)上表达的细胞表面分子。此类细胞表面分子的非限制性实例包括生长因子受体。目标生长因子受体包括但不限于表皮生长因子受体(EGFR)、C-Met、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)、HER2和血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)。
在某些实施方案中，双官能分子可用于降解肝细胞癌(HCC)细胞表面上的生长因子(例如，在体内对患有HCC的个体给药以治疗HCC时)，其中双官能分子包括：第一部分，该第一部分特异性结合至EGFR、C-Met、IGF1R、FGFR4或HER2；以及第二部分，该第二部分特异性结合至ASGPR(例如，第二部分可以包括含有ASGPR配体(例如，GalNAc、半乳糖和/或葡萄糖)的支架(例如，聚合物支架))。
根据一些实施方案，双官能分子可用于降解在纤维化肝脏细胞上表达的细胞表面分子(例如，生长因子)(例如，在体内对患有肝脏纤维化的个体给药后)，其中双官能分子包括：第一部分，该第一部分特异性结合促进纤维化的细胞表面或细胞外蛋白(例如，PDGFR)；以及第二部分，该第二部分特异性结合至ASGPR(例如，第二部分可以包括含有一个或多个ASGPR配体(例如，GalNAc、半乳糖和/或葡萄糖)的支架(例如，聚合物支架))。
在某些实施方案中，相对于在存在仅第一部分的情况下细胞表面分子或细胞外分子的降解，双官能分子增进细胞表面分子或细胞外分子的降解。根据一些实施方案，相对于在存在仅第一部分或第二部分的情况下细胞表面分子或细胞外分子的降解，双官能分子增进细胞表面分子或细胞外分子的降解。在本文中，“增进降解”是指细胞表面分子或细胞外分子在存在双官能分子的情况下降解，并且在相同的条件下，在存在仅第一部分或者存在仅第一部分或第二部分的情况下不降解；或者细胞表面分子或细胞外分子在存在双官能分子的情况下降解的程度大于细胞表面分子或细胞外分子在相同的条件下在存在仅第一部分或存在仅第一部分或第二部分的情况下降解的程度。当细胞表面分子或细胞外分子在存在双官能分子的情况下降解的程度大于细胞表面分子或细胞外分子在相同的条件下在存在仅第一部分或存在仅第一部分或第二部分的情况下降解的程度时，在存在双官能分子的情况下该降解可以是1.2倍或更高、1.4倍或更高、1.6倍或更高、1.8倍或更高、2倍或更高、2.5倍或更高、3倍或更高、3.5倍或更高、4倍或更高、4.5倍或更高、5倍或更高、5.5倍或更高、6倍或更高、6.5倍或更高、7倍或更高、7.5倍或更高、8倍或更高、8.5倍或更高、9倍或更高、9.5倍或更高、或者10倍或更高。
在以下实验部分的实例4中提供了一个非限制性实例，其中本公开的双官能分子相对于在存在仅第一部分的情况下细胞表面分子的降解增进了细胞表面分子的降解。实例5中提供了双官能分子相对于在存在仅第一部分的情况下细胞表面分子的降解不增进细胞表面分子的降解的实例。
本领域普通技术人员可以容易地确定，相对于细胞表面分子或细胞外分子在存在仅第一部分或存在仅第一部分或第二部分的情况下的降解，目标双官能分子是否增进了细胞表面分子或细胞外分子的降解。在下面的实验部分中提供了用于容易地进行这种确定的合适的方法的非限制性实例。
本公开的双官能分子可以是任何合适的形式。在一些实施方案中，第一部分是多肽，第二部分是多肽，并且双官能分子是包括与第二部分融合的第一部分的融合蛋白。第一部分可以与第二部分直接融合。在其他方面，第一部分可以与第二部分间接融合，例如，在第一部分与第二部分之间设置间隔结构域的情况下。本公开还提供了当双官能分子是融合蛋白时编码双官能分子的核酸。还提供了包括此类核酸的表达介体，以及包括本公开的任何核酸和/或表达介体的细胞(例如，宿主细胞)。还提供了产生此类细胞的方法，所述方法包括将本公开的任何核酸和/或表达介体引入细胞中，例如，使用合适的细胞转染方案和转染试剂。本公开还提供了当双官能分子是融合蛋白时制备双官能分子的方法。此类方法可以包括在双官能分子在细胞中表达的条件下培养本公开的细胞。
本公开的双官能分子的其他合适形式包括缀合物。因此，在一些实施方案中，本公开的双官能分子包括与第二部分缀合的第一部分。在某些方面，第一部分是抗体并且第二部分特异性结合M6PR。举例来说，第一部分可以是抗体并且第二部分可以包括聚合物支架，该聚合物支架包括/陈列一个或多个M6PR配体，例如，一个或多个M6P和/或M6P类似物，其中聚合物支架缀合至抗体。在一些这样的实施方案中，第二部分是包括用一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种氨基酸的糖蛋白。还提供了制备此类缀合物的方法，所述方法包括将第一部分缀合至第二部分。在图12中示意性地示出了这种方法的非限制性实例，其中第一部分是抗体并且第二部分是如本文所述的含糖聚合物。在一些实施方案中，所述方法包括将第一部分位点特异性缀合至第二部分。例如，当第一部分包括多肽(例如，抗体)时，该缀合可以包括将第二部分位点特异性缀合至第一部分的预先选择的氨基酸。在某些方面，所述预先选择的氨基酸位于第一部分的N端或C端。在其他方面，所述预先选择的氨基酸在第一部分的内部——即，在第一部分的N端和C端氨基酸之间。在一些实施方案中，所述预先选择的氨基酸是非天然氨基酸。可以提供给第一部分和/或第二部分以促进缀合的非天然氨基酸的非限制性实例包括具有选自以下中的官能团的那些：叠氮化物、炔烃、烯烃、氨基-氧基、肼、醛(例如，甲酰甘氨酸，例如，来自康泰伦特药业(Catalent Pharma Solutions)的SMARTagTM技术)、硝酮、氧化腈、环丙烯、降冰片烯、异氰化物、芳基卤化物和硼酸官能团。可以掺入和选择以提供目标官能团的非天然氨基酸是已知的并且描述于例如Maza等人(2015年)《生物共轭化学(Bioconjug.Chem.)》26(9):1884-9、Patterson等人(2014年)《ACS化学生物学(ACS Chem.Biol.)》9:592-605、Adumeau等人(2016年)《分子成像和生物学(Mol.Imaging Biol.)》(2):153-65中以及其他地方。
在一些实施方案中，将第一部分缀合至第二部分包括将第二部分缀合至第一部分上的聚糖，或反之亦然。这种方法可以包括修饰第一部分上的一个或多个聚糖以提供第二部分可以附接的官能团。在一个非限制性实例中，第一部分(例如，抗体)上的N-聚糖可以经由高碘酸盐氧化成醛基进行修饰，然后可以用第二部分(例如，氨氧基M6Pn)官能化。
当双官能分子是缀合物时，可以采用一个或多个接头来促进第一部分与第二部分的缀合。此类接头的非限制性实例包括酯接头、酰胺接头、马来酰亚胺或马来酰亚胺基接头；缬氨酸-瓜氨酸接头；腙接头；N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPDB)接头；琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸酯(SMCC)接头；乙烯基砜基接头；包括聚乙二醇(PEG)的接头，诸如但不限于四甘醇；包括丙酸的接头；包括癸烯酸的接头，以及包括它们的任何组合的接头。在某些方面，该接头是化学不稳定接头，诸如在中性pH(血流pH 7.3-7.5)下稳定但在内化到弱酸性胞内体(pH 5.0-6.5)以及靶细胞(例如，癌细胞)的溶酶体(pH 4.5-5.0)中时发生水解的酸可裂解接头。化学不稳定接头包括但不限于腙基接头、肟基接头、碳酸酯基接头、酯基接头等。根据某些实施方案，该接头是酶不稳定接头，诸如这样一种酶不稳定接头，其在血流中是稳定的，但在内化到靶细胞中时进行酶切(例如，通过靶细胞(例如，癌细胞)的溶酶体中的溶酶体蛋白酶(诸如组织蛋白酶或纤溶酶))。酶不稳定接头包括但不限于包括肽键的接头，例如，二肽基接头，诸如缬氨酸-瓜氨酸接头，诸如马来酰亚胺己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄基(MC-vc-PAB)接头、缬氨酰-丙氨酰基-对氨基苄氧基(Val-Ala-PAB)接头等。化学不稳定接头、酶不稳定的和不可切割的接头是已知的并且详细描述于例如Ducry&Stump(2010年)《生物共轭化学(BioconjugateChem.)》21:5-13中。
许多策略可用于通过接头缀合第一部分和第二部分。例如，可以通过将接头共价附接至第一部分来衍生第一部分，其中接头具有能够与第二部分上的“化学柄”反应的官能团。又例如，第二部分可以通过将接头共价附接至第二部分而衍生，其中接头具有能够与第一部分上的“化学柄”反应的官能团。接头上的官能团可以变化，并且可以基于与第一部分或第二部分上的化学柄的相容性来选择。根据一个实施方案，通过将具有化学柄的非天然氨基酸掺入第一部分或第二部分中来提供化学柄。在一些实施方案中，缀合第一部分和第二部分通过炔烃叠氮化物环加成来实现。
本公开的双官能分子的其他合适形式包括双特异性抗体。例如，本公开的双官能分子可以是双特异性抗体，其中第一部分(例如，第一Fab臂)特异性结合细胞表面分子或细胞外分子，并且第二部分(例如，第二Fab臂)特异性结合溶酶体靶向分子(例如，M6PR)。图19中提供了这种双特异性抗体的示意图。在一些实施方案中，双特异性抗体在胞内体的降低的pH下与靶标脱离。这种策略允许给定的双特异性抗体与受体一起循环，并不断地将货物和靶标递送至溶酶体，而不会降解抗体。用于制备双特异性抗体的方法是已知的。例如，当双官能分子是双特异性抗体时，可以使用“旋钮入孔”(KIH)方法制备双特异性抗体。KIH技术涉及工程改造CH3结构域以在每条重链中创建“旋钮”或“孔”以促进异源二聚化。KIH的设计和生产策略是已知的并且包括描述于例如以下中的那些：Xu等人(2015年)MAbs 7(1):231-42；Carter等人(2001年)《免疫学方法期刊(J.Immunol.Methods)》248(1-2):7-15；Ridgway等人(1996年)《蛋白质工程(Protein Eng.)》9(7):617-2；以及Merchant等人(1998年)《自然生物技术(Nat.Biotechnol.)》16(7):677-81。
组合物
如上所述，本公开提供了组合物。所述组合物可以包括本公开的任何双官能分子，包括在以上双官能分子部分中描述的任何双官能分子，为了简洁起见，将其并入本文但不重申。
在某些方面，所述组合物包括存在于液体介质中的本公开的双官能分子。液体介质可以是水性液体介质，诸如水、缓冲溶液等。一种或多种添加剂诸如盐(例如，NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4)、缓冲剂(Tris缓冲剂、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-(2-乙磺酸)(HEPES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、2-(N-吗啉代)乙磺酸钠盐(MES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-三[羟甲基]甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)等)、蛋白酶抑制剂、甘油等可以存在于此类组合物中。
还提供了药物组合物。所述药物组合物包括本公开的任何双官能分子和药学上可接受的载体。所述药物组合物通常包括治疗有效量的双官能分子。“治疗有效量”是指足以产生期望的结果的剂量，例如，足以产生有益的或期望的治疗(包括预防性)结果的量，诸如患有与双官能分子的第一部分特异性结合的细胞表面分子或细胞外分子相关联的细胞增殖性病症(例如，癌症)的个体中的细胞增殖减少等。有效量可以在一次或多次给药中给药。
本公开的双官能分子可以掺入各种用于治疗性给药的制剂中。更特别地，该双官能分子可以通过与适当的药学上可接受的赋形剂或稀释剂组合配制成药物组合物，并且可以配制成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，诸如片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、软膏、溶液剂、注射剂、吸入剂和喷雾剂。
适于对个体给药(例如，适于人给药)的本公开的双官能分子的制剂通常是无菌的，并且还可以不含可检测的致热原或根据所选择的给药路径对个体给药禁忌的其它污染物。
在药物剂型中，该双官能分子可以单独给药或适当联合给药，以及与其它药物活性化合物联合给药。以下方法和赋形剂仅仅是实例，而绝不是限制性的。
对于口服制剂，双官能分子可以单独使用或与适当的添加剂组合使用以制备片剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂，例如，使用常规添加剂，诸如乳糖、甘露醇、玉米淀粉或马铃薯淀粉；使用粘合剂，诸如结晶纤维素、纤维素衍生物、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；使用崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉或羧甲基纤维素钠；使用润滑剂，诸如滑石粉或硬脂酸镁；并且如果需要，使用稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂和调味剂。
可以将双官能分子配制成制剂，通过将所述制剂溶解、悬浮或乳化在水性或非水性溶剂(诸如植物油或其它类似油、合成脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇)中进行注射；并且如果需要，可以使用常规添加剂，诸如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。
药物组合物可以是液体形式、冻干形式或由冻干形式重构的液体形式，其中冻干制剂在给药前用无菌溶液重构。用于重构冻干组合物的标准方法是加回一定体积的纯水(通常等于冻干期间去除的体积)；然而，包括抗菌剂的溶液可用于生产用于肠胃外给药的药物组合物。
双官能分子的水性制剂可以在pH缓冲溶液中制备，例如，在约4.0至约8.0、诸如约4.5至约7.5、例如约5.0至约7.0的pH范围内。适于此范围内的pH的缓冲剂的实例包括磷酸盐缓冲剂、组氨酸缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和其它有机酸缓冲剂。缓冲剂浓度可以是约1mM至约100mM、或约5mM至约50mM，这取决于例如缓冲剂和所需的制剂张力。
使用方法
如上所述，还提供了使用本公开的双官能分子的方法。在一些实施方案中，所述方法包括使用以上双官能分子部分中描述的任何双官能分子，为了简洁起见，将其并入本文但不重申。
在某些方面，提供了降解细胞表面分子或细胞外分子的方法。此类方法包括在溶酶体靶向分子将细胞表面分子或细胞外分子穿梭至溶酶体以进行降解的条件下，使细胞表面分子或细胞外分子与本公开的任何双官能分子接触。此类方法可用于各种应用。在某些方面，该方法在体外进行(例如，在试管、细胞培养板或孔等中)并且可用于例如测试和/或研究应用。在其他方面，该方法在体内进行(例如，在给药双官能分子的个体中)并且可用于例如临床/治疗应用。
在一些实施方案中，提供的方法包括对有需要的个体给药治疗有效量的本公开的任何双官能分子或任何药物组合物。根据受试者的治疗方法，可以治疗各种的个体。通常这样的受试者是“哺乳动物”或“哺乳动物的”，其中这些术语广泛用于描述哺乳动物纲内的生物体，包括食肉目(例如，狗和猫)，啮齿类(例如，小鼠、豚鼠和大鼠)和灵长类(例如，人、黑猩猩和猴)。在一些实施方案中，个体是人。
在一些实施方案中，双官能分子(或包括该双官能分子的药物组合物)的有效量是这样的量，与没有用双官能分子或药物组合物治疗的个体中的症状相比，当单独(例如，在单一疗法中)或与一种或多种另外的治疗剂组合(例如，在组合疗法中)以一个或多个剂量给药时，该量有效地将个体的医学病状(例如，癌症、神经退行性疾病)的症状降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多。
在某些方面，个体患有或疑似患有神经退行性疾病，其特征在于大脑中的淀粉样蛋白β沉积(例如，阿尔茨海默病)或大脑中的tau蛋白沉积(例如，tau蛋白病)，并且双官能分子的第一部分特异性结合至apoE4(例如，从APOE4基因的ε4等位基因表达的apoE4)，使得apoE4的靶向降解可治疗个体的神经退行性疾病。
在一些实施方案中，提供的方法包括对患有癌症的个体给药治疗有效量的本公开的任何双官能分子或任何药物组合物。根据此类方法，双官能分子的第一部分特异性结合至少导致个体癌症的细胞表面分子或细胞外分子，并且其中，使用双官能分子靶向降解细胞表面分子或细胞外分子可治疗个体的癌症。在某些方面，第一部分特异性结合至选自以下中的分子：癌细胞上的细胞表面分子、癌细胞上的细胞表面分子的配体、免疫细胞上的细胞表面分子、免疫细胞上的细胞表面分子的配体、抑制性免疫受体以及抑制性免疫受体的配体。
在某些实施方案中，个体患有以存在实体瘤、半实体瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤等为特征的癌症。在一些实施方案中，个体患有选自以下中的癌症：乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、结直肠癌、前列腺癌、神经胶质瘤、膀胱癌、子宫内膜癌、肾癌、白血病(例如，急性髓性白血病(AML))、肝癌(例如，肝细胞癌(HCC)，诸如原发性或复发性HCC)、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、甲状腺癌、它们的任何组合以及它们的任何亚型。
根据一些实施方案，个体患有特定的肝病(包括但不限于肝细胞癌(HCC))，并且所述方法用于治疗该疾病。例如，在某些实施方案中，个体患有HCC，第一部分结合个体的HCC细胞上的细胞表面分子，并且第二部分结合ASGPR。在某些实施方案中，第一部分结合个体的HCC细胞上的肿瘤促进蛋白。根据一些实施方案，肿瘤促进蛋白是HCC细胞上的生长因子。此类生长因子的非限制性实例包括EGFR、C-Met、IGF1R和FGFR4。这种双官能分子可以包括如本文其他地方描述的结合ASGPR的任何第二部分。
在某些实施方案中，个体患有肝纤维化，并且所述方法用于治疗肝纤维化。例如，根据一些实施方案，个体患有肝纤维化，第一部分结合个体的纤维化肝脏细胞上的细胞表面分子，并且第二部分结合ASGPR。在某些实施方案中，第一部分结合个体的纤维化肝脏细胞上的纤维化促进蛋白。根据一些实施方案，纤维化促进蛋白是纤维化肝脏细胞上的生长因子。这种生长因子的一个非限制性实例是PDGFR。这种双官能分子可以包括如本文其他地方描述的结合ASGPR的任何第二部分。
在任何使用本公开的双官能分子的方法中，在某些实施方案中，相对于在存在仅第一部分的情况下细胞表面分子或细胞外分子的降解，双官能分子增进细胞表面分子或细胞外分子的降解。类似地，在任何使用本公开的双官能分子的方法中，根据一些实施方案，相对于在存在仅第一部分或第二部分的情况下细胞表面分子或细胞外分子的降解，双官能分子增进细胞表面分子或细胞外分子的降解。关于这种降解增进的详细情况在上面的双官能分子部分中提供并且为了简洁起见并入本文中但不重申。
“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指至少改善与个体的医学病状(例如，细胞增殖性疾病，例如，癌症)相关联的症状，其中改善在广义上用于指至少降低与所治疗的医学病状相关联的参数，例如症状的大小。因此，治疗还包括医学病状或至少与其相关联的症状被完全抑制(例如，防止发生)或停止(例如，终止)的状况，使得个体不再患有该医学病状，或至少不再患有表征该医学病状的症状。
在某些方面，本公开提供了增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，包括对需要ADCC的个体给药本公开的双官能分子或药物组合物。在一些实施方案中，双官能分子的第一部分特异性结合至抑制性免疫受体或抑制性免疫受体的配体。在某些方面，双官能分子的第一部分特异性结合至免疫检查点分子，诸如PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、TIGIT或B7族的成员。
双官能分子或药物组合物可以使用适于药物递送的任何可用方法和路径给药于个体，包括体内和体外方法，以及全身和局部给药路径。常规和药学上可接受的给药路径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、局部应用、眼内、静脉内、动脉内、鼻、口服和其它肠内和肠胃外给药路径。在一些实施方案中，给药通过肠胃外给药进行。如果需要，可以组合给药路径，或根据双官能分子和/或所需效果调节给药路径。双官能分子或药物组合物可以以单个剂量或多个剂量给药。在一些实施方案中，双官能分子或药物组合物静脉内给药。在一些实施方案中，双官能分子或药物组合物通过注射给药，例如，用于全身递送(例如，静脉内输注)或给药至局部位点。
试剂盒
如上文所述，本公开还提供了试剂盒。在一些实施方案中，主题试剂盒包括本公开的任何双官能分子(包括在以上双官能分子部分中描述的任何双官能分子，为简洁起见将其并入本文但不重申)，以及说明书，所述说明书用于使用该双官能分子降解第一部分特异性结合的细胞表面分子或细胞外分子。在某些方面，说明书用于体外降解细胞表面分子或细胞外分子，例如用于研究和/或测试目的。在其他方面，说明书用于在体内降解细胞表面分子或细胞外分子，例如用于临床/治疗应用。例如，提供的试剂盒包括本公开的任何双官能分子或药物组合物，以及说明书，所述说明书用于对有需要的个体给药双官能分子或药物组合物。此类试剂盒可以包括以单位剂量(例如，安瓿)或多剂量形式存在的一定量的双官能分子或药物组合物。因此，在某些实施方案中，试剂盒可以包括一个或多个(例如，两个或更多个)单位剂量(例如，安瓿)的双官能分子或药物组合物。
如本文中所使用的，术语“单位剂量”是指适合作为用于人和动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位，每个单位含有按足以产生期望效果的量计算的预定量的组合物。单位剂量的量取决于各种因素，诸如在受试者中所采用的特定双官能分子、要实现的效果以及与双官能分子相关联的药效学。在其它实施方案中，试剂盒可以包括单一多剂量的量的双官能分子或药物组合物。
在其他方面，提供的试剂盒包括本公开的任何含糖聚合物(包括以上双官能分子部分中描述的任何含糖聚合物，为简洁起见，将其并入本文但不重申)，以及将含糖聚合物与目标分子缀合的说明书。此类试剂盒还可以包括用于将含糖聚合物与目标分子缀合的试剂。在一些实施方案中，目标分子是多肽。此类多肽的非限制性实例包括抗体。在某些方面，目标分子特异性结合细胞表面分子或细胞外分子，包括以上双官能分子部分中描述的任何细胞表面分子或细胞外分子，为简洁起见，将其并入本文但不重申。
试剂盒的组分可以存在于分开的容器中，或多种组分可以存在于单一容器中。
试剂盒中所包括在说明书可以记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以印刷在如纸或塑料等基材上。因此，说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒的容器或其组分的标签中(即与包装或次包装有关联)等。在其它实施方案中，说明书作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如，便携式闪存驱动器、DVD、CD-ROM、软盘等)上的电子存储数据文件存在。在其它实施方案中，试剂盒中不存在实际说明书，但是提供了用于从远程源(例如经由因特网)获得说明书的方式。该实施方案的一个实例是包括网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的方式被记录在合适的基材上。
含糖聚合物、单体及其制备方法
本公开还提供了含糖聚合物。在一些实施方案中，本公开的含糖聚合物包括聚合物支架和附接至聚合物支架的一个或多个甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)配体。含糖聚合物、聚合物支架和/或M6PR配体可以是以上双官能分子部分中描述的那些中的任何一种，为了简洁起见，将其并入本文但不重申。例如，含糖聚合物可以是包括用一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种氨基酸的糖蛋白。糖蛋白可以是N-羧酸酐(NCA)衍生的糖蛋白。在某些方面，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。替代地或附加地，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物，例如本文所述的任何M6P类似物，例如一个或多个甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。在一些实施方案中，聚合物支架包括1至50个M6PR配体，诸如1至40个、1至30个、1至20个、1至10个(例如，1至6个)、或者1至5个M6PR配体。在某些方面，聚合物支架包括10至50个、15至45个、20至40个、或者25至35个M6PR配体。在某些方面，聚合物支架包括5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、30个或更多个、或者40个或更多个M6PR配体。
还提供了制备本公开的含糖聚合物的方法。在一些实施方案中，制备含糖聚合物包括聚合。聚合可以通过NCA聚合进行，在图8中示意性地示出了其实例。
在某些方面，制备含糖聚合物的方法包括将所述一个或多个M6PR配体附接至聚合物支架。在其他方面，此类方法包括由用一个或多个M6PR配体官能化的单体合成聚合物支架。例如，支架可以由用一个或多个M6PR配体官能化的一个或多个单体合成，其中该合成通过固相合成来实现。图9中提供了示例固相合成方案。
在相关方面，本公开提供了单体。单体用一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6PR)配体官能化。在某些方面，单体是氨基酸。在一些实施方案中，单体是非天然氨基酸。所述一个或多个M6PR配体可以包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。替代地或附加地，所述一个或多个M6PR配体可以包括一个或多个M6P类似物，例如本文所述的任何M6P类似物，诸如甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。
尽管有所附权利要求，但本公开还由以下实施方案定义。
1.一种双官能分子，包括：
第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子；以及
第二部分，所述第二部分特异性结合溶酶体靶向分子。
2.如实施方案1所述的双官能分子，其中，相对于在仅存在所述第一部分的情况下所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解，所述双官能分子增进所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解。
3.如实施方案1或实施方案2所述的双官能分子，其中，所述第一部分特异性结合细胞表面分子。
4.如实施方案3所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是细胞表面受体。
5.如实施方案4所述的双官能分子，其中，所述细胞表面受体是生长因子受体。
6.如实施方案1至5中任一项所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子存在于癌细胞上。
7.如实施方案6所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
8.如实施方案1至7中任一项所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子存在于免疫细胞上。
9.如实施方案8所述的双官能分子，其中，所述免疫细胞选自由以下组成的群组：自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
10.如实施方案8所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是抑制性免疫受体。
11.如实施方案10所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是抑制性免疫受体的配体。
12.如实施方案8所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是免疫检查点分子。
13.如实施方案12所述的双官能分子，其中，所述免疫检查点分子选自由以下组成的群组：PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、TIGIT以及B7族成员。
14.如实施方案1所述的双官能分子，其中，所述第一部分特异性结合细胞外分子。
15.如实施方案14所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是细胞表面受体的配体。
16.如实施方案15所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是生长因子。
17.如实施方案15所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是细胞因子或趋化因子。
18.如实施方案14所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是抗体。
19.如实施方案18所述的双官能分子，其中，所述抗体是自身抗体。
20.如实施方案18或实施方案19所述的双官能分子，其中，所述抗体特异性结合至细胞表面分子或细胞外分子。
21.如实施方案1至20中任一项所述的双官能分子，其中，所述第一部分选自由以下组成的群组：多肽、配体、适体、纳米颗粒和小分子。
22.如实施方案21所述的双官能分子，其中，所述第一部分是多肽。
23.如实施方案22所述的双官能分子，其中，所述第一部分是抗体。
24.如实施方案23所述的双官能分子，其中，所述抗体是IgG、单链Fv(scFv)、Fab、(Fab)2、(scFv’)2或纳米抗体。
25.如实施方案1至24中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分选自由以下组成的群组：多肽、配体、适体、纳米颗粒和小分子。
26.如实施方案1至25中任一项所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子是甘露-6-磷酸酯受体(M6PR)。
27.如实施方案26所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一个或多个M6PR配体。
28.如实施方案27所述的双官能分子，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。
29.如实施方案27或实施方案28所述的双官能分子，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物。
30.如实施方案29所述的双官能分子，其中，所述一个或多个M6P类似物包括一个或多个甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。
31.如实施方案27至30中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括1个至500个M6PR配体。
32.如实施方案27至31中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括聚合物支架，所述聚合物支架陈列所述一个或多个M6PR配体。
33.如实施方案32所述的双官能分子，其中，所述聚合物支架是含糖聚合物，所述含糖聚合物包括所述一个或多个M6PR配体。
34.如实施方案33所述的双官能分子，其中，所述含糖聚合物是糖蛋白，所述糖蛋白包括用所述一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种氨基酸。
35.如实施方案34所述的双官能分子，其中，所述糖蛋白是N-羧酸酐(NCA)衍生的糖蛋白。
36.如实施方案1至25中任一项所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子在肝脏细胞的表面上表达。
37.如实施方案36所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子在肝细胞的表面上表达。
38.如实施方案36或实施方案37所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子在肝细胞癌(HCC)细胞、纤维化肝脏细胞或该两者的表面上表达。
39.如实施方案36至38中任一项所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
40.如实施方案39所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一个或多个ASGPR配体。
41.如实施方案40所述的双官能分子，其中，所述一个或多个ASGPR配体包括一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
42.如实施方案40或实施方案41所述的双官能分子，其中，所述一个或多个ASGPR配体包括一个或多个半乳糖。
43.如实施方案40至42中任一项所述的双官能分子，其中，所述一个或多个ASGPR配体包括一个或多个葡萄糖。
44.如实施方案40至43中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括1个至500个ASGPR配体。
45.如实施方案40至44中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括聚合物，所述聚合物包括所述一个或多个ASGPR配体。
46.如实施方案45所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括聚(GalNAc-co-Ala)。
47.如实施方案41所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一价、二价或三价的含有GalNAc的树状聚合物支架。
48.如实施方案47所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括三价的含有GalNAc的树状聚合物支架。
49.如实施方案42所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一价、二价或三价的含有半乳糖的树状聚合物支架。
50.如实施方案49所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括三价的含有半乳糖的树状聚合物支架。
51.如实施方案36至50中任一项所述的双官能分子，其中，所述第一部分特异性结合在肝细胞上表达的细胞表面分子。
52.如实施方案51所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是生长因子受体。
53.如实施方案52所述的双官能分子，其中，所述生长因子受体选自由以下组成的群组：表皮生长因子受体(EGFR)、C-Met、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)以及血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)。
54.如实施方案1至53中任一项所述的双官能分子，其中，所述第一部分是多肽并且所述第二部分是多肽，并且其中，所述双官能分子是融合蛋白，所述融合蛋白包括融合至所述第二部分的所述第一部分。
55.如实施方案54所述的双官能分子，其中，所述第一部分直接融合至所述第二部分。
56.如实施方案54所述的双官能分子，在所述第一部分与所述第二部分之间包括间隔结构域。
57.如实施方案1至56中任一项所述的双官能分子，其中，所述双官能分子是双特异性抗体，所述双特异性抗体特异性结合：
细胞表面分子或细胞外分子；以及
溶酶体靶向分子。
58.如实施方案1至53中任一项所述的双官能分子，其中，所述双官能分子是缀合物，所述缀合物包括缀合至所述第二部分的所述第一部分。
59.如实施方案58所述的双官能分子，其中，所述第一部分是抗体。
60.如实施方案58或实施方案59所述的双官能分子，包括如实施方案27至35中任一项所定义的第二部分。
61.如实施方案58或实施方案59所述的双官能分子，包括如实施方案40至50中任一项所定义的第二部分。
62.一种对如实施方案54至57中任一项所述的双官能分子编码的核酸。
63.一种包括如实施方案62所述的核酸的表达介体。
64.一种包括如实施方案62所述的核酸或如实施方案63所述的表达介体的细胞。
65.一种产生如实施方案64所述的细胞的方法，包括将如实施方案62所述的核酸或如实施方案63所述的表达介体引入细胞中。
66.一种制备如实施方案58或实施方案59所述的双官能分子的方法，包括将所述第一部分缀合至所述第二部分。
67.根据实施方案66所述的方法，其中，所述缀合包括将所述第一部分位点特异性缀合至所述第二部分。
68.根据实施方案67所述的方法，其中，所述第一部分包括多肽，并且其中，所述缀合包括将所述第二部分位点特异性缀合至所述第一部分的预先选择的氨基酸。
69.根据实施方案68所述的方法，其中，所述预先选择的氨基酸位于所述第一部分的N端或C端。
70.根据实施方案68所述的方法，其中，所述预先选择的氨基酸在所述第一部分的内部。
71.根据实施方案68至70中任一项所述的方法，其中，所述预先选择的氨基酸是非天然氨基酸。
72.根据实施方案66至71中任一项所述的方法，其中，所述第一部分是抗体。
73.根据实施方案66至72中任一项所述的方法，其中，所述第二部分如实施方案27至35中任一项所定义。
74.根据实施方案66至72中任一项所述的方法，其中，所述第二部分如实施方案40至50中任一项所定义。
75.根据实施方案66至74中任一项所述的方法，其中，所述缀合通过炔烃叠氮化物环加成来实现。
76.一种降解细胞表面分子或细胞外分子的方法，包括：
在所述溶酶体靶向分子将所述细胞表面分子或所述细胞外分子穿梭至所述溶酶体进行降解的条件下，使所述细胞表面分子或所述细胞外分子与如实施方案1至61中任一项所述的双官能分子接触。
77.根据实施方案76所述的方法，其中，相对于在仅存在所述第一部分的情况下所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解，所述双官能分子增进所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解。
78.根据实施方案76或实施方案77所述的方法，其中，所述方法在体外执行。
79.根据实施方案76或实施方案77所述的方法，其中，所述方法在体内执行。
80.一种药物组合物，包括：
如实施方案1至61中任一项所述的双官能分子；以及
药学上可接受的载体。
81.如实施方案80所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制用于肠胃外给药。
82.一种方法，包括对有需要的个体给药如实施方案80或实施方案81所述的药物组合物。
83.一种治疗癌症的方法，包括对患有癌症的个体给药有效量的如实施方案80或实施方案81所述的药物组合物。
84.根据实施方案83所述的方法，其中，所述第一部分特异性结合至选自由以下组成的群组的分子：癌细胞上的细胞表面分子、癌细胞上的细胞表面分子的配体、免疫细胞上的细胞表面分子、免疫细胞上的细胞表面分子的配体、抑制性免疫受体以及抑制性免疫受体的配体。
85.根据实施方案83或实施方案84所述的方法，其中，所述个体患有肝细胞癌(HCC)，所述第一部分结合所述个体的HCC细胞上的细胞表面分子，并且所述第二部分结合ASGPR。
86.根据实施方案85所述的方法，其中，所述第一部分结合所述个体的HCC细胞上的生长因子。
87.根据实施方案90所述的方法，其中，所述第一部分结合选自由以下组成的群组的生长因子：EGFR、C-Met、IGF1R和FGFR4。
88.根据实施方案85至87中任一项所述的方法，其中，所述第二部分如实施方案36至50中任一项所定义。
89.一种增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，包括对需要ADCC的个体给药如实施方案80或实施方案81所述的药物组合物。
90.一种增强个体中的癌症免疫原性的方法，包括对所述个体给药如实施方案80或实施方案81所述的药物组合物。
91.根据实施方案89或实施方案90所述的方法，其中，所述第一部分特异性结合至选自由以下组成的群组的分子：抑制性免疫受体以及抑制性免疫受体的配体。
92.根据实施方案82至91中任一项所述的方法，其中，所述给药通过肠胃外给药进行。
93.根据实施方案82至91中任一项所述的方法，其中，相对于在仅存在所述第一部分的情况下所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解，所述双官能分子增进所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解。
94.一种试剂盒，包括：
如实施方案1至61中任一项所述的双官能分子；以及
说明书，所述说明书用于降解所述第一部分特异性结合的所述细胞表面分子或所述细胞外分子。
95.如实施方案94所述的试剂盒，其中，所述说明书用于体外降解所述细胞表面分子或所述细胞外分子。
96.如实施方案94所述的试剂盒，其中，所述说明书用于体内降解所述细胞表面分子或所述细胞外分子。
97.一种试剂盒，包括：
如实施方案1至61中任一项所述的双官能分子或如实施方案80或实施方案81所述的药物组合物；以及
说明书，所述说明书用于将所述双官能分子或所述药物组合物给药于有需要的个体。
98.如实施方案97所述的试剂盒，其中，所述双官能分子或所述药物组合物以一个或多个单位剂量存在。
99.如实施方案97所述的试剂盒，其中，所述双官能分子或所述药物组合物以两个或更多个单位剂量存在。
100.一种含糖聚合物，包括：
聚合物支架；以及
与所述聚合物支架附接的一个或多个甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)配体。
101.如实施方案100所述的含糖聚合物，其中，所述含糖聚合物是糖蛋白，所述糖蛋白包括用所述一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种氨基酸。
102.如实施方案101所述的含糖聚合物，其中，所述糖蛋白是N-羧酸酐(NCA)衍生的糖蛋白。
103.如实施方案100至102中任一项所述的含糖聚合物，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。
104.如实施方案100至103中任一项所述的含糖聚合物，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物。
105.如实施方案104所述的含糖聚合物，其中，所述一个或多个M6P类似物包括一个或多个甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。
106.如实施方案100至105中任一项所述的含糖聚合物，其中，所述聚合物支架包括1个至500个M6PR配体。
107.一种制备如实施方案100至106中任一项所述的含糖聚合物的方法，包括：
将所述一个或多个M6PR配体附接至所述聚合物支架；或者
由用所述一个或多个M6PR配体官能化的单体合成所述聚合物支架。
108.根据实施方案107所述的方法，其中，所述支架由用所述一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种单体聚合而成，并且其中，所述合成通过固相合成来实现。
109.根据实施方案108所述的方法，其中，所述含糖聚合物是糖蛋白聚合物，并且其中，所述合成通过固相肽合成来实现。
110.一种试剂盒，包括：
如实施方案100至106中任一项所述的含糖聚合物；以及
说明书，所述说明书用于将所述含糖聚合物缀合至目标分子。
111.如实施方案110所述的试剂盒，还包括试剂，所述试剂用于将所述含糖聚合物缀合至目标分子。
112.如实施方案110或实施方案111所述的试剂盒，其中，所述目标分子是多肽。
113.如实施方案112所述的试剂盒，其中，所述多肽是抗体。
114.如实施方案110至113中任一项所述的试剂盒，其中，所述目标分子特异性结合细胞表面分子或细胞外分子。
115.一种用一个或多个甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)配体官能化的单体。
116.如实施方案115所述的单体，其中，所述单体是氨基酸。
117.如实施方案115所述的单体，其中，所述单体是非天然氨基酸。
118.如实施方案115至117中任一项所述的单体，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。
119.如实施方案115至118中任一项所述的单体，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物。
120.如实施方案119所述的单体，其中，所述一个或多个M6P类似物包括一个或多个甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。
提供以下实例是为了说明而非限制。
实验
实例1——甘露糖-6-磷酸酯聚合物将货物穿梭至溶酶体
在该实例中测试的是双官能分子(参见图10)，其包括生物素帽(如本文中所使用的“第一部分”——在图10中描绘为三角形)和M6Pn聚合物(如本文中所使用的“第二部分”)，以确定双官能分子是否可以介导中性抗生物素蛋白-647(NA647——生物素可强结合的一种蛋白质)从细胞外空间向溶酶体的转移以进行降解。图10提供了荧光成像结果(底部)，证明双官能分子确实可以介导中性抗生物素蛋白-647向溶酶体的转移，因为观察到蛋白质和溶酶体染色染料的共定位。
接下来，以如上所述的方式测试各种细胞系。图11显示的数据证明几种细胞系表现出以M6Pn聚合物依赖性方式摄取NA647。鉴于这些结果，预期任何带有M6PR(例如，CIM6PR)的细胞系都将允许通过这种方法将细胞表面分子和细胞外分子穿梭至溶酶体，并且不限于本研究中所测试的细胞系。
实例2——M6Pn缀合抗体将靶标穿梭至溶酶体
在该实例中测试的是双官能分子，其中第一部分是与特定目标靶标结合的抗体，并且第二部分是含有M6Pn的糖蛋白。
图13提供了示意图(顶部)和荧光成像数据(底部)，证明聚(M6Pn)标记的抗体可以将它们的结合配偶体穿梭至溶酶体。在该实例中，在蛋白质和溶酶体染色染料共定位(合并)的情况下，小鼠IgG-488与带有聚(M6Pn)标签的抗小鼠IgG抗体一起温育。
图14提供了示意图(顶部)和进一步的数据(底部)，证明聚(M6Pn)标记的抗体可以将它们的结合配偶体穿梭至细胞内区室。在该实例中，重组人apoE4与小鼠来源的抗人apoE4抗体、抗小鼠IgG抗体或带有聚(M6Pn)标签的抗小鼠抗体一起温育。使用含M6Pn的二次抗体观察到明显更多的吸收。
图15提供了进一步的数据，证明聚(M6Pn)标记的抗体可以穿梭其结合配偶体以进行降解。在该实例中，通过将细胞与带有M6Pn标签的西妥昔单抗一起温育来评估EGFR降解。与西妥昔单抗或带有模拟聚合物(GalNAc)的西妥昔单抗相比，所有测试的细胞系都观察到了总EGFR的损失。EGF是EGFR降解的阳性对照。泳道1：对照。泳道2：EGF(100ng/mL，1h，+对照)。泳道3：西妥昔单抗。泳道4：西妥昔单抗-GalNAc缀合物。泳道5：西妥昔单抗-M6P缀合物(长)。泳道6：西妥昔单抗-M6P缀合物(短)。通过光密度测定法计算对照百分比。
图16提供的数据证明聚(M6Pn)标记的抗体片段可以穿梭其结合配偶体以进行降解。在该实例中，通过将细胞与带有M6Pn标签的西妥昔单抗衍生的Fab部分一起温育来评估EGFR降解。与单独的西妥昔单抗Fab或带有模拟聚合物(GalNAc)的西妥昔单抗Fab相比，观察到总EGFR的损失。
图17提供了进一步的数据，证明聚(M6Pn)标记的抗体可以穿梭其结合配偶体以进行降解。在该实例中，CD71(转铁蛋白受体)的降解是通过以下方式来评估的：将细胞与抗CD71的主要小鼠来源抗体、抗小鼠IgG抗体或带有聚(M6Pn)标签的抗小鼠抗体一起温育。含有M6P标签的系统会引起明显更多的降解。
图18提供了进一步的数据，证明聚(M6Pn)标记的抗体可以穿梭其结合配偶体以进行降解。在该实例中，通过将细胞与抗PDL1抗体或带有M6P标签的抗PDL1抗体一起温育来评估PDL1降解。仅在使用M6P标记的抗PDL1抗体的情况下观察到降解。
实例3——ASGPR配体将货物穿梭至肝细胞中的溶酶体
目前的若干种疗法都存在脱靶效应。在该实例中描述了肝脏中蛋白质的靶向降解，其可用于治疗肝脏相关疾病，诸如肝癌和肝纤维化。被称为脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的清道夫受体专门或几乎专门在肝脏细胞(肝细胞)中表达。如图20(左)所示，ASGPR在质膜与胞内体之间组成性循环。ASGPR将细胞外糖蛋白带入细胞内，以便在溶酶体中降解。本文证明了利用该受体使用双官能分子可降解肝细胞上的细胞外蛋白或膜蛋白，所述双官能分子包括：与此类膜蛋白或细胞外蛋白结合的第一部分；以及包括ASGPR配体的第二部分。
在本文的ASGPR相关的实例中测试的是这样的双官能分子，所述双官能分子包括与有待降解的靶标分子结合的抗体，该抗体与包括N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的聚合物、特别是聚(GalNAc-co-Ala)聚合物的第二部分缀合，如图20(左下)所示。
为了评估包括ASGPR配体的双官能分子是否确实可以将货物穿梭至肝细胞中的溶酶体，采用了图21中示意性说明的测定。测试了包括与聚(GalNAc-co-Ala)聚合物缀合的抗小鼠IgG抗体的双官能分子，以确定该双官能分子是否可以将细胞外荧光标记的小鼠IgG(IgG-AF647)穿梭到肝细胞的细胞内区室中。在该实例中还测试了包括与M6PR配体缀合的抗小鼠IgG抗体的双官能分子。将HEPG2细胞(肝细胞癌细胞系)与50nM IgG-AF647和25nM的抗小鼠缀合物一起温育1小时。通过流式细胞术分析细胞摄取。如条形图所示，使用含有GalNAc的缀合物观察到细胞荧光以大约8倍增加，而含有M6Pn的缀合物在背景上引起了2倍的增加。数据证明，在肝细胞中——其中ASGPR的表达水平高于M6PR——含有GalNAc的缀合物在触发细胞摄取方面更有效。
图22显示了来自图21所述但在HUH7细胞(另一种肝细胞癌细胞系)中的测定的结果。观察到IgG-AF647高效摄取到HUH7细胞中。此外，还包括这样的对照，在所述对照中，将细胞与M6PR或ASGPR抑制剂(分别为单体M6P(mM6P)和单体GalNAc(mGalNAc))一起温育。当细胞与抑制剂一起温育时，摄取减少，表明利用含有GalNAc或M6Pn的缀合物的摄取确实分别由ASGPR或M6PR介导。
实例4——使用西妥昔单抗-ASGPR配体缀合物高效降解肝细胞中的EGFR
已知表皮生长因子受体(EGFR)在肝细胞癌(HCC)中诱导增殖和血管生成。68％的HCC患者在其HCC细胞上表达EGFR。移植目前仍然是HCC患者的最佳治疗选择，而优质的已故捐献者器官的供应有限。受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂或抗体通常用于治疗，但由于受体酪氨酸激酶(EGFR、HER2、HER3、c-Met、IGF1R)的异源二聚化引起相同的下游效应子的磷酸化以经由RTK串扰恢复致癌信号，从而导致HCC细胞对这些治疗产生抗性。西妥昔单抗是一种EGFR阻断抗体，在HCC患者的II期临床试验中失败。
在该实例中评估了包括与ASGPR配体(该实例中的聚(GalNAc-co-Ala))缀合的抗EGFR抗体(该实例中的西妥昔单抗)的双官能分子是否可以诱导HCC细胞中EGFR的摄取和降解，如图23中(顶部)示意性所示。还测试了西妥昔单抗M6PR配体缀合物。
在第一个实验中使用了HEP3B细胞。将细胞与10nM的西妥昔单抗缀合物温育48小时，然后裂解用于蛋白质印迹分析。蛋白质印迹(如图23底部所示)有5个泳道：1)未处理，2)EGF(已知的EGFR下调剂)，3)西妥昔单抗，4)西妥昔单抗GalNAc缀合物，以及5)西妥昔单抗M6Pn缀合物。如图所示，与西妥昔单抗M6Pn缀合物相比，西妥昔单抗GalNAc缀合物表现出高效的EGRFR降解和更大的EGFR降解。纽蛋白用作加载对照。
在第二个实验中使用了HEPG2细胞。结果示于图24中。观察到HEPG2细胞中EGFR的高效降解。在这里，西妥昔单抗GalNAc与西妥昔单抗M6Pn缀合物之间的降解效率相似，这可能是由于HEP3B和HEPG2细胞系中EGFR的相对水平引起的。右侧显示了两种细胞系中受体和EGFR的相对mRNA水平(可在公共数据库中获得)。因为与HEP3B细胞相比，HEPG2细胞中的EGFR水平相对较低，所以数据表明，即使使用效率较低的降解剂(西妥昔单抗M6Pn缀合物)，大部分膜EGFR也在降解，并且蛋白质印迹中所见的残留EGFR可能是内部EGFR。还监测了ASGPR水平以显示ASGPR水平在整个不同的处理方法中保持恒定。
接下来，进行了时间进程研究，以评估用西妥昔单抗缀合物处理的HEP3B细胞中EGFR随时间的降解。结果示于图25中。如图所示，到12小时时，西妥昔单抗GalNAc缀合物将EGFR水平降低至低于50％。降解在48小时时增加。在任何测试的时间点，西妥昔单抗M6Pn缀合物都没有使EGFR水平降低至低于50％。
进行免疫荧光实验以评估残留的EGFR是膜EGFR还是细胞内EGFR。结果示于图26中。HEP3B和西妥昔单抗中细胞的轮廓表明了EGFR在膜上的定位。当用西妥昔单抗M6Pn缀合物处理HEP3B时，一些EGFR定位在内部，而另一些保留在膜上。当用西妥昔单抗GalNAc缀合物处理HEP3B时，膜上几乎没有观察到EGFR，并且绝大多数EGFR位于细胞内。因此，西妥昔单抗GalNAc缀合物降解了大多数膜结合的EGFR，并且在蛋白质印迹上所见的残留(大约30％)的EGFR似乎是细胞内EGFR。
实例5——经由仅曲妥珠单抗以及曲妥珠单抗缀合物进行的HER2降解
在该实例中评估了在存在仅曲妥珠单抗或存在与图20所示的含有GalNAc的聚合物缀合的曲妥珠单抗(“曲妥珠单抗GalNAc”)的情况下HUH7和HEPG2细胞中HER2的降解程度。将HUH7和HEPG2细胞与10nM的曲妥珠单抗或曲妥珠单抗GalNAc缀合物一起温育48小时，然后裂解用于蛋白质印迹分析。图27中的蛋白质印迹对于每个细胞系具有3条泳道：1)未处理，2)曲妥珠单抗，3)曲妥珠单抗GalNAc。图27中的条形图显示了每个细胞系中HER2相对于对照的平均百分比。如图所示，在任一细胞系中，在存在仅曲妥珠单抗或存在与含有GalNAc的聚合物缀合的曲妥珠单抗的情况下，HER2降解不存在统计学差异。因此，相对于在存在仅曲妥珠单抗的情况下HER2的降解，曲妥珠单抗GalNAc缀合物不会增进HER2的降解。
因此，以上仅说明本公开的原理。应当理解的是，本领域技术人员能够设计各种布置，尽管未在本文明确描述或示出，但所述各种布置体现了本发明的原理并且包括在本发明的精神和范围内。此外，本文列举的所有实例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域的发展而贡献的概念，并且被解释为不限于这些具体列举的实例和条件。此外，本文叙述本发明的原理、方面和实施方案以及其具体实例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，预期此类等同物包括当前已知的等同物以及未来开发的等同物，即，开发的不论结构如何执行相同功能的任何要素。因此，本发明的范围并不旨在限于本文示出和描述的示范性实施方案。

Claims (120)

1.一种双官能分子，包括：
第一部分，所述第一部分特异性结合细胞表面分子或细胞外分子；以及
第二部分，所述第二部分特异性结合溶酶体靶向分子。
2.如权利要求1所述的双官能分子，其中，相对于在仅存在所述第一部分的情况下所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解，所述双官能分子增进所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解。
3.如权利要求1或权利要求2所述的双官能分子，其中，所述第一部分特异性结合细胞表面分子。
4.如权利要求3所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是细胞表面受体。
5.如权利要求4所述的双官能分子，其中，所述细胞表面受体是生长因子受体。
6.如权利要求1至5中任一项所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子存在于癌细胞上。
7.如权利要求6所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。
8.如权利要求1至7中任一项所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子存在于免疫细胞上。
9.如权利要求8所述的双官能分子，其中，所述免疫细胞选自由以下组成的群组：自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、T细胞、B细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
10.如权利要求8所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是抑制性免疫受体。
11.如权利要求10所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是抑制性免疫受体的配体。
12.如权利要求8所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是免疫检查点分子。
13.如权利要求12所述的双官能分子，其中，所述免疫检查点分子选自由以下组成的群组：PD-1、PD-L1、CTLA4、TIM3、LAG3、TIGIT以及B7族成员。
14.如权利要求1所述的双官能分子，其中，所述第一部分特异性结合细胞外分子。
15.如权利要求14所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是细胞表面受体的配体。
16.如权利要求15所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是生长因子。
17.如权利要求15所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是细胞因子或趋化因子。
18.如权利要求14所述的双官能分子，其中，所述细胞外分子是抗体。
19.如权利要求18所述的双官能分子，其中，所述抗体是自身抗体。
20.如权利要求18或权利要求19所述的双官能分子，其中，所述抗体特异性结合至细胞表面分子或细胞外分子。
21.如权利要求1至20中任一项所述的双官能分子，其中，所述第一部分选自由以下组成的群组：多肽、配体、适体、纳米颗粒和小分子。
22.如权利要求21所述的双官能分子，其中，所述第一部分是多肽。
23.如权利要求22所述的双官能分子，其中，所述第一部分是抗体。
24.如权利要求23所述的双官能分子，其中，所述抗体是IgG、单链Fv(scFv)、Fab、(Fab)2、(scFv’)2或纳米抗体。
25.如权利要求1至24中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分选自由以下组成的群组：多肽、配体、适体、纳米颗粒和小分子。
26.如权利要求1至25中任一项所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子是甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)。
27.如权利要求26所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一个或多个M6PR配体。
28.如权利要求27所述的双官能分子，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。
29.如权利要求27或权利要求28所述的双官能分子，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物。
30.如权利要求29所述的双官能分子，其中，所述一个或多个M6P类似物包括一个或多个甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。
31.如权利要求27至30中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括1个至500个M6PR配体。
32.如权利要求27至31中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括聚合物支架，所述聚合物支架陈列所述一个或多个M6PR配体。
33.如权利要求32所述的双官能分子，其中，所述聚合物支架是含糖聚合物，所述含糖聚合物包括所述一个或多个M6PR配体。
34.如权利要求33所述的双官能分子，其中，所述含糖聚合物是糖蛋白，所述糖蛋白包括用所述一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种氨基酸。
35.如权利要求34所述的双官能分子，其中，所述糖蛋白是N-羧酸酐(NCA)衍生的糖蛋白。
36.如权利要求1至25中任一项所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子在肝脏细胞的表面上表达。
37.如权利要求36所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子在肝细胞的表面上表达。
38.如权利要求36或权利要求37所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子在肝细胞癌(HCC)细胞、纤维化肝脏细胞或该两者的表面上表达。
39.如权利要求36至38中任一项所述的双官能分子，其中，所述溶酶体靶向分子是脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)。
40.如权利要求39所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一个或多个ASGPR配体。
41.如权利要求40所述的双官能分子，其中，所述一个或多个ASGPR配体包括一个或多个N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)。
42.如权利要求40或权利要求41所述的双官能分子，其中，所述一个或多个ASGPR配体包括一个或多个半乳糖。
43.如权利要求40至42中任一项所述的双官能分子，其中，所述一个或多个ASGPR配体包括一个或多个葡萄糖。
44.如权利要求40至43中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括1个至500个ASGPR配体。
45.如权利要求40至44中任一项所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括聚合物，所述聚合物包括所述一个或多个ASGPR配体。
46.如权利要求45所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括聚(GalNAc-co-Ala)。
47.如权利要求41所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一价、二价或三价的含有GalNAc的树状聚合物支架。
48.如权利要求47所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括三价的含有GalNAc的树状聚合物支架。
49.如权利要求42所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括一价、二价或三价的含有半乳糖的树状聚合物支架。
50.如权利要求49所述的双官能分子，其中，所述第二部分包括三价的含有半乳糖的树状聚合物支架。
51.如权利要求36至50中任一项所述的双官能分子，其中，所述第一部分特异性结合在肝细胞上表达的细胞表面分子。
52.如权利要求51所述的双官能分子，其中，所述细胞表面分子是生长因子受体。
53.如权利要求52所述的双官能分子，其中，所述生长因子受体选自由以下组成的群组：表皮生长因子受体(EGFR)、C-Met、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)以及血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)。
54.如权利要求1至53中任一项所述的双官能分子，其中，所述第一部分是多肽并且所述第二部分是多肽，并且其中，所述双官能分子是融合蛋白，所述融合蛋白包括融合至所述第二部分的所述第一部分。
55.如权利要求54所述的双官能分子，其中，所述第一部分直接融合至所述第二部分。
56.如权利要求54所述的双官能分子，在所述第一部分与所述第二部分之间包括间隔结构域。
57.如权利要求1至56中任一项所述的双官能分子，其中，所述双官能分子是双特异性抗体，所述双特异性抗体特异性结合：
细胞表面分子或细胞外分子；以及
溶酶体靶向分子。
58.如权利要求1至53中任一项所述的双官能分子，其中，所述双官能分子是缀合物，所述缀合物包括缀合至所述第二部分的所述第一部分。
59.如权利要求58所述的双官能分子，其中，所述第一部分是抗体。
60.如权利要求58或权利要求59所述的双官能分子，包括如权利要求27至35中任一项所定义的第二部分。
61.如权利要求58或权利要求59所述的双官能分子，包括如权利要求40至50中任一项所定义的第二部分。
62.一种对如权利要求54至57中任一项所述的双官能分子编码的核酸。
63.一种包括如权利要求62所述的核酸的表达介体。
64.一种包括如权利要求62所述的核酸或如权利要求63所述的表达介体的细胞。
65.一种产生如权利要求64所述的细胞的方法，包括将如权利要求62所述的核酸或如权利要求63所述的表达介体引入细胞中。
66.一种制备如权利要求58或权利要求59所述的双官能分子的方法，包括将所述第一部分缀合至所述第二部分。
67.根据权利要求66所述的方法，其中，所述缀合包括将所述第一部分位点特异性缀合至所述第二部分。
68.根据权利要求67所述的方法，其中，所述第一部分包括多肽，并且其中，所述缀合包括将所述第二部分位点特异性缀合至所述第一部分的预先选择的氨基酸。
69.根据权利要求68所述的方法，其中，所述预先选择的氨基酸位于所述第一部分的N端或C端。
70.根据权利要求68所述的方法，其中，所述预先选择的氨基酸在所述第一部分的内部。
71.根据权利要求68至70中任一项所述的方法，其中，所述预先选择的氨基酸是非天然氨基酸。
72.根据权利要求66至71中任一项所述的方法，其中，所述第一部分是抗体。
73.根据权利要求66至72中任一项所述的方法，其中，所述第二部分如权利要求27至35中任一项所定义。
74.根据权利要求66至72中任一项所述的方法，其中，所述第二部分如权利要求40至50中任一项所定义。
75.根据权利要求66至74中任一项所述的方法，其中，所述缀合通过炔烃叠氮化物环加成来实现。
76.一种降解细胞表面分子或细胞外分子的方法，包括：
在所述溶酶体靶向分子将所述细胞表面分子或所述细胞外分子穿梭至所述溶酶体进行降解的条件下，使所述细胞表面分子或所述细胞外分子与如权利要求1至61中任一项所述的双官能分子接触。
77.根据权利要求76所述的方法，其中，相对于在仅存在所述第一部分的情况下所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解，所述双官能分子增进所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中，所述方法在体外执行。
79.根据权利要求76或权利要求77所述的方法，其中，所述方法在体内执行。
80.一种药物组合物，包括：
如权利要求1至61中任一项所述的双官能分子；以及
药学上可接受的载体。
81.如权利要求80所述的药物组合物，其中，所述组合物被配制用于肠胃外给药。
82.一种方法，包括对有需要的个体给药如权利要求80或权利要求81所述的药物组合物。
83.一种治疗癌症的方法，包括对患有癌症的个体给药有效量的如权利要求80或权利要求81所述的药物组合物。
84.根据权利要求83所述的方法，其中，所述第一部分特异性结合至选自由以下组成的群组的分子：癌细胞上的细胞表面分子、癌细胞上的细胞表面分子的配体、免疫细胞上的细胞表面分子、免疫细胞上的细胞表面分子的配体、抑制性免疫受体以及抑制性免疫受体的配体。
85.根据权利要求83或权利要求84所述的方法，其中，所述个体患有肝细胞癌(HCC)，所述第一部分结合所述个体的HCC细胞上的细胞表面分子，并且所述第二部分结合ASGPR。
86.根据权利要求85所述的方法，其中，所述第一部分结合所述个体的HCC细胞上的生长因子。
87.根据权利要求90所述的方法，其中，所述第一部分结合选自由以下组成的群组的生长因子：EGFR、C-Met、IGF1R和FGFR4。
88.根据权利要求85至87中任一项所述的方法，其中，所述第二部分如权利要求36至50中任一项所定义。
89.一种增强抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法，包括对需要ADCC的个体给药如权利要求80或权利要求81所述的药物组合物。
90.一种增强个体中的癌症免疫原性的方法，包括对所述个体给药如权利要求80或权利要求81所述的药物组合物。
91.根据权利要求89或权利要求90所述的方法，其中，所述第一部分特异性结合至选自由以下组成的群组的分子：抑制性免疫受体以及抑制性免疫受体的配体。
92.根据权利要求82至91中任一项所述的方法，其中，所述给药通过肠胃外给药进行。
93.根据权利要求82至91中任一项所述的方法，其中，相对于在仅存在所述第一部分的情况下所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解，所述双官能分子增进所述细胞表面分子或所述细胞外分子的降解。
94.一种试剂盒，包括：
如权利要求1至61中任一项所述的双官能分子；以及
说明书，所述说明书用于降解所述第一部分特异性结合的所述细胞表面分子或所述细胞外分子。
95.如权利要求94所述的试剂盒，其中，所述说明书用于体外降解所述细胞表面分子或所述细胞外分子。
96.如权利要求94所述的试剂盒，其中，所述说明书用于体内降解所述细胞表面分子或所述细胞外分子。
97.一种试剂盒，包括：
如权利要求1至61中任一项所述的双官能分子或如权利要求80或权利要求81所述的药物组合物；以及
说明书，所述说明书用于将所述双官能分子或所述药物组合物给药于有需要的个体。
98.如权利要求97所述的试剂盒，其中，所述双官能分子或所述药物组合物以一个或多个单位剂量存在。
99.如权利要求97所述的试剂盒，其中，所述双官能分子或所述药物组合物以两个或更多个单位剂量存在。
100.一种含糖聚合物，包括：
聚合物支架；以及
与所述聚合物支架附接的一个或多个甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)配体。
101.如权利要求100所述的含糖聚合物，其中，所述含糖聚合物是糖蛋白，所述糖蛋白包括用所述一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种氨基酸。
102.如权利要求101所述的含糖聚合物，其中，所述糖蛋白是N-羧酸酐(NCA)衍生的糖蛋白。
103.如权利要求100至102中任一项所述的含糖聚合物，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。
104.如权利要求100至103中任一项所述的含糖聚合物，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物。
105.如权利要求104所述的含糖聚合物，其中，所述一个或多个M6P类似物包括一个或多个甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。
106.如权利要求100至105中任一项所述的含糖聚合物，其中，所述聚合物支架包括1个至500个M6PR配体。
107.一种制备如权利要求100至106中任一项所述的含糖聚合物的方法，包括：
将所述一个或多个M6PR配体附接至所述聚合物支架；或者
由用所述一个或多个M6PR配体官能化的单体合成所述聚合物支架。
108.根据权利要求107所述的方法，其中，所述支架由用所述一个或多个M6PR配体官能化的一种或多种单体聚合而成，并且其中，所述合成通过固相合成来实现。
109.根据权利要求108所述的方法，其中，所述含糖聚合物是糖蛋白聚合物，并且其中，所述合成通过固相肽合成来实现。
110.一种试剂盒，包括：
如权利要求100至106中任一项所述的含糖聚合物；以及
说明书，所述说明书用于将所述含糖聚合物缀合至目标分子。
111.如权利要求110所述的试剂盒，还包括试剂，所述试剂用于将所述含糖聚合物缀合至目标分子。
112.如权利要求110或权利要求111所述的试剂盒，其中，所述目标分子是多肽。
113.如权利要求112所述的试剂盒，其中，所述多肽是抗体。
114.如权利要求110至113中任一项所述的试剂盒，其中，所述目标分子特异性结合细胞表面分子或细胞外分子。
115.一种用一个或多个甘露糖-6-磷酸酯受体(M6PR)配体官能化的单体。
116.如权利要求115所述的单体，其中，所述单体是氨基酸。
117.如权利要求115所述的单体，其中，所述单体是非天然氨基酸。
118.如权利要求115至117中任一项所述的单体，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个甘露糖-6-磷酸酯(M6P)。
119.如权利要求115至118中任一项所述的单体，其中，所述一个或多个M6PR配体包括一个或多个M6P类似物。
120.如权利要求119所述的单体，其中，所述一个或多个M6P类似物包括一个或多个甘露糖-6-膦酸酯(M6Pn)。
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