CN114522244B - 视黄酸修饰的lytac分子及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种视黄酸修饰的LYTAC分子及其制备方法和应用，视黄酸修饰的LYTAC分子的结构如式(I)所示：式(I)中，n表示PEG的分子量，n为60‑5000；R为靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物。视黄酸修饰的LYTAC分子可应用于靶向蛋白降解和制备肿瘤细胞活性抑制剂。视黄酸生物安全性高，简单易得，易于修饰，可以与任何靶向结合蛋白受体的抗体、多肽或小分子偶联实现胞外或膜上蛋白的溶酶体降解，可用于制备肿瘤细胞活性抑制剂，用于肿瘤、炎症等疾病的治疗，具有广阔的应用前景。

Description

视黄酸修饰的LYTAC分子及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及靶向蛋白降解技术领域，尤其涉及一种视黄酸修饰的LYTAC分子及其制备方法和应用。
背景技术
靶向蛋白降解(Targeted protein degradation，TPD)通过劫持内源性蛋白质降解机制来诱导致病蛋白质的消耗或减少。与传统抑制剂的“占位驱动”(Occupancy-driven)模式不同，TPD只需要结合剂来招募目标蛋白进行降解，不依赖高亲和力的占据，因此可以靶向无酶活性或缺乏可用药物结合口袋的“不可成药”蛋白。同时，由于其催化作用模式，TPD技术能在低药物浓度(nM级)下实现高效、快速的靶蛋白消耗，延长药物作用时间，从源头避免了传统抑制剂的脱靶效应和不良反应(20)。
目前，TPD中发展最为成熟的是基于泛素化-蛋白酶体系统降解胞内蛋白的蛋白水解靶向嵌合体(Proteolysis-targeting chimera,PROTAC)技术。基于该技术开发的首款靶向雄激素受体的降解剂ARV-110已完成I期临床试验(NCT03888612)，在转移性去势抵抗性前列腺癌患者中显示出较好的有效性和安全性。目前，众多国内外知名药企：Arvinas、诺华等纷纷布局PROTAC技术，显示了该技术广大的市场潜力。
作为PROTAC的补充，2020年Carolyn Bertozzi等提出溶酶体靶向嵌合体(lysosome-targeting chimeras，LYTAC)技术，首次利用了内吞-溶酶体途径，通过靶向蛋白的胞外结构域，实现胞外蛋白和膜蛋白的靶向降解。目前报道的LYTAC主要由两个结合域组成，其中一个是靶向细胞表面的溶酶体靶向受体(lysosome-targeting receptor,LTR，例如非阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(cation-independent mannose-6-phosphatereceptor,CI-M6PR))的寡聚糖结构，另外一个是靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子。
LYTAC和CI-M6PR、靶蛋白结合后，将M-6-P修饰的蛋白转移到溶酶体，被报道可实现EGFR、HER2、PD-L1和载脂蛋白E4的成功降解，且解离的CI-M6PR能再次进入循环。
但上述LYTAC降解剂都存在如下缺点：1、目前LYTAC针对CI-M6PR的配体poly(M6Pn)合成路线复杂，超过15步以上化学反应，难以推广应用。2、非特异性糖基修饰的抗体在小鼠体内会被很快清，因此如何调节LYTAC的药代动力学特性以控制LYTAC的脱靶清除率，是该技术面临的另一难点。3、目前LYTACs分子的LTR配体是化学合成的非天然糖结构，因此在人体内可能产生较强免疫原性。因此亟需开发新型简单易得且具有较高生物相容性的LTR配体。
视黄酸是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。有文献报道视黄酸也可以作为CI-M6PR的配体。但目前尚无报道将视黄酸偶联抗体或多肽等作为LYTAC药物来降解膜蛋白。由于视黄酸生物安全性高，且结构中的羧基易于修饰偶联其他药物，因此本发明试图将其偶联抗体、多肽或小分子化合物来实现膜受体蛋白的降解。
发明内容
本发明提供了一种视黄酸修饰的LYTAC分子及其制备方法和应用，将视黄酸通过化学偶联靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物制备靶向药物，该靶向药物可应用于新型靶向蛋白质降解技术——溶酶体靶向嵌合体技术。
本发明的技术方案如下：
一种视黄酸修饰的LYTAC分子，所述视黄酸修饰的LYTAC分子的结构如式(I)所示：
式(I)中，n表示PEG的分子量，n为60-5000；R为靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物。
视黄酸分子式为C20H28O2，是体内维生素A的代谢中间产物，其生物安全性高，简单易得，易于修饰。将视黄酸偶联任何靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物可得到视黄酸修饰的LYTAC分子，可实现靶蛋白的降解。
优选的，所述的n为120-3000。
优选的，所述的R为EGFR抗体cetuximab、PDL-1抗体Atezolizumab、EGFR靶向多肽GE11、HER2抗体Herceptin、CPCR相关抗体、FGFR抗体、VEGFR抗体、CTLA4抗体或IL-5Rα抗体。
本发明还提供了所述视黄酸修饰的LYTAC分子的制备方法，包括以下步骤：
(1)将视黄酸与NH2-PEGn-Mal(氨基聚乙二醇马来酰亚胺)反应，经分离提纯后获得中间体；
(2)将中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物反应，经后处理后得到所述视黄酸修饰的LYTAC分子。
优选的，步骤(1)包括：将视黄酸溶解到溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，冰浴反应30-60min；在向其中加入NH2-PEGn-Mal，室温反应10-15h；反应液经后处理后得到中间体。
步骤(1)中，所述的后处理包括：
除去反应液中的溶剂得到油状浓缩物；将油状浓缩物用体积比为4:1的超纯水：甲醇的混合溶剂溶解后，采用制备型高效液相色谱进行分离与提纯；
色谱柱型号为COSMOSIL 5C18-MS-II 20mm*250mm；流动相是体积比为3:7的超纯水：甲醇的混合溶剂；洗脱速度为4mL/min；柱温为30℃；保留时间为14min。
优选的，步骤(1)中，视黄酸与NH2-PEGn-Mal的摩尔比为1：0.5-2；最优选为1：1。
优选的，步骤(2)包括：将中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物溶于PBS缓冲液中，室温反应1-5h，反应结束后除去未反应的原料，干燥后得到视黄酸修饰的LYTAC分子。
优选的，步骤(2)中，中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体、多肽或小分子化合物的摩尔比为8-10：1；最优选为10：1。
本发明的视黄酸修饰的LYTAC分子具有较强的靶向蛋白降解作用，可作为靶向蛋白降解剂。
本发明还提供了所述视黄酸修饰的LYTAC分子在靶向蛋白降解中的应用，用于靶向降解EGFR、PDL-1或HER2蛋白。
本发明还提供了所述视黄酸修饰的LYTAC分子在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用。
所述的肿瘤细胞为乳腺癌细胞、口腔癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞、结直肠癌细胞、膀胱癌细胞或前列腺癌细胞。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种结构简单、易于制备的视黄酸修饰的LYTAC分子，可作为靶向蛋白降解剂。视黄酸生物安全性高，简单易得，易于修饰，可以与任何靶向结合蛋白受体的抗体、多肽或小分子偶联实现胞外或膜上蛋白的溶酶体降解，可用于制备肿瘤细胞活性抑制剂，用于肿瘤、炎症等疾病的治疗，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2制得的视黄酸偶联EGFR抗体cetuximab后的产物RA-PEG2K-Ctx的质谱测试结果。
图2为实施例3制得的视黄酸偶联PDL-1抗体Atezolizumab后的产物RA-PEG2K-Ate的质谱测试结果。
图3为实施例4中RA-PEG2K-Ctx对两种肿瘤细胞(孵育24小时后)的EGFR受体蛋白的降解效果评价；其中，A为肺癌细胞H1975，B为肺癌细胞PC9。
图4为实施例5中RA-PEG2K-Ctx对两种肿瘤细胞(孵育48小时后)的EGFR受体蛋白的降解效果评价；其中，A为肺癌细胞H1975，B为肺癌细胞PC9。
图5为实施例6中RA-PEG2K-Ate对肿瘤细胞MDA-MB-231(孵育24小时后)的PDL-1蛋白的降解效果评价。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
本发明所述室温为25-30℃。
实施例1、中间体RA-PEG2K-Mal的合成
将视黄酸(10.2mg,34μmol)加入二氯甲烷中溶解，再加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)(17.1mg,90μmol)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)(10.3mg,90μmol)，冰浴反应半小时，再向其中加入NH2-PEG2K-Mal(氨基聚乙二醇马来酰亚胺，MW:2000)(34μmol,68mg),常温反应12h。反应液旋转蒸发去二氯甲烷后，获得油状浓缩物；浓缩物用体积比4:1的超纯水：甲醇的混合溶剂溶解后，采用制备型高效液相色谱进行分离与提纯(色谱柱型号为COSMOSIL 5C18-MS-II 20mm*250mm)，以体积比3:7的超纯水：甲醇的混合溶剂为流动相进行洗脱，洗脱速度为4mL/min，检测波长为254nm，柱温为30℃，保留时间为14min，收集产物RA-PEG2K-Mal，旋转蒸干甲醇后，再冻干，得中间体RA-PEG2K-Mal 0.071g。
实施例2、视黄酸偶联EGFR抗体cetuximab后的产物RA-PEG2K-Ctx的合成
将EGFR抗体Cetuximab(14.5mg,0.1μmol)与三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)(0.28mg,1μmol)在2mL PBS缓冲液中孵育半小时，再将实施例1方法制备的中间体RA-PEG2K-Mal(2.4mg,1μmol)加入上述溶液中，室温反应3小时，反应结束后用超滤离心管(MWCO 50KD)离心去除未反应的原料。冻干后，得到式(I)所示LYTAC药物(记为RA-PEG2K-Ctx)10.2mg。质谱见图1，Cetuximab(Ctx)的分子量为145779.44，产物RA-PEG2K-Ctx测得的分子量为158465.73，因此每个抗体接了5个视黄酸分子。
实施例3、视黄酸偶联PDL-1抗体Atezolizumab后的产物RA-PEG2K-Ate的合成
将PDL-1抗体Atezolizumab(14.4mg,0.1μmol)与三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)(0.28mg,1μmol)在2mL PBS中孵育半小时，再将实施例1方法制备的中间体RA-PEG2K-Mal(2.4mg,1μmol)加入上述溶液中，室温反应3小时，反应结束后用超滤离心管(MWCO 50KD)离心去除未反应的原料。冻干后，得到式(I)所示LYTAC药物(记为RA-PEG2K-Ate)10.1mg。质谱见图2,Atezolizumab(Ate)的分子量为144590.5，产物RA-PEG2K-Ctx测得的分子量为148797.335，因此每个抗体分子接了2分子视黄酸。
实施例4、RA-PEG2K-Ctx对两种肿瘤细胞(孵育24小时后)的EGFR蛋白的降解效果评价
分别将EGFR抗体Cetuximab(10nM)与RA-PEG2K-Ctx(10nM)加入到肺癌细胞H1975和PC9细胞中，孵育24小时后，收集蛋白，通过Westernblot检测EGFR的表达，结果如图3所示，空白组和Ctx处理组EGFR蛋白都有表达。而RA-PEG-Ctx处理组，相对于空白组，EGFR蛋白降解了50％以上。因此结果表明RA-PEG2K-Ctx对两种细胞的EGFR蛋白都有很好的降解效果。
实施例5、RA-PEG2K-Ctx对两种肿瘤细胞(孵育48小时后)的EGFR蛋白的降解效果评价
分别将EGFR抗体Cetuximab(10nM)与RA-PEG2K-Ctx(10nM)加入到肺癌细胞H1975和PC9细胞中，孵育48小时后，收集蛋白，通过Westernblot检测EGFR的表达，结果如图4所示，空白组和Ctx处理组EGFR蛋白都有表达。而RA-PEG-Ctx处理组，相对于空白组，EGFR蛋白降解了80％以上。结果表明RA-PEG2K-Ctx对两种细胞的EGFR蛋白都有很好的降解效果。
实施例6、RA-PEG2K-Ate对肿瘤细胞MDA-MB-231(孵育24小时后)的PDL-1蛋白的降解效果评价
分别将PDL-1抗体Atezolizumab(Ate)(25nM)与RA-PEG2K-Ate(25nM)加入到乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞中，孵育24小时后，收集蛋白，通过Westernblot检测PDL-1的表达，结果如图5所示，空白组和Ate处理组PDL-1蛋白表达基本一致。而RA-PEG-Ate处理组，相对于空白组，PDL-1蛋白降解了50％以上。结果表明RA-PEG2K-Ate对PDL-1蛋白有很好的降解效果。
以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种视黄酸修饰的LYTAC分子，其特征在于，所述视黄酸修饰的LYTAC分子的结构如式（I）所示：
；
式（I）中，n表示PEG的分子量，n为60-5000；R为EGFR抗体cetuximab、PDL-1抗体Atezolizumab、HER2抗体Herceptin、FGFR抗体、VEGFR抗体、CTLA4抗体或IL-5Rα抗体。
2.一种如权利要求1所述视黄酸修饰的LYTAC分子的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将视黄酸与NH2-PEGn-Mal反应，经分离提纯后获得中间体；
（2）将中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体反应，经后处理后得到所述视黄酸修饰的LYTAC分子。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）包括：将视黄酸溶解到溶剂中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，冰浴反应30-60min；再向其中加入NH2-PEGn-Mal，室温反应10-15h；反应液经后处理后得到中间体。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的后处理包括：
除去反应液中的溶剂得到油状浓缩物；将油状浓缩物用体积比为4:1的超纯水：甲醇的混合溶剂溶解后，采用制备型高效液相色谱进行分离与提纯；
色谱柱型号为COSMOSIL 5C18-MS-II 20 mm*250 mm；流动相是体积比为3:7的超纯水：甲醇的混合溶剂；洗脱速度为4 mL/min；柱温为30 ℃；保留时间为14 min。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，视黄酸与NH2-PEGn-Mal的摩尔比为1：0.5-2。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）包括：将中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体溶于PBS缓冲液中，室温反应1-5h，反应结束后除去未反应的原料，干燥后得到视黄酸修饰的LYTAC分子。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，中间体与带有巯基的靶向靶蛋白的抗体的摩尔比为8-10：1。
8.一种根据权利要求1所述的视黄酸修饰的LYTAC分子在制备靶向蛋白降解剂中的应用，其特征在于，所述的靶向蛋白降解剂用于靶向降解EGFR、PDL-1或 HER2蛋白。
9.一种根据权利要求1所述的视黄酸修饰的LYTAC分子在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用。
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