CN113372413B - 一种靶向CD11b受体的PET显像剂及其标记前体及其制备方法、组合物和用途 - Google Patents

一种靶向CD11b受体的PET显像剂及其标记前体及其制备方法、组合物和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种靶向CD11b受体的PET显像剂及其标记前体及其制备方法、组合物和用途。其中，靶向CD11b受体的PET显像剂具有如下所示结构：
Figure DDA0003067988350000011
与现有技术相比，本发明首次进行了68Ga‑NOTA‑Polypeptide‑PEG11‑Tz自动化合成，制备方法简单快捷，为预定位方法对胃癌肿瘤显像的科学研究和临床应用奠定了基础。

Description

一种靶向CD11b受体的PET显像剂及其标记前体及其制备方 法、组合物和用途
技术领域
本发明涉及放射性药物化学技术领域，具体涉及一种靶向CD11b受体的PET显像剂及其标记前体及其制备方法、组合物和用途
背景技术
CD11b(Mac-1，αMβ2)是一种在肿瘤微环境中髓系细胞膜表面上高度表达的白介素受体。CD11b在炎症条件下对白细胞的粘附，跨内皮迁移和组织募集中发挥了重要的作用。肿瘤微环境中的髓系细胞包括中性粒细胞，肿瘤相关的树突细胞以及肿瘤抑制细胞群，肿瘤相关的巨噬细胞。CD11b在髓样细胞中具有明显的特异性且丰度较高，通过对受体的抑制可以减少在肿瘤微环境中髓样细胞的浸润。因此，靶向CD11b分子探针用于胃癌的PET成像可通过靶向肿瘤浸润的髓细胞，对胃癌进行诊断。
胃癌具有较高死亡率，主要是由于疾病早期缺乏有效的检测信息和药物治疗。因此，早期诊断和准确评估对于治疗决策和预后至关重要。正电子发射断层扫描(PositronEmission Tomography，PET)是目前在活体检测肿瘤和疾病发生发展的最佳影像学设备，能实现对细胞代谢和功能的高分辨率显像，从分子水平对人体的生理、生化过程进行无创、三维、动态研究。PET检查依赖于光谱性或者特异性的靶向正电子显像剂在目标器官的代谢、吸收。18F-FDG是目前PET最常用的显像剂，目前，18F-FDG在胃癌的诊断中受部分组织类型的影响，诊断效果存在差异，因此寻求新的靶点对胃癌的诊断意义重大。
目前在对CD11b抗体的放射性标记研究中，由于抗体分子量较大，体内代谢时间长，因此常用长半衰期核素标记，但是，抗体直接与长半衰期核素标记会对非靶器官产生不必要的辐射损伤。预靶向策略通过分别向体内注射抗体和放射性配体来减少非靶组织的放射剂量。1,2,4,5-四嗪(1,2,4,5-terazine,Tz)和反式-环辛烯(Trans-cyslooctene,TCO)之间的反电子需求[4+2]Diels-Alder环加成(inverse electron demend[4+2]Diels-Alder cycloaddition,IEDDA)生物正交点击化学系统已在体内预靶向PET成像中引起了极大关注，可以有效的降低正常组织的辐射剂量，提高肿瘤与正常组织的吸收比。预定位策略结合了单克隆抗体的高靶向特异性以及短半衰期核素低辐射剂量的优点，影像对比度高，对正常组织辐射损伤小。在预定位成像中，首先注射TCO连接的抗体，待抗体在靶位点积累一段时间后注入小分子放射性配体，与TCO发生化学反应，由于其分子量较小迅速从血液中清除，降低了显像背景的放射性聚集。而作为生物偶联的工具，IEDDA点击反应速率快，效率高，已被用于核医学预定位显像并显示出较好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向CD11b受体的PET显像剂及其标记前体及其制备方法、组合物和用途，代谢稳定，与CD11b受体结合性好，且易于合成。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种靶向CD11b受体的PET显像剂标记前体，具有如下所示结构：
Figure BDA0003067988330000021
记为NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz。
标记前体的全称为：
[2-S-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic-acid]-Polype ptide-HO(CH2CH2O)11H-[3-(4-benzylamino)-1,2,4,5-tetrazine]。
本发明设计使用NOTA作为68Ga最佳螯合剂，Polypeptide以及PEG11均为亲水性分子，标记前体具有较高的亲水性，且通过泌尿系统排泄，有效的降低腹部的本底，有利于胃癌肿瘤的显影，并且该前体可以与Ga-68在常温下迅速反应，标记简单。
一种上述靶向CD11b受体的PET显像剂标记前体的制备方法，在搅拌下，往化合物1的DMF溶液中依次加入N,N-二异丙基乙胺，并调节使其pH>7，然后再加入化合物5，在室温搅拌1小时，收集目标馏分，冻干得到所述的显像剂标记前体；
所述的化合物1具有如下所示结构：
Figure BDA0003067988330000031
所述的化合物5具有如下所示结构：
Figure BDA0003067988330000032
优选地，反应过程中采用LC/MS监测化合物5的含量变化，当化合物5完全消耗完成后，反应溶液直接用反相制备HPLC纯化(含有0.1％TFA H2O/CH3CN,C-18柱)，收集目标馏分，冻干得到显像剂标记前体，产品性状为红色固体。
进一步地，所述的化合物1的制备方法包括：以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，进行接肽反应，得到Ploypeptide，其间依次脱去Fmoc保护基团，连接PEG12-OH以及p-SCN-Bn-NOTA，构建化合物1；
所述的Ploypeptide中Fmoc保护的氨基酸依次为：Fmoc-Dde-Lys-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。
更进一步地，所述的化合物1的制备方法具体包括以下步骤：
(1)称取Rink Amide MBHA树脂(0.175mmol，1.11g)到固相管中，加入DMF，惰性气体鼓吹1小时后用DMF洗涤树脂三次，加入含有20wt％piperidine的DMF溶液，惰性气体鼓吹0.5小时后用DMF洗涤树脂五次，向树脂中加入Fmoc-Dde-Lys-OH(2.00eq)，加入DMF混合均匀，加入缩合剂HBTU(1.90eq)和碱DIEA(4.00eq)，惰性气体鼓吹1小时反应后用DMF洗涤树脂；
(2)向树脂中加入Fmoc-PEG12-OH(2.00eq)，加入DMF混合均匀，HBTU(1.90eq)和碱DIEA(4.00eq)，惰性气体鼓吹1小时反应后用DMF洗涤树脂；
(3)向树脂中加入(Boc)2O(3.00eq)和碱DIEA(6.00eq)，惰性气体鼓吹1小时反应后用DMF洗涤树脂；
(4)向树脂中加入De-Dde和含有0.3％N2H4·H2O的DMF溶液，混匀，惰性气体鼓吹1小时反应后用DMF洗涤树脂；
(5)向树脂中依次加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.00eq)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(3.00eq)、Fmoc-Glu(OtBu)-OH(3.00eq)、Fmoc-Arg(Pbf)-OH(3.00eq)、Fmoc-Ahx-OH(3.00eq)，加入DMF溶液混匀，加入缩合剂HBTU(2.85eq)和碱DIEA(6.00eq)，最后加入p-SCN-Bn-NOTA(2.00eq)，再加入DIEA((8.00eq)，惰性气体鼓吹1小时反应后用DMF洗涤树脂；
(6)将以上树脂干燥完成后，加入溶液(2.5％Tis/2.5％H2O/95％TFA)，室温下震荡2.5小时。过滤树脂并收集滤液。将上述滤液缓慢倒入冷的异丙醚溶液中，用3000转的离心机离心得到粗品肽。将粗品肽用异丙醚洗涤两次，然后干燥得到化合物1。
所述的化合物5的制备方法包括：往搅拌下的化合物2的DCM溶液中，依次加TEA和化合物3，在室温下搅拌反应，得到化合物4，在0℃下，往搅拌下的化合物4的二氯甲烷和DMF混合溶液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺和碳二亚胺，在25～35℃下搅拌反应得到所述的化合物5；
所述的化合物2具有如下所示结构：
Figure BDA0003067988330000041
所述的化合物3具有如下所示结构：
Figure BDA0003067988330000042
所述的化合物4具有如下所示结构：
Figure BDA0003067988330000051
化合物5的制备过程如下所示：
Figure BDA0003067988330000052
优选地，合成化合物4时，采用LC/MS监测化合物2完全消耗，并且目标化合物作为主要产物生成，旋干反应溶剂，然后用100-200目的硅胶进行柱分离，洗脱剂为DCM/MeOH＝10:1-3:1，最终得到化合物4，产品性状为红色固体。
合成化合物5时，采用LC/MS监测化合物4完全消耗完成，反应溶液用二氯甲烷(10.0mL)稀释，然后依次用氯化氢溶液(1M,10.0mL)，饱和食盐水(10.0mL)洗涤,最后用无水Na2SO4干燥，浓缩得到化合物5，产品性状为红色固体。
优选地，反应过程中采用LC/MS监测化合物5的含量变化，当化合物5完全消耗完成后，反应溶液直接用反相制备HPLC纯化(含有0.1％TFA H2O/CH3CN,C-18柱)，收集目标馏分，冻干得到显像剂标记前体，产品性状为红色固体。
一种靶向CD11b受体的PET显像剂，具有如下所示结构：
Figure BDA0003067988330000053
记为68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz。
PET显像剂的全称为：
68Ga-{[2-S-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic-acid]-Polypeptide-HO(CH2CH2O)11H-[3-(4-benzylamino)-1,2,4,5-tetrazine]}。
一种上述靶向CD11b受体的PET显像剂的制备方法，将NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz加入NaOAc中得到前体溶液，用HCl溶液于68Ge/68Ga发生器中淋洗68GaCl3，淋洗后的68GaCl3与前体溶液混合，常温放置反应得到所述的靶向CD11b受体的PET显像剂。
具体可包括以下步骤：
Figure BDA0003067988330000061
一种靶向CD11b受体的PET显像剂组合物，包括上述PET显像剂和靶向CD11b受体的抗体与反式环辛烯的组合物，所述的靶向CD11b受体的抗体与反式环辛烯的组合物记为anti-CD11b-TCO；
所述的PET显像剂68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz和anti-CD11b-TCO通过正交点击化学反应连接。具体过程如下所示：
Figure BDA0003067988330000062
式中，R1、R2为需要连接的不同基团。
anti-CD11b-TCO的全称为anti-CD11b-trans-cyclooctene。
进一步地，所述的anti-CD11b-TCO的制备方法包括：
在555μL的CD11b抗体(6.04mg/mL)的PBS(pH 7.4)的溶液中，加入344μL 0.2M的碳酸氢钠，pH调整为8.5。在抗体溶液中加入N,N-二甲基甲酰胺以及TCO-NHS ester溶液，使得N,N-二甲基乙酰胺含量为10％，TCO/mAb的化学摩尔比为30:1。将此混合溶液在23℃下反应3.5小时得到anti-CD11b-TCO。
优选地，反应完成后，将截留分子量为40KD的脱盐柱用PBS(pH 7.2)平衡后，纯化得到anti-CD11b-TCO。
将所得到的anti-CD11b-TCO与2mg/mL NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz反应，采用RP-HPLC方法检测NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz消耗量，计算DAR值，明确CD11b抗体分子连接的TCO数量，最终得到平均每一个CD11b抗体分子上连接12.01个TCO分子。
一种上述靶向CD11b受体的PET显像剂组合物的用途，将所述的PET显像剂组合物用于通过预定位方法对胃癌肿瘤显像。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明PET显像剂代谢稳定，PET显像剂组合物与CD11b受体结合性好，且易于合成，能靶向肿瘤微环境中髓系细胞的CD11b受体，用非侵入的方法验证CD11b表达的情况；
2.本发明68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz作为放射性配体，其与抗体组合物anti-CD11b-TCO在体内结合，首次通过预定位方法对胃癌肿瘤显像，具有较大的应用价值；
3.本发明首次进行了68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz自动化合成，制备方法简单快捷，为预定位方法68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO的科学研究和临床应用奠定了基础；
4.本发明通过对PET显像剂前体的结构设计，使其具有较高的亲水性，且通过泌尿系统排泄，有效的降低腹部的本底，有利于胃癌肿瘤的显影，另外，该前体可以与Ga-68在常温下迅速反应，标记简单；
5.本发明提供了一种PET显像剂标记前体及Ga-68对PET显像剂的标记方法，制备方法合成路线简便，合成时间短，放化纯度高，比活度满足要求，标记后的PET显像剂68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz，可作为靶向CD11b受体的正电子放射性配体与anti-CD11b-TCO结合，通过预定位方法减低对正常组织的辐射损伤，且影像对比度高；
6.PET显像剂在胃癌的诊断显像中具有一定的价值，肿瘤特异性摄取，靶/非靶吸收比较高，图像对比度高，为临床提供新的思路。
附图说明
图1为本发明实施例1中NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的质量控制图；
图2为本发明实施例1中anti-CD11b-TCO的SEC-HPLC质量控制图；
图3为本发明实施例2中68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的RP-HPLC质量控制图；
图4为本发明实施例3中68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的体外稳定性结果图；
图5为本发明实施例4中68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的体内药代动力学实验图；
图6为本发明实施例5中68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO与RAW264.7细胞结合实验图；
图7为本发明实施例7中荷MGC-803肿瘤小鼠的PET/CT显像图一；
图8为本发明实施例7中荷MGC-803肿瘤小鼠的PET/CT显像图二。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的合成：
Figure BDA0003067988330000091
化合物5的合成步骤如下：
1)往搅拌下的化合物2(250mg,1.34mmol)的DCM(2.50mL)溶液中，依次加TEA(0.37mL)和化合物3(182mg,1.60mmol)。反应溶液在室温下搅拌1小时。旋干反应溶剂，然后用100-200目的硅胶进行柱分离，洗脱剂为DCM/MeOH＝10:1-3:1，最终得到化合物4(50.0mg)。
2)在0℃下，往搅拌下的化合物4(50.0mg,165μmol)的二氯甲烷(1.25mL)和DMF(1.25mL)混合溶液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺(22.9mg,199μmol)和碳二亚胺(63.6mg,331μmol)，反应溶液在29℃下搅拌2小时。LC/MS监测化合物4完全消耗完成。反应溶液用二氯甲烷(10.0mL)稀释。浓缩得到化合物5(70.0mg)。
Peptide的合成步骤如下：
Figure BDA0003067988330000092
1)称取Rink Amide MBHA树脂(0.175mmol,1.11g)到固相管中，加入DMF，氮气鼓吹2小时。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。往上述树脂加入Fmoc保护的氨基酸Dde-Lys-OH(2.00eq)，加入DMF溶液混匀，再加入缩合剂HBTU(1.90eq)和碱DIEA(4.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。加入Fmoc保护的PEG12-OH(2.00eq)，加入DMF溶液混匀，再加入缩合剂HBTU(1.90eq)和碱DIEA(4.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。加入(Boc)2O(3.00eq)，加入DIEA(6.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入De-Dde，加入0.3％N2H4·H2O/DMF溶液混匀，氮气鼓吹反应1h。用DMF洗涤树脂五次。加入Fmoc保护的氨基酸Glu(OtBu)-OH(3.00eq)，加入DMF溶液混匀，再加入HBTU(2.85eq)和DIEA(6.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。加入Fmoc保护的氨基酸Arg(Pbf)-OH(3.00eq)，加入DMF溶液混匀，再加入HBTU(2.85eq)和DIEA(6.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。加入Fmoc保护的氨基酸Glu(OtBu)-OH(3.00eq)，加入DMF溶液混匀，再加入HBTU(2.85eq)和DIEA(6.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。加入Fmoc保护的氨基酸Arg(Pbf)-OH(3.00eq)，加入DMF溶液混匀，再加入HBTU(2.85eq)和DIEA(6.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。加入Fmoc-Ahx-OH(3.00eq)，加入DMF溶液混匀，再加入HBTU(2.85eq)和DIEA(6.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。加入p-SCN-Bn-NOTA(2.00eq)，再加入DIEA(8.00eq)，氮气鼓吹反应1h。后用DMF洗涤树脂三次。加入20％piperidine/DMF，氮气鼓吹0.5小时。用DMF洗涤树脂五次。
投料顺序及用量具体如下表所示：
表1投料表
Figure BDA0003067988330000101
Figure BDA0003067988330000111
2)将以上树脂干燥完成后，加入溶液(2.5％Tis/2.5％H2O/95％TFA)，室温下震荡2.5小时。过滤树脂并收集滤液。将上述滤液缓慢倒入冷的异丙醚溶液中，用3000转的离心机离心得到粗品肽。将粗品肽用异丙醚洗涤两次，然后干燥得到311mg粗品。已完成多肽化合物的切割和纯化，得到化合物1。
3)在搅拌下，往化合物1(160mg,85.1μmol)的DMF(1.00mL)溶液中依次加入N,N-二异丙基乙胺(33.0mg,255μmol)，并调节使其pH>7,然后再加入化合物5(40.4mg,102μmol)，在室温搅拌1小时。LC/MS监测化合物5完全消耗完成。反应溶液直接用反相制备HPLC纯化(含有0.1％TFA H2O/CH3CN,C-18柱)，收集目标馏分，冻干得到目标化合物NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz(5.0mg)，产品性状为红色固体。HPLC结果如图1所示，纯度为95.5％。
组合物的anti-CD11b-TCO合成步骤：
1).在555μL的CD11b抗体(6.04mg/mL)的PBS(pH 7.4)的溶液中，加入344μL 0.2M的碳酸氢钠，使得pH调整为8.5。在抗体溶液中加入N,N-二甲基甲酰胺以及TCO-NHS ester溶液，使得N,N-二甲基乙酰胺含量为10％。将此混合溶液在23℃下反应3.5小时，后将截留分子量为40KD的脱盐柱用PBS(pH 7.2)平衡后，纯化得到最终反应产物。
2).将1)所得到的anti-CD11b-TCO与2mg/mL NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz反应，采用RP-HPLC方法检测NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz消耗量，计算DAR值，明确CD11b抗体分子连接的TCO数量。最终得到平均每一个CD11b抗体分子上连接12.01个TCO分子。通过SEC-HPLC测定纯度为98.55％。HPLC结果如图2所示。
实施例2
目标化合物PET放射性配体68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的合成，其包括下列步骤：
1)取NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz(100μg)加入0.25M NaOAc(pH 5.5,1mL)溶液中，用0.05M HCl溶液4mL于68Ge/68Ga发生器中淋洗68GaCl3(0.70–0.74GBq)。
2)与含NaOAc的前体溶液混合，常温放置反应10分钟。
3)用HPLC进行放射性产物的放射化学纯度测定。
4)HPLC测定标记率。用流动相梯度以1mL/min的速度淋洗，0-20分钟，MeCN/H2O(含有0.1％TFA)20:80至MeCN/H2O(含有0.1％TFA)50:55。产物放化纯度大于97％。HPLC结果如图3所示。
实施例3
本发明68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的体外稳定性实验：
以实施例2所得的68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz约10μCi分别置于100μL0.9％生理盐水，PBS以及胎牛血清(FBS)中，充分混匀后37℃下存放。分别在30min、2h、3h取样，在分析型HPLC上检验其纯度变化。可以发现3h时68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的纯度仍能保持在70％以上，结果如图4所示，表明此探针比较稳定。
实施例4
本发明68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz的药代动力学实验：
以实施例2所得的68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz约200μCi尾静脉注射进5只8周雄性裸鼠体内，分别于注射后1、3、5、10、20、30、45、60、90和120min时断尾，用毛细血管取约为5μL血样，置于计数管底部，测其计数，得到其血药浓度-时间曲线，可知随注射时间的延长，雄性裸鼠体内的68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz含量逐渐降低，结果如图5所示，分子探针血液分布半衰期为5.22±0.25分钟，血液清除半衰期为28.4±0.45分钟，表明分子探针由血液循环系统可以较快分布于各个器官，在血液中清除也相对较快。
实施例5
本发明68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO与CD11b受体结合试验：
将实施例1和2所得的68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO在体外结合后将浓度范围在25n M-300nM的[68Ga]-NOTA-anti-CD11b按浓度梯度加入24孔板中的RAW264.7巨噬细胞(每孔约1×106个)中，孵育2h后分别收集上清液和细胞悬液进行γ计数器计数，以加入100μM的anti-CD11b化合物组为非特异性结合，得到结合饱和曲线，结果如图6所示。
通过曲线可知，Kd值为14.76±0.56nM，Bmax值为22.9±1.68fmol/cell，表明68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO与CD11b受体有较好的亲和力。
实施例6
本发明68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO的生物分布实验：
以实施例1所得的anti-CD11b-TCO(100μg)先尾静脉注射进8周荷瘤MGC-803雄性裸鼠15只，让抗体在体内循环24h，48h，72h后，再尾静脉注射68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz(200μCi)。麻醉状态下，采取摘取眼球取血方式，分别在30min、60min和120min时各处死5只裸鼠，收集包括血、脑、心、肺、肝、脾、肾、胃、小肠、大肠、骨、肌肉和肿瘤组织进行称量及放射性计数。发现注射68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz 1小时后，肿瘤的积聚明显高于心脏、肺、胃、肠、骨髓和大脑，表明肿瘤部位对分子探针特异性摄取，可对胃肿瘤有诊断价值。
实施例7
本发明68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO的动态活体显像试验：
以实施例2所得的anti-CD11b-TCO(100μg)先尾静脉注射进8周荷瘤MGC-803雄性裸鼠9只，让抗体再体内循环24h，48h，72h后，再尾静脉注射68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz(300μCi)。在持续麻醉状态下进行PET/CT显像30min，60min，120min。
图7为anti-CD11b-TCO预定位48h时后注射68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz30min、1h以及2h的显像结果，上排为横断面，下排为冠状面。图8为anti-CD11b-TCO预定位24h、48h、72h注射68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz后1h行PET/CT显像，上排为横断面，下排为冠状面。结果发现在如图7～8所示的PET/CT图像中，显像剂68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz/anti-CD11b-TCO可浓集于右肩部的肿瘤组织中。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种靶向CD11b受体的PET显像剂标记前体，其特征在于，具有如下所示结构：
Figure FDA0003740002920000011
记为NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz。
2.一种如权利要求1所述的靶向CD11b受体的PET显像剂标记前体的制备方法，其特征在于，在搅拌下，往化合物1的DMF溶液中加入N,N-二异丙基乙胺，并调节使其pH>7，然后再加入化合物5，在室温下搅拌，得到所述的显像剂标记前体；
所述的化合物1具有如下所示结构：
Figure FDA0003740002920000012
所述的化合物5具有如下所示结构：
Figure FDA0003740002920000013
3.根据权利要求2所述的靶向CD11b受体的PET显像剂标记前体的制备方法，其特征在于，所述的化合物1的制备方法包括：以Rink Amide MBHA树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有Fmoc保护的氨基酸，进行接肽反应，得到Ploypeptide，其间依次脱去Fmoc保护基团，连接PEG12-OH以及p-SCN-Bn-NOTA，构建化合物1；
所述的Ploypeptide中Fmoc保护的氨基酸依次为：Fmoc-Dde-Lys-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH。
4.根据权利要求3所述的靶向CD11b受体的PET显像剂标记前体的制备方法，其特征在于，所述的化合物1的制备方法具体包括以下步骤：
(1)称取Rink Amide MBHA树脂到固相管中，加入DMF，惰性气体鼓吹后用DMF洗涤树脂，加入含有20wt％piperidine的DMF溶液，惰性气体鼓吹后用DMF洗涤树脂，向树脂中加入Fmoc-Dde-Lys-OH，加入DMF混合均匀，加入缩合剂HBTU和碱DIEA，惰性气体鼓吹反应后用DMF洗涤树脂；
(2)向树脂中加入Fmoc-PEG12-OH，加入DMF混合均匀，再加入缩合剂HBTU和碱DIEA，惰性气体鼓吹反应后用DMF洗涤树脂；
(3)向树脂中加入(Boc)2O和碱DIEA，惰性气体鼓吹反应后用DMF洗涤树脂；
(4)向树脂中加入De-Dde和含有0.3wt％N2H4·H2O的DMF溶液，混匀，惰性气体鼓吹反应后用DMF洗涤树脂；
(5)向树脂中依次加入Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Ahx-OH，加入DMF溶液混匀，加入缩合剂HBTU和碱DIEA，最后加入p-SCN-Bn-NOTA，再加入DIEA，惰性气体鼓吹反应后用DMF洗涤树脂；
(6)将步骤(5)所得树脂干燥完成后，加入Tis、H2O和TFA的混合溶液，室温下震荡，过滤树脂并收集滤液，将滤液倒入冷的异丙醚溶液中，干燥得到化合物1。
5.根据权利要求2所述的靶向CD11b受体的PET显像剂标记前体的制备方法，其特征在于，所述的化合物5的制备方法包括：往搅拌下的化合物2的DCM溶液中，依次加TEA和化合物3，在室温下搅拌反应，得到化合物4，在0℃下，往搅拌下的化合物4的二氯甲烷和DMF混合溶液中依次加入N-羟基丁二酰亚胺和碳二亚胺，在25～35℃下搅拌反应得到所述的化合物5；
所述的化合物2具有如下所示结构：
Figure FDA0003740002920000031
所述的化合物3具有如下所示结构：
Figure FDA0003740002920000032
所述的化合物4具有如下所示结构：
Figure FDA0003740002920000033
6.一种靶向CD11b受体的PET显像剂，其特征在于，具有如下所示结构：
Figure FDA0003740002920000034
记为68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz。
7.一种如权利要求6所述的靶向CD11b受体的PET显像剂的制备方法，其特征在于，将权利要求1所述的NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz加入NaOAc中得到前体溶液，用HCl溶液于68Ge/68Ga发生器中淋洗68GaCl3，淋洗后的68GaCl3与前体溶液混合，常温放置反应得到所述的靶向CD11b受体的PET显像剂。
8.一种靶向CD11b受体的PET显像剂组合物，其特征在于，包括如权利要求6所述的PET显像剂和靶向CD11b受体的抗体与反式环辛烯的组合物，所述的靶向CD11b受体的抗体与反式环辛烯的组合物记为anti-CD11b-TCO；
所述的PET显像剂68Ga-NOTA-Polypeptide-PEG11-Tz和anti-CD11b-TCO通过正交点击化学反应连接。
9.根据权利要求8所述的靶向CD11b受体的PET显像剂组合物，其特征在于，所述的anti-CD11b-TCO的制备方法包括：在CD11b抗体的PBS溶液中，加入碳酸氢钠调整溶液pH值至8～9后，加入N,N-二甲基甲酰胺以及TCO-NHS ester溶液反应得到anti-CD11b-TCO。
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