CN109824765A

CN109824765A - 68Ga标记AEEA修饰c-Met分子成像探针及制备与应用

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Publication number: CN109824765A
Application number: CN201910183059.1A
Authority: CN
Inventors: 申宝忠; 孙夕林; 王凯; 刘杨; 韩兆国; 杨丽丽
Original assignee: Harbin Medical University
Current assignee: Harbin Engineering University; Harbin Medical University
Priority date: 2018-10-16
Filing date: 2019-03-12
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2039-03-12
Also published as: CN109824765B

Abstract

本发明属生物医药领域，具体涉及具有c‑Met靶向性的环状多肽，尤其涉及放射性核素⁶⁸Ga标记的c‑Met示踪剂⁶⁸Ga‑NOTA‑AEEA‑AH111972及其制备方法，本发明还涉及该示踪剂作为非小细胞肺癌(NSCLC)PET成像显像剂的应用。本发明所提供的探针采用短半衰期放射性核素⁶⁸Ga(T1/2～68min)标记，不但能减少不必要的放射性损伤，其体外成像设备PET还能提供高分辨率图像，且在此基础上进行了相应结构优化，以改善其药代动力学。

Description

68Ga标记AEEA修饰c-Met分子成像探针及制备与应用

技术领域：

本发明涉及具有c-Met靶向性的环状多肽，尤其涉及放射性核素⁶⁸Ga标记的c-Met示踪剂⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972及其制备方法，本发明还涉及该示踪剂作为非小细胞肺癌(NSCLC)PET成像显像剂的应用，属生物医药领域。

背景技术：

肝细胞生长因子受体(c-Met)在肿瘤的发生及进展方面扮演了重要角色，针对c-Met的靶向抑制药物已经广泛开展临床试验，并有部分抑制剂进入临床试验，取得了积极的成果。c-Met异常表达水平及表达状态与分子靶向治疗反应、治疗效果和预后密切相关，因此准确评价c-Met异常表达水平和表达状态显得尤为重要。PET分子成像可以在体、实时对肿瘤分子靶点的异常表达水平及状态进行定性定量研究，并能提供高分辨率、高对比度图像，对于指导肿瘤治疗、判断肿瘤预后具有重要意义。但开展PET分子成像研究的基础和技术难点主要是新型高效分子探针的研发。

1、c-Met在NSCLC的发生、进展方面扮演重要角色

c-Met基因是由染色体7q21～q31编码的酪氨酸激酶跨膜受体，其天然配体是肝细胞生长因子,与配体结合后共同形成HGF/c-Met信号通路。成熟的c-Met受体是由跨膜片段β链(145kDa)和胞外片段α链(50kDa)组成的异二聚体复合物，其胞外功能区的sema结构域(β链)为特异性HGF结合区域，胞内则包含具有负性调控激酶活性的JM结构域、酪氨酸激酶结构域等。当c-Met与HGF结合后,c-Met胞内区的4个酪氨酸残基发生自身磷酸化,进而募集Gab-1、Grb-2、Shc和c-Cb1等衔接蛋白,接着通过复杂的机制引发一系列的磷酸化反应,活化PI-3K、ERK1/2、PLC-γ、STATs和FAK等重要的信号分子,进而调节细胞正常的增殖、存活、分化、形态发生和运动调控，从而广泛参与人体的多种正常生理活动。

生理状态下，c-Met与HGF的结合是维持正常生理功能所必须的，并且受到机体严密调控，但NSCLC患者中存在HGF/c-Met信号通路的异常活化。被异常生理因素活化后，c-Met受体及下游信号通路激活，能促进DNA合成和细胞分裂、抑制癌细胞凋亡、促进癌细胞增殖，可以促进癌细胞的侵袭和转移，并通过多种方式直接或间接促进新生血管的形成，进而促进肿瘤的发生发展。研究成果证实包括受体超表达、基因扩增在内的c-Met信号通路的的异常活化还是NSCLC表皮生长因子受体(EGFR)靶向治疗获得性耐药的产生的重要机制。

鉴于c-Met在NSCLC发生发展过程中的重要作用，c-Met靶向治疗在NSCLC的应用受到越来越多的关注。

2、c-Met靶向药物治疗NSCLC的疗效现状

在全世界范围内，肺癌具有最高的发病率和癌症相关死亡率，并且NSCLC约占肺癌发病总数的80％。以放化疗为主的肿瘤治疗的传统治疗方式并不能很好的改善NSCLC预后，因此有效提高NSCLC治疗效果的治疗方案极为迫切。随着越来越多的研究证实c-Met受体超表达和基因扩增存在于相当比例的NSCLC病例中，并被认为是NSCLC发生发展的重要始动因素。c-Met信号通路活化后可进一步激活下游信号通路，介导肿瘤的生长、迁移、血管生成等。此外c-Met基因扩增还是介NSCLC EGFR靶向治疗获得性耐药的重要机制。

近年来，以c-Met为靶点的分子靶向药物研究广泛，发展迅速。c-Met分子靶向药物主要分为拮抗剂、抗体、小分子抑制剂，具体包括与HGF竞争性结合c-Met的生物拮抗剂NK1、NK2、NK4；中和HGF活性的抗HGF单克隆抗体AMG102、AV-299等，他们可与其他分子靶向药物发挥协同作用；可以阻断HGF与c-Met结合及抑制c-Met二聚化的抗c-Met单克隆抗体met-MAb、LY2875358等，临床研究显示此类药物能够延长c-Met阳性NSCLC患者的PFS及OS；非选择性c-Met小分子抑制剂主要有Crizotinib、Cabozantinib、Foretinib等，以及选择性c-Met小分子抑制剂有Tivantinib、AMG337、BMS-777607等。此外，c-Met抑制剂联合EGFR抑制剂用于NSCLC EGFR靶向治疗耐药的研究已经取得令人鼓舞的临床前成果，其临床试验成果也已在JCO、Lancet Oncology等深度报道。虽然已经有多种药物经FDA批准用于临床，但不加筛选的患者治疗使用导致以c-Met为分子靶点的靶向治疗总体有效率偏低。研究表明约40％的肺癌患者有c-Met的过表达，且表达水平在NSCLC细胞系中存在异质性。

由此可见，即使c-Met靶向药物在临床前研究中展示了非常有前景的NSCLC治疗效果，但由于缺乏有效筛选收益患者的方法，而使得c-Met靶向治疗整体疗效并不高。

3、c-Met分子成像研究现状及对于NSCLC诊疗的重要意义

目前c-Met异常活化的检测方法主要是分子病理以及血清学检查。分子病理学检查主要有1)免疫组化(IHC)、westren-blot，2)荧光原位杂交法(FISH)、实时荧光定量PCRTaqMan探针法，3)DNA直接测序。这些方法虽然因其准确性很高而被视作“金标准”，但分子病理检查作为有创检查其适用人群有限，无法反复取病理组织，且无法准确诊断异质性丰富的肿瘤，因此不能合理的制定和调整治疗方案；血清学检查因其简单、便捷、可重复性强而广泛用于肿瘤的初步筛查，但同时血清学检查敏感性较低、无法准确提供肿瘤位置信息、检查结果滞后于肿瘤进展，且检查结果与病理学检查存在一定差异。因此，亟需一种实时、在体、准确监测肿瘤c-Met异常表达状态的方法，以指导临床治疗方案的制定和调整。

分子成像技术借助靶向分子成像探针，对体内特异性的分子靶点进行在体、实时、动态、定性定量成像，将复杂的生物学过程变成直观的图像进行揭示。PET成像设备因其高灵敏度、高准确性、高稳定性及无创性等特点而被广泛应用于分子成像领域的研究。c-Met靶向分子成像可在体实时显示c-Met的表达水平、活化状态，对于存在c-Met表达肿瘤的早期检出、c-Met靶向治疗药物受益人群的筛选、抗肿瘤药物的疗效监测与评价、预后评估等有重要意义。但当前c-Met分子成像研究多是基于单克隆抗体或者荧光标记的分子探针。其不足之处明显，首先，单克隆抗体因其较大的分子量(>150KDa)在生物体内清除缓慢，半衰期可长达数周，且其免疫原性易造成较高的背景信号；其次，荧光标记的探针信号穿透能力较弱，只适于表浅器官，故难于临床转化。

鉴于c-Met靶向多肽(AH111972)具有非常高的c-Met受体亲和力(Kd<5nM)，本发明基于AH111972构建一种正电子核素⁶⁸Ga标记c-Met靶向分子探针，并通过PET全身成像(可获得较高分辨率，可以清晰分辨肿瘤区域)进行c-Met受体阳性表达肿瘤模型在体识别的临床前验证，对于c-Met高表达NSCLC的早期检出、c-Met靶向治疗药物收益人群的筛选、抗肿瘤药物的疗效监测与评价、预后评估等有重要意义，具有非常大的临床转化潜力。

发明内容：

本发明的目的之一是提供一种全新的放射性核素⁶⁸Ga标记的NSCLC c-Met靶向的PET成像示踪剂⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972及其制备方法与应用。

所述⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972是具有PET成像功能的多肽探针，是原多肽AH111972经赖氨酸和水溶性修饰后与linker连接，再经放射性核素标记而成，其结构中含有2-(2-(氨基甲氧基)乙氧基)乙酸(简称AEEA,可增加结构水溶性)结构，改善了原多肽的药代动力学特性，其结构式(I)如下：

(I)

其中，经过赖氨酸修饰的原多肽的结构式如式(Ⅱ)，再修饰水溶性并经Fomc保护后多肽结构式如式(Ⅲ)，修饰水溶性后多肽与双功能螯合剂(即linker，linker可为NOTA、DOTA、NODAGA等，本文以NOTA为例)连接结构式如式(Ⅳ)；

(Ⅱ)

(Ⅲ)

(Ⅳ)

本发明还提供制备所述多肽化合物即PET成像探针的方法，包括如下步骤：

1)将赖氨酸与靶向多肽AH111972以1-10:1-10的摩尔比混合，在N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和氯膦酸二乙酯(DECP)作用下，利用氨基缩合反应得到第一步产物，即经过赖氨酸修饰的AH111972；

2)步骤1)得到的第一步产物与2-(2-(氨基甲氧基)乙氧基)乙酸通过氨基缩合反应得到第二步产物并进行Fmoc保护，增加其水溶性；

3)将步骤2)得到的产物在20％哌啶DMF溶液条件下脱去保护基团Fmoc，得到第三步产物；

4)将步骤3)得到的第三步产物与linker在DIPEA条件下反应，得到产物四；

5)将步骤4)得到的产物四采用放射性核素标记；

进一步地，所述放射性核素包括但不限于⁶⁸Ga、⁶⁴Cu、⁸⁹Zr或¹⁸F；

优选地，所述所述放射性核素为⁶⁸Ga、⁶⁴Cu或¹⁸F；

更优选地，所述放射性核素为⁶⁸Ga；

进一步地，所述linker包括但不限于NOTA、DOTA或NODAGA；

所述放射性核素标记的方法为：将产物四溶于醋酸钠缓冲溶液或去离子水中；在所得溶液中加入放射性核素溶液，密封反应5-15min，冷却后，即生成所述的放射性核素标记的多肽配合物；

进一步地，所述放射性核素标记的方法为：将化合物(Ⅳ)溶于醋酸钠缓冲溶液或去离子水中；在其中加入新鲜淋洗的⁶⁸GaCl₃盐酸溶液，密闭60-90℃，反应5-15min，冷却后，将反应液通过事先活化好的C18固相萃取小柱，再用水冲C18柱子，除去未反应的⁶⁸Ga离子，再经50％乙醇溶液将产品从C18柱子洗脱，即得结构如(Ⅰ)所示的⁶⁸Ga标记的多肽产品，将乙醇浓度调至10％以下做成注射液。

本发明的目的之二是提供上述方法制备的多肽化合物，特别是示踪剂⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972在PET成像中的应用；

进一步地，是示踪剂⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972在作为c-Met分子靶向示踪剂中的应用；

特别是在测定高表达c-Met的NSCLC中的应用，该示踪剂可特异性结合NSCLC细胞膜上的c-Met受体，并可通过各种正电子核素检测设备定性、定量分析。

有益效果：

相较于其他c-Met分子靶向示踪剂，本发明所提供的探针采用短半衰期放射性核素⁶⁸Ga(T1/2～68min)标记，不但能减少不必要的放射性损伤，其体外成像设备PET还能提供高分辨率图像，且在此基础上进行了相应结构优化，以改善其药代动力学。

附图说明：

图1实施例1制备的⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972及中间产物结构式

其中，式I为⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972；式Ⅱ为经赖氨酸修饰的AH111972；式Ⅲ为经过赖氨酸修饰，再经AEEA修饰水溶性并经Fomc保护后的AH111972；式Ⅳ为AH111972经过赖氨酸修饰，再修饰水溶性后与双功能螯合剂连接的结构式；

图2不同c-Met表达水平的NSCLC裸鼠模型(Hcc827，H1299)注射本发明⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972探针后的PET/CT成像

其中，箭头所指为肿瘤区域，K指肾脏，B指膀胱。

具体实施方式：

为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

本发明所使用的原多肽AH111972氨基酸组成为：AGSCYCSGPPRFECWCYETEGT，AH111972已公开于Liu et al.Toward Operative In Vivo Fluorescence Imaging ofthe c-Met Proto-Oncogene for Personalization of Therapy in Ovarian Cancer[J].Cancer.2015(DOI:10.1002/cncr.29029)，可通过化学合成方法获得。

本发明所使用的缩写分别代表以下含义：

DIPEA：N，N-二异丙基乙胺；

DECP：氯膦酸二乙酯；

哌啶DMF：哌啶-二甲基甲酰胺。

以下将结合附图及编号对本发明做进一步的解释说明。

实施例1 ⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972及其制备

1)将赖氨酸与靶向多肽AH111972以2.5:1.5的摩尔比混合，溶于1mM DMF(二甲基甲酰胺)，在2.5当量N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和1.5当量氯膦酸二乙酯(DECP)作用下，利用氨基缩合反应得到第一步产物，即通过对AH111972进行赖氨酸修饰后的产物(Ⅱ)，如图1式Ⅱ；

2)步骤1)得到的第一步产物与2-(2-(氨基甲氧基)乙氧基)乙酸通过氨基缩合反应得到第二步产物并进行Fmoc保护，得到化合物(Ⅲ)，如图1式Ⅲ，增加其水溶性；

3)将步骤2)得到的化合物(Ⅲ)在20％哌啶DMF溶液条件下脱去保护基团Fmoc，得到第三步产物；

4)制备NOTA-AEEA-AH111972：将5mg第三步产物溶于200μL DMF中，加入与第三步产物摩尔比1:1的NOTA-NHS ester，然后加入DIPEA(N，N-二异丙基乙胺)5-10μL将pH调节至8.0～8.5，密封室温搅拌过夜，经HPLC分离纯化，收集目标产物的馏分，合并后冻干，经过质谱分析确认后得到NOTA-AEEA-AH111972(化合物(Ⅳ)，如图1式Ⅳ)。

上述的HPLC分离，第一流动相为0.1％三氟乙酸水溶液，第二流动相为0.1％三氟乙酸乙腈，梯度洗脱条件：0～10min，95-34％第一流动相；10～15min,34～5％第一流动相；15～17min，5～0％第一流动相；流动相的流速为1ml/min，检测波长为220nm。

MS，m/z：数字([M+H]+)

5)制备⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972：通过锗镓反生器，用0.05M HCl盐酸溶液淋洗得到925～1850MBq(25～50mCi)的⁶⁸GaCl₃盐酸溶液1ml。向1.5mlEP管中加入100μL 0.38mol/LpH＝3.5-4醋酸钠缓冲液溶解25μg的NOTA-AEEA-AH111972，然后加入925～1850MBq(25～50mCi)的⁶⁸GaCl₃盐酸溶液900μL。混合物摇匀后在65℃密闭反应15min，冷却至室温；

将以上反应液缓慢注入事先活化的Sep-Pak C18light柱，再用20ml去离子水除去未反应的⁶⁸Ga离子及水溶性杂质，吹干后用500μL的50％乙醇水溶液淋洗，即得结构如(Ⅰ)(如图1式Ⅰ)所示的⁶⁸Ga标记的多肽产品，淋洗液用生理盐水稀释至乙醇含量小于10％，用放射性HPLC测定其放化纯度，观察其外观性状为无色澄清透明液体。经衰变校正，探针⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972合成产率>80％，放化纯度>90％。

实施例2探针⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972的在体靶向验证

在体靶向验证实验选用高表达c-Met的NSCLC细胞系Hcc827和无表达c-Met的NSCLC细胞系H1299建立裸鼠肿瘤模型(BALB/c雌鼠，5周龄，约20g，2×10⁶细胞数皮下右肩部种植，待4周左右后肿瘤体积约300mm³进行在体成像实验)，经鼠尾注射⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972探针溶液后(5MBq～7.2MBq)，在异氟烷-氧气麻醉情况下进行1h和2h的PET/CT扫描(Discovery 790Elite，GE healthcare)，扫描时长5min，图像后处理平台AW4.6软件(GEHealthcare)。

成像结果如图2所示，Hcc827肿瘤摄取探针明显高于本底，并显著高于H1299，表明探针⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972可特异性识别高表达c-Met的NSCLC肿瘤模型，且从全身图像可观察到较高分辨率的肿瘤位置。

图像量化分析结果显示在1h时间点，Hcc827肿瘤摄取探针与对侧生理区域摄取的比值为2.9±0.76，而H1299肿瘤摄取探针与对侧生理区域摄取的比值仅为1.3±0.45，明显低于Hcc827(P<0.01)，进一步表明可特异性摄取探针⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972可特异性积聚于高表达c-Met的Hcc827，而无表达c-Met的H1299则没有明显探针摄取，证明了探针的在体靶向性能优异。

PET扫描图像结果可见肾脏和膀胱活度非常高，在1h和2h时间点膀胱和肾脏活度之和占全身活度之比超过86％，表明该探针主要通过泌尿系统排出体外。该探针快速的清除半衰期(<1h)和⁶⁸Ga的短半衰期(t_1/2＝68)有机结合可快速而精准的达到诊断NSCLC的目的。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。

Claims

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物为⁶⁸Ga-NOTA-AEEA-AH111972，结构式如式(I)：

2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物是原多肽AH111972经赖氨酸修饰后，再经AEEA修饰水溶性后与linker-NOTA连接，最后经放射性核素⁶⁸Ga标记而成，其中，经过赖氨酸修饰的原多肽的结构如式(Ⅱ)，再修饰水溶性并经Fomc保护后多肽结构如式(Ⅲ)，修饰水溶性后多肽与linker连接结构如式(Ⅳ)：

3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于，其中的放射性核素还可以是⁶⁴Cu、⁸⁹Zr或¹⁸F。

4.如权利要1-3任意一项所述的化合物，其特征在于，其中的linker还可以是DOTA、NODAGA。

5.权利要求1-4任意一项所述化合物的制备方法，其特征在于，具体如下：

1)将赖氨酸与靶向多肽AH111972以1-10:1-10的摩尔比混合，在N，N-二异丙基乙胺(DIPEA)和氯膦酸二乙酯(DECP)作用下，利用氨基缩合反应得到第一步产物，即通过对AH111972进行赖氨酸修饰后的产物；

2)步骤1)得到的第一步产物与2-(2-(氨基甲氧基)乙氧基)乙酸结构通过氨基缩合反应得到第二步产物并进行Fmoc保护；

3)将步骤2)得到产物脱去保护基团Fmoc，得到第三步产物；

5)将步骤4)得到的产物采用放射性核素标记。

6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述放射性核素标记的方法为：将化合物(Ⅳ)溶于醋酸钠缓冲溶液或去离子水中；在其中加入新鲜淋洗的⁶⁸GaCl₃盐酸溶液，密闭60-90℃，反应5-15min，冷却后，将反应液通过事先活化好的C18固相萃取小柱，再用水冲C18柱子，除去未反应的⁶⁸Ga离子，再经50％乙醇溶液将产品从C18柱子洗脱，即得结构如(Ⅰ)所示的⁶⁸Ga标记的多肽产品。

7.用于诊断、治疗和/或预防疾病的组合物或试剂盒，其包含权利要求1-4任意一项所述的化合物。

8.权利要求1-4任意一项所述化合物在制备用于诊断、治疗和/或预防疾病的组合物中的用途。

9.权利要求1-4任意一项所述化合物在制备PET成像探针中的应用。

10.权利要求1-4任意一项所述化合物在作为c-Met分子靶向示踪剂中的应用。