CN105579434A - 基于乙烯基砜的18f标记组合物和方法及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种巯基选择性放射性标记试剂，具有下列通式：*R-L-VS，其中所述*R是放射性同位素，L是连接基团，以及VS代表乙烯基砜官能团，其中所述标记试剂能够共价结合至含巯基生物分子，例如蛋白质或肽。也公开了所述标记试剂用于标记神经降压素和其变体的用途。

Description

基于乙烯基砜的18F标记组合物和方法及其用途
技术领域
本发明涉及正电子发射断层扫描(PET)成像的领域。更具体地，本发明涉及用于PET成像的示踪剂以及制备所述示踪剂的方法。
背景技术
由于其物理和核特性，正电子发射体氟-18是用于制备标记生物活性肽和小蛋白质的低分子量放射性示踪剂和放射性药物的理想的放射性核素。氟-18衰变具有高正电子丰度(99％)。与碳-11、氧-15和氮-13相比，氟-18的最低正电子发射能量(最大635keV)和在组织中的最短正电子线性范围(2.3mm)提供了PET成像的最高分辨率。其相对较长的半衰期(109.8分钟)使得可以进行多步合成方法、在几个小时内的延长的成像方案、动力学研究和代谢产物分析。
几乎所有的现有技术的氟-18标记试剂被设计为通过氨基官能团偶联到肽或蛋白质。例如，活化酯4-[18F]氟苯甲酸N-琥珀酰亚胺基酯(18F-SFB)是最流行的用于引入辅基来标记肽和蛋白质的试剂之一，这通过酰化反应实现(2-4)。除了18F-SFB，18F-标记的羧酸和氨基试剂也是已知的。然而，它们主要用于与在所关注的生物材料中的氨基和羧酸基团的偶联相结合(5-10)，而不是用于PET探针设计和合成。这些现有技术的18F-标记试剂的一个主要缺点是，氨基和羧基官能团是在蛋白质中普遍存在的，因此，没有可能对其选择性标记。
考虑到上述情况，仍然需要一种能够选择性标记所关注的蛋白质或肽的新的标记方法和试剂。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种对可用作PET示踪剂的化合物进行放射标记的化学选择性方法。
本发明的另一个目的是提供新颖的PET示踪剂，其在PET成像中具有令人满意的生理特性。
考虑本发明的目的，本领域熟知在大多数肽和蛋白质中游离巯基基团不如氨基和羧酸一样普遍。因此，巯基反应性试剂已被用来在特定位点修饰肽和蛋白质，从而提供比羧酸和胺反应性试剂更高的化学选择性的一个手段。1989年，Shiue等率先开发使用18F-标记的N-取代马来酰亚胺作为Michael受体的巯基反应试剂。合成了N-(对18F氟苯基)马来酰亚胺和间马来酰亚胺基-N-(对18F氟苄基)苯甲酰胺(11)用于在半胱氨酸位点处的Fab蛋白(来白兔IgG)标记。在这一研究之后，报道了三种基于作为巯基选择性试剂的18F标记的N-取代马来酰亚胺的新方法。2003年，Toyokuni等人开发了作为巯基选择性试剂的N-[4-[(4-18F氟亚苄基)氨基氧]丁基]马来酰亚胺(18F-FBABM)(12)(图1A)。在10分钟内于室温，在不优化反应条件的情况下，含巯基的三肽谷胱甘肽与18F-FBABM偶联，得到约70％的经衰变校正的放射化学产率(RCY)。2005年，deBruin等报道了另一种18F-马来酰亚胺试剂1-[3-(2-(18F氟吡啶-3-基氧基)丙基)吡咯-2，5-二酮(18F-FpyME)(图1B)。18F-FpyME(13)通过三个连续步骤合成，以[3-(3-Boc氨基丙氧基)吡啶-2-基]三甲基三氟甲磺酸铵为起始物。总反应时间在110分钟内，经衰变校正的放射化学产率为28％至37％。该巯基反应剂用于标记两种8kDa的含巯基蛋白质，得到60％至70％的分离产率(未经衰变校正)。2006年，Cai等合成了N-[2-(4-18F氟苯甲酰氨基)乙基]马来酰亚胺(18F-FBEM)(图1C)。通过18F-SFB与N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺偶合获得了18F-FBEM(14)。HPLC纯化后，使巯基反应剂与含巯基RGD肽的单体和二聚物在室温反应20分钟，RGD单体和二聚体总的经衰变校正RCY为20±4％(n＝5)。
尽管上述现有技术中的巯基反应性标记试剂取得了初步成功，但是多步标记反应、复杂的程序和相对低的产率限制了这些试剂应用。因此，现有技术的放射性标记的巯基反应性试剂仍有许多不足之处。
为了克服现有技术的上述困难，本发明的发明人发明了涉及新的试剂类型的放射标记巯基反应剂和用于制造该试剂的方法的新途径。
本发明的一个方面是一种18F标记方法，其用于对存在或被引入到肽或蛋白的游离巯基进行位点特异性标记。使用这种新方法合成了一种NTR1靶向PET成像剂，其表现出特定的肿瘤摄取和优越的肿瘤对背景的对比度。提高的肿瘤相比主要器官的摄取率(包括肿瘤/肾)产生了在注射后的较早时间点的高对比度图像。在正常组织中非常低的背景应使得可以通过PET成像18F-DEG-VS-NT进行非常小的肿瘤的检测(特别是在腹部区域)。
因此，本发明的一个方面涉及一类新的能够化学选择性标记靶化合物的放射性标记试剂。根据本发明的该方面的放射性标记试剂通常包括乙烯基砜官能团和放射性标记同位素，通式为*R-L-VS，其中*R是放射性同位素，L为连接基团，且VS代表乙烯基砜官能团。
*R放射性同位素可以是任何在本领域中公知的合适的放射性同位素。示例性放射性同位素可以是I、C、F、Br，但不限于此。在一个优选的实施方式中，放射性同位素是18F。此优选实施方式在本文中也称为18F乙烯基砜或18F-VS。
该连接基团L可以是任何具有可以容纳乙烯基砜官能团和R*放射标记的官能部分的合适的分子骨架。示例性连接基团可以选自芳族、脂族、PEG、含有杂原子的连接基团，但不限于此。
本发明的另一个方面涉及一种用放射性标记来选择性地标记蛋白质或肽的方法。根据本发明的这一方面的方法通常包括将如上所述的乙烯基砜放射性标记试剂连接至靶蛋白质或肽的步骤。在一些实施方式中，提供或合成放射性标记试剂的步骤可以在连接步骤前不久进行。本领域技术人员熟知，提供或合成步骤之前的时段受到所使用的特定*R标记的半衰期的限制。在放射性标记具有较短的可用半衰期时，合成和连接*R-VS标记试剂至靶蛋白/肽以及它们的最终应用之间的时间间隔较短。在这种情况下，放射性基团的连接必须在使用标记的蛋白质/肽前很短的时间内发生，这需要当场执行所述标记方法的系统。在其它情况下，当*R标记的半衰期长时，则靶蛋白质/肽的标记可以在大规模生产环境下非现场进行，将得到的标记的蛋白质/肽以封装的形式递送。
上述适用于被乙烯基砜标记试剂标记的蛋白质和肽一般包括至少一个半胱氨酸残基或游离硫反应性官能团，其能够与标记物的乙烯基砜基团反应以形成稳定的连接。在一些实施方式中，通过一个共价硫酯键形成连接。在其他实施方式中，可以通过非共价连接进行连接。优选地，靶蛋白质/肽具有介于1至10个游离巯基反应性基团和/或半胱氨酸残基。更优选地，所述靶蛋白质/肽还具有生物功能，如酶底物或涉及某些致病途径的结构成分。在一个优选的实施方式中，靶蛋白质/肽是神经降压素或其变体、或巯基化神经降压素变体、其他经稳定化的神经降压素、多聚体神经降压素、与其他配体的杂聚体神经降压素。在一个更优选的实施方式中，标记放射性同位素是18F。最优选地，所述放射性标记试剂是18F-DEG-VS，而所靶向的肽是神经降压素(即18F-DEG-VS-NT)。这种放射性标记的蛋白质或肽可以在成像技术如正电子发射断层扫描(PET)中用作示踪剂。
本发明的另一个方面涉及利用如上所述的本发明的新颖的示踪剂进行PET成像的方法。
根据本发明的这个方面的方法一般包括：给受试者施用有效量的18F-VS示标记踪化合物的步骤；以及使用PET成像仪器对受试者在所关注位置进行成像的步骤。
施用示踪化合物的方法通常是本领域已知的，其可包括但不限于静脉注射、口服施用或其他本领域已知的方式。
18F乙烯基砜至少具有下列优于18F标记马来酰亚胺的优点：1)一步法18F-氟化前体，以得到18F乙烯基砜；2)用乙烯基砜与巯基的反应的产物得到了单一立体异构体的结构，这不同于会产生两种可能的立体异构体的与马来酰亚胺的偶联；和3)这些乙烯基砜基团在溶液中是长时间稳定的，因为它们在中性pH不水解(15)。因此，即使在水性缓冲液条件下使用，它们保留优秀与含巯基的蛋白质或其他分子偶联的潜力。
本发明的再一个方面是涉及通过利用上述的放射性示踪剂对生物或生理过程进行成像的系统和装置。图7示出根据本发明的这个方面的系统/装置的示例性示意图。按照本发明的这一方面的实施方式可以包括它们的传统的自动化或半自动化盒、微波反应器或微流控反应器或者它们的等同物。
本发明的其它特征、目的以及优点将通过说明书和附图以及由所附的权利要求变得显而易见。
附图说明
图1示出了根据本发明实施方式的18F-标记化合物的示例性合成方案和HPLC图。(A)F-DEG-VS的合成方案；(B)18F-DEG-VS粗反应的的HPLC图谱；(C)富集18F-DEG-VS的HPLC图谱。
图2.(A)F-DEG-VS-c(RGDyC)和F-DEG-VS-c(RGDyK)的化学结构；(B)放射性-HPLC(UV)上的19F-DEG-VS-c(RGDyC)、19F-DEG-VS-c(RGDyK)、18F-DEG-VS与c(RGDyC)/c(RGDyK)(放射)的粗反应以及19F-DEG-VS-c(RGDyC)标准物的HPLC图谱。
图3示出了根据本发明实施方式的示例性放射合成方案。(A)18F-DEG-VS-NT放射合成方案。(B)19F-DEG-VS和NT的粗反应的HPLC图；(C)18F-DEG-VS-NT(放射性)19F-DEG-VS-NT(UV)和(19F-DEG-VS)2-NT(UV)的HPLC图谱。
图4显示了按照本发明的实施方式的竞争性结合测试的示例性结果。125I-NT(8-13)和19F-DEG-VS-NT或NT(8-13)在HT-29细胞中的竞争性结合测试。数据为平均值±SE(n＝3)。X轴反映了非放射性标记竞争物的浓度。19F-DEG-VS-NT和NT(8-13)的IC50值分别为2.03±0.22nmol/L和2.12±0.26nmol/L。
图5.(A)携带HT-29异种移植体的小鼠在注射3.7MBq的不带未经放射标记NT(8-13)的18F-DEG-VS-NT(上图)或带未经放射标记NT(8-13)的18F-DEG-VS-NT(中图)之后以及在注射3.7MBq的18F-FBEM-NT(下图)之后的代表性冠状显微PET图像；(B)在携带HT-29异种移植体的小鼠中在注射后(p.i.)2小时的18F-DEG-VS-NT生物分布。
图6示出18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT在尿、肿瘤、肾和肝中的代谢稳定性。18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT的保留时间分别为18.5分钟和19.0分钟。
图7示出在根据本发明的该方面的系统/装置的示例性示意图。
图8.18F-DEG-VS-NT于37C在1×PBS中温育5小时后的放射HPLC示踪。
图9.18F-DEG-VS-(Ac)-NT的放射合成方案和相应的放射HPLC示踪。
图10.18F-DEG-VS-c(RGDyC)标准物和在尿中的代谢稳定性的放射性HPLC图谱。
图11.(A)18F-FBEM的放射合成方案；(B)18F-FBEM-c(RGDyC)和18F-FBEM-NT的化学结构。
图12.18F-FBEM-c(RGDyC)标准物和在尿中的代谢稳定性的放射性HPLC图谱。
图13.(A)注射18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后2小时的携带HT-29肿瘤的小鼠的二维投影显微PET图像(箭头表示HT29肿瘤)；(B)注射18F-DEG-VS-NT和18FBEM-NT后的肿瘤、肾、肝、肌肉的时间活性曲线。
具体实施方式
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员能通常理解的相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文本(包括定义)为准。在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以整体并入本文。本文公开的材料、方法和实例只是说明性的，并不旨在进行限制。
如本文所用，术语“氨基酸”是D或L形式的天然氨基酸残基(例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)，以及具有一个或多个开放价的非天然氨基酸(例如，磷酸丝氨酸；磷酸苏氨酸；磷酸酪氨酸；羟脯氨酸；γ-羧基谷氨酸；马尿酸；八氢吲哚-2-羧酸；抑胃酶氨酸；1，2，3，4-四氢异喹啉-3-甲酸；青霉胺：鸟氨酸；瓜氨酸；α-甲基丙氨酸；对苯甲酰基苯丙氨酸；苯基甘氨酸；炔丙基甘氨酸；肌氨酸；和叔丁基甘氨酸)残基。该术语还包括携带有氨基保护基(例如乙酰基、酰基、三氟乙酰基或苄氧基羰基)的天然和非天然氨基酸，以及在羧基处被保护基团保护(例如，保护为(C1-C6)烷基酯或酰胺、苯基酯或酰胺或者苄基酯或酰胺)的天然和非天然氨基酸。其他合适的氨基和羧基保护基团也是本领域技术人员已知的(例如，参见T.W.Greene，ProtectingGroupsInOrganicSynthesis；Wiley：NewYork，1981；D.Voet，Biochemistry，Wiley：NewYork，1990；LStryer，Biochemistry，(3rdEd.)，WH.FreemanandCo：NewYork，1975；J.March，AdvancedOrganicChemistry，Reactions，MechanismsandStructure，(2ndEd.)，McGrawHill：NewYork，1977；F.CareyandR.Sundberg，AdvancedOrganicChemistry，PartB：ReactionsandSynthesis，(2ndEd.)，Plenum：NewYork，1977；以及其中引用的参考文献)。根据本发明，氨基或羧基保护基团也可包括放射性核素(例如，氟-18、碘-123或碘-124)。
如本文所用，术语“肽”是2至25个氨基酸(例如如上文所定义)的序列，或具有一个或多个开放价的肽残基。该序列可以是线性的或环状的。例如，环肽可以通过在序列中的两个半胱氨酸残基之间形成二硫键来制备或产生。肽可通过羧基末端、氨基末端或通过任何其它方便的连接点被连接，例如，通过半胱氨酸的硫。肽衍生物可如美国专利4612302号、4853371号和4684620号中的公开来制备。本文具体记载的肽序列以氨基末端位于左侧而羧基末端位于右侧进行书写。
术语“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基单链所构成的生物聚合物化合物。如本文所用的术语“蛋白质”可以是“多肽”同义的术语，或还可以指两种或多种多肽的复合物。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可包含非肽组分，例如糖基。糖和其他非肽类取代基可以通过产生所述蛋白的细胞来加入到蛋白质，并且随着细胞的类型而不同。本文所定义的蛋白质是指其氨基酸骨架结构；如糖基等取代基通常不指定，但仍然可以存在。
术语“同源性％”在本文中可与术语“同一性％”互换使用，指的是当使用序列比对程序比对时，两条以上的被比对序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。例如，70％同源性是指通过定义的算法确定为70％的序列同一性，相应地，给定的序列的同源物在给定序列的长度上具有大于80％序列同一性。序列同一性的示例性水平包括但不限于，80％、85％、90％或95％以上的与本文所述的给定序列(例如，乳铁蛋白的编码序列)的序列同一性。
如本文所用的术语“适体”是指结合到一个特定的目标分子的寡核酸分子或寡肽分子，例如RNA适体或DNA适体，包括特异性结合至靶分子的单链寡核苷酸。
如本文所用，术语“寡核苷酸”是指长度较短的单链多核苷酸链。寡核苷酸通常长度小于200个残基(例如，15至100)，然而，如本文所用，该术语还包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸通常以其长度来指称。例如，24残基的寡核苷酸被称作“24聚体(24-mer)”。寡核苷酸可以通过自杂交或通过与其它多核苷酸杂交而形成二级和三级结构。这样的结构可以包括但不限于双链体、发夹、十字形、弯折和三链体。
本文所用的术语“烷基”是指C1-C10的直链或支链烷基，例如，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、新戊基、叔戊基等。
术语“烯基”是指具有至少一个碳碳双键的支链或非支链烃。术语“C2-7烯基”是指具有2～7个碳原子并含有至少一个碳碳双键的烃。
本文所用的术语“芳基”表示单环或稠环芳烃。芳基的实例有苯基和萘基等。
本文所用的术语“杂芳基”是指5至6元芳族杂环基，其在环中含有选自氮、氧和硫原子组成的组的一个或多个杂原子，并且可以与碳环或其它杂环在任何可能的位置稠合。
本文中的术语“环烷基”指的是C3～C8环烷基，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基等。
本发明的一个方面涉及一类新的能够对靶化合物进行化学选择性标记的放射性标记试剂。根据本发明的该方面的放射性标记试剂通常包括乙烯基砜官能团和放射性标记同位素，并且可以示意性地表示为具有下列通式：
*R-L-VS
其中*R是放射性同位素，L是连接基团，且VS代表乙烯基砜官能团。
*R放射性同位素可以是任何本领域中已知的合适的放射性同位素，优选在与医疗成像应用相关放射性同位素。示例性放射性同位素包括但不限于I、C、F、Br的放射同位素。在优选的实施方式中，放射性同位素是18F。该优选实施例在本文中也称为18F乙烯基砜或18F-VS。
该连接基团L可以是任何具有可以容纳乙烯基砜官能团和R*放射标记的官能团的合适的分子骨架。示例性连接基团可以选自芳族、脂族、聚乙烯醇(PEG)、含有杂原子的连接基团，但不限于此。
在一个优选实施方式中，连接基团基于具有以下通式的PEG：
其中n是1至20，优选1至10，且更优选1至5。
可用作与本发明相关的连接基团的PEG的具体实例是
和
二乙二醇在本文称作DEG。
当用在连接基团中时，PEG化合物可以经修饰而包含可以被选择性放射性标记的官能团LG，其具有以下通式：
其中LG是可被放射性同位素、优选18F选择性取代的官能团，并且
其中n是1至20，优选1至10，且更优选1至5。
例如，所选择的PEG可以与4-硝基苯磺酰氯反应，以提供以下通式的4-硝基苯磺酸酯：
其中n是1至20，优选1至10，且更优选1至5。虽然此处所选择的官能团LG是4-硝基苯磺酰基，但官能团LG1没有特别限制，并且可以利用本文公开所指示根据所选连接基团和放射性标记进行选择。
结合本发明有用的合适的乙烯基砜具有通式结构：
其中R1、R2和R3独立地选自H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组。此外，R1和R2可任选被取代，以形成一个C3-C8的环状不饱和环。所选的烷基、环烷基、芳基和杂芳基可任选地具有取代基。R4选自烯基、芳基、杂芳基组成的组，其各自可以任选地具有取代基。此外，R4和R3可以任选地具有取代基，以产生具有3至8元环的硫代杂环体系。
在一个优选的实施方式中，乙烯基砜具有以下结构：
且更优选为：
其中R1、R2和R3独立地选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组。此外，R1和R2可任选地具有取代基，以形成一个C3-C8的环状不饱和环，且
R5、R6独立地选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组。另外，R5和R6可以任选地具有取代基。
更具体地，优选的乙烯基砜具有以下结构：
其他根据本发明有用的示例性的乙烯基砜包括：
然后，可以与通常包括官能团LG1的连接体偶联以形成L-VS偶联物。L-VS偶联物的优选实施方式具有以下通式：
或在一个优选实施方式中，
或
其中LG是可以被放射性同位素、优选18F选择性取代的官能团，并且
其中n是1至20，优选1至10，更优选1至5，
R1、R2和R3独立地选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组。此外，R1和R3可任选地具有取代基，以形成C3-C8环状不饱和的环。所选的烷基、环烷基、芳基和杂芳基可任选地具有取代基，且R5、R6独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组。另外，R5和R6可以任选地具有取代基。
L-VS偶联物随后可以被放射性标记，以得到具有以下通式的组合物：
其中，*R是放射性同位素，
n是1至20，优选1至10，更优选1至5。
R1、R2和R3独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组。此外，R1和R3可任选地具有取代基以形成C3-C8环状不饱和的环，且所选的烷基、环烷基、芳基和杂芳基可任选地具有取代基，且R5、R6独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组。另外，R5和R6可以任选地具有取代基。
在优选实施方式中，R5和R6是氢。
在另一个优选的实施方式中，R1、R2、R3、R5和R6均为氢。
更优选地，L-VS偶联物具有以下通式：
其中，*R是放射性同位素，并且
n是1至20，优选1至10，更优选1至5。
本发明的另一个方面涉及用于选择性地标记生物分子A的方法(如用放射性标记来标记蛋白质或多肽)以及所得的放射性标记的生物分子。所得的放射性标记的生物分子的一般结构可以示意性地由通式表示：
*R-L-VS-A，
其中*R、L和VS如上定义，并且A选自由蛋白质、多肽、适体、DNA寡核苷酸和其它配体组成的组。合适的蛋白质、多肽、适体、DNA寡核苷酸或配体通常包括或经修饰以包括能够与标记的乙烯基砜基团反应以形成稳定连接的至少一个半胱氨酸残基或游离巯基反应性官能团。在一些实施方式中，通过形成共价硫酯键来连接。在其他实施方式中，连接可以是通过非共价连接。优选地，生物分子A、优选蛋白质或肽具有1至10个游离巯基反应性基团和/或半胱氨酸残基。更优选的是，靶蛋白质/肽还具有生物功能，如酶底物或参与某些致病途径的结构元件。
在一个优选的实施方式中，靶蛋白质/肽是神经降压素或其变体、或巯基化神经降压素变体、其他经稳定化的神经降压素、多聚神经降压素、与其他配体的杂聚神经降压素。神经降压素(neurotensin)是一种13个氨基酸的神经肽。人类神经降压素具有氨基酸序列QLYENKPRRPYIL。已发现识别相同的C-末端的G蛋白偶联受体会识别8-13位六肽序列Arg(8)-Arg(9)-Pro(10)-Tyr(11)-ILE-(12)-Leu(13)。本发明的神经降压素的变体通常包括该8-13位六肽序列或其变体，该变体包括半胱氨酸残基或巯基或被修饰以包括半胱氨酸/巯基残基。一个优选的神经降压素类似物为Cys-pipGly-Pro-pipAmGly-Arg-Pro-Tyr-tBuGly-Leu-OH。神经降压素类似物的确切序列没有特别的限制，只要它保持足够神经降压素活性并且包含或经修饰而包含至少一个半胱氨酸残基或其它含巯基基团。优选地，排除任何外添的半胱氨酸残基，神经降压素类似物与所述8-13位六肽序列Arg(8)-Arg(9)-Pro(10)-Tyr(11)-ILE-(12)-Leu(13)至少50％同源。
在一个优选的实施方式中，*R-PEG-VS-A化合物包括具有下式的结构：
其中，*R是放射性同位素，
R5、R6、R8、R9可独立地选自由H、烷基、环烷基卤和芳基组成的组，其各自可任选地具有取代基，
A1选自由蛋白质、多肽、适体、DNA寡核苷酸和配体组成的组；
A2选自由H、蛋白质、多肽、适体、DNA寡核苷酸和配体组成的组，并且
其中，A1和A2一起可以任选形成多肽或环状多肽。
在优选实施方式中，标记放射性同位素*R是18F，R5、R6、R8、R9均为氢，A2和A1一起为神经降压素或神经降压素变体。
更优选地，所述放射性标记试剂是18F-DEG-VS，并且靶向的肽是神经降压素(即18F-DEG-VS-NT)。这种放射性标记的蛋白质或肽可以用作成像技术如正电子发射断层扫描(PET)等中的示踪剂。
根据本发明的这一方面的方法通常包括连接靶蛋白质或肽与如上所述的乙烯基砜放射性标记试剂的步骤。在一些实施方式中，提供或合成的放射性标记试剂的步骤可以在所述连接步骤之前的很短时间内进行。本领域技术人员熟知，提供或合成步骤之前的时段受到所使用的特定*R标记的半衰期的限制。放射性标记具有较短的可用半衰期时，在*R-VS标记试剂与靶蛋白/肽的合成和连接与它们的最终应用之间的时间间隔可能较短。在这种情况下，连接放射性基团必须在使用标记的蛋白质/肽前很短的时间内发生，这需要当场进行所述标记方法的系统。在其它情况下，当*R标记的半衰期长时，则靶蛋白质/肽的标记可以在大规模生产环境非现场进行，将得到的标记的蛋白质/肽以封装的形式递送。
本发明的另一个方面涉及利用如上所述的本发明的新颖的示踪剂进行PET成像的方法。
根据本发明的该方面的方法一般包括向受试者施用有效量的18F-VS标记的示踪剂化合物的步骤；以及使用PET成像仪器对受试者在所关注位置进行成像的步骤。
施用示踪化合物的方法是本领域公知的，其可包括但不限于静脉注射、口服施用或其他本领域已知的方式。
18F乙烯基砜至少具有下列优于18F标记马来酰亚胺的优点：1)一步法18F-氟化前体，以得到18F乙烯基砜；2)用乙烯基砜与巯基的反应的产物得到了单一立体异构体的结构，这不同于会产生两种可能的立体异构体的与马来酰亚胺的偶联；和3)这些乙烯基砜基团在溶液中是长时间稳定的，因为它们在中性pH不水解(15)。因此，即使在水性缓冲液条件下使用，它们保留优秀与含巯基的蛋白质或其他分子偶联的潜力。
本发明的再一个方面涉及通过利用上述的放射性示踪剂对生物或生理过程进行成像的系统和装置。图7示出在根据本发明的这个方面的系统/装置的示例性示意图。按照本发明的这一方面的实施方式可以包括它们的传统的自动化或半自动化盒、微波反应器或微流控反应器，或者它们的等同物。
某些结果的简要说明
化学合成
如图1中所示，以＞95％产率合成了F-DEG-VS前体[2-(2-(2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)乙氧基)乙基4-硝基苯磺酸酯(2)]，且通过与TBAF反应进行19F-氟化。19F-DEG-VS被用作18F-DEG-VS偶联物的反应条件和HPLC位置的化学标准物。
首先评估19F-DEG-VS和cRGDyC肽(具有游离SH基)以及cRGDyK肽(具有自游离NH2基)的冷反应(参见图2A)。cRGDyC和cRGDyK均与19F-DEG-VS反应，然而，cRGDyK只在pH高于8.5过夜温育后反应，相比之下，在pH7.0和30分钟温育的条件下cRGDyC即反应(图2B)。
巯基化NT也充分地与19F-DEG-VS反应。然而，由于其与本发明的NT类似物中存在的一个巯基和一个氨基反应，当在高pH(例如，pH9.0)进行反应时获得两种产品[19F-DEG-VS-NT和(19F-DEG-VS)2-NT](图3A和3B)。
放射化学
将VS-合成子的18F标记在各种溶剂、浓度和温度条件下进行测试。代表性的结果示于表1。装载10毫克的前体，基于HPLC积分计算出的18F-DEG-VS放射性标记产率为90％产率。进一步增加前体装载量仅使产率略增加至95％(见表1)。粗标记反应的代表性放射HPLC示踪示于图1B。18F-DEG-VS表现出良好的体外稳定性，并且在PBS中温育后，在HPLC纯化后4小时，放射化学纯度仍超过99％(图2C)。
对于18F反应，在相同的反应器中使等摩尔量的cRGDyC和cRGDyK与18F-DEG-VS温育。在这种情况下，只能观察到来自cRGDyC和18F-DEG-VS的产物(图2B)。没有来自cRGDyK/18F-DEG-VS产物证实了该反应针对巯基相对于氨基的选择性。因此，即使在高pH，18F-DEG-VS在游离氨基存在下选择性地标记巯基。
18F-DEG-VS也有效地与巯基化NT反应。19F-合成中所见的(F-DEG-VS)2-NT副产物在放射性标记反应中未观察到，如HLPC所示(图3C)。在PBS中温育后，在HPLC纯化后5小时，18F-DEG-VS-NT的放射化学纯度仍大于95％。为了比较18F-DEG-VS与巯基特异性马来酰亚胺类试剂，还制备了18F-FBEM，据显示其分别与c(RGDyC)和巯基化NT有效地反应(图11)。
体外细胞结合亲和力
使用竞争性细胞结合检测比较了19F-DEG-VS-NT与NT(8-13)的受体结合亲和性(图4)。两种肽均以剂量依赖的方式抑制了125I-NT(8-13)结合到NTR1阳性HT-29细胞。比较了19F-DEG-VS-NT的IC50值(2.03±0.22nmol/L)和NT(8-13)的IC50值(2.12±0.26nmol/L)。结果清楚地表明，F-DEG-VS-NT对NTR1有与NT(8-13)类似的体外受体结合亲和力。
生物分布和显微PET成像
在HT-29异种移植物(NTR1阳性)中的18F-DEG-VS-NT靶向神经降压素受体1(NTR1)的功效在多个时间点(注射后0.5、1和2小时)用显微PET进行评价。如图5A所示。对于18F-DEG-VS-NT，HT-29肿瘤在高的肿瘤对背景对比度下清晰可见，且肿瘤摄取在注射后0.5、1和2小时分别为130±0.17％ID/g、0.96±0.29％ID/g和0.63±0.20％ID/g。相比较而言，18F-FBEM-NT也显示出明显的在肿瘤中的摄取(0.13±0.08％ID/g)，但在注射后2小时显著低于18F-DEG-VS-NT的观察值(p＝0.017)。18F-FBEM-NT在注射后2小时的肝和肾摄取分别为0.28±0.03％ID/g和0.64±0.02％ID/g。相较于18F-FBEM-NT，18F-DEG-VS-NT显示出优良的肿瘤对背景的对比度和低的腹部背景(图13)。
18F-DEG-VS-NT的NTR1特异性通过阻断实验确认，其中放射示踪剂与过量未标记的NT(8-13)共注射。从图5A中可以看出，在未标记的NT(8-13)存在时的NTR1肿瘤摄取(在注射后0.5、1和2小时分别为0.47％ID/g、0.15％ID/g和0.04％ID/g)在所有时间点均显著低于没有NT(8-13)阻断的情形(p＜0.01)。肾摄取从注射后0.5小时的6.82±2.90％ID/g迅速下降到注射后2小时的0.17±0.01％ID/g。基于成像分析，肿瘤与肾之比、肿瘤与肝之比和肿瘤与肌肉之比在注射后2小时分别为3.69±1.50、10.33±4.01和27.12±5.46。在注射后2小时，肿瘤表现出比肾、肝和肌肉中显著更高的摄取。包括心脏和肺的其他器官在注射后2小时基本为背景水平。
除了显微PET研究，发明人还使用携带HT-29肿瘤的小鼠的单独组在注射18F-DEG-VS-NT后2小时进行了生物分布研究。如图5B所示。肿瘤和肾摄取为0.86±0.09％ID/g和0.46±0.05％ID/g。在注射后2小时，肿瘤表现出比在肾、肝和肌肉中显著更高的摄取(图5B)。包括心脏和肺的其他器官在注射后2小时基本为背景水平。
代谢稳定性研究
在注射后1小时在小鼠尿中以及在肝脏、肾脏和HT-29肿瘤匀浆物中测定18F-DEG-VS-NT的代谢稳定性。HPLC的色谱图示于图6中。无损18F-DEG-VS-NT的保留时间为18.50分钟。对于肿瘤在约20分钟处发现主代谢物峰，而对于尿液、肾脏和肝脏样本在13至15分钟和17分钟发现了两个主代谢物峰。整个研究过程中没有观察到显著脱氟。对18F-FBEM-NT的代谢稳定性也进行了研究。无损18F-FBEM-NT的保留时间为19.02分钟。除了15至21分钟之间的多个峰，对于肿瘤、肾和肝在约5分钟处发现了主要峰。发明人还合成了18F-DEG-VS-c(RGDyC)和18F-FBEM-c(RGDyC)，并分析了它们的尿代谢物。不同于不稳定的NT肽，c(RGDyC)在体内是稳定的。因此，18F-DEG-VS-c(RGDyC)给出了对应于在尿中排出的无损的经标记的肽的单峰(图10)。18F-FBEM-c(RGDyC)也给出了主峰，还有其它的峰(图12)。
本发明的某些方面的简要讨论
累积的证据表明，神经降压素受体在癌症生长和存活中起关键作用(16，19)。事实上，NTR已被提出作为有潜力的人胰腺癌、乳腺癌，头颈部癌、前列腺癌和非小细胞肺癌的标志物(19-28)。
因此，为得到NTR表达谱或个体肿瘤的“指纹”的显像剂的发展可能导致有效的早期诊断和癌症患者的定制治疗方案。神经降压素是NTR的十三肽配体，其在血浆中迅速被内源性肽酶代谢。为了提高体内稳定性，已经开发了各种NT类似物。例如，近来开发了一些放射性标记的神经降压素类似物，作为用于神经降压素受体阳性肿瘤的成像和治疗的有价值的工具(29-35)。虽然在这些初步的研究中已经获得了令人鼓舞的结果，这些试剂的相对高的肾摄取和次优的肿瘤对组织对比度需要进一步改善，尤其是在放射性标记的选择方面。以前，发明人已经表明，通过用18F代替64Cu使肽类PET探针的药物动力学取得了显著改善(36，37)。事实上，作为常用的PET放射性同位素之一，18F也可以容易地在医疗回旋加速器中大量制造，其对于成像应用具有110分钟的理想半衰期(1)。因此，发明人致力于开发用于NTR靶向成像的18F标记的PET探针。
因为半胱氨酸在肽和蛋白质中比赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基的丰度小得多，已使用巯基反应性试剂对这些生物分子进行位点选择性修饰。此前已报道了多种巯基反应性18F-合成子，其中大部带有马来酰亚胺基团以便在温和条件下与巯基偶联加成。然而，大多数的巯基反应性合成子需要多步反应，这可能是耗时且劳动密集型的。
认识到上述问题后，发明人着手开发了基于乙烯砜的Michael加成反应的平台技术。乙烯基砜化学已被证明适合于在温和的条件下的选择性修饰半胱氨酸残基(15)。乙烯基砜官能团的水稳定性、无副产物、与巯基反应的几乎定量的产率以及所形成的硫醚键的化学稳定性使得该反应成为有吸引力的18F标记手段。
本发明的基于VS的辅基被设计为亲水性的，这是对于体内应用非常理想的属性。为了简化标记程序，最初的努力都集中在VS的一步法放射性氟化。放射性氟化反应在MeCN/DMSO利用共沸干燥的[18F]-TBAF进行。据发现，VS-合成子向相应的[18F]-DEG-VS的转化极大依赖于VS-合成子的反应浓度和温度。在优化的条件下，可以在15分钟内得到＞90％标记率。分离的产率测定为35±6％。
因为VS还可以在高pH值与伯胺反应(15)，发明人决定研究VS-合成子反应在温和的条件下的选择性。虽cRGDyK和cRGDyC都可与19F-DEG-VS试剂有效反应，cRGDyK的反应性要低得多，其需要过夜温育和较高的pH值，而相比较对于cRGDyC而言只需要30分钟温育。然而，使用18F-DEG-VS试剂时，在cRGDyK和cRGDyC的等摩尔混合物中，只有cRGDyC反应。这一结果清楚地表明18F-DEG-VS对于SH官能团的化学选择性。
建立有效的18F-DEG-VS标记方法后，进行巯基化神经降压素的18F标记。在35分钟内，以＞95％的产率得到18F-DEG-VS-NT，且放射化学纯度是大于99％。18F-DEG-VS-NT的比放射性根据文献方法测定(38)，其中对最终产物的紫外积分与标准滴定曲线进行比较，得到18F-DEG-VS-NT的比放射性为19.2±4.3TBq/mmol。
因为肽的化学修饰可能显著降低受体结合亲和性，进行了19F-DEG-VS-NT和未修饰的NT体外细胞结合测定。如19F-DEG-VS-NT和未修饰NT(8-13)的类似IC50所表明，VS-合成子偶联所引起的亲和力下降是可以忽略不计的。18F-DEG-VS-NT的成像质量用HT-29异种移植物模型在体内进行评估，该模型已被很好地建立为具有高的NTR1表达(16)。18F-DEG-VS-NT具有快速的肾清除。18F-DEG-VS-NT主要在注射后30分钟在肾脏中积累(6.82±2.90％ID/g)，且迅速下降到注射后1小时的1.19±0.49％ID/g和注射后2小时的0.17±0.01％ID/g。由于在所有主要器官里的活性快速降低，在注射后2小时得到了高的肿瘤与器官比，包括肿瘤/肌肉(27.12±4.56)、肿瘤/肝脏(10.33±4.01)和肿瘤/肾(3.69±1.50)。在阻断实验中，非放射性的NT肽在所有时间点显著(p＜0.01)抑制了18F-DEG-VS-NT的肿瘤摄取(图5A)，这清楚地表明了这种成像剂的受体特异性。由于示踪剂具有在腹部区域非常低的摄取，发明人还进行了生物分布研究，以便更准确地确定在肝、肾、小肠、脾、胃和其他器官或组织中的摄取。如图5B所示，在这些器官的摄取量接近背景水平，这与来自显微PET扫描得到的高对比度肿瘤图像良好关联。由于在所有主要器官里的活性快速降低，如生物分布研究所计算，在注射后2小时得到了高的肿瘤对器官比，包括肿瘤/肌肉(30.65±22.31)、肿瘤/肝脏(11.86±1.98)和肿瘤/肾(1.91±0.43)。由于NT肽具有两个潜在的反应位点，还合成了(Ac)-NT，它也可以用18F-DEG-VS有效地进行标记。仍然需要确定这个新的试剂是否具有与18F-DEG-VS-NT类似的肿瘤靶向能力。
尽管本发明的一个方面是开发新的用于肽的巯基特异性18F-放射性标记方法和组合物及其通过PET成像的评价，进行了与现有的马来酰亚胺类试剂的直接体内比较，以便展示新开发的标记方法的潜在优点。因此，还合成了马来酰亚胺类试剂，即18F-FBEM-NT，以用于直接比较成像品质和代谢稳定性。如图12所示，18F-FBEM-NT是涉及5个步骤的更复杂的合成：氟化、水解、羧基活化、与马来酰亚胺衍生物反应、以及与Cys-NT偶联。相比较而言，18F-DEG-VS-NT的合成仅涉及两个步骤：合成子的氟化和与Cys-NT偶联。在PET成像方面更重要的是，与18F-DEG-VS-NT相比，18F-FBEM-NT显示出显著更高的背景和更低的对比度。为了确定所观察到的与18F-FBEM-NT相比的18F-DEG-VS-NT的更低的腹部背景和高肿瘤摄取是否由代谢差异所引起，进行了代谢稳定性研究。如图6所示，18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT都展示出一些体内代谢物。然而，对于18F-FBEM-NT在大约5分钟发现了主要代谢物峰，但18F-DEG-VS-NT没有。尽管如此，由于NT在人类和啮齿类动物中的半衰期短(39，40)，不能仅基于上述实验得出结论。在进一步的尝试中，发明人将两个合成子与代谢更稳定的c(RGDyC)肽偶联，并研究了18F-FBEM-c(RGDyC)和18F-DEG-VS-c(RGDyC)的尿代谢。如图10和12所示，18F-FBEM-c(RGDyC)在尿中具有对于18F-DEG-VS-c(RGDyC)未见的其它代谢物。该实验表明，本发明的基于VS的合成子在体内比基于马来酰亚胺的合成子更稳定。因此，在18F-DEG-VS-NT的研究中观察到的代谢物可能主要由NT肽的降解造成，而不是合成子本身。虽然马来酰亚胺类合成子如18F-FBEM根据文献报道预计可能不稳定，它们在18F成像研究的时间范围内可能仍表现良好。发明人得出的结论是，相比于18F-FBEM-NT，所观察到的18F-DEG-VS-NT在动物模型中的优异对比度值得考虑将此试剂向对人的NTR靶向成像进行临床转化。
本发明现将参照所示附图的特定示例性实施例详细描述。
实施例1
在该说明性实例中，描述了如何制造和使用本文所公开的具体18F-标记试剂之一，18F-DEG-VS。展示了18F-DEG-VS与生物配体神经降压素(NT)中的游离巯基的偶联。因为越来越多的证据表明神经降压素受体(NTR)在癌症生长和存活中发挥重要作用(16，17)，发明人使用了巯基化的NT肽以显示出18F-DEG-VS作为肽标记试剂的潜力。由此产生的18F标记的NT衍生物进一步在带有NTR1阳性肿瘤的啮齿动物模型中通过PET评估。
1.原料和方法
一般事项
所有可商购的化学试剂购自Aldrich并且不经进一步纯化而使用。cRGDyC和cRGDyK从PeptidesInternationalInc(Louisville，KY)购买。巯基化神经降压素类似物由CityofHope肽合成中心使用标准FMOC化学合成。无载体添加的18F-氟化物是使用SiemensRDS-112负离子回旋加速器通过以11-MeV质子轰击经同位素富集的[18O]水靶(95％富集，Isonics，Golden，CO)经18O(p，n)18F反应制备。
所有的HPLC条件都是梯度洗脱。HPLC方法1：C18柱(250×4.6mm，5微米)；1mL/分钟流速；且洗脱液梯度为：0至2分钟，95％溶剂A[0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶液]和5％溶剂B[0.1％TFA的乙腈(MeCN)溶液]；2至7分钟，95％～85％溶剂A和5％～15％溶剂B；7至27分钟，85％～70％溶剂A和15％～30％溶剂B。HPLC方法2：C18柱(250×4.6mm，5微米)；1mL/分钟流速；且洗脱液梯度为：0至2分钟，95％溶剂A和5％溶剂B；2至22分钟，95％～5％溶剂A和5％～95％溶剂B。HPLC方法3：C18柱(250×4.6mm，5微米)；1mL/分钟流速；采用逐步梯度洗脱：0至2分钟，95％溶剂A和5％溶剂B；2至32分钟，95％～65％溶剂A和5％～35％溶剂B。所有1HNMR和13CNMR光谱都于室温在400MHz记录(Varian)。光谱在直径5mm管中以CDCl3、D2O溶液获得，且以ppm计的化学位移是相对于CDCl3(δH7.26ppm，或δC77.2ppm)或D2O(δH4.65ppm)的残基信号来引述。在1HNMR谱中的多重性被描述为：s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，m＝多重峰，b＝宽峰。所有产物在ThermoElectronLTQ-FT质谱仪上进行质谱表征。
化学合成
2-(2-羟基乙氧基)乙基4-硝基苯磺酸酯(化合物1)的合成：将4-硝基苯磺酰氯(12.5g，56.6mmol)加入到二乙二醇(5g，47mmol)和三乙胺(9mL，66mmol)的二氯甲烷(150mL)溶液中(图1A)。反应混合物在室温搅拌过夜，然后用水和盐水洗涤。将溶剂蒸发后，残余物通过柱色谱(二氯甲烷/乙醚，9∶1)纯化，得到无色固体(1)(产率：25％～30％)。1H-NMR(CDCl3)：δ8.42(d，2H)，8.15(d，2H)，4.34(t，2H)，3.75(t，2H)，3.70(t，2H)，5.56(t，2H)。13C-NMR(CDCl3)：150.5(s)，141.9(s)，129.3(d)，124.5(d)，72.6(t)，70.3(t)，68.5(t)，61.7(t)。
2-(2-(2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)乙氧基)乙基4-硝基苯磺酸酯(化合物2)的合成：将t-BuOK(50μL，50％甲醇溶液)加入到(1)(1克，3.4mmol)和二乙烯基砜(2.2mL，20mmol)的溶液中。反应混合物在室温搅拌4小时。将反应混合物通过柱色谱(二氯甲烷/乙醚，9∶1)纯化，得到无色固体(2)(产率：70％～80％)。1H-NMR(CDCl3)：δ8.41(d，2H)，8.13(d，2H)，6.78(d，1H)，6.41(d，1H)，6.11(d，1H)，4.29(t，2H)，3.88(t，2H)，3.72(t，2H)，3.58(s，4H)，3.24(t，2H)。13C-NMR(CDCl3)：150.8(s)，141.8(s)，137.9(d)，129.3(d)，129.0(t)，124.5(d)，70.4(t)，68.5(t)，64.6(t)，54.9(t)。
(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙基磺酰基)乙烷(19F-DEG-VS，化合物3)的合成：将30μLTBAF(1MTBAF的THF溶液)加入到2-(2-(2-(乙烯基磺酰基)乙氧基)乙氧基)乙基4-硝基苯磺酸酯(12mg，41.2μmol)的DMSO(50μL)溶液中，在78℃反应过夜。将反应混合物通过C18柱在HPLC上纯化，得到2.8mg(3)(产率：41.3％)，为微黄色液体。该产物用ThermoLTQ-FT质谱仪表征。(m/z227.07[MH]+，C8H15FO4S，计算[MH]+227.07)。1H-NMR(D2O)：δ6.79(q，1H)，6.32(d，1H)，6.20(d，1H)，4.57(t，1H)，4.45(t，1H)，3.84(t，2H)，3.72(t，1H)，3.61(m，5H)，3.42(t，2H)。
19F-DEG-VS-cRGDyC的合成：将cRGDyC(1mg(1.68μmol)，在100μLH2O中)和19F-DEG-VS(500μg(2.2μmol)，在5μLMeCN和45μLH2O中)加入到900μL磷酸盐缓冲液(pH7.0)中。将反应混合物在室温温育30分钟，通过HPLC纯化。HPLC条件：C18柱；流速设定为1mL/分钟；洗脱液梯度为：0至2分钟，95％溶剂A[0.1％三氟乙酸(TFA)的水溶液]和5％溶剂B[0.1％TFA的乙腈(MeCN)溶液]；2至7分钟，95％～85％溶剂A和5％～15％溶剂B；7至27分钟，85％～70％溶剂A和15％～30％溶剂B。19F-DEG-VS-cRGDyC的保留时间为17.2分钟。最终产物冻干后为白色固体。该产物用ThermoLTQFT质谱仪表征。(m/z821.29[MH]+，C32H49FN8O12S2，计算[MH]+821.29)。
19F-DEG-VS-cRGDyK的合成：将cRGDyK(1mg(1.61μmol)，在100μLH2O中)和19F-DEG-VS(500μg(2.2μmol)，在5μLMeCN和45μLH2O中)加入到900μL磷酸盐缓冲液(pH9.0)中。将反应混合物在室温温育过夜，通过HPLC纯化。HPLC条件与cRGDyK纯化相同。19F-DEG-VS-cRGDyK的保留时间为13.1分钟。最终产物冻干后为白色固体。该产物用ThermoLTQFT质谱仪表征。(m/z846.38[MH]+，C32H49FN8O12S2，计算[MH]+846.38)。
19F-DEG-VS-神经降压素和19F-DEG-VS-(Ac)-神经降压素的合成：神经降压素类似物(NT，Cys-pipGly-Pro-pipAmGly-Arg-Pro-Tyr-tBuGly-Leu-OH，300μg(0.25μmol)，在30μLH2O中)或(Ac)-NT和19F-DEG-VS(500μg，2.2μmol，5μLMeCN和45μLH2O)加入到900μL0.1M硼酸盐缓冲液(pH8.5)。将反应混合物在室温温育30分钟，通过方法1使用HPLC纯化。19F-DEG-VS-NT和(19F-DEG-VS)2-NT的保留时间分别为20.08分钟和23.09分钟。最终产物冻干后为白色固体。该最终产物通过质谱表征(19F-DEG-VS-NT：m/z1409.75[MH)+，C63H105FN16O15S2，计算[MH]+1，409.74；(19F-DEG-VS)2-NT：m/z1，635.82[MH]+，C71H120F2N16O19S3，计算[MH]+1，635.80)。19F-DEG-VS-(Ac)-NT在放射HPLC上的保留时间为28.18分钟。最终产物通过质谱确认(19F-DEG-VS-(Ac)-NT：m/z1451.76[MH]+，C65H108FN16O16S2，计算[MH]+1451.75)。
19F-FBEM-c(RGDyC)的合成：FBEM如前所述合成(12)。将FBEM(420μg，1.6μmol，50μLH2O)和c(RGDyC)(500μg，0.8μmol，50μLH2O)加入到200μLPBS(pH7.5)中。将反应混合物在室温温育30分钟，用方法3通过HPLC纯化。19F-FBEM-c(RGDyC)的保留时间为18.2分钟。最终产物通过质谱确认(19F-FBEM-c(RGDyC)：m/z857.30[MH]+，C37H45FN10O11S，计算[MH]+857.31)。
19F-FBEM-NT的合成：将FBEM(130μg，0.5μmol，50μLH2O)和NT(300μg，0.25μmol，50μLH2O)加入到200μLPBS(pH7.5)中。将反应混合物在室温温育30分钟，用方法3通过HPLC纯化。19F-FBEM-NT的保留时间为18.9分钟。最终产物通过质谱确认(19F-FBEM-NT：m/z1445.74[MH]+，C68H101FN18O14S，计算[MH]+1445.76)。
放射化学
18F-(2-(2-(2-氟乙氧基)乙氧基)乙基磺酰基)乙烷(18F-DEG-VS，18F-3)的合成：18F氟化物(200mCi)放置于Sep-PakQMA盒中。用四丁基碳酸氢铵(TBAB)溶液(400μLH2O)将18F氟化物从QMA盒来洗脱至干燥V型管中。将所得溶液共沸干燥，随后在90℃蒸发MeCN。将(2)的溶液(10mg，在50μL无水DMSO中)加入到反应器中，并在80℃加热10至15分钟。加入乙酸(5％，800μL)以淬灭反应。然后通过HPLC纯化粗混合物(C18柱：1mL/分钟，洗脱剂梯度：0至2分钟，95％溶剂A和5％溶剂B；2至7分钟，95％～85％溶剂A和5％～15％溶剂B；7至27分钟，85％～65％溶剂A和15％～35％溶剂B)。19F-DEG-VS的保留时间为12.2分钟。将收集的18F-DEG-VS用NaOH(0.1mol/L)中和。18F-DEG-VS的分离放射化学产率基于HPLC为大于90％(未经衰变校正)。
18F-DEG-VS-cRGDyC的合成：18F-DEG-VS(100μL，1mCi)和cRGDyC(100μg)加入到30μL硼酸盐缓冲液(pH8.5)，并且将反应混合物在室温温育5至10分钟。加入乙酸(5％，600μL)以淬灭该反应，并通过HPLC纯化产物(C18柱：1mL/分钟，洗脱剂梯度：0至2分钟，95％溶剂A和5％溶剂B；2至22分钟，95％～5％溶剂A和5％～95％溶剂B)。18F-DEG-VS-cRGDyC的保留时间为21.5分钟。
18F-DEG-VS-cRGDyK的合成：18F-DEG-VS(100μL，1mCi)和100μL硼酸盐缓冲液(pH9.0)加入到cRGDyK(100μg)中，并且将反应混合物在室温温育30分钟。加入乙酸(5％，600μL)以淬灭该反应。产物通过HPLC纯化。
选择性试验：cRGDyK和cRGDyC。将18F-DEG-VS(100μL，1mCi)和50μL硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到cRGDyC(20μg)和cRGDyK(20μg)中。将反应混合物在室温温育30分钟。加入乙酸(5％，600μL)以淬灭该反应，且产物通过HPLC纯化。
18F-DEG-VS-NT和18F-DEG-VS-(Ac)-NT的合成：将18F-DEG-VS(100μL，1mCi)和30μL硼酸盐缓冲液(pH8.5)加入到神经降压素(100μg，0.084μmol)或(Ac)-NT中，将反应混合物在室温温育5至10分钟。加入乙酸(5％，600μL)以淬灭该反应，且产物使用方法1通过放射性HPLC纯化。18F-DEG-VS-NT的保留时间为25.6分钟，没有观察到(18F-DEG-VS)2-NT。为了研究18F-DEG-VS-NT的稳定性，最终产物与1×PBS在37℃温育5小时。然后将溶液的等分试样通过放射-HPLC进行分析，以确定放射化学纯度。18F-DEG-VS-(Ac)-NT的保留时间为28.4分钟。
18F-FBEM-c(RGDyC)的合成：18F-FBEM(100μL，1mCi)和30μLPBS(pH7.5)加入到装有100μgc(RGDyC)(0.16μmol)的小瓶中。将反应混合物在室温温育15分钟。该反应通过乙酸溶液(5％，600μL)淬灭，产物使用方法3通过放射性HPLC纯化。18F-FBEM-c(RGDyC)的保留时间为18.4分钟。
18F-FBEM-NT的合成：将18F-FBEM(100μL，1mCi)和30μLPBS(pH7.5)加入到装有100μg神经降压素肽(0.084μmol)的小瓶中。将反应混合物在室温温育15分钟。该反应通过乙酸溶液(5％，600μL)淬灭，产物使用方法3通过放射性HPLC纯化。18F-FBEM-NT的保留时间为19.0分钟。
细胞
人结肠腺癌细胞HT29获自美国典型培养物保藏中心并维持在37℃的潮湿气氛(含5％CO2)下的RPMI-1640(其中补充有1％L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素和10％胎牛血清)(LifeTechnologies，Inc.)中。
动物
动物程序按照南加州大学实验动物使用与管理委员会批准的协议进行。在程序中，在4至6周龄的20g至30g雄性无胸腺小鼠(BALB/cnu/nu)的肩部以1×106细胞/0.1mL的浓度皮下注射HT-29人结肠腺癌细胞(美国典型培养物保藏中心)，并给予足够的时间以使肿瘤生长到至少3毫米的直径。
体外细胞结合测定
19F-DEG-VS-NT和NT(8-13)的体外NTR1-结合亲和力和特异性是如前所述(18)利用125I-NT(8-13)通过竞争性细胞结合测定(PerkinElmer，Waltham，MA)进行评估。详细地，将HT-29细胞置于48孔板(1百万/0.4mL/孔)并温育过夜。细胞用结合缓冲液(50mMHepes，125mMNaCl，7.5mMKCl，5.5mMMgCl2，1mMEGTA，5g/LBSA，2mg/L胰凝乳，100mg/L大豆胰蛋白酶抑制剂，50mg/L杆菌肽，pH7.4)洗涤三次。HT-29细胞一式三份分别与25000cpm的125I-NT(8-13)以及不同浓度(0.001nM至1000nM)的19F-DEG-VS-NT和NT(8-13)在37℃温育1小时。洗涤后，将细胞在37℃用1mol/LNaOH溶解，其放射活性用γ-计数器测定。HT-29细胞最佳拟合50％抑制浓度(IC50)值通过使用GraphPadPrism(GraphPad软件)非线性回归拟合数据来进行计算。实验是用一式三份样品进行的。
2.小鼠HT-29肿瘤异种移植物的生物分布和显微PET成像
在携带HT-29结肠异种移植物的裸鼠尾静脉注射3.7MBq18F-DEG-VS-NT或18F-FBEM-NT(分别n＝3)后进行显微PET成像。为进行阻断研究，将NT(8-13)(100μg)与18F-DEG-VS-NT(n＝3)共同注射。串行成像(注射后0.5、1和2小时；扫描持续时间分别为5分钟、5分钟和10分钟)使用显微PETR4扫描器(ConcordeMicrosystems，Knoxville，TN；8cm轴向视野，空间分辨率2.0mm)。
图像通过MAP迭代算法使用显微PETManager软件(ConcordeMicrosystems，Knoxville，TN)重建，然后通过AcquisitionSinogramImageProcessing(ASIPro)软件(ConcordeMicrosystems，Knoxville，TN)分析该图像。肝脏内平均放射性累积从PET肝脏图像的中央部分内绘制的所关注三维区域(ROI)获得。使用通过扫描充有已知活性浓度18F的圆柱假体获得的校准因子，将图像强度转换为活性浓度(Bq/cm3)的单位。假定组织密度为1g/mL，测定的组织活性浓度被换算成以Bq/g为单位，再乘以100并除以注射剂量，以获得源于图像的百分比注射剂量/克组织(％ID/g)。
生物分布是用带有HT-29结肠异种移植物的裸鼠进行。在注射3.7MBq18F-DEG-VS-NT后2小时，吸入麻醉下处死动物。切除并称重所关注的器官。使用γ计数器测定每个切除的标本的放射性；放射性摄取用％ID/g表达。计算各组动物平均摄取(％ID/g)和相应的标准偏差。
体内代谢稳定性
评价了在携带HT-29肿瘤的裸鼠中的18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT的体内代谢稳定性。静脉注射7.4MBq的18F-DEG-VS-NT和18F-FBEM-NT后30分钟，将小鼠处死。收集尿液并用1mL的PBS稀释。血液在14,000rpm离心5分钟。收集肝、肾脏和肿瘤并使用匀浆机匀化，悬浮在1mLPBS缓冲液中，然后在14,000rpm离心5分钟。对于每个样品，在除去上清液后，将50％TFA的100μLPBS加入到该溶液中，接着混合并离心5分钟。然后将上层溶液收集，并注射进行HPLC分析(HPLC方法3)。用级分收集器收集洗脱液(1.0分钟/级分)，每个级分的放射性用γ计数器测定。对于18F-DEG-VS-c(RGDyC)和18F-FBEM-c(RGDyC)，收集尿液样品并通过HPLC分析。
3.统计分析
定量数据表示为平均值±SD。使用单向ANOVA和t分布检验进行比较。P＜0.05被认为是统计学显著。
实施例2
神经降压素受体(NTR)的过度表达与前列腺癌的进展和生长增加和增殖有关。这项工作的目的是评估用于前列腺癌的NTR1靶成像的PET剂18F-DEG-VS-NT。
13个氨基酸的NT肽经设计在氨基端具有游离巯基(NT-SH)。巯基(sulfhydryl)特异性18F-乙烯基砜(18F-VS)被开发用于NT-SH偶联。18F-DEG-VS-NT的体外研究(包括受体结合测定、细胞摄取和流出测定)是使用人前列腺癌PC3细胞系进行的。体内PET和生物分布研究也使用带有PC3异种移植物的裸鼠进行。
从共沸干燥18F-氟化物开始，18F-VS是一步合成的，并且在生产规模下有24.3％的经衰减校正的产率。NT-SH和18F-VS的偶联在室温以30.5％分离产率生成18F-DEG-VS-NT。在冷的NT肽的存在下，18F-DEG-VS-NT在PC3细胞中的摄取被成功阻断。PET成像分析展示出PC3肿瘤模型中的高肿瘤摄取和低背景摄取。在注射后3小时进行生物分布研究，其表明肿瘤与肌肉、肝脏和肾脏的比率分别为19.4±5.5、15.6±4.1和3.0±0.3。
18F-DEG-VS-NT展示出高的PC3肿瘤摄取和正常组织中的低背景，如显微PET图像所示。18F-DEG-VS-NT是有前景的通过靶向NTR1诊断前列腺癌的PET剂。
实施例3
基于新开发的本发明的18F-乙烯基砜(18F-VS)，已开发了18F-DEG-VS-NT用于神经降压素受体(NTR)靶向成像。在这项工作中，发明人研究了该巯基反应性合成子与成熟18F-FBEM标记方法相比是否显示出优势。
基于已经成熟确立的18F-FBEM和发明人新开发的18F-乙烯基砜，合成了18F-FBEM-NT和18F-DEG-VS-NT用于NTR1靶向成像。使用携带HT29异种移植物的裸鼠进行了体内PET和代谢稳定性研究。
基于HPLC积分，以＞90％产率获得了18F-FBEM-NT和18F-DEG-VS-NT。两种试剂在PBS溶液中显示出良好的稳定性。然而，代谢稳定性研究表明，这些试剂在体内有数种代谢物，这可能是由于神经降压素类似物的半衰期很短所致。在成像研究中未见明显的骨摄取，表明体内脱氟可忽略不计。尽管这两种示踪剂在稳定性研究中没有表现出显著差异，但是18F-DEG-VS-NT确实有比18F-FBEM-NT更低的腹部背景和更高的肿瘤肿瘤。
相对于18F-FBEM-NT，18F-DEG-VS-NT在体内成像实验中显示出更好的成像品质和对比度。
实施例4
神经降压素受体(NTR)已被认为在癌症生长和存活中起关键作用。这项工作的目的是开发用于各种癌症类型的NTR1靶向成像的18F标记的PET试剂。
将乙酸基引入CysNT肽的氨基端，然后将该肽与18F-乙烯基砜(18F-VS)反应。体内PET成像使用携带HT29、BXPC3和Colo205异种移植物的裸鼠进行。
(Ac)CysNT能与18F-VS高效反应，基于HPLC积分其产率＞90％。18F-VS-(Ac)NT的放射化学纯度＞98％。无创显微PET表明，18F-VS-(Ac)NT在皮下HT-29、BXPC3和Colo205异种移植物中展示出NTR特异性肿瘤摄取。阻断实验成功地证明了受体特异性。
18F-VS-(Ac)NT在结肠直肠癌和胰腺癌模型中展示出特异性肿瘤摄取和良好的肿瘤与背景对比度。18F-VS-(Ac)NT是有前景的NTR1靶向PET成像用试剂。
尽管本发明已经就具体的示例性实施方式和实例而言进行了描述，但是应当理解，这里公开的实施方式仅用于说明用途，本领域技术人员可以在不脱离如所附权利要求所阐述的本发明的主旨和范围的情况下进行修改和变化。
表1.选择的用于18F-DEG-VS放射合成的条件
前体量 反应温度 放射化学产率(基于HPLC)
2mg 80℃ ＞75％
10mg 80℃ ＞90％
20mg 80℃ ＞95％
20mg 60℃ ＞95％
参考文献
本文依赖于下面的参考文献并将其整体并入：
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Claims (12)

1.一种巯基选择性放射性标记试剂，具有下列通式：
*R-L-VS
其中*R是放射性同位素，L是连接基团，以及VS代表乙烯基砜官能团。
2.权利要求1所述的巯基选择性放射性标记试剂，其具有通式：
其中，*R是放射性同位素，
n是1～20，优选为1～10，且更优选为1～5，
R1、R2和R3独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组；进而R1和R3可任选地具有取代基从而形成C3～C8环状不饱和环，并且所选中的烷基、环烷基、芳基和杂芳基可任选地具有取代基，并且
R5、R6独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，进而R5和R6可以任选地具有取代基。
3.权利要求2所述的巯基选择性放射性标记试剂，其具有通式：
其中，*R是放射性同位素，并且
n是1～20，优选1～10，且更优选1～5。
4.权利要求1所述的巯基选择性放射性标记试剂，其中，*R是18F，且L是三肽DEG。
5.一种成像示踪剂，其包括：
权利要求1所述的放射性标记试剂，所述放射性标记试剂可操作性地与生物活性配体或生理活性配体连接。
6.权利要求5所述的成像示踪剂，其具有通式：
其中，*R是放射性同位素，
R5、R6、R8、R9可独立地选自由H、烷基、环烷基卤和芳基组成的组，其中的每一个可任选地具有取代基，
A1选自由蛋白质、多肽、适体、DNA寡核苷酸和配体的组；
A2选自由蛋白质、多肽、适体、DNA寡核苷酸和配体的组，并且，
其中A1和A2一起可以任选形成蛋白质、肽、多肽、DNA寡核苷酸或环状多肽。
7.权利要求6所述的成像示踪剂，其中A1、A2的至少一个或A1和A2一起包括神经降压素、神经降压素变体、巯基化神经降压素或巯基化神经降压素变体、其他的经稳定化的神经降压素、多聚神经降压素、杂聚神经降压素。
8.权利要求7所述的成像示踪剂，其中，所述神经降压素变体包括肽序列，该肽序列与六肽序列Arg(8)-Arg(9)-Pro(10)-Tyr(11)-ILE-(12)-Leu(13)具有至少50％同源性，并且所述神经降压素变体还包括至少一个半胱氨酸残基或处在至少一个残基上的巯基。
9.权利要求7所述的成像示踪剂，其中，所述神经降压素变体是Cys-pipGly-Pro-pipAmGly-Arg-Pro-Tyr-tBuGly-Leu-OH，或具有与所述神经降压素变体至少50％同源性的序列。
10.一种用于制备巯基选择性放射性标记剂的前体，该前体具有通式：
其中LG是可以被放射性同位素、优选18F选择性取代的官能团，并且
其中n是1～20，优选1～10，且更优选1～5，
R1、R2和R3独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中，进而R1和R3还可任选地经取代而形成C3～C8环状不饱和环，并且所选中的烷基、环烷基、芳基和杂芳基可任选地具有取代基，且
R5、R6独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，进而R5和R6可以任选地具有取代基。
11.权利要求10所述的前体，其具有通式：
其中LG是可以被放射性同位素、优选18F选择性取代的官能团，并且
其中n是1～20，优选1～10，且更优选1～5，
R1、R2和R3独立选自由H、烷基、环烷基、芳基和杂芳基组成的组，其中，进而R1和R3可任选地经取代而形成C3～C8环状不饱和环，并且所选中的烷基、环烷基、芳基和杂芳基可任选地具有取代基。
12.权利要求11所述的前体，其中R1、R2和R3是H且n＝1。
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