CN103491984B

CN103491984B - 放射性标记的her2结合肽

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Publication number: CN103491984B
Application number: CN201180068112.5A
Authority: CN
Inventors: F.休德; Bd-L.李; R.张; P.艾弗森; P.谢菲尔; T.埃里克松; E.贡内里乌松; F.弗雷德; L.阿布拉姆森; J.菲尔德维施; N.赫尔恩; C.伦德尔
Original assignee: Affibody AB; General Electric Co
Current assignee: Affibody AB; General Electric Co
Priority date: 2010-12-22
Filing date: 2011-12-19
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2031-12-19

Abstract

包含与放射性核素和螯合剂缀合的分离的多肽的成像剂；其中所述分离的多肽与HER2或其变体特异性结合；和制备和使用这些成像剂的方法。

Description

放射性标记的HER2结合肽

序列表

本申请含有经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表，并且通过引用而全文结合到本文中。在2010年12月13日产生的所述ASCII副本命名为2355971.txt，并且为4,957个字节大小。

发明领域

本发明一般性涉及与人表皮生长因子受体类型2 (HER2)结合的成像剂和制备和使用所述剂的方法。

发明背景

人表皮生长因子受体类型2 (HER2)为跨膜蛋白质和受体酪氨酸激酶蛋白质的erbB家族的成员。HER2为在各种各样的癌症中过表达的充分建立的肿瘤生物标记物，所述癌症包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌和口腔癌。因此，HER2作为分子靶标和作为患者生存的诊断或预后指示剂或对抗肿瘤手术的应答的预测性标记物具有很大的价值。

在过去的十年间，使用各种成像形式，广泛研究了HER2表达的非侵入性分子成像。这些形式包括用正电子发射断层显像(PET)和单光子发射断层显像(SPECT)的放射性核素成像。HER2的PET和SPECT成像(分别为HER2-PET和HER2-SPECT)提供高灵敏度，高空间分辨率。HER2的PET成像还提供强的定量能力。HER2-PET和HER2-SPECT可特别用于在患者中整个肿瘤HER2表达的实时测定，鉴定在肿瘤中HER2随时间的表达，选择用于HER-靶向的治疗(例如，基于曲妥单抗的疗法)的患者，预测对疗法的应答，评价药物功效，和许多其它应用。然而，未开发具有化学性并且呈现适于临床应用的体内行为的PET或SPECT-标记的HER2配体。

天然存在的葡萄球菌蛋白质A包含形成与片段结合的三螺旋结构(支架)的结构域、免疫球蛋白同种型G (IgG)的可结晶区域(Fc)。衍生自蛋白质A的Z-结构域的某些多肽含有由三个通过环连接的α-螺旋组成的支架。位于这些螺旋的两个之上的某些氨基酸残基构成用于IgG的Fc区域的结合部位。通过取代位于螺旋1和2上的表面-暴露的氨基酸残基(13个残基)，已制备备选的结合剂分子，以改变这些分子的结合能力。一个这样的实例为HER2结合分子或HER2结合剂。这些HER2结合剂已用PET或SPECT-活性放射性核素标记。这样的PET和SPECT-标记的结合剂提供在患者中测量体内HER2表达模式的能力，因此，有助于临床医生和研究者诊断、预测和治疗与HER2相关的疾病状况。

已评价用PET-活性放射性核素(¹⁸F)放射性标记的HER2结合亲和体(affibody)分子作为过表达HER2的恶性肿瘤的成像剂。经由螯合剂例如maGGG (巯基乙酰基三甘氨酰基)、CGG (半胱氨酸-二甘氨酰基)、CGGG (SEQ ID NO: 6) (半胱氨酸-三甘氨酰基)或AA3，与^99mTc缀合的HER2结合亲和体分子已用于诊断成像。在小鼠中已证明这些分子与表达靶HER2的肿瘤结合。

在大多数情况下，通过硫醇-反应性马来酰亚胺基团将产生信号的¹⁸F基团引入亲和体。在¹⁸F掺入后，使用多步合成来制备硫醇反应性马来酰亚胺基团。然而，该化学仅提供低放射化学收率。类似地，^99mTc与亲和体缀合为多步、低收率过程。此外，Tc降低和与螯合剂形成络合物需要高pH (例如，pH=11)条件和长的反应时间。

虽然¹⁸F标记的亲和体分子的体内性能适度良好，但是仍存在显著的改进空间。例如，在一些研究中，在注射成像剂后2小时，发现肿瘤摄取仅为6.36±1.26%ID/g。另一方面，^99mTc标记的亲和体分子具有主要的肝胆清除，引起在肠中高放射性累积，这限制其用于检测腹部区域中的HER2肿瘤和亚态。

因此，需要用于合成放射性标记的多肽的化学和方法，其中放射性部分(例如，¹⁸F)可在最终的阶段引入，进而提供高放射化学收率。此外，需要用于PET或SPECT成像的新的基于HER2的成像剂，具有改进的性质，特别是与肾清除和毒性效应相关的性质。

发明概述

本发明的组合物为一类能与HER2或其变体特异性结合的新的成像剂。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含经由二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合的包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。二胺二肟螯合剂可包含Pn216、cPn216、Pn44，或它们的衍生物。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含经由NOTA螯合剂与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga缀合的包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

在一个或多个实施方案中，成像剂组合物包含经由接头与¹⁸F缀合的包含SEQ. IDNo. 1、SEQ. ID. No 2或其保守变体的分离的多肽。接头包含衍生自氨基氧基、叠氮基或炔基的基团。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

用于制备成像剂组合物的本发明方法的一个实例包括：(i) 提供包含SEQ. IDNo. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；和(ii) 使二胺二肟螯合剂与多肽反应，以形成螯合剂缀合的多肽。在另一个实例中，所述方法包括：(i) 提供包含SEQ. ID No.1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与接头反应；和(iii) 使接头与¹⁸F部分反应，以形成¹⁸F缀合的多肽。接头可包含氨基氧基、叠氮基或炔基。

附图简述

参考附图，当阅读以下详细说明时，将更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中：

图1A和1B分别为两种抗-HER2多肽(Z477 (SEQ. ID No. 3)和(Z477)₂ (SEQ. IDNo. 5))在八种不同的浓度下对人HER2的结合亲和力的表面等离振子共振(SPR)的图。

图2A和图2B分别为C6 (大鼠神经胶质瘤，对照)和人抗-HER2抗体对SKOV3 (人卵巢癌)的定性流式细胞术的图。图2C显示对于SKOV3和C6细胞系，对于每个细胞的Her2受体的柱形图。

图3为关于SKOV3细胞和空白，关于一组肿瘤类型SKOV3 2-1、SKOV3 3-1，SKOV3 3-4，对于Her2的ELISA测定的柱形图。

图4为^99mTc标记的Z00477 (SEQ. ID No. 3)的反相HPLC γ色谱图。

图5A为在pH 9下聚集的^99mTc(CO)₃(His6)Z00477 (SEQ. ID. No. 4) ('His6'公开为SEQ ID NO: 7)的尺寸排阻HPLC γ色谱图。图5B为非聚集的^99mTc(CO)₃(His6)Z00477('His6'公开为SEQ ID NO: 7)标记的亲和体标准物的尺寸排阻HPLC γ色谱图。

图6为在来自携带SKOV3肿瘤的小鼠的血液、肿瘤、肝、肾和脾样品中，Z00477(SEQ. ID No. 3)的生物分布概况(profile)的图，包括随时间的肿瘤:血液比。

图7为Mal-cPN216接头的化学结构的图。

图8A为电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)的图，图8B为对于纯化的Z00477(SEQ. ID No. 3)-cPN216的质量反卷积结果的图。

图9为用^99mTc标记的Z02891-cPN216 (SEQ. ID No. 2)的反相HPLC γ示踪色谱图(trace chromatogram)。

图10为在来自携带SKOV3肿瘤的小鼠的血液、肝、肾、脾和尾部样品中，经由cPN216(% ID，%注射剂量)用^99mTc标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况的图。

图11为在来自携带SKOV3肿瘤的小鼠的肿瘤、血液、肝、肾、膀胱/尿、尾部、肠和脾样品中，经由cPN216 (% ID，%注射剂量)用^99mTc标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况的图。

图12为在携带SKOV3肿瘤的小鼠中Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况的图，显示肿瘤:血液比。

图13A和图13B为Boc-保护的马来酰亚胺(malimide)-氨基氧基(Mal-AO-Boc)和马来酰亚胺-氨基氧基(Mal-AO)接头的化学结构的图。13A为2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基氨基)-2-氧代乙氧基氨基甲酸叔丁酯(Mal-AO-Boc)的化学结构，13B为2-(氨基氧基)-N-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙基)乙酰胺盐酸盐(Mal-AO.HCl)的化学结构。

图14A为Z00342 (SEQ. ID No. 1)原料的反相HPLC色谱图，14B为纯化的Z00342(SEQ. ID No. 1)-AO成像剂组合物的反相HPLC色谱图，均在280 nm下分析。

图15为粗反应混合物和¹⁸F-氟苄基-Z00342 (SEQ. ID No. 1)和¹⁸F-氟苄基-Z02891’ (SEQ. ID No. 2)的纯化的最终产物的反相HPLC γ色谱图。

图16为来自具有SKOV3-肿瘤的动物，用¹⁸F标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)多肽的生物分布概况(%ID，%注射剂量)的图。

图17为来自具有SKOV3-肿瘤的动物，用¹⁸F标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)多肽的生物分布概况(% ID，%注射剂量)和肿瘤:血液比的图。

图18为在血液、肿瘤、肝、肾、脾和骨样品中，¹⁸F标记的Z00342 (SEQ. ID No. 1)和¹⁸F标记的Z02891 (SEQ. ID No. 2)的生物分布概况(% ID，%注射剂量)的柱形图。

图19为Mal-NOTA接头的化学结构的图。

图20A为电喷雾电离飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)的图，图20B为Z00477 (SEQ. IDNo. 3)-NOTA的ESI-TOF-MS质量反卷积结果的图。

图21为在反应1小时后，⁶⁷Ga-标记的Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA的粗反应混合物的反相HPLC γ示踪的图。

图22为纯化的⁶⁷Ga-标记的NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA多肽的反相HPLCγ示踪的图。

发明详述

本发明的成像剂通常包含与¹⁸F、^99mTc、⁶⁷Ga或⁶⁸Ga缀合的SEQ. ID No. 1、SEQ. IDNo. 2或其保守变体的分离的多肽；和制备和使用所述组合物的方法。分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。在一个或多个实施方案中，分离的多肽的序列与任何SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体具有至少90%序列相似性。

分离的多肽可包含天然氨基酸、合成的氨基酸或采用与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸模拟物(mimetics)。天然存在的氨基酸为通过遗传密码来编码的那些以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸盐、O-磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸。

分离的多肽可使用标准固相合成技术来制备。或者，多肽可使用重组技术来制备。当多肽使用重组技术来制备时，可分离编码多肽或其保守变体的DNA。编码多肽或其保守变体的DNA可插入克隆载体，引入宿主细胞(例如，真核细胞、植物细胞或原核细胞)，并且使用任何本领域公认的表达系统来表达。

多肽可基本上由单一手性形式的氨基酸残基组成。因此，本发明的多肽可基本上由L-氨基酸或D-氨基酸组成；但是也可采用L-氨基酸和D-氨基酸的组合。

由于本文提供的多肽衍生自蛋白质A的Z-结构域，在结合界面上的残基可被非保守地取代或保守地取代，同时保持结合活性。在一些实施方案中，取代的残基可衍生自20种天然存在的氨基酸的任一种或其任何类似物。

多肽可为约49个残基-约130个残基长度。具体的多肽序列在表1中列举。

表1

另外的序列可加入到末端，以赋予所选的官能度。因此，另外的序列可悬垂于一个或两个末端，以促进多肽的纯化或分离，单独地或与结合靶标偶联(例如，通过将His标签悬垂于多肽)。

在表1中列举的多肽可经由接头与¹⁸F缀合；经由二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合，或经由NOTA螯合剂与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga缀合。表2提供这些多肽的等电点(pI)。

表2

	pI	MW (kD)
			His6-Z00477 (SEQ. ID No. 4)('His6'公开为SEQ ID NO: 7)	8.31	8143.11
Z02891(SEQ. ID No. 2)	8.10	7029.96
			His6-Z00342 ('His6'公开为SEQ ID NO: 7)	8.14	8318.27

在一个或多个实施方案中，包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽可与¹⁸F缀合。¹⁸F可在分离的多肽的C末端、N-末端或内部位置处掺入。

在一个或多个实施方案中，¹⁸F可经由接头与分离的多肽缀合。接头可包含氨基氧基、叠氮基或炔基。接头的氨基氧基可与醛连接，例如氟-取代的醛。接头的叠氮基可与氟取代的炔连接。类似地，接头的炔基可与氟取代的叠氮化物连接。接头还可包含硫醇反应性基团。接头可包含马来酰亚胺基-氨基氧基、马来酰亚胺基-炔或马来酰亚胺基-叠氮基。¹⁸F缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ.ID No. 2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 使多肽与接头反应，其中接头包含氨基氧基、叠氮基或炔基，以形成接头缀合的多肽；和使接头与¹⁸F部分反应。

在另一实施方案中，所述方法可包括：(i) 提供包含SEQ. ID No. 1、SEQ. ID No.2或其保守变体的分离的多肽；(ii) 提供接头；(iii)使接头与¹⁸F部分反应，以形成¹⁸F标记的接头；和(iv) 使¹⁸F标记的接头与SEQ. ID No 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽反应，以形成接头缀合的多肽。

使用上述实例，可在多肽上引入氟或放射性氟原子，例如¹⁸F。当氟-取代的醛与接头缀合的多肽的氨基氧基反应时，得到氟-取代的多肽。类似地，当氟取代的叠氮化物或炔基与接头缀合的多肽的相应的炔或叠氮基反应时，得到氟取代的多肽。当放射性氟-取代的醛、叠氮化物或炔与接头缀合的多肽的相应的氨基氧基、炔或叠氮基反应时，得到放射性氟-标记的多肽或成像剂组合物。此外，醛、叠氮化物或炔各自可具有放射性氟(¹⁸F)取代基，以制备放射性氟-标记的成像剂组合物。用于在多肽上引入氟的方法也可用于制备具有任何长度的氟化的成像剂组合物。因此，在一些实施方案中，成像剂组合物的多肽可包含例如40-130个氨基酸残基。

用于合成成像剂的接头-缀合的多肽的化学容易，并且所述方法的一个反应步骤比先前已知的方法更有效并且导致较高的收率。所述方法更容易进行，更快速并且在较温和的、更加方便使用者的条件下实施。例如，用¹⁸F-缀合的接头(例如，¹⁸F-氟代苯甲醛)标记多肽的方法比本领域已知的程序更简单。通过将¹⁸F直接亲核掺入到三甲基苯胺(trimethylanilinium)前体上，在一步中制备¹⁸F缀合的-接头。¹⁸F-接头(即，¹⁸F-FBA)随后与多肽(例如，亲和体)缀合。接头的制备也比本领域先前已知的方法更容易。此外，放射性标记的基于氨基氧基的接头-缀合的多肽和螯合剂缀合的多肽的cPn家族(例如，亲和体)显示显著更好的生物分布和更好的肿瘤摄取以及更好的清除，具有较少的肝摄取。

氟-标记的组合物为在诊断应用中高度期望的材料。使用建立的成像技术(例如PET)可显现¹⁸F标记的成像剂组合物。

在另一实施方案中，多肽可经由式(1)的二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合。

其中R'、R''、R'''、R''''独立地为H或C_1-10烷基、C_3-10烷基芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟基烷基、C_1-10烷基胺、C_1-10氟烷基，或者两个或更多个R基团与它们连接的原子共同形成碳环、杂环、饱和或不饱和的环，其中R可为H、C_1-10烷基、C_3-10烷基芳基、C_2-10烷氧基烷基、C_1-10羟基烷基、C_1-10烷基胺或C_1-10氟烷基。在一个实施方案中，n可在0-5变化。制备二胺二肟螯合剂的方法的实例描述于题为“Methods of radio fluorination of biologicallyactive vector(生物学活性载体的放射性氟化的方法)”的PCT申请国际公布号WO2004080492(A1)和题为“Radio labelled conjugates of RGD-containing peptidesand methods for their preparation via click-chemistry(含有RGD的肽的放射性标记的缀合物及其经由点击化学的制备方法)”的PCT申请国际公布号WO2006067376(A2)，它们通过引用结合到本文中。

^99mTc可经由二胺二肟在分离的多肽的N-末端与分离的多肽缀合。螯合剂可为双官能化合物。在一个实施方案中，双官能化合物可为Mal-cPN216。Mal-cPN216包含硫醇-反应性马来酰亚胺基团(用于与SEQ ID No. 1或SEQ ID No 2的多肽的末端半胱氨酸缀合)和双-胺肟基团(二胺二肟螯合剂)(用于与^99mTc螯合)。Mal-cPN216可具有式(2)。

二胺二肟螯合剂缀合的肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ. ID No.2或其保守变体的分离的多肽，(ii) 使二胺二肟螯合剂与多肽反应，以形成二胺二肟缀合的多肽。二胺二肟螯合剂还可与^99mTc进一步缀合。

在一个或多个实施方案中，多肽可经由NOTA (1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N''-三乙酸)螯合剂与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga缀合。NOTA缀合的多肽可如下制备：(i) 提供包含SEQ.ID No. 1、SEQ. ID No. 2或其保守变体的分离的多肽，(ii) 使NOTA螯合剂与多肽反应，以形成NOTA缀合的多肽。NOTA螯合剂还可与⁶⁷Ga或⁶⁸Ga进一步缀合。

在一个实施方案中，Ga(尤其是⁶⁷Ga)可经由NOTA螯合剂与分离的多肽缀合。NOTA螯合剂可被马来酰亚胺基官能化，如在式(3)中描述的。

本发明还包括使受试者的至少一部分成像的方法。在一个实施方案中，所述方法包括给予受试者成像剂组合物和使受试者成像。受试者可例如用诊断装置来成像。

所述方法还可包括监测所述组合物向受试者的递送和诊断患有HER2相关疾病状况(例如，乳腺癌)的受试者的步骤。在一个实施方案中，受试者可为哺乳动物，例如，人。在另一实施方案中，受试者可包含细胞或组织。组织可用于活组织检查。诊断装置可采用选自磁共振成像、光学成像、光学相干X射线断层照相、X-射线、计算机断层显像、正电子发射断层显像，或它们的组合的成像方法。

所述成像剂组合物可肠胃外给予人和其它动物。用于肠胃外注射的本发明的药物组合物包含药学上-可接受的无菌含水或非含水溶液剂、分散体、混悬剂或乳剂以及用于临用前重构为无菌可注射溶液剂或分散体的无菌散剂。合适的含水和非含水载体、稀释剂、溶剂或溶媒的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油(例如橄榄油)和可注射有机酯例如油酸乙酯。例如，通过使用涂布材料(例如卵磷脂)、通过调节分散体的粒径和通过使用表面活性剂，可保持适当的流动性。

这些成像剂组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。通过包括各种抗菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸，等)，可确保防止微生物作用。还可期望包括等渗剂，例如糖、氯化钠，等。通过包括延迟吸收的剂(例如单硬脂酸铝和明胶)，可引起可注射药物形式的延长的吸收。

所述成像剂组合物可在生理学上可接受的载体中分散，使得潜在的毒性最小化。因此，成像剂可在pH为约6-约8的生物相容的溶液中分散。在一些实施方案中，所述剂在pH为约7-约7.4的生物相容的溶液中分散。在其它实施方案中，所述剂在pH为约7.4的生物相容的溶液中分散。

所述成像剂组合物可与常用于药物工业以在含水介质中悬浮或溶解化合物的其它添加剂组合，随后悬浮液或溶液可通过本领域已知的技术灭菌。成像剂组合物可采用多种形式给予，并且适于所选的给药途径。例如，成像剂可局部(即，经由组织或粘膜)、静脉内、肌内、皮内或皮下给予。适于注射的形式包括用于制备无菌可注射溶液剂、分散体、脂质体或乳液制剂的无菌含水溶液剂或分散体和无菌散剂。适于吸入使用的形式包括例如在气溶胶中分散的那些剂。适于局部给予的形式包括霜剂、洗剂、软膏等。

可将所述成像剂组合物浓缩，以向受试者方便地递送优选量的所述剂并且以期望的形式在容器中包装。所述剂可在容器中分配，其中在生理学上可接受的溶液中分散，以方便促进以0.1 mg-50 mg所述剂/kg受试者体重的浓度给予所述剂。

在一个或多个实施方案中，在给予所述剂后约4小时，可使靶组织成像。在备选的实施方案中，在给予受试者所述剂后约24小时，可使靶组织成像。

实施例

提供以下实施例仅用于说明，并且不应理解为限制本发明。

基于可得到的文献(Bruskin等人，Nucl. Med. Biol. 2004：31：205；Tran等人，Imaging agent composition(成像剂组合物) Chem. 2007：18：1956)选择具有表达HER2的合理可能性的一组肿瘤发生细胞系，如在表3中所描述。

表3

细胞系	物种	类型	目的
				SKOV3	人	卵巢癌	候选
SKBR3	人	乳腺癌	候选
				C6	大鼠	神经胶质瘤	对照

所有细胞系得自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且按照推荐培养。在使用前将细胞培养至> 90%汇合。使用抗-Her2第一抗体(R&D Systems，PN MAB1129)和DakoQIFIKIT (PN K0078)对在表4中列举的细胞系进行流式细胞术(Beckman CoulterCytomics FC500 MPL)，用于定量分析间接免疫荧光染色。具有5种含有不同数量Mab分子的不同群体的校准珠粒与细胞系结合使用，以确定对于每个细胞表面受体的数量。在所有情况下，适当的同种型对照得自相应的销售商。

使用细胞解离缓冲液(PBS + 10 mM EDTA)而不是胰蛋白酶，将粘着细胞从其烧瓶释放，以避免细胞表面受体的蛋白水解。将细胞在PBS中洗涤两次，并且在冰冷的FC缓冲液(PBS + 0.5% BSA w/v)中再悬浮至5-10×10⁶个细胞/ml的浓度。将100 µL细胞的等分试样与5 µg第一抗体混合，并且在冰上孵育45分钟。细胞随后用1 ml冰冷的流式细胞术(FC)缓冲液(PBS，含有2%牛血清白蛋白)洗涤，在300×g下离心5分钟，并且在0.5 µL FC缓冲剂液中再悬浮。加入100 µL第二抗体片段(F(ab)₂ FITC-缀合的山羊抗-小鼠免疫球蛋白)与PBS的1:50稀释液，并且在冰上和暗处孵育45分钟。细胞随后用1 mL冰冷的FC缓冲液洗涤两次，在300×g下离心5分钟，并且在500 µL的FC缓冲液中再悬浮。在流式细胞术前使所有染色的细胞通过100-微米过滤器，以防止流动池堵塞。

在Beckman Coulter Cytomics FC500 MPL上进行流式细胞术。对于每个管，收集最少5×10⁴个事件。所有分析为单一颜色，在FL1中检测FITC。向前散射(FS)和侧散射(SS)数据证明所有细胞群体紧密成群。

流式细胞术用于评价细胞的体外HER2表达(图2A、2B和2C)，其中SKOV3细胞显示最高水平的HER2表达(图3)。图3中的结果可再现(n=3)。

最高表达细胞系为SKOV3。将这些细胞注入6-12周龄免疫-妥协的(immuno-compromised)小鼠，让其生长肿瘤。肿瘤生长曲线和成功率取决于接种的细胞数量。用3-4,000,000个细胞/小鼠得到优化肿瘤生长。

用年龄在6-15周范围的雌性CD-1裸小鼠(Charles River Labs，Hopkinton，MA)进行体内研究。在通风的架子中饲养小鼠，可随意获取食物和水，标准12小时白天-夜晚照明循环。对于异种移植，用100 μl的细胞/PBS注射动物。在右后腿(hindquarter)皮下植入细胞。在异氟烷麻醉下实施植入。对于SKOV3，在每只小鼠中植入3×10⁶-4×10⁶个细胞。在这些条件下，在多于80%的注射的动物中，在3-4周后得到可用的肿瘤(100-300 μg)。

通过解剖自小鼠收集肿瘤，并且整个肿瘤在-20℃下储存，直至处理。在Dounce匀浆器中，将肿瘤在1 ml补充蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA #24948)中在冰上研磨。匀浆随后在冰上孵育30分钟，随后在冷冻的离心机中在10,000×G下离心10分钟。收集上清液，并且在冰上或在4℃下储存，直至进一步处理。使用BCA蛋白质测定试剂盒(Pierce Biotechnology 23225)测定在裂解液中的蛋白质浓度。将裂解液稀释至标准浓度，以在微量滴定板中得到20 μg蛋白质/孔。根据制造商的使用说明，用市售可得的人HER2试剂盒(R&D Systems，DYC1129)进行ELISA。每一个样品一式三份运行，数据报告为pg HER2/μg总蛋白质，误差报告为标准偏差。

通过ELISA测量体内靶标表达。将切除的肿瘤匀浆化，并且使用市售可得的配对试剂盒(R&D系统，DYC1129，Minneapolis，MN)分析HER2。图3中的结果显示SKOV3细胞系生长高-表达肿瘤。ELISA对照为用于流式细胞术的负对照系的细胞-培养裂解液。这些结果说明SKOV3的肿瘤异种移植适用于靶向人HER2的分子的体内研究。

所有的多肽接受自瑞典的亲和体 AB。多肽根据其数字内部开发编码提及，其加前缀“Z”。表1详述本文所述的多肽。多肽包括多肽Z00342 (SEQ. ID No. 1)；多肽Z02891(SEQ. ID No. 2)；多肽Z00477 (SEQ. ID No. 3和4)，和Z00477的二聚物，即，(Z00477)₂(SEQ. ID No. 5)。

在Biacore™ 3000仪器(GE Healthcare，Piscataway，NJ)上，使用表面等离振子共振(SPR)检测体外测量多肽与HER2/neu抗原之间的结合相互作用。得到Her2/neu抗原的细胞外结构域作为与得自R&D Systems (Minneapolis，MN)的人IgG (Fc-Her2)的Fc区域的缀合物，并且与用10 μL/分钟HBS-EP缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4，0.15M NaCl，3mM EDTA，0.005% v/v 表面活性剂 P20)预先平衡的CM-5右旋糖酐-官能化的传感器芯片(GEHealthcare，Piscataway，NJ)共价连接，随后用EDC和NHS激活。在激活的传感器芯片上注射Fc-HER2 (5 μg/ml)/10 mM乙酸钠(pH 5.5)，直至实现(2分钟)期望的固定水平(~3000共振单位)。通过注射乙醇胺(1 M，pH 8.5)，封闭在传感器芯片上的残余的活化基团。通过用2.5M NaCl、50 mM NaOH重复(5×)洗涤，除去任何非共价结合的缀合物。在相同的传感器芯片上的第二流动池同样处理，只是没有Fc-HER2固定，以用作用于折射指数变化和与传感器芯片的非特异性结合相互作用的对照表面。在动力学研究之前，在两个表面上测试靶标分析物的结合，并且实施表面稳定性实验以确保足够除去结合的分析物，和在用2.5 M NaCl、50mM NaOH处理后，使传感器芯片再生。使用BIA评价软件(GE Healthcare，Piscataway，NJ)分析SPR传感图。通过评价对于每一个计算的动力学参数的残差和标准误差，“拟合优度” (χ2< 10)，并且将模型化的传感图与实验数据直接比较，确定动力学模型的稳健性。在8种分析物浓度(0-100 nM蛋白质)下收集SPR测量，并且将所得到的传感图与1:1 Langmuir结合模型拟合。

图1显示当在人HER2-官能化的表面上运行时对于Z00477 (SEQ. ID No. 3)和(Z00477)₂ (SEQ. ID No. 5)得到的实例表面等离振子共振(SPR)数据。该关系对于亲和力已知的所有多肽(表2)均适用，其中二聚物Z(477)₂ (SEQ. ID No. 5)的值为基于亲合力影响的估计值。

使用对先前公布的程序(Waibel，R.；等人，A. Nat. Biotechnol. 1999，17，897.)的改进，用fac-[^99mTc(CO)₃]⁺核实现对带His6 (SEQ ID NO: 7)-标签的多肽的标记。简要地，将Na[^99mTcO₄]/盐水(4 mCi，2 mL)加入到Isolink®硼烷碳酸盐(boranocarbonate)试剂盒(Alberto，R.等人，J. Am. Chem. Soc. 2001，123，3135.)中。将所得到的溶液加热至95℃保持15-20分钟，以得到fac-[^99mTc(CO)₃(H₂O)₃]⁺。除去一部分(2 mCi，1 mL)溶液，并且用1 N HCl中和至pH ~7。移出325 μL等分试样，并且加入到His6-多肽(SEQ ID NO: 7) (40μg)的溶液中。将所得到的溶液在35-37℃的水浴中加热40分钟。典型的放射化学收率在80-95%范围(通过ITLC-SG测定，Biodex，0.9% NaCl)。在NAP-5柱(GE Healthcare，10 mM PBS)上将粗反应产物层析分离，以得到>99%放射化学纯度的产物。得到的典型比活为3-4 μCi/μg。所得到的溶液随后用10 mM PBS稀释，以得到用于随后的生物分布研究的适当浓度。

在配备Grace-Vydac Peptide/Protein C4 (4.6×250 mm)柱和Raytest GABI放射性检测器的Agilent 1100系列HPLC上进行HPLC。溶剂A为95:5水:MeCN(具有0.1% TFA)，溶剂B为5:95水:MeCN(具有0.1% TFA)。梯度如下(所有变化是线性的；时间/%B)：0/0、4/20、16/60、20/100、25/100、26/0、31/0。

在纯化前，用三羰基锝核以高收率(>90%)标记每一种多肽。通过NAP-5层析法纯化得到具有>99%放射化学纯度的^99mTc-标记的多肽样品(表4)。

表4

NAP-5纯化的放射性标记的多肽的代表性的HPLC色谱图示于图4。在220 nm UV色谱图中，放射性标记的物类的保留时间实际上与相应的未标记的多肽的保留时间没有变化(除了由于UV和γ检测器的物理分离的时间差异；数据未显示)。

用于研究^99mTc(CO)₃(His6)-多肽('His6'公开为SEQ ID NO: 7)的动物模型。

用年龄在6-15周范围的雌性CD-1裸小鼠(Charles River Labs，Hopkinton，MA)进行体内研究。在通风的架子中饲养小鼠，可自由获取食物和水，标准12小时白天-夜晚照明循环。对于异种移植，用100 μl的细胞/PBS注射动物。在右后腿皮下植入细胞。在异氟烷麻醉下实施植入。对于SKOV3，在每只小鼠中植入3×10⁶-4×10⁶个细胞。在这些条件下，在多于80%的注射的动物中，在3-4周后得到可用的肿瘤(100-300 μg)。

生物分布

将~1 μg的^99mTc-标记的多肽(~3 μCi/1 μg)尾静脉注射给予小鼠。将小鼠放置在滤纸衬里的笼子中，直至安乐死。在每个时间点使三只小鼠安乐死，将目的组织解剖，并且在Perkin Elmer Wallac Wizard 1480 γ计数器上计数。对血液、肾、肝、脾和注射部位(尾部)收集数据。将来自笼子与膀胱的尿汇集，并且也计数。将其余的组织计数，并且对于每只动物，将所有组织的总和加上尿求总和，以提供总注射剂量。对于每一种器官，基于该总数确定%注射剂量，并且将器官称重，用于确定每克的%注射剂量(%ID/g)。数据报告为所有三只小鼠在时间点的平均值，其中误差条代表该组的标准偏差。

将^99mTc标记的Z00477 (SEQ. ID No. 4)多肽注入SKOV3小鼠。图6显示对于这些实验的肿瘤和血液曲线。Z00477 (SEQ. ID No. 4)多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示良好的肿瘤摄取，最大值为在注射后(PI)30分钟约3%的注射剂量/克组织，并且在PI 240分钟时，峰值肿瘤:血液比大于8。

多肽呈现从血液单指数清除，其中半衰期小于2分钟。该清除主要通过肝和肾介导。观察到在脾中多肽摄取适度，并且在肝中适度至高摄取，如在表5中所描述的。

表5. 在携带SKOV3肿瘤的小鼠中，Z00477 (SEQ. ID No. 3) His6 (SEQ ID NO:7) (带标签)的摄取(%ID/g)

	5分钟	30分钟	120分钟	240分钟
					血液	7.30 ± 0.32 (n=3)	1.47 ± 0.16 (n=3)	0.56 ± 0.03 (n=3)	0.43 ± 0.03 (n=3)
肿瘤	1.57 ± 0.62 (n=3)	3.06 ± 0.17 (n=3)	3.40 ± 0.87 (n=3)	3.60 ± 1.15 (n=3)
					肝	29.07 ± 0.70 (n=3)	32.19 ± 6.50 (n=3)	39.57 ± 6.29 (n=3)	35.17 ± 3.48 (n=3)
肾	54.83 ± 9.29 (n=3)	85.89 ± 10.00 (n=3)	97.99 ± 10.45 (n=3)	92.54 ± 7.36 (n=3)
					脾	5.57 ± 2.39 (n=3)	3.76 ± 0.23 (n=3)	4.65 ± 2.21 (n=3)	5.36 ± 0.80 (n=3)

比起相应的单体，二价多肽呈现较高的亲和力，推测是由于亲合力效应。然而，它们较大的尺寸可阻碍肿瘤穿透。对于HER2多肽，可得到四种高亲和力多肽的每一种的二价形式。将Z00477 (SEQ. ID No. 3)二聚物(Z00477)₂ (SEQ. ID No. 5)放射性标记，并且用于在具有SKOV3-肿瘤的小鼠中的4小时生物分布实验。

一价和二价多肽另外呈现类似的生物分布特性，并且观察到二者的血液半衰期均在1-2分钟范围。结果清楚地表明单体和二价多肽两者可体内靶向HER2。

为了引入^99mTc螯合剂cPN216 (图7)，合成双官能化合物Mal-cPN216，其包含硫醇-反应性马来酰亚胺基团(用于与多肽的末端半胱氨酸缀合)和胺肟基团(用于螯合^99mTc)。

cPN216-胺由GE Healthcare得到。N-ß-马来酰亚胺基丙酸购自PierceTechnologies (Rockford，IL)。N-甲基吗啉、(苯并三唑-1-基氧基)三吡咯烷子基磷六氟磷酸盐(PyBoP)、二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵和无水DMF购自Aldrich (Milwaukee，WI)。PBS缓冲液(1x，pH 7.4)得自Invitrogen (Carlsbad，CA)。HPLC-级乙腈(CH₃CN)、HPLC-级三氟乙酸(TFA)和Millipore 18 mΩ水用于HPLC纯化。

在0℃下，向N-ß-马来酰亚胺基丙酸(108 mg，0.64 mmol)、cPN216-胺(200 mg，0.58 mmol)和PyBoP (333 mg，0.64 mmol)/无水DMF的冰冷溶液中加入0.4 M的N-甲基吗啉/DMF (128 μL，1.16 mmol)。2小时后除去冰浴，将混合物在室温下搅拌过夜，随后进行HPLC纯化。得到白色粉末状的产物(230 mg，80%收率)。¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)：δ 1.35(m，2 H)，1.43 (s，12 H)，1.56 (m，5 H)，1.85 (s，6 H)，2.33 (dd，J1= 8 Hz，J2=4 Hz，2H)，2.78 (m，4 H)，3.04 (m，2 H)，3.61 (dd，J1= 8 Hz，J2=4 Hz，2 H)，7.02 (s，2 H)，8.02(s，1 H)，8.68 (s，4 H)，11.26 (s，2 H)；对于[M+H]⁺，m/z=495.2(C24H43N6O5，计算MW=495.3)。

以约1 mg/mL的浓度，用刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶解多肽。通过加入DTT/刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶液，还原多肽中的二硫键。DTT的最终浓度为20 mM。将反应混合物涡旋2小时，经过用脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)预先平衡的Zeba脱盐旋转柱(Pierce Technologies)，以除去过量的DTT试剂。收集洗脱的还原的多肽分子，加入双官能化合物Mal-cPN216(20当量/当量多肽)作为在DMSO中的溶液，将混合物在室温下涡旋3小时，并且用液氮冷冻。将反应混合物储存过夜，随后进行反相HPLC纯化(图8A和图8B)。

在MiCHROM Magic C18AQ 5 μ 200A柱(MiChrom Bioresources，Auburn，CA)上实施HPLC纯化。溶剂A：H₂O (具有0.1%甲酸)，溶剂B：CH₃CN (具有0.1%甲酸)。梯度：5-100% B，经30分钟。

将含有期望产物的级分合并，用100 mM碳酸氢铵溶液中和，通过冻干除去溶剂，以得到白色固体状的期望的成像剂组合物(收率41%)。

纯化产物的LC-MS分析证实存在期望产物，MW表明仅一种cPN216标记加入到多肽构建体中(Z00477 (SEQ. ID No. 3)-cPN216：计算MW：7429 Da，实测值：7429 Da；Z02891(SEQ. ID No. 2)-cPN216 计算MW：7524 Da，实测值：7524 Da)。

向20 mL小瓶中加入10.00 mL蒸馏的去离子水。在加入NaHCO₃ (450 mg，5.36×10^-3 mol)、Na₂CO₃ (60 mg，5.66×10^-4 mol)和对氨基苯甲酸钠(20 mg，1.26×10^-4 mol)之前，使氮气鼓泡通过该溶液约30分钟。所有试剂独立称重，并且加入到含有水的小瓶中。将氯化锡(1.6 mg，7.09×10^-6 mol)和MDP (2.5 mg，1.42×10^-5 mol)共同称重到1打兰小瓶中，随后通过在约1 mL的碳酸盐缓冲液混合物中快速悬浮而转移(具有1次随后的洗涤)。移出10μL等分试样，并且在氮气流下转移至硅烷化的小瓶，立即冷冻，并且保持在液氮浴中，直至冻干。每一个小瓶部分加盖橡胶隔膜，并且放置在托盘冻干器中过夜。将小瓶真空密封，从冻干器移出，用铝盖卷曲密封，用无水氮气再次加压，并且在致冷器中储存，直至进一步使用。

使用内部生产的一步试剂盒制剂(Chelakit A+)实施放射性标记的多肽的合成，该制剂含有氯化亚锡作为锝的还原剂、亚甲基二膦酸、对氨基苯甲酸盐作为自由基清除剂和碳酸氢钠/碳酸钠(pH 9.2)作为缓冲液的冻干的混合物。按快速连续顺序，将20 μL的2 μg/μL多肽/盐水溶液加入到Chelakit中，接着立即加入得自Cardinal Health (Albany，NY)的Na^99mTcO₄ (0.8 mCi，29.6 MBq)/0.080 mL盐水(0.15M NaCl)。将混合物搅动一次，让其在环境温度下静置20分钟。完成后，通过ITLC测定粗放射化学收率(下表6，根据ITLC-SG，Biodex，0.9% NaCl)。

表6

化合物	粗RCP (%)	纯化的RCP (%)	RCY (%)衰变校正/(未校正)
				Z00477 (SEQ. ID No. 3)	49.2	98.6	53.9 (13.1)
Z02891 (SEQ. ID No. 2)	71.6	97.5	46.9(43.8)

用0.35 mL的150 mM无菌NaCl将反应体积提高至0.45 mL，通过尺寸排阻色谱法(NAP5，GE Healthcare，装载10 mM PBS)纯化最终产物。将粗反应混合物负载于NAP5柱上，让其进入凝胶床，在用0.8 mL的10 mL PBS洗脱后，分离最终的纯化产物。在标准剂量校准器(CRC-15R，Capintec，Ramsey，NJ)中测定最终活性。通过ITLC(>98.5%)、C4 RP-HPLC (图9)和SEC-HPLC分析测定放射化学收率(表6)和纯度。最终产物(10-15μCi/μg，0.2-0.5 μCi/μL (0.37MBq/μg，7.4MBq/mL))立即用于生物分布研究。

用于该实验的HPLC条件如下：C4 RP-HPLC方法1：溶剂A：95/5 H₂O/CH₃CN (具有0.05% TFA)，溶剂B：95/5 CH₃CN/ddH₂O (蒸馏的去离子水)(具有0.05% TFA)。梯度洗脱：0分钟0%B，4分钟20%B，16分钟60%B，20分钟100%B，25分钟100%B，26分钟0%B，31分钟0%B。

C4 RP-HPLC方法2：溶剂A：0.06% NH₃/水，溶剂B：CH₃CN。梯度洗脱：0分钟0%B，4分钟20%B，16分钟60%B，20分钟100%B，25分钟100%B，26分钟0%B，31分钟0%B。

在HP Agilent 1100上实施RP-HPLC分析，其具有G1311A QuatPump、具有100μL注射器和2.0mL座毛细管的G1313A自动注射器、Grace Vydac-蛋白质C4柱(S/N E050929-2-1，4.6 mm×150 mm)、G1316A柱加热器、G1315A DAD和Ramon Star-GABI γ-检测器。

SEC HPLC：溶剂：1× (10 mM) PBS (Gibco，Invitrogen，pH 7.4，含有CaCl₂和MgCl₂)。等度洗脱30分钟。在Perkin Elmer SEC-4 Solvent Environmental对照，Series410 LC泵，ISS 200 Advanced LC样品处理器和Series 200二极管阵列检测器上实施分析。具有Socket 8103 0111针孔(0.7 mm内径，具有250 μL体积)流动池γ检测器的RaytestGABI通过Perkin Elmer NCI 900 Network Chromatography Interface对接。所用的柱为Superdex 75 10/300 GL High Performance SEC柱(GE Healthcare。编码：17-5174-01，ID号0639059)。

用于将^99mTc掺入cPN216螯合剂(pH=9.2)的Chelakits的操作pH几乎匹配Z00477(SEQ. ID No. 3)多肽的计算的pI。测定在这些条件下的标记，以引起在最终产物中的聚集(图5A和图5B)。通过尺寸排阻HPLC和通过在生物分布研究中观察到的提高的血液停留时间和肝摄取证实聚集。通过改变多肽的等电点，将^99mTc成功地掺入到Z02891 (SEQ. ID No.2)构建体上。尺寸排阻HPLC证实存在具有适当的分子量的物类，并且生物分布研究显示在肿瘤异种移植物中示踪剂的摄取。

将~1 ug的^99mTc-标记的多肽(~10 μCi/1 μg)尾静脉注射给予小鼠。将小鼠放置在滤纸衬里的笼子中，直至安乐死。在每个时间点使三只小鼠安乐死，将目的组织解剖，并且在Perkin Elmer Wallac Wizard 1480 γ计数器上计数。对血液、肾、肝、脾和注射部位(尾部)收集数据。将来自笼子与膀胱的尿汇集，并且也计数。将其余的组织计数，并且对于每一只动物，将所有组织的总和加上尿求总和，以提供总注射剂量。对于每一种器官，基于该总数确定%注射剂量，并且将器官称重，用于确定每克的%注射剂量(%ID/g)。将数据报告为所有4-5只小鼠在时间点的平均值，其中误差条代表该组的标准偏差。在4小时内，取4个时间点(注射后5、30、120和240分钟)。

Z02891 (SEQ. ID No. 2)-cPN216-^99mTc多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示强肿瘤摄取，在注射后(PI)30分钟，具有7.11 ± 1.69% (n=5)的注射剂量/克组织的值，在高达PI 240分钟的研究的时间-过程中，其保持相当恒定。在注射后30、120和240分钟，肿瘤:血液比分别为2、5和5。图10、11和12显示对于这些实验的肿瘤、血液和肿瘤:血液曲线。

多肽呈现从血液单指数清除，其中半衰期小于2分钟。该清除主要通过肾介导，在注射后PI 240分钟，具有10.58 ± 2.96 (n=5) ID/器官。活性主要在尿中分泌。在研究过程中，观察到由于可能的聚集，在脾中多肽摄取适度至高，并且在肝中适度摄取，例如，12%ID/器官(相当于在小鼠中%ID/g的值)。

Z02891 (SEQ. ID No. 2)-cPN216-^99mTc的生物分布结果

表7 在携带SKOV3肿瘤的小鼠中，Z02891 (SEQ. ID No. 2) cPN216摄取(%ID/g)

	5分钟	30分钟	120分钟	240分钟
					血液	8.69 ± 0.99 (n=5)	3.32 ± 0.48 (n=5)	1.33 ± 0.05 (n=5)	1.05 ± 0.09 (n=5)
肿瘤	3.19 ± 1.78 (n=4)	7.11 ± 1.69 (n=5)	7.18 ± 3.33 (n=5)	5.07 ± 3.47 (n=5)
					肝	9.87 ± 0.81 (n=5)	11.07±1.06 (n=5)	8.33 ± 0.50 (n=5)	9.38 ± 0.69 (n=5)
肾	67.61±9.24 (n=5)	74.15±4.17 (n=5)	37.14±3.48 (n=5)	29.67±10.87 (n=5)
					脾	7.07 ± 1.84 (n=5)	4.51 ± 1.25 (n=5)	3.91 ± 0.44 (n=5)	2.85± 0.62 (n=5)

经由设计的C-末端半胱氨酸，Z00477 (SEQ. ID. NO. 4)、Z00342 (SEQ. ID No.1)和Z02891 (SEQ. ID No. 2)-半胱氨酸多肽被氨基氧基官能化。通过高效液相色谱法(HPLC)测定提供的多肽分子的纯度>95%。

为了将¹⁸F掺入多肽分子中，合成包含两个垂直的基团的双官能接头Mal-AO：硫醇-反应性马来酰亚胺基团(用于与设计的半胱氨酸缀合)和醛-反应性氨基氧基(图13A和图13B)。使用1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)-介导的偶联条件，通过使N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺与2-(叔丁氧基羰基氨基氧基)乙酸反应，来制备该接头，得到接头的Boc-保护的形式。随后通过酸裂解，使Boc保护基团脱保护，以定量收率得到最终的Mal-AO产物。最终产物无需进一步纯化可直接使用。

二氯甲烷、2-(叔丁氧基羰基氨基氧基)乙酸、三乙胺、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸(TFA)盐、水合N-羟基苯并三唑(HOBT)，1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)、二硫苏糖醇(DTT)和所有其它标准合成试剂购自Sigma-Aldrich Chemical Co.(St. Louis，MO)。所有化学物质无需进一步纯化可直接使用。PBS缓冲液(1x，pH 7.4)得自Invitrogen (Carlsbad，CA)。HPLC-级乙酸乙酯、己烷、乙腈(CH₃CN)、三氟乙酸(TFA)和Millipore 18 mΩ水用于纯化。

向2-(叔丁氧基羰基氨基氧基)乙酸(382 mg，2 mmol)/无水二氯甲烷(20 mL)溶液中序贯加入三乙胺(307 μL，2.2 mmol)、N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺-TFA盐(508 mg，2mmol)、HOBT(306 mg，2 mmol)和EDC (420 mg，2.2 mmol)。在室温下搅拌24小时后，反应混合物用乙酸乙酯(50 mL)稀释，用饱和碳酸氢钠溶液(3×30 mL)、水(30 mL)和盐水(30 mL)洗涤。有机层经无水硫酸镁干燥，过滤。将滤液浓缩至浅黄色固体，通过柱色谱法纯化(70%乙酸乙酯/己烷)，以得到白色粉末状的产物(500 mg，80%收率)。¹H-NMR (400MHz，CDCl₃)：δ1.50 (s，9 H)，3.55 (tt，J1= 6.0 Hz，J2= 6.5 Hz，2 H)，3.77 (dd，J= 7.6 Hz，2 H)，4.30(s，2 H)，6.3 (s，2 H)。

将9.3 mg的Mal-AO-Boc在1 mL的3M HCl/甲醇中的溶液在室温下搅拌18小时。真空除去溶剂，以得到浅黄色固体状的Mal-AO (80%收率)。¹H-NMR (400MHz，DMSO-d₆)：δ 3.27CH₂ (t，J= 4.0 Hz，2H)，3.49 CH₂ (t，J= 4.0 Hz，2H)，4.39 CH₂O (s，2H)，7.00 CH=CH (s，2H)；对于[M+H]⁺，m/z=214.07(C₈H₁₂N₃O₄，计算MW=214.11)。

以约1 mg/mL的浓度，用刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶解多肽。通过加入二硫苏糖醇(DTT)在刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)中的溶液，还原多肽中的二硫键。DTT的最终浓度为20 mM。将反应混合物涡旋2小时，通过用脱气的PBS缓冲液预先平衡的Zeba脱盐旋转柱(Pierce Technologies)洗脱，以除去过量的DTT试剂。收集还原的多肽，加入双官能Mal-AO化合物(15当量/当量多肽)作为在DMSO中的溶液。在室温下涡旋过夜后，反应混合物用高效液相色谱法(HPLC)纯化(图14A和图14B)。

在MiCHROM Magic C18AQ 5μ 200A柱(MiChrom Bioresources，Auburn，CA)上实施HPLC纯化。溶剂A：H₂O (具有0.1%甲酸)，溶剂B：CH₃CN (具有0.1%甲酸)。梯度：5-100% B，经30分钟。将含有期望产物的级分合并，用100 mM碳酸氢铵溶液中和，通过冻干除去溶剂，以得到白色固体状的氨基氧基-修饰的多肽。

ESI-TOF-MS分析证实存在具有预期的分子量的靶标产物，对于Z00477 (SEQ. IDNo. 4)-ONH₂、Z00342 (SEQ. ID No. 1)-ONH₂和Z02891 (SEQ. ID No. 2)-ONH₂，分别计算MW为：6964 Da、8531 Da和7243 Da，实测值：6963 Da、8532 Da和7244 Da。

方法：在氮气气氛下或在使用前用氮气净化的顶部卷曲密封的小瓶中实施所有反应。购买Kryptofix 222 (Aldrich)和K₂CO₃ (EMD Science)并且原样使用。Optima^TM-级乙腈用作HPLC和反应溶剂二者。

K¹⁸F (40mCi.mL^-1 (1480 MBq.mL^-1)/纯水)得自IBA Molecular (Albany，NY)和PETNET Solutions (Albany，NY)，并且原样使用。[¹⁸F^-]氟化物首先在Chromafix 30-PS-HCO₃阴离子交换柱(ABX，Radeberg，德国)上固定，随后用1 mL含有Kryptofix K222 (376g.mol^-1，8 mg，2.13×10^-5 mol)和碳酸钾(138.2 g.mol^-1，2.1 mg，1.52×10^-5 mol)的乙腈:蒸馏的去离子H₂O (ddH₂O)的4:1混合物洗脱到干燥(drydown)容器中。在部分真空和氮气流下，伴随温和加热(~ 45℃) (~15分钟)除去溶剂。来源小瓶和阴离子交换柱随后用0.5mL含有K222 (8 mg)的乙腈洗涤，在部分真空和温和加热(~ 10分钟)下，使反应混合物再次干燥。用氮气使反应容器再次加压，用另外的0.5mL乙腈再次重复共沸干燥。将4-甲酰基-N,N,N-三甲基苯胺三氟甲磺酸酯(313.30 g.mol^-1，3.1 mg，9.89×10^-6 mol)溶解于0.35 mL的无水DMSO (Acros)中，并且直接加入到含有K¹⁸F.K222、K₂CO₃的反应容器中。将反应混合物加热至90℃保持15分钟，立即冷却，用3 mL的ddH₂O淬灭。该混合物随后经过阳离子交换柱(Waters SepPak Light Accell Plus CM)，用ddH₂O稀释至10 mL，并且负载于反相C18SepPak (Waters SepPak Plus C18)上。SepPak用10 mL的ddH₂O冲洗，随后用30 mL的空气净化。将[¹⁸F]4-氟代苯甲醛(¹⁸FBA)在1.0 mL的甲醇中洗脱。

单独地，将高回收小瓶(2mL，National Scientific)装载Z00477-(SEQ. ID No.3)-ONH₂ (0.35-0.5mg)、Z00342-(SEQ. ID No.1)-ONH₂ (0.35-0.5mg)或Z02891-(SEQ. IDNo. 2)-ONH₂ (0.35-0.5mg)。将固体在25 μL的ddH₂O和8 μL的三氟乙酸中悬浮。将25 μL的¹⁸FBA/甲醇(参见以上)转移至反应小瓶。将容器加盖，卷曲，放置在加热块中，并且在60℃下保持15分钟；此时移出小的等分试样(<5 μL)用于分析型HPLC分析。在准备半制备型HPLC纯化中，450 μL的含有0.1% TFA的ddH₂O用于将溶液稀释至约500 μL。将¹⁸FB-多肽分离并且通过半制备型HPLC纯化。用ddH₂O将含有产物(0.113 mCi/4.18MBq)的HPLC级分稀释5:1，随后固定在tC18 Plus Sep Pak (Waters)上。SepPak首先用5 mL的ddH₂O，随后用30 mL的空气冲洗。通过首先洗脱空体积(约0.5mL)，接着在单独的烧瓶中收集250-300 μL的洗脱液，在最少量的乙醇中分离¹⁸FB-多肽。对已分离的产物实施RP-HPLC分析，以确定放射化学和化学纯度。通常，注射10 μL的0.1 μCi/μL溶液，用于配制后分析。在表9中指出分离的放射化学收率，并且由向¹⁸FBA中加入多肽而衰变校正，并且放射化学纯度>99%。或者，¹⁸F-标记的多肽通过NAP5尺寸排阻色谱法如下分离：用10mM PBS将反应混合物稀释至约0.5mL，并且在凝胶上负载。通过用0.8 mL的10mM PBS洗脱柱，分离¹⁸F-标记的多肽，并且无需进一步修饰可直接使用。这些结果在表8和图15中说明。

表8

化合物	分离的收率(衰变校正)(%)	HPLC RCP (%)
			Z00477 (SEQ. ID No. 4)	0.6%/1.2%	95%
Z00342 (SEQ. ID No. 1)	8.2% (10.7%)	>99%
			Z02891 (SEQ. ID No. 2)	6.2% (7.6%)	>99%

所用的分析型HPLC条件如下：在HP Agilent 1100上实施分析，其具有G1311AQuatPump、具有100μL注射器和2.0mL座毛细管的G1313A自动注射器、Phenomenex GeminiC18柱(4.6mm×150mm)，5μ，100Å (S/N 420477-10)、G1316A柱加热器、G1315A DAD和RamonStar-GABI γ-检测器。95:5 ddH₂O:CH₃CN(具有0.05% TFA)，溶剂B：CH₃CN(具有0.05%TFA)。梯度洗脱(1.0 mL.分钟^-1)：0分钟0%B，1分钟15%B，21分钟50%B，22分钟100%B，26分钟100%B，27分钟0%B，32分钟0%B，或梯度洗脱(1.2 mL.分钟^-1)：0分钟0%B，1分钟15%B，10分钟31%B，10.5分钟100%B，13.5分钟100%B，14分钟0%B，17分钟0%B。

所用的半制备型HPLC条件如下：在Jasco LC上实施纯化，其具有DG-2080-54 4-线脱气器、MX-2080-32动态混合器和两个PU-2086 Plus Prep泵、具有安装的大体积注射试剂盒的AS-2055 Plus Intelligent自动注射器、Phenomenex 5μ Luna C18(2) 100Å，250 ×10 mm，5 μ保护柱(S/N 295860-1、P/N 00G-4252-N0)、MD-2055 PDA和与固态SiPIN光电二极管γ检测器连接的Carroll & Ramsey Associates Model 105S Analogue Ratemeter。梯度洗脱：0分钟5%B，32分钟20%B，43分钟95%B，46分钟95%B，49分钟5%B，溶剂A：ddH₂O:CH₃CN(具有0.05% TFA)，溶剂B：CH₃CN(具有0.05% TFA)。

将~1 ug的¹⁸F-标记的多肽(~4 uCi/1 µg)尾静脉注射给予小鼠。将小鼠放置在滤纸衬里的笼子中，直至安乐死。在每个时间点使三只小鼠安乐死，将目的组织解剖，并且在Perkin Elmer Wallac Wizard 1480 γ计数器上计数。对于血液、肾、肝、脾、骨和注射部位(尾部)，收集数据。将来自笼子与膀胱的尿汇集，并且也计数。将其余的组织计数，并且对于每一只动物，将所有组织的总和加上尿求总和，以提供总注射剂量。基于该总数确定对于每一种器官的注射剂量百分比，并且将器官称重，用于确定每克的注射剂量百分比(%ID/g)。数据报告为所有三只小鼠在时间点的平均值，其中误差条代表该组的标准偏差。

在SKOV3细胞异种移植模型中，多肽经历生物分布研究。在4小时内，取4个时间点(注射后5、30、120和240分钟)。完整的生物分布数据获自在携带SKOV3肿瘤的小鼠中的%ID/g Z02891 (SEQ. ID No. 2)-¹⁸F-氟苄基肟和在携带SKOV3肿瘤的小鼠中的%ID/g Z00342(SEQ. ID No. 1) ¹⁸F-氟苄基肟。图16、图17和图18显示对于这些测试的肿瘤、血液、肿瘤:血液和清除曲线。

Z02891 (SEQ. ID No. 2) ¹⁸F-氟苄基肟多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示强肿瘤摄取，在注射后(PI)240分钟时，具有17.47 ± 2.89 (n=3)的注射剂量/克组织的值。在注射后30、120和240分钟时，肿瘤:血液比分别为约3、34和128。Z00342 (SEQ. ID No. 1)¹⁸F-氟苄基肟多肽在表达靶标的SKOV3肿瘤中显示强肿瘤摄取，在PI 240分钟时，具有12.45± 2.52 (n=3)的注射剂量/克组织的值。在注射后30、120和240分钟时，肿瘤:血液比分别为约3、32和53。

多肽呈现从血液单指数清除，其中半衰期小于2分钟。Z02891 (SEQ. ID No. 2)的该清除主要通过肾介导，在PI 240分钟时，具有0.95 ± 0.07 (n=3) ID/器官。活性主要在尿中分泌。在研究过程(注射后4小时)期间，观察到在脾中多肽摄取最小化，和在肝中低摄取，约1.8%ID/器官(相当于在小鼠中的%ID/g值)。

表9. 在携带SKOV-3肿瘤的小鼠中，Z02891 (SEQ. ID No. 2) ¹⁸F-氟苄基肟摄取(%ID/g)

	5分钟	30分钟	120分钟	240分钟
					血液	9.23± 0.68 (n=3)	2.91 ± 0.23 (n=3)	0.40 ± 0.07 (n=3)	0.14 ± 0.02 (n=3)
肿瘤	2.39 ± 1.13 (n=3)	8.91 ± 2.09(n=3)	13.47 ± 3.61 (n=3)	17.47 ± 2.89 (n=3)
					肝	4.68 ± 0.45 (n=3)	3.85 ± 0.95 (n=3)	1.57 ± 0.42 (n=3)	1.59 ± 0.83 (n=3)
肾	72.42 ± 15.61(n=3)	35.02 ± 5.76(n=3)	5.22 ± 0.65 (n=3)	2.49 ± 0.17 (n=3)
					脾	3.04 ± 1.15 (n=3)	1.46 ± 0.05 (n=3)	0.37 ± 0.01 (n=3)	0.26 ± 0.04 (n=3)

表10. 在携带SKOV-3肿瘤的小鼠中，Z00342 (SEQ. ID No. 1) ¹⁸F-氟苄基肟摄取(%ID/g)

	5分钟	30分钟	120分钟	240分钟
					血液	7.38± 0.72 (n=3)	1.76 ± 0.09 (n=3)	0.33 ± 0.08 (n=3)	0.87 ± 0.98 (n=3)
肿瘤	2.54 ± 0.00 (n=2)	4.97 ± 3.14 (n=3)	10.30 ± 1.08 (n=3)	12.45 ± 2.52 (n=3)
					肝	8.29 ± 0.41 (n=3)	6.94 ± 0.92 (n=3)	2.54 ± 1.44 (n=3)	1.41 ± 0.35 (n=3)
肾	78.93 ± 2.93 (n=3)	30.94 ± 4.93 (n=3)	10.75 ± 2.17 (n=3)	4.91 ± 0.63 (n=3)
					脾	3.85 ± 0.51 (n=3)	1.77 ± 0.34 (n=3)	0.47 ± 0.08 (n=3)	0.23 ± 0.05 (n=3)

所有反应在氮气气氛下或在用氮气净化的顶部卷曲密封的小瓶中实施。Optima^TM-级乙腈用作HPLC和反应溶剂二者。

将[¹²³I]4-碘代苯甲醛(¹²³I BA)加入到含有0.35-0.5mg的多肽-ONH₂ (Z02891，SEQ. ID No. 2)的高回收小瓶(2 mL，National Scientific)中。通过在25 μL的ddH₂O中溶解多肽，并且加入8 μL的三氟乙酸，接着加入¹²³IIBA/甲醇，开始反应。将容器加盖，卷曲，放置在加热块中，并且在60℃下保持15分钟；移出小的等分试样(<5 μL)用于分析型HPLC分析，以评价反应状态。在准备半制备型HPLC纯化中，将反应混合物稀释至ddH₂O:含有0.1%TFA的乙腈混合物的最小的1:1混合物。将¹²³IB-多肽分离并且通过半制备型HPLC或NAP5尺寸排阻色谱法纯化。将含有产物的HPLC级分用ddH₂O进一步稀释(5:1)，并且随后固定在tC18 Plus Sep Pak (Waters)上。首先用5 mL的ddH₂O，随后用30 mL的空气冲洗SepPak，得到¹²³IB-多肽/最少量的乙醇，做法是首先洗脱空体积(约0.5mL)，接着在单独的烧瓶中收集250-300 μL的洗脱液。对已分离的产物实施RP-HPLC分析，以确定放射化学和化学纯度。

在NOTA (1,4,7-三氮杂环壬烷-N,N',N''-三乙酸)螯合剂与多肽缀合后，用Ga(尤其是⁶⁷Ga)标记多肽Z00477 (SEQ. ID 3)。(图19)

如下完成Mal-NOTA与多肽分子的生物缀合。以约1 mg/mL的浓度，用刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶解多肽。通过加入DTT/刚脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)溶液，还原多肽中的二硫键。DTT的最终浓度为20 mM。将反应混合物涡旋2小时，通过用脱气的PBS缓冲液(1x，pH 7.4)预先平衡的Zeba脱盐旋转柱(Pierce Technologies)，以除去过量的DTT试剂。收集洗脱的还原的多肽分子，并且加入双官能化合物mal-NOTA(15当量/当量多肽)作为在DMSO中的溶液，将混合物在室温下涡旋。让反应进行过夜，以确保多肽分子的完全转化。

在MiCHROM Magic C18AQ 5μ 200A柱(MiChrom Bioresources，Auburn，CA)上实施HPLC纯化。溶剂A：H₂O (具有0.1%甲酸)，溶剂B：CH₃CN (具有0.1%甲酸)。梯度：5-100% B，经30分钟。(图20A)

将含有期望产物的级分合并，用100 mM碳酸氢铵溶液中和，通过冻干除去溶剂，以得到白色固体状的缀合的多肽。

纯化产物的LC-MS分析证实存在期望产物，并且MW表明仅一种NOTA螯合剂加入到多肽构建体中(对于Z00477 (SEQ. ID No. 3)-NOTA，计算MW：7504 Da，实测值：7506 Da)。(图20B)

随后如下完成放射性标记：开始时将25µl HEPES溶液(63mM)加入到螺旋顶盖小瓶中，接着加入10µl ⁶⁷GaCl₃ (GE Healthcare)/40.5 MBq的0.04M HCl。随后将30 µg (MW=7506，4.0×10^-9 mol)的NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)/30 µl H₂O加入到反应混合物中，以得到61 µM的最终NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)浓度，pH为3.5-4.0。将反应小瓶密封，反应保持在环境温度下。在室温下2小时后，粗反应混合物的反相HPLC分析测定⁶⁷Ga-NOTAZ00477 (SEQ. ID No. 3)的放射化学纯度(通过HPLC测定)为95%。(图21)。在1天的反应时间后，通过HPLC纯化⁶⁷Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)。将22MBq的⁶⁷Ga-NOTA Z00477(SEQ. ID No. 3)注射到HPLC上，用于纯化。15MBq的⁶⁷Ga标记的产物得自纯化(放射化学收率=68%)。真空除去HPLC溶剂，以得到具有约0.5 mL体积的溶液。随后加入约1.45 mL的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水，以得到在pH 6-6.5下放射性浓度为7.7 MBq/mL的最终溶液。发现纯化的配制的⁶⁷Ga-NOTA Z00477 (SEQ. ID No. 3)在室温下稳定至少2小时。(RCP=96%，通过HPLC) (图22)。

所用的分析型HPLC条件如下：Grace Vydac C₄蛋白质5微米，300Å，4.6×250 mmHPLC柱。溶剂A=95/5 H₂O/MeCN/0.05%三氟乙酸(TFA)，溶剂B=95/5 CH₃CN/H₂O/0.05% TFA。HPLC梯度(分钟/%B)：0/0，4/20，16/60，20/100，25/100，26/0。

所用的半制备型HPLC条件如下：柱：Grace Vydac C4蛋白质5微米，300Å，4.6×250mm。溶剂A=95/5 H₂O/MeCN/0.05%三氟乙酸(TFA)，溶剂B=95/5 CH₃CN/H₂O/0.05% TFA。HPLC梯度(分钟/%B)：0/0，4/20，16/60，20/100，25/100，26/0。

虽然本文仅说明和描述了本发明的某些特性，但是本领域技术人员可以想到许多修改和变化。因此，应理解的是，所附权利要求书旨在涵盖落入本发明的真实精神内的所有这些修改和变化。

Claims

1.一种成像剂组合物，所述组合物包含：

分离的多肽，所述多肽由SEQ. ID No 2组成，经由二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合；其中所述分离的多肽与HER2或其变体特异性结合。

2.权利要求1的组合物，其中所述二胺二肟螯合剂包含Pn216、cPn216或Pn44。

3.权利要求2的组合物，其中在分离的多肽的N-末端处^99mTc经由cPn216螯合剂与分离的多肽缀合。

4.权利要求1的组合物在制备试剂中的用途，所述试剂用于使受试者的至少一部分成像的方法，所述方法包括：

给予受试者权利要求1的组合物，和

用诊断装置使受试者成像。

5.权利要求4的用途，所述方法还包括以下步骤：

监测权利要求1的组合物向受试者的递送；和

诊断患有HER2相关疾病状况的受试者。

6.一种用于制备权利要求1的成像剂组合物的方法，所述方法包括：

(i) 提供分离的多肽，所述多肽由SEQ. ID No 2组成；

(ii) 使二胺二肟螯合剂与多肽反应，以形成螯合剂缀合的多肽，从而获得成像剂组合物，

其中所述二胺二肟螯合剂与^99mTc缀合。