CN111316105A - 用于质谱法的基于亚砜的试剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及适用于分析物分子诸如肽的质谱测定的基于亚砜的试剂，以及这样的试剂和分析物分子的加合物，以及所述试剂和加合物的应用。此外，本发明涉及用于分析物分子的质谱测定的方法。

Description

用于质谱法的基于亚砜的试剂

本发明涉及适用于分析物分子诸如肽的质谱测定的基于亚砜的试剂，以及这样的试剂和分析物分子的加合物，以及所述试剂和加合物的应用。此外，本发明涉及用于分析物分子的质谱测定的方法。

在开发允许在仅几个小时中进行人类基因组学研究的新基因组测序方法之后，^[1]我们现在正在见证新颖质谱方法的出现，所述方法现在使人们能够研究细胞和组织的完整蛋白质组。^[2-4]。

蛋白质组被定义为存在于样品中的所有蛋白质的集合，因此蛋白质组随细胞类型不同以及在不同组织中有很大差异。^[5]。

因此，蛋白质组学数据会提供关于细胞情况和潜在存在的疾病状态的指纹型信息。^[6]要深入了解生物系统的蛋白质组，必须获取关于不同样品中的各种蛋白质的水平的定量信息。如今，这用质谱法进行。由于完整蛋白质的精确定量是困难的，所以所述方法需要对蛋白质组进行消化（胰蛋白酶消化）以得到相应的肽。为了定量这些肽，进行了诸如代谢标记、^[7-8]无标记定量^[9]或同量异位标记^[10-11]之类的方法。

由于同量异位标记能够揭示肽丰度的甚至小的差异，并且因为可以在一次测量中对比许多样品，所以它是最常用的定量方法之一。^[12]。

但是，仍然需要提高MS分析方法的灵敏度，特别是对于通过MS定量分析具有低丰度的肽或在只有少量材料（诸如活组织检查组织）时。

目前可用的MS试剂的一个主要缺点是它们的低裂解效率，这会减少可用于定量分析的报告离子的数目并因此减少互补离子的数目。^[13]另外，报告物和平衡物单元之间的裂解会降低互补离子肽的电荷状态，且这可能导致MS不可见的中性物质的形成。

因此，本发明涉及一种用于MS中的新颖的基于亚砜的试剂，其允许极其灵敏地测定生物样品中的分析物分子诸如肽。此外，所述试剂的同位素修饰形式的应用允许获取用于对比研究的准确定量MS数据。特别地，本发明的试剂可以用于蛋白质组学中，从而能够精确定量复杂混合物中的肽。

因而，本发明的第一方面是适合用作质谱分析试剂的化合物，其具有通式(I)：

Z¹-L¹-(CR¹R²)-S(O)-CR³H-CH₂-C(-L²-Z²)R⁴(-L^x-X)

其中

Z¹是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元

L¹是键或间隔基，

Z²是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元，

L²是键或间隔基，

R¹、R²、R³、R⁴独立地是氢或C₁-C₃烷基，

X是能够与分析物分子反应，由此形成与所述分析物分子的共价键的反应基团，

L^X是键或间隔基。

在一个特定方面，化合物(I)可以作为同位素异数体（isotopologue）存在，即这样的化合物：其中在本文中也被称作所述化合物的同位素中性原子，例如¹H、¹²C、¹⁴N和/或¹⁶O原子的一种或多种主要同位素已被较少的稳定同位素（即稳定同位素诸如D、¹³C、¹⁵N和¹⁸O）替换。特定优选的是¹³C和¹⁵N。

本发明也涉及试剂组合物或试剂盒，其包含至少一种化合物(I)，且尤其是这样的化合物(I)的多种同位素地不同的物质，它们优选地是同量异位的。

本发明的另一个方面是化合物(I)或包含至少一种化合物(I)的组合物或试剂盒用于分析物分子、特别是包含氨基的分析物分子（诸如肽或蛋白）的质谱测定的用途。

本发明的再另一个方面是通过化合物(I)和分析物分子的反应而形成的共价加合物。所述加合物可以是通式(II)的化合物：

Z¹-L¹-(CR¹R²)-S(O)-CR³H-CH₂-C(-L²-Z²)R⁴-(L^x-X’)-T

其中

T是分析物分子，

X'是由化合物(I)上的基团X与分析物分子T的反应形成的基团，

Z¹、L¹、Z²、L²、L^x、R¹、R²、R³和R⁴如在权利要求1-10中的任一项中所定义，

其中所述加合物可以携带永久正或负电荷。

式(I)的化合物与分析物分子、特别是包含肽基团的分析物分子的加合物可以用于质谱测定。通过使样品中存在的分析物分子与化合物(I)反应，可以产生所述加合物。但是，也可以将所述加合物提供为纯物质用于用作校准剂和/或标准品。

本发明的再另一个方面是一种用于质谱测定样品中的分析物分子的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)使分析物分子与本文定义的式(I)的化合物共价地反应，由此形成所述分析物分子和化合物(I)的共价加合物，和

(b)对来自步骤(a)的加合物进行质谱分析。

本发明进一步涉及通过MS、且特别是通过定量MS对分析物分子的测定。所述分析物分子可以是能够与本发明的化合物(I)上的反应基团X形成共价键的任何物质。

例如，所述分析物可以是生物分子，其选自肽、蛋白、碳水化合物、氨基酸、脂肪酸、脂质、核苷、核苷酸、核酸和其它生物分子，包括小分子代谢物和辅因子以及药物、农业试剂、毒素或其代谢物。

一般而言，分析物分子可以存在于生物、临床或环境样品中，诸如体液，例如血液、血清、血浆、尿、唾液等，组织或细胞提取物，等。在本发明的某些实施方案中，可以不经进一步纯化地使用细胞或组织的完全裂解物。但是，当然，所述分析物分子可以存在于样品中，所述样品是纯化的或部分纯化的样品，例如纯化的或部分纯化的蛋白混合物或提取物。

根据一个特别优选的实施方案，所述分析物分子是肽或蛋白质，特别是被包含在复杂样品中的肽或蛋白质。例如，可以在一次MS测量中针对感兴趣的肽或蛋白质分析细胞或组织的完整蛋白质组。优选地，在分离之后，将蛋白质组（即样品中所有蛋白质的集合）消化以提供较小的肽，然后用本文所述的试剂标记。

在特定优选的实施方案中，分析物分子是能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键的具有氨基的蛋白质、肽或物质。这样的氨基可以是肽链的N-端氨基和/或侧链的氨基，例如赖氨酸的氨基。

根据另一个实施方案，所述分析物分子包含至少一个巯基，其能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键，诸如含有Cys的肽。

当然，待分析的肽或蛋白质还可以包含翻译后修饰诸如糖基化、酰化等。通过翻译后修饰向蛋白质添加的此类残基也可以被本发明的试剂靶向。

此外，所述分析物分子也可以是碳水化合物或具有碳水化合物基团的物质，例如糖蛋白或核苷。例如，所述分析物分子可以是单糖诸如核糖、脱氧核糖、阿拉伯糖、核酮糖、葡萄糖、甘露糖等，或寡糖，例如二糖（诸如蔗糖、麦芽糖或乳糖）或三糖或四糖，以及多糖，或包含这样的单糖、寡糖或多糖基团的物质。

所述分析物分子可以包含羰基，例如醛或酮基、或被掩蔽的醛或酮基，例如能够与化合物(I)的反应基团X形成共价键的半缩醛基，特别是环状半缩醛基。所述分析物分子也可以包含缩醛基，其可以在与化合物(I)反应之前被转化为醛、酮或半缩醛基。

本发明的化合物(I)包含能够与分析物分子反应，由此形成与所述分析物分子的共价键的反应基团X。在一个优选的实施方案中，基团X选自

(i)羰基反应基团，其能够与任何类型的具有羰基的分子（例如碳水化合物分子）反应，

(ii)巯基反应基团，其能够与任何类型的具有巯基的分子（例如含有Cys的肽）反应，或

(iii)胺反应基团，其能够与任何类型的具有氨基的分子（例如含有氨基的肽）反应。

特别优选的是胺反应基团。

所述羰基反应基团可以具有通过相邻的O或N原子NH₂-N/O的α效应而增强的超亲核N原子或二巯基分子。它可以选自：

(i)肼基团，例如H₂N-NH-、或H₂N-NR¹-基团，

其中R¹是芳基或C_1-4烷基，特别是C₁或C₂烷基，其任选地被例如卤素、羟基和/或C_1-3烷氧基取代，

(ii)腙基团，例如H₂N-NH-C(O)-、或H₂N-NR²-C(O)-基团，

其中R²是芳基或C_1-4烷基，特别是C₁或C₂烷基，其任选地被例如卤素、羟基和/或C_1-3烷氧基取代，

(iii)羟基氨基，例如H₂N-O-基团，

(iv)二巯基，特别是1,2-二巯基或1,3-二巯基。

当然，如上所述的肼或羟基氨基也可以用于与在分析物分子上存在的其它亲电子基团反应。

所述巯基反应基团可以是例如亲电子的烯烃基，例如R¹R²C=CR³-C(O)-NH-，其中R¹、R²和R³独立地是H、卤素或C_1-4烷基，优选H。其它巯基反应性试剂可以为马来酰亚胺、烷基卤或卤代乙酰胺，特别是碘乙酰胺。

存在众多可以与伯胺或仲胺诸如肽或蛋白质的N-端氨基和甲基化的胺（例如来自甲基化的赖氨酸侧链）形成化学键的氨基反应基团。因此，根据本发明，“氨基反应基团”包括酰叠氮、异硫氰酸酯、异氰酸酯、NHS酯、五氟苯基酯、羟基苯并三唑酯、磺酰氯、乙二醛、环氧化物、环氧乙烷类、碳酸酯、芳基卤、亚氨酸酯、碳二亚胺、酸酐和氟苯基酯。

但是，根据优选的实施方案，本文所用的“氨基反应性的”基团优选地是活性酯基，诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基-NHS、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)基团或亚氨酸酯-CH₂-C(=NH₂ ⁺)-O-CH₃。特别优选的是NHS。

所述化合物(I)具有各自能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元Z¹和Z²，即电荷单元Z¹和Z²可以是永久带电荷的，例如，当使用季铵基团时，或可以通过质子化(正电荷)或去质子化(负电荷)产生。

优选地，Z¹和Z²是相同的和/或Z¹和Z²具有相同电荷。

在特定实施方案中，但不一定，化合物(I)具有各自包含至少一个带电荷基团（即在基本上中性的条件下主要以带电荷状态存在的基团）的电荷单元Z¹和Z²。

例如，电荷单元Z¹和Z²可以各自包含

(i)至少一个带正电荷的基团，诸如伯、仲、叔或季铵基或鏻基，特别是具有10或更高的pK_a，更特别是具有12或更高的pK_a，或

(ii)至少一个带负电荷的基团，诸如磷酸根、硫酸根、磺酸根或羧酸根基，特别是具有10或更高的pK_b，更特别是具有12或更高的pK_b。

根据一个优选的实施方案，Z¹和Z²都是叔氨基，即-NR¹R²，其中R¹和R²优选地是C₁-C₅-烷基或形成5或6元环状烷基环，该环任选地包含一个或两个另外杂原子，诸如N。R¹和R²可以独立地选择，但是优选地R¹和R²是相同的。特别地，R¹和R²选自二甲基-氨基和二乙基-氨基或一起形成哌啶或吡咯烷。

Z¹和Z²的这种质子化可以作为本发明试剂的合成的最后步骤进行，并且可以存储质子化的试剂。但是，甚至在本发明的试剂与分析物分子的反应之后，直接在MS-分析之前，也可以将Z¹和Z²在气相中质子化，这甚至是优选的。通过Z¹和Z²的质子化，避免了在试剂裂解过程中形成中性物质。

通式(I)中的基团L¹、L²和L^x独立地表示键，即共价键，或间隔基，即具有1直到通常4、6、8或10个原子或甚至更多个原子的链长度的直链或支链间隔基，例如任选地包括至少一个杂原子，特别是N的C-原子和或羰基。优选地L¹和L²就链长而言是相等的，并且任选地包括杂原子和/或羰基，但是，其同位素组成可能不同，即L¹和L²可以是彼此的同位素异数体。

根据一个特别优选的实施方案，L¹和/或L²基团是-C(O)-NH-(CH₂)_n和/或-NH-C(O)-(CH₂)_m-，其中m和n是1-10之间的整数。

在一个优选的实施方案中，式(I)的化合物适合用作用于测定肽或蛋白分子的试剂，且可以是通式(Ia)的化合物：

Z¹-L¹-(CR¹R²)-S(O)-CR³H-CH₂-C(-L²-Z²)R⁴(-L^x-X¹)

其中

Z¹包含至少一个带正电荷的基团，诸如伯、仲、叔或季铵基，特别是质子化的叔氨基，诸如质子化的二甲基-氨基和二乙基-氨基、哌啶或吡咯烷，L¹是间隔基，特别是-C(O)-NH-(CH₂)_n-，其中n是1-10的整数，其中n优选地是m，

Z²等于Z¹，

L²是间隔基，特别是-NH-C(O)-(CH₂)_m-，其中m是2-10的整数，

R¹、R²、R³、R⁴是氢，

X¹是能够与分析物分子诸如肽的胺（例如氨基）反应的胺反应基团，

L^X是键或间隔基。

X¹优选地选自N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、磺基-NHS、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)或亚氨酸酯-CH₂-C(=NH₂ ⁺)-O-CH₃。

根据本发明的化合物的一个具体实施例是式(Ib)的化合物：

。

本发明的另一个方面涉及为同位素异数体的式(I)的化合物。术语“同位素异数体”涉及这样的化合物(I)：其中至少一个主要同位素被相应元素的稳定次要同位素替换，该稳定次要同位素的分子质量不同于相应主要同位素的分子质量。因此，所得的(I)的同位素异数体的分子质量不同于由主要同位素（在此称为同位素中性的）组成的相应化合物的分子质量。分子质量的这种差异使得同位素中性化合物及其同位素异数体可以通过质谱法区分。在一个优选的实施方案中，所述同位素异数体包含至少一种选自D (作为H的替换)、¹³C (作为¹²C的替换)、¹⁵N (作为¹⁴N的替换)和¹⁸O (作为¹⁶O的替换)的同位素。

在同位素异数体中，一个或多个且直到所有的相应同位素中性原子可以被同位素替换。因此，可以提供单一化合物的大量不同的同位素异数体。

例如，在如上所示的式(Ia)或(Ib)的化合物中，在L¹间隔基（各自-C(O)-NH-(CH₂)_n，其中优选地n=m）和/或L²间隔基（各自-NH-C(O)-(CH₂)_m-，其中优选地m>1）中的一个或多个或所有的¹⁴N和¹²C原子可以被¹⁵N或¹³C替换。

可以将化合物(I)提供为同位素中性化合物，或作为同位素异数体（其可通过MS与相应同位素中性化合物区分开），或作为包含相同化合物的多种不同的MS可区分的同位素异数体的组合物，或作为包含呈单独形式的相同化合物的多种不同的MS可区分的同位素异数体的试剂盒。包含试剂的多种不同的MS可区分的同位素异数体的组合物或试剂盒特别适合用于如下所述的多重应用。

在本发明的一个优选实施方案中，组合物或试剂盒包含至少两种如本文所述的同量异位的同位素异数体试剂。例如，在根据式(I)的第一试剂A中，将重稳定的同位素诸如¹⁵N或¹³C引入Z¹或L¹中。Z²和L²保持不变。在第二试剂B中，Z¹和L¹保持不变，但是将与在试剂A中相同的同位素引入Z²或L²中。所得试剂A和B是同量异位的(也参见图1)。

根据式(Ib)的试剂允许在保持同量异位性的同时将最多七个重稳定同位素诸如¹⁵N或¹³C引入产生具有Δm/z=1的报告物的结构中。

由于试剂的同量异位特性，源自两个样品的相同分析物分子将作为加合物在MS分离过程中具有相同的保留时间。同时进入质谱仪的是，来自不同样品并用不同的但同量异位的本发明试剂标记的加合物导致在MS屏幕中的一个不能辨别的m/z值。这允许通过为MS²选择单个前体m/z来执行基于质谱的鉴别。

因此，包含式(Ib)的试剂（其具有1-7个引入的稳定同位素，同时是同量异位的）的试剂盒或组合物代表了本发明的另一个优选的实施方案。这种设计可以实现与一个单独MS测量平行的最多达8种不同样品的质谱定量。

下面在实施例部分和图4中描述了优选的式(I)化合物（包括其同位素异数体）的合成。

本发明的再另一个方面涉及式(I)的化合物用于分析物分子的质谱测定，特别是用于如上所述的肽分析物分子的测定的用途。该用途包括借助于与化合物(I)的反应使分析物分子衍生化，由此形成共价加合物，并随后进行MS分析。

图1显示了涉及使用化合物(I)作为试剂通过MS定量测定肽分子的一般方案。特别地，将根据本发明的试剂(式1b; SOT)与从现有技术已知的试剂进行对比。

在加合物包含正电荷的情况下，以正模式进行MS检测。在加合物带有负电荷的情况下，将在负MS模式下进行检测。

质谱测定可以通过另外的分析方法来组合，所述分析方法包括色谱方法诸如气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)，特别是HPLC，和/或基于离子迁移率的分离技术。

本发明的另一个方面是通过如上所述的通式(I)的化合物与分析物分子的反应形成的加合物。借助于该反应，在化合物(I)和分析物分子之间形成共价键。

在一个优选的实施方案中，所述加合物是通式(II)的化合物：

Z¹-L¹-(CR¹R²)-S(O)-CR³H-CH₂-C(-L²-Z²)R⁴-(L^x-X’)-T

其中

T是分析物分子，

X'是由化合物(I)上的基团X与分析物分子T的反应形成的基团，

Z¹、L¹、Z²、L²、L^x、R¹、R²、R³和R⁴如上面所定义，

其中所述加合物可以携带永久正或负电荷。

对于MS检测，式(II)的加合物化合物带有正或负电荷。该电荷优选地由化合物(I)的电荷单元Z¹和Z²提供，优选地由Z¹和Z²的质子化提供。但是，电荷在化合物(I)中的存在不是必需的，因为可以通过其它方式来提供电荷，例如当分析物分子本身带有电荷时和/或当可以借助于质子化或去质子化为加合物提供电荷时。

两个电荷单元Z¹和Z²（优选为质子化的叔氨基）的存在会导致较高的电荷状态，这导致较高的分析物分子/加合物片段化，并因此导致更准确的分析物分子鉴定。此外，两个带电荷单元Z¹和Z²的存在避免了在加合物裂解/片段化过程中中性物质的形成。增加的电荷密度会促进检测和片段化。

本发明的再另一个方面是加合物化合物(II)在分析物分子的质谱测定中的用途。在一个特别优选的实施方案中，质谱测定包括串联质谱测定，更特别地在三重四极杆装置中，其中分析物加合物的分子离子经受片段化，例如通过碰撞诱导的解离(CID)。

在片段化过程中，除了包含Z¹和L¹的报告离子外，还利用包含Z²和L²的平衡物从弓形加合物（arch adduct）产生了平衡物-加合物共轭物，即互补离子(也参见图1)。连接的平衡物保留了与同量异位标记试剂不同的同位素模式，因此，互补离子也允许定量。这提供了以下优点：共洗脱肽（其产生与目标报告物信号不能辨别的报告离子）不能干扰信号。理想地，因此可以克服妨碍基于报告离子分析的准确定量的比率扭曲的已知问题。

在一个实施方案中，通过使存在于待分析样品中的分析物分子与已经加入样品中的化合物(I)反应，可以产生加合物化合物(II)。

在另一个实施方案中，也可以将加合物化合物(II)提供为纯物质，用于用作校准剂和/或用作标准品。加合物化合物(II)作为校准剂的应用可能涉及生成特定分析物分子的校正曲线，其中对不同已知量的加合物化合物(II)进行MS分析，并测量各自的信号强度，以便允许精确定量测定在样品中存在的分析物分子的未知量。

本发明的再另一个方面涉及一种用于分析物分子的定量质谱测定的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供至少两个要对比的分析物样品，

(b)使每个提供的样品中的分析物分子与本文定义的通式(I)的试剂共价地反应，由此对于每个样品，使用不同的通式(I)的同位素异数体试剂，并且由此为不同样品使用的同位素异数体试剂是彼此同量异位的，和

由此形成在每个样品中的分析物分子和试剂的加合物，

(c)合并所述至少两个包含分析物分子和同量异位试剂的加合物的样品，

(d)对来自步骤(c)的合并的加合物进行质谱分析，

其中所述质谱分析步骤(d)优选地包括：

(i)将合并的同量异位加合物的离子进行质谱分析的第一阶段，

由此根据它们的质量/电荷(m/z)比率来表征合并的加合物的离子，

(ii)造成合并的加合物离子的片段化，

由此从每个加合物离子产生具有相同电荷的报告离子和互补离子，并且

由此为每个最初提供的要对比的分析物样品提供非同量异位报告离子和非同量异位互补离子，

(iii)将步骤(ii)的非同量异位报告离子和非同量异位互补离子进行质谱分析的第二阶段，

(iii)步骤(ii)的报告离子的相对定量，和

(iv)步骤(ii)的互补离子的相对定量。

当然，步骤（a）的分析物样品之一可以是标准样品或参考样品。以此方式，可以确定在一个未知样品中的分析物的量。但是，根据本发明的方法，也可以在一个MS测量中定量多个样品的相同分析物，并且对比不同样品的分析物含量。

本发明适合用于临床应用，诸如提供关于对象、特别是人对象的诊断和/或预后信息。具体的应用是诊断与细胞或组织的蛋白质组改变有关、伴随其或由其引起的疾病，例如诊断过度增殖性疾病诸如癌症，例如确定肿瘤的侵袭性和侵袭力，表征血小板以及测量肝纤维化水平，研究抗体特征和免疫细胞（诸如T-细胞）的特征。一般而言，试剂(I)及其同位素异数体可以用于获得关于特定蛋白质或肽在细胞和/或组织中的存在和水平的定量信息。

附图图例

图1

A)定量蛋白质组学的同量异位标记实验. 将样品分别用试剂1或2的同位素异数体标记，并合并用于LC-MS研究。气相的片段化会产生用于相对定量的报告物和互补离子。报告离子比例被共分离的肽（紫色，*）扭曲。可以在没有这样的扭曲的情况下分析互补离子簇。

B)当前使用的TMT (1)试剂. 片段化会在平衡物上引入负电荷，从而降低在互补离子上的总电荷状态。C)在该研究中报道的亚砜标签(SOT, 2)具有电荷中性片段化，其保留在互补离子上的所有电荷以促进片段化。

图2

A)在肽上的TMT 1和SOT 2之间的片段化效率的对比. 在28%HCD的归一化碰撞能量下，SOT-标记的肽更容易片段化并产生高报告离子信号。标签＝反应的试剂。

B)在MS²-实验中观察到的报告离子SOT¹⁸⁰相对强度的统计分析。报告离子表现出优秀的可见性，使得容易进行报告离子定量。C）用TMT (1)或SOT (2)双链体标记的前体肽的电荷状态分布。通过使用SOT试剂，较高的电荷状态变得更丰富，由于较高的电荷密度，这应当导致更有效的片段化。

图3

A)包含完整标签（报告物+ 平衡物）或显示报告离子丢失，从而导致互补离子簇的形成的所有已鉴定片段离子(67720)的比率。

B)鉴定出的肽物质的统计分析. 平均而言，每个肽形成15个独立的互补离子，其产生7-8个互补离子簇。包含完整未切割标签的肽片段的数目会确保可靠的肽鉴定。C）标记的肽EMLPVLEAVAK⁴⁺的实施例MS²光谱，描绘了报告离子（红色）、七个互补离子簇（橙色）和用于鉴定的片段离子（灰色）。

图4

A) 本发明的试剂2以及同位素异数体2¹⁷⁹和2¹⁸⁰的描述。

B) a) 3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐, NEt₃, HOBt, 60℃, 2 h, 85%; b)经两步原位i) TCEP*HCl, NaHCO₃, H₂O/DMF (4:1), 室温, 10 min; ii)溴乙酸苄酯, 室温, 2h, 95%; c) 10%的甲酸在MeOH中的溶液, 100重量%Pd黑, 40℃, 2 h, 81%; d) N,N’-二甲基乙烷-1,2-二胺, DIPEA, PyBOP, DMF, 40℃, 1 h, 73%; e) LiOH, MeOH/H₂O (2.5:1), 室温, 1 h, 100%; f) pH = 2, mCPBA, H₂O, 室温, 20 min, 75%; g) NHS-TFA, 吡啶, DMF, 室温, 2 h, 35%。179 Da和180 Da是产生的报告离子的分子量。

实施例

1. 介绍

将两个样品的蛋白质组分离、消化，然后使肽与同量异位标记试剂诸如TMT 1 (图1B)或本发明的标记试剂2 (图1C)反应。

接下来将制备的衍生化的肽混合物合并，并通过HPLC-MS^[14]或甚至CE-MS^[15-16]分析该混合物。

在分离过程中，由于标记的同量异位特性，从两个样品（图1中的蓝色和红色）衍生出的相同肽将具有相同的保留时间。因此，它们将同时进入质谱仪，从而在整个MS扫描中得出一个不能辨别的m/z-值。这允许通过为MS²选择单个前体m/z来执行基于质谱的鉴别。现在，同量异位标记的裂解会提供两种不同的报告离子(Δ, Fig 1A)，其允许相对定量。

除报告离子外，还从每种肽生成了平衡物-肽缀合物，即互补离子。因为连接的平衡物保留了与同量异位标记试剂不同的同位素模式，所以互补离子也允许定量。^[13]。

这甚至具有以下优点：产生与感兴趣的报告信号不能辨别的报告离子的共洗脱肽（紫色）不能干扰信号。这个被称为比率扭曲的问题经常妨碍基于报告离子分析的准确定量。^[17]。

当今可用试剂的一个缺点是它们的低裂解效率，这减少了可用于分析的报告离子的数目，并因此减少了互补离子的数目。

另外，报告物和平衡物单元之间的裂解降低了互补离子肽的电荷状态，且这可能导致MS不可见的中性物质的形成。

2. 结果和讨论

在这里，我们报告了一种新的亚砜标签试剂2 (SOT, 图1)的开发，该试剂可以干净地片段化并具有高收率。基于气相中的亚砜片段化，生成报告物和互补离子的强信号。重要的是，该试剂具有两个碱性叔氨基，它们在气相中被质子化。这避免了在试剂裂解过程中中性物质的形成。相反，它甚至增加了电荷密度，这有利于检测和片段化。SOT试剂2原则上允许在保持同量异位性的同时将最多七个重的稳定同位素引入到生成具有Δm/z = 1的报告物的结构中。选择该设计以能够与一次单独测量平行地对8种不同样品进行质谱定量。

本发明的试剂2和两种特征为不同报告离子分子量(179 Da和180 Da)的同量异位同位素衍生物(2¹⁷⁹和2¹⁸⁰)的合成显示在图4中(也参见实施例的项目4)。所述合成开始于高胱氨酸二聚体的甲酯3，该甲酯首先用二甲基氨基丙酸转化为双酰胺4。用溴乙酸苄酯还原二硫化物和使巯基烷基化，会提供关键中间体5。将苄基酯裂解为6，并使6与1,1-二甲基乙二胺反应，生成双酰胺7。使甲酯在7-8中进行皂化反应，将硫化物氧化为亚砜9，并将酸转化，提供作为活性酯的试剂2。为了获得所需的同位素异数体，我们在第二次合成中用相同的化合物10(其中一个甲基携带¹³C原子(SI))代替了二甲基氨基丙酸。在第三合成中，我们使用了¹³C-标记的溴乙酸苄酯11 (SI)。这以类似的产率产生对应的试剂2¹⁷⁹和2¹⁸⁰。

为了检查本发明的试剂SOT 2的片段化特性，我们按照标准方案(SI)将包含所有翻译的蛋白质的完整的大肠杆菌裂解物消化到相应的肽中。将得到的复杂肽混合物(P)分成两部分。当一部分与试剂2¹⁷⁹ (P-2¹⁷⁹)反应时，另一部分与2¹⁸⁰合并以得到P-2¹⁸⁰ (pH =8.5, 150 mM三乙基碳酸氢铵缓冲液, 3 mg 2, 60 min)。随后，我们羟胺用淬灭未反应的试剂2。接下来，将标记的混合物{P-2¹⁷⁹+P-2¹⁸⁰}以1:1的比例合并，并根据报道的操作将复杂混合物脱盐并浓缩。^[18]。

为了对比，我们根据生产商的推荐使用商购可得的同位素标记的TMT试剂1 (双链体)进行了相同实验以获得混合物{P-TMT¹²⁶ + P-TMT¹²⁷}。接下来通过nanoHPLC-MS²测量肽混合物{P-2¹⁷⁹ + P-2¹⁸⁰}和{P-TMT¹²⁶ + P-TMT¹²⁷}，并使用MaxQuant软件和内部开发的软件包（Sl）分析数据。^[19]得到的数据示于图2和图3。

作为一个例子，图2A显示了直接与复杂混合物中相应的TMT标记的肽对比，在与肽ALEGDAEWEAK²⁺（两个标记）反应后SOT试剂2的裂解。我们在28%HCD (高能碰撞解离)的归一化片段化能量进行了测量，其理想地适合片段肽的鉴定。SOT试剂2显然产生了更多的报告离子，此外，该试剂似乎支持肽片段化，因为我们观察到了更多的片段离子。图2B显示了在SOT-标记的样品中鉴定的所有肽的分析，且在这里，我们看到在大多数MS²光谱中，相对报告离子强度高达80-100％，这是前所未有的。

通过使用可用软件包确定报告离子比率，可以轻松进行相对定量。图2C显示了在片段化之前完整的标记肽（前体）的电荷状态。与我们的设计一致，我们看到SOT试剂2生成了具有高得多的带电荷状态的标记肽。重要的是，超过60％的标记肽具有等于或高于+3的电荷状态。该高电荷密度有助于后续片段化，其产生更多的数据用于精确分析。

尽管报告离子强度允许测量在P-2¹⁸⁰相对于P-2¹⁷⁹中存在的所有肽之间的相对比例，但是经常希望用平衡物-肽缀合物产生的互补离子簇进行定量。因为这些平衡物-缀合物在质谱仪中进一步片段化，形成大量的互补离子簇，它们是序列特异性的并且都可以用于定量。这提供了更高的数据密度，并且它避免了与比率扭曲相关的问题。在我们的实验中，我们观察到SOT试剂2对于这样的互补离子簇分析具有几乎完美的性能。当研究含标记的肽片段离子时，我们看到这些片段中的53%仍包含完整的试剂2，而47％已经丢失报告基团，从而产生了互补离子簇(图3A)。这种接近完美的1:1比率允许使用标准数据库搜索算法平行鉴定（完整）肽，并通过大量形成的互补离子簇进行定量。图3B表明，SOT试剂2从每个前体平均产生15个肽-平衡物片段供随后定量，其对应于大约7-8个互补离子簇。图3C显示了来自一个肽的光谱作为实例。报告离子（红色）和七个互补离子簇（橙色）（包括14个互补离子）的信号在高相对强度下清晰可见。为了鉴定肽，可以利用多个高强度离子（灰色）。

3. 结论

总之，我们报告了一种新的同量异位标记试剂的设计，该试剂允许报告离子和互补离子簇的有效平行形成，以进行精确的肽定量。该试剂有助于消除由比率扭曲引起的定量误差。这首次实现了甚至在复杂样品中准确测定相对肽并从而准确测定蛋白质丰度。SOT试剂2的最重要特性是，平行地形成报告离子和互补离子簇，并且多个叔氨基的引入会产生预期的较高电荷状态，这导致更好的肽片段化并因此导致更准确的肽鉴定。

4. 化学合成操作

4.1起始原料的合成

溴乙酸苄酯(12)典型操作1 (TP1)

向干燥的且Ar冲洗的50 mL Schlenk-烧瓶（配有搅拌棒和隔膜）中加入商购可得的溴乙酸(1.00 g, 7.19 mmol, 1.16当量)、苯甲醇(0.64 mL, 6.20 mmol, 1.00当量)和4-甲基苯-1-磺酸(21.36 mg, 0.12 mmol, 0.02当量)，在10 mL甲苯存在下回流2 h。结束以后，将反应混合物冷却至室温并用20 mL 20%碳酸氢钠水溶液洗涤2次，随后用盐水和水洗涤。将合并的有机层经硫酸镁干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶, EtOAc/DCM 1:4)纯化，产生作为无色油的12 (1.38 g, 84%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 7.46 - 7.13 (m, 1H), 5.16 (s, 1H), 3.95(s, 6H) ppm。

溴(2-¹³C)乙酸苄酯(11)

在TP1以后，在有5 mL甲苯存在下使溴乙酸-2-¹³C (500 mg, 3.60 mmol, 1.16当量)和苯甲醇(0.32 mL, 3.10 mmol, 1.00当量)与4-甲基苯-1-磺酸(10.68 mg, 0.06 mmol,0.02当量)反应回流2 h，并像平常一样后处理。通过快速柱色谱法(硅胶, EtOAc/DCM 1:4)纯化，产生作为无色油的11 (427 mg, 52%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 7.41 - 7.33 (m, 5H), 5.20 (s, 2 H), 4.18(s, 1H), 3.80 (s, 1H) ppm. HRMS (EI⁺)：C₈ ¹³CH₁₀BrO₂ ⁺ [M+H]⁺的计算值: 229.9819；实测: 229.9718。IR (cm^-1):

= 3065, 1733, 1587, 1497, 1455, 1376, 1278, 1213,1147, 1106, 967, 736。

3-[苄基(甲基)氨基]丙酸甲酯(13)

将3-溴丙酸甲酯(3.00 g, 18.0 mmol)和N-甲基-1-苯基甲胺(2.18 g, 18.0 mmol)溶解在乙腈(120 mL)中。在室温搅拌2 min以后，加入Na₂CO₃ (19.0 g, 180 mmol)，并使温度增加至70℃保持24 h。冷却后，将反应溶液过滤，并将120 mL DCM加入滤液中。将有机相用0.5 M NaOH (3×50 mL)洗涤和经Na₂SO₄干燥。过滤后，将产物在减压下浓缩以产生作为无色油的13 (3.44 g, 16.5 mmol 92%)。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃): δ 7.30−7.18 (m, 5H, C₆ H ₅-CH₂-N), 3.63 (s, 3H,-COOCH ₃), 3.48 (s, 2H, C₆H₅-CH ₂-N), 2.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H, -N-CH ₂-CH₂-), 2.49(t, J = 7.2 Hz, 2H, -CH ₂-COOCH₃), 2.17 (s, 3H, -N-CH ₃)。¹³C NMR (101 MHz,CDCl₃): δ 173.00 (-COOCH₃), 138.85 (q), 128.95, 128.24和127.04 (C ₆H₅-CH₂),62.12 (C₆H₅-CH₂), 52.75 (-N-CH₂-CH₂-), 51.56 (-COOCH₃), 41.91 (-N-CH₃), 32.75(CH₂-COOCH₃)。HRMS (ESI⁺)：C₁₂H₁₈NO₂ ⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 208,13321；实测: 208.13313。IR (cm^-1):

= 2950 (w), 2841 (w), 2790 (w), 1737 (s), 1495 (w), 1452 (m),1236 (m), 1357 (w), 1325 (w), 1202 (m), 1168 (s), 1125 (m), 1975 (w), 1038(m), 1025 (m)。

3-(甲基氨基)丙酸盐酸盐(14)

在火焰干燥的Schlenk管中，将3-[苄基(甲基)氨基]丙酸甲酯13 (1 g, 4.82 mmol)溶解在MeOH (60 mL)中。然后将管的气氛用N₂净化，并将10重量%的Pd/C (100 mg)分成小份加入溶液中。将气氛再次用N₂净化以确保没有氧剩余。将填充了H₂的双层胶乳气球连接至Schlenk管，并将反应物在室温搅拌16 h。在6 h和10 h以后，用H₂重新填充气球。用硅藻土滤出Pd/C。蒸发得到微黄色油。将粗制的挥发性产物不经进一步纯化地用于下一步。将得到的甲酯溶解在5 M HCl中并回流8 h。将溶液蒸发至干燥。从MeOH/乙氧基乙烷重结晶得到作为无色吸湿晶体的期望产物14 (478 mg, 3.42 mmol, 71%)。

熔点: 89−92℃。¹H-NMR (400 MHz, D₂O) δ 3.28 (t, J = 6.4 Hz, 2H, -N-CH ₂-CH₂-), 2.81 (t, J = 6.5 Hz, 2H, -CH ₂-COOH), 2.72 s (3H, CH ₃) ppm。 ¹³C NMR (101MHz, CDCl₃): δ 174.11 (-COOH), 44.36 (-N-CH₂-CH₂-), 32.99 (-CH₂-COOH), 29.90(CH₃) ppm。HRMS (ESI) C₄H₁₀NO₂ ⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 104.07060；实测: 104.07063。IR(cm^-1):

= 3376 (w), 2968 (s), 2819 (s), 1729 (s), 1557 (w) 1465 (m), 1402(s) 1351 (w), 1289 (w), 1189 (s), 1156 (s), 1024 (s)。

3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙酸盐酸盐(10)

将3-(甲基氨基)丙酸盐酸盐14 (401 mg, 2.87 mmol, 1.00当量)溶解在88%甲酸(1.79 mL, 44.8 mmol, 15.6当量)中。然后加入(¹³C)甲醛(20%在水中; 1 g, 6.45 mmol,2.25当量)，并将溶液通过微波辐照在110℃、100 W加热1 h。加入200µL HCl，并在真空中除去溶剂。通过在真空中与甲苯共沸，除去痕量的甲酸。将浅微黄色固体从MeOH/乙氧基乙烷中重结晶以得到无色固体(383 mg, 2.48 mmol, 86%)。

熔点: 183℃。¹H-NMR (400 MHz, D₂O): δ 3.30 (td, J = 6.7, 3.0 Hz, 2H, -N-CH ₂-CH₂-), 2.97 - 2.60 (m, 8H, -CH ₂-COOH, -CH ₃, -¹³CH ₃) ppm。¹³C-NMR (101 MHz,D₂O): δ = 174.06 (-COOH), 53.10 (-N-CH₂-CH₂-), 43.34 (-CH₃), 42.78 (-¹³ CH₃),28.78 (-CH₂-COOH) ppm。HRMS (ESI⁺)：C₄ ¹³CH₁₂NO₂ ⁺ [M+H]⁺ 的计算值119.08961，实测119.08960。IR (cm^-1):

= 2957(m), 2692 (m), 2592 (w), 2481 (w), 1717 (s), 1468(w), 1420 (m), 1370 (w), 1300 (w), 1201 (s) 1161 (m), 1006 (w), 966 (m), 854(s), 798 (m)。

4.2一般合成操作

在以下部分中，将化合物2¹⁷⁹指定为2**，且将化合物2¹⁸⁰指定为2*。

(2R)-2-氨基-4-{[(3S)-3-氨基-4-甲氧基-4-氧代丁基]二硫烷基}丁酸甲酯(3)

给干燥的且Ar冲洗的250 mL Schlenk-烧瓶（配有搅拌棒和隔膜）装入溶解在无水MeOH(80 mL)中的商购可得的DL-高胱氨酸(4,4'-二硫烷二基双(2-氨基丁酸), 6.0 g, 22.36mmol, 1.0当量)。将白色浆溶液冷却至0℃，并经由注射器逐滴加入亚硫酰氯(6.48 mL,89.44 mmol, 4.0当量)。将得到的无色反应混合物历时3 h温热至室温。然后，将反应混合物真空浓缩过夜，得到作为白色固体的3 (6.6 g, 100%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.21 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.86 (s, 6H),3.35 (s, 2H), 2.84 (m, 5H), 2.47 - 2.22 (m, 5H) ppm。 ¹³C-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 170.53, 53.87, 52.61, 33.57, 30.91 ppm。 HRMS (ESI⁺)：C₁₀H₂₁N₂O₄S₂ ⁺ [M+H]⁺的计算值: 297.0864；实测: 297.09380。IR (cm⁻¹):

= 3373, 2854, 2611, 2003,1738, 1591, 1503, 1439, 1224, 1139, 860。

(2R)-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]-4-({(3S)-3-[3-(二甲基-氨基)丙烷酰氨基]-4-甲氧基-4-氧代丁基}二硫烷基)丁酸甲酯(4)典型操作2 (TP2)

向干燥的且Ar冲洗的50 mL Schlenk-烧瓶（配有搅拌棒和隔膜）中加入商购可得的3-(二甲基氨基)丙酸盐酸盐(370 mg, 2.40 mmol, 2.4当量)和甲酯3 (300 mg, 0.61 mmol,1.0当量)，并溶解于5 mL无水DMF中。然后，加入TEA (0.29 mL, 2.12 mmol, 3.5当量)、HOBT (340 mg, 2.50 mmol, 2.5当量)和EDC (502 mg, 2.61 mmol, 2.6当量)，并在60℃搅拌2 h。将得到的橙色浆反应混合物真空浓缩。通过快速柱色谱法(硅胶, DCM/MeOH 16:1)纯化，得到作为白色固体的4 (426 mg, 85%)。

¹H-NMR (800 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.62 - 4.55 (m, 1H), 3.75 (d, J=1.5,2H), 3.37 (s, 1H), 2.84 - 2.79 (m, 1H), 2.78 - 2.72 (m, 1H), 2.71 - 2.63 (m,2H), 2.46 (td, J=7.3, 2.8, 2H), 2.30 (s, 6H), 2.10 - 2.04 (m, 1H) ppm。 ¹³C-NMR(201 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 174.37, 173.54, 52.88, 52.37, 49.85, 35.59, 35.52,34.14, 32.13 ppm。HRMS (ESI⁺)：C₂₀H₃₉N₄O₆S₂ ⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 494.2233；实测:495.23034。IR (cm⁻¹):

= 3382, 2953, 2833, 2498, 2069, 1733, 1643, 1548, 1439,1222, 1173, 1119, 977, 856。

二甲基-4,4'-二硫烷二基(2R,2'S)-双(2-(3-(甲基(甲基-¹³C)氨基)-丙烷酰氨基)-丁酸酯) (4**)

在TP2以后，前面合成的3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙酸盐酸盐10 (220 mg, 1.42mmol, 2.20当量)和甲酯3 (238 mg, 0.645 mmol, 1.00当量)产生作为白色固体的4**(200 mg, 62%)。

¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz): δ 4.57 (ddd, J = 8.5, 4.8, 3.1 Hz, 1H), 3.73(s, 6H), 2.83−2.59 (m, 4H), 2.46−1.99 (m, 20H)。HRMS (ESI⁺)：C₁₈ ¹³C₂H₃₉N₄O₆S₂ ⁺ [M+H]⁺ 的计算值:497.22889；实测: 497.23792。

(2S)-4-{[2-(苄氧基)-2-氧代乙基]硫烷基}-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸甲酯(5)典型操作3 (TP3)

将前面合成的二硫化物4 (750 mg, 1.51 mmol, 1.0当量)加入干燥的且Ar冲洗的50mL Schlenk-烧瓶（配有搅拌棒和隔膜）中，并溶解于5 mL H₂O和15 mL DMF的混合物中。然后，将NaHCO₃ (535 mg, 6.37 mmol, 4.2当量)和TCEP (435 mg, 1.51 mmol, 1.0当量)加入反应混合物。通过质量确定还原结束后，加入商购可得的溴乙酸苄酯(0.6 mL, 3.79mmol, 2.50当量)并在室温搅拌2 h。然后将得到的反应混合物真空浓缩并通过快速柱色谱法(硅胶, 5%的MeOH在DCM中的溶液)纯化，得到作为无色油的5 (510 mg, 42%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 7.53 - 7.15 (m, 5H), 5.18 (s, 2H), 4.56(dd, ³ J = 8.9, ² J = 4.8 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.33 (s, 2H), 2.75 - 2.58 (m,4H), 2.45 (t, ³ J = 7.2 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.17 - 2.05 (m, 1H), 2.02 -1.90 (m, 1H) ppm。¹³C-NMR (151 MHz, CDCl₃) δ = 172.58, 172.51, 170.15, 135.60,128.73, 128.52, 128.37, 67.18, 55.11, 52.47, 51.05, 44.59, 33.52, 32.82,31.82, 28.47 ppm。HRMS (ESI⁺)：C₁₉H₂₉N₂O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 397.1719；实测:397.17908。IR (cm^-1):

= 3285, 2950, 2864, 1736, 1655, 1539, 1455, 1440, 1374,1271, 1213, 1170, 1146, 1025, 748, 698。

(2S)-4-{[2-(苄氧基)-2-氧代(1-¹³C)乙基]硫烷基}-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸甲酯(5*)

在TP3以后，使二硫化物4 (370 mg, 0.75 mmol, 1.0当量)与前面合成的溴(2-¹³C)乙酸苄酯11 (294µL, 1.86 mmol, 2.3当量)反应，得到作为无色油的5* (550 mg, 92%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 7.42 - 7.28 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.59- 4.52 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.50 (s, 1H), 3.15 (s, 1H), 2.93 (t, J = 7.0Hz, 2H), 2.75 - 2.60 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.50 (s, 6H), 2.19 -2.05 (m, 1H), 2.04 - 1.86 (m, 1H) ppm。HRMS (ESI⁺)：C₁₈ ¹³CH₂₉N₂O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 398,1752；实测: 398.18235。

(2S)-4-{[2-(苄氧基)-2-氧代乙基]硫烷基}-2-(3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙烷酰氨基)丁酸甲酯(5**)

在TP3以后，二硫化物4** (200 mg, 0.40 mmol, 1.0当量)提供作为无色油的5**(252 mg, 79%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄): δ = 7.40−7.28 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.53(dd, J = 8.93, 4.90 Hz), 3.69 (s, 3H), 2.73 - 2.56 (m, 4H), 2.44 - 1.87 (m,10H)。¹³C-NMR (101 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 174.49, 173.61, 171.96, 137.34, 129.58,129.32, 129.25, 67.94, 56.03, 52.80, 52.55, 45.08, 34.17, 33.97, 32.01,29.51。HRMS (ESI) C₁₈ ¹³CH₂₉N₂O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 398.18252；实测: 398.18256。

({(3S)-3-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]-4-甲氧基-4-氧代丁基}硫烷基)乙酸(6)典型操作4 (TP4)

将前面合成的苄基-保护的硫化物5 (160 mg, 0.40 mmol, 1.0当量)加入干燥的且Ar冲洗的25 mL Schlenk-烧瓶（配有搅拌棒和隔膜）中并溶解于3-4 mL 10%甲酸-甲醇中。然后，将大约160 mg钯黑催化剂加入反应混合物并在40℃搅拌2 h。通过质量和TLC确认去保护结束以后，将反应混合物过滤，真空浓缩，并通过快速柱色谱法(硅胶, 25%的MeOH在DCM中的溶液)纯化，得到作为无色油的6(100 mg, 81%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.61 (dd, J = 9.4, 4.2 Hz, 1H), 3.27 (t,J = 6.8 Hz, 1H), 3.21 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 3.12 (s, 2H), 2.75 (s, 6H), 2.73 -2.55 (m, 3H), 2.18 - 2.07 (m, 1H), 2.05 - 1.93 (m, 1H) ppm。LRMS (ESI⁺)：C₁₂H₂₃N₂O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 307,1249；实测: 307.10。IR (cm⁻¹):

= 3253, 1734,1652, 1574, 1468, 1372, 1217, 1147, 1084, 977, 761。

({(3S)-3-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]-4-甲氧基-4-氧代丁基}硫烷基)(2-¹³C)乙酸(6*)

在TP4以后: 5* (580 mg, 1.46 mmol, 1.0当量)提供作为无色油的6* (280 mg,62%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.62 (dd, J = 4.62 (dd, J=9.4, 4.2, 1H),3.72 (s, 3H), 3.35 (s, 2H), 3.30 - 3.24 (m, 2H), 3.17 (dq, J=13.0, 6.4, 1H),2.74 (s, 6H), 2.72 - 2.60 (m, 4H), 2.18 - 1.94 (m, 2H) ppm。¹³C-NMR (101 MHz,甲醇-d ₄) δ = 173.85, 172.39, 170.21, 55.22, 52.79, 49.85, 44.01, 37.30,31.80, 31.62, 29.24 ppm。HRMS (ESI⁺)：C₁₁ ¹³CH₂₃N₂O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 308.1283；实测: 308.13564。

{[(3S)-4-甲氧基-3-(3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙烷酰氨基)-4-氧代丁基]硫烷基}乙酸(6**)

在TP4以后: 5** (252 mg, 0.63 mmol, 1.0当量)提供作为无色油的6** (181 mg,93%)。

¹H NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄): δ 4.61 (dd, J = 9.5, 4.2 Hz, 1H), 3.70 (s,3H), 3.38 - 3.16 (m, 4H), 3.08 (d, J = 3.26 Hz, 2H), 2.94 - 2.59 (s, 10H)ppm。HRMS (ESI⁺) C₁₁ ¹³CH₂₃N₂O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 308.13557；实测308.13569。

(2S)-4-[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)硫烷基]-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸甲酯(7): 典型操作5 (TP5):

将前面合成的酸6 (100 mg, 0.33 mmol, 1.0当量)加入干燥的且Ar冲洗的50 mLSchlenk-烧瓶（配有搅拌棒和隔膜）中并溶解于10 mL干燥的DMF中。然后，加入商购可得的N ¹,N ²-二甲基乙烷-1,2-二胺(42µL, 0.39 mmol, 1.2当量)、DIPEA (83µL, 0.49 mmol,1.5当量)和PyBOP (203 mg, 0.39 mmol, 1.2当量)，并将反应混合物在室温搅拌1 h。通过质量确定酰胺化结束以后，将反应混合物真空浓缩并通过快速柱色谱法(硅胶, 1:12MeOH/DCM)纯化，得到作为无色油的7 (90 mg, 73%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.56 (dd, J = 9.0, 4.8, 1H), 3.72 (s,3H), 3.38 - 3.32 (m, 2H), 3.19 (d, J=1.3, 2H), 2.74 - 2.57 (m, 4H), 2.47 (dt,J = 11.6, 6.8, 4H), 2.30 (d, J = 4.3, 12H), 2.12 (dddd, J = 13.2, 8.3, 7.2,4.9, 1H), 2.03 - 1.92 (m, 1H) ppm。¹³C-NMR (101 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 174.36,173.65, 172.47, 59.04, 55.99, 52.82, 52.64, 45.47, 45.03, 38.22, 35.97,34.00, 32.11, 29.70 ppm。LRMS (ESI⁺)：C₁₆H₃₃N₄O₄S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 377.2144；实测:377.19。IR (cm^-1):

= 3375, 2878, 17740, 1597, 1509, 1439, 1226, 1144, 1066,1022, 903, 843, 744。

(2S)-4-{[2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代(1-¹³C)乙基]硫烷基}-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸甲酯(7*):

在TP5以后，6* (270 mg, 0.87 mmol, 1.0当量)提供作为无色油的7* (246 mg,74%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.56 (dd, J = 9.0, 4.8, 1H), 3.72 (s,3H), 3.36 (d, J = 6.2, 2H), 3.33 (s, 1H), 3.01 (s, 1H), 2.74 - 2.58 (m, 4H),2.47 (dt, J = 11.4, 7.0, 4H), 2.30 (d, J=4.1, 13H), 2.18 - 1.92 (m, 3H), 1.29- 1.15 (m, 1H) ppm。LRMS (ESI⁺)：C₁₅ ¹³CH₃₃N₄O₄S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 378.2178；实测:378.24。

(2S)-4-[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)硫烷基]-2-(3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙烷酰氨基)丁酸甲酯(7**):

在TP5以后，6** (181 mg, 0.59 mmol, 1.0当量)提供作为无色油的7** (173 mg,78%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄): δ 4.46 (dd, J = 9.0, 4.8 Hz, 1H), 3.62 (s,3H), 3.25 (t, J = 6.95 Hz, 2H), 3.09 (s, 2H), 2.66 - 2.48 (m, 4H), 2.44 -1.80 (m, 18H) ppm。¹³C-NMR (101 MHz, 甲醇-d ₄): δ 172.94, 172.29, 171.13, 57.62,54.56, 51.45, 51.26, 44.04, 43.59, 36.81, 34.57, 34.22, 32.49, 30.69, 28.31ppm。HRMS (ESI⁺)：C₁₅ ¹³CH₃₃N₄O₄S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 378.22506；实测378.22516。

(2S)-4-[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)硫烷基]-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸(8): 典型操作6 (TP6):

将前面合成的化合物7 (90 mg, 0.24 mmol, 1.0当量)溶解在2 mL H₂O和5 mL MeOH的混合物中。然后加入LiOH (17 mg, 0.71 mmol, 3.0当量)，并将反应混合物在室温搅拌1h。皂化结束以后，将产物脱盐，得到作为白色固体的8 (86.6 mg, 100%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.55 (dd, J = 9.3, 4.5, 1H), 3.64 (t, J = 5.9, 2H), 3.46 (t, J = 6.7, 2H), 3.35 (t, J = 6.0, 2H), 2.95 (d, J = 13.2,13H), 2.90 - 2.83 (m, 2H), 2.81 - 2.64 (m, 2H), 2.22 - 2.11 (m, 1H), 2.09 -1.97 (m, 1H) ppm。¹³C-NMR (101 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 174.78, 173.70, 171.90, 58.04,54.90, 52.72, 43.88, 43.72, 43.63, 36.19, 36.00, 32.07, 30.75, 30.10 ppm。HRMS(ESI^-)：C₁₅H₂₉N₄O₄S^- [M-H]^- 的计算值: 361,1910；实测: 361.19188。IR (cm^-1):

=3368, 2916, 1743, 1632, 1524, 1439, 1311, 1227, 1160, 1059, 984, 845。

(2S)-4-{[2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代(1-¹³C)乙基]硫烷基}-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸(8*)

在TP6以后: 7* (220 mg, 0.58 mmol, 1.0当量)提供作为白色固体的8* (210 mg,99%)。

¹H-NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄) δ = 4.33 (dd, J = 7.8, 4.6, 1H), 3.39 - 3.32(m, 3H), 3.02 (s, 1H), 2.67 - 2.56 (m, 4H), 2.45 (dt, J = 14.7, 7.1, 4H),2.27 (d, J = 3.2, 13H), 2.18 - 1.87 (m, 2H) ppm。¹³C-NMR (101 MHz, 甲醇-d ₄) δ =176.77, 172.29, 172.26, 57.64, 54.84, 54.15, 44.12, 43.73, 36.99, 36.91,33.25, 32.65, 28.61 ppm。HRMS (ESI^-)：C₁₄ ¹³CH₂₉N₄O₄S^- [M-H]^- 的计算值: 362.2021；实测: 362.19517。

(2S)-4-[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)硫烷基]-2-(3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙烷酰氨基)丁酸(8**)

在TP6以后: 7** (173 mg, 0.46 mmol, 1.0当量)提供作为白色固体的8** (105 mg,62%)。

¹H NMR (400 MHz, 甲醇-d ₄): δ 4.33 (dd, J = 7.8, 4.6 Hz, 1H), 3.35 (t,J = 6.41 Hz, 2H), 3.19 (s, 2H), 2.67 - 2.56 (m, 4H), 2.50 - 1.88 (m, 18H)。HRMS (ESI⁺)：C₁₄ ¹³CH₃₁N₄O₄S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 364.20941；实测: 364.20962。

(2S)-4-(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙烷亚磺酰基)-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]-丁酸(9)典型操作7 (TP7):

将8 (50 mg, 0.14 mmol, 1.0当量)溶解在2 mL脱盐H₂O中。将pH值设定至pH = 2以后，加入mCPBA (30.8 mg, 0.14 mmol, 1.0当量)，并将反应混合物在室温搅拌20 min。通过质量确定氧化结束以后，将得到的反应混合物用DCM (4x 10 mL)萃取并真空浓缩，得到作为白色固体的9 (40 mg, 75%)。

¹H-NMR (400 MHz, D₂O) δ = 4.46 (td, J = 8.1, 5.1, 1H), 3.90 (d, J =14.1, 1H), 3.72 (d, J = 14.1, 1H), 3.64 - 3.51 (m, 2H), 3.34 (td, J = 6.7,1.8, 2H), 3.25 (t, J = 6.0, 2H), 3.06 - 2.85 (m, 2H), 2.82 (d, J = 9.5, 13H),2.76 (t, J = 6.8, 2H), 2.34 - 2.19 (m, 1H), 2.17 - 2.04 (m, 1H) ppm。¹³C-NMR(101 MHz, D₂O) δ = 174.42, 171.66, 166.86, 56.23, 55.98, 55.88, 53.32, 47.34,47.19, 42.96, 42.81, 34.87, 29.50, 23.97 ppm。HRMS (ESI⁺)：C₁₅H₃₁N₄O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 379.1937；实测: 379.19624。

(2S)-4-[2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代(1-¹³C)乙烷亚磺酰基]-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]-丁酸(9*)

在TP7以后: 8* (145 mg, 0.39 mmol, 1.0当量)提供作为白色固体的9* (150 mg,99%)。

¹H-NMR (400 MHz, D₂O) δ = 4.46 (ddt, J = 15.6, 10.1, 5.0, 1H), 4.10 -3.50 (m, 4H), 3.35 (dt, J = 8.0, 4.0, 2H), 3.24 (t, J = 6.2, 2H), 3.07 - 2.95(m, 2H), 2.82 (d, J = 9.4, 13H), 2.75 (q, J = 6.7, 3H), 2.60 (s, 1H), 2.29(dp, J = 13.5, 7.4, 1H), 2.19 - 2.00 (m, 1H) ppm。HRMS (ESI⁺)：C₁₄ ¹³CH₃₁N₄O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 380.20432实测: 380.20452。

(2S)-4-(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙烷亚磺酰基)-2-(3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙烷酰氨基)丁酸(9**)

在TP7以后: 8** (105 mg, 0.29 mmol, 1.0当量)提供作为白色固体的9** (75 mg,69%)。

¹H-NMR (400 MHz, D₂O) δ = 4.52 (dd, J = 8.7, 5.1 Hz, 1H), 3.71 - 3.29(m, 8H), 3.10 - 2.62 (m, 16H), 2.50 - 2.17 (m, 2H) ppm。HRMS (ESI⁺)：C₁₄ ¹³CH₃₁N₄O₅S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 380.20432；实测: 380.20424。

(2S)-4-[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)硫烷基]-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2)典型操作8 (TP8):

将前面合成的亚砜9 (80 mg, 0.22 mmol, 1.0当量)溶解在5 mL DMF中。然后，将干燥的吡啶(34µL, 0.42 mmol, 2.0当量)和NHS-TFA (89 mg, 0.42 mmol, 2.0当量)加入反应混合物中。通过质量确定酯活化结束以后，将得到的反应混合物真空浓缩。将得到的橙色油溶解在乙腈中并经由丙酮沉淀，得到作为白色固体的2 (35 mg, 35%)。

HRMS (ESI⁺)：C₁₈ ¹³CH₃₄N₅O₇S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 476.2101；实测: 476.21727。

(2S)-4-{[2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代(1-¹³C)乙基]硫烷基}-2-[3-(二甲基氨基)丙烷酰氨基]丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2*)

在TP8以后: 9* (50 mg, 0.13 mmol, 1.0当量)提供作为白色固体的2* (20 mg,32%)。

HRMS (ESI⁺)：C₁₈ ¹³CH₃₄N₅O₇S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 477.2134；实测: 477.22124。

(2S)-4-[(2-{[2-(二甲基氨基)乙基]氨基}-2-氧代乙基)硫烷基]-2-(3-{甲基[(¹³C)甲基]氨基}丙烷酰氨基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(2**)

在TP8以后: 9** (75 mg, 0.20 mmol, 1.0当量)提供作为白色固体的2** (30 mg,31%)。

HRMS (ESI⁺)：C₁₈ ¹³CH₃₄N₅O₇S⁺ [M+H]⁺ 的计算值: 477.2134；实测: 477.22064。

参考文献列表

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Claims (17)

1.一种用于质谱法中的试剂，所述试剂是通式(I)的化合物：

Z¹-L¹-(CR¹R²)-S(O)-CR³H-CH₂-C(-L²-Z²)R⁴(-L^x-X)

其中

Z¹是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元，

L¹是键或间隔基，

Z²是能够携带至少一个带电荷基团的电荷单元，

L²是键或间隔基，

R¹、R²、R³、R⁴独立地是氢或C₁-C₃烷基，

X是能够与分析物分子反应，由此形成与所述分析物分子的共价键的反应基团，

L^X是键或间隔基。

2.权利要求1的试剂，其中所述电荷单元Z¹和Z²各自包含至少一个带正电荷的基团，诸如伯、仲、叔或季铵基或鏻基，特别是具有10或更高的pK_a，更特别是具有12或更高的pK_a。

3.权利要求1的试剂，其中所述电荷单元Z¹和Z²各自包含至少一个带负电荷的基团，诸如磷酸根、硫酸根、磺酸根或羧酸根基，特别是具有10或更高的pK_b，更特别是具有12或更高的pK_b。

4.权利要求1-3中的任一项的试剂，其中所述电荷单元Z¹和Z²具有相同电荷。

5.权利要求1-4中的任一项的试剂，其中所述电荷单元Z¹和Z²永久地带电荷。

6.权利要求1-5中的任一项的试剂，其中所述反应基团X是

(i)羰基反应基团，其能够与分析物分子上的羰基例如醛或酮基或被掩蔽的羰基例如半缩醛基反应，其中所述羰基反应基团X可以选自通过相邻的O和/或N原子诸如NH₂-N/O造成的α效应而增强的超亲核N原子或二巯基基团，或者

(ii)巯基反应基团，诸如烯烃或炔烃，其能够与分析物分子上的巯基例如Cys-基团反应，或者

(iii)胺反应基团，其能够与分析物分子的胺例如氨基反应。

7.权利要求1-6中的任一项的试剂，其中X可以具体地选自

(i)肼基团，例如H₂N-NH-、或H₂N-NR¹-基团，

其中R¹是芳基或C_1-4烷基，特别是C₁或C₂烷基，其任选地被取代，

(ii)腙基团，例如H₂N-NH-C(O)-、或H₂N-NR²-C(O)-基团，

其中R²是芳基或C_1-4烷基，特别是C₁或C₂烷基，其任选地被取代，

(iii)羟基氨基，例如H₂N-O-基团，

(iv)二巯基，特别是1,2-二巯基或1,3-二巯基，

(v)亲电子的烯烃基，例如R¹R²C=CR³-C(O)-NH-

其中R¹、R²和R³独立地是H、卤素或C_1-4烷基，优选H，

(vi)活性酯基诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或磺基-NHS、羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(HOAt)基团或亚氨酸酯-CH₂-C(=NH₂ ⁺)-O-CH₃。

8.权利要求1-7中的任一项的试剂，所述试剂具有通式(Ia)：

Z¹-L¹-(CR¹R²)-S(O)-CR³H-CH₂-C(-L²-Z²)R⁴(-L^x-X¹)

其中

Z¹包含至少一个带正电荷的基团诸如伯、仲、叔或季铵基团，

L¹是间隔基，特别是-C(O)-NH-(CH₂)_n-，其中n是1-10的整数，其中n优选地是m，

Z²等于Z¹，

L²是间隔基，特别是-NH-C(O)-(CH₂)_m-，其中m是2-10的整数，

R¹、R²、R³、R⁴是氢，

X¹是能够与分析物分子诸如肽的胺例如氨基反应的胺反应基团，

L^X是键或间隔基。

9.权利要求1-8中的任一项的试剂，所述试剂具有通式(Ib)：

。

10.权利要求1-9中的任一项的试剂，所述试剂是同位素异数体，特别是包含至少一种选自D、¹³C、¹⁵N和/或¹⁸O、特别是¹³C或¹⁵N的同位素的同位素异数体。

11.一种组合物或试剂盒，其包含至少两种权利要求1-10中的任一项所述的同位素异数体试剂，它们是同量异位的。

12.权利要求1-11中的任一项的试剂或权利要求11的组合物或试剂盒用于分析物分子的质谱测定的用途，其中所述质谱测定具体地包括串联质谱测定，更具体地在三重四极杆装置中。

13.由权利要求1-12中的任一项所述的通式(I)的化合物与分析物分子的反应形成的共价加合物。

14.权利要求13的加合物，所述加合物是通式(II)的化合物：

Z¹-L¹-(CR¹R²)-S(O)-CR³H-CH₂-C(-L²-Z²)R⁴-(L^x-X’)-T

其中

T是分析物分子，

X'是由化合物(I)上的基团X与分析物分子T的反应形成的基团，

Z¹、L¹、Z²、L²、L^x、R¹、R²、R³和R⁴如在权利要求1-10中的任一项中所定义，

其中所述加合物可以携带永久正或负电荷。

15.权利要求13或14中的任一项的加合物，其中所述分析物分子T是含氨基的肽。

16.权利要求13-15中的任一项的加合物用于分析物分子的质谱测定的用途，其中所述质谱测定具体地包括串联质谱测定，更具体地在三重四极杆装置中。

17.一种用于分析物分子的定量质谱测定的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供至少两个要对比的分析物样品，

(b)使每个提供的样品中的分析物分子与根据权利要求1-9中的任一项的通式(I)的试剂共价地反应，由此对于每个样品，使用不同的通式(I)的同位素异数体试剂，并且由此为不同样品使用的同位素异数体试剂是彼此同量异位的，和

由此形成在每个样品中的分析物分子和试剂的加合物，

(c)合并所述至少两个包含分析物分子和同量异位试剂的加合物的样品，

(d)对来自步骤(c)的合并的加合物进行质谱分析，

其中所述质谱分析步骤(d)优选地包括：

(i)将合并的同量异位加合物的离子进行质谱分析的第一阶段，

由此根据它们的质量/电荷(m/z)比率来表征合并的加合物的离子，

(ii)造成合并的加合物离子的片段化，

由此从每个加合物离子产生具有相同电荷的报告离子和互补离子，并且

由此为每个最初提供的要对比的分析物样品提供非同量异位报告离子和非同量异位互补离子，

(iii)将步骤(ii)的非同量异位报告离子和非同量异位互补离子进行质谱分析的第二阶段，

(iii)步骤(ii)的报告离子的相对定量，和

(iv)步骤(ii)的互补离子的相对定量。

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