BR112020004444A2 - reagente à base de sulfóxido para espectrometria de massa - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a reagentes à base de sulfóxido adequados na determinação espectrométrica de massa de moléculas de analito tais como peptídeos bem como adutos de tais reagentes e moléculas de analito e aplicações dos ditos reagentes e adutos. Além disso, a presente invenção refere-se a métodos para a determinação espectrométrica de massa de moléculas de analito.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “REA-

GENTE À BASE DE SULFÓXIDO PARA ESPECTROMETRIA DE MASSA”.

[001] A presente invenção se refere a reagentes à base de sulfóxido adequados na determinação espectrométrica de massa de moléculas de analito tais como peptídeos bem como adutos de tais reagentes e moléculas de analito e aplicações dos ditos reagentes e adutos. Além disso, a presente invenção se refere a métodos para a determinação espectrométrica de massa de moléculas de analito.

[002] Depois do desenvolvimento de novos métodos de sequen- ciamento de genoma que permitem estudos de genômica humana em apenas algumas horas,! atualmente, testemunhou-se a emergência de novos métodos de espectrometria de massa que agora permitem a investigação dos proteomas completos de células e tecidos ./2*!

[003] O proteoma é definido como a coleção de todas as proteí- nas presentes em uma amostra e consequentemente proteomas dife- rem dramaticamente de tipo celular a tipo celular e em diferentes teci- dos.

[004] Dados de proteômica, portanto, fornecem informações do tipo perfil sobre situações celulares e estados de doença potencial- mente existentes.!º! Para ganhar conhecimento profundo no proteoma de sistemas biológicos, é necessário obter informação quantitativa sobre os níveis das proteínas individuais nas diferentes amostras. Hoje em dia, isto é realizado com espectrometria de massa. Visto que a quantificação exata de proteínas intactas é difícil, os métodos reque- rem digestão (tripsinização) dos proteomas para fornecer os peptídeos correspondentes. Para a quantificação destes peptídeos, métodos tais como rotulagem metabólica,!*! quantificação isenta de rótulo!º! ou rotu- lagem isobárical** 11! são realizados.

[005] Visto que a rotulagem isobárica é capaz de revelar até pequenas diferenças em abundâncias de peptídeo e porque muitas amostras podem ser comparadas em uma medição, este é um dos métodos de quantificação mais comumente usados.12

[006] Existe, entretanto, ainda uma necessidade de aumentar a sensibilidade dos métodos de análise de MS, particularmente para a análise quantitativa de peptídeos que têm uma abundância baixa ou quando apenas poucos materiais (tais como tecidos de biópsia) estão disponíveis, por MS.

[007] Uma principal desvantagem de reagentes de MS disponí- veis atualmente é sua eficiência de clivagem baixa, que reduz o número de íons repórteres e, portanto, íons complementares, disponí- veis para análise quantitativa.*! Adicionalmente, a clivagem entre as unidades repórteres e compensadoras reduz o estado de carga do peptídeo de íon complementar e isto pode levar à formação de espé- cies neutras invisíveis em MS.

[008] Assim, a presente invenção se refere a um novo reagente à base de sulfóxido para o uso em MS que permite uma determinação extremamente sensível de moléculas de analito tais como peptídeos em amostras biológicas. Além disso, o uso de versões isotopicamente modificadas dos reagentes permite obter dados de MS quantitativos exatos para estudos comparativos. Em particular, o reagente inventivo pode ser usado em proteômica, permitindo a quantificação exata de peptídeos em misturas complexas.

[009] Assim, um primeiro aspecto da presente invenção é um composto adequado como um reagente para espectrometria de massa, que é da fórmula geral (1): ZI-LI-(CRIR2)-S(0)-CR?H-CH2-C(-L2-22)Rº(-L*-X) em que Z' é a unidade de carga capaz de portar pelo menos uma porção carregada

L'? é uma ligação ou um espaçador, Zº é unidade de carga capaz de portar pelo menos uma porção carregada, L? é uma ligação ou um espaçador, R1, R?, Rà, Rº são independentemente hidrogênio ou alquila C1-C3, X é um grupo reativo capaz de reagir com uma molécula de analito, por meio do qual uma ligação covalente com a molécula de analito é formada, L* é uma ligação ou espaçador.

[010] Em um aspecto particular, o composto (Il) pode estar pre- sente como um isotopólogo, isto é, um composto em que um ou mais isótopos principais aqui também referidos como átomos isotopica- mente neutros do composto, por exemplo, átomos de *H, 1?C, **N e/ou 16Q foram substituídos por isótopos estáveis menores, isto é, isótopos estáveis tais como D, ºC, **N e 1ºO. Em particular, preferidos são **C e **N.

[011] A invenção também se refere a uma composição de rea- gente ou kit de reagente compreendendo pelo menos um composto (1) e particularmente uma pluralidade de espécies isotopicamente dife- rentes de tal composto (1) que são preferivelmente isobáricas.

[012] Um outro aspecto da invenção é o uso do composto (1) ou uma composição ou kit compreendendo pelo menos um composto (1) para a determinação espectrométrica de massa de uma molécula de analito, particularmente de uma molécula de analito compreendendo um grupo amino tal como um peptídeo ou proteína.

[013] Ainda um outro aspecto da invenção é um aduto covalente formado por reação do composto (|) e uma molécula de analito. O aduto pode ser um composto da fórmula geral (Il): Z-LI-(CRIR2)-S(O0)-CR?H-CH2-C(-L2-22)R4-(L*-X")-T em que T é uma molécula de analito, X é uma porção resultante da reação de um grupo X no composto (|) com uma molécula de analito T, Z', LI, 22, 12, Ls, R1, R2, Rà e Rº são como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que o aduto pode portar uma carga positiva ou negativa permanente.

[014] O aduto do composto da fórmula (1) e a molécula de analito, particularmente uma molécula de analito compreendendo uma porção de peptídeo podem ser usados para a determinação espectrométrica de massa. O aduto pode ser gerado reagindo-se a molécula de analito presente em uma amostra com o composto (Il). O aduto, entretanto, também pode ser fornecido como uma substância pura para o uso como um calibrador e/ou padrão.

[015] Ainda um outro aspecto da invenção é um método para a determinação espectrométrica de massa de uma molécula de analito em uma amostra compreendendo as etapas: (a) reagir covalentemente a molécula de analito com um composto da fórmula (1) como definido aqui, por meio do qual um aduto covalente da molécula de analito e do composto (1) é formado, e (b) submeter o aduto da etapa (a) a uma análise espectro- métrica de massa.

[016] A presente invenção se refere ainda à determinação de uma molécula de analito por MS e em particular por MS quantitativa. A molécula de analito pode ser qualquer substância capaz de formar uma ligação covalente com um grupo reativo X no composto (1) da presente invenção.

[017] Por exemplo, o analito pode ser uma biomolécula selecio- nada de peptídeos, proteínas, carboidratos, aminoácidos, ácidos graxos, lipídeos, nucleosídeos, nucleotídeos, ácidos nucleicos e outras biomoléculas incluindo metabólitos de molécula pequena e cofatores bem como fármacos, agentes agrícolas, toxinas ou metabólitos destes.

[018] Em geral, moléculas de analito podem estar presentes em amostras biológicas, clínicas ou ambientais tais como líquidos corpo- rais, por exemplo, sangue, soro, plasma, urina, saliva, etc., extratos teciduais ou celulares, etc. Em algumas modalidades da presente invenção um lisato completo de células ou tecido pode ser usado sem purificação adicional. Entretanto, certamente, as moléculas de analito podem estar presentes em uma amostra que é uma amostra purificada ou parcialmente purificada, por exemplo, uma mistura ou extrato de proteína purificados ou parcialmente purificados.

[019] De acordo com uma modalidade especialmente preferida, a molécula de analito é um peptídeo ou uma proteína, em particular um peptídeo ou proteína compreendidos em uma amostra complexa. Por exemplo, o proteoma completo de uma célula ou tecido pode ser analisado quanto ao peptídeo ou proteína de interesse dentro de uma medição de MS. Preferivelmente, depois do isolamento, o proteoma, isto é, a coleção de todas as proteínas em uma amostra, é digerido para fornecer peptídeos menores antes de ser rotulado com um reagente descrito aqui.

[020] Em modalidades preferidas particulares, a molécula de analito é uma proteína, peptídeo ou substância tendo um grupo amino, que é capaz de formar uma ligação covalente com grupo reativo X de composto (1). Um tal grupo amino pode ser um grupo amino N-terminal de cadeia de peptídeo e/ou um grupo amino de uma cadeia lateral, como, por exemplo, de lisina.

[021] De acordo com uma outra modalidade, a molécula de anali- to compreende pelo menos um tiol, que é capaz de formar uma ligação covalente com grupo reativo X do composto (Il), tal como peptídeos contendo Cys.

[022] Certamente, peptídeos ou proteínas a serem analisados também podem compreender modificações pós-traducionais tais como glicosilação, acilação etc. Tais resíduos adicionados às proteínas por modificação pós-traducional também podem ser alvejados pelo reagente inventivo.

[023] Além disso, a molécula de analito também pode ser um carboidrato ou substância tendo uma porção carboidrato, por exemplo, uma glicoproteína ou um nucleosídeo. Por exemplo, a molécula de analito pode ser um monossacarídeo tal como ribose, desoxirribose, arabinose, ribulose, glicose, manose, etc., ou um oligossacarídeo, por exemplo, um dissacarídeo tal como sacarose, maltose ou lactose ou um tri- ou tetrassacarídeo bem como um polissacarídeo, ou substância compreendendo uma tal porção mono-, oligo- ou polissacarídeo.

[024] A molécula de analito pode compreender um grupo carbo- nila, por exemplo, um grupo aldeído ou um grupo ceto, ou um grupo aldeído ou ceto mascarado, por exemplo, um grupo hemiacetal, parti- cularmente um grupo hemiacetal cíclico, que é capaz de formar uma ligação covalente com grupo reativo X do composto (1). A molécula de analito também pode compreender um grupo acetal, que pode ser convertido em um grupo aldeído, ceto ou hemiacetal antes da reação com o composto (1).

[025] O composto (1) da presente invenção compreende um grupo reativo X capaz de reagir com uma molécula de analito, por meio do qual uma ligação covalente com a molécula de analito é formada. Em uma modalidade preferida, o grupo X é selecionado de (i) um grupo reativo em carbonila, que é capaz de reagir com qualquer tipo de molécula, por exemplo, molécula de carboidrato, tendo um grupo carbonila, (ii) um grupo reativo em tiol, que é capaz de reagir com

7I41 qualquer tipo de molécula, por exemplo, peptídeo contendo Cys, tendo um grupo tiol ou (iii) um grupo reativo em amina, que é capaz de reagir com qualquer tipo de molécula, por exemplo, peptídeo contendo grupo amino, tendo um grupo amino.

[026] Especialmente preferidos são grupos reativos em amina.

[027] O grupo reativo em carbonila pode ter um átomo de N super-nucleofílico reforçado pelo efeito a através de um átomo de O ou N adjacente NH2-N/O ou uma molécula de ditiol. Ele pode ser selecio- nado de: (i) um grupo hidrazina, por exemplo, um grupo H2N-NH-, ou H2oN-NR*-, em que R' é arila, ou alquila C1-4, particularmente alquila C1 ou C2, opcionalmente substituído por exemplo, com halo, hidroxila, e/ou alcóxi C1-3, (ii) um grupo hidrazona, por exemplo, um grupo H2N-NH- C(O)-, ou HAN-NR?-C(O)-, em que R? é arila ou alquila C1-4, particularmente alquila C1 ou C2, opcionalmente substituído por exemplo, com halo, hidroxila, e/ou alcóxi C1-3, (iii) um grupo hidroxilamino, por exemplo, um grupo H2N-O-, (iv) um grupo ditiol, particularmente um grupo 1,2-ditiol ou 1,3-ditiol.

[028] Certamente, um grupo hidrazina ou hidroxil amino como descrito acima também pode ser usado para reagir com outros grupos eletrofílicos presentes em uma molécula de analito.

[029] O grupo reativo em tiol pode ser, por exemplo, um grupo alceno eletrofílico, por exemplo, RIR2C=CR*-C(O)-NH- em que R', R? e R? são independentemente H, halogênio ou alquila C1-4, preferi- velmente H. Outros agentes reativos em tiol podem ser maleimidas,

haletos de alquila ou haloacetamidas, em particular, iodoacetamidas.

[030] Existem numerosos grupos reativos em amino que podem formar ligações químicas com aminas primárias ou secundárias tais como grupos amino N-terminais de peptídeos ou proteínas e aminas metiladas, por exemplo, de cadeias laterais de lisina metilada. Assim, de acordo com a presente invenção “grupo reativo em amino” inclui acil azidas, isotiocianatos, isocianatos, ésteres de NHS, ésteres pentafluorfenílicos, ésteres de hidroxibenzotriazol, cloretos de sulfonila, glioxais, epóxidos, oxiranos, carbonatos, haletos de arila, imidoésteres, carbodiimidas, anidridos e ésteres fluorofenílicos.

[031] Entretanto, de acordo com modalidades preferidas, o grupo “reativo em amino” usado aqui, é preferivelmente um grupo éster ativo tal como N-hidróxi succinimida (NHS) ou sulfo-NHS, um hidroxibenzotriazol (HOBt), um grupo 1-hidróxi-7-azabenzotriazol (HOAt) ou um imidoéster -CH2-C(=NH2*)-O-CH3. Particularmente preferido é NHS.

[032] O composto (1) tem unidades de carga Z'º e Z?, cada uma capaz de portar pelo menos uma porção carregada, isto é, as unidades de carga Zº e Z? podem ser carregadas permanentes por exemplo, quando do uso de um grupo amônio quaternário, ou podem ser gerados por protonação (carga positiva) ou desprotonação (carga negativa).

[033] Preferivelmente 2º e Z? são iguais e/ou 2º e Z2?º têm a mesma carga.

[034] Em modalidades particulares, mas não necessariamente, o composto (1) tem unidades de carga Zº e Z?, cada uma compreen- dendo pelo menos uma porção carregada, isto é, uma porção que está predominantemente presente em um estado carregado sob condições substancialmente neutras.

[035] Por exemplo, cada uma das unidades de carga 2º e 2?

pode compreender (i) pelo menos uma porção positivamente carregada tal como um grupo amônio primário, secundário, terciário ou quaternário ou um grupo fosfônio, particularmente tendo um pKa de 10 ou mais alto, mais particularmente tendo um pKa de 12 ou mais alto, ou (ii) pelo menos uma porção negativamente carregada tal como um grupo fosfato, sulfato, sulfonato ou carboxilato, particular- mente tendo um pKr" de 10 ou mais alto, mais particularmente tendo um pKyp de 12 ou mais alto.

[036] De acordo com uma modalidade preferida, Z' e Z? são ambos grupos terc-amino, isto é, -NR'R? com R' e R? preferivelmente sendo alquila C1-C5 ou formando um anel de alquila cíclico de 5 ou 6 membros opcionalmente compreendendo um ou dois heteroátomos adicionais, tal como N. R' e R? podem ser selecionados indepen- dentemente, mas preferivelmente R' e R? são iguais. Especialmente, R' e R? são selecionados de dimetil-amino e dietil-amino ou formam juntos piperidina ou pirrolidina.

[037] Tal protonação de Zº e Z? pode ser feita como uma última etapa da síntese de reagentes inventivos e o reagente protonado pode ser armazenado. Entretanto, Z* e Zº também podem ser protonados na fase gasosa, mesmo depois da reação do reagente inventivo com uma molécula de analito, diretamente antes das análises de MS, o que é ainda preferido. Por protonação de Zº e Z?, a formação de espécies neutras durante a clivagem de reagente é evitada.

[038] Grupos L', Lº e L* na fórmula geral (1) independentemente representam uma ligação, isto é, uma ligação covalente, ou um espa- çador, isto é, um espaçador linear ou ramificado tendo um compri- mento de cadeia de 1 até usualmente 4, 6, 8 ou 10 átomos ou ainda mais, por exemplo, átomos de C opcionalmente incluindo pelo menos um heteroátomo, em particular N e ou grupos carbonila.

Preferivelmente L' e L? são iguais quanto ao comprimento de cadeia e opcionalmente incluíram heteroátomos e/ou grupos carbonila, entre- tanto, podem diferir com composição de isótopo, isto é, L' e L? podem ser isotopólogos entre si.

[039] De acordo com uma modalidade especialmente preferida, grupos L'? e/ou L? são -C(O)-NH-(CH>2)n e/ou -NH-C(O)-(CH2)m- com m e n sendo um número inteiro entre 1 e 10.

[040] Em uma modalidade preferida, o composto da fórmula (1) é adequado como um reagente para a determinação de moléculas de peptídeo ou proteína e pode ser um composto da fórmula geral (la): Z!-LI-(CRIR2)-S(0)-CR?H-CH2-C(-L2-Z2)Rº(-L*X!) em que Z' compreende pelo menos uma porção positivamente carregada tal como um grupo amônio primário, secundário, terciário ou quaternário, em particular um grupo terc-amino protonado, tal como dimetil-amino e dietil-amino protonados, piperidina ou pirrolidina, L' é um espaçador, em particular -C(O)-NH-(CH2))- com n sendo um número inteiro de 1 a 10, em que n é preferivelmente m, Z?éiguala Z!, L? é um espaçador, em particular -NH-C(O)-(CH2)m- com m sendo um número inteiro de 2 a 10, R1, R?, Rà, R$ são hidrogênio, X' um grupo reativo em amina que é capaz de reagir com uma amina, por exemplo, um grupo amino de uma molécula de analito tal como um peptídeo, LX é uma ligação ou espaçador.

X' é preferivelmente selecionado de N-hidróxi succinimida (NHS), — sulfo-NHS, — hidroxibenzotriazol (HOBt), 1-hidróxi-7- azabenzotriazol (HOAt) ou imidoésteres -CH2-C(=NH2*)-O-CH;3.

[041] Um exemplo específico de um composto de acordo com a presente invenção é um composto da fórmula (lb):

IN EAES — oo as N.. d

[042] Um outro aspecto da presente invenção se refere a um composto da fórmula (1) que é um isotopólogo. O termo “isotopólogo” se refere a um composto (|) em que pelo menos um dos isótopos principais é substituído por um isótopo estável menor do respectivo elemento, tendo uma massa molecular, que é diferente da massa molecular do respectivo isótopo principal. Assim, o isotopólogo resul- tante de (1) tem uma massa molecular que é diferente da massa molecular do respectivo composto consistindo nos isótopos principais aqui referidos como isotopicamente neutros. Esta diferença na massa molecular permite a diferenciação espectrométrica de massa de um composto isotopicamente neutro e um isotopólogo deste. Em uma modalidade preferida, o isotopólogo compreende pelo menos um isótopo selecionado de D (como substituição de H), ºC (como substituição de 1?C), **N (como substituição de **N) e *6O (como substituição de *ºO).

[043] Em um isotopólogo, um ou mais e até todos os respectivos átomos isotopicamente neutros podem ser substituídos por isótopos. Desse modo, um grande número de diferentes isotopólogos de um único composto pode ser fornecido.

[044] Por exemplo, em um composto da fórmula (la) ou (Ib) como mostrado acima, um ou mais ou todos os átomos de !*N e !?C no espaçador L', respectivamente -C(O)-NH-(CH2))n com preferivelmente n=m, e/ou o espaçador L?, respectivamente -NH-C(O)-(CH2)m- com preferivelmente m>1, podem ser substituídos por **N ou "ºC.

[045] O composto (Il) pode ser fornecido como um composto isotopicamente neutro ou como um isotopólogo que é distinguível em MS do respectivo composto isotopicamente neutro ou como uma composição compreendendo uma pluralidade de diferentes isotopó- logos distinguíveis em MS do mesmo composto ou como um Kkit compreendendo uma pluralidade de diferentes isotopólogos distinguíi- veis em MS do mesmo composto em forma separada. Composição ou kits compreendendo uma pluralidade de diferentes isotopólogos distinguíveis em MS de um reagente são particularmente adequados para aplicações de multiplexação como descrito abaixo.

[046] Em uma modalidade preferida da invenção uma compo- sição ou kit compreende pelo menos dois reagentes de isotopólogos como descrito aqui que são isobáricos. Por exemplo, em um primeiro reagente A de acordo com a fórmula (1) um isótopo estável pesado tal como **N ou "ºC é introduzido em Zº ou L'. 72? e 1º permanecem inalterados. Em um segundo reagente B Zº e L' permanecem inalte- rados, mas o mesmo isótopo como no reagente A é introduzido em Z? ou L?. Os agentes A e B resultantes são isobáricos (consultar também a Figura 1).

[047] O reagente de acordo com a fórmula (lb) permite a intro- dução de até sete isótopos estáveis pesados tais como **N ou "ºC nas estruturas gerando repórteres com A m/z=1 enquanto mantendo a isobaricidade.

[048] Devido ao caráter isobárico dos reagentes, as mesmas moléculas de analito derivadas de duas amostras caracterizará como aduto o mesmo tempo de retenção durante a separação por MS. Entrando no espectrômetro de massa ao mesmo tempo, os adutos derivados de diferentes amostras e rotulados com reagentes inventi- vos diferentes mas isobáricos levam a um valor de m/z indistinguível em uma triagem por MS. Isto permite realizar identificação com base em espectrometria de massa selecionando-se um único m/z precursor para MS?.

[049] Assim, kits ou composições compreendendo reagentes da fórmula (Ib) tendo 1 a 7 isótopos estáveis introduzidos enquanto sendo isobáricos representam uma outra modalidade preferida da presente invenção. Um tal projeto permite quantificação espectrométrica de massa de até 8 amostras diferentes em paralelo com uma única medição de MS.

[050] A síntese de compostos preferidos da fórmula (1) incluindo isotopólogos destes é descrita abaixo na seção Exemplos e na Figura

4.

[051] Ainda um outro aspecto da invenção se refere ao uso do composto da fórmula (|) para a determinação espectrométrica de massa de uma molécula de analito, particularmente para a determi- nação de uma molécula de analito de peptídeo como descrito acima. Este uso envolve uma derivação da molécula de analito por meio de uma reação com o composto (1), por meio da qual um aduto covalente é formado e subsequentemente submetido à análise por MS.

[052] Um esquema geral envolvendo o uso do composto (|) como um reagente para a determinação quantitativa de uma molécula de peptídeo por MS é mostrado na Figura 1. Em particular, um reagente de acordo com a presente invenção (Fórmula 1b; SOT) é comparado a um reagente conhecido da técnica anterior.

[053] No caso do aduto compreender uma carga positiva, a detecção por MS ocorre no modo positivo. No caso do aduto ter uma carga negativa, a detecção será realizada no modo de MS negativo.

[054] A determinação espectrométrica de massa pode ser combi- nada por métodos analíticos adicionais incluindo métodos cromatográ- ficos tais como cromatografia gasosa (GC), cromatografia líquida (LC), particularmente HPLC, e/ou técnicas de separação com base em mobilidade iônica.

[055] Um outro aspecto da invenção é um aduto formado por reação do composto da fórmula geral (1) como descrito acima e uma molécula de analito. Por meio desta reação, uma ligação covalente entre o composto (1) e a molécula de analito é formada.

[056] Em uma modalidade preferida, o aduto é um composto da fórmula geral (11): ZI-LI-(CRIR?2)-S(0)-CR?H-CH2-C(-L2-22)R4-(LX')-T em que T é uma molécula de analito, X é uma porção resultante da reação de um grupo X no composto (1) com uma molécula de analito T, Z1, LI, 22, L2, L, R1, R2, Rô e Rº são como definidos acima, em que o aduto pode portar uma carga positiva ou negativa permanente.

[057] Para a detecção por MS, o composto de aduto da fórmula (II) porta uma carga positiva ou negativa. Esta carga é preferivelmente fornecida pelas unidades de carga Z* e Zº do composto (1), preferivel- mente por protonação de Zº e Z?. A presença de uma carga no composto (1), entretanto, é não necessária visto que uma carga pode ser fornecida por outro meio, por exemplo, quando a molécula de analito por si só porta uma carga e/ou quando o aduto pode ser forne- cido com uma carga por meio de uma protonação ou desprotonação.

[058] A presença de duas unidades de carga 2º e Z?, preferivel- mente grupos terc-amino protonados, leva a estados de carga mais alta que resultam em fragmentação de molécula de analito/aduto alta e consequentemente identificação de molécula de analito mais exata. Além disso, a presença das duas unidades carregadas Z' e 2? evita a formação de espécies neutras durante a clivagem/fragmentação do aduto. A densidade de carga aumentada facilita a detecção e fragmentação.

[059] Ainda um outro aspecto da invenção é o uso do composto de aduto (ll) para a determinação espectrométrica de massa de uma molécula de analito. Em uma modalidade preferida particular, a deter- minação espectrométrica de massa compreende determinação espec- trométrica de massa em tandem, mais particularmente em um disposi- tivo triplo quádruplo, em que o íon molecular do aduto de analito é submetido à fragmentação, por exemplo, por dissociação induzida por colisão (CID).

[060] Durante a fragmentação além de um fon repórter compre- endendo Zº e L' um conjugado de compensador-aduto, o íon com- plementar, é gerado do aduto arqueado (consultar também a Figura 1) com o compensador compreendendo Z? e Lº?. O compensador ligado mantém o padrão de isótopo distinto dos reagentes de rotulagem isobárica, assim, o íon complementar também permite a quantificação. Isto fornece a vantagem de que peptídeos de coeluição que fornecem íons repórteres indistinguíveis dos sinais repórteres de interesse, podem não interromper o sinal. Desejavelmente, o problema conhe- cido de distorção de razão que impede uma quantificação exata com base em análise de íon repórter pode ser assim superado.

[061] Em uma modalidade, o composto de aduto (Il) pode ser gerado por reação de uma molécula de analito presente em uma amostra a ser analisada com o composto (|) que foi adicionado à amostra.

[062] Em uma outra modalidade, um composto de aduto (Il) também pode ser fornecido como uma substância pura para o uso como um calibrador e/ou como um padrão. O uso do composto de aduto (Il) como um calibrador pode envolver a geração de uma curva de calibração para uma molécula de analito específica, em que dife- rentes quantidades conhecidas de composto de aduto (Il) são submetidas à análise de MS e as respectivas intensidades de sinal são medidas de modo a permitir uma determinação quantitativa exata de uma quantidade desconhecida da molécula de analito presente em uma amostra.

[063] Ainda um outro aspecto da presente invenção se refere a um método para a determinação espectrométrica de massa quanti- tativa de uma molécula de analito compreendendo as etapas: (a) fornecer pelo menos duas amostras de analito a serem comparadas, (b) reagir covalentemente a molécula de analito em cada amostra fornecida com um reagente da fórmula geral (1) como definido aqui, por meio do qual para cada amostra um reagente de isotopólogo diferente da fórmula geral (1) é usado e por meio do qual os reagentes de isotopólogos usados para diferentes amostras são isobáricos entre si e por meio do qual um aduto da molécula de analito e do reagente em cada amostra é formado, (c) combinar pelo menos duas amostras compreendendo o aduto da molécula de analito e os reagentes isobáricos, (d) submeter os adutos combinados da etapa (c) a uma análise espectrométrica de massa, em que a etapa de análise espectrométrica de massa (d) preferivelmente compreende: (1) submeter íons dos adutos isobáricos combinados a um primeiro estágio de análise espectrométrica de massa, por meio do qual os íons dos adutos combinados são caracterizados de acordo com sua razão de massa/carga (m/z), (ii) causar a fragmentação dos íons de aduto combinados, por meio do qual um íon repórter e um íon complementar tendo a mesma carga são produzidos a partir de cada íon de aduto e por meio do qual íons repórteres não isobáricos e íons complementares não isobáricos são fornecidos para cada amostra de analito originalmente fornecida a ser comparada, (ili) submeter os íons repórteres não isobáricos e íons complementares não isobáricos da etapa (ii) a um segundo estágio de análise espectrométrica de massa, (ili) quantificação relativa dos íons repórteres da etapa (ii), e (iv) quantificação relativa dos íons complementares da etapa (ii).

[064] Certamente, uma das amostras de analito da etapa (a) pode ser uma amostra padrão ou de referência. Deste modo, a quanti- dade de analito em uma amostra desconhecida pode ser determinada. Entretanto, de acordo com o método inventivo o mesmo analito de uma pluralidade de amostras também pode ser quantificado dentro de uma medição de MS e do teor de analito das diferentes amostras a serem comparadas.

[065] A presente invenção é adequada para aplicações clínicas tais como o fornecimento de informação diagnóstica e/ou prognóstica em um sujeito, particularmente um sujeito humano. Aplicações especí- ficas são a diagnose de doenças associadas com, acompanhadas por ou causadas por uma alteração no proteoma de uma célula ou tecido, por exemplo a diagnose de doenças hiperproliferativas tais como câncer, por exemplo, determinação da agressividade e invasão de tumores, caracterização de plaquetas bem como a medição do nível de fibrose hepática, investigação das características do anticorpo e características de células imunes tais como células T. Em geral, o reagente (|) e seus isotopólogos podem ser usados para obter infor- mação quantitativa sobre a presença e níveis de proteína ou peptídeos específicos em células e/ou tecidos.

Descrição das Figuras

Figura 1 A) Experimento de rotulagem isobárica para proteômica quantitativa. As amostras são individualmente rotuladas com isotopó- logos dos reagentes 1 ou 2 e combinadas para estudos de LC-MS. A fragmentação na fase gasosa produz íons repórteres e complemen- tares para a quantificação relativa. A razão de íon repórter é distorcida por peptídeos coisolados (roxo, *). Os agrupamentos de íon comple- mentar podem ser analisados sem uma tal distorção.

B) Reagente de TMT (1) correntemente usado. A fragmen- tação introduz uma carga negativa no compensador, reduzindo o estado de carga global nos íons complementares. C) Etiqueta de Sulfóxido (SOT, 2) relatada neste estudo com uma fragmentação de carga neutra que mantém todas as cargas nos íons complementares para facilitar a fragmentação.

Figura 2 A) Comparação da eficiência de fragmentação entre TMT 1 e SOT 2 em um peptídeo. Em uma energia de colisão normalizada de 28% de HCD, o peptídeo rotulado com SOT fragmenta mais facilmente e produz sinais de íon repórter altos. Etiqueta = reagente reagido.

B) Análise estatística das intensidades relativas de SOT1%º de íon repórter observadas no experimento de MS?. O fon repórter exibe uma excelente visibilidade, permitindo quantificação de fon repórter fácil. C) Distribuição do estado de carga de peptídeos precur- sores rotulados com o dúplex de TMT (1) ou SOT (2). Usando-se o reagente de SOT, estados de carga mais altos se tornam mais abundantes, o que deveria levar à fragmentação mais eficiente devido à densidade de carga mais alta.

Figura 3 A) Razão de todos os íons de fragmento identificados (67720) contendo o rótulo intacto (repórter + compensador) ou que mostram perda dos íons repórteres, levando à formação de agrupa- mentos de íon complementar.

B) Análise estatística das espécies de peptídeo identifica- das. Em média, cada peptídeo forma 15 íons complementares individuais, que resultam em 7 a 8 agrupamentos de íon complemen- tar. O número de fragmentos de peptídeo contendo o rótulo não cliva- do, intacto garante identificação de peptídeo confiável. C) Espectro de MS? exemplar do peptídeo rotulado EMLPVLEAVAK*, representando os íons repórteres (vermelho), sete agrupamentos de íon comple- mentar (laranja) e íons de fragmento usados para identificação (cinza).

Figura 4 A) Representação do reagente inventivo 2 e dos isotopó- logos 217º e 21%, B) a) Cloridrato do ácido 3-(dimetilamino)propiônico, NEts, HOBt, 60ºC, 2 h, 85%; b) Em duas etapas in situ i) TOEP*HCI, NaHCO;3, H2O/DMF (4:1), r.t., 10 min; ii) Bromoacetato de benzila, r.t., 2 h, 95%; c) Ácido fórmico a 10% em MeOH, 100% em peso de negro de Pd, 40ºC, 2 h, 81%; d) N,N'-dimetiletano-1,2-diamina, DIPEA, PyBOP, DMF, 40ºC, 1 h, 73%; e) LiOH, MeOH/H2O (2,5:1), rt, 1h, 100%; f) pH = 2, nCPBA, H2O, r.t., 20 min, 75%; g) NHS-TFA, piridina, DMF, r.t., 2 h, 35%. 179 Da e 180 Da são os pesos moleculares dos íons repórteres gerados.

Exemplos

1. Introdução

[066] Os proteomas de duas amostras são isolados, digeridos e os peptídeos são reagidos com um reagente de rotulagem isobárica tal como o TMT 1 (Fig. 1B) ou o reagente de rotulagem inventiva 2 (Fig. 1C).

[067] As misturas de peptídeo derivado preparadas são combi- nadas em seguida e a mistura é analisada por HPLC-MS!! ou ainda

CE-MS.1516]

[068] Durante a separação, os mesmos peptídeos derivados das duas amostras (azul e vermelho na Fig. 1) caracterizarão o mesmo tempo de retenção devido ao caráter isobárico dos rótulos. Eles, consequentemente, entrarão no espectrômetro de massa ao mesmo tempo, levando a um valor de m/z indistinguível na varredura de MS total. Isto permite realizar a identificação com base em espectrometria de massa selecionando-se um único m/z precursor para MS?. A cliva- gem dos rótulos isobáricos fornece agora dois íons repórteres diferen- tes (A, Fig 1A), o que permite a quantificação relativa.

[069] Além de um íon repórter, um conjugado de compensador- peptídeo, o íon complementar, também é gerado a partir de cada peptídeo. Porque o compensador ligado mantém o padrão de isótopo distinto do reagente de rotulagem isobárica, os íons complementares também permitem a quantificação.)

[070] Isto ainda tem a vantagem de que peptídeos de coeluição (roxo), que fornecem íons repórteres indistinguíveis dos sinais repórte- res de interesse, podem não interromper o sinal. Este problema, conhecido como distorção de razão, frequentemente impede a quanti- ficação exata com base na análise de íon repórter.17)

[071] Uma desvantagem dos reagentes disponíveis atualmente é sua eficiência de clivagem baixa, que reduz o número de íons repórte- res e portanto, íons complementares, disponíveis para análise.

[072] Adicionalmente, a clivagem entre as unidades repórteres e compensadoras reduz o estado de carga do peptídeo de íon comple- mentar e isto pode levar à formação de espécies neutras invisíveis em MS.

2. Resultados e debate

[073] Aqui foi relatado o desenvolvimento de um novo reagente de Etiqueta de SulfÓóxido 2 (SOT, Fig. 1) que fragmenta de forma limpa e com rendimento alto. Sinais fortes tanto para os íons repórteres quanto para os íons complementares são gerados com base em uma fragmentação de sulfóxido na fase gasosa. Importantemente, o reagente caracteriza dois grupos terc-amino básicos, que são protona- dos na fase gasosa. Isto evita a formação de espécies neutras durante a clivagem de reagente. Ao contrário, isto ainda aumenta a densidade de carga, o que facilita a detecção e fragmentação. O reagente de SOT 2 permite, em princípio, a introdução de até sete isótopos está- veis pesados na estrutura gerando repórteres com Am/z = 1, enquanto mantendo a isobaricidade. Este projeto foi escolhido para permitir a quantificação espectrométrica de massa de oito amostras diferentes em paralelo com uma única medição.

[074] A síntese do reagente inventivo 2 e de dois derivados de isótopo isobáricos (217º e 21%), que caracterizam diferentes pesos moleculares de íon repórter (179 Da e 180 Da), é mostrada na Figura 4 (conforme também o item 4. dos Exemplos). A síntese começa com o éster metílico do dímero de homocistina 3, que é primeiro convertido com ácido dimetilaminopropiônico na bisamida 4. A redução do dissul- feto e alquilação do tiol com bromoacetato de benzila fornece o intermediário chave 5. A clivagem do éster benzílico a 6 e a reação de 6 com 1,1-dimetiletilenodiamina fornece a bisamida 7. A saponificação do éster metílico em 7 a 8, a oxidação do sulfeto ao sulfóxido 9 e a conversão do ácido fornecem o reagente 2 como o éster ativo. Para acessar os isotopólogos necessários, foi substituído, em uma segunda síntese, o ácido dimetilaminopropiônico pelo mesmo composto 10 em que um grupo metila porta um átomo de *ºC (SI). Em uma terceira síntese, foi usado o benzilbromoacetato rotulado com *ºC 11 (SI). Isto forneceu os reagentes correspondentes 2” e 21%ºº em rendimentos similares.

[075] Para examinar as propriedades de fragmentação do reagente inventivo SOT 2, foi digerido um lisato de E. coli total, contendo todas as proteínas traduzidas nos peptídeos correspon- dentes seguindo um protocolo padrão (SI). A mistura de peptídeo complexa obtida (P) foi dividida em duas porções. Enquanto uma porção foi reagida com o reagente 217º (P-217º) a outra foi combinada com 21% para fornecer P-21%º (pH = 8,5, 150 mM de tampão de bicar- bonato de trietilamônio, 3 mg 2, 60 min). Extinguiu-se subsequen- temente o reagente 2 não reagido com hidroxilamina. Em seguida, as misturas rotuladas (P-217º+P-218º) foram combinadas em uma razão de 1:1e a mistura complexa foi dessalinizada e concentrada de acordo com os procedimentos relatados.!"º!

[076] Para comparação, foi realizado o mesmo experimento com os reagentes de TMT 1 isotopicamente rotulados comercialmente disponíveis (dúplex) de acordo com as recomendações do fabricante para obter a mistura (P-TMT126 + P-TMT2). As misturas de peptídeo (P-217º + P-2189) e (P-TMTI126 + P-TMTI1274 foram medidas em seguida por nanoHPLC-MS? e os dados foram analisados usando o software MaxQuant e um pacote de software desenvolvido internamente (SI). Os dados obtidos são representados na Fig. 2 e Fig. 3.

[077] Como um exemplo, a Fig. 2A mostra a clivagem do rea- gente de SOT 2 depois da reação com o peptídeo ALEGDAEWEAK?* (dois rótulos) em comparação direta ao peptídeo rotulado com TMT correspondente na mistura complexa. Foi medida uma energia de fragmentação normalizada de 28% de HCD (dissociação colisional de energia mais alta), que é idealmente apropriada para fragmentar peptídeos para sua identificação. O reagente de SOT 2 claramente gera mais íons repórteres e além disso, o reagente parece suportar a fragmentação de peptídeo porque foram observados mais íons de fragmento. A Fig. 2B mostra uma análise de todos os peptídeos identificados na amostra rotulada com SOT e aqui, observamos que na maioria dos espectros de MS?, a intensidade de íon repórter relativa é tão alta quanto 80 a 100%, o que é inédito.

[078] Isto permite a quantificação relativa fácil determinando-se as razões de (on repórter com pacotes de software disponíveis. A Fig. 2C mostra os estados de carga dos peptídeos rotulados intactos antes da fragmentação (precursores). De acordo com o projeto, observou-se que o reagente de SOT 2 gera peptídeos rotulados com estados de carga muito mais altos. Importantemente, mais do que 60% dos peptídeos rotulados têm estados de carga iguais a ou acima de +3. Esta densidade de carga alta facilita a fragmentação subsequente, que resulta em mais dados para a análise exata.

[079] Embora a intensidade de fon repórter permita medir as razões relativas entre todos os peptídeos presentes em P-2'%º versus P-217º, é frequentemente desejável quantificar com os agrupamentos de íon complementar gerados pelos conjugados de compensador- peptídeo. Porque estes conjugados de compensador fragmentam ainda no espectrômetro de massa, um grande número de agrupa- mentos de íon complementar é formado, que é específico de sequên- cia e pode ser todo usado para quantificação. Isto fornece densidade de dados mais altos e evita os problemas associados com distorção de razão. Nesse experimento, observou-se que o reagente de SOT 2 tem propriedades quase perfeitas para uma tal análise de agrupamento de íon complementar. Quando os íons de fragmento de peptídeo conten- do rótulo foram estudados, observou-se que 53% destes fragmentos ainda continham o reagente intacto 2, enquanto 47% perderam o grupo repórter produzindo agrupamentos de íon complementar (Fig. 3A). Esta razão de 1:1 quase perfeita leva em consideração a identi- ficação paralela dos peptídeos (intactos) com algoritmos de pesquisa de base de dados padrão e quantificação por intermédio dos agrupa- mentos de íon complementar abundantemente formados. A Fig. 3B mostra que o reagente de SOT 2 cria a partir de cada precursor em média 15 fragmentos de peptídeo-compensador para quantificação posterior, que corresponde a aproximadamente 7 a 8 agrupamentos de íon complementar. A Fig. 3C mostra o espectro de um peptídeo como um exemplo. Os sinais para os íons repórteres (vermelho) e de sete agrupamentos de íon complementar (laranja), abrangendo 14 íons complementares, são claramente visíveis em intensidades relati- vas altas. Para a identificação do peptídeo, íons de intensidade alta múltiplos estão disponíveis (cinza).

3. Conclusão

[080] Em suma, foi relatado o projeto de um novo reagente de rotulagem isobárica que permite a formação paralela eficiente de íons repórteres e agrupamentos de íon complementar para quantificação de peptídeo precisa. O reagente ajuda a eliminar erros de quantificação causados por distorção de razão. Isto permite, pela primeira vez, a determinação exata de peptídeo relativo e consequentemente abun- dâncias de proteína mesmo em amostras complexas. As propriedades mais importantes do reagente de SOT 2 são que íons repórteres e agrupamentos de íon complementar são formados em paralelo e que a introdução de grupos terc-amino múltiplos gera os estados de carga mais altos esperados, o que resulta em melhor fragmentação de peptídeo e consequentemente identificação de peptídeo mais exata.

4. Procedimentos de Síntese Química

4.1 Síntese de materiais de partida o

SÊ Procedimento típico 1 (TP1) de bromoacetato de benzila (12)

[081] A um frasco Schlenk de 50 mL seco e fluxado com ar, equipado com uma barra de agitação e um septo, foi adicionado o ácido bromoacético comercialmente disponível (1,00 g, 7,19 mmol, 1,16 equiv), fenilmetanol (0,64 mL, 6,20 mmol, 1,00 equiv) e ácido 4- metilbenzeno-1-sulfônico (21,356 mg, 0,12 mmol, 0,02 equiv) na presença de 10 mL de tolueno submetido ao refluxo por 2 h. Depois da conclusão, a mistura de reação foi resfriada até a temperatura ambiente e lavada duas vezes com 20 mL de solução de bicarbonato de sódio a 20% em água seguido por salmoura e lavagem com água. As camadas orgânicas combinadas foram secas em sulfato de magnésio e concentradas por intermédio de vácuo. Purificação por cromatografia em coluna flash (sílica-gel, ELOAC/DCM 1:4) produzindo 12 como um óleo incolor (1,38 g, 84%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 7,46 - 7,13 (m, 1H), 5,16 (s, 1H), 3,95 (s, 6H) ppm.

o

SÊ * Bromo(2-"ºC)acetato de benzila (11)

[082] A seguir de TP1, ácido bromoacético-2-"?C (500 mg, 3,60 mmol, 1,16 equiv) e fenilmetanol (0,32 mL, 3,10 mmol, 1,00 equiv) reage com ácido 4-metilbenzeno-1-sulfônico (10,688 mg, 0,06 mmol, 0,02 equiv) na presença de 5 mL de tolueno por 2 h em refluxo e foi processado como de costume. Purificação por cromatografia em coluna flash (sílica-gel, ELCOAC/DCM 1:4) produzindo 11 como um óleo incolor (427 mg, 52%). RMN de 1H (400 MHz, metanol-da) 5 = 7,41 - 7,33 (m, 5H), 5,20 (s, 2 H), 4,18 (s, 1H), 3,80 (s, 1H) pom. HRMS (El*): calculado para Cs! ?CH1oBrO2* [M+H]*: 229,9819; encontrado: 229,9718. IR (cm): v = 3065, 1733, 1587, 1497, 1455, 1376, 1278, 1213, 1147, 1106, 967,

736.

o

IA 3-[Benzil(metil)amino]propanoato de metila (13)

[083] Metil-3-bromopropanoato (3,00 g, 18,0 mmol) e N-metil-1- fenilmetanamina (2,18 g, 18,0 mmol) foram dissolvidos em acetonitrila (120 mL). Depois de 2 min de agitação na temperatura ambiente, Na2CO;3 (19,0 g, 180 mmol) foi adicionado e a temperatura foi aumen- tada para 70ºC por 24 h. Depois do resfriamento, a solução de reação foi filtrada e 120 mL de DCM foram adicionados ao filtrado. A fase orgânica foi lavada com NaOH 0,5 M (3 x 50 mL) e seca em Na2SOa,. Depois da filtração, o produto foi concentrado em pressão reduzida para produzir 13 como óleo incolor (3,44 g, 16,5 mmol, 92%).

RMN de *H (400 MHz, CDCI3): 5 7,30 — 7,18 (m, 5H, CsHs-CH2-N), 3,63 (s, 3H, -COOCH3), 3,48 (s, 2H, CsH5s-CH2-N), 2,71 (t, J = 7,2 Hz, 2H, -N-CH2-CH>2-), 2,49 (t, J = 7,2 Hz, 2H, -CH2-COOCH;3), 2,17 (s, 3H, -N-CH3). RMN de *ºC (101 MHz, CDCI3): à 173,00 (-COOCH;3), 138,85 (q), 128,95, 128,24 e 127,04 (CsH5-CH>2), 62,12 (CsHs-CH2), 52,75 (-N- CH2-CH2-), 51,56 (-COOCH3), 41,91 (-N-CH3), 32,75 (CH2-COOCH;3). HRMS (ESI*): calculado para Ci2Hi'sNO2* [M+H]": 208,13321; encontrado: 208,13313. IR (cm): é = 2950 (w), 2841 (w), 2790 (w), 1737 (s), 1495 (w), 1452 (m), 1236 (m), 1357 (w), 1325 (w), 1202 (m), 1168 (s), 1125 (m), 1975 (w), 1038 (m), 1025 (m).

o HCl ANA Cloridrato do ácido 3-(metilamino)propanoico (14)

[084] Em um tbo Schlenk seco por chama 3- [benzil(metil)amino]propanoato de metila 13 (1 g, 4,82 mmol) foi dissol- vido em MeOH (60 mL). Depois a atmosfera do tubo foi purgada com N2e 10 em peso de Pd/C (100 mg) foram adicionados em pequenas porções à solução. A atmosfera foi purgada com N2 novamente para se certificar de que nenhum oxigênio fosse deixado. Um balão de látex de duas camadas cheio com H,> foi fixado ao tubo Schlenk e a reação foi agitada por 16 h na temperatura ambiente. Depois de 6 he 10ho balão foi cheio novamente com H2. Pd/C foi separado por filtração com celite. A evaporação resultou em um óleo amarelado. O produto volátil bruto foi usado sem purificação adicional para a etapa seguinte. O éster metílico resultante foi dissolvido em HCl 5 M e submetido ao refluxo por 8 h. A solução foi evaporada à secura. A recristalização a partir de MeOH/etoxietano produziu o produto desejado 14 como cristais higroscópicos incolores (478 mg, 3,42 mmol, 71%). Pf.: 89 a 92ºC. RMN de 1H (400 MHz, D20) 5 3,28 (t, J = 6,4 Hz, 2H, - N-CH2-CH>2-), 2,81 (t, J = 6,5 Hz, 2H, -CH-COOH), 2,72 s (3H, CHs3) ppm. RMN de *ºC (101 MHz, CDCIa): à 174,11 (-COOH), 44,36 (-N- CH2-CH2-), 32,99 (-CH>-COOH), 29,90 (CH3) pom. HRMS (ESI) calculado para CaHioNO>2* [M+H]*: 104,07060; encontrado: 104,07063. IR (cm): é = 3376 (w), 2968 (s), 2819 (s), 1729 (s), 1557 (w) 1465 (m), 1402 (s) 1351 (w), 1289 (w), 1189 (s), 1156 (s), 1024 (s). o HCl ANO | Cloridrato do ácido 3-(metil[(*?C)metilJamino)propanoico

[085] (10) Cloridrato do ácido 3-(metilamino)propanoico 14 (401 mg, 2,87 mmol, 1,00 equiv) foi dissolvido em 88% de ácido fórmico (1,79 mL, 44,8 mmol, 15,6 equiv). Depois (*C)formaldeído (20% em água; 1 g, 6,45 mmol, 2,25 equiv) foi adicionado e a solução foi aquecida por intermédio de irradiação de micro-ondas a 110ºC, 100 W por 1 h. 200 ul de HCI foram adicionados e o solvente foi removido a vácuo. Traços de ácido fórmico foram removidos azeotropicamente com tolueno a vácuo. O sólido levemente amarelado foi recristalizado a partir de MeOH/etoxietano para obter um sólido incolor (383 mg, 2,48 mmol, 86%).

Pf.: 183 ºC. RMN de *H (400 MHz, D2O): 5 3,30 (td, J = 6,7, 3,0 Hz, 2H, -N-CH2>-CH2-), 2,97 - 2,60 (m, 8H, -CH>-COOH, -CH3, -CH3) ppm. RMN de *ºC (101 MHz, D2O): 5 = 174,06 (-COOH), 53,10 (-N-CH2- CH2-), 43,34 (-CH3), 42,78 (-?CH3), 28,78 (-CH2-COOH) ppm. HRMS (ESI*): calculado para C4"ºCHi2NO2* [M+H]* 119,08961, encontrado 119,08960. IR (cm): é = 2957 (m), 2692 (m), 2592 (w), 2481 (w), 1717 (s), 1468 (w), 1420 (m), 1370 (w), 1300 (w), 1201 (s) 1161 (m), 1006 (w), 966 (m), 854 (s), 798 (m).

4.2 Procedimentos de síntese gerais

[086] Na seção seguinte, o composto 2” será designado como 2** e o composto 2'%º será designado como 2*. NH, o MEO As SN Some o NH, (2R)-2-amino-4-([(3S)-3-amino-4-metóxi-4-0xobutil] dissulfanil)butanoato de metila (3)

[087] Um frasco Schlenk de 250 mL seco e fluxado com ar, equipado com uma barra de agitação e um septo, foi carregado com a DL-homocistina comercialmente disponível (ácido 4,4- dissulfanodiilbis(2-aminobutanoico), 6,0 g, 22,386 mmol, 1,0 equiv) dissolvido em MeOH anidro (80 mL). A solução de pasta fluida branca foi resfriada até 0ºC e cloreto de tionila (6,48 mL, 89,44 mmol, 4,0 equiv) foi adicionado às gotas por intermédio de seringa. A mistura de reação incolor resultante foi deixada aquecer até a temperatura ambiente durante 3 h. Depois, a mistura de reação foi concentrada por intermédio de vácuo durante a noite produzindo 3 como um sólido branco (6,6 g, 100%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 4,21 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,86 (s, 6H), 3,35 (s, 2H), 2,84 (m, 5H), 2,47 - 2,22 (m, 5H) ppm. RMN de **C (400 MHz, metanol-da) à = 170,53, 53,87, 52,61, 33,57, 30,91 ppm. HRMS (ESI”): calculado para CioH21N2024S2* [M+H]*: 297,0864;

encontrado: 297,09380. IR (cm-!): é = 3373, 2854, 2611, 2003, 1738, 1591, 1503, 1439, 1224, 1139, 860. o So o ! MO A Is SN Some | o INps o Procedimento típico 2 (TP2) de (2R)-2-[3- (dimetilamino)propanamido]-4-(f(3S)-3-[3-(dimetil- amino)propanamido]-4-metóxi-4-oxobutil)dissulfanil)butanoato de metila (4)

[088] A um frasco Schlenk de 50 mL seco e fluxado com ar, equi- pado com uma barra de agitação e um septo, foi adicionado o cloridrato do ácido 3-(dimetilamino)propanoico comercialmente dispo- nível (370 mg, 2,40 mmol, 2,4 equiv) e o éster metílico 3 (300 mg, 0,61 mmol, 1,0 equiv) e dissolvido em 5 mL de DMF anidro. Depois, TEA (0,29 mL, 2,12 mmol, 3,5 equiv), HOBT (340 mg, 2,50 mmol, 2,5 equiv) e EDC (502 mg, 2,61 mmol, 2,6 equiv) foram adicionados e agitados por 2 h a 60ºC. A mistura de reação de pasta fluida laranja resultante foi concentrada por intermédio de vácuo. Purificação por cromatografia em coluna flash (sílica-gel, DCM/MeOH 16:1) forneceu 4 como um sólido branco (426 mg, 85%). RMN de *H (800 MHz, metanol-da) 5 = 4,62 - 4,55 (m, 1H), 3,75 (d, J=1,5, 2H), 3,37 (s, 1H), 2,84 - 2,79 (m, 1H), 2,78 - 2,72 (m, 1H), 2,71 - 2,63 (m, 2H), 2,46 (td, J=7,3, 2,8, 2H), 2,30 (s, 6H), 2,10 - 2,04 (m, 1H) ppm. RMN de *ºC (201 MHz, metanol-da) à = 174,37, 173,54, 52,88, 52,37, 49,85, 35,59, 35,52, 34,14, 32,13 pom. HRMS (ESI*): calculado para CaoH39N4O06S2* [M+H]*: 494,2233; encontrado: 495,23034. IR (cm-!): q = 3382, 2953, 2833, 2498, 2069, 1733, 1643, 1548, 1439, 1222, 1173, 1119, 977, 856.

. o mA o | MOLA Is SN tome | Oo HN N > Dimetil-4,4'-dissulfanodiil(2R,2'S)-bis(2-(3-(metil(metil- 1BC)amino)-propanamido)-butanoato) (4**)

[089] A seguir de TP2 o cloriddato do ácido 3- (metil[(C)metilJaminolpropanoico previamente sintetizado 10 (220 mg, 1,42 mmol, 2,20 equiv) e éster metílico 3 (238 mg, 0,645 mmol, 1,00 equiv) forneceram 4** como um sólido branco (200 mg, 62%). RMN de *H (CDCl3, 400 MHz): 5 4,57 (ddd, J = 8,5, 4,8, 3,1 Hz, 1H), 3,73 (s, 6H), 2,83 — 2,59 (m, 4H), 2,46 — 1,99 (m, 20H). HRMS (ESI*): calculado para C18º CaH3aN4O6S2* [M+H]*: 497,22889; encontrado: 497,23792.

o o

SAIO

HN N mo Procedimento típico 3 (TP3) de (2S)-4-([2-(benzilóxi)-2- oxoetillsulfanil)-2-[3-(dimetilamino )|oropanamido]butanoato de metila (5)

[090] O dissulfeto previamente sintetizado 4 (750 mg, 1,51 mmol, 1,0 equiv) foi adicionado a um frasco Schlenk de 50 mL seco e fluxado com ar, equipado com uma barra de agitação e um septo e dissolvido em uma mistura de 5 mL de H2O e 15 mL de DMF. Depois, NaHCO;3 (535 mg, 6,37 mmol, 4,2 equiv) e TCEP (435 mg, 1,51 mmol, 1,0 equiv) foram adicionados à mistura de reação. Depois da conclusão da redução por intermédio de massa, o bromoacetato de benzila comer- cialmente disponível (0,6 mL, 3,79 mmol, 2,50 equiv) foi adicionado e agitado por 2 h na temperatura ambiente. A mistura de reação resul- tante depois foi concentrada por intermédio de vácuo e purificada por cromatografia em coluna flash (sílica-gel, 5%º de MeOH em DCM) forneceu 5 como um óleo incolor (510 mg, 42%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 7,53 - 7,15 (m, 5H), 5,18 (s, 2H), 4,56 (dd, 3J = 8,9, 2) = 4,8 Hz, 1H), 3,71 (s, 3H), 3,33 (s, 2H), 2,75 - 2,58 (m, 4H), 2,45 (t, ?J = 7,2 Hz, 2H), 2,29 (s, 6H), 2,17 - 2,05 (m, 1H), 2,02 - 1,90 (m, 1H) pom. RMN de ºC (151 MHz, CDCI3) 5 = 172,58, 172,51, 170,15, 135,60, 128,73, 128,52, 128,37, 67,18, 55,11, 52,47, 51,05, 44,59, 33,52, 32,82, 31,82, 2847 pom. HRMS (ESI*): calculado para CisH2oN2O05S* [M+H]*: 397,1719; encontrado: 397,17908. IR (cm): é = 3285, 2950, 2864, 1736, 1655, 1539, 1455, 1440, 1374, 1271, 1213, 1170, 1146, 1025, 748, 698. o o Les N (28)-4-[[2-(benzilóxi)-2-0x0(1-"2C)etil]sulfanil)-2-[3- (dimetilamino)propanamido]butanoato de metila (5*)

[091] A seguir de TP3, o dissulfeto 4 (370 mg, 0,75 mmol, 1,0 equiv) reage com o bromo(2-"ºC)acetato de benzila previamente sinte- tizado 11 (294 ul, 1,86 mmol, 2,3 equiv) forneceu 5* como um óleo incolor (550 mg, 92%). RMN de !H (400 MHz, metanol-da) 5 = 7,42 - 7,28 (m, 5H), 5,16 (s, 2H), 4,59 - 4,52 (m, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,50 (s, 1H), 3,15 (s, 1H), 2,93 (t, J=7,0 Hz, 2H), 2,75 - 2,60 (m, 2H), 2,56 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2,50 (s, 6H), 2,19 - 2,05 (m, 1H), 2,04 - 1,86 (m, 1H) pom. HRMS (ESI*): calculado para Ci8'ºCHaoN205S* [M+H]': 398,1752; encontrado: 398,18235. 9 o

SAAE

HN N >

(28)-4-[[2-(benzilóxi)-2-oxoetil]lsulfanil)-2-(3-(metil[(1C) metilJamino)propanamido)butanoato de metila (5**)

[092] A seguir de TP3, o dissulfeto 4** (200 mg, 0,40 mmol, 1,0 equiv) forneceu 5** como um óleo incolor (252 mg, 79 %). RMN de 1H (400 MHz, metanol-da): 5 = 7,40 — 7,28 (m, 5H), 5,15 (s, 2H), 4,53 (dd, J = 8,93, 4,90 Hz), 3,69 (s, 3H), 2,73 - 2,56 (m, 4H), 2,44 - 1,87 (m, 10H). RMN de *C (101 MHz, metanol-ds) 5 = 174,49, 173,61, 171,96, 137,34, 129,58, 129,32, 129,25, 67,94, 56,03, 52,80, 52,55, 45,08, 34,17, 33,97, 32,01, 29,51. HRMS (ESI) calculado para C18 CH29N2O05S* [M+H]*: 398,18252; encontrado: 398,18256.

o o nos om |

INN o Procedimento típico 4 (TP4) de ácido (((3S)-3-[3- (dimetilamino)propanamido]-4-metóxi-4-oxobutil)sulfanil)acético (6)

[093] O sulfeto protegido por benzila previamente sintetizado 5 (160 mg, 0,40 mmol, 1,0 equiv) foi adicionado a um frasco Schlenk de mL seco e fluxado com ar, equipado com uma barra de agitação e um septo e dissolvido em 3 a 4 mL de ácido fórmico-metanol a 10%. Depois, aproximadamente 160 mg de catalisador de negro de paládio foram adicionados à mistura de reação e agitados por 2 h a 40ºC. Depois da conclusão da desproteção por intermédio de massa e TLC a mistura de reação foi filtrada, concentrada por intermédio de vácuo e purificada por cromatografia em coluna flash (sílica-gel, 25 % de MeOH em DCM) forneceu 6 como um óleo incolor (100 mg, 81 %). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 4,61 (dd, J = 9,4, 4,2 Hz, 1H), 3,27 (t, J = 6,8 Hz, 1H), 3,21 (t, J = 6,5 Hz, 1H), 3,12 (s, 2H), 2,75 (s, 6H), 2,73 - 2,55 (m, 3H), 2,18 - 2,07 (m, 1H), 2,05 - 1,93 (m, 1H) ppm. LRMS (ESI*): calculado para Ci2H23N205S* [M+H]": 307,1249; encontrado: 307,10. IR (cm-!): é = 3253, 1734, 1652, 1574, 1468,

1372, 1217, 1147, 1084, 977, 761. 9 o o ou) 17” Ácido — (((3S)-3-[3-(dimetilamino)propanamido]-4-metóxi-4- oxobutil)sulfanil)(2-"9C)acético (6*)

[094] A seguir de TP4: 5* (580 mg, 1,46 mmol, 1,0 equiv) forne- ceu 6* como um óleo incolor (280 mg, 62%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 4,62 (dd, J = 4,62 (dd, J=9,4, 4,2, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,35 (s, 2H), 3,30 - 3,24 (m, 2H), 3,17 (da, J=13,0, 6,4, 1H), 2,74 (s, 6H), 2,72 - 2,60 (m, 4H), 2,18 - 1,94 (m, 2H) ppm. RMN de *ºC (101 MHz, metanol-da) 5 = 173,85, 172,39, 170,21, 55,22, 52,79, 49,85, 44,01, 37,30, 31,80, 31,62, 29,24 pom. HRMS (ESI*): calculado para C11º ?*CH23N205S* [M+H]*: 308,1283; encontrado: 308,13564. 9 o tos om | INN,

O Ácido 1I(3S)-4-metóxi-3-(3- (metil[(C)metilJamino)propanamido)-4-oxobutil]sulfanil)acético (6**)

[095] A seguir de TP4: 5** (252 mg, 0,63 mmol, 1,0 equiv) forne- ceu 6** como um óleo incolor (181 mg, 93%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da): 5 4,61 (dd, J = 9,5, 4,2 Hz, 1H), 3,70 (s, 3H), 3,38 - 3,16 (m, 4H), 3,08 (d, J = 3,26 Hz, 2H), 2,94 - 2,59 (s, 10H) pom. HRMS (ESI*) calculado para C11º!CH23N2O05S* [M+H]*: 308,13557; encontrado: 308,13569. | o o ANA om | H Ns o

(2S)-4-[(2-([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-0x0etil)sulfanil]-2- [3-(dimetilamino)propanamido]butanoato de metila (7): Procedimento típico 5 (TP5): O ácido previamente sintetizado 6 (100 mg, 0,33 mmol, 1,0 equiv) foi adicionado a um frasco Schlenk de 50 mL seco e fluxado com ar, equipado com uma barra de agitação e um septo e dissolvido em 10 mL de DMF seco.

Depois, a N',Nº-dimetiletano-1,2-diamina comercialmente disponível (42 ul, 0,39 mmol, 1,2 equiv), DIPEA (83 uL, 0,49 mmol, 1,5 equiv) e PyBOP (203 mg, 0,39 mmol, 1,2 equiv) foram adicionados e a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 1 h.

Depois da conclusão da amidação por intermédio de massa a mistura de reação foi concentrada por intermédio de vácuo e purificada por cromatografia em coluna flash (sílica-gel, 1:12 MeOH/DCM) forneceu 7 como um óleo incolor (90 mg, 73 %). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 4,56 (dd, J = 9,0, 4,8, 1H), 3,72 (s, 3H), 3,38 - 3,32 (m, 2H), 3,19 (d, J=1,3, 2H), 2,74 - 2,57 (m, 4H), 2,47 (dt, J = 11,6, 6,8, 4H), 2,30 (d, J = 4,3, 12H), 2,12 (dddd, JU = 13,2, 8,3, 7,2, 4,9, 1H), 2,03 - 1,92 (m, 1H) pom.

RMN de "ºC (101 MHz, metanol-da) à = 174,36, 173,65, 172,47, 59,04, 55,99, 52,82, 52,64, 45,47, 45,03, 38,22, 35,97, 34,00, 32,11, 29,70 pom.

LRMS (ESI*): calculado para C16H33N404S* [M+H]*: 377,2144; encontrado: 377,19. IR (cm): é = 3375, 2878, 17740, 1597, 1509, 1439, 1226, 1144, 1066, 1022, 903, 843, 744. | o o AO one | Nf o (2S8)-44[2-([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-ox0(1- BC)etillsulfanil)-2-[3-(dimetilamino)propanamido]butanoato de metila (7*): A seguir de TP5, 6* (270 mg, 0,87 mmol, 1,0 equiv) forneceu 7* como um óleo incolor (246 mg, 74%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 4,56 (dd, J = 9,0, 4,8, 1H), 3,72

(s, 3H), 3,36 (d, J = 6,2, 2H), 3,33 (s, 1H), 3,01 (s, 1H), 2,74 - 2,58 (m, 4H), 2,47 (dt, J = 11,4, 7,0, 4H), 2,30 (d, J=4,1, 13H), 2,18 - 1,92 (m, 3H), 1,29 - 1,15 (m, 1H) pom.

LRMS (ESI*): calculado para C15” CH33N4O04S* [M+H]*: 378,2178; encontrado: 378,24. | o o ANA Sove | H Ng, o (28)-4-[(2-([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-ox0etil)sulfanil]-2- (3-(metil[(C)metilJamino)propanamido)butanoato de metila (7**): À seguir de TP5, 6** (181 mg, 0,59 mmol, 1,0 equiv) forneceu 7** como um óleo incolor (173 mg, 78%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da): 5 4,46 (dd, J = 9,0, 4,8 Hz, 1H), 3,62 (s, 3H), 3,25 (t, J = 6,95 Hz, 2H), 3,09 (s, 2H), 2,66 - 2,48 (m, 4H), 2,44 - 1,80 (m, 18H) ppm.

RMN de ҼC (101 MHz, metanol-ds): 5 172,94, 172,29, 171,13, 57,62, 54,56, 51,45, 51,26, 44,04, 43,59, 36,81, 34,57, 34,22, 32,49, 30,69, 28,31 pom.

HRMS (ESI*): calculado para C15"*CH33N404S* [M+H]*: 378,22506; encontrado: 378,22516. | o o AA on | H Ns o Ácido (2S)-4-[(2([2-(dimetilamino)etilJamino)-2- oxoetil)sulfanil]-2-[3-(dimetilamino )|oropanamido]butanoico (8): Procedimento típico 6 (TP6): O composto previamente sintetizado 7 (90 mg, 0,24 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvido em uma mistura de 2 mL de H2O e 5 mL de MeOH.

Depois LiOH (17 mg, 0,71 mmol, 3,0 equiv) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 1 h.

Depois da conclusão da saponificação, o produto foi dessalinizado e forneceu 8 como um sólido branco (86,6 mg, 100%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 4,55 (dd, J = 9,3, 4,5, 1H), 3,64

(t, J = 5,9, 2H), 3,46 (t, JU = 6,7, 2H), 3,35 (t, J = 6,0, 2H), 2,95 (d, J = 13,2, 13H), 2,90 - 2,83 (m, 2H), 2,81 - 2,64 (m, 2H), 2,22 - 2,11 (m, 1H), 2,09 - 1,97 (m, 1H) pom. RMN de ºC (101 MHz, metanol-da) à = 174,78, 173,70, 171,90, 58,04, 54,90, 52,72, 43,88, 43,72, 43,63, 36,19, 36,00, 32,07, 30,75, 30,10 pom. HRMS (ESI): calculado para C15H29N4Oa4SM-HT: 361,1910; encontrado: 361,19188. IR (cm): é = 3368, 2916, 1743, 1632, 1524, 1439, 1311, 1227, 1160, 1059, 984,

845. | o o ANA So |

H MN o Ácido (28)-4-([2-([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-0x0(1- 1PBC)etillsulfanil)-2-[3-(dimetilamino)propanamido]butanoico — (8º) A seguir de TP6: 7* (220 mg, 0,58 mmol, 1,0 equiv) forneceu 8* como um sólido branco (210 mg, 99%). RMN de *H (400 MHz, metanol-da) 5 = 4,33 (dd, J = 7,8, 4,6, 1H), 3,39 - 3,32 (m, 3H), 3,02 (s, 1H), 2,67 - 2,56 (m, 4H), 2,45 (dt, JU = 14,7, 7,1, 4H), 2,27 (d, J = 3,2, 13H), 2,18 - 1,87 (m, 2H) pom. RMN de "ºC (101 MHz, metanol-da) 5 = 176,77, 172,29, 172,26, 57,64, 54,84, 54,15, 44,12, 43,73, 36,99, 36,91, 33,25, 32,65, 28,61 pom. HRMS (ESI): calculado para Ci CHooN4O0sSM-HI: 362,2021; encontrado: 362,19517. | o o ANA Son | H IN, o Ácido (2S)-4-[(2([2-(dimetilamino)etilJamino)-2- oxoetil)sulfanil]-2-(3-(metil[(*C)metilJamino)propanamido)butanoico (8**) A seguir de TP6: 7** (173 mg, 0,46 mmol, 1,0 equiv) forneceu 8** como um sólido branco (105 mg, 62%).

RMN de *H (400 MHz, metanol-da): 5 4,33 (dd, J = 7,8, 4,6 Hz, 1H), 3,35 (t, J = 6,41 Hz, 2H), 3,19 (s, 2H), 2,67 - 2,56 (m, 4H), 2,50 - 1,88 (m, 18H). HRMS (ESI”): calculado para C14” *CH31N404S* [M+H]*: 364,20941; encontrado: 364,20962. | o o o AA von |

HN N To Ácido (28)-4-(2[2-(dimetilamino)etilJamino)-2- oxoetanossulfinil)-2-[3-(dimetilamino)propanamido]-butanoico (9) Pro- cedimento típico 7 (TP7): 8 (50 mg, 0,14 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvido em 2 mL de H2O dest.. Depois que o valor de pH foi ajustado para pH = 2, MCPBA (30,8 mg, 0,14 mmol, 1,0 equiv) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada na temperatura ambiente por 20 min. Depois da conclusão da oxidação por intermédio de massa a mistura de reação resultante foi extraída com DCM (4x 10 mL) e concentrada por intermédio de vácuo forneceu 9 como um sólido branco (40 mg, 75%). RMN de *H (400 MHz, D2O) 5 = 4,46 (td, J = 8,1, 5,1, 1H), 3,90 (d, J = 14,1, 1H), 3,72 (d, J = 14,1, 1H), 3,64 - 3,51 (m, 2H), 3,34 (td, J = 6,7, 1,8, 2H), 3,25 (t, J = 6,0, 2H), 3,06 - 2,85 (m, 2H), 2,82 (d, J = 9,5, 13H), 2,76 (t, J = 6,8, 2H), 2,34 - 2,19 (m, 1H), 2,17 - 2,04 (m, 1H) ppm. RMN de *ºC (101 MHz, D2O0) ô = 174,42, 171,66, 166,86, 56,23, 55,98, 55,88, 53,32, 47,34, 47,19, 42,96, 42,81, 34,87, 29,50, 23,97 ppm. HRMS (ESI*): calculado para C1isH31N4O05S* [M+H]*: 379,1937; encontrado: 379,19624. | o o o Avi ron |

H ASAS o Ácido (2S8)-4-[2([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-ox0(1- 1BC)etanossulfinil]-2-[3-(dimetilamino)propanamido]-butanoico (9*) A seguir de TP7: 8* (145 mg, 0,39 mmol, 1,0 equiv) forneceu 9* como um sólido branco (150 mg, 99%). RMN de *H (400 MHz, D2O0) 5 = 4,46 (ddt, J = 15,6, 10,1, 5,0, 1H), 4,10 - 3,50 (m, 4H), 3,35 (dt, J = 8,0, 4,0, 2H), 3,24 (t, J = 6,2, 2H), 3,07 - 2,95 (m, 2H), 2,82 (d, J = 9,4, 13H), 2,75 (q, J = 6,7, 3H), 2,60 (s, 1H), 2,29 (dp, J = 13,5, 7,4, 1H), 2,19 - 2,00 (m, 1H) pom.

HRMS (ESI*): calculado para C14” CH3iN4OsS* [M+H]*: 380,20432 encontrado: 380,20452. | o o ANA on | H Ned, o Ácido (28)-4-(2[2-(dimetilamino)etilJamino)-2- oxoetanossulfinil)-2-(3-(metil[(*C)metilJamino)propanamido)butanoico (9**) A seguir de TP7: 8** (105 mg, 0,29 mmol, 1,0 equiv) forneceu 9** como um sólido branco (75 mg, 69%). RMN de *H (400 MHz, D2O) à = 4,52 (dd, J = 8,7, 5,1 Hz, 1H), 3,71 - 3,29 (m, 8H), 3,10 - 2,62 (m, 16H), 2,50 - 2,17 (m, 2H) pom.

HRMS (ESI*): calculado para C1u”ºCH3aiN.OsS* [M+H]": 380,20432; encontrado: 380,20424. O, Ao " yo o (2S)-4-[(2-([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-0x0etil)sulfanil]-2- [3-(dimetilamino)propanamido]butanoato de 2,5-dioxopirrolidin-1-ila (2): Procedimento típico 8 (TP8): O sulfóxido previamente sintetizado 9 (80 mg, 0,22 mmol, 1,0 equiv) foi dissolvido em 5 mL de DMF.

Depois, piridina seca (34 ul, 0,42 mmol, 2,0 equiv) e NHS-TFA (89 mg, 0,42 mmol, 2,0 equiv) foram adicionados à mistura de reação.

Depois da conclusão da ativação de éster por intermédio de massa a mistura de reação resultante foi concentrada por intermédio de vácuo. O óleo laranja resultante foi dissolvido em acetonitrila e precipitado por intermédio de acetona forneceu 2 como um sólido branco (35 mg, 35%). HRMS (ESI*): calculado para C18”ºCH3aNsO7S* [M+H]*: 476,2101; encontrado: 476,21727. O, Ao “" > N (2S8)-44[2-([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-o0x0(1- BC)etil]lsulfanil)-2-[3-(dimetilamino)propanamido]butanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (2*) A seguir de TP8: 9* (50 mg, 0,13 mmol, 1,0 equiv) forneceu 2* como um sólido branco (20 mg, 32%). HRMS (ESI*): calculado para C18”ºCH3aNsO7S* [M+H]*: 477,2134; encontrado: 477,22124. O, | a ? Ao " JO: o (2S)-4-[(2-([2-(dimetilamino)etilJamino)-2-0x0etil)sulfanil]-2- (3-(metil[(C)metilJamino)propanamido)butanoato de 2,5- dioxopirrolidin-1-ila (2**) A seguir de TP8: 9** (75 mg, 0,20 mmol, 1,0 equiv) forneceu 2** como um sólido branco (30 mg, 31%). HRMS (ESI*): calculado para C18”ºCH3aNsO7S* [M+H]*: 477,2134; encontrado: 477,22064. Lista de Referências 11] S. Goodwin, J. D. McPherson, W. R. McCombie, Nat. Rev. Genet. 2016, 17, 333-351.

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Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Reagente para o uso em espectrometria de massa, caracterizado pelo fato de que é um composto da fórmula geral (1): Z!-LI-(CRIR2)-S(0)-CR3H-CH2-C(-L2-22)Rº(-L*-X) em que Z' é unidade de carga capaz de portar pelo menos uma porção carregada L'? é uma ligação ou um espaçador, Z? é unidade de carga capaz de portar pelo menos uma porção carregada, L? é uma ligação ou um espaçador, R', R?, Rà, Rº são independentemente hidrogênio ou alquila C1-C3, X é um grupo reativo capaz de reagir com uma molécula de analito, por meio do qual uma ligação covalente com a molécula de analito é formada, L* é uma ligação ou espaçador.

2. Reagente, de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zado pelo fato de que as unidades de carga 2º e Z? compreendem cada pelo menos uma porção positivamente carregada tal como um grupo amônio primário, secundário, terciário ou quaternário ou um grupo fosfônio, particularmente tendo um pKa de 10 ou mais alto, mais particularmente tendo um pKa de 12 ou mais alto.

3. Reagente, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo fato de que as unidades de carga Z* e Z? compreendem cada pelo menos uma porção negativamente carregada tal como um grupo fosfato, sulfato, sulfonato ou carboxilato, particularmente tendo um pKr de 10 ou mais alto, mais particularmente tendo um pKr de 12 ou mais alto.

4. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que as unidades de carga Z' e Zº têm a mesma carga.

5. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as unidades de carga 2º e 7? são permanentemente carregadas.

6. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo X é (i) um grupo reativo em carbonila que é capaz de reagir com um grupo carbonila, por exemplo, um grupo aldeído ou ceto, ou um grupo carbonila mascarado, por exemplo, um grupo hemiacetal, em uma molécula de analito, em que o grupo reativo em carbonila X pode ser selecionado de um átomo de N super-nucleofílico reforçado por um efeito a causado por um átomo de O e/ou N adjacente tal como um NH>2-N/O, ou um grupo ditiol, ou (ii) um grupo reativo em tiol, tal como um alceno ou alcino, que é capaz de reagir com um grupo tiol, por exemplo, um grupo Cys em uma molécula de analito, ou (ili) um grupo reativo em amina que é capaz de reagir com uma amina, por exemplo, um grupo amino de uma molécula de analito.

7. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 6, caracterizado pelo fato de que X pode ser particularmente selecionado de (i) um grupo hidrazina, por exemplo, um grupo H2N-NH-, ou H2oN-NR*-, em que R' é arila ou alquila C1-4, particularmente alquila C1 ou C2, opcionalmente substituído, (ii) um grupo hidrazona, por exemplo, um grupo H2N-NH- C(O)-, ou HaN-NR2-C(O)-, em que R? é arila ou alquila C1-4, particularmente alquila C1 ou C2, opcionalmente substituído,

(ili) um grupo hidroxilamino, por exemplo, um grupo H2N-O-, (iv) um grupo ditiol, particularmente um grupo 1,2-ditiol ou 1,3-ditiol, (v) um grupo alceno eletrofílico, por exemplo, RIR2C=CR?- C(O)-NH- em que R', R? e Rº são independentemente H, halogênio ou alquila C1-4, preferivelmente H, (vi) um grupo éster ativo tal como N-hidróxi succinimida (NHS) ou sulfo-NHS, um hidroxibenzotriazol (HOBt), um grupo 1- hidróxi-7-azabenzotriazol (HOAt) ou imidoéster -CH2-C(=NH2*)-O-CH;3.

8. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é da fórmula geral (la): Z!-LI-(CRIR2)-S(0)-CR?H-CH2-C(-L2-2Z2)R*(-L*X) em que Z* compreende pelo menos uma porção positivamente car- regada tal como um grupo amônio primário, secundário, terciário ou quaternário, L' é um espaçador, em particular -C(O)-NH-(CH2)J- com n sendo um número inteiro de 1 a 10, em que n é preferivelmente m, Z?éiguala Z', L? é um espaçador, em particular -NH-C(O)-(CH2)m- com m sendo um número inteiro de 2 a 10, R', R2?, Rô, Ri são hidrogênio, X' um grupo reativo em amina que é capaz de reagir com uma amina, por exemplo, um grupo amino de uma molécula de analito tal como um peptídeo, L* é uma ligação ou espaçador.

9. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é da fórmula geral (Ib):

.. 1 eo ox AN, À ão o H HN Y Te N. o

10. Reagente, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é um isotopólogo, particular- mente um isotopólogo compreendendo pelo menos um isótopo sele- cionado de D, *ºC, **N e/ou *ºO, em particular *ºC ou **N.

11. Composição ou kit, caracterizados pelo fato de que compreendem pelo menos dois reagentes de isotopólogos como defi- nidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10 que são isobáricos.

12. Uso de um reagente como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou de uma composição ou kit como definida na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para a determina- ção espectrométrica de massa de uma molécula de analito, em que a determinação espectrométrica de massa particularmente compreende uma determinação espectrométrica de massa em tandem, mais parti- cularmente em um dispositivo triplo quádruplo.

13. Aduto covalente, caracterizado pelo fato de ser formado por reação do composto da fórmula geral (1) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e uma molécula de analito.

14. Aduto, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que é um composto da fórmula geral (Il): ZI-LI-(CRIR2)-S(0)-CR?H-CH2-C(-L2-22)R+-(LX')-T em que T é uma molécula de analito, X' é uma porção resultante da reação de um grupo X no composto (1) com uma molécula de analito T, Z', LI, 22, L2, L, R1, R2, R$ e Rº são como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 10,

em que o aduto pode portar uma carga positiva ou negativa permanente.

15. Aduto, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, carac- terizado pelo fato de que a molécula de analito T é um peptídeo contendo grupo amino.

16. Uso de um aduto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de ser para a determi- nação espectrométrica de massa de uma molécula de analito, em que a determinação espectrométrica de massa particularmente compre- ende uma determinação espectrométrica de massa em tandem, mais particularmente em um dispositivo triplo quádruplo.

17. Método para a determinação espectrométrica de massa quantitativa de uma molécula de analito, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas: (a) fornecer pelo menos duas amostras de analito a serem comparadas, (b) reagir covalentemente a molécula de analito em cada amostra fornecida com um reagente da fórmula geral (1) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, por meio do qual para cada amostra um reagente de isotopólogo diferente da fórmula geral (1) é usado e por meio do qual os reagentes de isotopólogos usados para amostras diferentes são isobáricos entre si, e por meio do qual um aduto da molécula de analito e do reagente em cada amostra é formado, (c) combinar pelo menos duas amostras compreendendo o aduto da molécula de analito e dos reagentes isobáricos, (d) submeter os adutos combinados da etapa (c) a uma análise espectrométrica de massa, em que a etapa de análise espectrométrica de massa (d) preferivelmente compreende:

(i) submeter íons dos adutos isobáricos combinados a um primeiro estágio de análise espectrométrica de massa,

por meio do qual os íons dos adutos combinados são caracterizados de acordo com sua razão de massa/carga (m/z),

(ii) causar a fragmentação dos íons de aduto combinados,

por meio do qual um íon repórter e um (íon complementar tendo a mesma carga são produzidos a partir de cada íon de aduto e por meio do qual íons repórteres não isobáricos e íons complementares não isobáricos são fornecidos para cada amostra de analito originalmente fornecida a ser comparada,

(iii) submeter os íons repórteres não isobáricos e íons com- plementares não isobáricos da etapa (ii) a um segundo estágio de aná- lise espectrométrica de massa,

(iii) quantificação relativa dos íons repórteres da etapa (ii), e

(iv) quantificação relativa dos íons complementares da eta- pa (ii).

Amostra 1 A O nNis Das Isolamento & Rotul Combinar enrenecess digasiáo de Peter química —=— AS proteina GW — SML ——— Ness Peptídeos isobaricamente Amostra 2 rotulados 8 MS total 8 Ms Ei 3 ; S 3 deconvolucionada ]) > à > r— MS/MS ' if Par ' A o

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