JP2009503485A - 質量標識体 - Google Patents

質量標識体 Download PDF

Info

Publication number
JP2009503485A
JP2009503485A JP2008523449A JP2008523449A JP2009503485A JP 2009503485 A JP2009503485 A JP 2009503485A JP 2008523449 A JP2008523449 A JP 2008523449A JP 2008523449 A JP2008523449 A JP 2008523449A JP 2009503485 A JP2009503485 A JP 2009503485A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
mass
label
group
reactive
substituted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2008523449A
Other languages
English (en)
Other versions
JP5054690B2 (ja
Inventor
クリスチャン・ハモン
ヨゼフ・シュヴァルツ
ヴォルフガング・ベッカー
シュテファン・キーンレ
カルステン・クーン
ユルゲン・シェーファー
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Electrophoretics Ltd
Original Assignee
Electrophoretics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Electrophoretics Ltd filed Critical Electrophoretics Ltd
Publication of JP2009503485A publication Critical patent/JP2009503485A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5054690B2 publication Critical patent/JP5054690B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/404—2,5-Pyrrolidine-diones with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. succinimide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings
    • C07D401/12—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry

Abstract


【課題】質量分析において生物分子を標識し検出するための質量標識体を提供する。
【解決手段】該質量標識体は、以下の構造
Ｘ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基

（式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚは独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる。
【選択図】なし

Description

本発明は、所望の分子、特にペプチドやタンパク質等の生体分子の標識に有用な化合物に関する。より詳細には、本発明は、質量分析法による検出のための検体の標識及び質量標識した検体を質量分析法により分析する関連方法に関する。本発明により、生体分子の相対定量が特に容易となる。
放射性原子、蛍光色素、発光試薬、電子捕獲試薬及び光吸収色素等を用いた、所望の分子を標識する様々な方法が当該技術分野において知られている。これらの標識系は、それぞれ、特定の用途には適しているが、他の用途には適さないという特徴を有する。安全性の点から、非放射性標識系への関心が高まり、特に遺伝分析のための蛍光標識法が商業的に広く開発されている。蛍光標識法によれば、比較的少数の分子の同時標識が可能で、通常４、最大で８の標識体を同時に使用できる。しかし、検出装置が高価であり、生じたシグナルの分析が困難であるため、蛍光検出法で同時に使用できる標識体数は制限される。
ごく最近、所望の分子に開裂可能に結合した標識体の検出方法が、質量分析法の分野において開発されている。分子生物学への応用において、多くの場合、所望の分子を分析前に分離することが必要であり、その分離する方法として一般的に液相分離法が用いられる。最近の質量分析法では、液相分離用インターフェースが多数開発されており、これにより質量分析法がこのような応用において検出方法として特に効果的なものとなっている。最近まで、液体クロマトグラフィー質量分析法が検体イオン又はフラグメントイオンを直接的に検出するために用いられていたが、核酸分析等多くの場合では、間接標識によって検体構造を決定することができる。これは、特に質量分析法の使用に対して有利である。その理由は、ＤＮＡのような複雑な生物分子は複雑な質量スペクトルを持つので、検出感度が比較的低くなるからである。間接検出とは、もとの検体の同定に標識体分子を用いることができることを意味し、その場合には、検出感度が高く及び質量スペクトルが単純になるようにその標識体を作製する。質量スペクトルが単純であることは、複数の検体の同時分析に複数の標識体を用いることができることを意味する。
特許文献１に記載されている核酸プローブアレイは、開裂可能な標識体に共有結合し、その標識体は質量分析法で検出可能であり、共有結合した核酸プローブ配列を同定する。この出願の標識したプローブは、Ｎｕ−Ｌ−Ｍ構造を有し、式中、ＮｕはＬに共有結合した核酸、Ｌは質量標識体Ｍに共有結合した開裂可能リンカーである。この出願において好ましい開裂可能リンカーは、質量分析計のイオン源内で開裂する。質量標識体は、置換ポリアリールエーテルであることが好ましい。この出願において、質量分析法により質量標識体を分析する具体的な方法として、様々なイオン化法と四重極質量分析計、ＴＯＦ分析計及び磁場型装置による分析が開示されている。
特許文献２において、リガンドが開示されており、具体的には質量タグ分子に開裂可能に結合した核酸が開示されている。開裂可能リンカーは光開裂可能であることが好ましい。この出願では、質量分析法による質量標識体を分析する具体的な方法として、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）―ＴＯＦ（飛行時間）質量分析法が開示されている。
特許文献３において、放出可能な非揮発性の質量標識体分子が開示されている。好ましい実施形態では、質量標識体は高分子からなり、この高分子は通常、反応性基又はリガンド、即ちプローブに開裂可能に結合した生体高分子である。開裂可能リンカーは、化学的又は酵素的に開裂可能であることが好ましいと考えられる。質量分析法による質量標識体を分析する具体的な方法として、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ質量分析法が開示されている。
特許文献４、特許文献５及び特許文献６において、リガンドが開示されており、具体的には質量タグ分子に開裂可能に結合した核酸が具体的に開示されている。開裂可能リンカーは化学的又は光開裂可能であることが好ましいと考えられる。これらの出願において、質量分析法により質量標識体を分析する具体的な方法として、様々なイオン化法と四重極質量分析計、ＴＯＦ分析計及び磁場型装置による分析が開示されている。
これらの先行技術の出願において、タンデム型又は直列型質量分析を用いて質量標識体を分析することについては触れられていない。
非特許文献１において、同位体コード化アフィニティータグを用いてタンパク質からペプチドを捕獲し、タンパク質の発現分析を可能とすることが開示されている。この論文において、チオール反応性のビオチンリンカーを、システインを有するペプチドを捕獲するために用いることが記載されている。一の材料から得られたタンパク質の試料をビオチンリンカーと反応させ、エンドペプチダーゼにより開裂する。ビオチン化システイン含有ペプチドをアビジンビーズで単離することにより、後続する質量分析法による分析が可能となる。１番目の試料をビオチンリンカーで標識し、２番目の試料を重水素化したビオチンリンカーで標識することで、これらの２つの試料を量的に比較することができる。そして、それらの試料における各ペプチドは、質量スペクトルにおいて一対のピークと現れる。質量スペクトルの各タグに対応するピークを積分することにより、タグに結合したペプチドの相対発現量を得ることができる。
アプライドバイオシステムズ社は、いわゆるｉＴＲＡＱ試薬を市販しており、これはアミン変性する標識試薬であり、タンパク質の多重定量化に用いられる。一般的に、複数の同重体試薬が多くの試料を標識するために提供されている。例えば、４の同重体試薬からなるセットにより４の試料を多重化する。しかし、試薬の効能をさらに向上させることが望ましい。通常、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法においてこれらの試薬が用いられる。
特許文献７において、２以上の質量標識体からなるセットが開示されている。セットの各標識体はフラグメンテーション耐性の質量マーカー部分からなり、質量マーカー部分は質量正規化部分に開裂可能リンカーを介して結合する。セット中の各標識体の総質量は同じでも異なっていてもよく、また、セットの各標識体の質量マーカー部分の質量も同じでも異なっていてもよい。共通の質量の質量マーカー部分を有するセット中のいずれの標識体のグループにおいては、各標識体の総質量はそのグループにおける他の全ての標識体とは異なる。また、共通の総質量を有するセット中の任意の標識体のグループにおいては、各標識体はそのグループにおける他の全ての質量マーカー部分とは異なる質量を有する質量マーカー部分を有する。これにより、セットの全ての質量標識体は、質量分析法により互いに識別可能である。この出願において、上述のように定義した質量標識体の２以上のセットからなる質量標識体アレイも開示されている。いずれかのセットにおける各質量標識体の総質量は、アレイの他の全てのセットの各質量標識体の総質量と異なる。この出願において、検体固有の１の質量標識体又は２以上の質量標識体を質量分析法により同定し、検体を検出することからなる分析方法も更に開示されている。異なる具体的な質量標識体が非常に多くこの出願において開示されている。質量標識体はＭ−Ｌ−Ｘ構造を有することが好ましく、式中、Ｍは質量正規化基、Ｌは開裂可能リンカー、Ｘは質量マーカー部分である。Ｍ及びＸの性質は特に限定されるものではないが、質量正規化基は、必要に応じて１以上のＦ原子により置換されたベンジル基であることが好ましい。リンカーはアミド結合であることが好ましい。質量マーカー部分は、１以上のＦ原子により任意に置換されたピリジル基であることが好ましい。
特許文献８において、２以上の質量標識体からなるセットが開示されている。セットの各標識体は少なくとも１のアミド結合を介して質量正規化部分に結合する質量マーカー部分からなる。質量マーカー部分はアミノ酸からなり、質量正規化部分もアミノ酸からなる。特許文献７では、セットにおける各標識体の総質量は同じでも異なっていてもよく、セットにおける各標識体の質量マーカー部分の質量も同じでも異なっていてもよい。これにより、セットの全ての質量標識体が質量分析法により互いに識別可能となる。また、特許文献７と同様に、この出願においても質量標識体アレイ及び分析方法が開示されている。この出願は、特に、ペプチド分析と少なくとも１のアミノ酸からなる質量正規化部分と質量マーカー部分を有する質量標識体に関する。
国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９８／００１２７明細書 国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９４／０１６７５明細書 国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／２２６３９明細書 国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０７０明細書 国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１０４６明細書 国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９７／０１３０４明細書 国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０１／０１１２２明細書 国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ０２／０４２４０明細書 ギギ（Ｇｙｇｉ）ら． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：９９４−９９９、「同位体コードアフィニティータグを用いた複合タンパク混合物の定量分析」１９９９
特許文献７及び特許文献８に開示された質量標識体と分析方法は大体にして成功をおさめたが、今もなお、質量標識体及び質量標識体を質量分析法により同定することにより検体を検出する方法を改良し、提供する必要がある。特に、これらの新しい質量標識体と分析方法により、質量スペクトルを著しく複雑にすることなく、複数の試料を同時にかつ量的に分析することができるが、今もなお、質量分析計により容易に同定し、高感度で定量化できるように質量標識体を改良し、提供する必要がある。そして、同定する検体と容易に反応して、質量分析計による分析前に過剰な質量標識体を容易に取り除ける質量標識体を提供することが望ましい。
そこで、本発明の目的は、当該技術分野における従来技術の諸問題を解決し、以下の目的を達成することを課題とする。即ち、本発明の目的は、質量スペクトルにおいて明確に同定でき、より正確な定量ができるように改良した質量標識体を提供することにある。更に、本発明の目的は、容易に検体と反応でき、質量分析計による分析前に同定する検体に結合した質量標識体から容易に分離できるように改良した質量標識体を提供することにある。
更に、本発明の目的は、本発明の標識体を活用し生物分子を分析する改良方法を提供し、このような方法、特にペプチド分析の感度を最大化することにある。
本発明の第１の態様は、質量分析において生物分子を標識し検出するための質量標識体であって、以下の構造
Ｘ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
（式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚは独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなることを特徴とする質量標識体を提供することにある。
本明細書中における質量標識体とは、検体を標識して決定するのに適した部分を意味するための用語である。標識体とは、タグの同意語である。
本明細書中における質量マーカー部分とは、質量分析法により検出する部分を意味するための用語である。
本明細書中における質量正規化部分とは、質量分析法により必ずしも検出されず、質量標識体が所望の総質量を有していることを確実にするために存在する部分を意味するための用語である。質量正規化部分は構造的に特に制限されず、単に質量標識体の全体質量を変動させるためのものである。
上記一般式において、ＺがＣ（Ｒ１）２である場合、炭素原子上の各Ｒ１は同じでも異なっていてもよい（即ち、Ｒ１は独立している）。したがって、Ｃ（Ｒ１）２基として、ＣＨ（Ｒ１）基等の基があり、一方のＲ１はＨであり、他方のＲ１は上述のように定義されたＲ１から選択された他の基である。
上記一般式において、Ｘと非環状Ｚ間の結合は、この位置で選択されたＸ及びＺ基によっては、単結合でも二重結合でもよい。例えば、ＸがＮ又はＣ（Ｒ１）である場合、Ｘから非環状Ｚへの結合は単結合でなくてはならない。ＸがＣである場合、Ｘから非環状Ｚへの結合は、選択された非環状Ｚ基及び環状Ｚ基によっては、単結合でも二重結合でもよい。非環状Ｚ基がＮ又はＣ（Ｒ１）である場合、非環状ＺからＸへの結合は単結合であり、更にｙが０であった場合、選択されたＸ基及び非環状Ｚが結合する基によっては、二重結合でもよい。非環状ＺがＮ（Ｒ１）、ＣＯ（Ｒ１）、ＣＯ、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳである場合、Ｘへの結合は単結合でなくてはならない。当業者は、上記式における正しい原子価（単結合又は二重結合によるリンク）を有する適したＸ，Ｚ及び（ＣＲ１ ２）ｙ基を容易に選択することができる。
本発明は、質量分析において生物分子を標識し検出するための上述のように定義された質量標識体であって、以下の構造
Ｘ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
（式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚ１及びＺ２は独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；少なくともＺ１及びＸのいずれかはＮであり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる質量標識体も提供する。
本発明は、質量分析において生物分子を標識し検出するための上述のように定義された質量標識体であって、以下の構造
Ｘ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
（式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚ１は独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；Ｚ２はＮ、Ｎ（Ｒ２）、Ｃ（Ｒ１）（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；Ｒ２は置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり、及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる質量標識体も提供する。
本発明は、質量分析において生物分子を標識し検出するための上述のように定義された質量標識体であって、以下の構造
Ｘ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
（式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚ１は独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；Ｚ２はＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、Ｃ（Ｈ）Ｒ３、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；Ｒ２は置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；Ｒ３はＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、又は置換又は未置換複素環基であり；ｙは０−１０の整数であり；及びＬはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる質量標識体も提供する。
本発明は、質量分析において生物分子を標識し検出するための上述のように定義された質量標識体であって、以下の構造
Ｘ−Ｌ−Ｍ
（式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
（式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚは独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなり、ｙが３又は４であり、Ｌのアミド結合が（ＣＲ１ ２）ｙに隣接する場合、（ＣＲ１ ２）ｙの少なくとも１のＲ１は、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基から選択される質量標識体も提供する。
好ましい実施形態において、１以上の上記式で定義された本発明の質量標識体は、１以上の以下の式又は化合物を含有しない。

（式中、ＣＨＲＣＯ２Ｈ基は、自然界に存在するアミノ酸である）；
（式中、ＲはＣ１−Ｃ４アルキル基、Ｃ２−Ｃ３アルケニル基、最大で６のＣ原子を有する遊離シクロアルキル基、又は１以上のハロゲン又は１以上の下級アルキル基により任意に置換されたフェニル基又はナフチル基を表す）；

（式中、ＲはＨ又は下級アルキル基であり、Ａはアシルオキシ、ハロゲン、ヒドロキシル、水素を取り除かれた窒素が水銀元素又は−Ｓ−Ｒ’基（Ｒ’はモノカルボキシ置換低級アルキル基）に直接結合するように水素が置換された酸性窒素化合物残基、ポリカルボキシ置換低級アルキル基、モノカルボキシ置換芳香族基、ポリカルボキシ置換芳香族基、低級一価アルコール基及び低級多価アルコール基及びそれらの塩、並びにその製造に有用な中間化合物）；
（式中、Ｒはハロゲン、Ｃ１−Ｃ４アルキル、シアノ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、トリフルオロメチル又はトリフルオロメトキシを表し、Ｒ１はピペリジル、１、２、３、６−テトラヒドロ−４−ピリジニル、ピリジル又はピロリジニルを表し、Ｒ２はＣ１−Ｃ４アルキルの水素を表し、Ｒ３及びＲ４は独立して水素、Ｃ１−Ｃ４アルキルを表し、又はＲ３はＲ４と共にＣ３−Ｃ７シクロアルキルを表し、Ｒ５はトリフルオロメチル、Ｓ（Ｏ）ｑＣ１−Ｃ４アルキル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロゲン又はシアノを表し、Ｌは単結合又は二重結合であり、ｎは１から３までの整数であり、ｍは０又は１から３までの整数であり、ｑは０又は１から２の整数である）；
Ｎ−（３，５−ビス−トリフルオロメチル−ベンジル）−３−（４−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メチル−３−ピペリジン−４−イル−プロピオンアミド、
Ｎ−（３，５−ジクロロ−ベンジル）−３−（４−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メチル−３−ピペリジン−４−イル−プロピオンアミド、
Ｎ−［１−（３，５−ジクロロ−フェニル）−エチル］−３−（４−フルオロ−フェニル）−Ｎ―メチル−３−ピペリジン−４−イル−プロピオンアミド、
Ｎ−［１−（３，５−ジクロロ−フェニル）−エチル］−３−（４−フルオロ−フェニル）−Ｎ−メチル−３−［１−（２−メトキシエチル）−ピペリジン−４−イル］−プロピオンアミド、
Ｎ−（３，５−ジクロロ−ベンジル）−３−（４−フルオロ−フェニル）−３−（４−フルオロ−ピペリジン−４−イル）−Ｎ−メチル−プロピオンアミド、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−｛１−［２−（メチルオキシ）エチル］−４−ピペリジニル｝プロピオンアミド−Ｎ−｛−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］−１−メチルエチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛［３−ブロモ−４−（メチルオキシ）フェニル］メチル）−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−［（３，５−ジメチルフェニル）メチル］−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−［（３，４−ジブロモフェニル）メチル］−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−［（３−フルオロ−２−メチルフェニル）メチル］−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛［２−クロロ−３−（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ−［（３，５−ジブロモフェニル）メチル］−３−（４−フルオロフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ｛−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（２，４−ジクロロフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ−｛−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ−［（３，５−ジブロモフェニル）メチル］−３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ−［（３，５−ジブロモフェニル）メチル］−３−（３，４−ジクロロフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
３−（４−クロロフェニル）−Ｎ−［（３，５−ジブロモフェニル）メチル］−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（３−ピペリジニリデン）プロピオンアミド、
Ｎ−［（３，５−ジブロモフェニル）メチル］−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニリデン）プロピオンアミド、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル）−３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）−Ｎ−メチル−３−（１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛（１Ｒ）−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロ−２−メチルフェニル）−Ｎ−メチル−３−（１，２，３，６−テトラヒドロ−４−ピリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（３−ピロリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル）−３−（４−フルオロフェニル）−３−（３−フルオロ−３−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド、
Ｎ−｛−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（２−モルフォリニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル）−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（３−ピペリジニル）プロピオンアミド、
Ｎ−｛（３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル）−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピリジニル）プロピオンアミド、及びその鏡像異性体、ジアステレオ異性体、薬剤として許容される塩（例えば、塩酸塩）及び溶媒化合物；及び
Ｎ｛（１Ｒ）−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド（ジアステレオ異性体１）、
Ｎ−｛（１Ｓ）−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−Ｎ−メチル−３−（４−ピペリジニル）プロピオンアミド（ジアステレオ異性体２）、
Ｎ｛（１Ｒ）−１−［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］エチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド（ジアステレオ異性体１）、
Ｎ−［（３，５−ジブロモフェニル）メチル］−３−（４−フルオロフェニル）−３−（４−フルオロ−４−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド（鏡像異性体２）、
Ｎ−｛［３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル］メチル｝−３−（４−フルオロフェニル）−３−（３−フルオロ−３−ピペリジニル）−Ｎ−メチルプロピオンアミド（ジアステレオ異性体Ａ）、
及び薬剤として許容される塩（例えば、塩酸塩）及びその溶媒化合物；
（式中、Ａは低級アルキレン基を表し、Ｒ１は置換又は未置換のシクロアルキル―低級アルキル基、シクロアルキル基、テトラヒドロピラニル−低級アルキル基、低級アルキレンジオキシ−置換低級アルキル基、置換フェニル−低級アルキル基又は低級アルキル置換ピペリジニル−低級アルキル基を表し、Ｒ２は置換又は未置換５−又は６−員の飽和又は不飽和複素環−低級アルキル基、テトラヒドロピラニルチオ−低級アルキル基、ピリジルチオ−低級アルキル基、低級アルキレン−ジオキシ―置換低級アルキル基又は置換又は未置換低級アルキル基を表し、カルボスチリル骨格の３位と４位の間における炭素間結合は、単結合又は二重結合を表す）；
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（２，４−ジメトキシ−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（２−エトキシ−４−メチル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（２−エトキシ−４−エチル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（４−エチル−２−メトキシ−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（４−イソプロピル−２−メトキシ−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（２−エトキシ−４−イソプロピル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−カルボン酸（４−｛４−［２，５−ジメチル−４−（ピリジン−２−イルメトキシル）−フェニル］−ピペリジン−１−イル｝−ブチル）−アミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−［４−（４−ベンゾ［１，３］ジオキソール−５−イル−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−［４−（４−ナフタレン−２−イル−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（５，６，７，８−テトラヒドロ−ナフタレン−２−イル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（４−ナフタレン−１−イル−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４−（４−クロロ−ベンゾイルアミノ）−Ｎ−｛４−［４−（２−トリフルオロエトキシ−４−メチル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−ベンズアミド、
４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−カルボン酸｛４−［４−（２−メチルスルファニル−フェニル）−ピペリジン−１−イル］−ブチル｝−アミド、
４’−トリフルオロメチル−ビフェニル−４−カルボン酸｛４−［４−（１−メチル−１Ｈ−インドール―３−イル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
４’−トリフルオロメチル―ビフェニル―４―カルボン酸｛４―［４−（１Ｈ−インドール―３―イル）―ピペリジン―１−イル］−ブチル｝−アミド、
４’−トリフルオロメチル―ビフェニル―４―カルボン酸［４―（４―ベンゾ［ｂ］チオフェン―３―イル―ピペリジン―１―イル）―ブチル］―アミド、
４−（４−クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４−［４−（２，４―ジメトキシ―フェニル）―ピペラジン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、
４−（４−クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４―［４―（２，４―ジメトキシ―フェニル）―［１，４］ジアゾカン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、
４’−トリフルオロメチル―ビフェニル―４―カルボン酸｛４―［４−（２−エトキシル―４―メチル―フェニルアミノ）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
４’―トリフルオロメチル―ビフェニル―４―カルボン酸（４―｛４−［ベンゼンスルフォニル―（２―エトキシ―４―メチル―フェニル）―アミノ］―ピペリジン―１―イル｝―ブチル）―アミド、
４’―トリフルオロメチル―ビフェニル―４―カルボン酸｛４−［４−（ナフタレン―１―イルオキシ）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
４−（４−クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４−［４−（２―メトキシ―４―メチル―フェニル）―ピペラジン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、
４’―トリフルオロメチル―ビフェニル―４―スルフォン酸｛４−［４−（２―エトキシ―４―メチル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
５―［４―（２―エトキシ―４―メチル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ペンタン酸（４’―トリフルオロメチル―ビフェニル―４―イル）―アミド、
４’―｛５−［４−（１−メトキシ―ナフタレン―２―イル）―ピペリジン―１―イル］―ペンチルオキシ｝―ビフェニル―４―カルボニトリル、
４’―｛４−［４−（１―メトキシ―ナフタレン―２―イル）―ピペリジン―１―イル］―ブトキシ｝―ビフェニル―４―カルボニトリル、
４−メチル―２―（４―トリフルオロメチル―フェニル）―チアゾール―５―カルボン酸｛４−［４―（４―イソプロピル―２―メトキシル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル―アミド、
２−（４−クロロ―フェニル）―１―メチル―１Ｈ―インドール―５―カルボン酸｛４―［４―（２―エトキシ―４―メチル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
２−（４−トリフルオロメチル―フェニル）―ベンゾフラン―５―カルボン酸｛４−［４−（２−エトキシル―４―メチル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
２―（４―クロロ―フェニル）―ベンゾフラン―５―カルボン酸｛４−［４−（２―エトキシル―４―メチル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
２−（３，４―ジクロロ―フェニル）―ベンゾフラン―５―カルボン酸｛４―［４―（１―シクロプロピルメトキシ―５，６，７，８―テトラヒドロ―ナフタレン―２―イル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
２―（６―トリフルオロメチル―ピリジン―３―イル））―ベンゾフラン―５―カルボン酸｛４―［４―（１―シクロプロピルメトキシ―５，６，７，８―テトラヒドロ―ナフタレン―２―イル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
Ｎ―｛４―［４―（２―エトキシ―４―メチル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―４―（４―トリフルオロメチル―フェニル）―ビニル］―ベンズアミド、
Ｎ―｛４−［４−（２−エトキシ―４―メチル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―４―（４―トリフルオロメチル―ベンジルオキシ）―ベンズアミド、
４―［２―（３，５―ジクロロ―フェニル）―エテニル］―Ｎ―｛４―［４―（２，４―ジメトキシ―フェニル）―ピペラジン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、
４―［２―（３，５―ジクロロ―フェニル）―エチル］―Ｎ―｛４―［４―（２，４―ジメトキシ―フェニル）―ピペラジン―１−イル］―ブチル｝―ベンズアミド、
４―（４―ベンゾイル）―Ｎ―｛４―［４―（４―イソプロピル―２―メトキシル―フェニル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、
４’―トリフルオロメチル―ビフェニル―４―カルボン酸｛４―［４―（２，４―ジエトキシ―ベンジル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
４―（４―クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４―［４―（２，４―ジメトキシ―ベンゾイル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、
４’―シアノ―ビフェニル―４―カルボン酸｛４−［４―（１―メチル―１Ｈ―インドール―３―イル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―アミド、
４−（４―クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４−［４−（５―メチル―２―ピペリジン―４―イル―フェノール）］―ブチル｝―ベンズアミド、
４―（４―クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４―［４―（５―エチル―２―ピペリジン―４―イル―フェノール）］―ブチル｝―ベンズアミド、
４―（４―クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４―［４―（１―ヒドロキシ―５，６，７，８―テトラヒドロ―ナフタレン―２―イル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、又は
４―（４―クロロ―ベンゾイルアミノ）―Ｎ―｛４−［４―（１―ヒドロキシ―ナフタレン―２―イル）―ピペリジン―１―イル］―ブチル｝―ベンズアミド、又は
生理学的に許容できるそれらの塩、溶媒化合物又は誘導体。
上記式中及び化合物において低級基について言及された部分については、低級とは当業者にとって特定の基の炭素原子数が少ないと考えられることを意味する用語である。好ましくは、Ｃ１−Ｃ６を意味する。
第２の態様において、本発明は、質量分析において生物分子を標識し検出するための反応性質量標識体であって、質量標識体を生物分子に結合させる反応性官能基及び上述のように定義された質量標識体からなる反応性質量標識体を提供する。反応性官能基は質量標識体の質量正規化部分に結合し又は質量標識体の質量マーカー部分に結合してもよい。
本発明者らは、上述のように定義された質量標識体が、質量分析計により容易に同定でき、高感度で定量化できることも見出した。
好ましい実施形態において、質量標識体の総分子量は６００ダルトン以下、５００ダルトン以下がより好ましく、４００ダルトン以下が特に好ましく、３００から４００ダルトンが最も好ましい。質量標識体の分子量は、３２４、３３８、３３９及び３８０ダルトンであることが特に好ましい。質量標識体の大きさが小さければ、更に小さな大きさの生物分子を本発明の質量標識体により標識し検出するできるため、これらの好ましい実施形態は特に有利である。そのため、質量分析による分析の際に、本発明の質量標識体により標識した生物分子を標識されていない生物分子と同一の質量スペクトルウィンドーで見ることができるようになる。これにより、質量標識体自体のピークの同定が容易となる。
好ましい実施形態において、質量マーカー部分の分子量は３００ダルトン以下、２５０ダルトン以下がより好ましく、１００から２５０ダルトンが特に好ましく、１００から２００ダルトンが最も好ましい。質量マーカー部分の大きさが小さいということは質量スペクトルのサイレント領域にピークが現れるため、質量スペクトルから質量マーカーを容易に同定でき、高感度で定量化を行うことが可能である。このため、これらの好ましい実施形態は特に有利である。
本明細書中において、質量スペクトル（例えば、ＭＳ／ＭＳスペクトル）のサイレント領域とは、標識したペプチドのフラグメンテーションにより生成されたフラグメントの存在と関連したピークにより発生した低バックグラウンドノイズが現れる質量スペクトルの領域を意味するための用語である。緩衝剤、変性剤及び界面活性剤等の不純物がＭＳ／ＭＳスペクトルに現れないように、ＭＳモードにおける１のピークのフラグメンテーションによりＭＳ／ＭＳスペクトルが得られる。これにより、ＭＳ／ＭＳモードによる定量化が有利となる。そのため、サイレント領域とは、検出する生物分子と関連したピークにより発生したバックグラウンドノイズが低い質量スペクトルの領域を意味するための用語である。検出する生物分子がペプチド又はタンパク質である場合、質量スペクトルのサイレント領域は２００ダルトン未満である。検出する生物分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド又は核酸塩基である場合、質量スペクトルのサイレント領域は５００ダルトン未満である。
本発明者らは、検出する生物分子に結合していない上述のように定義された質量標識体及び反応性質量標識体は、質量分析計による分析前に本発明の質量標識体により標識した生物分子から容易に分離できることも見出した。
本発明者らは、上述のように定義された反応性質量標識体が容易にかつ迅速に生物分子と反応し、標識した生物分子が形成されることも見出した。
本発明は、検体に関連可能な質量標識体を質量分析法により同定して生物分子又は生物分子の混合物を検出することからなる分析方法であって、質量標識体が上述のように定義された質量標識体であることを特徴とする方法をも提供する。
第３の態様において、本発明は、２以上の質量標識体又は反応性質量標識体からなるセットであり、セットの各標識体は上述のように定義されたものであり、各質量正規化部分は質量標識体が所望の総質量を有することを確実にし、セットは
−共通の質量を有する質量マーカー部分を有し、固有の総質量を有する標識体のグループ；又は
−そのグループの他全ての質量マーカー部分と異なる質量を有する質量マーカー部分を有し、共通の総質量を有する標識体のグループ
からなり、質量分析においてセットの全ての質量標識体が互いに識別可能であることを特徴とする質量標識体又は反応性質量標識体セットを提供する。
セットの標識体数は、セットが複数の標識体からなれば特に制限されないが、セットは２以上、３以上、４以上又は５以上の標識体からなることが好ましく、６以上の標識体からなることがより好ましく、８以上の標識体からなることが最も好ましい。
本明細書における総質量とは、質量標識体の全質量を意味する。即ち、質量標識体の質量マーカー部分、開裂可能リンカー、質量正規化部分及びその他構成分子の質量の合計を意味する。
質量正規化部分については、その質量のみが限定され、セットの異なる質量標識体間において変動してもよい。例えば、異なる質量の質量マーカー部分を有し、共通の総質量の標識体のグループからセットがなる場合、セットの各質量標識体の質量正規化部分の質量は異なる。この場合、個々の質量標識体における質量正規化部分の質量は、共通の総質量から、その質量標識体における特定の質量マーカー部分の質量及び開裂可能リンカーの質量を減算することにより求められる。共通の質量を有する質量マーカー部分を有し、異なる総質量の標識体のグループからセットがなる場合、そのグループにおける全ての標識体の総質量が異なるように質量正規化部分の質量を変動させる必要があることは明白である。
セットにおける全ての質量標識体は、質量分析により互いに識別可能である。そのため、質量標識体は、質量分析計により区別することができる。即ち、個々の質量標識体に由来するピークと他のピークを明確に別々のものとすることができる。質量マーカー部分又は質量標識体の質量の違いは、異なる質量標識体又は質量マーカー部分に由来するイオンを質量分析計により区別することができることを意味する。
本発明は、上述に定義した２以上の質量標識体セットからなり、いずれかのセットの各質量標識体の総質量はアレイの他のセットの各質量標識体の総質量と異なる質量標識体のアレイをも提供する。
本発明の好ましい実施形態において、質量標識体のアレイは全て化学的に同一であることが好ましく、質量正規化部分及び質量マーカー部分の質量は同位体置換により異なるようにする。
本発明の更に好ましい実施形態において、質量標識体は増感基からなってもよい。質量標識体は以下の構造を有していることが好ましい。
増感基− Ｘ−Ｌ−Ｍ −反応性官能基
この実施例において、増感基は、通常、質量マーカー部分に結合し、その部分の検出感度を質量分析計において高めるものである。反応性官能基は増感基とは異なる部分に結合し存在するように示されているが、質量標識体はこれに限定される必要はなく、増感基を有し、反応性官能基を有さない場合もある。他の実施形態においては、増感基は反応性官能基と同じ部分に結合していてもよい。
本発明のある実施形態において、質量標識体はアフィニティー捕獲試薬からなる。アフィニティー捕獲リガンドは、ビオチンであることが好ましい。標識した検体と標識されていない検体は、例えばアビジン固相において、アフィニティー捕獲リガンドにより捕獲することにより分離することができる。
第４の態様において、本発明は、生物分子又は生物分子の混合物に関連可能な質量標識体又は２以上の質量標識体を質量分析法により同定して、好ましくは生体分子又は生体分子の混合物等の検体又は検体の混合物を分析する方法であって、質量標識体が上述のように定義された質量標識体セット又はアレイであることを特徴とする方法をも提供する。
この方法は、
１．生体分子又は生体分子の混合物を本発明による質量標識体と反応させ、
２．標識した生体分子を電気泳動又はクロマトグラフィーにより任意に分離し、
３．標識した生体分子をイオン化し、
４．標識した生体分子の好ましいイオンの質量電荷比に対応する所定の質量電荷比を有するイオンを質量分析計において選択し、
５．衝突させることにより選択されたイオンを誘起解離し、
６．衝突生成物を検出して、質量標識体を示す衝突生成イオンを同定
することからなることが好ましい。
この実施形態において、質量標識体がアフィニティータグからなる場合、標識されていない生体分子から標識した生体分子を分離するために、アフィニティータグされた生体分子がカウンターリガンドにより捕獲されてもよい。このステップは、前記任意の第２ステップより前に行われることが好ましい。
ある実施形態において、所定の質量電荷比を有するイオンを選択する前記ステップは、直列型分析器の最初の質量分析計により行われる。そして、第４のステップによれば、選択されたイオンはチャンネルを通して独立した衝突室に運ばれ、気体又は固体表面と衝突させる。次に、第５のステップによれば、衝突生成物は直列型分析器の更なる質量分析計に運ばれ、衝突生成物を検出する。通常用いられる直列型分析器として、三連四重極質量分析計、タンデムセクター型分析器、四重極飛行時間質量分析計等がある。
他の実施形態において、所定の質量電荷比を有するイオンを選択するステップと、選択されたイオンを気体に衝突させるステップと、衝突生成物を検出するステップは、質量分析計の同じ場所において行われる。例えば、イオントラップ型質量分析計やフーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計において行われてもよい。
本発明において、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化）法を用いてもよい。ＭＡＬＤＩでは、光励起マトリックスに過剰モル生体分子溶液を包埋させる必要がある。適切な周波数を有するレーザー光を用いることにより、マトリックスが励起され、マトリックスと共に包括された生体分子が急速に蒸発する。酸性マトリックスから生体分子へプロトンが移動すると、特にＴＯＦ（飛行時間）質量分析法等の陽イオン質量分析法で検出できるプロトン化生体分子の数を増やすことができる。陰イオン質量分析法もＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって行うことができる。この技術によれば、イオンに大量の並進エネルギーを与えることができるにも関わらず、余分なフラグメンテーションを生じずにすむ傾向がある。レーザーエネルギーと、イオン源からのイオンを加速するために用いられる電位差を印加するタイミングによって、フラグメンテーションをこの技術により制御することができる。広い質量範囲を示し、スペクトルにおける単電荷イオンの広い分布を示し、複数のペプチドを同時に分析できることから、この技術は非常に好まれている。本発明において、ＴＯＦ／ＴＯＲ法を用いてもよい。
光励起マトリックスは色素、即ち、特定の周波数を有する光を強く吸収する化合物からなり、蛍光やりん光によってエネルギーを放出するのではなく、例えば振動モードを介してエネルギーを熱分散させることが好ましい。レーザーによってマトリックスが励起して振動することにより色素が急速に昇華し、これと同時に包埋された検体が気相になる。
ＭＡＬＤＩ法は本発明において有用であるが、本発明はこの方法に限定されるものではなく、必要であれば、当業者は当該技術分野における通常の他の方法を本発明に用いることができる。
他の態様において、本発明は、上述のように定義された質量標識体からなる標識した生物分子を提供する。生物分子は所望のいかなる生物分子でもよく、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、タンパク質、ペプチド及び／又はアミノ酸又はこれらの類似化合物でもよい。生物分子は、質量標識体の質量マーカー部分又は質量標識体の質量正規化部分に結合してもよい。
本発明は、以下の構造
生物分子−リンカー−標識体
（式中、標識体は本発明のセット又はアレイの質量標識体であり、リンカーは後述するリンカーであり、生物分子は所望のいかなる生物分子でもよく、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、タンパク質、ペプチド及び／又はアミノ酸又はこれらの類似化合物でもよい。）を有する、質量標識した生物分子のセット又はアレイをも提供する。
この実施形態の１の好ましい態様においては、セット又はアレイの生物分子（１、１を超える又は全ての生物分子）は、周知の質量又はクロマトグラフィーにおける所定の性質を有する標準的な生物分子である。このような標準的な生物分子を本発明の方法に用いて、例えばクロロマトグラフィーによる分離ステップの結果を分析する際に、未知の生物分子と比較することができる。
質量分析計におけるＭＳ／ＭＳとは、イオンを選択し、選択したイオンをＣＩＤ（衝突誘起解離）処理し、フラグメントイオンの更なる分析を行うことができる質量分析計を意味する用語である。
直列型分析器とは、質量分析計が直列に配置され、連結された質量分析計においてＭＳ／ＭＳ処理の各ステップが交互に行われるＭＳ／ＭＳ可能な質量分析計を意味する用語である。通常用いられる直列型分析器として、三連四重極質量分析計、タンデムセクター型分析器、四重極飛行時間質量分析計及びＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計等がある。
添付した図を参照しながら、本発明の更なる詳細について説明する。以下の説明は本発明の例示であり、本発明は以下の実施形態に限定されない。
（質量マーカー部分）
好ましい実施形態において、本発明は、上述のように定義された質量標識体であって、質量マーカー部分の分子量が３００ダルトン以下、好ましくは２５０ダルトン以下、より好ましくは１００から２５０ダルトン、最も好ましくは１００から２００ダルトンである質量標識体を提供する。。質量マーカー部分の分子量は、１２５、１２６、１５３及び１５４ダルトン、又は１以上又は全ての１２Ｃ原子を１３Ｃ原子で置換した場合における分子量であることが特に好ましい。例えば、分子量が１２５である未置換質量マーカー部分では、その置換された化合物の質量は、１、２、３、４、５及び６の１３Ｃ原子で置換された場合及び／又は１以上又は全ての１４Ｎ原子を１５Ｎ原子により置換した場合において、それぞれ１２６、１２７、１２８、１２９、１３０及び１３１ダルトンとなる。
本発明の質量マーカー部分の構成要素は、フラグメンテーション耐性であることが好ましい。そうすれば、衝突誘起解離（ＣＩＤ）により容易に壊れるような結合を行うことにより、マーカーのフラグメンテーション部を制御することができる。
本発明の質量マーカー部分は以下の基

（式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚは独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）（即ち、−Ｏ−Ｃ（Ｒ１）−又は−Ｃ（Ｒ１）−Ｏ−）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる。
質量マーカー部分の置換基は特に限定されるものではなく、任意の有機基及び／又はＢ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ又はＳ原子又はハロゲン原子等（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）の周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ又はＶＩＩＡ族の１以上の原子からなってもよい。
置換基が有機基からなる場合、有機基は炭化水素基からなることが好ましい。炭化水素基は、直鎖、分岐鎖又は環状基からなっていてもよい。独立して、炭化水素基は脂肪族基又は芳香族基からなってもよい。さらに独立して、炭化水素基は飽和又は不飽和基からなってもよい。
炭化水素が不飽和基からなる場合、１以上のアルケン官能基及び／又は１以上のアルキン官能基からなってもよい。炭化水素が直鎖又は分岐鎖基からなる場合、１以上の第一級、第二級及び／又は第三級アルキル基からなってもよい。炭化水素が環状基からなる場合、芳香族環、脂肪族環、複素環基及び／又はこれらの縮合環誘導体からなってもよい。そのため、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾール及び／又はオキサゾール基、又はこれらの位置異性体からなってもよい。
炭化水素基の炭素原子数は特に限定されないが、炭化水素基が１−４０の炭素原子からなることが好ましい。そのため、炭化水素基は低級炭化水素（１−６のＣ原子）又は高級炭化水素（７以上の炭素原子、例えば７−４０のＣ原子）であってもよい。環状基の環中の原子数は特に限定されないが、３、４、５、６又は７の原子等、３−１０の原子から環状基の環がなることが好ましい。
上述されたヘテロ原子からなる基及び上述のように定義された他のいずれの基は、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ又はＳ原子又はハロゲン原子等（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）の周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ又はＶＩＩＡ族の１以上のヘテロ原子からなってもよい。そのため、置換基は、例えばヒドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、硫酸塩基、スルフォン酸基、リン酸塩基等の、１以上の有機化学的な共通の官能基からなってもよい。置換基は、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物等これら基の誘導体からなってもよい。
さらに、いずれの置換基も２以上の置換基及び／又は上述のように定義された２以上の官能基からなっていてもよい。
本発明において、上述のように定義された基からなる質量マーカー部分への言及は、質量標識体の開裂の起こる場所によっては、質量マーカー部分が他の基からなっていてもよいことを意味する。ＣＯとＮＨ間のアミド結合においてリンカーの開裂が起きる一実施形態において、質量マーカー部分は更に以下に示すＣＯ基からなっていてもよい。
ＮＨ基の後の結合においてリンカーの開裂が起きる他の実施形態においては、質量マーカー部分は更に以下に示すＣＯ及びＮＨ基からなっていてもよい。
ＣＯ基の前でリンカーの開裂が起きる更に他の実施形態においては、質量マーカー部分は以下の基のみからなる。
好ましい実施形態において、ｙは０、１又は２であり、ｙが０又は１であることがより好ましい。
好ましい一実施形態において、環状ユニットは芳香族であり、環状ユニットの各ＺはＮである。ＸがＣであることも好ましい。環状ユニットにないＺがＳであることも好ましい。
他の好ましい実施形態において、環状ユニットは脂肪族であり、環状ユニットの各ＺはＣ（Ｒ１）２である。ＸがＮであることも好ましい。環状ユニットにないＺがＣ（Ｒ１）２であることも好ましい。
好ましい実施形態において、質量マーカー部分は以下の基
及び
から選択された基からなる。
質量標識体の開裂が起きる場所によっては、上記基は他の基からなってもよい。アミド結合のＣＯとＮＨ間のアミド結合においてリンカーの開裂が起きる一実施形態において、上記質量マーカー部分基は更に以下に示すＣＯ基からなっていてもよい。
ＮＨ基の後の結合においてリンカーの開裂が起きる他の実施形態においては、上記質量マーカー部分基は、更に以下に示すＣＯ及びＮＨ基からなっていてもよい。
ＣＯ基の前でリンカーが開裂する更に他の実施形態においては、質量マーカー部分は以下の基のみからなる。
更に好ましい実施形態において、質量マーカー部分は以下の基
及び
から選択された基からなる。
質量標識体の開裂が起きる場所によっては、上記基は他の基からなってもよい。アミド結合のＣＯとＮＨ間のアミド結合においてリンカーの開裂が起きる一実施形態において、上記質量マーカー部分基は更に以下に示すＣＯ基からなっていてもよい。
ＮＨ基の後の結合においてリンカーの開裂が起きる他の実施形態においては、上記質量マーカー部分基は、更に以下に示すＣＯ及びＮＨ基からなっていてもよい。
ＣＯ基の前でリンカーが開裂する更に他の実施形態においては、質量マーカー部分は以下の基のみからなる。
（リンカー）
本発明の質量標識体の開裂可能リンカーは、アミド結合からなる。開裂可能リンカーは、衝突により開裂可能であるリンカーであることが好ましい。リンカーがアミド結合からなるのであればリンカーの構造は特に限定されないが、リンカーはアミド結合からなることが好ましい。
上述又は後述する説明において、所望の分子を本発明の質量標識体化合物に結合させるリンカー基について言及する。様々なリンカーが当該技術において知られており、これらのリンカーは本発明の質量標識体とこれらに共有結合で結合した生物分子との間に導入される。これらのリンカーの一部は開裂可能であってもよい。オリゴ又はポリエチレングリコール又はこれらの誘導体をリンカーとして用いることができ、例えばＭａｓｋｏｓ， Ｕ． ＆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ， Ｅ．Ｍ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２０： １６７９−１６８４， １９９２に開示されたものを用いることができる。コハク酸系リンカーも広く用いられているが、オリゴヌクレオチドを標識するのにあまり好まれていない。この理由は、当該リンカーが一般に塩基に不安定であるため、多数のオリゴヌクレオチド合成で使用されている塩基介在脱保護ステップには不適合だからである。
プロパルギルアルコールは二官能リンカーであり、オリゴヌクレオチド合成の条件下において安定した結合を提供し、オリゴヌクレオチドに対して本発明を使用するのに好ましいリンカーである。同様に、６−アミノヘキサノールは、適切に官能基を付与した分子を結合するに有用な二官能試薬であり、好ましいリンカーである。
光開裂可能リンカーなどの多様な既知の開裂可能リンカー基を本発明の化合物と併用できる。オルソニトロベンジル基は、光開裂可能リンカーとして公知であり、特に、２−ニトロベンジルエステルや２−ニトロベンジルアミンは、ベンジルアミン結合で開裂する。開裂可能リンカーの論評については、Ｌｌｏｙｄ−Ｗｉｌｌｉａｍｓら、 Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４９， １１０６５−１１１３３， １９９３を参照されたい。これは、様々な光開裂可能及び化学的開裂可能リンカーについて言及している。
国際公開第００／０２８９５号パンフレットにおいて、開裂可能リンカーとしてビニルスルフォン化合物が開示されている。これらは本発明においても使用することができ、特にポリペプチド、ペプチド及びアミノ酸を標識するのに用いられる。この出願の内容を参照により本明細書に援用する。
国際公開第００／０２８９５号パンフレットにおいて、気相中で塩基により開裂可能なリンカーであるシリコン化合物の使用が開示されている。これらのリンカーも本発明においても使用することができ、特にオリゴヌクレオチドを標識するのに用いられる。この出願の内容を参照として本明細書に引用する。
（質量正規化部分）
質量標識体が所望の総質量を有することを確実にするのに適したものであれば、本発明の質量標識体の質量正規化部分の構造は特に限定されない。しかし、質量正規化部分は、直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ２０置換又は未置換脂肪族基及び／又は１以上の置換又は未置換アミノ酸からなることが好ましい。
質量正規化部分は、Ｃ１−Ｃ６置換又は未置換脂肪族基からなることが好ましく、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５置換又は未置換脂肪族基からなることがより好ましく、Ｃ１、Ｃ２又はＣ５置換又は未置換脂肪族基又はＣ１メチル置換基からなることが特に好ましい。
１以上の置換又は未置換アミノ酸は、任意の必須又は可欠天然又は人工アミノ酸でもよい。好ましいアミノ酸として、アラニン、β−アラニン及びグリシンが挙げられる。
質量正規化部分の置換基は特に限定されるものではなく、どの有機基及び／又はＢ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ又はＳ原子又はハロゲン原子等（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）の周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ又はＶＩＩＡ族の１以上の原子からなってもよい。
置換基が有機基からなる場合、有機基は炭化水素基からなることが好ましい。炭化水素基は、直鎖、分岐鎖又は環状基から構成されてもよい。独立して、炭化水素基は脂肪族基又は芳香族基からなってもよい。さらに独立して、炭化水素基は飽和又は不飽和基からなってもよい。
炭化水素が不飽和基からなる場合、１以上のアルケン官能基及び／又は１以上のアルキン官能基からなってもよい。炭化水素が直鎖又は分岐鎖基からなる場合、１以上の第一級、第二級及び／又は第三級アルキル基からなってもよい。炭化水素が環状基からなる場合、芳香族環、脂肪族環、複素環基及び／又はこれらの縮合環誘導体からなってもよい。そのため、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾール及び／又はオキサゾール基、又はこれらの位置異性体からなってもよい。
炭化水素の炭素原子数は特に限定されないが、炭化水素が１−４０個の炭素原子からなることが好ましい。そのため、炭化水素基は低級炭化水素（１−６個の炭素原子）又は高級炭化水素（７個以上の炭素原子、例えば７−４０個の炭素原子）であってもよい。環状基の環中の原子数は特に限定されないが、３個、４個、５個、６個又は７個の原子等、環状基の環は３−１０の原子からなることが好ましい。
上述されたヘテロ原子からなる基及び上述のように定義された他のいずれの基は、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ又はＳ原子又はハロゲン原子等（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）の周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ又はＶＩＩＡ族の１以上のヘテロ原子からなってもよい。そのため、置換基は、例えばヒドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、硫酸塩基、スルフォン酸基、リン酸塩基等の、１以上の共通の有機化学的官能基からなってもよい。置換基は、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物等これら基の誘導体からなってもよい。
さらに、いずれの置換基も２以上の置換基及び／又は上述のように定義された２以上の官能基からなっていてもよい。
（反応性質量標識体）
質量分析法により生物分子を標識し検出する本発明の反応性質量標識体は、上述のように定義された質量標識体、及び質量標識体の生物分子への結合又は結合を容易にする反応性官能基からなる。本発明の好ましい実施形態において、反応性官能基により、質量標識体が生物分子の適切な官能基と共有結合的に反応できる。生物分子として、限定するものではないが、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド又はポリペプチドが挙げられる。反応性官能基はリンカーを介して質量標識体に結合してもよく、リンカーは開裂可能であってもなくてもよい。反応性官能基は、質量標識体の質量マーカー部分又は質量標識体の質量正規化部分に結合してもよい。
本発明の質量標識体には、様々な反応性官能基を用いることができる。標識する生物分子の１以上の反応性部位と反応することができるのであれば、反応性官能基の構造は特に限定されない。反応性官能基は、求核性又は求電子性であることが好ましい。
最も簡潔な実施形態において、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであってもよい。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化質量標識体は、ヒドラジンと反応することにより、ヒドラジド反応性官能基を生成することもできる。これは、例えば、過ヨウ素酸酸化糖部分を標識するのに用いることができる。場合によっては、アミノ基又はチオールを反応性官能基として用いることもできる。リシンを用いて、質量標識体を遊離カルボキシル官能基に結合することができる。この場合、カルボジイミドをカップリング剤として用いる。本発明の質量標識体に他の反応性官能基を導入するにあたって、最初にリシンを用いることもできる。リシンεアミノ基を無水マレイン酸に反応させることにより、チオール反応性マレイミド官能基を導入することができる。様々なアルケニルスルフォン化合物を合成するのにあたって、チオールとアミンに反応する有用なタンパク質標識試薬であるシステインチオール基を最初に用いることができる。アミノヘキサン酸等の化合物を用いて、質量変動質量マーカー部分又は質量正規化部分と反応性官能基の間に、スペーサーを設けることができる。
下記表１に、生体分子の求核性官能基と反応して共有結合するいくつかの反応性官能基を列挙する。オリゴヌクレオチドの合成における使用においては、第一級アミン又はチオールが分子の終端に頻繁に導入され、標識が可能となる。以下に列挙された官能基であれば、いずれも本発明の化合物に導入することができ、質量マーカーを所望の生物分子に結合させることができる。必要であれば、反応性官能基を用いて反応性官能基を更に有するリンカー基を更に導入することができる。尚、表１は全てを網羅したものではなく、本発明は列挙された官能基のみの使用に限定されない。
本発明の好ましい実施形態において、反応性官能基は以下の基
（式中、各Ｒ２は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基である）からなる。
反応性官能基の置換基は特に限定されるものではなく、どの有機基及び／又はＢ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ又はＳ原子又はハロゲン原子等（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）の周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ又はＶＩＩＡ族の１以上の原子からなってもよい。
置換基が有機基からなる場合、有機基は炭化水素基からなることが好ましい。炭化水素基は、直鎖、分岐鎖又は環状基から構成されてもよい。独立して、炭化水素基は脂肪族基又は芳香族基からなってもよい。さらに独立して、炭化水素基は飽和又は不飽和基からなってもよい。
炭化水素が不飽和基からなる場合、１以上のアルケン官能基及び／又は１以上のアルキン官能基からなってもよい。炭化水素が直鎖又は分岐鎖基からなる場合、１以上の第一級、第二級及び／又は第三級アルキル基からなってもよい。炭化水素が環状基からなる場合、芳香族環、脂肪族環、複素環基及び／又はこれらの縮合環誘導体からなってもよい。そのため、環状基は、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、インデン、フルオレン、ピリジン、キノリン、チオフェン、ベンゾチオフェン、フラン、ベンゾフラン、ピロール、インドール、イミダゾール、チアゾール及び／又はオキサゾール基、又はこれらの位置異性体からなってもよい。
炭化水素の炭素原子数は特に限定されないが、炭化水素が１−４０個の炭素原子からなることが好ましい。そのため、炭化水素基は低級炭化水素（１−６個の炭素原子）又は高級炭化水素（７個以上の炭素原子、例えば７−４０個の炭素原子）であってもよい。環状基の環中の原子数は特に限定されないが、３個、４個、５個、６個又は７個の原子等、環状基の環は３−１０の原子からなることが好ましい。
上述されたヘテロ原子からなる基及び上述のように定義された他のいずれの基は、Ｂ、Ｓｉ、Ｎ、Ｐ、Ｏ又はＳ原子又はハロゲン原子等（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）の周期表のＩＩＩＡ、ＩＶＡ、ＶＡ、ＶＩＡ又はＶＩＩＡ族の１以上のヘテロ原子からなってもよい。そのため、置換基は、例えばヒドロキシ基、カルボン酸基、エステル基、エーテル基、アルデヒド基、ケトン基、アミン基、アミド基、イミン基、チオール基、チオエーテル基、硫酸塩基、スルフォン酸基、リン酸塩基等の、１以上の共通の有機化学的官能基からなってもよい。置換基は、カルボン酸無水物及びカルボン酸ハロゲン化物等これら基の誘導体からなってもよい。
さらに、いずれの置換基も２以上の置換基及び／又は上述のように定義された２以上の官能基からなっていてもよい。
より好ましい実施形態において、反応性官能基は以下の基
からなる。
本発明の好ましい実施形態において、反応性質量標識体は以下の１の構造を有する。
３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−Ｏｓｕ）
３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）―エステル（Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−Ｏｓｕ）
６−［（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−ヘキサン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（Ｐｙｒｍ−Ｃ６−Ｏｓｕ）
２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−Ｏｓｕ）
［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）］−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（Ｐｙｒｍ−Ｇｌｙ−Ｏｓｕ）
本発明の第３の態様の好ましい実施形態によれば、セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分を有しており、セットの各標識体は固有の総質量を有する（第１タイプの標識体）。
更に好ましい他の実施形態において、セットの各標識体は共通の総質量を有し、セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分を有する（第２タイプの標識体）。
標識体のセットは上述した２の好ましい実施形態に限定される必要はなく、概略したように全ての標識体が質量分析法により識別可能であれば、例えば、両タイプの標識体からなってもよい。
第２タイプの標識体セットにおいて、セットの各質量マーカー部分が共通の基本構造を有し、セットの各質量正規化部分が共通の基本構造を有し、セットの各質量標識体が１以上の質量調整部分からなり、質量調整部分が質量マーカー部分の基本構造及び／又は質量正規化部分の基本構造に結合し又はその中に位置することが好ましい。この実施形態において、セットの各質量マーカー部分は異なる数の質量調整部分からなり、セットの各質量標識体は同数の質量調整部分を有する。
この説明を通じて、共通の基本構造により、２以上の部分は実質同一の骨格構造、バックボーン又はコアを共有することを意味する。骨格構造は、上記式の質量マーカー部分又は上述のように定義された質量正規化部分からなり、更にアミド結合で結合された複数のアミノ酸からなってもよい。しかし、アリールエーテルユニット等の他のユニットも同時に存在してよい。共通の基本構造が変化しないように、骨格構造又はバックボーンは、ペンダント置換基、又は原子又は同位体で置換されてもよい。
好ましい実施形態において、上述のように定義された第１又は第２タイプの質量標識体又は反応性質量標識体セットは、以下の構造
Ｍ（Ａ）ｙ−Ｌ−Ｘ（Ａ）ｚ
（式中、Ｍは質量正規化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量調整部分であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、ｙ及びｚは０又はそれ以上の整数であり、ｙ＋ｚは１以上の整数である）を有する質量標識体からなる。Ｍがフラグメンテーション耐性基であり、Ｌが他の分子又は原子と衝突した際にフラグメンテーション感受性であるリンカーであり、Ｘがプレイオン化されたフラグメンテーション耐性基であることが好ましい。
質量標識体セットが上述された第２タイプのものであれば、ＭとＸの質量の合計はセットのすべての標識体にて同一である。ＭとＸは同一の基本構造又はコア構造を有することが好ましく、この構造は質量調整部分により変性される。質量調整部分は、ＭとＸの質量の合計がセットの全ての質量標識体において同一であることを確実にし、各Ｘが異なる（固有の）質量を有することも確実にする。
質量調整部分（Ａ）は
（ａ）質量マーカー部分及び／又は質量正規化部分内に位置する同位体置換基、及び
（ｂ）質量マーカー部分に結合した及び／又は質量正規化部分に結合した置換原子又は置換基から選択されることが好ましい。
質量調整部分は、ハロゲン原子置換基、メチル基置換基及び２Ｈ、１５Ｎ、１８Ｏ又は１３Ｃ同位体置換基から選択されることが好ましい。
本発明の第３態様における好ましい一実施形態において、上述のように定義された質量標識体セットの各質量標識体は以下の構造
Ｘ（＊）ｎ−Ｌ−Ｍ（＊）ｍ
（式中、Ｘは質量マーカー部分であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、及びＭは質量正規化部分であり、及び＊は同位体質量調整部分であり、及びｎ及びｍは０以上の整数である）を有し、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
Ｘは以下の基
（式中、Ｒ１、Ｚ、Ｘ及びｙは上述のように定義されたものであり、セットの各標識体は０又は以上の＊からなる）からなり、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
好ましい実施形態において、質量マーカー部分は以下の基
及び
（式中、セットは０又は１以上の＊からなる）から選択される基からなり、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
更に好ましい実施形態において、質量マーカー部分は以下の基
及び
（式中、セットは０又は１以上の＊からなる）から選択される基からなり、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
更に好ましい実施形態において、本発明の反応性質量標識体は以下の反応性官能基
（式中、Ｒ２は上述のように定義されたものであり、セットは０又は１以上の＊からなる）からなり、これにより、
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
反応性官能基は以下の基
（式中、セットは０又は１以上の＊からなる）からなることが好ましく、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
好ましい実施形態において、反応性質量標識体セットは以下のいずれかの構造
（式中、＊は酸素がＯ１８、炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
好ましい実施形態において、反応性質量標識体セットは以下のいずれかの構造
（式中、＊は炭素が１３Ｃ又は窒素が１５Ｎであることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
より好ましくは、上述のように定義された反応性質量標識体セットは、以下のいずれかの構造
（式中、＊は炭素が１３Ｃ又は窒素が１５Ｎであることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する。
以上全ての好ましい化合物及び構造式において、同位体種＊は、検体に標識体を結合することを容易にするために存在する反応性部分に位置するのではなく、質量マーカー部分及び／又はリンカー及び／又は質量調整部分内に位置することが特に好ましい。＊は、質量マーカー部分Ｘに位置することが最も好ましい。同位体置換基の数は特に限定されないが、セットの標識体数によって決定することができる。通常、同位体種＊の数は０−２０、より好ましくは０−１５、最も好ましくは１−１０であり、例えば１、２、３、４、５、６、７又は８である。２の標識体を有するセットにおいて、同位体種＊の数は１であることが好ましいが、５の標識体を有するセットにおいては同位体種数が４であることが好ましく、６の標識体を有するセットにおいては同位体種数が５であることが好ましい。しかしながら、標識体の化学構造によっては、同位体種数を異なるものとしてもよい。
必要であれば、標識体が１以上の硫黄原子を含有する場合、異種同位体Ｓを質量調整部分に用いてもよい。
質量調整部分が１５Ｎ又は１３Ｃである特に好ましい実施形態において、反応性質量標識体セットは以下の構造
を有する２の質量標識体からなる。
質量調整部分が１５Ｎ又は１３Ｃである特に好ましい他の実施形態において、反応性質量標識体セットは以下の構造
を有する５の質量標識体からなるセットからなる。
質量調整部分が１５Ｎ又は１３Ｃである特に好ましい他の実施形態において、反応性質量標識体セットは以下の構造
又はこれらの構造の立体異性体を有する６の質量標識体Ｉ−ＶＩからなる。
本発明には、上述のように定義された複数の質量標識体セットのアレイも含まれる。本発明の質量標識体セットを複数含むものであれば、本発明の質量標識体のアレイは特に限定されない。アレイは、２以上、３以上、４以上又５以上の質量標識体セットからなることが好ましい。アレイの各質量標識体は、以下のいずれかの構造
（Ｓ）ｘ−Ｍ（Ａ）ｙ−Ｌ−Ｘ（Ａ）ｚ
Ｍ（Ａ）ｙ−（Ｓ）ｘ−Ｌ−Ｘ（Ａ）ｚ
（式中、Ｓは質量系列変性基であり、Ｍ、Ｘ及びＬは上述のように定義されたものであり、Ａは質量調整部分であり、Ｘは０又以上の整数であり、ｙ及びｚは０以上の整数であり、ｙ＋ｚは１以上の整数である）を有することが好ましい。質量系列変性基は、セットの質量を互いに分離する。この基はどのような基でもよいが、アミノ酸又はアリールエーテル基であることが好ましい。異なるセットの他のタグとは異なる数のアミノ酸をその部分に有することにより、セットの質量を分離してもよい。
以下の説明において、電荷輸送官能基及び可溶化基について言及する。これらの基は、イオン化と溶解度を促進するために、質量標識体の本発明の質量マーカー等に導入されてもよい。陽イオン又は陰イオン検出を用いるかによって、選択するマーカーは異なる。以下の表２は、陽イオン化又は陰イオン化を促進するために質量マーカーに導入されてもよい、いくつかの官能基を示す。表はこのような官能基を網羅したものではなく、本発明は以下に列挙された官能基のみの使用に限定されない。
国際公開第００／０２８９３号パンフレットは、質量マーカーのイオン化の向上を図るため、クラウンエーテルやポルフィリン等の金属イオン結合部分の使用を開示している。これらの部分は、本発明の質量マーカーの使用に用いることもできる。
本発明は２以上のプローブからなるセットをも提供し、セットの各プローブは異なるものであり、上述のように定義された質量標識体セット又はアレイの固有の質量標識体又は２以上の固有の質量標識体に結合する。
更に、２以上のプローブセットからなるプローブアレイも提供する。いずれかのセットの各プローブは、上述のように定義された質量標識体セットの固有の質量標識体又は２以上の固有の質量標識体に結合し、いずれかのセットにおけるプローブは同じ質量標識体セットの質量標識体に結合し、各プローブセットは、上述のように定義された質量標識体のアレイの固有の質量標識体セットの質量標識体に結合する。
一実施形態において、各プローブは２以上の固有の質量標識体に結合していることが好ましく、質量標識体セットの各質量標識体の存在又は不在により、及び／又は、プローブに結合した各質量標識体の量により各質量標識体を識別する。このことは、質量標識体の混合物にプローブが結合していてもよいことから、本発明における「混合モード」という用語で示す。
上記態様において、プローブの性質は特に限定されないが、各プローブは生体分子からなることが好ましい。全ての生体分子を用いることができるが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質及びアミノ酸から選択されたものであることが好ましい。
好ましい一実施形態において、本発明は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド等を質量標識した、以下の構造
生物分子−リンカー−標識体
（式中、リンカーは上述のように定義されたリンカーであって、標識体は上述のように定義されたいずれかのセット及びアレイの質量標識体である）を有する生物分子セット及びアレイを提供する。
どのような生物分子でも用いることができるが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質及びアミノ酸から選択されたものであることが好ましい。
一実施形態において、各生物分子は２以上の特有の質量標識体に結合していることが好ましく、質量標識体セットの各質量標識体の存在又は不在により、及び／又は、プローブに結合した各質量標識体の量により各質量標識体を識別する。上述したように、このことは、質量標識体の混合物にプローブが結合していてもよいことから、本発明における「混合モード」という用語で示す。
上述のように、本発明は分析方法を提供する。この方法は、生物分子に特異的な質量標識体又は２以上の質量標識体を質量分析法により同定して生物分子を検出することからなり、質量標識体は上述のように定義した質量標識体セット又はアレイの質量標識体である。本発明の質量標識体を用いて生物分子を同定することにより方法が有利なるのであれば、この方法は特に限定されない。前記方法として、例えば核酸塩基配列決定法や１以上の遺伝子発現をプロファイルする方法等、試料のタンパク質の量を検出するものがある。容易に複数の生物分子を同時に分析するのに用いることできることから、この方法は特に有利である。しかも、本発明の質量標識体を用いると、従来のスペクトルよりもすっきりとした質量スペクトルが得られるため、この方法の正確さ及び感度が高まる。そのため、個々の生物分子を分析するのにも有利である。
更に好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）１以上の生物分子をプローブセット又はプローブアレイに接触させ、セット又はアレイの各プローブは少なくとも１の生物分子に特異的なものであり、プローブは上述のように定義されたものであり、
（ｂ）その生物分子に特異的なプローブを検出して生物分子を同定する
ことからなる方法を提供する。
この実施形態において、質量分析法により質量標識体を検出する前に、プローブから質量標識体が開裂することが好ましい。
この特定の実施形態における方法の本質は特に限定されないが、この方法は１以上の核酸をハイブリッド形成プローブセットに接触することからなるのが好ましい。ハイブリッド形成プローブセットは、通常、最大で２５６ ４マーのセットからなり、セットの各プローブは異なる２以上の核酸塩基を有する。この方法は、標的核酸の存在を同定するのに適していてもよく、又はプライマー伸長における核酸の鋳型の塩基配列決定にも用いることができる。
主に多くの標識体を同時に識別することが可能であることから、本発明の質量標識体は二次元分析方法に用いるのに特に適している。このため、標識体は二次元ゲル電気泳動法又は二次元質量分析法に用いることができる。
（質量変動質量マーカー部分及び質量正規化部分）
上述したように、質量標識体を合成する際に１以上の同位体を質量調整部分として含有することにより、質量マーカー部分と質量正規化部分の質量を変動してもよい。適した同位体として、重水素（２Ｈ）、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏがある。図２及び図３は質量標識体セットを示す。図２は、２の質量標識体からなるセットを示し、両質量標識体は同一の総質量を有するが、質量マーカー部分又は質量正規化部分に同位体を含有することにより、各質量標識体は異なる質量の質量マーカー部分（ＴＭＴフラグメント）を有する。図３は、５の質量標識体からなるセットを示し、これらの質量標識体は全て同一の総質量を有するが、質量マーカー部分又は質量正規化部分に同位体を含有することにより、各質量標識体は互いに異なる質量の質量マーカー部分を有する。図２２（アステリスクは炭素１３又は窒素１５であることを示す）は、６の質量標識体からなるセットを示し、６の標識体は全て同一の総質量を有するが、質量マーカー部分及び／又は質量正規化部分に同位体を含有することにより、各質量標識体は他の全ての質量マーカー部分と異なる質量の質量マーカー部分を有する。
実施例４及び５において、同位体からなる本発明の質量標識体の合成について説明する。図１４は、二重試薬の逆合成の反応系を、３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−Ｏｓｕ）を用いて示す。図１５は、二重試薬の逆合成の反応系を、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−Ｏｓｕ）を用いて示す。
（質量マーカー部分又は質量正規化部分における質量変動アミノ酸）
好ましい実施形態において、質量マーカー部分又は質量正規化部分が更に１以上のアミノ酸からなる場合、様々なアミノ酸を用いることができる。質量正規化部分においては、中性アミノ酸が好ましい。以下の表５では、同位体によって質量変動された市販のアミノ酸を示す。本発明によれば、この表に示した１、２、３又は４以上のどのアミノ酸も質量マーカー部分又は質量正規化部分に含ませることができる。
上述のほとんどのアミノ酸のＤ体及びＬ体が市販されている（例えばＩＳＯＴＥＣ社、Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ、オハイオ州）。本発明の質量正規化部分を作製するにあたって、どちらを用いてもよい。Ｄ体及びＬ体の混合物も使用できるが、本発明のタグをクロマトグラフィーによる分離において使用する場合は、あまり好ましくない。一部では、ＦＭＯＣ又はｔ−ＢＯＣ保護誘導体も使用できる。重水素を水素で置換し、１２Ｃ及び１３Ｎ同位体を１３Ｃ及び１５Ｎ同位体で置換して質量変動したアミノ酸も使用でき、同様に本発明の質量正規化部分の合成に用いることができる。ペプチドには通常ない様々なアミノ酸も本発明の質量正規化部に用いることができ、例えば、重水素型アミノ酪酸も市販されている。本発明の目的に鑑み、安全性の面から非放射性で安定した同位体が好まれるが、安定した同位体は特に限定される必要もない。
数々のアミノ酸のフッ素化誘導体も使用することができる。市販されているフッ素化アミノ酸の一部を以下の表６に示す。
ほとんどの上記フッ素化アミノ酸について、Ｄ体及びＬ体の混合物の試薬を用いることができる。一般的に、アミノ酸のフッ素化体は、同位体置換体に比べあまり好まれていない。一定範囲の同一質量の質量標識体を生成する場合、フッ素化化合物を使用することができるが、各質量標識体は化学的に異なる。これは、同位体置換質量標識体に比べて、質量分析計における挙動の変動が大きいことを意味する。更に、質量標識体をクロマトグラフィーによる分離に使用する場合、これらの質量標識体は同一の性質をクロマトグラフィーにおいて示さない。
（アフィニティー捕獲リガンド）
本発明の特定の実施形態において、質量マーカーはアフィニティー捕獲リガンドからなる。アフィニティー捕獲リガンドは、特異性の高い結合相手を有するリガンドである。これらの結合相手は、結合相手がリガンドでタグされた分子を選択的に捕獲することを可能とする。結合相手により固相担体が誘導体化することが好ましく、それによりアフィニティーリガンドによりタグされた分子は選択的に固相担体に捕獲される。好ましいアフィニティー捕獲リガンドはビオチンであり、当該技術において周知の標準的な方法により本発明の質量標識体に導入することができる。特にリシン残基は、質量マーカー部分又は質量正規化部分の後に導入することができ、これを介してアミン反応性ビオチンが質量標識体に結合できる（例えば、Ｇｅａｈｌｅｎ Ｒ．Ｌ．ら， Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０２（１）： ６８−６７Ａ「カルボキシ末端をビオチニル化したペプチドの一般的作製方法」 １９９２； Ｓａｗｕｔｚ Ｄ．Ｇ．ら， Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １２（５）： １０１９−１０１２， 「［Ｌｙｓ］ブラディキニンのビオチニル化類似化合物の合成及び分子特性分析」 １９９１； Ｎａｔａｒａｊａｎ Ｓ．ら， Ｉｎｔ Ｊ Ｐｅｐｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ ４０（６）： ５６７−５６７， 「部位特異的ビオチニル化。エンドセリン―１類似化合物及びＰＴＨ−１類似化合物の新規アプローチとその応用」 １９９２を参照）。イミノビオチンを用いることもできる。ビオチンに対する様々なアビジンカウンターリガンドを使用することができる。アビジンカウンターリガンドには単量体及び四量体アビジン及びストレプトアビジンがあり、これら全てを様々な固相担体に用いることができる。
他のアフィニティー捕獲リガンドとして、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、ニトロフェニル部分及びｃ−ｍｙｃエピトープ等の様々なペプチドエピトープがあり、それらに対してカウンターリガンドとして選択的モノクローナル抗体が存在する。容易にＮｉ２＋イオンに結合するヘキサヒスチジン等の金属イオン結合リガンドを用いることもできる。例えば、イミノ二酢酸キレート化Ｎｉ２＋イオンのクロマトグラフィー樹脂が市販されている。これらの固定化ニッケルカラムは、質量標識体を捕獲するのに用いられる。更に他のアフィニティー捕獲リガンドとしてアフィニティー捕獲官能基が、適切に誘導体化された固相担体と選択的に反応してもよい。例えば、ボロン酸は、隣接したシス−ジオール及びサリチルヒドロキサム酸等の化学的に類似したリガンドに選択的に反応することが知られている。
（質量スペクトル増感基及び質量識別法）
本発明の好ましい実施形態において、ペプチド質量タグは増感基からなる。感度を向上させる方法として、メチル化及びグアニジン化してもよい。グアニジノ基及び第三級アミノ基は共に、エレクトロスプレー質量分析法に有用な増感基である。
ペプチドを誘導体化する他の様々な方法が開発されており、第４級アンモニウム誘導体、第４級ホスホニウム誘導体及びピリジル誘導体を陽イオン質量分析法用に使用するものもある。特にハロゲン化芳香族化合物等のハロゲン化化合物が電気盆、即ち熱電子を非常に容易にピックアップするものとしてよく知られている。フッ素化芳香族化合物の様々な誘導体化試薬（Ｂｉａｎ Ｎら， Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ １１（１６）： １７８１−１７８４， 「多重電気盆で標識したアルブミンのレーザー脱離及び質量分析法による検出」 １９９７）は、電子捕獲検出用に開発されており、この電子捕獲検出は高感度のイオン化及び検出のプロセスであるため、陰イオン質量分析法に用いられる（Ａｂｄｅｌ−Ｂａｋｙ Ｓ． ＆ Ｇｉｅｓｅ Ｒ．Ｗ．， Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６３（２４）：２９８６−２９８９， 「ゼプトモルレベルのガスクロマトグラフィー／電子捕獲陰イオン質量分析法」 １９９１）。フッ素化芳香族基も増感基として使用することができる。陰イオン質量分析法において感度を向上させるため、芳香族スルフォン酸も用いることもできる。
それぞれの増感基は異なる利点を有しており、用いられるイオン化法及び質量分析によって異なる。感度が増大するメカニズムも各基によって異なってもよい。誘導体化を、塩基度を上昇させることによりプロトン化及び電荷局在化を促進する方法もあれば、タグされたペプチドの表面活性を増加して、ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法）やＦＡＢ（高速原子衝撃イオン化法）等の表面脱離法において感度を増大させる方法もある。陰イオン質量分析法ではバックグラウンドノイズがより少ないため、感度がより高い傾向にある。電荷誘導体化により、衝突誘起解離法において誘導体化ペプチドのフラグメンテーション生成物を変えることもできる。特に、ある誘導体化法ではフラグメンテーションパターンが単純になることから、非常に有利である。どのような増感基が選択するかは、用いる質量分析法によって決定する（論評については、Ｒｏｔｈら，Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １７：２５５−２７４，「質量分析法による分析のためのペプチド誘導体化」， １９９８を参照）。本発明の目的を鑑みると、周知の誘導体化法を全て本発明のペプチド質量タグに用いることができる。固相ペプチド合成後、本発明のペプチド質量タグを誘導体化するために既に公開されたプロトコルを、改良を加えずに用いることができる。また、必要であれば、プロトコルを固相合成中に使用するのに適したようにすぐに導入することができる。
（質量分析法によるペプチド分析）
質量分析計の必須の特徴は以下の通りである。
導入系→イオン源→質量分析計→イオン検出器→データ捕獲システム
ペプチド分析の目的によっては、好ましい導入系、イオン源及び質量分析計がある。
（導入系）
本発明のいくつかの態様において、質量分析法による分析前に試料の複雑さを軽減するために、クロマトグラフィー又は電気泳動によって分離することが好まれる。各種の質量分析法技術は、特にキャピラリーゾーン電気泳動法及びＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）等の分離技術に対応している。ただし、固体表面から物質を除去するＭＡＬＤＩ及びＦＡＢ（後述する）等のイオン化技術は、クロマトグラフィーによる分離にあまり適さないため、このような技術において分離が必要な場合、イオン化源の選択は若干制限される。ほとんどの目的において、クロマトグラフィーによる分離とこれらの一の技術による質量分光分析をインラインで連結するには非常に多くのコストがかかった。動的ＦＡＢやエレクトロスプレー、熱スプレー及びＡＰＣＩ等のスプレーによるイオン化技術はすべて、クロマトグラフィーによる分離と既にインラインで対応しており、このような液体クロマトグラフィー質量分析法による分析を行う装置は市販されている。
（イオン化技術）
生体分子の研究において、質量分析法としていわゆるソフトイオン化技術を利用することが多い。これにより、タンパク質及び核酸等の大きな分子をほぼ無傷でイオン化することができる。そして、液相技術を用いると、大きな生物分子を穏やかなｐＨの低濃度溶液で、質量分析計に導入することができる。多数の技術が本発明を用いるのに適しており、例えば、ＥＳＩ−ＭＳ（エレクトロスプレーイオン化質量分析法）、ＦＡＢ（高速原子衝撃イオン化質量分析法）、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）及びＡＰＣＩ−ＭＳ（大気圧化学イオン化質量分析法）が挙げられる。ただし、これらに限定されるものではない。
（エレクトロスプレーイオン化法）
エレクトロスプレーイオン化法において、検体生物分子の希釈溶液を質量分析計において原子化、即ち、微細スプレーとして注入する必要がある。例えば、溶液を荷電した針の先端から乾燥窒素流及び静電場に噴霧する。イオン化のメカニズムは完全には明らかになっていないが、大体には次のようなものであると考えられている。溶媒が窒素流において蒸発し、小さな液滴となり、これが検体分子の濃縮につながる。ほとんどの生物分子は実効電荷を有していることから、溶解した分子の静電反発が高まる。蒸発するにつれ、この反発は液滴の表面張力よりも最終的に大きくなり、液滴が分解され、小さな液滴になる。これは、クーロン爆発とも呼ばれる。静電場により、液滴の表面張力が更に上昇し、噴霧プロセスが容易となる。小さな液滴になっても蒸発が継続し、結果として、全ての溶媒のように、生物分子が基本的に気相となるまで繰り返し爆発が起こる。この技術は他の技術と比べ、イオン化の過程においてイオンに付加するエネルギーが比較的少量であり、そのエネルギーが比較的狭い範囲において分布することから、質量標識体の使用においてこの技術は特に重要である。適切に配置された電極による電場を使用することにより、イオンが加速しイオン化室から出てくる。電場の極性を変えて、陰又は陽イオンを抽出してもよい。電極間の電位差により、質量分析器に導入する陽又は陰イオン及び質量分析計に導入するイオンの運動エネルギーが決定する。このことは、質量分析計におけるイオンのフラグメンテーションを考慮した際に重要である。イオンに付加するエネルギーが多いほど、検体分子とイオン源に存在する浴ガスの衝突により、フラグメンテーションが起こりやすくなる。イオン化室からのイオンを加速するのに用いられる電場を調整することにより、イオンのフラグメンテーションを制御することができる。標識した生物分子からタグを取り除く手段としてイオンのフラグメンテーションが用いられる場合、これは特に有利である。エレクトロスプレーイオン化法は、ＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー質量分析法）と呼ばれる液体クロマトグラフィーとインラインで用いることができることから、特に有利である。
（ＭＡＬＤＩ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化法））
ＭＡＬＤＩでは、光励起マトリックスに過剰モル生体分子溶液を包埋させる必要がある。適切な周波数を有するレーザー光を用いることにより、マトリックスが励起され、マトリックスと共に包括された生体分子が急速に蒸発する。酸性マトリックスから生体分子へプロトンが移動すると、特にＴＯＦ（飛行時間）質量分析法等の陽イオン質量分析法で検出できるプロトン化生体分子の数を増やすことができる。陰イオン質量分析法もＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによって行うことができる。この技術だと、イオンに大量の並進エネルギーを与えることができるにも関わらず、余分なフラグメンテーションを生じずにすむ傾向がある。また、加速電圧をフラグメンテーションの制御に再度用いることもできる。
（高速原子衝撃イオン化法）
ＦＡＢ（高速原子衝撃イオン化法）を用いて、比較的不揮発性である分子の気化及びイオン化技術を説明する。これらの技術では、試料とキセノン原子又はセシウムイオンの高エネルギービームの衝突により、表面から試料が脱離する。そして試料は、通常、不揮発性材料（例えば、ＮＢＡ（ｍ−ニトロベンジルアルコール）又はグリセロール）である単純マトリックス表面上に試料を塗布する。ＦＡＢ技術も液相導入系に対応しており、キャピラリー電気泳動導入系又は高圧液体クロマトグラフィー系から溶出した液体はフリットを通過し、検体溶液でほぼ前面のフリット表面を被覆し、フリット表面から検体溶液を原子衝撃によりイオン化する。
（質量分析器）
衝突誘起解離によるペプチドのフラグメンテーションを本発明に用いることにより、タンパク質に結合したタグを同定する。様々な質量分析器を用いて、ペプチドをフラグメント化し、そのフラグメントの質量を決定してもよい。
（ペプチドのＭＳ／ＭＳ及びＭＳｎ分析）
タンデム型質量分析計において、ＣＩＤ（衝突誘起解離）により所定の質量電荷比を有するイオンを選択し、フラグメント化することが可能である。そして、フラグメントを検出し、選択したイオンの構造情報を得ることができる。タンデム型質量分析計でＣＩＤによりペプチドを分析する場合、特徴的な開裂パターンを観察して、ペプチド配列を決定することができる。一般に天然ペプチドはペプチドバックボーンのアミド結合において無作為にフラグメント化し、そのペプチドの特徴的なイオンシリーズが得られる。イオンの電荷がイオンのＮ末端フラグメントに保持される場合には、ｎ番目のペプチド結合での開裂に対するＣＩＤフラグメントシリーズはａｎ、ｂｎ、ｃｎ等と表される。同様に、電荷がイオンのＣ末端フラグメントに保持される場合にはフラグメントシリーズはｘｎ、ｙｎ、ｚｎ、等と表される。
トリプシンとトロンビンは、分子の両末端に塩基性基、即ちＮ末端にα−アミノ基、Ｃ末端にリジン又はアルギニン側鎖を持つペプチドを生成することから、タンデム質量分析法において好ましい開裂剤である。これは二重荷電イオンの形成に有利であり、このイオンでは荷電中心が分子の反対末端にある。ＣＩＤを行うと、二重荷電イオンからＣ末端イオンシリーズ及びＮ末端イオンシリーズが生成し、これを手がかりにしてペプチド配列を決定する。一般的に、所与ペプチドのＣＩＤスペクトルには、イオンシリーズが１又は２しか現れることができない。四重極装置に通常用いられる低エネルギー衝突では、ｂシリーズのＮ末端フラグメント及びｙシリーズのＣ末端フラグメントのいずれかが多い。二重荷電イオンを分析する場合には両方のシリーズが度々検出されるが、一般にはｙシリーズイオンはｂシリーズよりも多い。
アミドバックボーンのプロトン化とそれに続く分子内求核攻撃によって５員オキサゾロン構造が形成され、プロトン化アミド結合が開裂するメカニズムを通して、一般的に、ペプチドはフラグメント化される（Ｓｃｈｌｏｓｓｅｒ Ａ．とＬｅｈｍａｎｎＷ．Ｄ．Ｊ． Ｊ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ３５： １３８２−１３９０， 「ペプチドの単分子反応における５員環形成：低エネルギー衝突誘発による解離」２０００）。図１６ａは、このようなフラグメンテーションが起きるメカニズムの１例を示す。求核攻撃を行うにあたって、このメカニズムは、プロトン化アミドのＮ−末端側のプロトン化アミドに隣接するアミド結合のカルボニル基を要する。荷電オキサゾロニウムイオンはｂ−シリーズイオンを多く生じるが、Ｎ−末端フラグメントからＣ−末端フラグメントへのプロトン転移は、図１６ａに示すように、ｙ−シリーズイオンを多く生じる。Ｎ−末端を保護せず、一般に、ペプチド中のＮ−末端と第２アミノ酸の間のアミドに対してｂ−シリーズイオンが認められない場合、カルボニル基が適切に位置するためのこの必要事項は、Ｎ−末端アミノ酸に隣接するアミド結合での開裂の原因とならない。しかし、アセチル化Ｎ−末端を持つペプチドは、このメカニズムの構造的必要条件を満たさず、このメカニズムによる第１アミノ酸直後のアミド結合でフラグメント化する可能性がある。図１６ｃに示すように、チオアセチル化Ｎ−末端を持つペプチドは、オキサゾロンメカニズムによって、特に容易に開裂することになる。同じ位置では、硫黄原子が酸素原子よりも求核性が強いからである。ペプチドのアミドバックボーンのフラグメンテーションは、バックボーンのメチル化によって調節することもできる。ペプチド中のアミド窒素をメチル化すると、メチル化アミドの隣りにあるアミド結合Ｃ−末端のフラグメンテーションが促進され、ｂ−イオンの形成も有利になる。フラグメンテーションが向上する原因の一部は、メチル基の電子供与効果によりメチル化アミドのカルボニル基が求核性を増大したためと推測され、他方ｂ−イオンの形成が高まるのは、図１６ｂに示すように、生じたオキサゾロニウムイオンがプロトンをＣ−末端フラグメントに転移できない結果であると考えられる。本発明に関連して言えば、タグジペプチドのＮ−末端のチオアセチル化して、隣りのアミド結合でタグペプチドの開裂を高めることができる。同様に、Ｎ−末端アセチル又はチオアセチル基の窒素原子のメチル化も、隣接するアミド結合の開裂を高める。
ポリペプチド又はペプチドのアミド骨格のフラグメンテーションの容易性は、ペプチドの側鎖官能基によっても大きく調節される。従って、ペプチド配列は、最も容易にフラグメント化する箇所を決定する。一般的に、ペプチド配列のどのアミド結合が容易にフラグメント化するかを予知するのは困難である。これは、本発明のペプチド質量タグの設計にとって重大な結果をもたらす。しかし、所望のアミド結合でフラグメント化するペプチド質量タグを設計できるとする考察がいくつかある。例えば、プロリンは、そのＮ−末端アミド結合でのフラグメント化を促進することが知られている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ Ｂ．Ｌ．， Ｂｕｒｓｅｙ Ｍ．Ｍ．， Ｂｉｏｌ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ． ２１： ９２， １９９７）。Ｃ−末端アミドでのフラグメント化が、エネルギー的に好ましくない、歪んだ二環式オキサゾロン構造を生じるからである。アスパラギン酸も、そのＮ−末端アミド結合でのフラグメント化を促進する。しかし、Ａｓｐ−Ｐｒｏ結合は、低エネルギーＣＩＤ分析で特に不安定であり（Ｗｙｓｏｃｋｉ Ｖ．Ｈ．ら， Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ３５（１２）： １３９９−１４０６， 「移動及び局在プロトン： ペプチド解離を理解する枠組み」２０００）、この状況で、アスパラギン酸は、Ｃ−末端側のアミド結合の開裂を促進すると考えられる。このため、プロリン及びａｓｐ−ｐｒｏ結合も本発明のタグペプチドに使用すれば、ペプチド内の特定位置でのフラグメント化が促進される。
通常用いられるタンデム質量分析計は、三連四重極型であり、四重極衝突室で分離された２の四重極質量分析器からなる。この衝突四重極は２の質量分析器四重極間のイオンガイドとして機能する。ガスを衝突四重極に導入して、第１の質量分析器からのイオン気流と衝突させることができる。第１の質量分析器によりイオンはその質量／電荷の比をもとにして選択され、通過する衝突セルでフラグメント化する。フラグメントイオンは第３の四重極で分離され、検出される。誘起開裂はタンデム分析計以外のジオメトリーで起きる。トラップされたイオンが衝突するガスをトラップに導入する過程で、イオントラップ質量分析計によりフラグメンテーションが促進される。一般的に、イオントラップにはヘリウム等の浴ガス含まれるが、例えばネオンを更に加えることによりフラグメンテーションが促進される。同様に、トラップされたイオンをフォトン誘導フラグメント化することもできる。他の好ましいジオメトリーは四重極／直交飛行時間タンデム装置であり、高走査速度の四重極と高感度のレフレクトロンＴＯＦ質量分析器とを結合してフラグメンテーション生成物を同定することができる。
従来のセクター型装置は、タンデム質量分析法に通常用いる他のジオメトリーである。セクター型質量分析計は２の別々のセクターからなり、電気セクターがイオンビームに焦点を合わせると、イオンビームがイオン源を出発し、電場により同じ運動エネルギーを持つイオン流となる。磁気セクターはイオンを質量に基づいて分離し、検出器でスペクトルが形成される。タンデム質量分析法では、このような２のセクターからなる質量分析器を使用することができ、電気セクターが第１質量分析器を設け、磁気セクターが第２質量分析器を設け、２のセクター間には衝突セルが設けられる。衝突セルで分離された２の完全セクターからなる質量分析器は、質量タグしたペプチドの分析にも使用することができる。
（イオントラップ）
イオントラップ質量分析計は四重極質量分析計に似ている。一般的に、イオントラップは３の電極からなる構造をしている。これは、円筒状電極の各端の「キャップ」電極によって、 空洞が形成される。円筒状電極に交流高周波電位を印加し、キャップ電極にはＤＣ又はＡＣ電位でバイアスをかける。空洞に注入したイオンは、円筒状電極の振動電場により安定した軌道に束縛される。しかし、特定のイオンは、所与振幅の振動電位に対して不安定な軌道をとり、トラップから放出される。振動高周波電位を変化することによって、質量電荷比に応じてトラップに注入したイオン試料がトラップから連続的に放出する。そして、放出されたイオンを検出することにより、質量スペクトルが得られる。
イオントラップは、一般的に、イオントラップの空洞に存在する少量の浴ガス、例えばヘリウムで動作される。これにより、装置の解像度と感度の両方が増加し、また、トラップに入ったイオンは、浴ガスとの衝突を経て浴ガスの周囲温度にまで大体冷却される。衝突すると、試料をトラップに導入した時のイオン化は増加するが、それと共にイオン軌道の振幅と速度は低下してイオン軌道はトラップの中央近傍に保持される。このことは、振動電位を変更すると、軌道が不安定になったイオンは、低下した蓄積イオンに比べて急速にエネルギーを獲得し、緊密な束となってトラップから飛び出し、その結果、ピークが狭く大きくなる。
イオントラップは、タンデム質量分析計のジオメトリーを真似たものにすることができ、実際に、多重質量分析計のジオメトリーを真似たものにして、トラップされたイオンの複雑な分析が可能となっている。試料由来の単一の質量種はトラップに保持できる。即ち、その他の種は全てトラップから放出させることができ、第一振動周波上に第二振動周波を超負荷することにより、保持した種を慎重に励起することができる。励起されたイオンは浴ガスと衝突し、十分に励起されるとフラグメント化する。このため、このフラグメントを更に分析することができる。フラグメントイオンを保持して他のイオンを放出し、フラグメントイオンを励起してフラグメント化することにより、更にフラグメントイオンを分析することも可能である。十分な試料が存在する限り、このプロセスを繰り返し行い、更なる分析をすることができる。留意すべき点として、これらの装置は一般的に誘導フラグメンテーション後のフラグメントイオンを高い割合で保持する。これらの装置とＦＴＩＣＲ質量分析計（後述する）は、線形質量分析計に見られる空間分解タンデム質量分析法ではなく、一時的な分解タンデム質量分析法の形態を代表するものである。
（ＦＴＩＣＲ ＭＳ（フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴質量分析法））
ＦＴＩＣＲ質量分析計は、イオン試料が空洞内に保持されるという点でイオントラップと類似する特徴を有する。しかし、ＦＴＩＣＲ ＭＳでは、交差電磁場により高真空室にイオンがトラップされる。箱の二つの側面を形成する一対の平板電極によって電場は形成される。この箱は超伝導磁石の磁場に収容される。この磁石は、電場を形成しかつトラッププレートである２枚の平板に連結しており、トラッププレート間にあってかつ印加した磁場に直交する円形軌道に注入イオンを束縛する。箱の他の対立側を形成する２枚の送信板に高周波パルスを印加すると、イオンはより大きな軌道に励起される。イオンのサイクロイド運動により、受信板を含む箱の残りの二つの対立側に、対応する電場が発生する。励起パルスによりイオンはより大きな軌道に励起されるが、衝突を経てイオンの固有運動が失われるに従いこの軌道は崩壊する。受信板が検出した対応シグナルは、ＦＴ（フーリエ変換）分析により質量スペクトルに変換される。
誘起フラグメンテーション実験において、これらの装置は、イオントラップと類似の方法を行うことができる。所望の単一種を除く全てのイオンをトラップから放出できる。衝突ガスをトラップに導入してフラグメンテーションを誘起することができる。そして、フラグメントイオンを分析することができる。一般的に、フラグメンテーション生成物と浴ガスとが結合すると、受信板が検出したシグナルのＦＴ分析によって分析する場合に、解像度が低くなる。しかし、フラグメントイオンを空洞から放出させ、例えば四重極タンデム分析器で分析することができる。
（クロマトグラフィー又は電気泳動による標識されたペプチドの分離）
本発明の第４態様における任意の第２ステップでは、質量分析にる分析前に標識された生体分子をクロマトグラフィーで分離する。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）で分離することが好ましく、これを質量分析計に直接連結すれば、ペプチドをクロマトグラフィーカラムから溶出しながらペプチドをインライン分析することができる。ＨＰＬＣによって多様な分離技術を実施できるが、質量分析前のペプチド分離には、逆相クロマトグラフィーが一般的である。キャピラリーゾーン電気泳動は別の分離方法であり、質量分析計に直接連結することにより溶出試料の自動分析ができる。これらの分析方法や他の分画技術を用いて、質量分析前の生物分子の混合物の複雑さを軽減してもよい。直交分離等、分離技術を組み合わせて用いてもよい。
［本発明の応用］
（ペプチド及びポリペプチドの標識及びＬＣ−ＭＳ−ＭＳによる分析）
本発明の好ましい実施形態では、質量標識体を使用してペプチド混合物を液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ）により分析する。これらの態様による本発明の質量標識体の使用について、ペプチド分析に関連付けて説明する。図１（ａ）から（ｅ）に示されたような反応性質量標識体を用いて、ペプチドを標識してもよい。
質量標識体を結合すると、標識したペプチドの質量は標識体の質量だけ変動する。このペプチドの質量はもとのタンパク質を同定するには十分であると推測される。この場合、質量標識体のみを検出すればよく、以下の詳細に説明する三連四重極で選択した反応をモニタリングすることにより検出できる。概述すると、所望ペプチドの質量に対応する質量荷電比を持ったイオンが通過できるように三連四重極の第１四重極を設定し、質量マーカー部分の質量に合うように調節する。次に、選択したイオンを第２四重極で衝突誘起解離（ＣＩＤ）する。ペプチド分析におけるこのような条件下で、イオンは概ねにその分子のアミド結合でフラグメント化する。質量標識体の質量は全て同じであるが、異なる置換基を有するため末端部分が異なる。そのため、質量標識体は互いに識別可能である。特定の質量のイオンに関連したマーカーフラグメントの存在により、そのイオンはペプチドであり、かつ別々の試料に由来するタグのピークの相対的な高さから、試料中のペプチドの相対量に関する情報が得られることが確認される。試料中に同じ末端質量を有する末端ペプチドが多数あるか、ペプチドが未知である等、質量のみで十分にペプチドを同定できない場合、全ＣＩＤスペクトルを分析して配列情報を決定してもよい。ペプチドフラグメンテーションピークを使用してペプチドを同定することができ、質量標識体ピークからそのペプチドの相対量に関する情報が得られる。
タンデム質量分析法によるタンパク質、特にペプチド混合物の分析は、スペクトルの「ノイズ」が入るので複雑になる。ペプチドを生物試料から単離すると、時折、緩衝剤、変性剤及び界面活性剤が混入して、質量スペクトル中にこれら全てのピークが現れる。その結果、ペプチドピーク以外のピークがスペクトルに現れてしまい、ペプチドに対応するピークを同定することが非常に困難となる。特に、試料タンパク質が小さく、単離が困難な場合に問題となる。したがって、各種方法を駆使してどのピークがペプチドに対応するかを決定してから、詳細なＣＩＤ分析を行うことになる。三連四重極装置でプリカーサーイオンスキャンを行うことができる（Ｗｉｌｍ Ｍ．ら、 Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ６８（３）：５２７−３３， “未分離ペプチド混合物の親イオンスキャン” （１９９６）を参照）。単一反応モニタリングモードで三連四重極を動作すれば、第１四重極が全質量範囲を走査し、第２四重極においてゲートに入れられた各イオンに対してＣＩＤを行う。そして、特定の１のフラグメントイオンのみを検出するように第３四重極を設定する。このフラグメントイオンは、通常、ペプチドに由来するインモニウムイオン等の特徴的なフラグメントイオンである。このような技術を用いることにより、リン酸基の存在も検出することができる。三連四重極／飛行時間質量分析計を使用する別の方法では、ＣＩＤを行うと質量電荷比が親イオンよりも高い娘イオンが生成されるイオンを同定することにより、二重荷電イオンを走査する。スペクトルのピークの組み合わせを探して、二重荷電イオンを同定する別の方法もある。このピークは、適切な強度比を持ち、０．５ダルトンだけ離れていることから、同一のイオンであるが分子中に存在する１３Ｃの比率だけが異なることを示す。
本発明の質量標識体でペプチドを標識することにより、新しいプリカーサーイオンスキャンが予見できる。即ち、標識したペプチドのＣＩＤを行った後の本発明の質量標識体に対応するフラグメントの存在により、ペプチドピークを同定してもよい。特に、各試料から本発明の方法により単離したペプチドを１以上の質量標識体で標識してよい。全試料に使用するプリカーサーイオンスキャン用質量標識体及び試料に特異的な質量標識体の等モル混合物を用いて、各試料のペプチドを標識してもよい。こうすれば、異なる試料においてペプチドレベルが変動しても、プリカーサーイオンスキャンによるペプチドピークの同定に悪影響はない。
ペプチドイオンを同定し選択したら、ＣＩＤを行う。ＣＩＤスペクトルは時折極めて複雑となり、ＣＩＤスペクトルのどのピークが有意なペプチドフラグメントシリーズに対応するかを決定するのが、質量分析法でペプチド配列を決定する際に更に問題になる。Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ ら、 Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ． Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃ． １１ ：１０１５−１０２４（１９９７）には別の方法が記載されており、１：１ １６Ｏ／１８Ｏ水中で、分析するサンプルをトリプシン処理している。その加水分解反応の結果、２のペプチド集団が生じ、第１の集団の末端カルボキシルには１６Ｏが、第２の集団の末端カルボキシルには１８Ｏが含有される。試料中の各ペプチドに対して、強度の等しい二重ピークが存在し、その二重ピークは２ダルトン離れている。このピークはペプチド本来の同位体のピークと少し重なるが、ＣＩＤスペクトルにおいてこれをダブレットとして自動走査することができる。２の異なるフラグメントによりダブレット間の質量差を決定し、アミノ酸を同定することができる。Ｎ末端ペプチドを単離すれば、この方法を本発明の方法に応用することができる。
（タンパク質発現のプロファイリング）
癌組織の変化を理解するには、例えば、その組織での分子的変化を全て理解し、理想的にはその変化を正常組織に関連付けることが必要である。分子的変化を全て決定するには、遺伝子発現の変化、タンパク質発現及び最終的には代謝産物の変化を測定できなければならない。異なる組織試料間の多数の遺伝子の発現量を、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）量で同時に比較することは、マイクロアレイ技術を使えば可能である（例えば、Ｉｙｅｒ Ｖ．Ｒ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８３（５３９８）：８３−８７，「ヒト繊維芽細胞の血清に対する応答の際の転写プログラム」１９９９参照）。しかし、ｍＲＮＡ量は組織中のタンパク質量に直接相関しない。組織についてタンパク質発現のプロファイルを決定するのにあたって、二次元ゲル電気泳動法が広く使用されている。残念ながら、この技術は極めて手間がかかり、再現性に難点があるため２以上の試料を２−Ｄゲル上で同時に比較することは困難である。上述のように、本発明の方法を使えば、ペプチドを効果的に分析することができる。本発明の質量標識体をＬＣ−ＭＳ−ＭＳで使用すれば、試料が異なっても同じペプチドを同定することができる。更に、試料が異なっても同一のペプチドの相対量を決定することができる。多数の試料中のペプチドの同一性及び相対量を迅速かつ感度よく測定できるため、発現をプロファイルすることができる。したがって、本発明の目的は、ペプチドの選択的単離及び標識を基礎とした、複雑なタンパク質サンプルを比較分析する改良方法を提供することにある。以下に、タンパク質発現を包括的に分析する２の開示されたアプローチについて説明し、タンパク質の特定の状態、例えばリン酸化及び炭水化物修飾を分析するための様々な方法についても記載する。
（包括的タンパク質発現プロファイル用の末端ペプチド単離）
Ｎ末端又はＣ末端のペプチドの単離については、タンパク質試料の包括的な発現プロファイルを決定する方法として説明してきた。末端ペプチドの単離により、１のタンパク質において少なくとも１のペプチド又は１のペプチドのみが確実に単離され、その結果、複雑な分析試料における成分が最初の試料より確実に少なくなる。大きなポリペプチドを短いペプチドにすれば、質量分析法による試料の分析がより容易となる。ポリペプチド末端からペプチドを単離する方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９８／００２０１明細書及び国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０３２５８明細書に記載されている。
（炭水化物修飾タンパク質の単離）
炭水化物はタンパク質の翻訳後修飾体としてしばしば存在する。このようなタンパク質の単離するための様々なアフィニティークロマトグラフィーが知られている（概説として、Ｇｅｒａｒｄ Ｃ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １８２， ５２９−５３９「糖タンパク質の精製」１９９０参照）。炭水化物に対する各種天然タンパク質受容体が知られている。このクラスの受容体の構成員はレクチンとして知られており、特定の炭水化物官能基に対して高度の選択性がある。特定のレクチンで誘導体化したアフィニティーカラムを使用すれば、特定の炭水化物で修飾されたタンパク質を単離することができる。他方、各種の異なるレクチンからなるアフィニティーカラムを使用すれば、各種の異なる炭水化物で修飾されたタンパク質を単離することができる。本発明の一実施形態において、炭水化物修飾タンパク質を含有するタンパク質試料の分析用プロトコルは、以下のステップからなる。
１．トリプシン及びＬｙｓ−Ｃ等の配列特異的開裂試薬で試料を処理し；
２．レクチン又はボロン酸誘導体を含有するアフィニティーカラムにタンパク質試料を通して炭水化物修飾タンパク質のみを単離し；
３．配列特異的開裂により生じた遊離αアミノ基において、捕獲した糖修飾タンパク質を本発明の質量標識体により標識し；及び
４．標識したペプチドをＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する。
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化質量標識体を使用して、遊離αアミノ基を標識することもできる。Ｌｙｓ−Ｃを使用する場合には、各炭水化物修飾ペプチドの遊離εアミノ基及び遊離αアミノ基の両方に標識することができる。
隣接−ジオール基、すなわち隣接する炭素原子上に存在するヒドロキシル基を有する炭水化物は多数ある。１，２−シスジオール立体配位に隣接ジオールを含有するジオール含有炭水化物はボロン酸誘導体と反応して環状エステルを形成する。この反応は塩基性ｐＨでは好まれているが、酸性ｐＨでは容易に逆転する。シス−ジオール含有炭水化物を有するタンパク質を親和性により捕獲するリガンドとして、樹脂に固定化されたフェニルボロン酸誘導体が用いられている。本発明の第６態様の一実施形態では、フェニルボロン酸に結合したビオチンからなるアフィニティーリガンドペプチド質量標識体のセットを合成することもできる。これらのボロン酸タグを用いて、隣接シス−ジオールを含有した炭水化物で修飾されたペプチド又はタンパク質からなる２の別々の試料を標識することもできる。本発明の他の実施態様において、炭水化物修飾ポリペプチドを含有するタンパク質試料の分析用プロトコルは、以下のステップからなる：
１．少なくとも１のタンパク質試料を塩基性ｐＨでボロン酸アフィニティーリガンド質量標識体と反応させ；
２．ポリペプチドを配列特異的なエンドプロテアーゼで開裂し；
３．標識したペプチドをアビジン誘導した固相担体上に捕獲し； 及び
４．標識して捕獲したペプチドをＬＣ−ＭＳ−ＭＳで分析する。
アフィニティーリガンド質量標識体と反応する前又は後で、試料を配列特異的エンドプロテアーゼで消化してもよい。
また、例えばシアール酸において、過ヨウ素酸塩で隣接−ジオールを酸化的に開裂するとカルボニル基に変換することができる。末端にガラクトース又はガラクトサミンを有する糖をガラクトース酸化酵素で酵素的に酸化することによっても、糖のヒドロキシル基をカルボニル基に変換することができる。複合炭水化物もノイラミダーゼ等の炭水化物開裂酵素で処理すると、特定の糖修飾体を選択的に除去し、酸化可能な糖を後に残すことができる。これらのカルボニル基を標識すれば、このような修飾をしたタンパク質を検出又は単離できる。ビオシチンヒドラジッド（Ｐｉｅｒｃｅ＆Ｗａｒｒｉｎｅｒ社、チェスター、イギリス）等のヒドラジッド試薬は、カルボニル含有炭水化物種中のカルボニル基と反応する（Ｅ．Ａ．Ｂａｙｅｒら，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０，２７１−２８１「ビオシチンヒドラジッド−アビジンビオチン技術を用いた糖複合体中のシアール酸、ガラクトース及び他の糖のの選択的標識」、１９８８）。あるいは、アミン修飾ビオチン、例えばＢｉｏｃｙｔｉｎ及びＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）ＰＥＯ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ＆Ｗａｒｒｉｎｅｒ社、チェスター、イギリス）で、還元的アルキル化（Ｍｅａｎｓ Ｇ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ４７， ４６９−４７８「アミノ基の還元的アルキル化」１９７７；Ｒａｙｍｅｎｔ Ｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２７６： １７１−１７９「タンパク質の結晶特性を変更するためのリジン残基還元的アルキル化」１９９７）を用いてカルボニル基を標識することができる。したがって、隣接−ジオール含有炭水化物修飾体を有する複合体混合物中のタンパク質をビオチニル化することができる。ビオチニル化して、炭水化物で修飾したタンパク質はアビジン固相担体を使用して単離することができる。
過ヨウ素酸塩で酸化した炭水化物修飾ペプチドを分析するために、本発明によるペプチド質量標識体セットを合成することができる。
本発明の更なる実施形態は、以下のステップからなる：
１．ポリペプチド試料を過ヨウ素酸塩で処理し、糖ペプチド上の隣接シス−ジオールを有する炭水化物がカルボニル官能基を獲得し；
２．ビオチンと結合したヒドラジド活性質量標識体で、このカルボニル官能基を標識し；
３．タンパク質試料を配列特異的エンドプロテアーゼで消化し；
４．標識したペプチドをアビジン誘導固相担体上に捕捉し； 及び
５．ビオチニル化ペプチドをＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する。
アフィニティーリガンド質量標識体と反応する前又は後で、試料を配列特異的エンドプロテアーゼで消化してもよい。
（フォスフォペプチドの単離）
リン酸化は遍在的で可逆的な翻訳後修飾であり、個々のタンパク質の状態変化に介在する遷移シグナルとして広く用いられるので、ほとんど全ての生物のシグナル経路の大半に見られる。これは重要な研究分野であり、リン酸化動力の分析を可能にするツールは細胞の刺激応答、例えば細胞の薬物応答を完全に理解するのに必須である。
リン酸セリン及びリン酸スレオニン含有ペプチドの分析技術はよく知られている。それらの方法の一部は、リン酸塩のベータ除去のための公知反応を基礎としている。この反応の結果、リン酸セリン及びリン酸スレオニンからデヒドロアラニン及びメチルデヒドロアラニンが形成され、それらは共にミカエル受容体でありチオールと反応する。これを利用してアフィニティークロマトグラフィー用の疎水基を導入している（例えば、Ｈｏｌｍｅｓ Ｃ．Ｆ．， ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ２１５（１），２１−２４「リン酸セリン含有ペプチドの選択的単離の新方法」１９８７参照）。また、ジチオールリンカーも使用されており、これによりリン酸セリン及びリン酸スレオニン含有ペプチドにフルオレセイン及びビオチンを導入している（Ｆａｄｄｅｎ Ｐ， Ｈａｙｓｔｅａｄ ＴＡ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２５（１）， ８１−８，「ペプチド及びタンパク質のリン酸セリンの量的及び選択的蛍光体標識：キャピラリー電気泳動及びレーザー誘導蛍光によるアットモルレベルでの特徴づけ」１９９５；Ｙｏｓｈｉｄａ Ｏ． Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９， ３７９−３８２「リン酸プロテオームをプローブ化するツールとしてのリン酸化タンパク質の濃縮分析」２００１）。セリン及びスレオニンでリン酸化したタンパク質をアフィニティー濃縮するＹｏｓｈｉｄａらの方法を、図８に示すマレイミドタグを用いて改良し、多数の試料を比較することもできる。これは、特にリン酸化カスケードの動力解析に役に立つ。
様々なタンパク質に存在するリン酸チロシン残基に結合する抗体を産生することについて報告している研究グループは多い（例えば、Ａ．Ｒ．Ｆｒａｃｋｅｌｔｏｎら Ｍｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０１， ７９−９２「抗リン酸チロシンモノクロナール抗体の生成及びリン酸チロシン含有タンパク質のアフィニティー精製への利用」１９９１及びＭｅｔｈｏｄ Ｅｎｚｙｍｏｌ 同号中の他の論文参照）。このことは、翻訳後にチロシンがリン酸化修飾を受けたタンパク質のかなり多数のものは、これら抗体をアフィニティーカラムのリガンドとして使用するアフィニティークロマトグラフィーによって単離してもよいことを意味する。
これらのリン酸チロシンに結合する抗体を本発明において使用すれば、リン酸チロシン残基を含有するタンパク質から末端ペプチドを単離することができる。複合体混合物中のチロシンリン酸化タンパク質は、抗リン酸チロシン抗体アフィニティーカラムを使用して単離することができる。本発明の他の実施形態において、チロシンがリン酸化されたタンパク質を含有するタンパク質試料の分析用プロトコルは、以下のステップからなる：
１．トリプシン又はＬｙｓ−Ｃ等の配列特異的開裂試薬で試料を処理し；
２．抗リン酸チロシン抗体を含有するアフィニティーカラムにタンパク質試料を通し、リン酸チロシン修飾ペプチドのみを単離し；
３．配列特異的開裂により生じた遊離αアミノ基において、捕獲したフォスフォペプチドを本発明の質量標識体により標識し；及び
４．標識したペプチドをＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する。
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化タグを使用して、遊離αアミノ基を標識することもできる。
固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）はリン酸タンパク質及びリン酸ペプチドを単離する更なる代表的な技術である。リン酸塩は三価金属イオンからなる樹脂、特にガリウム（ＩＩＩ）イオンに結合する（Ｐｏｓｅｗｉｔｃｈ， Ｍ．Ｃ．，Ｔｅｍｐｓｔ， Ｐ．， Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ．， ７１：２８８３−２８９２「フォスフォペプチドの固定化ガリウム（ＩＩＩ）アフィニティークロマトグラフィー」１９９９）。セリン／スレオニンリン酸化及びチロシンリン酸化したペプチド及びタンパク質を同時に単離することができるため、この技術は有利である。
したがって、ＩＭＡＣはリン酸化タンパク質試料の分析に本発明においても使用することができる。本発明の更なる実施形態において、リン酸化タンパク質を含有するタンパク質試料の分析用プロトコルは、以下のステップからなる。
１．トリプシン又はＬｙｓ−Ｃ等の配列特異的開裂試薬で試料を処理し；
２．固定化金属イオンからなるアフィニティーカラムにタンパク質試料を通し、リン酸化ペプチドのみを単離し；
３．配列特異的開裂により生じた遊離αアミノ基において、捕獲したフォスフォペプチドを本発明の質量標識体により標識し；及び
４．標識したペプチドをＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する。
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド活性化タグを使用して、遊離αアミノ基を標識することもできる。
本発明の他の実施形態において、リン酸化タンパク質試料を分析するにあたり、リン酸化タンパク質を単離し、次にリン酸タンパク質のＮ末端又はＣ末端を分析してもよい。末端ペプチドを単離する技術は多数の特許出願（例えばＷＯ９８／３２８７６、ＷＯ００／２０８７０及びＥＰ０１３０４９７５．４）に開示されている。リン酸化タンパク質を含有するタンパク質試料の分析用プロトコルは、以下のステップからなる：
１．固定化金属イオンからなるアフィニティーカラムにタンパク質試料を通し、リン酸化ペプチドのみを単離し；
２．捕獲したリン酸化タンパク質からＣ末端及び／又はＮ末端ペプチドを単離し；
３．捕獲した末端ペプチドを本発明の質量標識体で標識し；
４．標識したペプチドをＬＣ−ＭＳ−ＭＳにより分析する。
以下の実施例に言及しつつ、本発明の更なる詳細について説明する。以下の説明は本発明の例示であり、本発明は以下の実施例に限定されない。
実施例１から７において、本発明の好ましい標識体の合成について説明する。以下に示すもの以外の試薬は全てシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、Ｅｓｃｈｅｎｓｔｒａｓｓｅ ５、 ８２０２４、タウフキルヘェン、ドイツ）から入手したものである。
同位体試薬であるブロモ−１３Ｃ−酢酸及び１５Ｎ−アミノプロパン酸は、カンプロサイエンティフィック社（Ｃａｍｐｒｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＧｍｂＨ、１０４１４、ベルリン、ドイツ）から購入した。３−アミノプロパン酸ベンジルエステル、２−アミノプロパン及びアミノ酢酸は、メルクバイオサイエンス社（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＧｍｂＨ、６５８２４、Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ、ドイツ）から入手した。
アンバーライト（登録商標）ＸＡＤ−１６は、精製に用いる非イオン性高分子吸収剤である。フロリジルは、クロマトグラフィーに用いる合成活性化マグネシア−シリカゲルである。
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを得るために、標準的な方法により、対応するカルボン酸を活性してタンデム質量タグを合成した。試薬である（ピリミジン−２−イルスルファニル）−酢酸（ａ）、ブロモ酢酸（ｃ）、３−アミノプロパン酸（ｅ）、６−アミノヘキサン酸（ｄ）及び２，６−ジメチルピペリジン（ｂ）は市販されている。
異なる合成プロトコルにおいて記載されている市販の化合物には、英字を付記している。
（実施例１）
＜６−［（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−ヘキサン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（３）の合成＞
３のステップにより、６−［（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−ヘキサン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（３）を合成した。
１．（ピリミジン−２−イルスルファニル）−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（１）の合成
１


Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．３０ｇ（２０ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド４．５０ｇ（２２ｍＭｏｌ）を、ＤＭＦ５０ｍｌに溶解した（ピリミジン−２−イルスルファニル）−酢酸３．４０ｇ（２０ｍＭｏｌ）の溶液に０℃で加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間攪拌した後、残留物を濾過し、黒色の濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。次に、残留物を還流して酢酸エチル１００ｍｌに溶解し、この熱溶液を濾過し、蒸発させた。残留物をＣＨ２Ｃｌ２に溶解した後、ＮａＨＣＯ３でこの溶液を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、活性炭で精製した。溶液を濾過した後、溶媒を蒸発させた。そして、酢酸エチルから化合物を再結晶した。
収量：１．７ｇ（２６％）
保持係数（ＲＦ）＝０．２６（酢酸エチル／メタノール）５：１
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）d ２．８０（ｓ，４Ｈ，Ｏ−Ｓｕ），４．４１（ｓ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２），７．２８（ｔ，１Ｈ，ｐｙｒ５−ＣＨ），８．６５（ｄ，２Ｈ，ｐｙｒ４，６−ＣＨ）
２．６−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−ヘキサン酸２の合成
２
（ピリミジン−２−スルファニル）−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル１ｇ（３．７４ｍＭｏｌ）をＤＭＦ５０ｍｌに溶解した。そして、６−アミノヘキサン酸０．５ｇ（３．７５ｍＭ）及びトリエチルアミン１．０５ｍｌ（７．５ｍＭｏｌ）をこの溶液に加えた後、反応混合物を一晩攪拌した。溶媒を除去した後、その生成物を水５０ｍｌに溶解し、２ＮのＮａＯＨで溶液のｐＨをｐＨ９．５となるように調整した。そして、その水溶液をＣＨ２Ｃｌ２で５回洗浄し、２ＮのＨＣｌで溶液の塩基度をｐＨ８となるように調整した。次に、混合物を活性炭素で処理して濾過し、２ＮのＨＣｌで濾過液のｐＨをｐＨ２となるように調整した後、溶液を蒸発させた。得られた残留物を少量の冷水で処理し、ペースト化した。そして、ペーストを濾過し、水とアセトンで洗浄した。
収量：０．１７ｇ（１６％）
ＲＦ＝０．４０（アセトン／メタノール／水／ジクロロメタン／酢酸エチル／酢酸 ９：２：２：６：２：１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）d １．２０−１．４５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２），２．１８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２−ＣＯ），３．０６（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），３．８１（ｓ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２），７．２２（ｔ，１Ｈ，ｐｙｒ５−ＣＨ），８．１０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６４（ｄ，２Ｈ，ｐｙｒ４，６−ＣＨ）
３．６−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−ヘキサン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル３の合成
３
６−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル−アセチルアミノ］−ヘキサン酸（２）０．１７ｇ（０．６ｍＭｏｌ）をジクロロメタン５ｍｌ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド６９ｍｇ（０．６ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド１２４ｍｇ（０．６ｍＭｏｌ）に加えた。この反応混合物を室温で１６時間攪拌した。溶液を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。得られた残留物をジクロロメタン２５ｍｌに溶解した後、酢酸エチルを用いて生成物をクロマトグラフィー（フロリジル）で精製した。そして、ジイソプロピルエーテルから化合物を再結晶した。
収量：０．１９ｇ（８２％）
ＲＦ＝０．２３（酢酸エチル）
Ｍｐ：１０３−１０５℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）d １．２０−１．４５（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２），２．６６（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２−ＣＯ），２．８３（ｓ，４Ｈ，Ｏ−Ｓｕ），３．０６（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），３．８６（ｓ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２），７．２２（ｔ，１Ｈ，ｐｙｒ５−ＣＨ），８．０８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．６１（ｄ，２Ｈ，ｐｙｒ４，６−ＣＨ）
（実施例２）
＜３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（８）の合成＞
５のステップにより、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（８）を合成した。
１．（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸−ｔブチルエステル（４）の合成
ブロモ酢酸−ｔブチルエステル（ｃ）１５．１ｍｌ（１０２ｍＭｏｌ）及び２，６−ジメチル−ピペリジン（ｂ）３０ｍｌ（２３４ｍＭｏｌ）を、ＴＨＦ１５０ｍｌ中で５時間、還流攪拌した。溶媒を除去した後、生成物を水に溶解し、２ＮのＮａＯＨで溶液のｐＨをｐＨ１１．５となるように調整した。酢酸エチルを用いて不均一な反応混合物を抽出し、水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を蒸発させた後、シリカゲルカラムから残留物をジイソプロピルエーテルを用いて溶出させた。
収量：２３ｇ（＞９９％）
ＲＦ＝０．５８（ジイソプロピルエーテル）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）d １．０９（ｄ，６Ｈ，Ｎ−Ｃ−ＣＨ３），１．１６−１．６７（ｍ，６Ｈ，ｐｉｐ３，４，５−ＣＨ２）；１．４３（ｓ，９Ｈ，ｔ−Ｂｕ）；２．８１（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ）；３．４５（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２）
２．（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸塩酸塩（５）の合成
５
（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸−ｔブチルエステル（４）２３ｇ（０．１Ｍｏｌ）を１２ＮのＨＣｌ２５ｍｌ（３００ｍＭｏｌ）と共に水１００ｍｌ中で２時間、６０℃で攪拌した。水と過剰ＨＣｌを真空中で蒸留した後、得られた残留物を共沸的にトルエンで乾燥した。
収量：２１．０３ｇ（＞９９％）
ＲＦ＝０．１８（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ＝５：１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）d １．１−１．３８（ｍ，６Ｈ，Ｎ−Ｃ−ＣＨ３）；１．４−１．９（ｍ，６Ｈ，ｐｉｐ３，４，５−ＣＨ２）；３．３５−３．６５（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ）；４．０５（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２）；９．０５（ｂｒ．ｓ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）；１０．８５（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）
３．（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（６）の合成
６
ＤＭＦ１００ｍｌ中の（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸塩酸塩（５）１２．６０ｇ（６０ｍＭｏｌ）をＮ−ヒドロキシスクシンイミド７．０２ｇ（６０ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド１２．５８ｇ（６０ｍＭｏｌ）に加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間攪拌した後、残留物を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。残留物をＣＨ２Ｃｌ２３００ｍｌに溶解した後、ＮａＨＣＯ３でこの溶液を洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥して溶媒を蒸発させた。そして、ジイソプロピルエーテル（活性炭）から化合物を再結晶した。
収量：１２．６１ｇ（７７％）
Ｍｐ：７３℃
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）d １．１４（ｄ，６Ｈ，Ｎ−Ｃ−ＣＨ３），１．１８−１，７（ｍ，６Ｈ，ｐｉｐ３，４，５−ＣＨ２）；２．７５−２．８５（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ）；２．８２（ｓ，４Ｈ，Ｏ−Ｓｕ）；３．９（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２）
４．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸（７）の合成
７
５０ｍｌＤＭＦ中の（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（６）２．６８ｇ（１０ｍＭｏｌ）を３−アミノプロパン酸０．９ｇ（１０ｍＭｏｌ）及びトリエチルアミン２．０２ｇ（２０ｍＭｏｌ）に加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間攪拌し、溶液を蒸発させ、水に蒸留物を溶解させ、２ＮのＨＣＬで溶液のｐＨをｐＨ３となるように調整した。ＸＡＤ−１６で不均一な反応混合物を精製し、溶媒を蒸発させた後に、水分離器を用いてトルエンで残留物を乾燥した。
収量：４．９８ｇ（＞９９％）
ＲＦ＝始点位置（メタノール／ジクロロメタン１：１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）d １．１４（ｄ，６Ｈ，Ｎ−Ｃ−ＣＨ３），１．１８−１，７（ｍ，６Ｈ，ｐｉｐ３，４，５−ＣＨ２）；２．１８（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２−ＣＯ）；２．７５−２．８５（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ）；３．９０（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２）
５．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（８）の合成
８
ＤＭＦ５０ｍｌ中の３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸（７）４．９８ｇ（１０ｍＭｏｌ）を、Ｎ−ヒドロキシスクシンアミド１．１５ｇ（６０ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド４．１２ｇ（６０ｍＭｏｌ）に加えた。この反応混合物を室温で１６時間攪拌し、ＣＨ２Ｃｌ２１００ｍｌで混合物を希釈した後、溶液を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。得られた残留物を酢酸エチル３０ｍｌに溶解した後、溶液を洗浄して濾過し、溶媒を蒸発させた。酢酸エチルを用いて生成物をクロマトグラフィー（フロリジル、２７ｍｍ×３２０ｍｍ）で精製した。
収量：３ｇ（８８％）
ＲＦ＝０．３（酢酸エチル）
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）d ０．９８（ｄ，６Ｈ，Ｎ−Ｃ−ＣＨ３），１．１５−１．６３（ｍ，６Ｈ，ｐｉｐ３，４，５−ＣＨ２）；２．４２（ｂｒ．ｓ，２Ｈ，ＣＨ２−ＣＯ）；２．８５（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ）；２．８１（ｓ，４Ｈ，Ｏ−Ｓｕ）；２．９９（ｍ，２Ｈ，ＮＨ−ＣＨ２）；３．４４（ｓ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２）；７．９４（ｔ，１Ｈ，Ｎ−Ｈ）
（実施例３）
＜３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステルの合成＞
３のステップにより、３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステルを合成した。
１．（ピリミジン−２−イルスルファニル）−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（９）の合成
９
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１２．３１ｇ（１０７ｍＭｏｌ）及びジシクロへキシルカルボジイミド２２．７０ｇ（１１０ｍＭｏｌ）を、ＤＭＦ２００ｍｌに溶解した（ピリミジン−２−イルスルファニル）−酢酸（ａ）１８．２７ｇ（１０７ｍＭｏｌ）の溶液に、−３５℃で加えた。この反応混合物をアルゴン下で１６時間攪拌し、得られた残留物を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。残った生成物を還流して酢酸エチル４００ｍｌに溶解し、この熱溶液を濾過した。酢酸エチルを用いて、混合物をクロマトグラフィー（フロリジル）で精製した。そして、酢酸エチルから化合物を再結晶した。
収量：４．９０ｇ（１７％）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）d ２．８０（ｓ，４Ｈ，Ｏ−Ｓｕ），４．４１（ｓ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２），７．２８（ｔ，１Ｈ，ｐｙｒ５−ＣＨ），８．６５（ｄ，２Ｈ，ｐｙｒ４，６−ＣＨ）
２．３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸（１０）の合成
１０
（ピリミジン−２−イルスルファニル）−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（９）２．６８ｇ（１０ｍＭｏｌ）をＤＭＦ５０ｍｌに溶解した。３−アミノプロパン酸（ｅ）０．９０ｇ（１０ｍＭｏｌ）及びトリエチルアミン２．７８ｍｌ（２０ｍＭｏｌ）をこの溶液に加えた後、反応混合物を室温で一晩攪拌した。溶媒を除去した後、生成物を水１００ｍｌに溶解し、２ＮのＮａＯＨを用いて溶液のｐＨがｐＨ１０となるように調整した。そして、水溶液をＣＨ２Ｃｌ２を用いて５回洗浄し、混合物を活性炭で処理して濾過し、２ＮのＨＣｌを用いて濾過液のｐＨがｐＨ３となるように調整した。この溶液を再度濾過し、ＸＡＤ−１６で濾過液を精製した。そして、アセトンから化合物を再結晶した。
収量：０．６４ｇ（２６．５％）
ＲＦ＝始点位置（酢酸エチル）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）d ２．２３（ｔ，２Ｈ，ＣＨ２−ＣＯ），３．４２（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），３．８６（ｓ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２），７．２３（ｔ，１Ｈ，ｐｙｒ５−ＣＨ），８．３１（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），８．６０（ｄ，２Ｈ，ｐｙｒ４，６−ＣＨ）
３．３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（１１）の合成
１１
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド０．３０５ｇ（２．６５ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロへキシル−カルボジイミド０．５４７ｇ（２．６５ｍＭｏｌ）を、ＣＨ２Ｃｌ２１０ｍｌ中の３−［２−ピリミジン−２−イルスルファニル］−アセチルアミノ］−プロパン酸（１０）０．６４ｇ（２．６５ｍＭｏｌ）に加えた。この反応混合物を室温で１６時間攪拌し、得られた残留物を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。残留物をジクロロメタンに溶解した後、酢酸エチルを用いて生成物をクロマトグラフィー（フロリジル）で精製した。溶出液の溶媒を蒸発させた後、残留物を還流して酢酸エチルに溶解させ、活性炭で精製した。熱溶液を濾過し、溶媒を蒸発させた。残留物を少量の低温酢酸エチルで処理し、ペースト化した。ペーストを濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。
収量：０．５０ｇ（５６％）
ＲＦ＝０．２８（酢酸エチル／メタノール５：１）
１Ｈ−ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）d ２．８４（ｍ，６Ｈ，ＣＨ２−ＣＯ，Ｏ−Ｓｕ），３．３９（ｍ，２Ｈ，Ｎ−ＣＨ２），３．８８（ｓ，２Ｈ，Ｓ−ＣＨ２），７．２２（ｔ，１Ｈ，ｐｙｒ５−ＣＨ），８．３１（ｔ，１Ｈ，ＮＨ），８．６２（ｄ，２Ｈ，ｐｙｒ４，６−ＣＨ）
（実施例４）
＜３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステルの合成＞
６のステップにより、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステルを合成した。
１．ブロモ−２−１３Ｃ−酢酸−ベンジル−エステル１２の合成
１２
ジクロロメタン１５０ｍｌに溶解したベンジルアルコール（ｇ）４．２２ｇ（３９ｍＭｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド８．５０ｇ（３９ｍＭｏｌ）及び４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．４０ｇに、ブロモ−２−１３Ｃ−酢酸（ｅ）５ｇ（３４．４７ｍＭｏｌ）を加えた。この反応混合物を室温で一晩攪拌し、残留物を濾過し、濾過液を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄した。ジクロロメタンで水層を３回抽出し、混合した有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥して、溶媒を真空中で蒸発させた。溶離剤としてジクロロメタンを用いて、生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：７．３７ｇ（９１％）
ＲＦ＝０．５（ＣＨ２Ｃｌ２）
２．（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−酢酸−ベンジルエステル１３の合成
１３
ＴＨＦ１５０ｍｌ中で、ブロモ−２−１３Ｃ−酢酸−ベンジルエステル（１２）７．３７ｇ（３２ｍＭｏｌ）及び２，６−ジメチル−ピペリジン（ｂ）９ｍｌ（７０ｍＭｏｌ）を、５時間、還流攪拌した。溶媒を蒸発させた後、水１５０ｍｌと酢酸エチル１５０ｍｌの乳濁液に生成物を溶解し、２ＮのＮａＯＨを用いて水層のｐＨをｐＨ１１．６となるように調整した。層を分離した後、酢酸エチルで水層を３回抽出し、有機相を混合し、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄して、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、溶離剤としてジイソプロピルエーテルを用いて、残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：８．３２ｇ（＞９９％）
ＲＦ＝０．３（（ｉＰｒ）２）
３．（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−酢酸１４の合成
１４
（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−酢酸−ベンジルエステル（１３）８．３２ｇ（３２ｍＭｏｌ）をメタノール１００ｍｌに溶解した。０．５ｇＰｄ／Ｃ（５％）をこの溶液に加え、水素７３０ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させ、得られた残留物を少量の低温ジイソプロピルエーテルで処理し、ペースト化した。溶媒を濾過除去し、生成物を真空中で乾燥した。
収量：５．２８ｇ（９６％）
ＲＦ＝０．１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ ５：１）
４．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−アセチルアミノ］−プロパン酸−ベンジルエステル１５の合成
１５
５０ｍｌＤＭＦに溶解した１−ヒドロキシベンゾトリアゾール９．４０ｇ（６１．２ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド１２．６２ｇ（６１，２ｍＭｏｌ）の混合物に、（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸（１４）５．２８ｇ（３０．６ｍＭｏｌ）を加えた。３０分室温で攪拌した後、３−アミノプロパン酸ベンジルエステル１０．７５ｇ（３０．６ｍＭｏｌ）及びトリエチルアミン６．１８ｇ（６１，２ｍＭｏｌ）をこの反応混合物に加え、一晩室温で攪拌した。溶媒を蒸発させ、得られた残留物を酢酸エチル２００ｍｌに溶解し、溶液を濾過し、濾過液を１ＮのＮａＯＨ溶液８０ｍｌで３回、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗浄した。ＭｇＳＯ４で有機相を乾燥させ、溶媒を蒸発させた。酢酸エチルを用いて残留物を第１のフラッシュクロマトグラフィーで精製し、溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ ５０：１を用いて生成物を第２のフラッシュクロマトグラフィーで溶出させた。
収量：９．０７ｇ（８９％）
ＲＦ＝０．４７（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ １０：１）
５．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−アセチルアミノ］−プロパン酸１６の合成
１６
３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−アセチルアミノ］−プロパン酸ベンジルエステル（１５）９．０７ｇ（２７，２０ｍＭｏｌ）をメタノール２００ｍｌに溶解した。０．５ｇＰｄ／Ｃ（５％）を溶液に加え、水素６４０ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。反応混合液を濾過し、溶媒を蒸発させた。
収量：６．８０ｇ（＞９９％）
ＲＦ＝０．１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ ５：１）
６．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル１７の合成
１７
３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−２−１３Ｃ−アセチルアミノ］−プロパン酸（１６）４．９８ｇ（１０ｍＭｏｌ）を、ジクロロメタン２００ｍｌに溶解したＮ−ヒドロキシスクシンアミド３．２２ｇ（２８ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド５．７８ｇ（２８ｍＭｏｌ）に加えた。反応混合物を１６時間室温で攪拌し、溶液を濾過して、濾過液を真空中で蒸発させ乾燥した。生成物をジイソプロピルエーテルで洗浄した。
収量：８ｇ（８４％）
Ｍｐ＝１０８−１０９℃
（実施例５）
＜３−［２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル］アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル７の合成＞
７のステップにより、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル７を合成した。
１．ブロモ酢酸−ベンジルエステル１８の合成
１８
ジクロロメタン１５０ｍｌに溶解したベンジルアルコール（ｆ）４．２２ｇ（３９ｍＭｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド８．５０ｇ（３９ｍＭｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン０．４０ｇに、ブロモ酢酸（ｈ）５ｇ（３４，４７ｍＭｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、得られた残留物を濾過して、濾過液を飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄した。水層をジクロロメタンで３回抽出し、混合した有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥して、溶媒を真空中で蒸発させ、乾燥した。溶離剤としてジクロロメタンを用いて、生成物をフラッシュクラマトグラフィーで精製した。
収量：７．４５ｇ（９２％）
ＲＦ＝０．５（ＣＨ２Ｃｌ２）
２．（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸−ベンジルエステル１９の合成
１９
ブロモ酢酸−ベンジルエステル（１８）７．３９ｇ（３２ｍＭｏｌ）及び２，６−ジメチル−ピペリジン（ｂ）９ｍｌ（７０ｍＭｏｌ）をＴＨＦ１５０ｍｌ中で、５時間、還流攪拌した。溶媒を蒸発させた後、生成物を水１５０ｍｌと酢酸エチル１５０ｍｌの乳濁液に溶解し、２ＮのＮａＯＨ１６．５ｍｌを用いて水層のｐＨがｐＨ１１．６となるように調整した。層を分離した後、酢酸エチルで水層を３回抽出し、有機層を混合し、飽和ＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、溶離剤としてジイソプロピルエーテルを用いて残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：８ｇ（９５％）
ＲＦ＝０．３（（ｉＰｒ）２Ｏ）
３．（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸２０の合成
２０
（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸−ベンジルエステル（１９）８ｇ（３１ｍＭｏｌ）をメタノール１００ｍｌに溶解した。０．５ｇＰｄ／Ｃ（５％）を溶液に加え、水素７２５ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発し、残留物を少量の低温ジイソプロピルエーテルで洗浄して、ペースト化した。溶媒を濾過除去し、生成物を真空中で乾燥した。
収量：５ｇ（９４％）
ＲＦ＝０．１（ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ ５：１）
Ｆｐ＝１７９−１８０℃
４．３−１５Ｎ−アミノプロパン酸ベンジルエステルヒドロ−ｐ−トシレート２１の合成
２１
水分離器を用いて、トルエン２０ｍｌ中でｐ−トルエンスルフォン酸３．１３ｇ（１６．５ｍＭｏｌ）を１時間加熱し、還流した。ベンジルアルコール６．６ｍｌ（６３．４ｍＭｏｌ）及び３−１５Ｎ−アミノプロパン酸１．５ｇ（１６．５ｍＭｏｌ）を冷却した混合物に加えた。反応混合物を更に１時間加熱し、還流した。ジイソプロピルエーテル９０ｍｌを冷却した溶液に加えた。溶液を−２０℃で一晩放置した後、沈殿物を濾過し、ジイソプロピルエーテルで洗浄した。
収量：４．６８ｇ（８１％）
Ｍｐ＝１２２−１２５℃
５．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸ベンジルエステル２２の合成
２２
ＤＭＦ１００ｍｌに溶解した１−ヒドロキシベンゾトリアゾール４．０８ｇ（２６．６６ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド５．５０ｇ（６１．２ｍＭｏｌ）の混合物に、（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸（２１）２．２８ｇ（１３．３３ｍＭｏｌ）を加えた。室温で３０分攪拌した後、３−１５Ｎ−アミノプロパン酸ベンジルエステル４．６８ｇ（１３．３３ｍＭｏｌ）及びトリエチルアミン３．６９ｍｌ（６６．６６ｍＭｏｌ）を反応混合物に加え、一晩室温で攪拌した。混合物を蒸発させ、残留物を酢酸エチル２００ｍｌに溶解し、溶液を濾過し、得られた濾過液を１Ｎ ＮａＯＨ溶液８０ｍｌで３回、飽和ＮａＣｌ溶液で一回洗浄した。そして、有機層をＭｇＳＯ４で乾燥して、溶媒を蒸発させた。酢酸エチルを用いて残留物を第１のフラッシュクロマトグラフィーで精製し、溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ ５０：１を用いて生成物をフラッシュクロマトグラフィーにおいて溶出させた。
収量：０．８７ｇ（２０％）
ＲＦ＝０．４７（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ １０：１）
６．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸２３の合成
２３
メタノール５０ｍｌに３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸ベンジルエステル（２２）０．８７ｇ（２．６０ｍＭｏｌ）を溶解した。０．１５ｇＰｄ／Ｃ（５％）を溶液に加え、水素５８ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。
収量：０．５９ｇ（＞９３％）
ＲＦ＝０．１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ ５：１）
７．３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル２４の合成
２４
ジクロロメタン２０ｍｌ中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド０．２８ｇ（２．４２ｍＭｏｌ）とＮ，Ｎ−ジシクロへキシルカルボジイミド０．５ｇ（２．４２ｍＭｏｌ）に３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸（２３）０．５９ｇ（２．４２ｍＭｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌して、溶液を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。ジイソプロピルエーテルから生成物を再結晶した。
収量：０．７ｇ（８５％）
Ｍｐ＝１０９−１１０℃
（実施例６）
＜３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル５の合成＞
４のステップにより、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル５を合成した。
１．２−アミノプロパン酸ベンジルエステルヒドロｐ−トシレート２５の合成
２５
トルエン１０ｍｌ中のｐ−トルエンスルフォン酸９．７（５１ｍＭｏｌ）とベンジルアルコール２０ｍｌ（１９３ｍＭｏｌ）に、２−アミノプロパン酸４．４５ｇ（５０ｍＭｏｌ）を加えた。水分離器を用いて、反応混合物を２時間加熱し還流した。ジクロロメタン３０ｍｌを冷却した反応混合物に加え、ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ ５０：１を用いて生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：８．５ｇ（４９％）
２．２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸ベンジルエステル２６の合成
２６
（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸（２０）３．１１ｇ（１５ｍＭｏｌ）を、ＤＭＦ５０ｍｌに溶解した１−ヒドロキシベンゾトリアゾール４．５９ｇ（３０ｍＭｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロへキシルカルボジイミド６．１９ｇ（３０ｍＭｏｌ）の混合物に加えた。室温で３０分攪拌した後、２−アミノプロパン酸ベンジルエステル（１）３．１１ｇ（１５ｍＭｏｌ）及びトリエチルアミン４．１５ｍｌ（３０ｍＭｏｌ）を反応混合物に加え、室温で一晩攪拌した。混合物を濾過して、溶液を蒸発させた。残留物を酢酸エチル２５０ｍｌに溶解し、溶液を０．５ＮのＮａＯＨ溶液で３回、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。溶離剤としてＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ ９５：５を用いて残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：３．９２ｇ（８０％）
ＲＦ＝０．７５（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ ５：１）
３．２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−プロパン酸２７の合成
２７
メタノール１５０ｍｌに２−［２−（２，６−ジメチルピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−プロパン酸ベンジルエステル（２６）８．３０ｇ（２５ｍＭｏｌ）を溶解した。０．５ｇＰｄ／Ｃ（５％）を溶液に加え、水素５６０ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。
収量：６．３（＞９９％）
ＲＦ＝０．１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ ５：１）
４．２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル２８の合成
２８
水分離器を用いて、ｐ−トルエンスルフォン酸４．７５ｇ（２５ｍＭｏｌ）を１時間加熱して還流した。溶媒を蒸発させた後、ジクロロメタン１００ｍｌに溶解した残留物に、２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−プロパン酸（２７）６．３０ｇ（２５ｍＭｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド２．８８ｇ（２５ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド５．１５ｇ（２５ｍＭｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌し、溶液を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。ジイソプロピルエーテルから生成物を再結晶した。
収量：１２ｇ（９３％）
Ｍｐ＝１０９−１１０℃
（実施例７）
＜［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル５の合成＞
３のステップにより、［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル５を合成した。

１．［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−酢酸ベンジルエステル２９の合成
２９
（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−酢酸（２０）７．６９ｇ（３７ｍＭｏｌ）を、１００ｍｌＤＭＦに溶解した１−ヒドロキシベンゾトリアゾール１１．３４ｇ（７４ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド１５．２７ｇ（７４ｍＭｏｌ）の混合物に加えた。３０分室温で攪拌した後、ＤＭＦ１００ｍｌに溶解した１２．５ｇ（３７ｍＭｏｌ）アミノ酢酸ベンジルエステル（１）及びトリエチルアミン１０．２５ｍｌ（７４ｍＭｏｌ）を反応混合物に加えて、室温で一晩攪拌した。混合物を濾過し、溶液を蒸発させた。残留物をジクロロメタン２５０ｍｌに溶解し、溶液を再度濾過して、蒸発させた。残留物を酢酸エチル１００ｍｌに溶解した後、溶液を０．５ＮのＮａＯＨ溶液２００ｍｌで３回、飽和ＮａＣｌ溶液で１回洗浄した。有機層をＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒を蒸発させた。溶離剤として酢酸エチルを用いて残留物を第１のフラッシュクロマトグラフィーで精製し、ＣＨ２Ｃｌ２：ＣＨ３ＯＨ １０：１を用いて第２のシリカゲルカラムから生成物を溶出させた。
収量：６．５４ｇ（５６％）
ＲＦ＝０．７７（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ ５：１）
２．［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−酢酸３０の合成
３０
メタノール１５０ｍｌに［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−酢酸ベンジルエステル（２９）６．５４ｇ（２０ｍＭｏｌ）を溶解した。０．５ｇＰｄ／Ｃ（５％）を溶液に加え、水素４７０ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。
収量：４．５４ｇ（＞９９％）
ＲＦ＝０．１（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ ５：１）
３．［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル３１の合成
３１
ジクロロメタン１５０ｍｌに溶解したＮ−ヒドロキシスクシンイミド２．３０ｇ（２０ｍＭｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド４．１２ｇ（２０ｍＭｏｌ）に［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）アセチルアミノ］酢酸（３０）４．５４ｇ（２０ｍＭｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間攪拌し、溶液を濾過して、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。残留物をジクロロメタン５０ｍｌに溶解して、炭で処理した。濾過した後、溶液を真空中で蒸発させ乾燥し、酢酸エチルから生成物を再結晶した。
収量：４．０３ｇ（６２％）
Ｍｐ＝１５０−１５１℃
（実施例８）
＜タンデム質量標識体とモデルトリプシンぺプチドの結合＞
―使用したモデルトリプシン消化ぺプチド―
ＶＡＴＶＳＬＰＲ ＭＷ： ８４２，０１
ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲ ＭＷ： １５９３，７５
ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ ＭＷ： ２２１１，４２
―試験した反応性質量標識体―
６［（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−ヘキサン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（Ｐｙｒｍ−Ｃ６−Ｏｓｕ）
３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−Ｏｓｕ）
３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−Ｏｓｕ）
２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−Ｏｓｕ）
―モデルペプチドへの一般的な結合反応プロトコル―
水３５μＬ及びｐＨ７．５−７．８のＢｏｒａｔ−Ｐｕｆｆｅｒ３７．５μＬ（４００ｍＭ）と水／ＡＣＮ（３：１比）に溶解したペプチド３７．５μＬ（７５０ｎＭｏｌ）を混合した。そして、このペプチド溶液に、ＤＭＦ４０μＬに溶解したＴＭＴ試薬（反応性質量標識体）（４０ｍＭ）を加えた。室温で３時間攪拌した後、ＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ−２５０ｍｍ／４，６ｍｍ−５μ Ｃ１８）を用いて反応混合物を精製し、標識したペプチドをＭＳで分析した。
図４は、モデルペプチド（ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ）と反応性質量標識体（３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル）を反応させ、標識したペプチド（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡ（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−）Ｋを形成することが３時間で完了することを示している。
図５は、モデルペプチド（ＶＡＴＶＳＬＰＲ）と反応性質量標識体（３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル）を反応させ、標識したペプチド（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲ）を形成することが３時間で完了することを示している。
図６は、モデルペプチド（ＶＡＴＶＳＬＰＲ）と反応性質量標識体（３−［２−（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル）を反応させ、標識したペプチド（Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲ）を形成することが３時間で完了することを示している。
図１６は、モデルペプチド（ＶＡＴＶＳＬＰＲ）と反応性質量標識体（２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル）を反応させ、標識したペプチド（ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲ）を形成することが１５分で完了することを示している。
（実施例９）
＜質量標識したペプチドのＭＳ／ＭＳ分析＞
―ＭＳ／ＭＳ実験のプロトコル―
ＱＴＯＦ２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社，マンチェスター、イギリス）でＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＣＡＰ−ＬＣ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社、 Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、アメリカ）（カラム：Ｄｉｏｎｅｘ社製のＰｅｐＭａｐ（登録商標） Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム、内径７５μｍ、全長１５０ｍｍ；溶媒：水９５％からアセトニトリル９５％、双方とも０．２％ギ酸を有する）でＨＰＬＣ分析を行った。
ペプチドをエレクトロスプレー源でイオン化し、ＴＭＴフラグメントのピーク強度を決定する際に、各ペプチドのスペクトルを合計し平滑化してイオン存在比を求めた。
図７から１３及び１７から２０は、ＴＭＴで標識したペプチド配列の二重又は三重荷電イオンのＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを示し、ＴＭＴはそれぞれＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲ、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲ、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡ（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ）−Ｋ、Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲ、Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲ、Ｐｙｒｍ−Ｃ６−ＶＡＴＶＳＬＰＲ、Ｐｙｒｍ−Ｃ６−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲ、ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲ、ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲ、ＤＭＰｉｐ−Ｇｌｙ−ＶＡＴＶＳＬＰＲ、ＤＭＰｉｐ−Ｇｌｙ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲである。各図において、第１の図は標識したペプチドに対応するＭＳモードＴＯＦスペクトルを示し、第２の図は所定の衝突エネルギーにおける標識したペプチドのＣＩＤスペクトルを示す。ＤＭＰｉｐ−Ｇｌｙ、ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａのｍ／ｚ１２６、Ｐｙｒｍ−βＡｌａ及びＰｙｒｍ−Ｃ６のｍ／ｚ１５３における期待タグフラグメント（ＴＭＴフラグメント）の存在を矢印によって示す。標識した各ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルのＳＥＱＵＥＳＴ分析結果も示す。
（実施例１０）
＜二重方式を用いた相対定量＞
５の異なるモデルトリプシンペプチドを用いて、配合比から相対定量を行った。試験したペプチドと比は以下の通りである。
５の異なるペプチド： ＦＳＷＧＡＥＧＥＲ
ＶＡＴＶＳＬＰＲ
ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡＫ
ＥＩＱＡＥＧＮＲ
ＤＩＡＩＨＨＰＷＩＲ
７の異なる比： ０：１００
１０：９０
２５：７５
５０：５０
７５：２５
９０：１０
１００：０
軽フラグメント及び重フラグメントとして用いたＴＭＴタグは以下のＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−Ｏｓｕである。
軽フラグメント
重フラグメント
ＴＭＴタグフラグメントのＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳデータは、上記５のペプチドの７の異なる期待比及び観察比の回帰直線と整合した。ＴＭＴで標識した対応ペプチドを分析した。タグフラグメントのイオンピークのＣ１３（重タグ（＝Ｈ）ｍ／ｚ１２７）及びＣ１２（軽タグ（＝Ｌ）ｍ／ｚ１２６）におけるピーク最大値を分析して、存在比を決定した。
（実施例１１）
＜同位体で標識した３−［２−（（２Ｓ、６Ｒ）−２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロパン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステルの合成＞
一般的な反応スキームは以下の通りである。
以下の表に示した同位体で標識した出発原料を用いて、６の同位体で標識した質量標識体（ＴＭＴ化合物）Ｉ−ＶＩの合成を一部又は全ての上記反応スキームで行った。
標識されていない市販のシス−２，６−ジメチルピペリジン８（上記反応スキームを参照）から直接、化合物Ｉ及びＩＩの合成を始めた。
化合物ＩＶの合成について、以下に詳細に説明する。
（ｉ）１，７−１３Ｃ２−ヘプタン二酸１の合成
窒素雰囲気下、乾燥テトラヒドロフラン５９０ｍｌにジイソプロピルアミン１２４ｍｌ（０．８８５ｍｍｏｌ）を加えた。−２０℃に冷却した後、ヘキサン中の１．６モル（ｍｏｌ／Ｌ）ｎ−ブチルリチウム（ＢｕＬｉ）５６０ｍｌを滴下した。温度を０℃まで上昇させてから、ＨＭＰＡ（ヘキサメチルホスホルアミド）７０ｍｌを加えた。０℃で１０分間攪拌した後、０℃で、最初に酢酸−１−１３Ｃ（ｂ）２３ｍｌ（０．３９６ｍｏｌ）を滴下し、その後ＨＭＰＡ１４０ｍｌを加えた。最初の１時間は０℃で、その後２時間は室温で溶液を攪拌した。０℃に冷却した後、１，３−ジブロモプロパン（ａ）２０．４ｍｌ（０．２ｍｏｌ）を加え、溶液を一晩室温で攪拌した。水８００ｍｌで希釈した後、有機相を分離し、ジエチルエーテル／水（２：１）及び水で抽出した。水性抽出物をプールし、ジエチルエーテルで洗浄し、濃縮塩酸でｐＨ３に酸性化し、塩化ナトリウムで飽和し、ジエチルエーテルで抽出した。エーテル抽出物を混合し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、溶離剤としてジイソプロピルを用いて生成オイルをフラッシュクロマトグラフィーで精製した。この反応は２回繰り返して行われ、それぞれ、０．２ｍｏｌ、０．１７４ｍｏｌの酢酸−１−１３Ｃ（ｂ）を用いた。
収量：３４．５（３７％）
ＲＦ＝０．６３（酢酸エステル／メタノール ５：１）
（ｉｉ）（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジブロモ−１，７−１３Ｃ２−ヘプタン二酸−ジメチルエステル２の合成
１，２−ジクロロエタン１５０ｍｌ中の塩化チオニル３４．８２ｍｌ（０．４７７ｍｏｌ）を１，２−ジクロロエタン４００ｍｌ中の１，７―１３Ｃ２−ヘプタン二酸３２．４ｇ（０．２ｍｏｌ）の懸濁液に加えた。１．５時間還流した後、１，２−ジクロロエタン１５０ｍｌを蒸留して、除去し、１，２−ジクロロメタン１５０ｍｌ中のブロミン２９．３５ｍｌ（０．５７６ｍｏｌ）を滴下した。更に１０時間還流した後、沸騰したメタノールに熱溶液を滴下した。得られた混合物を０．５時間還流して、溶媒を減圧除去した。残留物をジイソプロピルエーテル１５０ｍｌに溶解し、亜硫酸水素ナトリウム溶液、重炭酸ナトリウム溶液、飽和塩化ナトリウム溶液及び水で洗浄した。この溶液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧除去した。
収量：７０ｇ（＞９９％）
ＲＦ＝０．６３（ジクロロメタン）
（ｉｉｉ）（２Ｒ，６Ｓ）−１−ベンジル−ピペリジン−２，６−ジ−（１−１３Ｃ−カルボン酸）ジメチルエステル３の合成
トルエン２５０ｍｌ中のベンジルアミン７６．５ｍｌ（０．７２２ｍｏｌ）の溶液を加熱して還流し、トルエン１５０ｍｌ中の（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジブロモ−１，７−１３Ｃ２−ヘプタン二酸ジメチルエステル（２）７０ｇ（０．２ｍｏｌ）を滴下した。５時間還流した後、溶媒を減圧除去した。残留物をジイソプロピルエーテル／飽和重炭酸ナトリウム溶液（１：１）２０００ｍｌに溶解し、エーテル相を分離した。水層をジイソプロピルエーテルで抽出し、混合したエーテル抽出物を塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウム溶液で乾燥し、濾過し、溶媒を減圧除去した。ジイソプロピルエーテル／ヘキサン（１：３）を用いて残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：２５．５ｇ（４３．５％）
ＲＦ＝０．５３（ジイソプロピルエーテル）
（ｉｖ）（（２Ｒ，６Ｓ）−１−ベンジル−６−ヒドロキシ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−２−イル）−１３Ｃ−メタノール４の合成
窒素下、乾燥ジエチルエーテル６００ｍｌ中の水酸化アルミニウムリチウム５．６ｇ（０．１４８ｍｏｌ）の溶液に、乾燥ジエチルエーテル２００ｍｌ中の（２Ｒ，６Ｓ）−１−ベンジル−ピペリジン−２，６−ジ−（１−１３Ｃ−カルボン酸）ジメチルエステル（３）２５．５ｇ（８７ｍｍｏｌ）を加えた。１時間還流した後、水５．６ｍｌ、１５％水酸化ナトリウム溶液５．６ｍｌ、水１６．８ｍｌを順に加え、その混合物を室温で２時間攪拌した。そして、懸濁液を濾過し、ジエチルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧除去した。溶離剤として酢酸エチル／メタノール（５：１）を用いて残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：２０ｇ（９９％）
ＲＦ＝０．３８（酢酸エチル／メタノール ５：１）
（ｖ）（（２Ｓ，６Ｒ）−６−ヒドロキシ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−２−イル）−１３Ｃ−メタノール５の合成
メタノール２５０ｍｌ中の（（２Ｒ，６Ｓ）−１−ベンジル−６−ヒドロキシ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−２−イル）−１３Ｃ−メタノール（４）２０ｇ（８７ｍｍｏｌ）の溶液に、パラジウム／チャコール（ｐａｌｌａｄｉｕｍ−ｏｎ−ｃｈａｒｃｏａｌ）（Ｐｄ／Ｃ）（５％）１ｇを加えた。水素１８００ｍｌを用いて、常圧下、室温で水素添加を行った。溶液を濾過し、溶媒を減圧除去した。残留物をジクロロメタンに溶解して濾過助剤により取り除き、溶媒を減圧除去した。
収量：１１．１４ｇ（８７％）
ＲＦ＝０．０６（エチル酢酸／メタノール ５：１）
（ｖｉ）（２Ｒ，６Ｒ）−２，６−ジ−（（トルエン−４−スルフォニル）−オキシ−１３Ｃ−メチル）−ピペリジン−１−イル−トルエンスルフォんアミド６の合成
ジクロロメタン３００ｍｌ中の（（２Ｓ，６Ｒ）−６−ヒドロキシ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−２−イル）−１３Ｃ−メタノール（５）１１．１４ｇ（７６．７２ｍｍｏｌ）の溶液に、ジクロロメタン２５０ｍｌ中のトリエチルアミン３２ｍｌ（２３１．６ｍｍｏｌ）及びジクロロメタン２５０ｍｌ中の４−塩化トルエンスルフォニル４４．１６ｇ（２３１．６ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた溶液を０℃で３時間、更に室温で５日間攪拌した。反応混合物を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。溶離剤として酢酸エチル／ヘキサン（１：１）を用いて残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：１１．５ｇ（２５％）
ＲＦ＝０．４１（ヘキサン／酢酸エチル６：４）
（vii）（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−１−（トルエン−４−スルフォニル）−ピペリジン７の合成
テトラヒドロフラン５０ｍｌ中の水酸化アルミニウムリチウム７ｇ（０．１８４）の溶液にテトラヒドロフラン５０ｍｌ中の（２Ｒ，６Ｒ）−２，６−ジ−（（トルエン−４−スルフォニル）−オキシ−１３Ｃ−メチル）−ピペリジン−１−イル−トルエンスルフォンアミド（６）１１．５ｇ（１８．９ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた溶液を４時間還流した。この反応混合物をジエチルエーテル３００ｍｌ及び水７ｍｌで希釈し、１５％水酸化ナトリウム溶液７ｍｌ及び水２１ｍｌを順に加えた。懸濁液を氷上で１時間攪拌し、濾過し、酢酸エチル及びジクロロメタンで洗浄し、溶媒を減圧除去した。溶離剤としてジイソプロピルエーテル／ヘキサン（１：１）を用いて残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：３．４ｇ（６７％）
ＲＦ＝０．８３（ジイソプロピルエーテル）
（viii）（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン８の合成
窒素下で、１，２−ジメトキシエタン１７０ｍｌ中のナフタレン１０．５４ｇ（７２ｍｍｏｌ）及びナトリウム１．８７ｇ（７２ｍｍｏｌ）の溶液を一晩攪拌し、（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−１−（トルエン−４−スルフォニル）−ピペリジン（７）３．４ｇ（１２．６ｍｍｏｌ）を加えた。更に２時間攪拌し、ジエチルエーテル中の１モルの塩酸１００ｍｌを加え、溶媒を減圧除去した。残留物を水５０ｍｌで懸濁し、ジイソプロピルエーテルで洗浄し、溶媒を減圧除去した。残留物を２モルの水酸化ナトリウム溶液３０ｍｌに溶解し、塩化ナトリウムで飽和して、酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル抽出物を混合し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ジエチルエーテル中の１モルの塩酸３０ｍｌで希釈し、溶媒を減圧除去した。
収量：１．７５ｇ（９１．６％）（塩化物）
（ix）ブロモ−１３Ｃ２−酢酸−ベンジル−エステル９の合成
ジクロロメタン５００ｍｌ中のブロモ−１３Ｃ２−酢酸（ｃ）２０ｇ（０．１４ｍｍｏｌ）の溶液に、ベンジルアルコール（ｄ）１６．２ｍｌ（０．１５７ｍｏｌ）、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン１ｇ及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド３２．２ｇ（０．１５６ｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で一晩攪拌し、残留物を濾過し、濾過液を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。ジクロロメタンで水層を３回抽出し、混合した有機相を塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を真空中で蒸発させた。溶離剤としてジクロロメタン／ヘキサン（１：１）を用いて生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：２８．２ｇ（８７％）
ＲＦ＝０．６７（ジクロロメタン）
（ｘ）（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−酢酸ベンジルエステル１０の合成
水２ｍｌ中の水酸化ナトリウム０．２２２ｇ（５．５５ｍｍｏｌ）の溶液中で、塩化物として（２Ｒ，６Ｓ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン（８）０．８５ｇ（５．６ｍｍｏｌ）を５分攪拌し、テトラヒドロフラン５０ｍｌ及びブロモ−１３Ｃ２−酢酸−ベンジルエステル（９）０．８ｇ（３．５ｍｍｏｌ）を加えた。５時間還流した後、溶媒を減圧除去した。残留物をジイソプロピルエーテルに溶解し、重炭素ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。溶離剤としてジイソプロピルエーテル／ヘキサン（１：１）を用いて残留物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。
収量：０．６１ｇ（８２％）
ＲＦ＝０．５（ジイソプロピルエーテル）
（ｘｉ）（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−酢酸１１の合成
メタノール２５ｍｌに（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２―酢酸ベンジルエステル（１０）０．６１ｇ（２．３ｍｍｏｌ）を溶解した。パラジウム／チャコール（ｐａｌｌａｄｉｕｍ ｏｎ ｃｈａｒｃｏａｌ）（５％）０．１ｇを溶液に加え、水素５５ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。得られた反応混合物を濾過し、溶媒を減圧除去した。
収量：０．３７ｇ（９２．５％）
ＲＦ＝０．０５（ジイソプロピルエーテル）
（ｘｉｉ）３−１５Ｎ−アミノ−プロパン酸ベンジルエステル１２の合成
１２０ｍｌトルエン中のβ−アラニン−１５Ｎ１．４ｇ（１５．５５ｍｍｏｌ）、４−トルエンスルホン酸３．１８ｇ及びベンジルアルコール１３．１４ｍｌ（１２７ｍｍｏｌ）の溶液を４時間還流した。室温まで冷却した後、溶液をジソイソプロピルエーテル７５ｍｌで希釈し、４℃で一晩放置し、沈殿物を濾過し、ジソイソプロピルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥した。
収量：５．３２ｇ（９７．５％）（トシル酸塩）
（ｘｉｉｉ）３−［２−（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロピオン酸ベンジルエステル１３の合成
ジメチルホルムアミド２５ｍｌに（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−酢酸（１１）０．３７ｇ（２．１ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール０．６４ｇ（４．１８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド０．８７ｇ（４．２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン０．５８ｍｌ（４．２ｍｍｏｌ）を溶解した。室温で３０分攪拌した後、トシル酸塩として３−１５Ｎ−アミノ−プロパン酸ベンジルエステル（１２）０．７８ｇ（２．２１ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン０．５８ｍｌ（４．２ｍｍｏｌ）を得られた反応混合物に加え、室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチル２００ｍｌに溶解し、得られた溶液を濾過し、濾過液を１モルの水酸化ナトリウム溶液及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を蒸発させた。酢酸エチルを用いて残留物を第１のフラッシュクロマトグラフィーで精製し、溶離剤としてジクロロメタン／メタノール５０：１を用いて生成物を第２のフラッシュクロマトグラフィーで溶出した。
収量：０．６９ｇ（９７％）
ＲＦ＝０．５６（ジクロロメタン／メタノール １０：１）
（ｘｉｖ）３−［２−（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸１４の合成
メタノール２０ｍｌに３−［２−（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸ベンジルエステル（１２）０．６９ｇ（２ｍＭｏｌ）を溶解した。パラジウム／チャコール（ｐａｌｌａｄｉｕｍ ｏｎ ｃｈａｒｃｏａｌ）（５％）０．５ｇを溶液に加え、水素５０ｍｌを用いて、常圧下、室温で３０分水素添加を行った。得られた反応混合物を濾過し、溶媒を蒸発させた。
収量：０．４ｇ（８１％）
ＲＦ＝０．０５（酢酸エチル／メタノール ５：１）
（ｘｖ）３−［２−（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イルエステル１５の合成
ジクロロメタン１０ｍｌに溶解したＮ−ヒドロキシスクシンイミド１７０．５ｍｇ（１．４８ｍｍｏｌ）及びＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド３０５．４ｍｇ（１．４８ｍｍｏｌ）に３−［２−（（２Ｓ，６Ｒ）−２，６−ジ−１３Ｃ−メチル−ピペリジン−１−イル）−１３Ｃ２−アセチル−１５Ｎ−アミノ］−プロパン酸（１３）０．３９ｇ（１．５５ｍｍｏｌ）を加えた。得られた反応混合物を室温で１６時間攪拌した。溶液を濾過し、濾過液を真空中で蒸発させ、乾燥した。生成物をジイソプロピルエーテルで洗浄した。
収量：４５０ｍｇ（８４％）
Ｍｐ＝１０８−１０９℃
（実施例１２）
複雑な生物試料に用いる二重質量標識体（ＴＭＴ）方式の量的性質の評価を以下のスパイク実験で行った。
８のタンパク質の混合物から得た質量標識（ＴＭＴ）されたペプチドを出発原料として複雑な生物試料にスパイクした。この試料は、酵母菌の合計溶解物試料から得た、タンパク質消化物のＳＣＸ画分である。
タンパク質の混合物は、等モル量（１ｎｍｏｌ）のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３Ｐ＿ＲＡＢＩＴ）、リゾチーム（ＬＹＣ＿ＣＨＩＣＫ）、ミオグロビン（ＭＹＧ＿ＨＯＲＳＥ）、β−ガラクトシダーゼ（ＢＧＡＬ＿ＥＣＯＬＩ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨＡ＿ＲＡＢＩＴ）、ホスホリラーゼｂ（ＰＨＳ２＿ＲＡＢＩＴ）、ピルビン酸キナーゼ（ＫＰＹＭ＿ＲＡＢＩＴ）及びＢＳＡ（ＡＬＢＵ＿ＢＯＶＩＮ）からなり、これらはすべてＳｉｇｍａ社（Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）から購入した。タンパク質の混合物は所定比の二重方式で標識した。所定比は、Ｇ３Ｐ＿ＲＡＢＩＴは１：１、ＭＹＧ＿ＨＯＲＳＥは１：１、ＰＨＳ２＿ＲＡＢＩＴは１：３、ＬＹＣ＿ＣＨＩＣＫは１：１、ＢＧＡＬ＿ＥＣＯＬＩは３：１、ＫＰＹＭ＿ＲＡＢＩＴは２：１、ＡＬＢＵ＿ＢＯＶＩＮは１：２、ＬＤＨＡ＿ＲＡＢＩＴは１：１である。質量（ＴＭＴ）標識を次のようにして行った。概略すると、得られた２の配合したタンパク質の試料を５０ｍＭのＢｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ及びｐＨ７．５の１％ＳＤＳに溶解し、Ｃｙｓ残基を１ｍＭのトリス［２−カルボキシエチルホスフィン］（ＴＣＥＰ）及び７．５ｍＭのヨードアセタミド（ＩＡＡ）で還元してアルキル化した。そして、２のタンパク質の混合物をトリプシンで消化（ｐＨ７．８、３７℃、２０時間、ＳＤＳ＜０．１％）し、プールして、本発明によるジメチルピペリジン（ＤＭＰ）二重タグで質量（ＴＭＴ）標識（２０ｍＭ、３時間、ｐＨ７．５）した。
そして、Ｎ−ヒドロキシルアミン（０．２５％ＮＨ２ＯＨ、３０分）で試料を処理した。
１：１の割合で、質量標識体（ＴＭＴ）二重方式を酵母菌の合計溶解物画分に用いた。人工タンパク質混合物と同様に、２の酵母菌等量画分（双方とも５００μｇ）を質量（ＴＭＴ）標識した。
２の試料を質量（ＴＭＴ）標識した後、得られた２の質量（ＴＭＴ）標識したペプチド混合物を最初にＣ１８ガードカラムで精製し、次にＳＣＸクロマトグラフィーを用いて分画した。ＳｕｎＦｉｒｅ Ｃ１８ガードカラム（４，６ｘ２０ｍｍ、５μｍ、Ｗａｔｅｒｓ社、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）で、２のペプチド画分の精製と脱塩を段階的な勾配（８ｍＬ／分）を用いて行った。この勾配の順は、１００％バッファーＡ（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ／ＴＦＡ：９９．８／０．１／０．１）で３分間、５０％バッファーＡ及び５０％バッファーＢ（ＡＣＮ／Ｈ２０／ＴＦＡ：９９．８／０．１／０．１）で６分間、１００％バッファーＢで８分間行った。そして、酵母菌試料に由来する質量（ＴＭＴ）標識したペプチド混合物及びペプチド混合物を、ポリスルフォエチルＡカラム（４．６ｘ１００ｍｍ、５μｍ、２００Ａ、ＰｏｌｙＬＣ社製、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、メリーランド州、ＵＳＡ）を用いて、ＳＣＸ（強陽イオン交換）クロマトグラフィーで分画した。ペプチドを順に２の直線勾配において溶出させ、一方は０−２５０ｍＭのＫＣｌ（２５％ ｖ／ｖ ＡＣＮ、５ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３）から始めて２０分以上行い、続けて２５０から５００ｍＭのＫＣｌ（２５％ ｖ／ｖ ＡＣＮ、５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ３）を１０分以上かけて行った。両方とも流速は２ｍｌ／分であり、１分後ごとに画分を回収した。
人工タンパク質混合物及び酵母菌試料のＳＣＸ画分から得られた、質量（ＴＭＴ）標識したペプチド混合物の回収画分のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析をＱＴ―IIで別々に行い、基準ピークトレースを用いて濃度を推定した。人工混合物と酵母菌溶解物の割合は、１：１から１：１０ｗ／ｗ（１：１；１：１，５；１：２；１：３；１：４；１：５；１：８；１：１０）であった。スパイクされた異なる試料をＱＴ−IIを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析した。そして、８の人工タンパク質の混合物から親タンパク質の相対比を複雑なプロテオーム背景で定量化した。更に、１のＳＣＸ画分については、ＭＳ／ＭＳプロファイルを全て評価してより多くの酵母菌タンパク質を同定し、質量標識体（ＴＭＴ）二重試薬により得られた相対濃度を決定した。
＜データ分析と考察＞
ＳＥＱＵＥＳＴ及びＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ検索エンジンを用いて、ペプチドとタンパク質の同定を行った。酵母菌データベースを用いて酵母菌画分のタンパク質を同定し、社内で開発された小さなデータベースを用いて８のタンパク質の混合物のペプチドを同定した。ＳＥＱＵＥＳＴ検索をして、８のタンパク質の混合物の同定を行った。質量標識体（ＴＭＴ）フラグメント（質量マーカー部分、Ｘ）のシグネチャーイオンピーク領域をＳＥＱＵＥＳＴデータファイルから抽出して、相対定量を行った。そして、社内の試作ソフトウェアを用いて量的データを同定したペプチド配列のリストと照合した。相対存在比の計算は、データファイルから抽出された質量標識体（ＴＭＴ）レポーターイオン（質量マーカー部分）の積分値をもとにして行った。この定量の結果を最初に閾値フィルターなしで、次にフィルター有りで示し、質量標識（ＴＭＴ）レポーター強度が比較的低くなる（＞ＭＳ／ＭＳスペクトルで９０以下）ペプチドを除去した。
＜結果＞
―酵母菌溶解物の人工混合物から得られたタンパク質の相対存在比―
同じ親タンパク質から得られた全てのペプチドの相対存在比のＣＶは１−１０％であった。ＴＭＴレポーター強度が比較的低くなるペプチドを除去してデータを再分析したところ、ＣＶは向上し、最高値は６．８％であった。期待比と比較した際の実際比の精度は−０．７から＋９．８％であった。いずれの場合においても、人工混合物対酵母菌溶解物の比は実質的に実際比を影響することはなかった。
図２３ａ及び２３ｂは、（ａ）８のタンパク質の混合物及び（ｂ）酵母菌タンパク質画分のＴＭＴ標識したペプチド混合物の原液の基本ピーククロマトグラムを示す。
図２４ａ 酵母菌タンパク質画分の複雑なＴＭＴ標識したペプチド混合物にてスパイクした際の、８のタンパク質の混合物のＴＭＴ標識したペプチド混合物の異なる希釈溶液の基準ピーククロマトグラム。
図２４ｂ タンパク質（ＬＤＨＡ＿ＲＡＢＩＴ（Ｐ１３４９１））から同定したペプチドＤ＊ＹＳＶＴＡＮＳＫ＊の基準ピーククロマトグラム。基準ピーククロマトグラムは、スパイク実験でのペプチドの質量強度を示す。このスパイク実験では、酵母菌画分のＴＭＴ質量標識したペプチド混合物に、８のタンパク質の混合物から得られた、８の異なる濃度を有するＴＭＴ質量標識したぺプチドをスパイクした（例えば、それぞれ下から上へ示した１：１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５、１：８、１：１０）。
図２５ 各希釈実験及びタンパク質の人工混合物対タンパク質比から得られた相対定量データ。タンパク質１はβＧＡＬ＿ＥＣＯＬＩを、タンパク質２はＰＨＳ２＿ＲＡＢＩＴを、タンパク質３はＡＬＢＵ＿ＢＯＶＩＮを、タンパク質４はＫＰＹＭ＿ＲＡＢＩＴを、タンパク質５はＧ３Ｐ＿ＲＡＢＩＴを、タンパク質６はＬＤＨＡ＿ＲＡＢＩＴを、タンパク質７はＭＹＧ＿ＨＯＲＳＥを、タンパク質８はＬＹＳ＿ＣＨＩＣＫを表す。各タンパク質について、酵母菌消化画分においてスパイクした人工混合物の希釈溶液に対応する８の異なる点を示す。
図２６ 各希釈溶液に対応する各タンパク質のＣＶ．図２５の比に関連付けたデータである。
図２７ ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて低強度のＴＭＴレポーターイオン（質量マーカー部分）を有するぺプチドを閾値フィルターで除去した後の、各希釈実験及びタンパク質の人工混合物対タンパク質比から得られた相対定量データ。
図２８ 各希釈溶液に対応する各タンパク質のＣＶ．図２７の比に関連付けたデータである。
＜酵母菌溶解物の酵母菌タンパク質の相対存在比＞
この実験では、使用するタンパク質混合物及びＭＳ濾過アルゴリズムにより９４−１２６の異なる酵母菌タンパク質の同定及び定量が行うことができるように、標準ＭＳ／ＭＳパラメータを設定した。全ての実験において酵母菌タンパク質の期待比は０．５であり、ＴＭＴ質量標識体二重試薬による実際の比は一貫して０．４２−０．４３であった。フィルターなしのデータにおいてＣＶは通常１２−２５％の範囲であったが、低強度フィルターを用いると５−６％まで著しく向上した。
図２９ａ及び図２９ｂ 人工混合物なしのＳＣＸ酵母菌画分から同定した異なるタンパク質の分布比。
図２９ａ 全てのペプチドについて考察すると、５０９のペプチドを有する同定した１２９のタンパク質の平均は０．４３であり、平均ＣＶは２４．３であった。７４．５％のペプチドのＣＶは０−１０％であり、６．１％のペプチドのＣＶは１０−２０％であり、１９．４％のペプチドのＣＶは２０％を越えていた。
図２９ｂ ＭＳ／ＭＳにおいて９０未満のＴＭＴレポーター（質量マーカー部分）を有するペプチドを除去するための閾値フィルターを用いると、３９３のペプチドを有する同定した１１６のタンパク質の平均は０．４２であり、平均ＣＶは５％であった。９４．３％のペプチドのＣＶは０−１０％であり、２．３％のペプチドのＣＶは１０−２０％であり、３．４％のペプチドのＣＶのみが２０％を越えていた。
図３０ａ及び図３０ｂ １：１比の人工混合物にスパイクしたＳＣＸ酵母菌画分から同定した異なるタンパク質の分布比。
図３０ａ 全てのペプチドについて考察すると、３６３のペプチドを有する同定した１０３のタンパク質の平均は０．４３であり、これらのタンパク質の平均ＣＶは１６．５％であった。正確には、６９．９％のタンパク質のＣＶは０−１０％であり、１２．３％のタンパク質のＣＶは１０−２０％であり、１７．８％のタンパク質のＣＶは２０％を越えていた。
図３０ｂ ＭＳ／ＭＳにおいて９０未満のＴＭＴレポーター（質量マーカー部分）を有するペプチドを除去するための閾値フィルターを用いると、２７６のペプチドを有する同定した９４のタンパク質の平均は０．４２であり、平均ＣＶは６．４％であった。８８．５％のタンパク質のＣＶは０−１０％であり、８．２％のタンパク質のＣＶは１０−２０％であり、３．３％のタンパク質のＣＶのみが２０％を越えていた。
図３１ａ及び図３１ｂ それぞれ１：０．１比で人工混合物にスパイクしたＳＣＸ酵母菌画分から同定した異なるタンパク質の分布比。
図３１ａ 全てのペプチドについて考察すると、４０１のペプチドの同定した１０７のタンパク質の平均は０．４２であり、これらのタンパク質の平均ＣＶは１４．６％であった。正確には、７６．７％のタンパク質のＣＶは０−１０％、１２．８％のタンパク質のＣＶは１０−２０％であり、１０．５％のタンパク質のＣＶは２０％を越えていた。
図３１ｂ ＭＳ／ＭＳにおいて９０未満のＴＭＴレポーター（質量マーカー部分）を有するペプチドを除去するための閾値フィルターを用いると、３０３のペプチドを有する同定した１０３のタンパク質の平均は０．４２であり、平均ＣＶは５．１％であった。８９％のタンパク質のＣＶは０−１０％であり、９％のタンパク質のＣＶは１０−２０％であり、１％未満のタンパク質のＣＶのみが２０％を越えていた。
（実施例１３）
＜６重質量標識体（ＴＭＴ試薬）の量的性質を評価するための実験＞
１．ペプチド混合物
６重方式の量的性質を評価するために用いたモデルトリプシンペプチド：
ペプチド１： ＦＳＷＧＡＥＧＱＲ ＭＷ： １０３７，１１
ペプチド２： ＶＡＴＶＳＬＨＰＲ ＭＷ： ９７９，１６
ペプチド３： ＶＡＴＶＳＬＰＲ ＭＷ： ８４２，０１
以下は、６重方式における反応性質量（ＴＭＴ）標識体である。アステリスクは炭素１３又は窒素１５を示す。
―モデルペプチドへの一般的な結合反応プロトコル―
水／ＡＣＮ８３μｌ（１：９比）に溶解したペプチド混合物（各ペプチドとも０．２μｍｏｌ）をＢｏｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（２００ｍＭ）と混合し、溶液のｐＨを７．８に調整した。そして、ＤＭＦ２３μｌに溶解したＴＭＴ試薬（反応性質量標識体）（１５ｍＭ）をペプチド溶液に加えた。２時間室温で攪拌した後、各ペプチド反応混合物を所定比で同時にプールした。そして、最終的に得られた混合物をＨＰＬＣ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｌｕｎａ−２５０ｍｍ／４．６ｍｍ−５μ Ｃ１８）で精製し、標識したペプチドをＬＣ−ＭＳ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
図３２ 図３２は、６重方式においてＴＭＴ試薬で標識した３のペプチドのタンパク質の相対測定を示す。各ペプチドを等モル比（１２６：１２７：１２８：１２９：１３０：１３１に対して１：１：１：１：１：１）で標識した。比は以下のように測定した。ＴＭＴ／（ＴＭＴ＋コントロール）は、コントロールとＴＭＴ（質量標識体）値はそのピーク領域に表される。各ペプチドの期待比は０．５である。
図３３ １２６．１、１２７．１、１２８．１、１２９．１、１３０．１及び１３１．１のＴＭＴレポーターイオン（質量マーカー部分）シリーズで反映された１：１：１：１：１：１比で標識したペプチド（ＴＭＴ−ＶＡＴＶＳＬＨＰＲ）ＴＭＴのシグネチャーイオン領域の例
図３４ ３のモデルトリプシン消化ペプチドから配合比の相対定量を行った。各ペプチドのアリコートを１：５：２：１：０．５：０．２比の６のＴＭＴ試薬（質量標識体）で標識した。ＴＭＴレポーターフラグメント（質量マーカー部分）のＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳデータは記載した３のペプチドの５の異なる期待比及び観察比の回帰直線に整合した。１２６．１、１２７．１、１２８．１、１２９．１、１３０．１及び１３１．１のピーク領域を測定することにより、各レポーターイオンの強度を決定した。ＴＭＴレポーターイオン（質量マーカー部分）１２６をコントロールとして、５の比を計算した。比は以下のように測定した。ＴＭＴ／（ＴＭＴ＋コントロール）は、コントロールとＴＭＴ値は、ピーク領域により表される。各タンパク質の期待比は、０．８３、０．６７、０．５０、０．３３及び０．１６であった。
図３５ １２６．１、１２７．１、１２８．１、１２９．１、１３０．１及び１３１．１のＴＭＴレポーターイオン（質量マーカー部分）シリーズで反映された１：５：２：１：０．５：０．２比で標識したペプチド（ＴＭＴ−ＶＡＴＶＳＬＨＰＲ）ＴＭＴのシグネチャーイオン領域の例
２．タンパク質混合物：６重方式の定量性質を評価するために、タンパク質混合物に用いたタンパク質：
タンパク質１、βＧＡＬ＿ＥＣＯＬＩ；タンパク質２、ＰＨＳ２＿ＲＡＢＩＴ；タンパク質３、ＡＬＢＵ＿ＢＯＶＩＮ；タンパク質４、ＫＰＹＭ＿ＲＡＢＩＴ；タンパク質５、Ｇ３Ｐ＿ＲＡＢＩＴ；タンパク質６、ＬＤＨＡ＿ＲＡＢＩＴ
以下の実施例は、６のタンパク質の混合物の分析をもとにした、タギングプロトコルの精度及び分析変動値を示す。
（実施例１４）
図３６ ６の各タンパク質の６の等量アリコートを６重ＴＭＴの異なる物質で標識した。３６のタンパク質タグ混合物の全てがプールされ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いて一回の操作で分析した。ＭＳ／ＭＳスペクトルの低強度ＴＭＴレポーターイオンを有するペプチドを除去する閾値フィルターを用いた後の各タンパク質の５の比に対する相対定量データを示す。各タンパク質は等量モル比（１２６：１２７：１２８：１２９：１３０：１３１に対して１：１：１：１：１：１）で標識され、ＴＭＴフラグメント１２６をコントロールフラグメントとして５の比を計算した。比は以下のように測定した。ＴＭＴ／（ＴＭＴ＋コントロール）は、コントロール及びＴＭＴ値はピーク領域により表される。この場合、期待比は０．５である。
（実施例１５）
図３７ 図に示した５の比を求めるための各ＴＭＴ６重物質で標識した各タンパク質の６の異なる量。ＭＳ／ＭＳスペクトルの低強度ＴＭＴレポーターイオンを有するペプチドを除去するための閾値フィルターを用いた後の、５の比の各タンパク質に対する相対定量データを示す。各タンパク質を異なる比（１２６：１２７：１２８：１２９：１３０：１３１に対して１：５：２：１：０，５：０，２）で標識した。ＴＭＴフラグメント１２６をコントロールフラグメントとして、以下のように比を計算した。ＴＭＴ／（ＴＭＴ＋コントロール）、例えば１２７／（１２７＋１２６）は、コントロール及びＴＭＴ値はそのピーク領域により表される。各タンパク質の期待比は０．８３、０．６７、０．５０、０．３３及び０．１６である。
＜質量標識されたペプチドのＭＳ／ＭＳ分析＞
―ＭＳ／ＭＳ実験のプロトコル
ＱＴＯＦ２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社，マンチェスター、イギリス）でＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析を行った。ＣＡＰ−ＬＣ ＨＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ社、 Ｍｉｌｆｏｒｄ、マサチューセッツ州、アメリカ）（カラム：Ｄｉｏｎｅｘ社製のＰｅｐＭａｐ（登録商標） Ｃ１８ ＨＰＬＣカラム、内径７５μｍ、全長１５０ｍｍ；溶媒：水９５％からアセトニトリル９５％、双方とも０．２％ギ酸を有する）でＨＰＬＣ分析を行った。
ペプチドをエレクトロスプレー源でイオン化し、対応するＴＭＴレポーターイオンのピーク領域を決定する際に、各ペプチドのスペクトルを合計し平滑化してイオン存在比を求めた。
図１ａからｅは、本発明による５つの反応性質量標識体を示す。図１ａは、３−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン―１―イル）―アセチルアミノ］―プロピオン酸―（２，５―ジオキソ―ピロリジン―１―イル）―エステル（ＤＭＰｉｐ―βＡｌａ―Ｏｓｕ）を示す。図１ｂは、３―［２―（ピリミジン―２―イルスルファニル）―アセチルアミノ］―プロピオン酸―（２，５―ジオキソ―ピロリジン―１―イル）―エステル（Ｐｙｒｍ―βＡｌａ―Ｏｓｕ）を示す。図１ｃは、６−［（ピリミジン−２−イルスルファニル）−アセチルアミノ］−ヘキサン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（Ｐｒｙｍ−Ｃ６−Ｏｓｕ）を示す。図１ｄは、２−［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−プロピオン酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−Ｏｓｕ）を示す。図１ｅは、［２−（２，６−ジメチル−ピペリジン−１−イル）−アセチルアミノ］−酢酸−（２，５−ジオキソ−ピロリジン−１−イル）−エステル（Ｐｙｒｍ−Ｇｌｙ−Ｏｓｕ）を示す。 図２は、本発明による質量標識体の２の同位体を示す。 図３は、本発明による質量標識体の５の同位体を示す。 図４は、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡ（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−）Ｋの形成を示す。 図５は、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲの形成を示す。 図６は、Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲの形成を示す。 図７ａ及び図７ｂは、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図８ａ及び図８ｂは、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図９ａ及び図９ｂは、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−ＬＧＥＨＮＩＤＶＬＥＧＮＥＱＦＩＮＡＡ（ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−）ＫのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図１０ａ及び図１０ｂは、Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図１１ａ及び図１１ｂは、Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図１２ａ及び図１２ｂは、Ｐｙｒｍ−Ｃ６−ＶＡＴＶＳＬＰＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図１３ａ及び図１３ｂは、Ｐｙｒｍ−Ｃ６−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図１４は、Ｐｙｒｍ−βＡｌａ−Ｏｓｕ用二重試薬の逆合成を示す。 図１５は、ＤＭＰｉｐ−βＡｌａ−Ｏｓｕ用二重試薬の逆合成を示す。 図１６は、ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲの形成を示す。 図１７ａ及び図１７ｂは、ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−ＶＡＴＶＳＬＰＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図１８ａ及び図１８ｂは、ＤＭＰｉｐ−Ａｌａ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図１９ａ及び図１９ｂは、ＤＭＰｉｐ−Ｇｌｙ−ＶＡＴＶＳＬＰＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図２０ａ及び図２０ｂは、ＤＭＰｉｐ−Ｇｌｙ−ＤＹＥＧＡＴＬＳＤＩＧＡＬＩＲのＭＳ／ＭＳ分析を示す。 図２１は、測定されたペプチド比（Ｈ：Ｌ＋Ｈ）ｘ１００とペプチド期待比（Ｈ：Ｌ＋Ｈ）ｘ１００の相関を示す。 図２２は、本発明による質量標識体の６の同位体及び質量マーカー部分のフラグメント（Ｘ）の分子量を示す。 図２３ａ及び図２３ｂは、本発明による質量標識体で標識したタンパク質の基準ピークのクロマトグラムを示す。 図２４ａ及び図２４ｂは、本発明による質量標識体で標識したタンパク質の基準ピークのクロマトグラムを示す。 図２５は、本発明による質量標識体で標識したタンパク質の混合物（人工混合物）の相対定量データを示す。 図２６は、図２５において本発明による質量標識体で標識したタンパク質の混合物の各タンパク質に対応するＣＶを示す。 図２７は、ＭＳ／ＭＳスペクトルの低密度質量マーカー部分のフラグメントであるペプチドを除去するために閾値フィルターをかけた後の、本発明による質量標識体で標識したタンパク質の混合物（人工混合物）の相対定量データを示す。 図２８は、図２７において本発明による質量標識体で標識したタンパク質の混合物の各タンパク質に対応するＣＶを示す。 図２９ａ及び図２９ｂは、人工混合物を含まない、強陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた酵母画分の同定された異なるタンパク質の分布比を示す。 図３０ａ及び図３０ｂは、人工混合物で１：１の割合においてスパイクした、強陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた酵母画分の同定された異なるタンパク質の分布比を示す。 図３１ａ及び図３１ｂは、人工混合物で１：０．１の割合においてスパイクした、強陽イオン交換クロマトグラフィーで得られた酵母画分の同定された異なるタンパク質の分布比を示す。 図３２は、本発明による６の質量標識体で標識された３のペプチドの相対的なタンパク質の測定を示す。 図３３は、本発明の質量標識体で標識されたペプチドのシグネチャーイオン領域を示す。 図３４は、本発明による６の質量標識体で標識されたペプチドの相対量を示す。 図３５は、本発明の質量標識体で標識されたペプチドのシグネチャーイオン領域を示す。 図３６は、閾値フィルターをかけた後の、本発明による６の質量標識体で標識されたペプチドの相対量を示す。 図３７は、閾値フィルターをかけた後の、本発明による６の質量標識体で標識したペプチドの相対量を示す。

Claims (67)

  1. 質量分析において生物分子を標識し検出するための質量標識体であって、以下の構造
    Ｘ−Ｌ−Ｍ
    （式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
    （式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚは独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなることを特徴とする質量標識体。
  2. 質量分析において生物分子を標識し検出するための質量標識体であって、以下の構造
    Ｘ−Ｌ−Ｍ
    （式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
    （式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚ１及びＺ２は独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；少なくともＺ１及びＸのいずれかはＮであり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる請求項１に記載の質量標識体。
  3. 質量分析において生物分子を標識し検出するための質量標識体であって、以下の構造
    Ｘ−Ｌ−Ｍ
    （式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
    （式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚ１は独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；Ｚ２はＮ、Ｎ（Ｒ２）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；Ｒ２は置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり、及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる請求項１又は請求項２に記載の質量標識体。
  4. 質量分析において生物分子を標識し検出するための質量標識体であって、以下の構造
    Ｘ−Ｌ−Ｍ
    （式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
    （式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚ１は独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；Ｚ２はＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｈ）Ｒ３、Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；Ｒ２は置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；Ｒ３はＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、又は置換又は未置換複素環基であり；ｙは０−１０の整数であり；及びＬはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなる前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  5. 質量分析において生物分子を標識し検出するための質量標識体であって、以下の構造
    Ｘ−Ｌ−Ｍ
    （式中、Ｘは質量マーカー部分である）からなり、Ｘは以下の基
    （式中、環状ユニットは芳香族又は脂肪族であり、隣接した任意の２原子間の独立した０−３の二重結合からなり；各Ｚは独立してＮ、Ｎ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）、ＣＯ、ＣＯ（Ｒ１）、Ｃ（Ｒ１）２、Ｏ又はＳであり；ＸはＮ、Ｃ又はＣ（Ｒ１）であり；各Ｒ１は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基であり；及びｙは０−１０の整数であり、Ｌはアミド結合からなる開裂可能リンカーであり、Ｍは質量正規化部分である）からなり、ｙが３又は４であり、Ｌのアミド結合が（ＣＲ１ ２）ｙに隣接する場合、（ＣＲ１ ２）ｙの少なくとも１のＲ１は、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基から選択される前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  6. 質量標識体の総分子量が６００ダルトン以下である前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  7. 質量マーカー部分の分子量が３００ダルトン以下である前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  8. ｙが０、１又は２である前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  9. 質量マーカー部分が以下の基
    及び
    から選択される基からなる前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  10. 質量マーカー部分が以下の基
    及び
    から選択される基からなる請求項９に記載の質量標識体。
  11. 質量マーカー部分を質量正規化部分に結合させる開裂可能リンカーが、衝突により開裂可能なリンカーである前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  12. リンカーが質量分析法を用いたＣＩＤ又はＳＩＤにより開裂可能である請求項１１に記載の質量標識体。
  13. 質量正規化部分が、直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ２０置換又は未置換脂肪族基及び／又は１以上のアミノ酸からなる前記請求項のいずれかに記載の質量標識体。
  14. 質量正規化基は、Ｃ１−Ｃ６置換又は未置換脂肪族基からなる請求項１３に記載の質量標識体。
  15. 質量分析において生物分子を標識し検出するための反応性質量標識体であって、質量標識体及び質量標識体を生物分子に結合させるための反応性官能基からなり、質量標識体は請求項１から請求項１４のいずれかに定義されたものであることを特徴とする反応性質量標識体。
  16. 反応性官能基が質量マーカー部分又は質量正規化部分に結合する請求項１５に記載の反応性質量標識体。
  17. 反応性官能基が生物分子の１以上の反応性部位と反応することができ、求核性又は求電子性である請求項１５又は請求項１６に記載の反応性質量標識体。
  18. 反応性官能基が以下の基
    （式中、各Ｒ２は独立してＨ、置換又は未置換の直鎖又は分岐Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換又は未置換環状脂肪族基、置換又は未置換芳香族基、又は置換又は未置換複素環基である）からなる請求項１５から請求項１７のいずれかに記載の反応性質量標識体。
  19. 反応性官能基が以下の基
    からなる請求項１５から請求項１８のいずれかに記載の反応性質量標識体。
  20. 反応性質量標識体が以下の構造



    の１を有する請求項１９に記載の反応性質量標識体。
  21. 質量マーカー部分が増感基からなる前記請求項のいずれかに記載の質量標識体又は反応性質量標識体。
  22. 増感基がプレイオン化基である請求項２１に記載の質量標識体又は反応性質量標識体。
  23. 各質量標識体又は反応性質量標識体がビオチン等のアフィニティー捕捉リガンドからなる前記請求項のいずれかに記載の質量標識体又は反応性質量標識体。
  24. 質量標識体又は反応性質量標識体がＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、タンパク質、ペプチド及び／又はアミノ酸又はこれらの類似化合物から選択される生物分子を標識し検出するためのものである前記請求項のいずれかに記載の質量標識体又は反応性質量標識体。
  25. 請求項１から請求項１４又は請求項２１から請求項２４のいずれかに定義された質量標識体からなることを特徴とする標識した生物分子。
  26. 生物分子が質量標識体の質量マーカー部分又は質量正規化部分に結合した請求項２５に記載の標識した生物分子。
  27. 生物分子がＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、核酸塩基、タンパク質、ペプチド及び／又はアミノ酸又はこれらの類似化合物から選択される請求項２６に記載の標識した生物分子。
  28. 質量分析法の分析方法において請求項１から請求項２４のいずれかに定義された質量標識体又は反応性質量標識体を使用することを特徴とする使用。
  29. 質量分析法がタンデム質量分析法である請求項２８に記載の使用。
  30. 質量マーカー部分を質量分析法により同定する生物分子の検出方法において請求項１から請求項２４のいずれかに定義された質量標識体を使用することを特徴とする使用。
  31. 生物分子の検出方法における請求項１４から請求項２４のいずれかに定義された反応性質量標識体の使用であって、反応性官能基が質量標識体を生物分子へ容易に結合させることを特徴とする使用。
  32. 生物分子に関連可能な質量標識体を質量分析法により同定して生物分子を検出することからなる分析方法であって、質量標識体が請求項１から請求項１４又は請求項２１から請求項２４のいずれかに定義された質量標識体であることを特徴とする方法。
  33. 方法であって、
    １．生物分子を請求項１５から請求項２４のいずれかに定義された反応性質量標識体と反応させ、
    ２．標識した生物分子を分離し、
    ３．生物分子に関連可能な質量標識体を質量分析法により同定する
    ステップからなる請求項３２に記載の方法。
  34. 質量分析法がタンデム質量分析法である請求項３２又は請求項３３に記載の方法。
  35. ステップ（２）において、逆相高速液体クロマトグラフィー、陽イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーにより、標識されていない検体から標識した検体を分離する請求項３３又は３４に記載の方法。
  36. ２以上の質量標識体又は反応性質量標識体からなるセットであり、セットの各標識体は請求項１から請求項２４のいずれかに定義されたものであり、各質量正規化部分は質量標識体が所望の総質量を有することを確実にし、セットは
    −共通の質量を有する質量マーカー部分を有し、固有の総質量を有する標識体のグループ；又は
    −そのグループの他全ての質量マーカー部分と異なる質量を有する質量マーカー部分を有し、共通の総質量を有する標識体のグループ
    からなり、質量分析においてセットの全ての質量標識体が互いに識別可能であることを特徴とする質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  37. セットの各標識体が共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体が固有の総質量を有する請求項３６に記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  38. セットの各標識体が固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体が共通の総質量を有する請求項３６に記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  39. セットの各質量標識体は以下の構造
    Ｍ（Ａ）ｙ−Ｌ−Ｘ（Ａ）ｚ
    （式中、Ｍは質量正規化部分であり、Ｘは質量マーカー部分であり、Ａは質量調整部分であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、ｙ及びｚは０以上の整数であり、及びｙ＋ｚは１以上の整数である）を有する請求項３６から請求項３８のいずれかに記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  40. 質量調整部分が
    （ａ）質量マーカー部分及び／又は質量正規化部分内に位置する同位体置換基、及び
    （ｂ）質量マーカー部分に結合した及び／又は質量正規化部分に結合した置換原子又は基
    から選択される請求項３９に記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  41. 質量調整部分がハロゲン原子置換基、メチル基置換基及び２Ｈ、１５Ｎ、１３Ｃ又は１８Ｏ同位体置換基から選択される請求項３９又は請求項４０に記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  42. セットの各質量標識体は以下の構造
    Ｘ（＊）ｎ−Ｌ−Ｍ（＊）ｍ
    （式中、Ｘは質量マーカー部分であり、Ｌは開裂可能リンカーであり、及びＭは質量正規化部分であり、及び＊は同位体質量調整部分であり、及びｎ及びｍは０以上の整数である）を有し、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３９から請求項４１のいずれかに記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  43. Ｘが以下の基
    （式中、Ｒ１、Ｚ，Ｘ及びｙは請求項１に定義されたものであり、セットの各標識体は０又は１以上の＊からなる）からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項４２に記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  44. 質量マーカー部分が以下の基
    及び
    （式中、セットは０又は１以上の＊からなる）から選択される基からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項４３に記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  45. 質量マーカー部分が以下の基
    及び
    （式中、セットは０又は１以上の＊からなる）から選択される基からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項４４に記載の質量標識体又は反応性質量標識体セット。
  46. 反応性官能基が以下の基
    （式中、Ｒ２は請求項１８に定義されたものであり、セットは０又は１以上の＊からなる）からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項４２から請求項４５のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  47. 反応性官能基が以下の基
    （式中、セットは０又は１以上の＊からなる）からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項４６に記載の反応性質量標識体セット。
  48. セットが以下の構造
    （式中、＊は酸素がＯ１８、炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  49. セットが以下の構造
    （式中、＊は酸素がＯ１８、炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  50. セットが以下の構造
    （式中、＊は酸素がＯ１８、炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  51. セットが以下の構造
    （式中、＊は酸素がＯ１８、炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  52. セットが以下の構造
    （式中、＊は酸素がＯ１８、炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  53. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  54. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  55. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  56. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  57. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  58. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  59. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  60. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  61. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  62. セットが以下の構造
    （式中、＊は炭素がＣ１３又は窒素がＮ１５であることを表し、セットの各標識体は１以上の＊からなる）を有する２以上の質量標識体からなり、これにより
    セットの各標識体は共通の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は固有の総質量を有し、又は
    セットの各標識体は固有の質量を有する質量マーカー部分からなり、セットの各標識体は共通の総質量を有する
    請求項３６から請求項４７のいずれかに記載の反応性質量標識体セット。
  63. 質量調整部分＊が１５Ｎ又は１３Ｃであり、セットが以下の構造
    を有する２の質量標識体からなる請求項５８に記載の反応性質量標識体セット。
  64. 質量調整部分＊が１５Ｎ及び１３Ｃであり、セットが以下の構造
    を有する５の質量標識体からなる請求項６１に記載の反応性質量標識体セット。
  65. 質量調整部分＊が１５Ｎ及び１３Ｃであり、セットが以下の構造
    を有する６の質量標識体からなる請求項５８に記載の反応性質量標識体セット。
  66. 複数の試料から得られる１以上の生物分子の相対及び／又は絶対量を決定する方法であって、方法は生物分子に関連可能な複数の質量標識体の相対及び／又は絶対量を質量分析法で同定することにより生物分子の量を検出することからなり、各質量標識体は請求項１から請求項１４又は請求項２１から請求項２４のいずれかに定義された質量標識体であり、又は請求項３６から請求項６５のいずれかに定義された質量標識体セットであることを特徴とする方法。
  67. 各生物分子が得られる試料の同定を行うために、各質量標識体が化学的に同一であり、異なった同位体で標識されている請求項６６に記載の方法。
JP2008523449A 2005-07-26 2006-07-26 質量標識体 Active JP5054690B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0515323.4 2005-07-26
GB0515323A GB0515323D0 (en) 2005-07-26 2005-07-26 Mass labels
PCT/GB2006/002787 WO2007012849A2 (en) 2005-07-26 2006-07-26 MASS LABELS FOR BIOMOLECULES CONTAINING A 2,6-DIMETHYL-PIPERIDIN-l-YL METHYLENE OR A PYRIMIDIN-2-YL THIOMETHYLENE MASS MARKER MOIETY AND A SUCCINIMID-OXY-CARBONYL REACTIVE FUNCTIONAL GROUP

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2009503485A true JP2009503485A (ja) 2009-01-29
JP5054690B2 JP5054690B2 (ja) 2012-10-24

Family

ID=34976608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2008523449A Active JP5054690B2 (ja) 2005-07-26 2006-07-26 質量標識体

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9023656B2 (ja)
EP (1) EP1907860B1 (ja)
JP (1) JP5054690B2 (ja)
CN (2) CN101313223B (ja)
AT (1) ATE488771T1 (ja)
AU (1) AU2006273834B2 (ja)
CA (1) CA2616985C (ja)
DE (1) DE602006018317D1 (ja)
GB (1) GB0515323D0 (ja)
NZ (1) NZ565513A (ja)
WO (1) WO2007012849A2 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013505908A (ja) * 2009-09-25 2013-02-21 エレクトロフォレティクス リミテッド 質量標識体
JP2013234974A (ja) * 2012-05-11 2013-11-21 Shimadzu Corp チアゾリジン−２，４−ジオン誘導体及びマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用マトリックス
JP2014215187A (ja) * 2013-04-25 2014-11-17 株式会社島津製作所 ペプチドの解析法
JP2016525677A (ja) * 2013-05-15 2016-08-25 エレクトロフォレティクス リミテッド 質量標識体
JP2018538511A (ja) * 2015-10-14 2018-12-27 ウイスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーシヨンＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 高スループット定量的プロテオミクス及びペプチドミクスのための質量欠損ベースの多重化ジメチルピリミジニルオルニチン（ｄｉｐｙｒｏ）タグ

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB0704764D0 (en) * 2007-03-12 2007-04-18 Electrophoretics Ltd Isobarically labelled reagents and methods of their use
GB0809488D0 (en) * 2008-05-23 2008-07-02 Electrophoretics Ltd Mass spectrometric analysis
WO2010104981A2 (en) 2009-03-10 2010-09-16 University Of Maryland Biotechnology Institute Deuterium isobaric tag reagents for quantitative analysis
US20110046489A1 (en) * 2009-08-18 2011-02-24 University Of Calcutta Systems and methods employing giant stokes shift
WO2011047192A2 (en) 2009-10-14 2011-04-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Protected amine labels and use in detecting analytes
US9354170B2 (en) 2011-02-15 2016-05-31 University Of Calcutta NIR fluorescence of heavy water
WO2013170067A1 (en) 2012-05-10 2013-11-14 Thermo Finnigan Llc Method for highly multiplexed quantitation of peptides by mass spectrometry and labeling reagent sets therefor
US9835629B2 (en) * 2012-05-18 2017-12-05 Pierce Biotechnology, Inc. Methods and reagents for biomolecule labeling, enrichment and gentle elution
US9366678B2 (en) 2012-10-25 2016-06-14 Wisconsin Alumni Research Foundation Neutron encoded mass tags for analyte quantification
GB201322567D0 (en) * 2013-12-19 2014-02-05 Electrophoretics Ltd Mass labels
US9146219B2 (en) * 2014-01-27 2015-09-29 National Medical Services, Inc. Sensitive method for measuring cis-diol containing compounds in plasma using 2D-LC-MS/MS
GB201410523D0 (en) * 2014-06-12 2014-07-30 Electrophoretics Ltd Mass labels
US11169155B2 (en) 2015-06-03 2021-11-09 President And Fellows Of Harvard College Reagents for quantitative mass spectrometry
GB201519186D0 (en) 2015-10-30 2015-12-16 Electrophoretics Ltd Isotopic methods for measurement of tryptophan and metabolites thereof
GB201521903D0 (en) 2015-12-11 2016-01-27 Electrophoretics Ltd Isorbaric mass labels
GB201521919D0 (en) * 2015-12-11 2016-01-27 Electrophoretics Ltd Isobaric mass labels
CN108658762B (zh) * 2018-06-12 2021-03-02 浙江凯普化工有限公司 一种脂环邻二酯的合成方法
US11022593B2 (en) 2018-10-25 2021-06-01 Savannah River Nuclear Solutions, Llc Solid phase sampling device and methods for point-source sampling of polar organic analytes
AU2020274563A1 (en) * 2019-05-13 2021-12-09 Shanghai Polaris Biology Co., Ltd. A tag for labeling biomolecules
WO2022216767A1 (en) * 2021-04-07 2022-10-13 The Texas A&M University System Mass tags for lipid analyses
CN113788788B (zh) * 2021-07-23 2023-12-05 浙江工业大学 一种荧光离子液体及其合成方法与应用
CN115260288A (zh) * 2022-06-14 2022-11-01 东莞理工学院 一种干腌火腿来源抗氧化肽复合物及应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002520580A (ja) * 1998-07-13 2002-07-09 ブラックス グループ リミテッド 質量分光分析のためのアリールスルフォンリンカー
WO2004086050A2 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Xzillion Gmbh & Co. Kg Labelling agents for mass spectrometry comprising tertiary amines
JP2005503557A (ja) * 2001-09-14 2005-02-03 イグジィリオン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディートゲゼルシャフト 質量標識体
WO2005057207A1 (en) * 2003-12-08 2005-06-23 Oxford Gene Technology Ip Limited Trityl derivatives for enhancing mass spectrometry

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2856405A (en) 1956-06-04 1958-10-14 Lakeside Lab Inc Mecuration products of 1-(2-pyrimidyl)-3-allylurea
US6204261B1 (en) * 1995-12-20 2001-03-20 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of interleukin-1β Converting enzyme inhibitors
FR2036922A1 (en) 1969-04-18 1970-12-31 Leurquin Lab 2-amino pyrimidine derivs prepn
JP2753622B2 (ja) 1988-05-02 1998-05-20 大塚製薬株式会社 カルボスチリル誘導体
GB9315847D0 (en) 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method
EP0868535B9 (en) 1996-01-23 2007-05-09 Qiagen Genomics, Inc. Methods and compositions for determining the sequence of nucleic acid molecules
CZ228598A3 (cs) 1996-01-23 1998-12-16 Rapigene, Inc. Způsoby a kompozice pro analyzování molekul nukleových kyselin za použití postupu třídění
WO1998026095A1 (en) 1996-12-10 1998-06-18 Genetrace Systems Inc. Releasable nonvolatile mass-label molecules
CA2441655A1 (en) 1997-01-15 1998-07-23 Xzillion Gmbh & Co Kg Mass label linked hybridisation probes
DE69817211T2 (de) 1997-01-23 2004-06-03 Xzillion Gmbh & Co. Kg Charakterisierung von polypeptiden
AU8908198A (en) * 1997-08-15 1999-03-08 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
GB9815166D0 (en) 1998-07-13 1998-09-09 Brax Genomics Ltd Compounds for mass spectrometry
JP2002509925A (ja) 1998-03-31 2002-04-02 ワーナー−ランバート・カンパニー セリンプロテアーゼ阻害剤としてのベンゾオキサジノン／ベンゾチアジノン
PL343112A1 (en) * 1998-03-31 2001-07-30 Warner Lambert Co Quinolones as serine protease inhibitors
GB9821393D0 (en) 1998-10-01 1998-11-25 Brax Genomics Ltd Protein profiling 2
GB0006141D0 (en) 2000-03-14 2000-05-03 Brax Group Ltd Mass labels
IL154222A0 (en) 2000-08-01 2003-07-31 Sod Conseils Rech Applic Imidazolyl derivatives
WO2002055496A1 (en) 2001-01-15 2002-07-18 Glaxo Group Limited Aryl piperidine and piperazine derivatives as inducers of ldl-receptor expression
US7183116B2 (en) * 2001-05-14 2007-02-27 The Institute For Systems Biology Methods for isolation and labeling of sample molecules
EP1267170A1 (en) 2001-06-07 2002-12-18 Xzillion GmbH & CO.KG Method for characterising polypeptides
EP1448996A2 (de) 2001-11-09 2004-08-25 Bayer HealthCare AG Isotopencodierte affinitätsmarker 2
GB0131014D0 (en) 2001-12-28 2002-02-13 James Peter Method for molecule-mlecule analysis
GB0215392D0 (en) 2002-07-03 2002-08-14 Glaxo Group Ltd Chemical compounds
AU2004206856B9 (en) 2003-01-16 2006-11-02 Caprotec Bioanalytics Gmbh Capture compounds, collections thereof and methods for analyzing the proteome and complex compositions
TW200519105A (en) 2003-10-20 2005-06-16 Lg Life Science Ltd Novel inhibitors of DPP-IV, methods of preparing the same, and pharmaceutical compositions containing the same as an active agent
US7384930B2 (en) 2004-11-03 2008-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Constrained compounds as CGRP-receptor antagonists

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002520580A (ja) * 1998-07-13 2002-07-09 ブラックス グループ リミテッド 質量分光分析のためのアリールスルフォンリンカー
JP2005503557A (ja) * 2001-09-14 2005-02-03 イグジィリオン ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディートゲゼルシャフト 質量標識体
JP4290003B2 (ja) * 2001-09-14 2009-07-01 エレクトロフォレティクス リミテッド 質量標識体
WO2004086050A2 (en) * 2003-03-24 2004-10-07 Xzillion Gmbh & Co. Kg Labelling agents for mass spectrometry comprising tertiary amines
WO2005057207A1 (en) * 2003-12-08 2005-06-23 Oxford Gene Technology Ip Limited Trityl derivatives for enhancing mass spectrometry

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2013505908A (ja) * 2009-09-25 2013-02-21 エレクトロフォレティクス リミテッド 質量標識体
JP2015143254A (ja) * 2009-09-25 2015-08-06 エレクトロフォレティクス リミテッド 質量標識体
JP2017037088A (ja) * 2009-09-25 2017-02-16 エレクトロフォレティクス リミテッド 質量標識体
JP2013234974A (ja) * 2012-05-11 2013-11-21 Shimadzu Corp チアゾリジン−２，４−ジオン誘導体及びマトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析用マトリックス
JP2014215187A (ja) * 2013-04-25 2014-11-17 株式会社島津製作所 ペプチドの解析法
JP2016525677A (ja) * 2013-05-15 2016-08-25 エレクトロフォレティクス リミテッド 質量標識体
JP2018538511A (ja) * 2015-10-14 2018-12-27 ウイスコンシン アラムナイ リサーチ ファウンデーシヨンＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ａｌｕｍｎｉ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ 高スループット定量的プロテオミクス及びペプチドミクスのための質量欠損ベースの多重化ジメチルピリミジニルオルニチン（ｄｉｐｙｒｏ）タグ
US11408897B2 (en) 2015-10-14 2022-08-09 Wisconsin Alumni Research Foundation Mass defect-based multiplex dimethyl pyrimidinyl ornithine (DiPyrO) tags for high-throughput quantitative proteomics and peptidomics

Also Published As

Publication number Publication date
US20100178710A1 (en) 2010-07-15
AU2006273834A8 (en) 2009-08-06
JP5054690B2 (ja) 2012-10-24
AU2006273834B2 (en) 2011-09-01
ATE488771T1 (de) 2010-12-15
CN104987326A (zh) 2015-10-21
CA2616985C (en) 2014-10-28
CN101313223A (zh) 2008-11-26
EP1907860B1 (en) 2010-11-17
GB0515323D0 (en) 2005-08-31
CN104987326B (zh) 2019-08-30
WO2007012849A2 (en) 2007-02-01
NZ565513A (en) 2011-03-31
US9023656B2 (en) 2015-05-05
CA2616985A1 (en) 2007-02-01
CN101313223B (zh) 2017-04-12
EP1907860A2 (en) 2008-04-09
AU2006273834A1 (en) 2007-02-01
DE602006018317D1 (de) 2010-12-30
WO2007012849A3 (en) 2007-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5054690B2 (ja) 質量標識体
EP1606623B1 (en) Labelling agents for mass spectrometry comprising tertiary amines
JP4290003B2 (ja) 質量標識体
US7700306B2 (en) Method for charcterising analytes
CA2775118C (en) Mass labels
US20070009960A1 (en) Characterising polypeptides

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20090626

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20111206

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20120301

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20120308

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120403

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20120703

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20120727

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 5054690

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150803

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250