JP2018538511A - 高スループット定量的プロテオミクス及びペプチドミクスのための質量欠損ベースの多重化ジメチルピリミジニルオルニチン（ｄｉｐｙｒｏ）タグ - Google Patents

高スループット定量的プロテオミクス及びペプチドミクスのための質量欠損ベースの多重化ジメチルピリミジニルオルニチン（ｄｉｐｙｒｏ）タグ Download PDF

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Abstract

同位体で標識化されたペプチド間のミリダルトン質量差異をＭＳ１レベルにて与えるための、質量欠損シグネチャーの使用により、多重化定量化が可能となり、質量差分アプローチによって生じる質量スペクトル複雑性の増大はない。本出願で提供されるのは、質量欠損ベースの化学タグ、ジメチルピリミジニルオルニチン（ＤｉＰｙｒＯ）である。これは、コンパクトであり、市販の出発材料を用いてごく少数の工程で高い純度で合成することが容易である。多重化ＤｉＰｙｒＯタグは、アミン反応性であり、重同位体の置換の計算により、標識化したペプチドに質量差異を与えることができる。ＤｉＰｙｒＯは、質量スペクトルの複雑性を増大させることなく、現在のＯｒｂｉｔｒａｐプラットフォーム又はＦＴ−ＩＣＲプラットフォームでの最大十重化定量化を実現する。ＤｉＰｙｒＯタグの合成は、酵母抽出物消化物を用いた、複雑なプロテオミクスサンプルを標識化する、ＤｉＰｙｒＯタグの実行可能性、及び、ＤｉＰｙｒＯタグの、ＬＣ−ＭＳ２分析中の標識化ペプチドに及ぼす効果と共に、実現される。ＤｉＰｙｒＯタグを用いる、グリカン及び代謝物質の標識化及び定量化もまた実証される。【選択図】 図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
[001]本出願は、２０１５年１０月１４日出願の米国特許仮出願第６２／２４１５９０号の優先権を主張する。この出願は、本開示と矛盾しない限り、参照によって本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究又は開発に関する陳述
[002]本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈによる認可第ＤＫ０７１８０１号の下に、政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において、一定の権利を有する。
発明の背景
[003]安定同位体標識化は、近年急速な進歩が見られたＭＳベースの定量的プロテオミクスのコア技術である。重い炭素、水素、窒素、及び酸素の原子が、ペプチドに代謝的に、又は化学的に組み込まれて質量差異がもたらされ、この差異が質量スペクトルで検出されてサンプルを差別化することができ、そして相対的定量化用のイオン強度の比較が可能となる（Ｏｄａら、ＰＮＡＳ、１９９９、９６：６５９１〜６５９６；Ｏｎｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００２、１：３７６〜３８６；Ｐａｎら、 Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００３、７５：１３１６〜１３２４；Ｗｕら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００４、７６：４９５１〜４９５９；Ｇｙｇｉら、Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１７：９９４〜９９９；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００３、７５：１８９５〜１９０４；Ｒｏｓｓら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００４、３：１１５４〜１１６９；Ｈｓｕら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００３、７５：６８４３〜６８５２；及びＢｏｅｒｓｅｍａら、Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ、２００９、４：４８４〜４９４）。
[004]ペプチド中に安定同位体を導入する多数のアプローチ、例えば細胞培養液中のアミノ酸による安定同位体標識化（ＳＩＬＡＣ）、アイソバリックタギング（ＴＭＴ／ｉＴＲＡＱ）及びｉＣＡＴが存在する。しかしながら、ほとんどの従来アプローチにおいて、これらの方法は、重同位体を組み込んで、質量を少なくとも１Ｄａ増大させるものである。
[005]従来法では、ＭＳ１スペクトルにおいてアイソトープクラスタ間の重なりを最小にするには、４Ｄａ以上の質量差異が理想的である。特別な考慮下での五重化（５−ｐｌｅｘ）ＳＩＬＡＣ及び五重化ジメチル標識化技術が報告されている（Ｍｏｌｉｎａら、Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ、２００９、８：４８−５８；及びＷｕら、Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ、２０１４、５０：１７０８）ものの、多重化の増大に由来するスペクトルの複雑性の漸次増大により、プロテオミクスの適用範囲が結果的に狭まって、質量差分アプローチ、すなわちＳＩＬＡＣは三重比較（ｔｒｉｐｌｅｘ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）に一般に制限されていた。
[006]高いレベルの多重化が、アイソバリック化学標識化アプローチ、例えばｉＴＲＡＱ、ＴＭＴ、及びＤｉＬｅｕアイソバリックタグによって達成されてきた。これらのアプローチは、ＭＳ１スペクトル複雑性を増大させることなく、ＭＳ２レベルでの定量化を実現するものである（Ｒｏｓｓら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００４、３：１１５４〜１１６９；Ｃｈｏｅら、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２００７、７：３６５１〜３６６０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００３、７５：１８９５〜１９０４；Ｄａｙｏｎら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２００８、８０：２９２１〜２９３１；Ｘｉａｎｇら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１０、８２：２８１７〜２８２５；及びＦｒｏｓｔら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ ２０１５、２９：１１１５〜１１２４）。
[007]アイソバリック標識化は、ＭＳ１スキャンの定量的情報が見えないようにすることによって、質量スペクトル複雑性の増大の問題に対処することで、従来のＳＩＬＡＣ法によって得られるよりも高いレベルの多重化を可能にしている。しかしながら、アイソバリック標識化は、複雑なサンプルにおける前駆体の激しい共単離（ｃｏ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ）（Ｏｗら、Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ、２００９、８：５３４７〜５３５５）、そして前駆体を「精製する」ためにイオン／イオン反応を使用する、提案されている解決策（ＱｕａｎｔＭｏｄｅ）（Ｗｅｎｇｅｒら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ、２０１１、８：９３３〜９３５；及びＲｅｎｓｖｏｌｄら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１３、８５：２０７９〜２０８６）又はＭＳ３ベースのレポーターイオン定量化の使用（Ｔｉｎｇら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ、２０１１、８：９３７〜９４０；及びＭｃＡｌｉｓｔｅｒら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１４、８６：７１５０〜７１５８）に起因する比率の抑制及び不正確性を欠点としており、双方とも機器のデューティサイクル及び感度を引き下げる結果、同定数及び定量化されるペプチド数が非常に減少する。フラッグシップＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎトライブリッド質量スペクトロメータは、とりわけこの問題に対処し、感度又は定量化率を著しく損なうことなく正確なレポーターイオンシグナルを与えるために、ＨＣＤ ＭＳ３分析用の複数のＭＳ２フラグメントイオンの同期式前駆体選択（ｓｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を備えている。
[008]高分解能ＭＳプラットフォームの利用可能性の高まりは、質量欠損を用いることにより、上述の戦略の多重化能力の向上を可能にした。アイソバリック六重化ＴＭＴ試薬は、１２Ｃ／１３Ｃ同位体間、そして１４Ｎ／１５Ｎ同位体間の微妙な相対的質量差異を利用することによって（１４Ｎ原子の代わりに１５Ｎ原子を、そして１２Ｃ原子の代わりに１３Ｃ原子を用いることによって）、八重に増大した。結果として生じたレポーター同位体種は、質量が６．３２ｍＤａ異なり、そして（ｍ／ｚ ４００にて）３０ＫのＭＳｎ分解力（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ ｐｏｗｅｒ）で識別され得る。現在、ＴＭＴ試薬は、４つの質量欠損ベースの同位体種により十重化セットとして提供され、そしてアイソバリックＤｉＬｅｕ試薬の多重化能力は、８つの質量欠損ベースの同位体種の付加により、四重から十二重へと、３倍になった。偽アイソバリックジメチル標識化（ｐｓｅｕｄｏ−ｉｓｏｂａｒｉｃ ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｌａｂｅｌｉｎｇ：ｐＩＤＬ）は、Ｃ及びＨの同位体間の質量欠損、及び定量化用の高分解能ＭＳ２を用いるものである（Ｚｈｏｕら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，２０１３，８５：１０６５８〜１０６６３）。中性子コーディング又はＮｅｕＣｏｄｅは、ＭＳ１レベルでの質量欠損ベースの同位体標識定量化について、Ｃｏｏｎ及び共同研究者によって作られた用語である（Ｈｅｂｅｒｔら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ、２０１３、１０：３３２〜３３４）。
[009]ＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣは、８つの同位体を異なる構成で有するリジン同位体種の、Ｃ、Ｈ、及びＮの同位体間の質量欠損を利用して、わずか５．８ｍＤａから３６ｍＤａにも及ぶ質量差異をもたらす細胞培養代謝標識化戦略である（Ｈｅｂｅｒｔら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ、２０１３、１０：３３２〜３３４；及びＭｅｒｒｉｌｌら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１４、１３：２５０３〜２５１２）。ＮｅｕＣｏｄｅリジンを組み込むペプチドのｍＤａ質量欠損シグネチャーは、低いＭＳ１分解力から中程度のＭＳ１分解力では認められないが、高分解力（＞２００Ｋ）では明らかになる。ゆえに、上記戦略は、従来のＳＩＬＡＣに付随するスペクトル複雑性を増大させることなく多重化を可能にし、そして、定量化がＭＳ１レベルにてなされるので、アイソバリック標識化がするような前駆体共単離に起因する不十分な定量的精度を欠点としない。ＭＳ１分解能によるＮｅｕＣｏｄｅ規模の多重化能力（３６ｍＤａのリジンを用いる二重化定量化）は、サンプルのプロテオームの＞８５％の定量化に、２４０Ｋの分解力を必要とする一方、１８ｍＤａ及び１２ｍＤａのリジンを用いる三重化定量化及び四重化定量化は、それぞれ４８０Ｋ及び９６０Ｋの分解力を必要とする。そのような高分解能は、超高磁場検出器を使用する最も精巧なＦＴ−ＩＣＲ機器又はＯｒｂｉｔｒａｐプラットフォームを必要とするので、上記技術は大多数の研究者にとって、まだ広く使用可能でない。
[0010]ＮｅｕＣｏｄｅリジンがＳＩＬＡＣ及びＳＩＬＡＭ双方の用途に用いられているが、生物の代謝標識化に限られている（Ｈｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ、２０１３、１０：３３２〜３３４；Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１４、１３：２５０３〜２５１２；Ｒｏｓｅら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１３、８５：５１２９〜５１３７；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１３、１２：３８１２〜３８２３；Ｒｈｏａｄｓら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１４、８６：２３１４〜２３１９；及びＲｏｓｅら、「ＮｅｕＣｏｄｅ Ｍｏｕｓｅ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｄｅｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｓｅ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ」、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、ＭＤ、２０１４、１〜６５頁において発表）。
[0011]ＮｅｕＣｏｄｅの呼称でＣｏｏｎ及び共同研究者によって報告された質量欠損ベースの化学標識化アプローチとして、カルバミル化（Ｕｌｂｒｉｃｈら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２０１４、２５：６〜９）及びメチルアミノ化（Ｕｌｂｒｉｃｈら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２０１４、８６：４４０２〜４４０８）による二重化定量化、そしてアミン反応性タグによる多重化定量化（Ｈｅｂｅｒｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｅｉｃｓ、２０１３、１２：３３６０〜３３６９）が挙げられる。アミン反応性ＮｅｕＣｏｄｅタグは、異なる構成の６つの重同位体（１３Ｃ及び１５Ｎ）を使用して、質量が１２．６ｍＤａ異なるタグの四重化セットを生じさせている。しかしながら、タグは３つのアミノ酸からなり、結果的に、４３１Ｄａと極端に大きい。アミノ酸の１つがアルギニンであり、これは、電荷隔離（ｃｈａｒｇｅ ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ）により、主鎖フラグメント化を阻害する（Ｔａｎｇら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、１９９３、６５：２８２４〜２８３４；及びＤｉｋｌｅｒら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１９９７、３２：１３３７〜１３４９）。定量的プロテオミクス用の多重化された質量欠損ベースのタグの概念を実証するのに有用である一方、このタグは、上述の制限により、その意図される用途にとって幾分非実用的である可能性がある。
[0012]したがって、サイズが小さく、且つ、標識化されるペプチドのフラグメント化を損なわない、定量的プロテオミクスワークフローへの組込み用の質量欠損ベースのタギング試薬の向上が所望されている。
[0013]本発明は、ジメチルピリミジニルオルニチン（ＤｉＰｙｒＯ）及びその誘導体に基づく新規の質量欠損ベースの化学タグを提供する。当該質量欠損タグは、コンパクトであり、標識化したペプチドのフラグメント化を強化し、市販の出発材料を用いてごく少数の工程で高い純度で合成することが一般に容易であるという点で、有益である。
[0014]本明細書中で一般に用いられる用語「ＤｉＰｙｒＯ質量欠損タグ」及び「ＤｉＰｙｒＯタグ」は、例えば以下の構造及び式に記載されるような、ジメチルピリミジニルオルニチンに由来する、置換されている構造及び置換されていない構造を含む。ＤｉＰｙｒＯタグは、非常に小さな質量差異（例えば、一実施形態において、最大４５．３ｍＤａ又はわずか５．８ｍＤａ）を標識化したサンプルに与えることによって、標識化したサンプルを高分解能ＭＳによって同時に分析し得、そしてピーク面積同士を比較して、単一のＬＣ−ＭＳ実験由来のサンプルの相対的定量化を可能とし得る。サンプル間の数Ｄａの質量差異を与える、類似した質量差異戦略、例えばＳＩＬＡＣ標識化又はジメチル標識化では、質量スペクトルの複雑性が、定量的チャンネルの数に比例して増大する結果として、機器効率を下がり、ペプチド及びタンパク質の同定数がより少なくなる。それに対して、本発明の質量欠損ベースの戦略によって用いられるｍＤａ質量差異は、低い分解能から中程度の分解能（＜１０ｋ＠ｍ／ｚ ４００）では区別がつかず、そして質量スペクトルの複雑性を大幅に増大させずに、高速度の同定を保持する。ｍＤａ差異は、高分解能（＞１２０ｋ）ＭＳ１スキャンで分解されて、標識化したサンプルピークを明らかとし得る。
[0015]本明細書中で一般に用いられる、ＤｉＰｙｒＯタグを記載する用語はまた、ＤｉＰｙｒＯタグの構造中に組み込まれ得る重い安定同位体の数を示し得る。例えば、用語「ＤｉＰｙｒＯ６」は、６つの重い安定同位体（すなわち、１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ、１８Ｏ）が、タグの構造中に組み込まれ得ることを示す。但し、１８Ｏ同位体は、２つの重同位体として数えられることを条件とする。その理由は、１８Ｏが１６Ｏよりもおおよそ２Ｄａ重いためである。
[0016]特定の実施形態において、ＤｉＰｙｒＯタグは、ごく少数の工程で、確立され、且つ単純な、化学的性質、並びに市販の試薬及び同位体を用いて、高い純度にて合成される。これにより、短い期間で高収率にて生産するのに手頃な技術となっている。合成経路は、多数の同位体種の変異体を製剤化することを可能にしている。例えば、タグ構造における重同位体の置換の計算により、ＤｉＰｙｒＯタグは、質量スペクトルの複雑性を増大させることなく、現在のＯｒｂｉｔｒａｐプラットフォームでの十重化定量化を実現する。
[0017]一実施形態において、本発明は、質量分析に標識化試薬として用いられる、同位体が濃縮された化合物を含む組成物を提供し、上記化合物が、式（ＦＸ１）を有し：

式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；Ｚが結合基であり；Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；上記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；上記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；上記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；上記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；ｍが、０又は１であり；但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とし；同位体が濃縮された上記化合物が、天然の同位体存在量を超える量で存在する。
[0018]一部の実施形態において、式（ＦＸ１）のアミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基が、トリアジンエステル、ＮＨＳエステル、ＴＦＰエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ヒドラジド、アミノオキシ、及びヨードアセチルからなる群から選択される。
[0019]一部の実施形態において、ＤｉＰｙｒＯタグは、アミン反応性基を含み、そしてペプチドのＮ末端及びあらゆるリジン側鎖の双方に結合することができる。例えば、少なくとも１つの実験において、複雑な酵母タンパク質抽出物消化物の、ＤｉＰｙｒＯタグによる標識化効率は、１時間の標識化反応を用いて、＞９９％の割合（Ｎ末端又はリジン）にて観察された。
[0020]本発明の様々な、同位体が濃縮された化合物は、様々な用途のために広範囲にわたって選択される、いくつかの安定な重い安定同位体を有することができる。本明細書中で用いられる、同位体が濃縮された化合物は、同位体標識として機能する１つ又は複数の重い安定同位体を有する化合物を指す。一実施形態において、例えば、同位体が濃縮された化合物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、及び１２個からなる群から選択される数の重い安定同位体を有する。一実施形態において、例えば、同位体が濃縮された化合物は、１つ以上の重い安定同位体を、任意選択で、一部の用途について、４つ以上の重い安定同位体を、そして任意選択で、一部の用途について、１０個以上の重い安定同位体を有する。
[0021]任意選択で、本明細書中に記載される、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも５つの原子が、独立して重同位体である。一実施形態において、本明細書中に記載される式（ＦＸ１）によって特徴付けられる、同位体が濃縮された上記化合物が、少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１５Ｎ同位体；又は少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は少なくとも１つの同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は少なくとも１つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は少なくとも１つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は少なくとも１つの２Ｈ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも２つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも１つの１３Ｃ同位体、少なくとも１つの１５Ｎ同位体、及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は少なくとも１つの１３Ｃ同位体、少なくとも１つの１５Ｎ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体を有する。
[0022]任意選択で、本明細書中に記載される式（ＦＸ１）によって特徴付けられる、同位体が濃縮された上記化合物が、少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は少なくとも４つの１３Ｃ同位体；又は少なくとも６つの１３Ｃ同位体；又は少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は少なくとも４つの１５Ｎ同位体；又は少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの２Ｈ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの１３Ｃ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの２Ｈ同位体、及び少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は少なくとも２つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は少なくとも２つの２Ｈ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は少なくとも２つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は少なくとも４つの２Ｈ同位体；又は少なくとも６つの２Ｈ同位体を有する。
[0023]一実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ２）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0024]一実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ３）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0025]一実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ４）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0026]一実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ５）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0027]一実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ６）によって特徴付けられる。
[0028]更なる実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ７）、（ＦＸ８）、（ＦＸ９）、（ＦＸ１０）、（ＦＸ１１）、（ＦＸ１２）、（ＦＸ１３）、（ＦＸ１４）、（ＦＸ１５）、（ＦＸ１６）、又は（ＦＸ１７）によって特徴付けられる：
[0029]一実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ２２）、（ＦＸ２３）、（ＦＸ２４）、（ＦＸ２５）、又は（ＦＸ２６）によって特徴付けられる：
[0030]一実施形態において、同位体が濃縮された上記化合物が、式（ＦＸ１８）又は（ＦＸ１９）によって特徴付けられる：
[0031]一部の実施形態において、式（ＦＸ１）のＺが、存在せず、又は、置換されているアルキレン基及び置換されていないアルキレン基が挙げられるがこれらに限定されない１つ若しくは複数の炭素原子を有する結合基である。特定の実施形態において、式（ＦＸ１）のＺが、ベータアラニン又はグリシンが挙げられるがこれらに限定されない、アミノ酸又はペプチドに対応する基である。一部の実施形態において、上記結合基が、例えば式（ＦＸ１８）及び式（ＦＸ１９）に示されるような、重同位体標識を組み込むことによって、質量差異による多重化の増大を可能にし得る更なる部位を提供し、式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す：
[0032]例えば、式（ＦＸ１８）が、Ｃ、Ｎ、及びＯの重同位体を組み込んで、＋４Ｄａ及び＋８Ｄａの質量差異を達成するのに用いられ得るグリシン−グリシンリンカを組み込み、そして式（ＦＸ１９）が、Ｃ及びＮの重同位体を組み込んで、＋４Ｄａ及び＋８Ｄａの質量差異を達成するのに用いられ得るベータアラニン−ベータアラニンリンカを組み込む。
[0033]一部の実施形態において、式（ＦＸ１）のＲ３及びＲ４又はＲ４及びＲ５が、６員芳香環を形成するように結合している。特定の実施形態において、ＤｉＰｙｒＯの芳香族誘導体が、標識化された種のより感度の良い蛍光検出を可能とする。例えば、式（ＦＸ１）のＲ３及びＲ４又はＲ４及びＲ５が、以下のスキームに従って、ベンゼンに対応する基を形成するように結合している：
[0034]一実施形態において、同位体が濃縮された化合物が、式（ＦＸ２０）又は式（ＦＸ２１）によって特徴付けられる：
[0035]本発明の一実施形態は、同位体が濃縮された、複数の異なる化合物を含む組成物を提供し、同位体が濃縮された、異なる上記化合物が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１）を有し；同位体が濃縮された、異なる上記化合物が、同位体種である。
[0036]一実施形態において、本発明は、質量分析用の標識化試薬として用いられる、同位体が濃縮された、複数の異なる同位体種を含むキットを提供し、同位体が濃縮された上記同位体種が、独立して、式（ＦＸ１）を有し：

式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；Ｚが結合基であり；Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；上記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；上記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；上記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；上記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；ｍが、０又は１であり；上記同位体種の少なくとも一部が、５０ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられ；同位体が濃縮された上記同位体種が、天然の同位体存在量を超える量で存在する。
[0037]更なる実施形態において、上記キットが、同位体が濃縮された、異なる上記同位体種のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上を含む。任意選択で、上記同位体種の少なくとも一部が、５ｍＤａ〜５５ｍＤａの範囲にわたって選択される質量差異によって特徴付けられ、２５ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられることが好ましい。
[0038]一実施形態において、上記同位体種の少なくとも一部が、１００，０００以上の分解力、１２０，０００以上の分解力、２４０，０００以上の分解力、又は４８０，０００以上の分解力を実現する質量分析技術を用いて分解可能な質量差異によって特徴付けられる。上記質量分析が、ＭＳ１技術、多重化技術、プロテオミクス分析技術、グライコーム分析技術、又はメタボロミクス分析技術を含む。上記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、グリカン、又は代謝物質のアミン基、カルボニル基、又はチオール基と反応性である。
[0039]一実施形態において、本発明は、１つ又は複数のアミン基を含有する標的分子を標識化する方法を提供し、上記方法が、
ａ）上記標的分子を用意するステップと；
ｂ）上記標的分子を、同位体が濃縮された化合物と反応させることによって、同位体で標識化された標的分子を生じさせるステップと
を含み；同位体が濃縮された同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１）を有し：

式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；Ｚが結合基であり；Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；上記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；上記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；上記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；上記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；ｍが、０又は１であり；但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とする。
[0040]一部の実施形態において、本発明は、質量分析技術を用いて標的分子を分析する方法を提供し、上記方法が、
ａ）上記標的分子を、複数の異なるサンプル中に与えるステップと；
ｂ）各サンプル中の上記標的分子を、同位体が濃縮された、異なる同位体種と反応させることによって、同位体で標識化された標的分子を含むサンプルを生じさせるステップであって、同位体が濃縮された、異なる上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１）を有し：

式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；Ｚが結合基であり；Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；上記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；上記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；上記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；上記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；ｍが、０又は１であり；但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とし；上記同位体種の少なくとも一部が、５０ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられる、ステップと；
ｃ）上記質量分析技術を用いて、各サンプルについて、同位体で標識化された上記標的分子を分析するステップと
を含む。
[0041]２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の異なるサンプルを、同位体が濃縮された、異なる同位体種と反応させることが好ましい。任意選択で、上記同位体種の少なくとも一部が、５ｍＤａ〜５５ｍＤａの範囲にわたって選択される質量差異によって特徴付けられ、２５ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられることが好ましい。
[0042]一実施形態において、上記質量分析技術を用いて、各サンプルについて、同位体で標識化された上記分析物を分析する上記ステップが、１００，０００以上の分解力、１２０，０００以上の分解力、２４０，０００以上の分解力、又は４８０，０００以上の分解力を実現する質量分析技術を用いて実行される。上記質量分析が、ＭＳ１技術、二重化、三重化、四重化、五重化、六重化、七重化、八重化、九重化、又は十重化の多重化質量分析技術を含む。任意選択で、上記質量分析が、プロテオミクス分析技術、グライコーム分析技術、又はメタボロミクス分析技術を含む。上記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、グリカン、又は代謝物質のアミン基、カルボニル基、又はチオール基と反応性である。
[0043]一実施形態において、上記方法はさらに、上記異なるサンプル中の、標識化された上記標的分子の相対量を定量化するステップを含む。任意選択で、相対的定量化が、標識化された上記標的分子からの蛍光を測定することによって実行される。相対的定量化が、ＭＳ１レベルにて実行され得、そして、定量化がＭＳ２レベルにて実行されるアイソバリック標識化とは異なり、測定される定量的比率が、干渉する前駆イオンの共単離に起因する圧縮の影響を受けない。アイソバリック標識化は、ペプチドをサンプリングして、ＭＳ２によって、定量化のためにレポーターイオンを生じさせることを必要とする一方、質量欠損戦略はそうではない。その理由は、定量的情報が、高分解能ＭＳ１スキャンのペプチド前駆体の相対ピーク面積から収集されるためである。
[0044]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ２）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0045]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ３）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0046]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ４）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0047]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ５）によって特徴付けられ：

式中、符号＊が、それぞれ独立して、上記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す。
[0048]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ６）によって特徴付けられる。
[0049]更なる実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ７）、（ＦＸ８）、（ＦＸ９）、（ＦＸ１０）、（ＦＸ１１）、（ＦＸ１２）、（ＦＸ１３）、（ＦＸ１４）、（ＦＸ１５）、（ＦＸ１６）、又は（ＦＸ１７）によって特徴付けられる：
[0050]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１８）又は（ＦＸ１９）によって特徴付けられる：
[0051]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ２０）又は（ＦＸ２１）によって特徴付けられる：
[0052]一実施形態において、同位体が濃縮された上記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ２２）、（ＦＸ２３）、（ＦＸ２４）、（ＦＸ２５）、又は（ＦＸ２６）によって特徴付けられる：
[0053]一実施形態において、本発明は、同位体が濃縮された標識化試薬を製造する方法であって、アミノ酸前駆体を用意するステップと；上記アミノ酸前駆体を、第１の試薬と化学反応させて、任意選択で置換されているピリミジン基を用意するステップと；上記アミノ酸前駆体のカルボン酸基を、第２の試薬と化学反応させて、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基を得て、以下の式を有する、同位体が濃縮された上記標識化試薬を形成するステップとを含み：

式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；Ｚが結合基であり；Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；上記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；上記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；上記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；上記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；ｍが、０又は１であり；但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とし；同位体が濃縮された上記同位体種が、天然の同位体存在量を超える量で存在する、方法を提供する。
[0054]上記アミノ酸前駆体が、同位体が濃縮されたアミノ酸前駆体、例えば同位体が濃縮されたアルギニンであることが好ましく、上記アミノ酸前駆体が、重同位体である少なくとも２つの原子を含有することによって特徴付けられ、上記重同位体が、天然の同位体存在量を超える量で存在する。上記第１の試薬又は上記第２の試薬が、同位体が濃縮された試薬であることが好ましく、上記試薬が、重同位体である少なくとも２つの原子を含有することによって特徴付けられ、上記重同位体が、天然の同位体存在量を超える量で存在する。
[0055]一実施形態において、上記アミノ酸前駆体のカルボン酸基が反応して、トリアジンエステルが形成される。一実施形態において、アミノ酸前駆体がアルギニンであり、そして上記方法がさらに、上記アルギニンのグアニジン基を誘導体化して、任意選択で置換されているピリミジン基を形成するステップを含む。更なる実施形態において、上記方法がさらに、任意選択で置換されている上記ピリミジン基を形成する前に、ホルムアルデヒドによるパラジウム触媒ジメチル化を上記アミノ酸前駆体に対して実行するステップを含む。
[0056]一実施形態において、本発明の化合物が、式（ＦＸ１）〜（ＦＸ４）のいずかれによって特徴付けられ、式中、ｍが１と等しい。一実施形態において、本発明の化合物が、式（ＦＸ１）〜（ＦＸ４）のいずれかによって特徴付けられ、式中、ｍが０と等しい。本明細書中で用いられる、式（ＦＸ１）〜（ＦＸ４）を有する化合物（式中、ｍが１と等しい）が、結合基Ｚを含む化合物を指す。本明細書中で用いられる、式（ＦＸ１）〜（ＦＸ４）を有する化合物（式中、ｍが０と等しい）が、結合基Ｚを含まない化合物を指し、例えば、式中、アミン反応性基Ａが、主鎖のカルボニル基に直接結合している。
[0057]本方法の重要な態様は、１００，０００以上の分解力、１２０，０００以上の分解力、２４０，０００以上の分解力、又は４８０，０００以上の分解力を実現する質量分析技術を用いて分解され得る質量差異を有する一連の、同位体が濃縮された化合物の使用である。分子質量差異が小さい（例えば３００ｍＤａ以下の）、同位体が濃縮された化合物の少なくとも一部の使用が、一部の実施形態において、高い多重化能に接近するのに有益である。一部の実施形態において、例えば、同位体が濃縮された化合物を分析するステップが、同位体が濃縮された化合物の質量対電荷比及び／又は分子質量の差異を分解することを含む。一部の実施形態において、例えば、第１の同位体が濃縮された化合物と第２の同位体が濃縮された化合物との分子質量の差異が、１００ｍＤａ以下である。一部の用途について、第１の同位体が濃縮された化合物と第２の同位体が濃縮された化合物との分子質量の差異が、５０ｍＤａ以下であり、任意選択で、一部の用途について、第１の同位体が濃縮された化合物と第２の同位体が濃縮された化合物との分子質量の差異が、１０ｍＤａ以上である。一部の実施形態において、例えば、第１の同位体が濃縮された化合物と第２の同位体が濃縮された化合物との分子質量の差異が、１００ｍＤａ〜１ｍＤａの範囲にわたって選択され、任意選択で、一部の用途について、第１の同位体が濃縮された化合物と第２の同位体が濃縮された化合物との分子質量の差異が、５０ｍＤａ〜１ｍＤａの範囲にわたって選択され、任意選択で、一部の用途について、第１の同位体が濃縮された化合物と第２の同位体が濃縮された化合物との分子質量の差異が、５０ｍＤａ〜５ｍＤａの範囲にわたって選択され、任意選択で、一部の用途について、第１の同位体が濃縮された化合物と第２の同位体が濃縮された化合物との分子質量の差異が、５０ｍＤａ〜１ｍＤａの範囲にわたって選択される。一部の実施形態において、例えば、同位体が濃縮された化合物がそれぞれ、分子質量が、別の同位体が濃縮された化合物の１００ｍＤａ〜１ｍＤａ以内であり、任意選択で、一部の用途について、同位体が濃縮された化合物がそれぞれ、分子質量が、別の同位体が濃縮された化合物の５０ｍＤａ〜１ｍＤａ以内であり、任意選択で、一部の用途について、同位体が濃縮された化合物がそれぞれ、分子質量が、別の同位体が濃縮された化合物の１０ｍＤａ〜１ｍＤａ以内である。一部の実施形態において、例えば、同位体が濃縮された化合物の全ての分子質量が、１０００ｍＤａ〜１ｍＤａの範囲内であり、任意選択で、一部の用途について、同位体が濃縮された化合物の全ての分子質量が、１００ｍＤａ〜１ｍＤａの範囲内であり、任意選択で、一部の用途について、同位体が濃縮された化合物の全ての分子質量が、５０ｍＤａ〜５ｍＤａの範囲内である。
ジメチルピリミジニルオルニチンタグ（２５４Ｄａの名目上の質量）及びアミン反応性トリアジンエステル基を含む、本発明の一実施形態におけるＤｉＰｙｒＯ質量欠損標識化試薬を示す図である。合計最大６つの重い安定同位体（１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ、１８Ｏ）を、質量欠損ベースのタグＤｉＰｙｒＯ６の構造（図１Ａ）に、異なる構成で組み込んで、最小質量欠損が４５．２８ｍＤａ、２０．９５ｍＤａ、１２．６４ｍＤａ、８．３１ｍＤａ、及び５．８４ｍＤａであるそれぞれ二重化セット（図１Ｂ）、三重化セット（図１Ｃ）、四重化セット（図１Ｄ）、六重化セット（図１Ｅ）、及び八重化セット（図１Ｆ）を生じさせる。 図１Ｂ〜図１Ｆに類似するが、２つの重い安定同位体（１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ、１８Ｏ）が、質量欠損ベースのタグの構造に、異なる構成で組み込まれて、名目上のタグ質量が２５０Ｄａ（ＤｉＰｙｒＯ２）及び２５８Ｄａ（ＤｉＰｙｒＯ１０）である更なる多重化セットを生じさせる、本発明の一実施形態におけるＤｉＰｙｒＯ質量欠損標識化試薬を示す図である。多重化ＤｉＰｙｒＯ２、ＤｉＰｙｒＯ６、及びＤｉＰｙｒＯ１０セットを、単一の実験に同時に用いて、質量欠損ベースの定量的チャンネルの、４Ｄａの間隔が空けられる３つのクラスタによって、多重化を増大させることができる。 図１Ｂ〜図１Ｆに類似するが、１０個の重い安定同位体（１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ、１８Ｏ）が、質量欠損ベースのタグの構造に、異なる構成で組み込まれて、名目上のタグ質量が２５０Ｄａ（ＤｉＰｙｒＯ２）及び２５８Ｄａ（ＤｉＰｙｒＯ１０）である更なる多重化セットを生じさせる、本発明の一実施形態におけるＤｉＰｙｒＯ質量欠損標識化試薬を示す図である。多重化ＤｉＰｙｒＯ２、ＤｉＰｙｒＯ６、及びＤｉＰｙｒＯ１０セットを、単一の実験に同時に用いて、質量欠損ベースの定量的チャンネルの、４Ｄａの間隔が空けられる３つのクラスタによって、多重化を増大させることができる。 図１Ｂ〜図１ＦのＤｉＰｙｒＯ６二重化、三重化、四重化、六重化、及び八重化セットの、考えられる重同位体構成を示す図である。 ＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣに用いることができる同位体標識化リジン（Ｋ）の重同位体構成を、そして、ＮｅｕＣｏｄｅ標識化リジンを用いて、様々な量の酵母プロテオームを同定するのに必須の分解力を示す図である。 ＤｉＰｙｒＯ６標識化トリプシンペプチドを用いて、様々な量の酵母プロテオームを同定するのに必須の分解力要件を記載する図である。 ＤｉＰｙｒＯ６標識化酵母トリプシン消化物とＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣ酵母Ｌｙｓ−Ｃ消化物との分解力の比較を示す図である。 ＤｉＰｙｒＯ６標識化酵母Ｌｙｓ−Ｃ消化物とＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣ酵母Ｌｙｓ−Ｃ消化物との分解力の比較を示す図である。 本発明の一実施形態におけるＤｉＰｙｒＯ試薬の合成を示す図である。アルギニンは、Ｈ２雰囲気中でのホルムアルデヒドによるパラジウム触媒ジメチル化に続いて、グアニジノの、ピリミジンへの誘導体化を受ける。カルボン酸がトリアジンエステルに活性化されて、ＤｉＰｙｒＯ標識化試薬が生じる。 合成したＤｉＰｙｒＯタギング試薬の直接注入ＭＳ後の、単離したＤｉＰｙｒＯタギング試薬の質量スペクトルを示す図である。フラッシュカラムクロマトグラフィの後、ＤｉＰｙｒＯが高い純度で回収された。 ＨＣＤ標準化衝突エネルギーの最適化を示す図である。ＤｉＰｙｒＯ標識化酵母トリプシン消化物サンプル及びＢＳＡトリプシン消化物を、（図１０Ａ）ＣＩＤ（酵母用）及び（図１０Ｂ）ＨＣＤ（ＢＳＡ用）を用いるＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅの、溶離勾配がそれぞれ１２０分及び３０分のｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２により、分析した。ＮＣＥ値は２４、２７、３０、３３、３６、及び３９であった。同定したペプチドスペクトルマッチの数値（灰色の下部線）及びメジアンＸＣｏｒｒ値（黒色の上部線）を、ＮＣＥの関数としてプロットした。高品質ＭＳ２スペクトルのより大きな数値に基づいて、２９又は３０のＮＣＥを、その後の実験に選択した。 様々な標識対ペプチド比率での、そしてＮ末端標識化（Ｎ）及び／又はリジン標識化（Ｋ）についての標識化効率データを示す図である。ＤｉＰｙｒＯタグは、少なくとも１つのタグでトリプシン生成ペプチド及びＬｙｓ Ｃ生成ペプチドを標識化し、１時間での５０：１（ｗ／ｗ）の標識：ペプチド比にて、＞９９％の効率であった。リジンを含有するトリプシン生成ペプチド及びＬｙｓ Ｃ生成ペプチドは、Ｎ末端及びリジン残基の双方にて、２つのタグで、それぞれ９９％及び９４％の効率で標識化された。 ペプチド同定に及ぼすＤｉＰｙｒＯ標識化の効果を示す。ＤｉＰｙｒＯで標識化した、そして標識化していない酵母トリプシン消化物サンプルを、ＨＣＤフラグメント化を用いる、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥｌｉｔｅのｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２により、分析した（それぞれ２９及び３５のＮＣＥ）図である。標識化サンプル由来の標識化ＰＳＭのペプチド電荷状態（図１２Ａ）、ペプチド長（図１２Ｂ）、及びＸＣｏｒｒ（図１１Ｃ）値の分布を、非標識化サンプル由来の数値に対してプロットした。 ＨＣＤフラグメント化後にＯｒｂｉｔｒａｐで得られたＤｉＰｙｒＯ標識化酵母トリプシンペプチドのＭＳ２スペクトルを示す（２９のＮＣＥ）図である。多くのｙ−イオン及びｂ−イオンを、確信的なペプチド配列同定のために観察した。ＤｉＰｙｒＯタグのフラグメント化によって生じた低質量領域の典型的なイオンを、菱形によって標示した。 特徴的なＤｉＰｙｒＯフラグメントイオンを示す（図１４Ａ）図である。ＤｉＰｙｒＯ標識化ペプチドの衝突誘起解離により、４つの特徴的な「レポーター」イオンが、ＭＳ２スペクトルの低質量領域において生じる。イオンの測定した質量に基づいて、電位構造を示す（図１４Ｂ）図である。理論上のＭＳ２スペクトルは、三重化ＤｉＰｙｒＯ６質量欠損同位体種が更なるイオンを生じさせて、イオンの４つのクラスタが得られることを示す。 本発明の一実施形態の種々の多重化セットを構成する各同位体種のための同位体位置を有する例示的なＤｉＰｙｒＯ６同位体構造を示す図である。これらの例示的な構造は包括的でなく、更なる同位体組合せが利用可能である。 軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１５Ｎ４ １８Ｏ）タグ及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６）タグで二重に標識化して、組み合わせて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２により、１２０分の溶離勾配を用いて分析した、酵母トリプシン消化物サンプル由来のデータを示す図である。また、保持時間（ＲＴ）＝６６．４分にて分解力（ＲＰ）が１２０ｋのＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析器において得たＦＴ−ＭＳスキャンを、ｍ／ｚ ６４２及び９６３にて電荷状態２＋及び３＋により検出した、ＤｉＰｙｒＯで標識化したペプチドの抽出したイオンクロマトグラムと共に示す。また、軽い、そして重い標識化サンプルについてベースライン分解ピークを示す同位体ピーククラスタを、基準ピークイオン（ＢＰＩ）クロマトグラムに加えて示す。 図１６で検出した、いくつかの二重化ＤｉＰｙｒＯ６標識化ペプチドの抽出したイオンクロマトグラムを、軽い、そして重い標識化サンプルについてベースライン分解ピークを示すペプチドの同位体ピーククラスタと一緒に示す図である。 軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１５Ｎ４ １８Ｏ）タグ、中程度のＤｉＰｙｒＯ２２２０（１３Ｃ２ ２Ｈ２ １５Ｎ２）タグ、及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６）タグで三重に標識化して、組み合わせて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２により、１２０分の溶離勾配を用いて分析した、酵母トリプシン消化物サンプル由来のデータを示す図である。ＢＰＩクロマトグラムを、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器で得たＦＴ−ＭＳスキャンと共に示す。また、ＲＰ ３０ｋ及びＲＰ ２４０ｋの背向（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）ＦＴ−ＭＳスキャンで検出した、ｍ／ｚ ７７７でのペプチドの同位体ピークのクラスタを示す。別々に標識化したペプチドサンプルは、３０ｋにて区別がつかないが、２４０ｋにて明らかであり、軽い、中程度の、そして重い、ＤｉＰｙｒＯ６で標識化したサンプルから生じた３つのピークの比較による定量化が可能となる。 ｍ／ｚ ７７７での図１８の三重化ＤｉＰｙｒＯ６標識化ペプチドピークを示す図であり、１２０ｋではなく２４０ｋにてベースライン分解している。このペプチドは、３＋電荷状態で検出された。そして、Ｎ末端にて単一のＤｉＰｙｒＯタグで標識化されている。 軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１５Ｎ４ １８Ｏ）タグ、中程度のＤｉＰｙｒＯ２２２０（１３Ｃ２ ２Ｈ２ １５Ｎ２）タグ、及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６）タグで、それぞれ２：１：２の比率で三重に標識化して、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のＬＣ−ＭＳにより分析した、酵母サンプル由来のデータを示す図である。ＲＰ ３０ｋ及びＲＰ ２４０ｋの背向ＦＴ−ＭＳスキャンで検出した、ｍ／ｚ ４７１、６２８、及び９４２でのペプチドの同位体ピークのクラスタを示す。別々に標識化したペプチドサンプルは、ＲＰ ３０ｋにて区別がつかないが、２４０ｋにて明らかであり、軽い、中程度の、そして重いＤｉＰｙｒＯ６で標識化したサンプルから生じた３つのピークの比較による定量化が可能となる。同定した酵母プロテオームのタンパク質の７６％超及びペプチドの６３％超が、三重化ＤｉＰｙｒＯタグを用いて、うまく定量化された。 単一のＤｉＰｙｒＯタグを有する三重化ＤｉＰｙｒＯ６標識化トリプシンペプチドの、２つのＤｉＰｙｒＯタグを有するトリプシンペプチドとの比較を示す図である。Ｎ末端アミン及びＣ末端アルギニン（Ｒ）残基を有するトリプシンペプチドが、単一のタグを有する一方、Ｎ末端アミン及びＣ末端リジン（Ｋ）残基を有し、側鎖アミンを有するペプチドが、２つのタグを有して、２４０ｋにてより容易にベースライン分解される。チャンネル間での質量欠損差異を２つのタグで２倍にすることで、より低い分解力でのより高次の多重化分析が可能となり得る。 ＲＰ ２４０ｋにて九重化定量化を可能にする二重化ＤｉＰｙｒＯ２、三重化ＤｉＰｙｒＯ６、及び四重化ＤｉＰｙｒＯ１０のセットの組合せを示す図である。多重化の増大は、質量欠損ベースの定量的チャンネルの、４Ｄａの間隔が空けられる３つのクラスタによって達成される。 軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１５Ｎ４ １８Ｏ；＋２５４．１５６１）タグ及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６；＋２５４．２０１３８）タグで、２：１の比率で組み合わせて二重に標識化したアミノ酸フェニルアラニン（１６５．０７９０Ｄａ）、トリプトファン（２０４．０８９９Ｄａ）、及びロイシン／イソロイシン（１３１．０９４６Ｄａ）を含有し、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２により、３０分の溶離勾配を用いて分析した、アミン含有代謝物質標準混合物サンプル由来のデータを示す図である。Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器でＲＰ １２０ｋにて得たＦＴ−ＭＳスキャンを、電荷状態１＋でｍ／ｚ ４２０、４５９、及び３８６にて検出した各ＤｉＰｙｒＯ標識化アミノ酸の抽出したイオンクロマトグラムと共に示す。同位体ピークのクラスタは、軽い、そして重い標識化サンプルについて、ベースライン分解したピークを示す。 真空内で乾燥させて、非同位体ＤｉＰｙｒＯタグ（乾燥ＤＭＦ中）で、２５：１及び５０：１のタグ対糖タンパク質の比率（重量）にて標識化して、ＭＡＬＤＩ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＬＴＱ ＸＬ系で分析した、ＰＮＧａｓｅＦ放出Ｎ−グリコシラミンの標識化効率を示す図である。標識化グリカンピークのシグナル強度を、標識化したグリカンピーク及び標識化していないグリカンピーク（存在する場合）の組合せ強度で割ることによって、標識化効率％を算出した。＞９８％の標識化効率が、１つのグリカン構造以外の全てについて、５０：１の比率で観察される。 １２００〜２０００ｍ／ｚの質量範囲において検出した豊富な非標識化グリカン及び（ＰＮＧａｓｅＦによりオバルブミンから放出された）ＤｉＰｙｒＯ標識化グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを示す図である。 Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器で、ＲＰ ２４０ｋで、ｍ／ｚ ８５８．９にて得た、二重化ＤｉＰｙｒＯ６標識化グリカンの前駆イオン二重線を、軽い、そして重い標識化種の抽出したイオンクロマトグラムと共に示す図である。同位体ピークのクラスタは、軽い、そして重い標識化種について、ベースライン分解ピークを示す。図２６Ｂは、ＨＣＤフラグメント化後に、Ｏｒｂｉｔｒａｐで得た、ｍ／ｚ ８５８．９での二重化ＤｉＰｙｒＯ６標識化グリカンの注釈付きＭＳ２スペクトルを示す（２７のＮＣＥ）。フラグメントイオンの完全なセットを、ＤｉＰｙｒＯ標識化グリカンの確信的な構造的同定のために観察する。 本発明の更なる実施形態の種々の多重化セットを構成する各同位体種のための同位体位置を有する例示的なＤｉＰｙｒＯ２同位体構造を示す図である。これらの例示的な構造は包括的でなく、更なる同位体組合せが利用可能である。 本発明の更なる実施形態の種々の多重化セットを構成する各同位体種のための同位体位置を有する例示的なＤｉＰｙｒＯ１０同位体構造を示す図である。これらの例示的な構造は包括的でなく、更なる同位体組合せが利用可能である。
発明の詳細な説明
定義
[0086]一般に、本明細書中で用いられる用語及びフレーズは、当該技術で認識される意味を有しており、標準的なテキスト、引用雑誌、及び当業者に知られている状況を参照して知ることができる。以下の定義は、本発明の文脈における用語及びフレーズの具体的な使用を明確にするために記載される。
[0087]一実施形態において、本発明の組成物又は化合物、例えば同位体が濃縮された化合物（同位体で標識化された分析物、同位体タギング試薬、同位体で標識化されたアミノ酸、同位体で標識化された標準物質、及び／又は同位体で標識化されたペプチド若しくはタンパク質が挙げられる）が単離され、又は精製される。一実施形態において、単離又は精製された化合物は、当該技術で理解されるように、少なくとも部分的に単離又は精製されている。一実施形態において、本発明の組成物又は化合物は、化学純度が９０％、一部の用途について任意選択で９５％、一部の用途について任意選択で９９％、一部の用途について任意選択で９９．９％、一部の用途について任意選択で９９．９９％、そして一部の用途について任意選択で９９．９９９％である。
[0088]本明細書中で開示される分子の多くが、１つ又は複数のイオン性基を含有する。イオン性基として、プロトンが除去され得る基（例えば−ＣＯＯＨ）、又はプロトンが加えられ得る基（例えばアミン）、及び四級化され得る基（例えばアミン）が挙げられる。そのような分子の全ての可能なイオン性形態及びそれらの塩が、本明細書中の本開示において個々に含まれることが意図される。本明細書中の化合物の塩に関して、当業者であれば、所定の用途のために、本発明の塩の調製に適した多種多様な利用可能な対イオンの中から選択することができる。特定の用途において、塩の調製のための所定のアニオン又はカチオンの選択により、当該塩の溶解度を上昇させ、又は下降させることができる。
[0089]本発明の化合物は、１つ又は複数のキラル中心を含有し得る。したがって、本発明は、ラセミ混合物、ジアステレオ異性体、エナンチオ異性体、互変異性体、及び１つ又は複数の立体異性体が濃縮された混合物を含むことが意図される。記載且つ特許請求される本発明の範囲は、化合物のラセミ体、並びに個々のエナンチオ異性体及びそれらの非ラセミ混合物を包含する。
[0090]本明細書中で用いられる用語「基」は、化合物の官能基を指し得る。本化合物の基は、化合物の一部である原子又は原子の集まりを指す。本発明の基は、１つ又は複数の共有結合を介して、化合物の他の原子に結合していてもよい。基はまた、基の価数状態に関して特徴付けることもできる。本発明は、一価、二価、三価その他の価数状態で特徴付けられる基を含む。
[0091]本明細書中で用いられる用語「前駆イオン」は、ＭＳ／ＭＳ分析のＭＳ１電離段階が挙げられる質量分析の電離段階の間に生産されるイオンを指すのに本明細書中で用いられる。
[0092]本明細書中で用いられる用語「プロダクトイオン」及び「二次イオン」は、本記載中で互換的に用いられ、質量分析中のイオン化及び／又はフラグメント化のプロセス（複数可）の間に生産されるイオンを指す。本明細書中で用いられる用語「二次プロダクトイオン」は、連続フラグメント化のプロダクトであるイオンを指す。
[0093]本明細書中で用いられる用語「分析」は、分析物の特性を判定するプロセスを指す。分析は、例えば、分析物の物理的特性、例えば、質量、質量電荷比、濃度、絶対存在量、相対存在量、又は原子若しくは置換基の組成を判定することができる。プロテオミクス分析の文脈では、用語分析は、サンプル中のタンパク質又はペプチドの組成（例えば配列）及び／又は存在量を判定することを指し得る。
[0094]本明細書中で用いられる用語「分析物」は、分析の対象である化合物、化合物の混合物、又は他の組成物を指す。分析物として、タンパク質、修飾タンパク質、ペプチド、修飾ペプチド、小分子、医薬化合物、オリゴヌクレオチド、糖、ポリマー、代謝物質、脂質、及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
[0095]本明細書中で用いられる用語「質量分析」（ＭＳ）は、分析物の元素組成、質量電荷比、絶対存在量、及び／又は相対存在量の判定のための分析技術を指す。質量分析技術は、分析物、例えばタンパク質、ペプチド、及び他の化合物の組成及び／又は存在量を解明するのに有用である。質量分析は、荷電種又は種フラグメントを生じさせるための分析物のイオン化、荷電種又は種フラグメント、例えばプロダクトイオンへのフラグメント化、及び、荷電種又は種フラグメントの質量電荷比の測定を含み、質量電荷比、更なるフラグメント化プロセシング、電荷移行プロセスその他に基づく単離の更なるプロセスを任意選択で含むプロセスを含む。分析物の質量分析を行うことで、例えば、分析物及び／又は分析物フラグメントについての質量電荷比及び対応する強度データを含む、質量分析データが作成される。分析物イオン及び分析物イオンフラグメントに対応する質量分析データは、分析物イオン及び／又は分析物イオンフラグメントの質量電荷比を表す質量電荷（ｍ／ｚ）単位の関数としての強度として、一般的に与えられる。質量分析により、一般的に、差異分析物に対応する強度が、様々な質量電荷比によって分解され得る。タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ又はＭＳ２）において、質量分析の複数の配列決定が実行される。例えば、タンパク質及びペプチドの混合物を含有するサンプルがイオン化され、そして結果として生じた前駆イオンが、その質量電荷比に従って分離され得る。次に、選択された前駆イオンが、フラグメント化され、そしてさらに、フラグメントの質量電荷比に従って分析され得る。
[0096]本明細書中で用いられる用語「干渉」は、注目する種又は分析物の検出に干渉する、分析の際に検出される種を指す。干渉は、注目するタンパク質又はタンパク質フラグメントではなく、注目するタンパク質フラグメント又はペプチドフラグメントの正確な検出又は定量化に干渉するタンパク質又はタンパク質フラグメントの検出を指し得る。干渉は、干渉比、例えば干渉シグナルの量の、分析物シグナルの量に対する比として定量化することができる。質量スペクトル分析において、干渉は、注目する分析物ではない種の検出に対応する干渉ピークとして表すことができる。
[0097]本明細書中で記載される「単離」又は「単離ウィンドウ」は、選択的に分離され、且つフラグメント化され、操作され、又は単離される、イオン、例えば前駆イオンの範囲を指す。
[0098]本明細書中で用いられる用語「種」は、特定の分子、化合物、イオン、アニオン、原子、電子、又はプロトンを指す。種として、同位体で標識化された分析物、同位体タギング試薬、同位体で標識化されたアミノ酸、及び／又は同位体で標識化されたペプチド若しくはタンパク質が挙げられる。
[0099]本明細書中で用いられる用語「質量電荷比」は、種の質量の、種の電荷状態に対する比率を指す。用語「ｍ／ｚ単位」は、質量電荷比の測定単位を指す。トムソン単位（Ｔｈと省略される）は、ｍ／ｚ単位の例であり、イオンの質量（ダルトン）の、イオンの電荷（元素電荷）に対する比率の絶対値として定義される。
[00100]本明細書中で用いられる用語「質量スペクトロメータ」は、サンプルからイオンを生じさせて、質量電荷比に従ってイオンを分離して、イオン、例えば、同位体が濃縮された化合物、同位体タギング試薬、同位体で標識化されたアミノ酸、及び／又は同位体で標識化されたペプチド若しくはタンパク質に由来するプロダクトイオンを検出する装置を指す。質量スペクトロメータとして、単段階質量スペクトロメータ及び多段階質量スペクトロメータが挙げられる。多段階質量スペクトロメータとして、質量分離されたイオンをフラグメント化して、プロダクトイオンを質量によって一度分離するタンデム質量スペクトロメータが挙げられる。
[00101]用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」は、本明細書中で同義的に用いられており、アミド結合（又はペプチド結合）によって互いに化学結合しているアミノ酸残基で構成される化合物のクラスを指す。ペプチド及びポリペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸残基又は修飾アミノ酸残基を含むポリマー化合物である。修飾は、自然に生じても自然に従わずに生じてもよく、例えば、化学合成によって生じる修飾がある。ペプチド中のアミノ酸への修飾として、リン酸化、グリコシル化、脂質化、プレニル化、スルホン化、ヒドロキシル化、アセチル化、メチル化、メチオニン酸化、アルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化、及び補因子の付加が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドとして、タンパク質が挙げられ、そしてさらに、タンパク質の分解によって、例えばタンパク質分解消化によって生じる組成物が挙げられる。ペプチド及びポリペプチドは、タンパク質の実質的に完全な消化によって、又は部分的な消化によって生じ得る。ポリペプチドとして、例えば、２〜１００アミノ酸単位、一部の実施形態について任意選択で２〜５０アミノ酸単位、一部の実施形態について任意選択で２〜２０アミノ酸単位、一部の実施形態について任意選択で２〜１０アミノ酸単位を含むポリペプチドが挙げられる。
[00102]「タンパク質」は、１つ又は複数のポリペプチド鎖及び／又は修飾ポリペプチド鎖を含む化合物のクラスを指す。タンパク質は、自然に起こるプロセス、例えば翻訳後修飾又は翻訳時修飾によって修飾され得る。例示的な翻訳後修飾又は翻訳時修飾として、リン酸化、グリコシル化、脂質化、プレニル化、スルホン化、ヒドロキシル化、アセチル化、メチル化、メチオニン酸化、補因子の付加、タンパク質分解、及びタンパク質の、巨大分子複合体への集合が挙げられるが、これらに限定されない。また、修飾したタンパク質として、自然に従わずに生じる、化学合成によって生成される誘導体、類似体、及び機能的模擬物が挙げられ得る。例示的な誘導体は、タンパク質を誘導体化する化学修飾、例えばアルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨウ素化、又はあらゆる修飾を含む。
[00103]化学における定量的分析は、サンプル中に存在する１つ、いくつか、又は全ての特定の物質（複数可）の絶対存在量又は相対存在量の判定である。生体サンプルについて、質量分析を介して実行される定量的分析は、ペプチド及びタンパク質の相対存在量を判定することができる。定量化プロセスは、タンパク質及びペプチドの分析物の同位体標識化、並びに質量分析による分析を典型的に包含する。
[00104]サンプルは、別の化合物の物理的特性、例えば質量、長さ、又は親和性に従って、とりわけ、当該技術において周知のクロマトグラフィ技術を用いて、分画することができる。分画は、当該技術において周知の、注目するサンプルを１つ又は複数の物理的特性によって分画するように作用する分離段階で起こり得る。分離段階は、いくつかある技術の中で特に、液体クロマトグラフィ技術及びガスクロマトグラフィ技術を使用することができる。分離段階は、液体クロマトグラフィ分離系、ガスクロマトグラフィ分離系、親和性クロマトグラフィ分離系、及びキャピラリー電気泳動分離系が挙げられるが、これらに限定されない。
[00105]「フラグメント」は、分子の一部、例えばペプチドを指す。フラグメントは、一価イオンであっても多価イオンであってもよい。フラグメントは、親ペプチド中のポリペプチド結合の部位特異的切断が挙げられる、親分子中の結合切断に由来してもよい。フラグメントは、複数の切断事象又は切断工程から生じてもよい。フラグメントは、親ペプチドのカルボキシ末端、アミノ末端、又はこれらの双方である先端を切られた（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ペプチドであってもよい。フラグメントは、ポリペプチド結合、Ｃ−Ｃ結合、Ｃ−Ｎ結合、Ｃ−Ｏ結合の切断、又はこれらの切断プロセスの組合せ直後に生じる生成物を指し得る。フラグメントは、アミノ酸の１つ又は複数の側鎖が除去されるプロセス、若しくは修飾が除去されるプロセス、又はこれらのプロセスのあらゆる組合せによって形成される生成物を指し得る。本発明に有用なフラグメントとして、準安定条件下で形成されるフラグメントが挙げられる。或いは、本発明に有用なフラグメントは、衝突誘起解離（ＣＩＤ）、表面誘起解離（ＳＩＤ）、レーザー誘起解離（ＬＩＤ）、電子捕獲解離（ＥＣＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、若しくはこれらの方法のあらゆる組合せ、又はタンデム質量分析の技術において知られているあらゆる均等物が挙げられるがこれらに限定されない種々の方法による、前駆体へのエネルギーの導入に由来する。また、本発明に有用なフラグメントとして、ｘ−タイプフラグメント、ｙ−タイプフラグメント、ｚ−タイプフラグメント、ａ−タイプフラグメント、ｂ−タイプフラグメント、ｃ−タイプフラグメント、内部イオン（又は内部切断イオン）、インモニウムイオン、又はサテライトイオンが挙げられるが、これらに限定されない。分析物、例えば同位体で標識化された分析物、同位体で標識化された標準物質、及び／又は同位体で標識化されたペプチド若しくはタンパク質に由来するフラグメントのタイプは、親の配列、フラグメント化の方法、親前駆イオンの電荷状態、親前駆イオンに導入されるエネルギーの量、及び親前駆イオンにエネルギーを送達する方法によって多くの場合決まる。フラグメントの特性、例えば分子質量は、フラグメント化質量スペクトルの分析によって特徴付けられ得る。
[00106]タギング試薬の「アミン反応性基」、「カルボニル反応性基」、又は「チオール反応性基」は、ペプチド、タンパク質、又は他の分子のアミン基、カルボニル基、及びチオール基とそれぞれ反応することによって、同位体が濃縮された化合物又はタグと、ペプチド、タンパク質、又は他の分子との間で結合を形成することができるあらゆる官能基であってもよい。
[00107]「アミノ酸」は、アミノ基（ＮＨ２）、カルボン酸基（ＣＯＯＨ）、及び種々のあらゆる側鎖基を含有する有機化合物を指す。アミノ酸は、基本式ＮＨ２ＣＨＲＣＯＯＨ（式中、Ｒは側鎖基である）によって特徴付けられ得る。天然アミノ酸は、自然界で生産されるアミノ酸であり、例えば、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リジン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、セリン、チロシン、アルギニン、及びヒスチジン、並びにオルニチン及びセレノシステインがある。
[00108]本明細書中で用いられる「同位体が濃縮された」及び「同位体で標識化された」は、１つ又は複数の同位体標識、例えば１つ又は複数の重い安定同位体を有する化合物（例えば、同位体で標識化されたアミノ酸、同位体で標識化された標準物質、同位体で標識化された分析物、同位体タギング試薬、及び／又は同位体で標識化されたペプチド若しくはタンパク質）を指す。「同位体標識」は、化合物、例えば同位体で標識化されたアミノ酸、同位体で標識化された標準物質、同位体で標識化された分析物、同位体タギング試薬、及び／又は同位体で標識化されたペプチド若しくはタンパク質に導入される１つ又は複数の重い安定同位体であって、上記化合物が、質量分析を用いて分析された場合に、他の化合物から発せられたシグナルから区別され得るシグナル、例えば、質量電荷比に基づいて他の同位体種から区別され得るシグナルを発する、１つ又は複数の重い安定同位体を指す。「同位体が重い」は、１つ又は複数の高質量の、又は重同位体（例えば重い安定同位体、例えば、１３Ｃ、１５Ｎ、２Ｈ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、３７Ｃｌ、８１Ｂｒ、２９Ｓｉ、及び３０Ｓｉ）を有する化合物又はそのフラグメント／部分を指す。
[00109]一実施形態において、同位体が濃縮された組成物は、特定の同位体組成を有する本発明の化合物を含み、上記化合物は、天然に存在するサンプル中の、同じ同位体組成を有する同じ化合物の存在量を、少なくとも１０倍上回る、一部の実施形態について少なくとも１００倍上回る、一部の実施形態について少なくとも１，０００倍上回る、一部の実施形態について少なくとも１０，０００倍上回る存在量で存在する。別の実施形態において、同位体が濃縮された組成物は、特定の同位体組成を有する本発明の化合物に関して、純度が実質的に濃縮されており、例えば、純度が９０％以上、一部の実施形態において９５％以上、一部の実施形態において９９％以上、一部の実施形態において９９．９％以上、一部の実施形態において９９．９９％以上、一部の実施形態において９９．９９９％以上である。別の実施形態において、同位体が濃縮された組成物は、特定の同位体組成を有する本発明の化合物に関して、例えば当該技術において知られている同位体精製法を用いて精製されたサンプルである。
[00110]「質量スペクトロメータ分解力」（多くの場合分解能と呼ばれる）は、質量スペクトルのｍ／ｚピークがどれくらい十分に分離される（すなわち分解される）かの定量的測定単位である。分解力を算出する種々の規則が存在する。ＩＵＰＡＣの定義は、以下の通りである：分解力（Ｒ）：
概要
[00111]質量分析対応プロテオミクスの分野は、タンパク質及びペプチドの同定の容易さ、及び同定の有用性が増すにつれ、大きくなり続けている。いくつかの方法が現在用いられて、種々のタグを化学的に、又は代謝的に組み込んで、質量スペクトルで検出され得る質量差異を与えてサンプルを差別化して、イオン強度の定量的比較を可能にしている。第一に、細胞培養液中のアミノ酸による安定同位体標識化（ＳＩＬＡＣ）は、細胞培養中の、タンパク質中への標準的な、又は重いアミノ酸の組込みによっており、質量分析によって分析される場合に、この組込みが、２つの離散的なピーク（１３Ｃ重原子に起因する）をもたらす。しかしながら、多重化する（複数のサンプルを比較する）試みは、この技術においては限られている。その理由は、結果として生じる質量スペクトルの複雑性が増大し（標識化されたペプチド間で最低３Ｄａの分離）、これが、達成可能なプロテオミクス適用範囲を狭めるためである。第二に、市販のｉＴＲＡＱ又はＴＭＴ等の試薬によるアイソバリックタギングは、分析されることになるペプチドに多成分タグを化学的に加えて、ＭＳ２レベルでの定量化を実現する。しかしながら、アイソバリック標識化は、前駆体の共単離に起因する、ペプチドの同定及び定量化を低下させる不正確性を欠点としている。
[00112]より最近開発された方法である質量欠損タグ又は中性子質量タグは、ＭＳ１レベルでの定量化用にｍｉｌｌｉＤａ質量差標識化タグをサンプルに加えるものである。この戦略は、従来のＳＩＬＡＣに付随するスペクトル複雑性を増すことなく多重化が可能となる。そして、定量化がＭＳ１レベルにてなされるので、アイソバリック標識化のような前駆体共単離に起因する不十分な定量的精度を欠点としない。
[00113]ジメチルピリミジニルオルニチン（ＤｉＰｙｒＯ）及びその誘導体に基づく新規の質量欠損ベースのタグの設計、合成、及び応用は、この戦略を、サイズがコンパクトであるだけでなく、標識化されるペプチドのフラグメント化を増強するタギング試薬を提供することによって、増強する。多重化されるＤｉＰｙｒＯ質量欠損タグは、市販の出発材料を用いてごく少数の工程で合成することが容易である（図８参照）。特に危険な反応条件も試薬も含まれない。以下に記載される実施例において、タグのＤｉＰｙｒＯ６構造は、６つの重い安定同位体（１３Ｃ、２Ｈ、１５Ｎ、１８Ｏ）を種々の構成で組み込んで、最も軽いタグと最も重いタグとの間で４５．３ｍＤａの質量欠損を、標識化されたペプチドに与える。これ以外にも、ＤｉＰｙｒＯ１０タグは、１０個の重い安定同位体を種々の構成で組み込んで、最も軽いタグと最も重いタグとの間で５４．５ｍＤａの質量欠損を、標識化されたペプチドに与える。例えば、質量が最低でも５．８ｍＤａ異なるＤｉＰｙｒＯ１０同位体種変異体を用いて、最大十重化の定量化が可能である。
[00114]ペプチド又はタンパク質の分析物上のこれらのタグによって与えられる質量差異は、単回のＬＣ−ＭＳ実験由来の相対的定量化での高分解能ＭＳによる分析が可能となるほど小さい（例えば八重化定量化について、５．８〜４５．３ｍＤａ）。小さな質量差異は、結果として生じるスペクトルの複雑性を増大させず、他の技術よりも高い標的同定率が可能となる。
[00115]以前に報告された質量欠損ベースのアミン反応性タグは、以下が挙げられるいくつかの欠点を有する：ａ）タグはサイズが非常に大きく（タグあたり＋４３５Ｄａの質量を、標識化されたペプチドに加える）、このサイズは、とりわけ二重標識化される場合に、標識化されたペプチドのクロマトグラフィ挙動、イオン化、及びフラグメント化に悪影響を及ぼす；ｂ）タグは、標識あたり５つの更なるアミド結合を導入し、アミド結合のフラグメント化は、いくつかの、配列情報のないプロダクトイオンを生成する；ｃ）タグは、アルギニンを含有してもよく、アルギニンは、最も塩基性のアミノ酸として、プロトンを分離し、そして配列情報のあるペプチド主鎖フラグメント化を阻害する。本発明の特定の実施形態が、これらの各問題に直接対処する：ａ）質量欠損ベースのＤｉＰｙｒＯタグは、サイズがコンパクトであり、タグあたり２５０〜２５８Ｄａの適度な質量を、標識化されたペプチドに加える；ｂ）１つの更なるアミド結合のみが導入されるので、配列情報のないフラグメントイオンが最小に保たれる；ｃ）タグは、イオン化、クロマトグラフィ保持／分離に大きな悪影響を与えない；及びｄ）タグはとりわけ、プロトンを分離しないように、且つフラグメント化を妨害しないように設計されている。実際、Ｓｅｑｕｅｓｔ ＨＴデータベースサーチの結果、ペプチド相互相関（ＸＣｏｒｒ）スコアの全体的な増大によって明示される、ＤｉＰｙｒＯ標識化ペプチドのフラグメント化効率の増大が観察された。
[00116]ＤｉＰｙｒＯタグの性能は、非同位体バージョンを用いて評価されて、酵母タンパク質抽出物消化物の高い標識化効率（全ペプチドの＞９９％）が、標準化衝突エネルギー（ＮＣＥ）の低下時のフラグメント化の増強、及び、Ｓｅｑｕｅｓｔ ＨＴデータベースサーチ後の、標識化されたペプチドのより高いＸＣｏｒｒスコアと共に、観察された。ＤｉＰｙｒＯ標識化ペプチドの衝突誘起解離（ＣＩＤ）フラグメント化及び高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメント化に必要とされる最適ＮＣＥは、正常なペプチドと比較して低い（２７〜３０対３５）。同定されたペプチドのＸＣｏｒｒスコアの増大と組み合わされて、ＤｉＰｙｒＯ標識化に由来するフラグメント化効率の著しい増大が観察された。加えて、標識は、より小さなペプチド（＜８アミノ酸）の検出を増強する。
[00117]さらに、用いられる合成アプローチは、タグのいくつかの同位体種変異体の製剤化を可能にすることで、タグの二重化、三重化、四重化、五重化、六重化、八重化、九重化、及び十重化セットが、以前のタグ及び技術による多重化の多くの課題を克服することができる。
[00118]化学物質。標識の合成に用いた全ての同位体試薬を、Ｉｓｏｔｅｃ（Ｍｉａｍｉｓｂｕｒｇ、ＯＨ）から購入した。質量分析用のグレードのトリプシン／Ｌｙｓ Ｃミックス、酵母タンパク質抽出物、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を、Ｐｒｏｍｅｇａ （Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）から購入した。尿素、ＡＣＳグレードのメタノール（ＭｅＯＨ）、ＡＣＳグレードのジクロロメタン（ＤＣＭ）、ＡＣＳグレードのアセトニトリル（ＡＣＮ）、Ｏｐｔｉｍａ ＵＰＬＣグレードのＡＣＮ、Ｏｐｔｉｍａ ＵＰＬＣグレードの水、及びＯｐｔｉｍａ ＬＣ／ＭＳグレードのギ酸を、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）から購入した。パラジウム活性炭（Ｐｄ／Ｃ）、塩化水素ガス（ＨＣｌ）、重水素ガス（Ｄ２）、Ｌ−アルギニンＨＣｌ、ホルムアルデヒド（ＣＨ２Ｏ）、トリス−ＨＣｌ、トリエチルアミン（ＴＥＡ）、アセチルアセトン、ヨードアセトアミド（ＩＡＡ）、重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリニウムテトラフルオロボレート（ＤＭＴＭＭ）、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、及びジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。ヒドロキシルアミン溶液を、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ（Ｗａｒｄ Ｈｉｌｌ、ＭＡ）から購入した。
[00119]１８Ｏ交換。軽いＤｉＰｙｒＯタグ（１５Ｎ４ １８Ｏ）は、Ｐｄ／Ｃ触媒ジメチル化の前に、１８Ｏ交換を必要とする。Ｌ−アルギニンＨＣｌを、１２Ｎ ＨＣｌ Ｈ２ １８Ｏ溶液（ｐＨ１）中に溶解させて、６５℃のホットプレート上で４時間撹拌した。過剰ＨＣｌを、真空内で溶液から蒸発させて、１８Ｏ Ｌ−アルギニンＨＣｌを得た。
[00120]Ｎα，Ｎα−ジメチルアルギニン。Ｌ−アルギニンＨＣｌ、Ｌ−アルギニン−１５Ｎ４ ＨＣｌ、又はＬ−アルギニン−（グアニジンイミノ−１５Ｎ２）ＨＣｌを、Ｈ２Ｏ又はＤ２Ｏ中に溶解させて、ホルムアルデヒド（ＣＨ２Ｏ、３７％ｗ／ｗ）又は同位体ホルムアルデヒド（ＣＤ２Ｏ又は１３ＣＨ２Ｏ、２０％ｗ／ｗ）を、２．５×モル過剰で加えてから、Ｐｄ／Ｃを加えた。反応器の空気を抜いて、Ｈ２ガス又はＤ２ガスで満たして、１００ＰＳＩに加圧して、６０℃にて４時間撹拌した。スラリーを濾過して、Ｎα，Ｎα−ジメチルアルギニン生成物を真空内で乾燥させた。
[00121]Ｎα，Ｎα−ジメチルアルギニンの誘導体化。Ｎα，Ｎα−ジメチルアルギニンを、１：１：２：２ Ｈ２Ｏ：ＴＥＡ：ＥｔＯＨ：アセチルアセトン溶液中に溶解させて、混合液を、６０℃のホットプレート上で１６時間撹拌した。Ｎ５（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）−Ｎα，Ｎα−ジメチルオルニチン（ＤｉＰｙｒＯ）生成物を、真空内で乾燥させて、フラッシュカラムクロマトグラフィ（ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、真空内で乾燥させた。
[00122]ＤｉＰｙｒＯの活性化。無水ＤＭＦ中のＤｉＰｙｒＯを、ＤＭＴＭＭ及びＮＭＭと、ＤｉＰｙｒＯに対して０．９×のモル比で組み合わせて、室温にて３０分間ボルテックスした。混合液を、ペプチド標識化に直ちに用いた。
[00123]酵母タンパク質抽出物の酵素消化。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）タンパク質抽出物（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を、トリプシン／Ｌｙｓ Ｃミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｒＬｙｓ−Ｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、又はＬｙｓ−Ｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって消化した。トリプシン／Ｌｙｓ−Ｃ消化のために、タンパク質を、７Ｍ尿素を有する５ｍＭ ＤＴＴの８０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液ｐＨ８中で３７℃にて１時間還元してから、１５ｍＭ ＩＡＡの付加、及び暗所にて３０分間のインキュベーションによって、遊離チオールをアルキル化した。アルキル化反応を、５ｍＭ ＤＴＴで停止させて、溶液を、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ８で１Ｍ尿素に希釈した。トリプシン／Ｌｙｓ Ｃミックスの付加及び１６時間３７℃でのインキュベーションによって、タンパク質を、１：２５の酵素対タンパク質の比率にて、タンパク質分解により消化した。Ｌｙｓ Ｃ及びＬｙｓ Ｎの消化を同様に実行したが、メーカーのプロトコルによって指図される以下の差異がある：尿素濃度は、Ｌｙｓ Ｃ又はＬｙｓ Ｎの付加前に希釈せず、そしてＬｙｓ Ｃ及びＬｙｓ Ｎによるタンパク質のインキュベーションは、３７℃にてそれぞれ１６時間及び４時間であった。消化をＴＦＡで反応停止させて、ｐＨ＜３にして、ＳｅｐＰａｋ Ｃ１８ ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてペプチドを脱塩した。消化したペプチドを等しいアリコートに３通りに分けて、真空内で乾燥させて、標識化前に、６０：４０のＡＣＮ：０．５Ｍ ＴＥＡＢ ｐＨ８．５中に溶解させた。
[00124]タンパク質消化物の標識化。１９：１、２５：１、又は５０：１の標識対ペプチド消化物の重量比にて、活性化したＤｉＰｙｒＯ溶液を加えて、室温にて１時間ボルテックスすることによって、標識化を実行した。ヒドロキシルアミンを０．２５％の濃度にまで加えることによって、標識化反応を停止させて、標識化したペプチドサンプルを、真空内で乾燥させた。標識サンプルを組み合わせて、ＳＣＸ ＳｐｉｎＴｉｐｓ（Ｐｒｏｔｅａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でクリーニングして、Ｏｍｉｘ Ｃ１８ピペットチップ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で脱塩した。
[00125]ＬＣ−ＭＳ２−ペプチドサンプル。標識化したペプチドサンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ質量スペクトロメータ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に連結したＷａｔｅｒｓ ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ系（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）、又はＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓに連結したＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＰＬＣ系のいずれかを用いるｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２によって、分析した。サンプルを真空内で乾燥させて、水中３％ＡＣＮ、０．１％ギ酸中に溶解させた。一体型エミッタチップで製造し、且つＢｒｉｄｇｅｄ Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｃ１８粒子（１．７μｍ、１３０Å、Ｗａｔｅｒｓ）で１５ｃｍ充填した７５μｍ内径のマイクロキャピラリカラム上に、ペプチドをロードした。移動相Ａを、水及び０．１％ギ酸で構成した。移動相Ｂを、ＡＣＮ及び０．１％ギ酸で構成した。５％〜３５％の移動相Ｂの勾配溶離を、３００ｎＬ／分の流量にて１２０分にわたって用いて、分離を実行した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅで、３８０〜１６００ｍ／ｚのペプチド前駆体の調査スキャンを、１２０ｋ又は２４０ｋ（＠４００ｍ／ｚ）の分解力にて実行した。５×１０５のＡＧＣ標的、そして１５０ミリ秒の最大射出時間であった。次に、上位１５の前駆体を、ＬＴＱでのＣＩＤ ＭＳ２分析について、２．０Ｄａの単離幅、３０の標準化衝突エネルギー（ＮＣＥ）、１×１０４のＡＧＣ標的、そして１００ミリ秒の最大射出時間の急速スキャンモードで選択した。前駆体を、±０．０５ｍ／ｚの許容差の、２０秒間の動的排除に曝した。Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓで、３５０〜１５００ｍ／ｚ由来のペプチド前駆体の調査スキャンを、５００ｋ（＠２００ｍ／ｚ）の分解力にて実行した。１×１０５のＡＧＣ標的、そして１００ミリ秒の最大射出時間であった。次に、上位１５の前駆体を、ＬＴＱでのＨＣＤ ＭＳ２分析について、０．７Ｄａの単離幅、３０のＮＣＥ、１×１０４のＡＧＣ標的、そして３５ミリ秒の最大射出時間の急速スキャンモードで、四重極単離によって選択した。前駆体を、±０．０５ｍ／ｚの許容差の、２０秒間の動的排除に曝した。
[00126]データ分析−ペプチドサンプル。非同位体ＤｉＰｙｒＯ実験用にＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（バージョン１．４．０．２８８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、又は三重化ＤｉＰｙｒＯ実験用にＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．５．５．１）のいずれかを用いて、質量スペクトルを処理した。Ｓｅｑｕｅｓｔ ＨＴアルゴリズムを用いるＰｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒで、又はＡｎｄｒｏｍｅｄａアルゴリズムを用いるＭａｘＱｕａｎｔで、ＵｎｉＰｒｏｔ出芽酵母完全データベースに対して生ファイルを検索した。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒにおいて、２５ｐｐｍの前駆体質量許容差、及び０．６Ｄａのフラグメント質量許容差で、検索を実行した。静的修飾は、ペプチドＮ末端の非同位体ＤｉＰｙｒＯ標識（＋２４８．１６３７２Ｄａ）、及びシステイン残基のカルバミドメチル化（＋５７．０２１４６Ｄａ）からなった。動的修飾は、リジン（Ｋ）残基の非同位体ＤｉＰｙｒＯ標識、及びメチオニン残基の酸化（＋２４８．１６３７２Ｄａ）からなった。パーコレータを用いて、１％ＦＤＲに対するｑ値に基づいて、ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を確認した。ＭａｘＱｕａｎｔにおいて、ＤｉＰｙｒＯ００４１（＋２５４．１５６１０Ｄａ）、ＤｉＰｙｒＯ２２２０（＋２５４．１７７０５Ｄａ）、及びＤｉＰｙｒＯ０６００（＋２５４．２０１３８Ｄａ）についての修飾を、標準的な定量化について、Ｎ末端及びＫ標識として指定した。第１の検索ペプチド許容差を２０ｐｐｍに設定して、主要な検索ペプチド許容差を、４．５ｐｐｍ（Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ）又は１０ｐｐｍ（Ｅｌｉｔｅ）に設定した。システイン残基のカルバミドメチル化の静的修飾及びメチオニン残基の酸化の可変的修飾を選択した。ｉＴＭＳ ＭＳ／ＭＳマッチ許容差を、０．６Ｄａに設定した。タンパク質及びＰＳＭを、１％ＦＤＲまでフィルタリングした（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）。全ての他のパラメータをデフォルトに留めた。定量化に、１の最小比率数（ｍｉｎｉｍｕｍ ｒａｔｉｏ ｃｏｕｎｔ）を指定して、全てのペプチドを用いた。
[00127]フィルタ補助Ｎ−グリカン分離。糖タンパク質（５０ｍＭ ＴＥＡＢバッファ中に溶解させた２μｇ／μＬ）を、４μＬの０．５Ｍ ＴＣＥＰと混合した。サンプル管を、１００℃〜室温のウォーターバスに４回、それぞれ１５秒で交互に入れ替えて、タンパク質を熱変性した。次に、混合液を、３０Ｋ ＭＷＣＯフィルタに加えて、２００μＬの５０ｍＭ ＴＥＡＢバッファとバッファ交換して（１４，０００×ｇで２０℃にて２０分間、３回遠心分離した）、ＰＮＧａｓｅＦ（１μＬ ＰＮＧａｓｅＦ／１０μｇタンパク質）と３７℃にて１８時間インキュベートした。放出されたグリコシラミンを、１４，０００×ｇで２０℃にて２０分間の遠心分離によって、脱グリコシルタンパク質から分離した。次に、結果として生じたＮ−グリコシラミンを、減圧下で乾燥するまで蒸発させて、標識化に直ちに用いた。
[00128]グリカン標識化。活性化したＤｉＰｙｒＯ溶液を乾燥グリカンに、２５：１の標識対元の糖タンパク質質量比（重量）にて加えることによって、標識化を実行して、室温にて１時間ボルテックスした。ヒドロキシルアミンを０．２５％の濃度にまで加えることによって標識化反応を停止させて、標識化したグリカンサンプルを組み合わせて、Ｏａｓｉｓ ＨＬＢカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ）でクリーニングして、真空内で乾燥させた。
[00129]ＬＣ−ＭＳ２−グリカンサンプル。標識化したグリカンサンプルを、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦに連結したＤｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＵＰＬＣ系を用いるｎａｎｏＨＩＬＩＣ−ＬＣ−ＭＳ２によって分析した。サンプルを真空内で乾燥させて、水中８０％ＡＣＮ中に溶解させた。一体型エミッタチップで製造し、且つＰｏｌｙＧＬＹＣＯＰＬＥＸ Ａ粒子（ＰｏｌｙＬＣ）で３０ｃｍ充填した７５μｍ内径のマイクロキャピラリカラム上に、ペプチドをロードした。移動相Ａを、ＡＣＮ及び０．１％ギ酸で構成した。移動相Ｂを、水及び０．１％ギ酸で構成した。２５％〜４５％の移動相Ｂの勾配溶離を、３００ｎＬ／分の流量にて４０分にわたって用いて、分離を実行した。Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦで、３００〜２０００ｍ／ｚの前駆体の調査スキャンを、２４０ｋ（＠２００ｍ／ｚ）の分解力にて実行した。１×１０６のＡＧＣ標的、そして１００ミリ秒の最大射出時間であった。次に、上位５の前駆体を、ＨＣＤ ＭＳ２分析について選択した。２．０Ｄａの単離幅であり、２７の標準化衝突エネルギー（ＮＣＥ）であった。前駆体を、１０秒間の動的排除に曝した。
[00130]ＤｉＰｙｒＯ質量欠損タグの原理及び設計の考慮。ＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣは、従来のＳＩＬＡＣに勝るいくつかの利点を有する生存ＭＳ定量的アプローチとして質量欠損ベースの同位体標識を確立している。しかしながら、上記技術は、代謝組込みに依然として限られている。哺乳類、例えば生理機能又は疾患の研究用のトランスジェニックマウスへのＳＩＬＡＣの応用（ＳＩＬＡＭ）は、組織の収穫以前に、動物の数週間、又は複数世代の、重標識化した食事の給餌を必要とする（Ｗｕら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００４、７６：４９５１〜４９５９；ＭｃＣｌａｔｃｈｙら、Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ、２００７、６：２００５〜２０１０；及びＲａｕｎｉｙａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２０１３、６１：２６０〜２６８）。組織中への組込み率は、様々な組織について様々な組込み率にて生じ、そして組込みは完全でない。ＮｅｕＣｏｄｅアプローチをＳＩＬＡＭに統合するには、高価な質量欠損ベースのリジン同位体種を含有する飼料食が、唯一のタンパク源として数週間供給されることが必要とされる。
[00131]それに対して、化学標識化アプローチは、質量欠損シグネチャーをあらゆる生体サンプル中に、起源に関係なく、高い標識効率で好都合に与えることができる。化学標識化アプローチはまた、哺乳類サンプルについて、対費用効果がより高くなり得る（但し、標識が、容易に利用可能な試薬を用いて容易に合成されることを条件とする）。その理由は、標識化試薬が、タンパク質抽出物の量に比例して、動物を育成するのに必要な食事よりも少量しか必要とされないためである。さらに、化学タグの構造は、単一のアミノ酸に限定されておらず、より多くの同位体を有するようにカスタム設計され得る。ゆえに、ＮｅｕＣｏｄｅ戦略を化学試薬形式に変換することで、広範囲にわたる種々のサンプルに応用可能となり、且つ多重化能を向上させることが可能となろう。この論理に影響されて、Ｈｅｒｂｅｒｔらは、質量が１２．６ｍＤａ異なる質量欠損ベースの同位体種を特徴とするアミン反応性ＮｅｕＣｏｄｅ標識を開発した（Ｈｅｂｅｒｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１３、１２：３３６０〜３３６９）。タグは、３つのアミノ酸（アセチルアルギニン（ＡｃＡｒｇ）、アセチルリジン（ＡｃＬｙｓ）、及びグリシン）、及びＮＨＳエステルアミン反応性基からなる。６つの重い炭素同位体及び重窒素同位体の合計を、ＡｃＡｒｇ基及びＡｃＬｙｓ基に４つの構成で組み込んで、３７．８ｍＤａに及ぶ四重化セットが生じる。当該標識が上記概念を実証するのに適している一方、合成はやや複雑であり、複数の保護同位体アミノ酸が必要とされ、当該同位体アミノ酸は高価であり、結果として生じるタグは非常に嵩高く、タグあたり４３１Ｄａの名目上の質量を標識化ペプチドに加える。
[00132]そのような質量欠損シグネチャーを有するペプチド同士をＭＳ１レベルにて識別するには、精巧なＯｒｂｉｔｒａｐ及びＦＴ−ＩＣＲ ＭＳプラットフォームにのみ利用可能な分解力が必要とされる。Ｈｅｂｅｒｔらは、２つの特定のＮｅｕＣｏｄｅリジン同位体種、１３Ｃ６ ２Ｈ０ １５Ｎ２と１３Ｃ０ ２Ｈ８ １５Ｎ０との間で３６ｍＤａの差異を十分に分解して、典型的なサンプル中のトリプシンペプチドの＞８５％の定量化を可能にするのに、２４０Ｋの分解力が必要とされると算出している２２。１２．６ｍＤａ又は６．３ｍＤａの間隔が空けられたペプチドを約９５％定量化するには、それぞれ４８０Ｋ及び９６０Ｋの分解力を必然的に伴う；したがって、アミン反応性ＮｅｕＣｏｄｅ標識は、１２．６ｍＤａの質量差異に制限された（Ｈｅｂｅｒｔら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１３、１２：３３６０〜３３６９）。
[00133]質量欠損ベースの多重化は、より多くの同位体種変異体を許容することで、分解能に対応する。そして、質量が６．３ｍＤａ異なる同位体種によるアミン反応性ＮｅｕＣｏｄｅタグの十二重化バージョンが報告された（Ｈｅｂｅｒｔら、「ＦＴＭＳ ｅｎａｂｌｅｄ ｎｅｔｕｒｏｎ−ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｔａｇｓ：４，１２，ａｎｄ ３６ ｐｌｅｘｅｓ」、２０１３、１〜７９頁に発表）。当該タグは、５つのアミノ酸の全体にわたって広がる１２個の窒素原子を有し、最も軽い（１３Ｃ０ １５Ｎ１１）変異体と最も重い（１３Ｃ１１ １５Ｎ０）変異体との間で６９．５ｍＤａの質量差異を達成する。理論上の計算に基づいて、６．３ｍＤａの質量欠損によりペプチド同士を区別するには、９６０Ｋの分解力で十分であるはずである。しかし、コアレッセンスを克服して、ｍ／ｚが約８１４の標識化した酵母ペプチドの１２ピーク全てを十分に分解するには、１．６ＭのＦＴ−ＩＣＲ分解力が必要とされた。分解能要件は、ＭＳ機器類で現在可能なことについての境界を押し動かす。そして、巨大サイズのタグ（＞６５０Ｄａ）から、ＭＳ１レベルにて、高レベルの質量欠損ベースの多重化のためにどれほど極端なことをせねばならないのかが分かる。タグは、範囲を絞った原理実証実験において確かに機能的である一方、実際の定量的プロテオミクス実験について、実用的なツールとして機能するのではなく、質量欠損ベースの定量化の潜在性を示すことを意味するに過ぎない。典型的な定量的プロテオミクスワークフローの妥当な境界内に残るタグが、ＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣと質量欠損ベースの化学標識とのギャップを埋めて、アプローチをより利用可能にするのに必要である。
[00134]化学タグ設計に必須の実用的な考慮に関して、単純性、及び利用可能な合成が重要である。質量欠損ベースの化学タグとなるためには、いくつかの他の基準も満たされなければならない。構造は、コンパクトであり、且つ高密度の窒素原子を供給して、１５Ｎによるネガティブな質量欠損を与える一方でまた、１３Ｃ、２Ｈ、及び１８Ｏの組込みについての単純な手段を提供して、ポジティブな質量欠損を与えるべきである。これらの同位体の組込みもまた、安価であるべきである。出発点として、アミノ酸が良好な候補であり得る。その理由は、同位体アミノ酸の広範囲にわたる利用可能性、及び固有のフラグメント化経路を保持する利点のためである。アルギニンは最良の選択肢である。その理由は、４つの窒素原子を有するためである。Ｎ，Ｎ−ジメチル化により、最大６つの２Ｈ同位体を加えて、＋３７．６６２ｍＤａの質量欠損の実質的な組合せを与えることができ、そしてまた、研究者は、２つの１３Ｃ同位体により同位体種を調整することができる。１８Ｏ交換は、２つの同位体を加えるが、中程度の＋４．２４５ｍＤａの質量欠損に寄与し、この質量欠損は、−１１．８６０ｍＤａの質量欠損を与える４つの１５Ｎ同位体との相乗効果を十分に生み出す。これらの２つの単純な合成工程により、合計６つの同位体位置の効率的な使用が可能になって、質量が４５．２７７ｍＤａ異なる軽いタグと重いタグが生じる。１０個もの同位体位置を用いることによって、質量が５４．５０ｍＤａ異なる軽いタグと重いタグを生成することができる。なお、２Ｈ同位体の使用は、最も軽い標識と最も重い標識との間で、窒素原子の数を増やすためにいくつかのアミノ酸を結合させる必要なく、十分な質量欠損差異を達成するのに重要である。そして、ホルムアルデヒドジメチル化によって２Ｈ同位体を組み込むことで、タグサイズをコンパクトに、合成を単純且つ利用可能に保つことができる。重水素原子は、多くの場合、逆相液体クロマトグラフィ（ＲＰＬＣ）中のクロマトグラフィ保持時間の作用に起因する懸念の理由であるが、研究によれば、アミノ酸の第２の炭素上の極性アミンの周りに２Ｈ原子を置くと、ＲＰＬＣ静止相との相互作用が低下して、重水素作用に起因する保持時間のシフトが最小になることが示された（Ｚｈａｎｇら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、２００２、７４：３６６２〜３６６９；及びＧｒｅｅｒら、Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２０１５、２６：１０７〜１１９）。
[00135]残念なことに、アルギニンは、その極性、塩基性、及び親水性に基づいて、化学タグとして特に理想的でない。この特性は、側鎖グアニジノ基の直接的な結果である。そして、考慮されなければならない他の基準である、標識の精製及び活性化、並びに標識化したペプチドのクロマトグラフィ保持、イオン化、及びフラグメント化に影響を及ぼす：。合成したタグは、容易に単離されて、高収率で回収される必要がある。しかし、保護されていないアミノ酸、とりわけアルギニンのような極性のある親水性のアミノ酸は、従来の小分子精製技術（すなわち、液−液抽出、再結晶、析出、フラッシュカラムクロマトグラフィ）による精製をとりわけ困難にするおそれがある。アルギニンの親水性は、標識化したペプチドの全体的な疎水性を引き下げて、Ｃ１８ ＳＰＥクリーンアップ及びＲＰＬＣ分離中の保持を低下させる。アルギニンの塩基性は、標識化したペプチドのイオン化を容易にする一方、フラグメント化による配列情報がほとんど与えられなくなろう。その理由は、アルギニンがプロトンを隔離して、ペプチド主鎖の切断を高度に抑制するためである（Ｔａｎｇら、Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ、１９９３、６５：２８２４〜２８３４；Ｄｉｋｌｅｒら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１９９７、３２：１３３７〜１３４９；及びＳｕｌｌｉｖａｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２００１、２１０〜２１１：６６５〜６７６）。加えて、低荷状態のペプチドは、ＣＩＤ／ＨＣＤフラグメント化の後に、高電荷状態のペプチドよりもうまく配列決定される（Ｓｗａｎｅｙら、Ｎａｔ Ｍｅｔｈ、２００８、５：９５９〜９６４）；１つ又は２つの塩基性アルギニン残基でペプチドを標識化することによって、電荷状態は＋１又は＋２だけ増大して、フラグメント化及び配列同定は妨げられよう。複雑化のこの長いリストは、グアニジノ基を誘導体化して、塩基性を弱め、且つ疎水性を増大させることによって、対処され得る。そのような戦略が、アルギニン含有ペプチドのフラグメント化及び配列決定を向上させるのに以前に使用された（Ｄｉｋｌｅｒら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１９９７、３２：１３３７〜１３４９；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２００１、２１０〜２１１：６６５〜６７６；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９７３、５１：２４７〜２５５；Ｋｕｙａｍａら、２００８、２２：２０６３〜２０７２；Ｆｏｅｔｔｉｎｇｅｒら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２００６、４１：６２３〜６３２；Ｌｅｉｔｎｅｒら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２００３、３８：８９１〜８９９；Ｌｉｎｄｎｅｒら、Ａｎａｌ Ｃｈｉｍ Ａｃｔａ、２００５、５２８：１６５〜１７３；Ｌｅｉｔｎｅｒら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２００７、４２：９５０〜９５９；Ｏｎｏｆｒｅｊｏｖａら、Ｊ Ｓｅｐ Ｓｃｉ、２００８、３１：４９９〜５０６；及びＤｏｎｇｒｅら、Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ、１９９６、１１８：８３６５〜８３７４）。
[00136]詳細には、数人の研究者は、グアニジウムを、アセチルアセトンとの反応によってピリミジンに変換することが有用であることを見出した（Ｄｉｋｌｅｒら、Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、１９９７、３２：１３３７〜１３４９；Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｉｎｔ Ｊ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍ、２００１、２１０〜２１１：６６５〜６７６；Ｍｏｒｒｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９７３、５１：２４７〜２５５；及びＫｕｙａｍａら、２００８、２２：２０６３〜２０７２）。この特定の戦略を、本願の質量欠損タグの設計に応用することによって、結果として生じるジメチルアルギニン誘導体は、クロマトグラフィ保持を実際に高めることができ、エレクトロスプレーイオン化を向上させることができ、且つ標識化したペプチドのタンデム質量フラグメント化を強化することができる。
[00137]本明細書中に記載される一実施形態のＤｉＰｙｒＯ質量欠損タグの一般的な構造は、Ｎ５（４，６−ジメチル−２−ピリミジニル）−Ｎα，Ｎα−ジメチルオルニチン、及びペプチドのＮ末端及びリジン側鎖の選択的修飾用のアミン反応性トリアジンエステル基で構成される（図１Ａ）。一実施形態において、ジメチルピリミジニルオルニチン構造は、質量が最大４５．２８ｍＤａ異なる特有の質量欠損ベースの同位体種を与える、様々な構成の合計６つの重い安定同位体（ＤｉＰｙｒＯ６）を特徴とする。このＤｉＰｙｒＯ試薬の合成（図８）は、ごく少数の工程で達成される：アルギニンのジメチル化、ジメチルアルギニンの、アセチルアセトンによる誘導体化、及びトリアジンエステルを形成するための活性化。不活型ＤｉＰｙｒＯタグは、合成後、高度に純粋であり（図９）、必要とされるまで保存することができる。必要とされる時点で、ＤＭＴＭＭによる活性化が、標識化の直前に実行される。組み込まれた各ＤｉＰｙｒＯ６タグは、２５４Ｄａの中程度の質量を、標識化されたペプチドに加える。市販の同位体出発材料のみを用いて、ＤｉＰｙｒＯ６タグの二重化、三重化セット、四重化セット、及び六重化セットが製剤化され得、タグ間の最小質量欠損は、それぞれ４５．２８ｍＤａ、２０．９５ｍＤａ、１２．６４ｍＤａ、及び８．３１ｍＤａである（図１Ｂ〜図１Ｅ）。質量欠損が５．８４ｍＤａである八重化ＤｉＰｙｒＯ６セット（図１Ｆ）もまた、２つのカスタム同位体アルギニンにより可能である。図１５は、各同位体種のための同位体位置を含む、１１個のＤｉＰｙｒＯ６同位体種を示しており、これらの同位体種は、本発明の一実施形態において、種々の多重化セットを構成することができる。
[00138]加えて、ＤｉＰｙｒＯ同位体種の、２つの、又は１０個の重同位体、ＤｉＰｙｒＯ２及びＤｉＰｙｒＯ１０との使用により、名目上の質量が２５０Ｄａ及び２５８Ｄａであるタグの更なる多重化セットをさらに創出することができ（図２Ａ〜図２Ｂ）、当該セットは、ハイブリッド質量差異／質量欠損定量化アプローチに、２５４Ｄａのタグと併せて用いられて、質量欠損ベースチャンネルの４Ｄａの質量差異間隔のクラスタにより、多重化を増大させることができる。ＤｉＰｙｒＯ２変異体の同位体種は、最小質量欠損が１８．４８ｍＤａ、８．３１ｍＤａ、及び５．８４ｍＤａであるそれぞれ二重化、三重化、及び四重化のセットに構成することができる。ＤｉＰｙｒＯ１０変異体の同位体種は、最小質量欠損が５４．５０ｍＤａ、２６．７９ｍＤａ、１７．５３ｍＤａ、１２．６４ｍＤａ、９．２２ｍＤａ、５．２８ｍＤａ、及び５．８４ｍＤａであるそれぞれ二重化、三重化、四重化、五重化、六重化、九重化、及び十重化に構成することができる。一実施形態において、同位体が濃縮された化合物（複数可）は、図１５、図２７、又は図２８に表される式によって特徴付けられる。
[00139]図１Ｂ〜図１Ｆの考えられる同位体構成、並びに二重化、三重化、四重化、六重化、及び八重化のセットの様々なＤｉＰｙｒＯ６同位体種間の相対質量欠損を、図３にさらに示す。同様に、図４は、ＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣに用いることができる同位体標識化リジン（Ｋ）の重同位体構成及び相対質量欠損間隔を示す。また、図４に示すのは、異なる質量欠損間隔について、ＮｅｕＣｏｄｅ標識化リジンを用いて、様々な量の酵母プロテオームを同定するのに必要とされる分解力である（Ｍｅｒｒｉｌｌら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１４、１３：２５０３〜２５１２参照）。データ依存性ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって同定したおおよそ８，０００の特有のＤｉＰｙｒＯ標識化酵母トリプシンペプチドのライブラリを用いて、各多重化セットの多重線を分解するのに必須のＯｒｂｉｔｒａｐ分解力を評価した（図５）。ｍ／ｚ差異が、１０％の最大ピーク高さの幅よりも広いならば、ペプチドは分解可能であり、ゆえに定量化可能であると考える。
[00140]ＤｉＰｙｒＯ６定量化は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳプラットフォームで、二重化について１２０〜１４０ｋ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ、Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ）、三重化について２４０ｋ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ、及びＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ）、そして四重化及び六重化について≧４８０ｋ（Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ及びＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ）のそれぞれの分解力にて達成可能である。四重化ＤｉＰｙｒＯ２タグ、八重化ＤｉＰｙｒＯ６タグ、又は十重化ＤｉＰｙｒＯ１０タグによる定量化は、全ペプチドの＞９５％を定量化するのに、分解力が１００万に近づくことを、今後のＯｒｂｉｔｒａｐプラットフォーム又は現在のＦＴ−ＩＣＲプラットフォームに要求するであろう。ＤｉＰｙｒＯ６標識化酵母消化物とＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣ酵母トリプシン消化物及びＬｙｓ−Ｃ消化物との分解力の比較を、図６及び図７にさらに示す。ＤｉＰｙｒＯタグにより、分解力の増分毎に、ＮｅｕＣｏｄｅ ＳＩＬＡＣよりも大きな多重化が可能となる。
[00141]２つ、６つ、及び１０個の重同位体によるＤｉＰｙｒＯ２、ＤｉＰｙｒＯ６、及びＤｉＰｙｒＯ１０の変異体を、ハイブリッド質量差異／質量欠損定量化戦略において組み合わせて、所定の分解力にて多重化を増大させることができる。例えば、二重化ＤｉＰｙｒＯ２、三重化ＤｉＰｙｒＯ６、及び四重化ＤｉＰｙｒＯ１０を組み合わせることで、ＲＰ ２４０ｋにて九重化定量化が可能となり（図２２）、これは、各クラスタにおけるタグ間の１７．５３〜２４．３３ｍＤａの質量欠損の分解に十分である。ＲＰ ９６０ｋが可能な機器があれば、四重化ＤｉＰｙｒＯ２、八重化ＤｉＰｙｒＯ６及び十重化ＤｉＰｙｒＯ１０のセットを組み合わせて、二十二重化定量化を達成することができる。図２７及び図２８はそれぞれ、各同位体種のための同位体位置を含む、５つのＤｉＰｙｒＯ２同位体種及び１８個のＤｉＰｙｒＯ１０同位体種を示しており、これらの同位体種は、本発明の一実施形態において、種々の多重化セットを構成することができる。十重化ＤｉＰｙｒＯ１０同位体種のうちの３つを除いて、ＤｉＰｙｒＯ２及びＤｉＰｙｒＯ１０の種々の多重化セットを、市販の同位体出発材料で合成することができる。
[00142]ＤｉＰｙｒＯ試薬の特徴付け及び応用。質量欠損同位体種の合成の前に、標識化用の軽いバージョンのタグ、及び標識化した複合体タンパク質消化物サンプルのＬＣ−ＭＳ２分析を用いて、ＤｉＰｙｒＯ試薬を特徴付けた。ＤｉＰｙｒＯ標識化ペプチドにとって最適な衝突エネルギーを評価するために、標識化した酵母トリプシン消化物を、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥｌｉｔｅでのＬＣ−ＭＳ２により、２４、２７、３０、３３、３６及び３９のＣＩＤ ＮＣＥ値にて分析した。別の実験では、ＨＣＤ衝突エネルギーを、標識化したＢＳＡトリプシン消化物で、同ＮＣＥ値にて評価した。同定したＰＳＭの生じた数値及びメジアンＸＣｏｒｒ値を、ＮＣＥの関数としてプロットした（図１０Ａ〜図１０Ｂ）。一般に、ＤｉＰｙｒＯ標識化ペプチドは、良好なフラグメント化のために、衝突エネルギーの引下げを必要とする。２つの実験の間で用いるサンプルの差異は、ＣＩＤとＨＣＤの公正な比較を可能としない一方、３０のＮＣＥ値が、高い数値の高品質スペクトラムを与えて、ＣＩＤ及びＨＣＤの双方に適していることが観察される。
[00143]活性化及び標識化の反応時間を最適化するために、酵母トリプシン消化物を、いくつかの条件下で標識化して、同定したタンパク質及びペプチドの数、並びにＤｉＰｙｒＯ標識を含有するＰＳＭ数に基づいて、評価した。活性化反応を、３０分間又は１時間実行して、標識化を、３０分間、１時間、２時間、及び４時間実行した。各サンプルについて１２０分の勾配を用いるＯｒｂｉｔｒａｐ ＥｌｉｔｅでのＬＣ−ＭＳ２分析の後（データ示さず）、３０分の活性化で十分であったが、６０分の活性化では、１１％未満のタンパク質群及び１５％未満のペプチドしか生じなかったと判定した。３０分の標識化で十分であり、１時間の標識化とほとんど同等である一方、２時間及び４時間の標識化では、タンパク質及びペプチドの同定数がわずかに低下した。
[00144]標識化効率を評価するために、酵母消化物（トリプシン、Ｌｙｓ Ｃ）を１時間、２５：１又は５０：１の標識対ペプチド比にて標識化して（概して図１１参照）、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅで分析し、ＣＩＤフラグメント化による１２０分の溶離勾配にわたって、１２０ＫのＭＳ１分解力であった。データを、Ｎ末端及びＫ残基上の動的修飾又は静的修飾として指定されるＤｉＰｙｒＯタグにより検索して、標識化効率を評価した。同定したタンパク質群、ペプチド、及びＰＳＭの数値を、以下の表１に要約する。
[00145]
[00146]ＤｉＰｙｒＯをＮ末端及びＫの双方に動的修飾として指定する場合、全体的な標識化効率は、５０：１の標識対ペプチド比にて優れており、ペプチドの９９％超が少なくとも１つのＤｉＰｙｒＯタグを有している。リジンを含有するトリプシンペプチドのほぼ９９％が、２つのタグで標識化されており、そしてリジンを含有するＬｙｓ Ｃペプチドのほぼ９５％が、２つのタグで標識化されている。
[00147]各ペプチド上に２つのＤｉＰｙｒＯタグを組み込むことによって、チャンネル間で測定される質量欠損シグネチャーは２倍になり、定量化に必要な分解能は引き下げられる。サンプル中の全ペプチドが２つのタグを収容し得ることを確実にするために、Ｃ末端側又はＮ末端側にリジンを有するタンパク質分解ペプチドを生産する消化用の酵素として、それぞれＬｙｓ Ｃ又はＬｙｓ Ｎを用いてもよい。ＤｉＰｙｒＯタグはサイズが中程度であるので、２つのタグの存在は、標識化ペプチドの分析を大幅に制限しない。平均的なＬｙｓ Ｃペプチド及びＬｙｓ Ｎペプチドは、平均的なトリプシンペプチドよりも長い一方、内部アルギニンに起因して、より高い電荷状態を有する傾向もある。先で表１に要約した、標識化効率実験由来のデータは、トリプシン消化が、Ｌｙｓ Ｃ消化よりも約２５％多いタンパク質同定数を、そして同様に、より多いペプチド同定数を実現することを示している。１：５０の標識対ペプチド比にて、２つのタグによる標識化が、トリプシンペプチド（９８．８％）についてよりもＬｙｓ Ｃペプチド（９４．９％）についてわずかに低い比率で起こったが、全体的な標識化（Ｎ末端又はＫ）効率は等しかった（９９．８％）。
[00148]次に、ＣＩＤ及びＨＣＤのフラグメント化モードの同定率を比較した。ＨＣＤを用いるＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅでのデータ依存取得中に、Ｏｒｂｉｔｒａｐで得られるあらゆるＭＳ１スキャンを、後のＨＣＤ ＭＳ２スキャンが得られ得る前に、完了しなければならない。しかしながら、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＦＴ）でのＭＳ１取得、及びイオントラップ（ＩＴ）でのＣＩＤ ＭＳ２取得を並行させることができる。この構成において、時間のかかる、高い分解能ＭＳ１トランジェント（ＭＳ１ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）（１２０Ｋについて３８４ミリ秒、２４０ｋについて７６８ミリ秒、４８０ｋについて約１．６ミリ秒）は、質量欠損シグネチャーを区別するのに必須であり、Ｏｒｂｉｔｒａｐで得られる一方、ＬＴＱは、上位のＮ前駆体のＣＩＤ ＭＳ２分析を同時に実行する。これにより、全体的なデューティサイクルに及ぼす高分解能ＭＳ１スキャンの影響は大いに引き下げられて、得られるスペクトル数はより多くなる。３つの分析を実行した：１２０ｋ ＦＴ−ＭＳ１及びＨＣＤ １５ｋのＦＴ−ＭＳ２；１２０ｋ ＦＴ−ＭＳ１及びＣＩＤの急速スキャンＩＴ−ＭＳ２；２４０ｋ ＦＴ−ＭＳ１及びＣＩＤの急速スキャンＩＴ−ＭＳ２。同定したタンパク質群、ペプチド、及びＰＳＭ、並びに得られたスペクトルの数を、表２に要約する。１２０ｋのＭＳ１分解力にて、並行のＣＩＤ ＩＴ−ＭＳ２取得は、ＨＣＤ ＦＴ−ＭＳ２が収集するスペクトルのほぼ２倍多いスペクトルを収集し、そして４４％多いタンパク質群、３５％多いペプチド、及び４８％多いＰＳＭをもたらす。ＭＳ１分解力を２４０ｋに２倍にすると、収集されるスペクトル数が１０％減り、７％少ないタンパク質群、５％少ないペプチド、及び１０％少ないＰＳＭをもたらす。
[00149]
[00150]ペプチド同定に及ぼすＤｉＰｙｒＯ標識化の影響を評価するために、標識化した、そして標識化していない酵母抽出物消化物サンプルのｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２分析を、ＨＣＤフラグメント化を用いて比較した。標識化したサンプルについて３０、そして標識化していないサンプルについて３５の標準化衝突エネルギー価を指定した一方、他の取得パラメータは等しくした。同定したＰＳＭの全体にわたるペプチド電荷状態、ペプチド長、及びＸＣｏｒｒ値の分布を、ヒストグラムとしてプロットして、サンプル間で比較した（図１２Ａ〜図１２Ｃ）。ＤｉＰｙｒＯ標識化により、中程度の電荷状態の増大が導かれることが観察された（標識化したペプチドは、２＋電荷状態と３＋電荷状態との間でそれぞれ４２％と４７％に、より均等に分配される一方、標識化していないペプチドは、大部分が２＋（７７％）であり、４＋の電荷状態が、標識化していないペプチド（２％）よりも標識化したペプチド（９％）について、同様に高い）。標識化はまた、６〜８個のアミノ酸を有する短いペプチドの検出及び同定を増強する（１２．５％の非標識化と比較して、２１．６％の標識化）。興味深いことに、標識化は、ＸＣｏｒｒ値の分布が、より高い値に向けてかなり広がるので、ＭＳ２スペクトルの全体の品質を高める（ＰＳＭの３１％のＸＣｏｒｒが、標識化していないサンプルにおける１１％と比較して、標識化したサンプルにおいて３．０以上である一方、標識化したＰＳＭの１４％のＸＣｏｒｒが、標識化していないＰＳＭの１％と比較して、４．０以上である）。同定信頼度のこの増大は、ＤｉＰｙｒＯタグが、配列情報のあるプロダクトイオンへのペプチドのフラグメント化を高めることを示している。ｂ−イオン及びｙ−イオンの高い適用範囲をもたらすＤｉＰｙｒＯ酵母トリプシンペプチドのＨＣＤ ＭＳ２スペクトルの例を示す（図１３）。標識化したペプチドは、多数のｂ−イオンフラグメント及びｙ−イオンフラグメントを生産して、より確信的なペプチド配列同定を可能にした。
[00151]ＤｉＰｙｒＯで標識化したペプチドのフラグメント化により、アイソバリックタグレポーターイオンに類似するＨＣＤ ＭＳ２スペクトルの低質量領域において、特徴的なフラグメントイオンが生じる（図１４Ａ）。非同位体ＤｉＰｙｒｏタグは、ｍ／ｚ１７６．１２にて強いイオンを、そしてｍ／ｚ２０４．１１、２２１．１８、及び２４９．１７にてより低い強度のイオンを生じさせる。多重化セットは、各タグの異なる同位体構成に起因して、４つのクラスタにおいていくつかのイオンを生じさせることとなる（図１４Ｂ）。これらのイオンは、アイソバリックタグレポーターイオンと同じようにしてＭＳ２レベルの定量化に用いることができる一方、前駆体共単離に起因して生じる同じ、比率のゆがみの影響を受けることとなる。多重化ＤｉＰｙｒＯで標識化したペプチドは、当該ペプチドのいくつかのピークを生じさせるので、とりわけ当該ペプチドの質量をペプチド主鎖フラグメントイオンの質量と共有するならば、これらのピークが、データベースサーチアルゴリズムを用いたペプチド配列の同定を複雑にする可能性がある。ＭＳ２スペクトルのデコンボリューション、及びレポーターイオンの除去によって、標識化したペプチドの同定の信頼度を高めることができることが最近報告された（Ｓｈｅｎｇら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１５、１４：４０５〜４１７）。これらのシグネチャーイオンを除去するようにＭＳ２スペクトルを前処理することは、ＤｙＰｙｒＯで標識化したペプチドの同定におそらく有益であろう。
[00152]複雑な酵母消化物サンプルの標識化及び分析への、二重化ＤｉＰｙｒＯ６タグ及び三重化ＤｉＰｙｒＯ６タグの応用。複雑な酵母消化物サンプルの標識化及び分析に、二重化ＤｉＰｙｒＯ６タグ及び三重化ＤｉＰｙｒＯ６タグを用いて、データを収集した。酵母トリプシン消化物サンプルを、軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１８Ｏ１５Ｎ４）及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６）のタグで二重に標識化して、組み合わせて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２により、１２０分の溶離勾配を用いて分析した（図１６）。保持時間（ＲＴ）＝６６．４分にて分解力（ＲＰ）が１２０ｋのＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析器において、基準ピークイオン（ＢＰＩ）クロマトグラムを得て、ＦＴ−ＭＳスキャンを得た。また、ｍ／ｚ ６４２及び９６３にて電荷状態２＋及び３＋により検出した、ＤｉＰｙｒＯ６で標識化したペプチドの抽出したイオンクロマトグラムを、軽い、そして重い標識化サンプルについてベースライン分解ピークを有する同位体ピーククラスタと共に示す（図１６）。上述のサンプルにおいて検出した、いくつかのＤｉＰｙｒＯ６で標識化したペプチドの抽出したイオンクロマトグラムを、軽い、そして重い標識化サンプルについてベースライン分解ピークを示すペプチドの同位体ピーククラスタと一緒に、図１７に示す。
[00153]酵母トリプシン消化物サンプルを、軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１８Ｏ１５Ｎ４）、中程度のＤｉＰｙｒＯ２２２０（１３Ｃ２ ２Ｈ２ １５Ｎ２）、及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６）のタグで三重に標識化して、組み合わせて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のＬＣ−ＭＳにより、１２０分の溶離勾配を用いて分析した（図１８）。Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器において、ＢＰＩクロマトグラムを得て、ＦＴ−ＭＳスキャンを得た。また、ＲＰ ３０ｋ及び２４０ｋの背向ＦＴ−ＭＳスキャンで検出した、ｍ／ｚ ７７７でのペプチドの同位体ピークのクラスタを示す。別々に標識化したペプチドサンプルは、ＲＰ ３０ｋにて区別がつかないが、２４０ｋにて明らかであり、軽い、中程度の、そして重い、ＤｉＰｙｒＯで標識化したサンプルから生じた３つのピークの比較による定量化が可能となる。このペプチドは、３＋電荷状態で検出され、Ｎ末端にて単一のＤｉＰｙｒＯタグで標識化されていた。三重化ＤｉＰｙｒＯ標識化ペプチドのピークは、１２０ｋではなく２４０ｋにて、ベースライン分解した（図１９）。
[00154]図２０は、軽いＤｉＰｙｒＯ００４１タグ、中程度のＤｉＰｙｒＯ２２２０タグ、及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００タグでそれぞれ２：１：２の比率で三重に標識化して、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のＬＣ−ＭＳにより分析した、酵母サンプル由来の類似のデータを示す。ＲＰ ３０ｋ及び２４０ｋでの背向ＦＴ−ＭＳスキャンで検出した、ｍ／ｚ ４７１、６２８、及び９４２でのペプチドの同位体ピークのクラスタを示す。別々に標識化したペプチドサンプルは、ＲＰ ３０ｋにて区別がつかないが、２４０ｋにて明らかであり、軽い、中程度の、そして重いＤｉＰｙｒＯ６で標識化したサンプルから生じた３つのピークの比較による定量化が可能となる。ＭａｘＱｕａｎｔ（バージョン１．５．５．１）ソフトウェアによるプロセシングの後、同定したタンパク質のおおよそ７６％、及び同定したペプチドの６４％が、三重化ＤｉＰｙｒＯ６タグを用いて、うまく定量化された。
[00155]単一のＤｉＰｙｒＯタグを有するトリプシンペプチドの、２つのＤｉＰｙｒＯタグを有するトリプシンペプチドとの比較を実行した（図２１）。Ｎ末端アミン及びＣ末端アルギニン（Ｒ）残基を有するトリプシンペプチドは、単一のタグを有した一方、Ｎ末端アミン及びＣ末端リジン（Ｋ）残基を有し、側鎖アミンを有するペプチドは、２つのタグを有することによって、与えられる質量欠損を２倍にし、そして、ＲＰ ２４０ｋにて、より容易にベースライン分解された。チャンネル間での質量欠損差異を２倍にすることで、より低い分解力での多重化分析が可能となり得る。
[00156]代謝物質標準物質の標識化及び分析への、二重化ＤｉＰｙｒＯ６タグの応用。アミン含有代謝物質標準物質（アミノ酸のフェニルアラニン（１６５．０７９０Ｄａ）、トリプトファン（２０４．０８９９Ｄａ）、及びロイシン／イソロイシン（１３１．０９４６Ｄａ））の混合物を含有するサンプルを、０．５Ｍ ＴＥＡＢバッファ中に溶解させて、軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１５Ｎ４ １８Ｏ；＋２５４．１５６１）タグ及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６；＋２５４．２０１３８）タグで、２５：１のタグ対代謝物質標準物質の比率（重量）にて１時間、二重に標識化した。標識化したサンプルを、２：１の比率で組み合わせて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｅｌｉｔｅ系のｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２により、３０分の溶離勾配を用いて分析した。図２３は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器でＲＰ １２０ｋにて得たＦＴ−ＭＳスキャンスペクトルを、電荷状態１＋でｍ／ｚ ４２０、４５９、及び３８６にて検出した各ＤｉＰｙｒＯ標識化アミノ酸の抽出したイオンクロマトグラムと共に示す。同位体ピークのクラスタを、軽い、そして重い標識化サンプルについてベースライン分解したピークを示す。
[00157]グリカンの標識化及び分析への、二重化ＤｉＰｙｒＯ６タグの応用。オバルブミン糖タンパク質標準物質を変性させて、グリカンをＰＮＧａｓｅＦにより一晩放出させた。放出したＮ−グリコシラミンを、脱グリコシルしたタンパク質から、１４，０００×ｇでの遠心分離によって分離した。適切な標識化条件を判定するために、フレッシュに放出させたグリカンを、０５Ｍ ＴＥＡＢバッファ中に溶解させ、又は完全に乾燥させてから、２５：１又は５０：１のタグ対元の糖タンパク質質量の比率（重量）にて、フレッシュに活性化した非同位体ＤｉＰｙｒＯタグ（乾燥ＤＭＦ中）を加えた。乾燥したグリカンの標識化により、１時間以内の効率的な標識化が達成された。図２４は、ＭＡＬＤＩ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＬＴＱ ＸＬ系のＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析に従う、２５：１及び５０：１の比率のサンプルについての同定したグリカンの標識化効率を、そして標識化していないグリカンピークと標識化したグリカンピークとのシグナル強度の比較を示す。５０：１の比率は、１つの高質量Ｎ−グリコシラミン以外の全てについて、ほぼ完全な標識化を実現する。１２００〜２０００ｍ／ｚの質量範囲において検出した豊富な非標識化グリカン及び標識化グリカンのＭＡＬＤＩ−ＭＳスペクトルを、図２５に示す。
[00158]次に、フレッシュに放出させたグリカンサンプルを乾燥させて、軽いＤｉＰｙｒＯ００４１（１５Ｎ４ １８Ｏ；＋２５４．１５６１）タグ及び重いＤｉＰｙｒＯ０６００（２Ｈ６；＋２５４．２０１３８）タグで二重に標識化して、１：１の比率で組み合わせて、Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｑ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ ＨＦ系のｎａｎｏＨＩＬＩＣ−ＬＣ−ＭＳ２により、４０分の溶離勾配を用いて分析した。図２６Ａは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器で、ＤｉＰｙｒＯで標識化したグリカンダブレットのＲＰ ２４０ｋで、ｍ／ｚ ８５８．９にて得たＦＴ−ＭＳスキャンスペクトル例を、軽い、そして重い標識化サンプルの抽出したイオンクロマトグラムと共に示す。同位体ピークのクラスタは、軽い、そして重い標識化サンプルについて、ベースライン分解ピークを示す。図２６Ｂは、ＤｉＰｙｒＯ６で標識化したグリカンの確信的な構造的同定についてのフラグメントイオンの完全なセットを含有する、ｍ／ｚ ８５８．９での二重線の注釈付きＨＣＤ ＦＴ−ＭＳ２スペクトルを示す。
[00159]結論。ＤｉＰｙｒＯタグについての合成反応の工程及び条件を決定して、６つの重同位体を有する同位体種で構成されるいくつかのアイソバリック多重化セットがうまく合成された。複雑な酵母消化物サンプルを標識化して、Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＥｌｉｔｅのｎａｎｏＬＣ−ＭＳ２によって分析して、標識化ペプチドのフラグメント化を評価した。質量欠損を２倍にし、且つ分析に要求される分解能を引き下げるためにＮ末端及びリジン側鎖の双方を完全に標識化するための、標識対ペプチド比率の最適化を、トリプシン及びＬｙｓ Ｃ消化物のサンプルについて実行した。トリプシンペプチドサンプル及び二重標識化Ｌｙｓ Ｃペプチドサンプルの定量化を実行して、分解力要件及びプロテオミクス適用範囲を比較した。質量欠損ベースの二重化ＤｉＰｙｒＯ６セット及び三重化ＤｉＰｙｒＯ６セットを用いて、複雑なプロテオーム定量化、アミン含有代謝物質定量化、及びＮ−グリコシラミン定量化用のタグの性能を、高分解能（ＲＰ ２４０ｋ）Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＭＳ取得により実証した。これまで達成してきた研究は、見込みのある結果をもたらして、ＤｉＰｙｒＯ質量欠損タグの実行可能性を、ロバストなＭＳ定量化アプローチとして確立した。
[00160]本出願の全体を通した全ての参照、例えば公布又は取得済みの特許又は均等物；特許出願公報が挙げられる特許文献；及び非特許文献又は他のソース材料；は、それらの全体が、参照によって本明細書に組み込まれるが、この組込みは、各参照が、本出願における本開示と少なくとも部分的に矛盾しない程度に、参照によって個々に組み込まれるかのようになされる（例えば、部分的に矛盾する参照は、参照の部分的に矛盾する部分を除いて、参照によって組み込まれる）。
[00161]本明細書中で使用された用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、示され、且つ記載される特徴のあらゆる均等物又はその一部を除外するような用語及び表現の使用は意図されないが、種々の修正が、特許請求する本発明の範囲内で可能であることが認識される。ゆえに、本発明が、好ましい実施形態、例示的な実施形態、及び任意選択の特徴によって詳細に開示されてきたが、本明細書中で開示される概念の修正及び変形が、当業者によって訴えられ得ること、そしてそのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられることを理解すべきである。本明細書中で提供される特定の実施形態は、本発明の有用な実施形態の例であり、本発明は、本記載において示される、装置、装置構成要素、方法工程の多数の変形を用いて実行されてもよいことが、当業者にとって明らかとなろう。当業者にとって明らかなように、本方法に有用な方法及び装置は、多数の任意選択の組成、プロセシング要素、及び工程を含み得る。
[00162]置換基の一群が本明細書中で開示される場合、その群及び全ての亜群の全ての個々のメンバが、群メンバのあらゆる異性体、エナンチオ異性体、及びジアステレオ異性体を含み、別々に開示されていることが理解される。マーカッシュ群又は他のグループ化が本明細書中で用いられる場合、群の全ての個々のメンバ、並びに当該群の可能な全ての組合せ及び部分的組合せが、本開示において個々に含まれることが意図される。化合物の特定の異性体、エナンチオ異性体、又はジアステレオ異性体が、例えば、式で、又は、化学名で指定されないで、本明細書中で化合物が記載される場合、その記載は、個々の、又はあらゆる組合せの、記載された化合物の各異性体及び各エナンチオ異性体を含むことが意図される。加えて、特に明記されない限り、本明細書中で開示される化合物の全ての同位体変異体が、本開示によって包含されることが意図される。例えば、開示される分子中の１つ又は複数のあらゆる水素が、重水素又は三重水素に置き換えられてもよいことが理解されよう。分子の同位体変異体が、分子のアッセイ、並びに分子又は分子の使用に関する化学研究及び生物学的研究の標準物質として、一般に有用である。そのような同位体変異体を製造する方法が、当該技術において知られている。当業者が同じ化合物を異なって命名し得ることが知られているので、化合物の特定の名前は、例示であることが意図される。
[00163]本明細書中で開示される分子の多くは、１つ又は複数のイオン性基［プロトンが除去され得る基（例えば−ＣＯＯＨ）、若しくは加えられ得る基（例えばアミン）、又は四級化され得る基（例えばアミン）］を含有する。そのような分子の全ての可能なイオン性形態及びそれらの塩が、本明細書中の本開示において個々に含まれることが意図される。本明細書中の化合物の塩に関して、当業者であれば、所定の用途のために、本発明の塩の調製に適した多種多様な利用可能な対イオンの中から選択することができる。特定の用途において、塩の調製のための所定のアニオン又はカチオンの選択により、当該塩の溶解度を上昇させ、又は下降させることができる。
[00164]本明細書中で記載又は例示されるあらゆる製剤又は構成要素の組合せが、特に明記されない限り、本発明を実践するのに用いられ得る。
[00165]明細書中で範囲、例えば温度範囲、時間範囲、又は組成範囲若しくは濃度範囲が与えられる場合はいつでも、所定の範囲内に含まれる全ての中間域及び部分範囲、並びに個々の値が、本開示に含まれることが意図される。本明細書中の記載に含まれる範囲又は部分範囲内のあらゆる部分範囲又は個々の値が、本出願中の特許請求の範囲から除外され得ることが理解されよう。
[00166]本明細書中で言及した全ての特許及び刊行物は、本発明が属する技術の当業者の技術レベルを示す。本明細書中で引用した文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれて、文献の公開日又は出願日時点での当該技術の状態を示し、そしてこの情報は、必要ならば、本明細書中で使用されて、先行技術内の特定の実施形態を除外し得ることが意図される。例えば、物質の組成物が特許請求される場合、出願人の本発明以前に当該技術において知られており、且つ利用可能な化合物（本明細書中の引用文献において効果的な開示が提供される化合物が挙げられる）が、本明細書中の物質の特許請求の範囲の組成物に含まれることが意図されないことを理解すべきである。
[00167]本明細書中で用いられる「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義であり、包括的又は開放型であり、そして追加の、記載されていない要素又は方法工程を除外しない。本明細書中で用いられる「からなる」は、特許請求の範囲の要素において指定されていないあらゆる要素、工程、又は成分を除外する。本明細書中で用いられる「から本質的になる」は、特許請求の範囲の基本的な、そして新規の特性に物質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。本明細書中のそれぞれの例において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「から本質的になる」、及び「からなる」はいずれも、他の２つの用語のいずれかと置き換えられてもよい。本明細書中で実例として記載される本発明は、本明細書中で詳細に開示されていないあらゆる要素（複数可）又は限定（複数可）が不在の場合にも、適切に実践され得る。
[00168]本明細書中で、そして添付の特許請求の範囲で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示す場合を除き、複数の言及を含むことに留意しなければならない。ゆえに、例えば、「細胞」への言及は、そのような細胞、及び当業者に知られているその均等物その他の複数を含む。同様に、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書中で互換的に用いられ得る。また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「有する」は、互換的に用いられ得ることにも留意するべきである。表現「請求項ＸＸ〜ＹＹのいずれかの」（ＸＸ及びＹＹは請求項の番号を指す）は、代替形態の複数の従属請求項を与えることが意図されており、一部の実施形態において、表現「請求項ＸＸ〜ＹＹのいずれか一項に記載の」と互換可能である。
[00169]当業者であれば、具体的に例示される以外の出発材料、生体材料、試薬、合成法、精製法、分析法、アッセイ法、及び生物学的方法が、過度の実験に頼らずに本発明の実践の際に使用され得ることを理解するであろう。そのようなあらゆる材料及び方法の、当該技術において知られている全ての機能的均等物が、本発明に含まれることが意図される。使用された用語及び表現は、限定ではなく説明の用語として用いられており、そのような用語及び表現の使用において、示され、且つ記載される特徴のあらゆる均等物又はその一部を除外する意図はないが、種々の修正が、特許請求する本発明の範囲内で可能であることが認識される。ゆえに、本発明が、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって詳細に開示されてきたが、本明細書中で開示される概念の修正及び変形が、当業者によって訴えられ得ること、そしてそのような修正及び変形は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内にあると考えられることを理解すべきである。
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Claims (69)

  1. 質量分析に標識化試薬として用いられる、同位体が濃縮された化合物を含む組成物であって、前記化合物が、式（ＦＸ１）を有し：

    式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；
    Ｚが結合基であり；
    Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；
    Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；
    前記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；
    前記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；
    前記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；
    前記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；
    ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；
    ｍが、０又は１であり；
    但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とし；同位体が濃縮された前記化合物が、天然の同位体存在量を超える量で存在する、組成物。
  2. 同位体が濃縮された前記化合物が、
    少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも１つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの２Ｈ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；少なくとも２つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体、少なくとも１つの１５Ｎ同位体、及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体、少なくとも１つの１５Ｎ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体
    を有する式（ＦＸ１）によって特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
  3. 同位体が濃縮された前記化合物が、
    少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも６つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの２Ｈ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの１３Ｃ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの２Ｈ同位体、及び少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの２Ｈ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも４つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも６つの２Ｈ同位体
    を有する、請求項１に記載の組成物。
  4. 式（ＦＸ１）のＡが、トリアジンエステル、ＮＨＳエステル、ＴＦＰエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ヒドラジド、アミノオキシ、及びヨードアセチルからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
  5. 式（ＦＸ１）のＺが、アミノ酸又はペプチドに対応する基である、請求項１に記載の組成物。
  6. 式（ＦＸ１）のＺが、ベータアラニン又はグリシンに由来する基である、請求項１に記載の組成物。
  7. Ｒ３及びＲ４又はＲ４及びＲ５が、６員芳香環を形成するように結合している、請求項１に記載の組成物。
  8. Ｒ３及びＲ４又はＲ４及びＲ５が、ベンゼンに対応する基を形成するように結合している、請求項１に記載の組成物。
  9. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ２）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項１に記載の組成物。
  10. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ３）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項１に記載の組成物。
  11. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ４）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項１に記載の組成物。
  12. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ５）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項１に記載の組成物。
  13. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ６）によって特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
  14. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ７）、（ＦＸ８）、（ＦＸ９）、（ＦＸ１０）、（ＦＸ１１）、（ＦＸ１２）、（ＦＸ１３）、（ＦＸ１４）、（ＦＸ１５）、（ＦＸ１６）、又は（ＦＸ１７）によって特徴付けられる、請求項１３に記載の組成物：
  15. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ１８）又は（ＦＸ１９）によって特徴付けられる、請求項１に記載の組成物：
  16. 同位体が濃縮された前記化合物が、式（ＦＸ２０）又は（ＦＸ２１）によって特徴付けられる、請求項１に記載の組成物：
  17. 同位体が濃縮された、複数の異なる化合物を含み、同位体が濃縮された、異なる前記化合物が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１）を有し；同位体が濃縮された、異なる前記化合物が、同位体種である、請求項１に記載の組成物。
  18. 質量分析用の標識化試薬として用いられる、同位体が濃縮された、複数の異なる同位体種を含むキットであって、同位体が濃縮された前記同位体種が、独立して、式（ＦＸ１）を有し：

    式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；
    Ｚが結合基であり；
    Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；
    Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；
    前記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；
    前記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；
    前記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；
    前記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；
    ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；
    ｍが、０又は１であり；
    前記同位体種の少なくとも一部が、５５ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられ；
    同位体が濃縮された前記同位体種が、天然の同位体存在量を超える量で存在する、キット。
  19. 同位体が濃縮された、異なる前記同位体種のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上を含む、請求項１８に記載のキット。
  20. 前記同位体種の少なくとも一部が、５ｍＤａ〜５５ｍＤａの範囲にわたって選択される質量差異によって特徴付けられる、請求項１８に記載のキット。
  21. 前記同位体種の少なくとも一部が、２５ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられる、請求項１８に記載のキット。
  22. 前記同位体種の少なくとも一部が、１００，０００以上の分解力を実現する質量分析技術を用いて分解可能な質量差異によって特徴付けられる、請求項１８に記載のキット。
  23. 前記質量分析が、ＭＳ１技術である、請求項１８に記載のキット。
  24. 前記質量分析が、多重化技術である、請求項１８に記載のキット。
  25. 前記質量分析が、プロテオミクス分析技術である、請求項１８に記載のキット。
  26. 前記質量分析が、グライコーム分析技術である、請求項１８に記載のキット。
  27. 前記質量分析が、メタボロミクス分析技術である、請求項１８に記載のキット。
  28. 前記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、グリカン、又は代謝物質のアミン基と反応性である、請求項１８に記載のキット。
  29. 前記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、グリカン、又は代謝物質のカルボニル基と反応性である、請求項１８に記載のキット。
  30. 前記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、又は代謝物質のチオール基と反応性である、請求項１８に記載のキット。
  31. １つ又は複数のアミン基を含有する標的分子を標識化する方法であって、
    ａ）前記標的分子を用意するステップと；
    ｂ）前記標的分子を、同位体が濃縮された化合物と反応させることによって、同位体で標識化された標的分子を生じさせるステップと
    を含み；同位体が濃縮された同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１）を有し：

    式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；
    Ｚが結合基であり；
    Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；
    Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；
    前記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；
    前記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；
    前記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；
    前記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；
    ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；
    ｍが、０又は１であり；
    但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とする、方法。
  32. 質量分析技術を用いて標的分子を分析する方法であって、
    ａ）前記標的分子を、複数の異なるサンプル中に与えるステップと；
    ｂ）各サンプル中の前記標的分子を、同位体が濃縮された、異なる同位体種と反応させることによって、同位体で標識化された標的分子を含むサンプルを生じさせるステップであり、同位体が濃縮された、異なる前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１）を有し：

    式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；
    Ｚが結合基であり；
    Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；
    Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；
    前記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；
    前記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；
    前記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；
    前記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；
    ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；
    ｍが、０又は１であり；
    但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とし；前記同位体種の少なくとも一部が、５５ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられる、ステップと；
    ｃ）前記質量分析技術を用いて、各サンプルについて、同位体で標識化された前記標的分子を分析するステップと
    を含む方法。
  33. ２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、又はそれ以上の異なるサンプルを、同位体が濃縮された、異なる同位体種と反応させるステップを含む、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記同位体種の少なくとも一部が、５ｍＤａ〜５５ｍＤａの範囲にわたって選択される質量差異によって特徴付けられる、請求項３２に記載の方法。
  35. 前記同位体種の少なくとも一部が、２５ｍＤａ以下の質量差異によって特徴付けられる、請求項３２に記載の方法。
  36. 前記質量分析技術を用いて、各サンプルについて、同位体で標識化された前記分子を分析する前記ステップが、１００，０００以上の分解力を実現する質量分析技術を用いて実行される、請求項３２に記載の方法。
  37. 前記質量分析技術が、ＭＳ１技術である、請求項３２に記載の方法。
  38. 前記質量分析技術が、二重化、三重化、四重化、五重化、六重化、七重化、八重化、九重化、及び十重化の多重化質量分析技術である、請求項３２に記載の方法。
  39. 前記質量分析技術が、プロテオミクス分析技術である、請求項３２に記載の方法。
  40. 前記質量分析技術が、グライコーム分析技術である、請求項３２に記載の方法。
  41. 前記質量分析技術が、メタボロミクス分析技術である、請求項３２に記載の方法。
  42. 前記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、グリカン、又は代謝物質のアミン基と反応性である、請求項３２に記載の方法。
  43. 前記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、グリカン、又は代謝物質のカルボニル基と反応性である、請求項３２に記載の方法。
  44. 前記同位体種の少なくとも一部が、ペプチド、タンパク質、又は代謝物質のチオール基と反応性である、請求項３２に記載の方法。
  45. 炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも５つの原子が、独立して重同位体である、請求項３２に記載の方法。
  46. 同位体が濃縮された前記同位体種が、
    少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも１つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの２Ｈ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；少なくとも２つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体、少なくとも１つの１５Ｎ同位体、及び少なくとも１つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも１つの１３Ｃ同位体、少なくとも１つの１５Ｎ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体
    を有する式（ＦＸ１）によって独立して特徴付けられる、請求項３２に記載の方法。
  47. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して：
    少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも６つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも４つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも４つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの２Ｈ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの１３Ｃ同位体、及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体、少なくとも２つの２Ｈ同位体、及び少なくとも２つの１３Ｃ同位体；又は
    少なくとも２つの１５Ｎ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの２Ｈ同位体及び少なくとも１つの１８Ｏ同位体；又は
    少なくとも２つの１３Ｃ同位体及び少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも２つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも４つの２Ｈ同位体；又は
    少なくとも６つの２Ｈ同位体
    を有する、請求項３２に記載の方法。
  48. 式（ＦＸ１）のＡが、トリアジンエステル、ＮＨＳエステル、ＴＦＰエステル、イソチオシアネート、イソシアネート、ヒドラジド、アミノオキシ、及びヨードアセチルからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
  49. 式（ＦＸ１）のＺが、アミノ酸又はペプチドに対応する基である、請求項３２に記載の方法。
  50. 式（ＦＸ１）のＺが、ベータアラニン又はグリシンに由来する基である、請求項３２に記載の方法。
  51. Ｒ３及びＲ４又はＲ４及びＲ５が、６員芳香環を形成するように結合している、請求項３２に記載の方法。
  52. Ｒ３及びＲ４又はＲ４及びＲ５が、ベンゼンに対応する基を形成するように結合している、請求項３２に記載の方法。
  53. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ２）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項３２に記載の方法。
  54. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ、式（ＦＸ３）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項３２に記載の方法。
  55. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ４）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項３２に記載の方法。
  56. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ５）によって特徴付けられ：

    式中、符号＊が、それぞれ独立して、前記重同位体のうちの１つであってもよい原子を示す、請求項３２に記載の方法。
  57. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ６）によって特徴付けられる、請求項３２に記載の方法。
  58. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ７）、（ＦＸ８）、（ＦＸ９）、（ＦＸ１０）、（ＦＸ１１）、（ＦＸ１２）、（ＦＸ１３）、（ＦＸ１４）、（ＦＸ１５）、（ＦＸ１６）、又は（ＦＸ１７）によって特徴付けられる、請求項３２に記載の方法：
  59. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ１８）又は（ＦＸ１９）によって特徴付けられる、請求項３２に記載の方法：
  60. 同位体が濃縮された前記同位体種が、それぞれ独立して、式（ＦＸ２０）又は（ＦＸ２１）によって特徴付けられる、請求項３２に記載の方法：
  61. 前記異なるサンプル中の、標識化された前記標的分子の相対量を定量化するステップをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
  62. 前記異なるサンプル中の、標識化された前記標的分子の相対量を定量化する前記ステップが、標識化された前記標的分子からの蛍光を測定することを含む、請求項６１に記載の方法。
  63. 同位体が濃縮された標識化試薬を製造する方法であって、
    アミノ酸前駆体を用意するステップと；
    前記アミノ酸前駆体を、第１の試薬と化学反応させて、任意選択で置換されているピリミジン基を用意するステップと；
    前記アミノ酸前駆体のカルボン酸基を、第２の試薬と化学反応させて、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基を得て、以下の式を有する、同位体が濃縮された前記標識化試薬を形成するステップとを含み：

    式中、Ａが、アミン反応性基、カルボニル反応性基、又はチオール反応性基であり；
    Ｚが結合基であり；
    Ｒ３〜Ｒ５が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル若しくはＣ１〜Ｃ４アセチルであり、又はＲ３〜Ｒ５のうちの少なくとも２つが、５員若しくは６員の芳香族若しくは脂環式の環を形成するように結合しており；
    Ｒ１、Ｒ２、及びＲ６が、それぞれ独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、又はＣ１〜Ｃ４アセチルであり；
    前記化合物中の任意の数の炭素が、１２Ｃ又は１３Ｃであり；
    前記化合物中の任意の数の窒素が、１４Ｎ又は１５Ｎであり；
    前記化合物中の任意の数の水素が、１Ｈ又は２Ｈであり；
    前記化合物中の任意の数の酸素が、１６Ｏ又は１８Ｏであり；
    ｎが、１〜５の範囲から選択される整数であり；
    ｍが、０又は１であり；
    但し、炭素原子、窒素原子、酸素原子、及び水素原子から独立して選択される、式（ＦＸ１）のうちの少なくとも２つの原子が、独立して重同位体であることを条件とし；
    同位体が濃縮された前記同位体種が、天然の同位体存在量を超える量で存在する、方法。
  64. 前記アミノ酸前駆体が、同位体が濃縮されたアミノ酸前駆体であり、前記アミノ酸前駆体が、重同位体である少なくとも２つの原子を含有することによって特徴付けられ、前記重同位体が、天然の同位体存在量を超える量で存在する、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記アミノ酸前駆体が、同位体が濃縮されたアルギニンである、請求項６３に記載の方法。
  66. 前記第１の試薬又は前記第２の試薬が、同位体が濃縮された試薬であり、前記試薬が、重同位体である少なくとも２つの原子を含有することによって特徴付けられ、前記重同位体が、天然の同位体存在量を超える量で存在する、請求項６３に記載の方法。
  67. 前記アルギニンのグアニジン基を誘導体化して、任意選択で置換されているピリミジン基を形成するステップを含む、請求項６５に記載の方法。
  68. 任意選択で置換されている前記ピリミジン基を形成する前に、ホルムアルデヒドによるパラジウム触媒ジメチル化を前記アミノ酸前駆体に対して実行するステップをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
  69. 前記アミノ酸前駆体のカルボン酸基が反応して、トリアジンエステルが形成される、請求項６３に記載の方法。
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