BRPI0718407A2

BRPI0718407A2 - Conjunto de reagentes de marcação, métodos para analisar simultaneamente a presença de um ou mais polipeptídeos, para marcar uma amostra de polipeptídeos, e para determinar montantes relativos de polipeptídeos ou peptídeos, uso do método, mistura de polipeptídeos ou peptídeos, kit, e, dispositivo para marcação por multiplexação e análise de amostras de proteínas.

Info

Publication number: BRPI0718407A2
Application number: BRPI0718407-7A
Authority: BR
Inventors: Ralf Hoffmann
Original assignee: Koninkl Philips Electronics Nv
Priority date: 2006-11-02
Filing date: 2007-10-23
Publication date: 2013-12-17
Also published as: WO2008053399A1; EP2087357A1; RU2009120683A; US20100068819A1; CN101542291A; EP1918714A1; JP2010509567A

Description

"CONJUNTO DE REAGENTES DE MARCAÇÃO, MÉTODOS PARA ANALISAR SIMULTANEAMENTE A PRESENÇA DE UM OU MAIS POLIPEPTÍDEOS, PARA MARCAR UMA AMOSTRA DE POLIPEPTÍDEOS, E PARA DETERMINAR MONTANTES RELATIVOS DE POLIPEPTÍDEOS OU PEPTÍDEOS, USO DO MÉTODO, MISTURA DE POLIPEPTÍDEOS OU PEPTÍDEOS, KIT, E, DISPOSITIVO PARA MARCAÇÃO POR MULTIPLEXAÇÃO E ANÁLISE DE AMOSTRAS DE PROTEÍNAS" CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê métodos e ferramentas para a triagem de alvos por técnicas de espectrometria de massa. Mais particularmente, os métodos e ferramentas da invenção permitem a triagem paralela de múltiplas amostras, com cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massa, usando uma combinação de procedimentos de marcação de peptídeos isotópicos e isobáricos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A análise e identificação de proteínas em misturas altamente complexas demandam tremendo poder resolutivo. Dois métodos comumente usados para resolução de tais misturas são eletroforese em gel bidimensional (2D-GE) e cromatografia líquida bidimensional ((2D)-LC).

2D-GE de alta resolução foi introduzida por Klose (1975) Humangenetik 26, 231-243 e 0'Farrell (1975), J. Biol Chem. 250, 4007- 40021. 2D-GE não é superada em resolução (>5000 proteínas), mas sofre de falta de automação e reprodutibilidade. Além disso, proteínas como proteínas de membrana hidrofóbica, proteínas básicas, proteínas ácidas, proteínas muito grandes ou muito pequenas são mal resolvidas.

Para os muitos marcadores promissores de doenças que escapam à identificação com eletroforese em gel, 2D-LC provê uma boa alternativa, permitindo separação com alta resolução de misturas complexas de proteínas [Hanash et al (2003) Nature 422, 226-232; Lipton et al. (2002) Proc. Natl Acad. Sei. USA 99, 11049-11054], Técnicas de 2D-LC são mais adequadas que as de 2D-GE para separar proteínas menores e apresentam automação e produtividade significativamente melhores. Várias tecnologias para separar digeridos de proteína/peptídeo por cromatografia líquida foram descritas, incluindo eletroforese capilar (CE), cromatografia líquida de alto desempenho de fase reversa (RP) HPLC, e cromatografia líquida bidimensional.

Tipicamente, peptídeos e proteínas isoladas por 2D-GE ou 2D- LC são identificadas seja por espectrometria de massa ou por determinação de composição de aminoácidos e/ou seqüência de aminoácidos.

O problema mais relevante para determinar diferenças de expressão de proteína estatisticamente significativas entre diferentes amostras (por exemplo, doença vs. controle) por tecnologias de espectrometria de massa é a quantificação relativa de sinais de MS provenientes das diferentes amostras. Portanto, é altamente desejável desenvolver metodologias, que permitam o processamento de amostras múltiplas em paralelo a fim de reduzir a variabilidade técnica entre diferentes amostras tanto quanto possível.

Recentemente, duas técnicas foram introduzidas para isto. A primeira técnica é a tecnologia de etiqueta de afinidade codificado por isótopo (Isotope-Coded AffinityTag (ICAT)) que permite análise proteômica quantitativa baseada em marcação diferencial isotópica de misturas de proteínas relacionadas [Gygi et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17, 994-999]. O reagente ICAT descrito usa três elementos funcionais: um grupo reativo a tiol para a marcação seletiva de resíduos de cisteína reduzidos, uma etiqueta de afinidade biotina para isolação seletiva de peptídeos marcados por cisteína, e uma etiqueta isotópica, que é sintetizado em duas formas isotópicas, a forma

• Λ 1 1

"leve" (não-isotópica) ou a "pesada" (utilizando H ou C). Como apenas um número moderado de peptídeos gerados contém cisteína em sua seqüência primária, a complexidade da amostra digerida purificada por afinidade decresce dramaticamente. Duas amostras de peptídeo individualmente marcadas ("leve" vs. "pesado") são combinadas antes de serem submetidas a técnicas de separação como cromatografia líquida (Figura 1) seguida por identificação por MS.

Uma técnica alternativa usa reagentes marcados isobaricicamente, designados como marcadores isobáricos, para quantificação relativa e absoluta (Isobaric Tag for Relative and Absolute Quantization (iTRAQ)). Esta técnica descrita por Ross et al. (2004, MoI. Cell. Proteomics 3, 1154-1169) provê quatro diferentes reagentes iTRAQ, cada um contendo um grupo repórter, um grupo de equilíbrio e um grupo reativo a peptídeo que reage com grupos amina primária (Figura 3). O grupo repórter é um grupo com uma massa de 114, 115, 116 ou 117 Da, dependendo de combinações isotópicas diferenciais de nCInC e 16O/18O em cada reagente. O grupo de equilíbrio varia em massa de 31 a 28 Da para assegurar que a massa combinada do grupo repórter com o grupo de equilíbrio permaneça constante (145 Da) para os quatro reagentes. Assim, a marcação do mesmo peptídeo com cada um desses reagentes (contendo combinações específicas de diferentes isótopos nos grupos repórter e de balanceamento) resulta em peptídeos que são isobáricos e coeluem em cromatografia líquida e consequentemente são cromatograficamente indistinguíveis. Durante análise por MS/MS, os íons com grupo repórter são fragmentados dos peptídeos, apresentando massas distintas de 114 a 117 Da. A intensidade destes fragmentos pode ser usada para quantificação dos peptídeos individuais. Assim a presença de um peptídeo particular em quatro diferentes amostras pode ser determinada diferencialmente marcando cada uma das amostras com um reagente iTRAQ. diferente. Marcadores iTRAQ são usados para quantificar a abundância relativa bem como a absoluta do peptídeo a partir de espectros MS/MS e permitem a marcação de até quatro diferentes amostras em um único experimento. Além disso, os peptídeos marcados são isobáricos e todos contribuem para uma espécie de íon que é observado na MS e que é usado para CID. Isto resulta em intensidade de sinal aumentada e maior probabilidade de identificação correta de peptídeo, particularmente para moléculas com baixa abundância, características de muitas proteínas biologicamente significativas. Recentemente, o conjunto de reagentes ITRAQ comercialmente disponíveis cresceu para oito, incluindo grupos repórter com massas de 113, 118, 119e 121.

Quantificação absoluta e relativa de sinais de MS é uma questão não resolvida em descoberta de biomarcadores por tecnologias baseadas em técnicas de espectrometria de massa. Entretanto, a identificação de diferenças relevantes de expressão entre diferentes amostras, (por exemplo, diferentes grupos de doença, diferentes estágios de progressão de uma doença, doença vs. controle/saudável) requer técnicas altamente reprodutíveis, pois biomarcadores relevantes só podem ser derivados de um grande número de medições.

As técnicas acima descritas ICAT e iTRAQ permitem uma multiplexação seja de 2 (ICAT) ou até 4 ou 8 (iTRAQ) amostras individuais com processamento simultâneo, minimizando assim a variabilidade técnica. Entretanto ambas as técnicas apresentam limitações significativas. A técnica ICAT só permite a investigação de duas amostras diferentes, ou dois grupos de doença, o que normalmente não representa o espectro completo de grupos relevantes da doença (por exemplo, diferentes estágios de progressão de uma doença). Seria, portanto, muito vantajoso ter disponível uma técnica, que permita a investigação de mais de 2 grupos. A tecnologia iTRAQ, embora permitindo análise de múltiplas amostras tem a desvantagem clara de exigir a realização de varreduras MS/MS em cada sinal MS (tanto para peptídeos não marcados quanto para os marcados) para quantificação relativa dos sinais do repórter. Na prática, isto não é viável quando o material de partida é de alta complexidade, como no caso de soro humano, ou outros fluidos corporais, pois a análise demandará tempo excessivo. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção supera a multiplexação limitada das técnicas da técnica anterior, combinando um componente de marcação isotópico e um componente de marcação isobárico em um único reagente de marcação. Com a geração de um maior número de reagentes de marcação diferencial que podem ser usados, a multiplexicidade da detecção da amostra combinada é aumentada.

As ferramentas e métodos de marcação da presente invenção têm a vantagem da fácil identificação em MS dos peptídeos diferencialmente marcados, limitando, portanto, a análise aos peptídeos de interesse.

O uso de métodos de marcação dupla da presente invenção tem a vantagem de reduzir significativamente o tempo de análise por espectrometria de massa, porque só precisam ser analisados por MS/MS aqueles peptídeos para os quais uma expressão diferencial de um peptídeo é observada entre amostras diferentes.

As ferramentas e métodos que fazem uso do método de marcação da presente invenção são de interesse para triagem múltipla de amostras de proteínas. Mais particularmente, eles tornam possível determinar simultaneamente diferenças quantitativas e/ou qualitativas em proteínas em amostras diferentes de proteínas. Isto pode ser usado para determinar diferenças em níveis de expressão, e permite também a determinação de diferenças de processamento proteolítico entre amostras diferentes de proteínas, por exemplo, no contexto de uma doença. Neste aspecto a presente invenção provê métodos para triagem múltipla de amostras diferentes que podem ser diretamente comparadas, por exemplo, na comparação de diferentes estágios de uma doença e/ou diferentes formas de doença.

Os reagentes de marcação da presente invenção permitem a realização de experimentos de marcação com multiplexação em que só um estágio de marcação é usado. Embora a identificação final de todas as proteínas diferencialmente marcadas seja assegurada por MS/MS, a presença de uma etiqueta isotópica nas proteínas ou peptídeos permite a identificação de todos os peptídeos diferencialmente marcados em um espectro de MS, pois eles aparecerão como picos separados distintos, com uma diferença de massa correspondente à diferença no isótopo marcador. Isto permite a limitação da análise adicional por MS/MS a aqueles peptídeos que foram identificados como estando expressos diferencialmente no estágio MS. Adicionalmente, a presença de uma etiqueta de afinidade permite limitação adicional da primeira análise por MS a peptídeos efetivamente marcados.

Aspectos particulares e preferidos da invenção são relatados nas reivindicações independentes e dependentes seguintes. Características das reivindicações dependentes podem ser combinadas com características das reivindicações independentes e de outras reivindicações dependentes sempre que for adequado e não meramente como explicitamente indicado nas reivindicações.

Um primeiro aspecto da invenção refere-se a um conjunto de reagentes de marcação para análise por espectrometria de massa de polipeptídeos, cada reagente de marcação contendo um componente de marcação alobárico, uma proteína/grupo reativo a peptídeo, e um componente de marcação isobárico contendo um grupo repórter (RP) e um grupo de equilíbrio (BG).

Em um modo de realização o componente de marcação alobárico é um componente de marcação isotópico, que não está contido no componente de marcação isobárico no reagente de marcação. Alternativamente, o componente de marcação alobárico está contido dentro do grupo repórter e/de equilíbrio do marcador isobárico no reagente de marcação.

Em um modo de realização dos reagentes de marcação da presente invenção, o grupo reativo a proteína/peptídeo reage com um resíduo de cisteína em uma proteína ou polipeptídeo.

Modos de realização particulares da presente invenção provêem reagentes de marcação como os descritos acima, contendo adicionalmente uma etiqueta de afinidade, que é opcionalmente clivável. Em outro modo de realização particular, a etiqueta de afinidade é biotina, ou uma molécula dela derivada.

Um outro aspecto da invenção provê métodos para analisar simultaneamente a presença de um ou mais polipeptídeos contendo um grupo funcional em diferentes amostras, que compreendem um estágio de marcação, em que cada amostra é marcada com um de um conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla de acordo com a presente invenção tendo a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química e contendo um componente alobárico e um componente de marcação isobárico. O estágio de marcação é assegurado permitindo que o grupo reativo a proteína dos reagentes de marcação reaja com um grupo funcional de um ou mais polipeptídeos nas amostras, ou peptídeos gerados a partir dos mesmos (como resultado, por exemplo, de clivagem proteolítica). Outros estágios dos métodos de acordo com este aspecto da invenção incluem, mas não estão limitados a (2) a combinação das amostras diferentes para obter uma mistura de amostras de polipeptídeos, (3) o isolamento seletivo dos polipeptídeos ou peptídeos duplamente marcados da mistura de amostras de polipeptídeos, e (4) a análise da ocorrência relativa dos polipeptídeos ou peptídeos marcados isolados por espectroscopia de massa. O conjunto de reagentes de marcação usado nos métodos da

presente invenção tipicamente compreende uma combinação única de um componente alobárico e um componente de marcação isobárico. De acordo com um modo de realização os componentes de marcação alobáricos são componentes de marcação isotópicos. De acordo com um modo de realização particular, os reagentes de marcação usados nos métodos acima descritos contêm uma etiqueta de afinidade.

De acordo com um modo de realização, os métodos da invenção compreendem adicionalmente, após o estágio (a); um estágio de clivagem, em que as proteínas ou polipeptídeos da amostra são clivados em peptídeos. Em um modo de realização particular esta clivagem é feita com tripsina.

De acordo com um modo de realização particular deste aspecto da invenção, a etapa (c) compreende o isolamento seletivo dos polipeptídeos ou peptídeos baseado em uma etiqueta de afinidade presente nos polipeptídeos ou peptídeos marcados.

Em um modo de realização particular deste método, o grupo funcional presente nos polipeptídeos ou peptídeos da amostra e que reage com o grupo reativo a proteína dos reagentes de marcação é um tiol.

De acordo com outro modo de realização deste método, o grupo funcional presente nos polipeptídeos ou peptídeos da amostra e que reage com o grupo reativo a proteína dos reagentes de marcação está presente como resultado de uma modificação de outro grupo funcional. Assim os métodos da presente invenção opcionalmente compreendem um estágio adicional de modificação, no qual os polipeptídeos ou peptídeos da amostra são modificados para obtenção de um grupo funcional adequado para reagir com o grupo reativo a proteína de um dos reagentes de marcação como os descritos aqui.

De acordo com um modo de realização dos métodos deste aspecto da invenção, o estágio (c) adicionalmente ou alternativamente compreende o estágio de isolar dos polipeptídeos combinados uma fração marcada de polipeptídeos ou peptídeos por eletroforese ou cromatografia.

De acordo com um modo de realização dos métodos deste aspecto da invenção, o estágio (d) compreende a etapa de determinar com MS o montante relativo de diferentes massas na fração isolada de polipeptídeo ou peptídeo marcados obtida no estágio (c). Opcionalmente, nos métodos deste aspecto da invenção, o estágio (d) compreende adicionalmente a etapa de submeter esta fração isolada de polipeptídeo marcado a dissociação induzida por colisão (CID) e determinar o montante relativo de diferentes polipeptídeos isobaricicamente marcados nela contidos. Em modos de realização específicos, o montante relativo de diferentes polipeptídeos isobaricicamente marcados é determinado determinando o montante relativo de grupos repórter liberados do marcador isobárico após CID.

De acordo com um modo de realização os métodos deste aspecto da invenção compreendem adicionalmente o estágio de determinar a seqüência deste polipeptídeo

Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método para marcar uma amostra de polipeptídeo com um reagente de marcação, como descrito no primeiro aspecto da invenção tendo um componente de marcação isobárico e um alobárico, incluindo a etapa de reagir este reagente de marcação com um grupo funcional dos polipeptídeos da amostra.

Um aspecto adicional da invenção refere-se ao uso dos métodos descritos acima para identificar proteínas que são diferenciadamente expressas em diferentes amostras de proteínas biológicas ou experimentais, como, por exemplo, um indivíduo como controle e uma ou mais amostras de proteínas de diferentes condições de doença, diferentes estágios de doença, diferentes pacientes que têm ou são suspeitos de ter a mesma doença...etc Ainda outro aspecto da presente invenção provê misturas de

polipeptídeos ou peptídeos originários de amostras diferentes, em que cada polipeptídeo ou peptídeo de uma amostra particular contém um marcador com um componente de marcação isotópico e um componente de marcação isobárico, tendo o marcador sido ligado aos polipeptídeos ou peptídeos através de um grupo funcional dos polipeptídeos ou peptídeos.

Em um modo de realização, o grupo funcional dos polipeptídeos ou peptídeos da mistura da invenção no qual o marcador foi ligado é um grupo funcional selecionado no grupo que consiste de uma amina primária no terminal N ou em lisina, um grupo carboxila em ácido aspártico, ácido glutâmico ou terminal C, e um grupo tiol em cisteína.

Em um modo de realização particular, esta mistura de peptídeos é uma mistura de peptídeos trípticos de proteínas biológicas resultante de um digerido tríptico de uma amostra de proteína.

Em um modo de realização particular, o número de marcadores diferentes presente nos peptídeos ou polipeptídeos na mistura deste aspecto da invenção é de pelo menos 4.

Um aspecto adicional da invenção provê conjuntos contendo quatro ou mais reagentes de marcação com um componente de marcação isobárico, um componente de marcação alobárico e um grupo reativo a proteína/peptídeo, em que cada reagente de marcação no conjunto tem a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química e em que cada reagente de marcação contém uma combinação única do componente alobárico e isobárico de marcador.

Em um modo de realização, os reagentes de marcação deste conjunto contêm uma etiqueta de afinidade.

Um aspecto adicional da presente invenção provê métodos para determinar montantes relativos de polipeptídeos ou peptídeos individuais de uma amostra diferente tendo a mesma seqüência de aminoácidos, dentro de uma mistura combinada destes polipeptídeos ou peptídeos, em que cada polipeptídeo ou peptídeo de uma amostra diferente é, antes da combinação, marcado com um de um conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla, sendo que todos os reagentes diferenciais de marcação dupla usados têm a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química e portam um componente de marcação isotópico e um isobárico e cada reagente de marcação contém uma combinação única de componentes isotópico e isobárico de marcador diferentes, compreendendo os estágios de:

a) opcionalmente isolar todos os polipeptídeos ou peptídeos marcados por cromatografia líquida, de modo a obter uma fração isolada contendo os referidos polipeptídeos ou peptídeos individuais tendo a mesma seqüência de aminoácidos

b) separar a fração isolada de polipeptídeos ou peptídeos obtida no estágio (a) em frações adicionais de polipeptídeos ou peptídeos cada uma com uma massa diferente, por uma primeira MS e determinar o montante relativo de cada fração com uma massa diferente.

c) submeter as frações de peptídeos obtidas no estágio (b) a uma segunda MS sob condições em que o componente de marcação isobárico (e opcionalmente o polipeptídeo ou peptídeo) é fragmentado e determinar os montantes de cada componente fragmentado de marcação isobárico.

d) determinar, do montante relativo de cada um dos componentes de marcação isobárico determinados no estágio (c), o montante relativo dos peptídeos individuais dentro da fração de polipeptídeo ou peptídeo obtida no estágio (b), e

e) calcular, a partir dos montantes relativos de cada fração de polipeptídeo ou peptídeo com massa diferente determinados no estágio (b) e dos montantes relativos dos peptídeos individuais dentro da fração de peptídeo obtida no estágio (d), o montante relativo de cada polipeptídeo individual marcado tendo a mesma seqüência de aminoácidos, presente na referida mistura combinada.

Ainda outro aspecto adicional da presente invenção refere-se a um dispositivo (100) para marcação por multiplexação e análise de amostras de proteínas contendo pelo menos duas fontes de amostras (101), uma unidade de marcação (103) e fontes de marcação correspondentes (104) cada uma contendo um reagente de marcação contendo um componente de marcação alobárico, um grupo reativo a proteína/peptídeo, e um componente de marcação isobárico com um grupo repórter (RG) e um grupo de equilíbrio (BG), e contendo adicionalmente uma unidade de separação (107), uma unidade de espectrometria de massa (108) e uma unidade de análise de dados (109).

Em um modo de realização particular este dispositivo compreende adicionalmente um ou mais elementos selecionados no grupo que consiste de uma unidade de preparação de amostra(102), uma unidade de clivagem de proteína (105) e uma unidade de purificação por afinidade (106).

As características, aspectos e vantagens, indicadas acima e outras, da presente invenção ficarão claras na descrição detalhada a seguir, considerada em conjunto com os desenhos anexos, que ilustram, por meio de exemplo, os princípios da invenção. Esta descrição é apresentada como exemplo apenas, sem limitar o escopo da invenção. Os números de referência citados abaixo referem-se aos desenhos anexos. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Fig. 1 mostra um fluxograma proteômico para análise quantitativa de perfis de proteína com reagentes cliváveis ICAT (tirado de Li et al. (2003) MoI. CeI. Proteom. 2, 1198-1204)

A Fig. 2 mostra uma estrutura esquemática de um reagente clivável ICAT da técnica anterior.

A Fig. 3 mostra estruturas exemplares de marcadores iTRAQ (A) e peptídeos marcados por eles (Β). O marcador consiste de um grupo repórter com massa na faixa de 114a 117 Da e um grupo de equilíbrio com massa na faixa de 31 a 28 Da.

A Fig. 4 mostra, de acordo com um modo de realização particular da invenção, um marcador em que o componente de marcação isotópico é introduzido dentro do componente de marcação isobárico, i.e. pela substituição de um átomo de oxigênio no grupo de equilíbrio (Figura 4A) por um de enxofre (Figura 4B). Na Figura 4C, o componente de marcação isotópico é introduzido na cadeia lateral propila do grupo piperazina do grupo repórter do componente de marcação isobárico.

A Fig. 5 mostra um conjunto não limitativo de exemplos de representações esquemáticas de reagentes de marcação de acordo com modos de realização particulares da presente invenção.

A Fig. 6 demonstra a análise simultânea de amostras múltiplas usando reagentes de marcação contendo tanto um componente isotópico quanto um isobárico de marcador de acordo com modos de realização particulares da presente invenção. A Figura 7 mostra de acordo com um modo de realização particular da presente invenção um dispositivo para análise por multiplexação de 8 amostras de proteínas (100), contendo pelo menos duas fontes de amostra (101), uma unidade de preparação de amostra(102), uma unidade de marcação (103) com fonte de reagente de marcação (104), uma unidade de clivagem de proteína (105) uma unidade de purificação por afinidade (106) (por exemplo, sistema de cromatografia por afinidade com avidina), uma unidade de separação (107) contendo dois sistemas de separação acoplados consecutivamente (1107) e (2107), uma unidade de espectrometria de massa (108) e uma unidade de análise de dados com circuitos de controle e análise (109) acoplada a um sistema de leitura (110).

Nas diferentes Figuras, os mesmos sinais de referência referem-se aos mesmos elementos ou a elementos análogos. DESCRIÇÃO DETALHADA DOS MODOS DE REALIZAÇÃO

A presente invenção será descrita relativamente a modos de realização particulares e por referência a certos desenhos, mas a invenção não é limitada por isto, mas apenas pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser considerados como limitativos de escopo. Os desenhos descritos são apenas esquemáticos e não são limitativos. Nos desenhos o tamanho de alguns dos elementos pode estar exagerado e desenhado fora de escala para fins ilustrativos. Onde os termos "contendo" e "compreendendo" aparecem nesta descrição e nas reivindicações, eles não excluem outros elementos ou estágios. Onde um artigo indefinido ou definido for usado na referência a um substantivo singular, por exemplo "um", "uma", "o","a", isto inclui o plural daquele substantivo, salvo indicação em contrário.

Além disso, os termos primeiro, segundo, terceiro e similares na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para indicar uma ordem seqüencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis em circunstâncias apropriadas e que os modos de realização da invenção aqui descritos podem ser realizados em outras seqüências diferentes das aqui descritas ou ilustradas.

Os seguintes termos ou definições são apresentados apenas para ajudar na compreensão da invenção. Estas definições não devem ser consideradas como tendo um escopo menor que o entendido por uma pessoa com conhecimento especializado usual na técnica.

O termo "polipeptídeo" ou "proteína", como aqui usado, refere-se a uma multiplicidade de aminoácidos naturais ou modificados conectados através de uma ligação peptídica. O comprimento de um polipeptídeo pode variar de 2 a vários milhares de aminoácidos (o termo inclui assim também os compostos geralmente designados como oligopeptídeos). Estão incluídos neste escopo polipeptídeos contendo um ou mais aminoácidos que são modificados por modificações pós-traducionais in vivo como glicosilação, fosforilação, etc. e/ou contendo um ou mais aminoácidos que foram modificados in vitro com agentes modificadores de proteína (por exemplo, agentes alquilantes ou acetilantes).

O termo "fragmento de polipeptídeo" ou "peptídeo" é aqui usado para referência à seqüência de aminoácidos obtida após clivagem de uma proteína ou polipeptídeo. Um fragmento de polipeptídeo ou peptídeo não é limitado em tamanho ou natureza.

Os termos "interno", "aminoterminal" e "carboxiterminal" referidos a um peptídeo são aqui usados para designar a localização do peptídeo em uma proteína ou polipeptídeo. Por exemplo, em uma clivagem tríptica de proteína NH2-X1 -K-X2-R-X3-K-X4-COOH (em que X1, X2, X3 e X4 são seqüências de peptídeos de comprimento indiferente sem lisina (K) ou arginina (R)), o peptídeo aminoterminal é NH2-X1-K-COOH, os peptídeos internos são NH2-X2-R-COOH e NH2-X3-K-COOH e o peptídeo carboxiterminal é NH2-X4-COOH.

O termo "clivagem de proteína" é aqui usado para referência à hidrólise de uma ligação peptídica entre dois aminoácidos em um polipeptídeo. Estão incluídas tanto a hidrólise química como a enzimática.

O termo "fragmentação" refere-se aqui à quebra de uma ou mais ligações químicas e subsequente liberação de uma ou mais partes de uma molécula como a obtida, por exemplo, por dissociação induzida por colisão (CID) em análise por espectrometria de massa em série (MS) ou MS/MS. Em certos modos de realização a ligação é a ligação peptídica, mas ela não é a isto limitada.

O termo "marcador" refere-se aqui a um composto que é

ligado covalentemente a um peptídeo ou polipeptídeo e que, com base em suas propriedades específicas é detectável por espectrometria de massa. Quando o marcador pode ser ligado covalentemente a um peptídeo ou polipeptídeo, isto é assegurado por um grupo reativo a proteína/peptídeo (PRG). De acordo com a presente invenção um marcador pode conter mais de um "componente de marcação", i.e. mais de um componente que com base em suas propriedades específicas é diferencialmente detectável. Geralmente o termo "marcador" será usado para designar a molécula presente no polipeptídeo ou peptídeo, e o termo "reagente de marcação" é usado para designar um marcador não ligado (ou a combinação de compostos usada para assegurar a presença do marcador na proteína ou peptídeo), antes da reação com uma proteína ou peptídeo, i.e., ainda contendo um grupo reativo a proteína/peptídeo livre.

Os termos "marcador duplo" e "reagente de marcação dupla" como aqui usado, referem-se a marcadores ou reagentes contendo tanto um componente alobárico (por exemplo, isotópico) como um componente de marcação isobárico. Da mesma maneira, o termo "duplamente marcado" aplicado a um peptídeo ou proteína refere-se à presença de um marcador contendo ambos os componentes de marcação no peptídeo ou proteína.

O termo "etiqueta isotópica" refere-se aqui a um marcador contendo um ou mais isótopos de um átomo.

O termo "componentes alobáricos de marcador" refere-se aqui a um conjunto de moléculas com essencialmente a mesma estrutura e comportando-se da mesma maneira em eletroforese e cromatografia, mas diferindo em um ou mais átomos para gerar uma diferença de massa, e que pode ser usado como (parte de) um marcador. Consequentemente, um conjunto de reagentes de marcação ou marcadores contendo um conjunto de componentes alobáricos de marcador apresentará diferenças de massa. Onde a diferença em um ou mais átomos corresponde ao fato de que os componentes de marcação contêm diferentes isótopos do mesmo átomo, é feita referência a "componentes de marcação isotópicos".

O termo "componentes de marcação isotópicos" refere-se aqui a um conjunto de moléculas com essencialmente a mesma estrutura e comportando-se da mesma maneira em eletroforese e cromatografia, mas diferindo em um ou mais isótopos para gerar uma diferença de massa, e que pode ser usado como (parte de) um marcador. Peptídeos idênticos cada um marcado com um marcador contendo um componente de marcação, mas diferindo em massa com base na presença de diferentes isótopos dos mesmos átomos (em número ou em tipo) podem ser distinguidos um do outro por MS.

O termo "componentes de marcação isobáricos" refere-se aqui a um conjunto de moléculas com a mesma estrutura, e a mesma massa, que na fragmentação liberam um fragmento particular com a mesma estrutura que difere em massa entre os diferentes componentes de marcação isobárico de um conjunto, devido a uma distribuição diferencial de isótopos dentro do componente de marcação isobárico. Um componente de marcação isobárico tipicamente compreende um grupo repórter (RG) e um grupo de equilíbrio (BG), que são separados na fragmentação e que apresentam uma distribuição diferencial de isótopos. A "massa combinada" de um conjunto de componentes de marcação isobáricos refere-se à massa total do grupo repórter e do grupo de equilíbrio para aquele conjunto de componentes de marcação isobáricos.

O termo "grupo repórter (RG)" refere-se à parte do componente de marcação isobárico que gera fragmentos ionizados após CID, que diferem individualmente em massa dentro de um conjunto de componentes de marcação isobárico, como resultado de ocorrência diferencial de um ou mais isótopos. Por exemplo, diferentes grupos repórter dentro de um conjunto de componentes de marcação isobárico são caracterizados pela ocorrência diferencial de 12CfuC e/ou 160/180 no grupo repórter. Os fragmentos típicos gerados na liberação do grupo repórter são usados para quantificar um polipeptídeo ou peptídeo marcado com um marcador contendo um componente de marcação isobárico. Tipicamente os fragmentos ionizados do grupo repórter aparecem na região de massas baixas de um espectro de MS, onde outros fragmentos ionizados não são geralmente encontrados.

O termo "grupo de equilíbrio (BG)" refere-se aqui à parte de componente de marcação isobárico, que contém um certo número de isótopos compensadores de modo a assegurar que a massa combinada do grupo repórter com a do grupo de equilíbrio fique constante para os diferentes componentes de marcação isobárico. O grupo de equilíbrio pode ou não ser liberado do marcador na CID.

O termo "grupo funcional" refere-se aqui a uma função química em um aminoácido, que pode ser usada para ligação (geralmente, por ligação covalente) a um composto químico. Grupos funcionais podem estar presentes na cadeia lateral de aminoácido ou no terminal amino ou no terminal carbóxi de um polipeptídeo ou peptídeo. O termo abrange tanto grupos funcionais que estão naturalmente presentes em um peptídeo ou polipeptídeo como aqueles introduzidos via, por exemplo, uma reação química usando grupos modificadores de proteínas.

O termo "grupo reativo a proteína/peptídeo (PRG)" refere-se aqui a uma função química em um composto (por exemplo, a reagente de marcação) que é capaz de reagir com um grupo funcional em um aminoácido de uma proteína ou peptídeo resultando na ligação (não-covalente ou covalente) de tal composto ao aminoácido.

A presente invenção refere-se a reagentes de marcação para uso na comparação de amostras diferentes de proteínas contendo tanto um componente de marcação isotópico como um isobárico, com isto permitindo a geração de um maior número de marcadores diferenciais para a diferenciação de peptídeos similares de diferente origem dentro de uma mistura combinada de polipeptídeos ou peptídeos. Usando os reagentes de marcação diferencial da invenção é, além disso, possível identificar a presença e o montante relativo de uma proteína ou um peptídeo em uma amostra combinada.

Assim, os métodos e ferramentas da presente invenção são de particular interesse na análise de um conjunto de amostras para o qual uma análise comparativa é interessante. Tal conjunto de amostras pode ser, sem ser a tanto limitado, formado por amostras de um paciente tiradas em diferentes ocasiões, amostras de diferentes versões clínicas de uma doença, amostras de diferentes pacientes etc.. A presente invenção provê assim métodos e ferramentas para identificar marcadores de progressão de doença, para diagnóstico diferencial e, além disso, para análise por multiplexação em ensaios bioquímicos ou fisiológicos.

Os métodos e ferramentas da presente invenção relacionam-se com a análise de amostras de proteínas. O termo 'amostra' como aqui usado não pretende necessariamente incluir ou excluir qualquer etapa de processamento anterior á realização dos métodos da invenção. As amostras podem ser amostras brutas não processadas, frações extraídas de proteínas, frações purificadas de proteínas etc.. Como indicado acima, as proteínas presentes nas amostras [sic-frase incompleta]. De acordo com um modo de realização as amostras de proteínas são pré-processadas por imunodepleção de proteínas abundantes.

Amostras de proteínas adequadas para análise com os reagentes de marcação e métodos da presente invenção incluem amostras provenientes de vírus, procariotos, bactérias, eucariotos, fungos, leveduras, vegetais, invertebrados, vertebrados, mamíferos e humanos. A preparação de amostras difere dependendo do organismo, tecido ou órgão investigado, mas procedimentos padronizados são usualmente disponíveis e conhecidos pelos especialistas. Em relação a amostras de proteínas de mamíferos e humanos a preparação cobre o isolamento de células cultivadas, células micro dissecadas a laser, tecido corporal, fluidos corporais, ou outras amostras relevantes de interesse. Em relação ao fracionamento de proteínas em uma amostra, Iise de cédulas é o primeiro estágio do fracionamento de células e purificação de proteína. Muitas técnicas são disponíveis para o rompimento de células, incluindo métodos físicos, enzimáticos e baseados em detergentes. Historicamente, Iise física tem sido o método preferido para rompimento de células; (homogeneização, Iise osmótica, rompimento de células por ultrassom) entretanto, ele requer muitas vezes equipamento caro, incômodo e envolve protocolos que são às vezes difíceis de repetir devido a variabilidade no equipamento (tal como pilões de homogeneização de encaixe solto comparados com encaixe justo). Em anos recentes, Iise baseada em detergente tornou-se muito popular devido à facilidade de uso, baixo custo e protocolos eficientes.

Células de mamíferos têm uma membrana plasmática, uma

bicamada proteína-lipídeo que forma uma barreira separando o conteúdo da célula do ambiente extracelular. Lipídeos da membrana plasmática são anfipáticos, tendo porções hidrofílicas e hidrofóbicas que se associam espontaneamente para formar uma película fechada bi-molecular. Proteínas de membrana são engastadas na bicamada lipídica, mantidas no lugar por um ou mais domínios transpondo o núcleo hidrofóbico. Além disso, proteínas periféricas ligam-se na superfície interna ou externa da bicamada através de interações com proteínas de membrana integrais ou com grupos terminais polares de lipídeos. A natureza do lipídeo e o teor de proteína variam com o tipo de célula. Evidentemente, a técnica escolhida para o rompimento de células, física ou baseada em detergente, deve levar em consideração a origem das células ou tecidos que estão sendo examinados e a facilidade ou dificuldade inerente ao rompimento de sua(s) camada(s) externa(s). O método deve além disso ser compatível com o montante de material a ser processado e as aplicações ulteriores planejadas.

Em modos de realização particulares, a extração de proteína inclui também o pré-fracionamento de proteínas celulares originadas de diferentes compartimentos (como proteínas extracelulares proteínas de membrana, proteínas citosólicas, proteínas nucleares, proteínas mitocondriais). Outros métodos de pré-fracionamento separam proteínas por propriedades físicas como ponto isoelétrico, carga e massa molecular.

De acordo com um modo de realização particular, as amostras são pré-tratadas antes da marcação ou clivagem, de modo a desnaturar as proteínas para acesso otimizado a reagentes ou proteases, usando agentes apropriados (por exemplo, cloreto de guanidínio, uréia, ácidos (por exemplo, 0,1% ácido trifluórico), bases (por exemplo, 50% piridina) e detergentes iônicos ou não iônicos).

Além disso, como será detalhado abaixo, dependendo do tipo de grupos reativos a proteína no agente de marcação, os métodos da presente invenção consideram que os grupos funcionais sejam irreversivelmente ou reversivelmente modificados com agentes modificadores de proteína, antes da marcação com os métodos da invenção. Exemplos são a liberação de amino terminais bloqueados, a redução de cistina a cisteína, bloqueio do grupo funcional tiol de cisteína, acetilação do grupo amina de lisina, etc.

Os métodos da presente invenção compreendem assim opcionalmente um pré-tratamento das amostras, que pode ser efetuado em um estágio de pré-tratamento contendo um ou mais dos métodos de preparação de amostra listados acima. Consequentemente, dispositivos adequados para os métodos da presente invenção opcionalmente contêm uma unidade de preparação de amostra contendo um ou mais dispositivos adequados para preparação de amostras, por exemplo, dispositivos de sonicação, sistemas de cromatografia (afinidade, gelfiltração), unidades de ultrafiltração, centrífugas, frascos de reação com temperatura controlada com sistemas de adição de tampões, enzimas, detergentes etc.

De acordo com a presente invenção, são providos ferramentas e métodos que permitem marcação múltipla com apenas um estágio de marcação. Isto é assegurado, de acordo com a presente invenção, combinando dois tipos de componentes de marcação adequados para detecção diferencial em MS, em um reagente de marcação, garantindo deste modo um conjunto de reagentes de marcação diferencial baseado em combinações de componentes de marcação.

De acordo com um modo de realização, os reagentes de marcação da invenção contêm um componente de marcação que é de um conjunto de componentes isobáricos (mesma massa) de marcação, e um que é de um conjunto de componentes alobáricos (diferentes massas) de marcação.

De acordo com a presente invenção, os componentes alobáricos dos reagentes de marcação são componentes que diferem em massa um do outro, como resultado do que os reagentes de marcação que os contêm, diferirão em massa. Consequentemente, estes componentes contribuem uma massa diferente aos peptídeos/proteínas aos quais estão ligados. Entretanto os componentes alobáricos de marcação da presente invenção têm essencialmente o mesmo efeito sobre o comportamento cromatográfico ou eletroforético dos peptídeos ou proteínas aos quais eles estão ligados.

De acordo com um modo de realização, os componentes alobáricos de marcação são componentes com essencialmente a mesma estrutura química, mas em que um átomo é substituído por outro de maneira tal que a estrutura do marcador é minimamente modificada. Consequentemente, marcação de peptídeos idênticos com um conjunto de reagentes de marcação contendo tais componentes alobáricos de marcador, resultará em peptídeos com pequenas (predeterminadas) diferenças de massa (que podem assim ser identificados em MS) mas que não diferem em, por exemplo, comportamento cromatográfico ou eletroforético antes da análise por MS.

De acordo com um modo de realização alternativo, o componente de marcação alobárico dos reagentes de marcação da invenção é um componente de marcação isotópico, i.e., que assegura a diferença de massa entre os diferentes reagentes de um conjunto por uma composição diferencial de isótopos.

Consequentemente, neste modo de realização, os reagentes de marcação da presente invenção contêm um componente de marcação isotópico, um componente de marcação isobárico e um grupo reativo a proteína. Opcionalmente, os reagentes de marcação compreendem adicionalmente uma etiqueta de afinidade. Geralmente, o componente de marcação isotópico e o componente de marcação isobárico constituem duas partes separadas dos reagentes de marcação. Entretanto, como é descrito abaixo, o componente de marcação isotópico pode também ser incorporado dentro do componente de marcação isobárico.

A combinação de diferentes componentes de marcação isotópicos e isobáricos nos reagentes de marcação da presente invenção permite um maior número de reagentes de marcação diferencial dentro de um conjunto, i.e. para uso na marcação diferencial de amostras em que após combinação das amostras, a origem da amostra pode ser identificada. Por exemplo, onde o número de diferentes componentes de marcação isotópicos é 2, e o número de reagentes de marcação isobáricos é 4, um total de 2x4=8 combinações de componentes de marcação, e assim de reagentes de marcação diferencial pode ser obtido. Neste exemplo, o conjunto de reagentes de marcação conterá 2 grupos de 4 reagentes de marcação, em que os 2 grupos diferem um do outro em massa (devido a marcação diferencial isotópica), e em que dentro de cada grupo, 4 reagentes de marcação serão isobáricos, i.e. com massa idêntica, mas gerando, em MS/MS, um grupo repórter com massa diferente. Consequentemente, peptídeos idênticos de origem diferente marcados com este conjunto de reagentes de marcação podem ser identificados, primeiramente em MS, como dois picos correspondentes aos dois grupos de peptídeos marcados isotopicamente, que, quando adicionalmente analisados por MS/MS, gerarão cada um adicionalmente 4 picos, correspondentes aos grupos repórter diferenciais dos componentes de marcação isobáricos.

De acordo com um modo de realização, os componentes de marcação isotópicos, usados nos reagentes de marcação combinados isotópicos/isobáricos da presente invenção, contêm uma estrutura em que um ou mais dos átomos no componente de marcação isotópico são substituídos com um isótopo estável, gerando assim um ou mais compostos com a mesma fórmula química, mas que são isotopicamente distinguíveis com base em sua diferença de massa. For exemplo, qualquer um ou mais dos átomos de

hidrogênio, nitrogênio, oxigênio ou enxofre no componente de marcação

• · 2

isotópico pode ser substituído por seus isótopos isotopicamente estáveis H,

13C, 15N, 17O, 18O ou 34S5 respectivamente. Por exemplo, hidrogênio é

• 12 13

substituído por deutério ou carbono C é substituído por C. Usando um ou mais dos isótopos acima citados, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou mesmo um número ainda maior de componentes de marcação isotópicos pode ser gerado, cada um tendo a mesma estrutura mas com Mr (sic (massa relativa)) diferente. Como indicado acima, a diferença de Mr destes componentes de marcação, na ligação de cada um dos reagentes de marcação com polipeptídeos idênticos em uma amostra diferente, é refletida na Mr resultante do polipeptídeo ou peptídeo gerado a partir do mesmo.

Exemplos de grupos que podem funcionar como componentes de marcação isotópicos por introdução diferencial de um ou mais isótopos incluem, mas não estão limitados, a éteres, poliéteres, éter diaminas, poliéter diaminas, diaminas, amidas, poliamidas, politioéteres, dissulfetos, silil éteres, cadeias alquílicas ou alquenílicas (cadeia reta, ramificada ou com porções que são cíclicas), grupos arila, diarila ou alquil-arila. Em modos de realização particulares, grupos arila presentes no componente isotópico dos reagentes de marcação da presente invenção contêm um ou mais heteroátomos (por exemplo, átomos Ν, O ou S).

De acordo com um modo de realização particular, o componente de marcação isotópico do reagente de marcação é tal que não sofre fragmentação similar à de peptídeo durante a análise por (MS)n. Para promover ionização, o componente de marcação isotópico, e mais particularmente o grupo isotópico correspondente, pode conter grupos ou porções como grupos ácidos ou básicos, por exemplo, COOH, SO3H, grupos amino primários, secundários ou terciários, grupos hetrocíclicos com

nitrogênio, éteres, ou combinações destes grupos. Em modos de realização

particulares, o componente de marcação isotópico contém grupos tendo uma

carga permanente, por exemplo, grupos fosfônio, grupos amônio quaternário,

grupos sulfônio, íons metálicos quelados, borato de tetralquila ou tetrarila ou

carbânions estáveis.

De acordo com um modo de realização, a estrutura do

componente de marcação isotópico dos reagentes de marcação da presente

invenção corresponde à formula geral -B1 -X1-(CH2)n-[X2-(CH2)m]x-X3-

(CH2)p-X4-B2 -em que:

-X1, X2, X3 e X4, independentemente um do outro, são

selecionados entre O, S, NH, NR, NRR'+, CO, COO, COS, S-S, SO, SO2,

CO-NR', CS-NR', Si-O, grupos arila ou diarila. (R é um grupo alquila,

alquenila, alquinila, alcóxi ou arila e R' é um hidrogênio ou um grupo alquila,

alquenila, alquinila, alcóxi ou arila). Em modos de realização particulares X1 -

X estão ausentes, mas tipicamente pelo menos um de X1 -X4 esta presente.

-n, m, ρ e q são números inteiros com valores entre O e cerca

de 100. Em modos de realização particulares um entre n, m, ρ ou q não é 0 e χ

é também um número inteiro na faixa de 0 a cerca de 100 sendo que a soma

n+xm+p+q é menor que cerca de 100 e em modos de realização mais

particulares menor que cerca de 20; e 1 2

-B e B , independentemente um do outro, são porções opcionais que facilitam a ligação de outras partes no reagente de marcação (por exemplo, uma etiqueta de afinidade, ou um grupo reativo a proteína/peptídeo descritos abaixo) ao componente de marcação isotópico ou que evitam clivagem indesejada daqueles ligadores do componente de marcação isotópico e são selecionados, por exemplo, entre COO, CO, CO- NR', CS-NR' e opcionalmente contém um ou mais grupos CH2 sozinhos ou em combinação com outros grupos, por exemplo, (CH2)q -CONR', (CH2)q - CS-NR', ou (CH2)q.

Em modos de realização particulares, um ou mais dos grupos CH2 do componente de marcação isotópico tendo a estrutura descrita acima, é opcionalmente substituído com pequenos grupos (Ci-Cô) alquila, alquenila, ou alcóxi, um grupo arila ou é substituído com grupos funcionais que promovem ionização, como grupos ácidos ou básicos ou grupos portando carga permanente positiva ou negativa. Em modos de realização particulares, uma ou mais ligações simples conectando grupos CH2 no ligador são substituídas por uma ligação dupla ou tripla. Em modos de realização particulares os grupos R e R',alquila, alquenila, alquinila ou alcóxi são pequenos tendo de 1 a cerca de 6 átomos de carbono.

De acordo com um modo de realização particular, os componentes de marcação isotópicos da presente invenção são formados por um ou dois átomos que são incorporados em uma cadeia lateral ou em outra parte dos reagentes de marcação, muito particularmente do componente de marcação isobárico. Este modo de realização será descrito abaixo com maior detalhe.

Os reagentes de marcação da presente invenção, em adição a um componente de marcação alobárico ou isotópico descrito acima, contêm adicionalmente um componente de marcação isobárico.

De acordo com um modo de realização, o componente de marcação isobárico compreende um grupo repórter (RP) e um grupo de equilíbrio (BG), em que a massa do grupo repórter é específica para cada componente de marcação isobárico (dentro de um conjunto de reagentes de marcação), e a massa total do grupo repórter e do grupo de equilíbrio dos diferentes componentes de marcação isobáricos é mantida constante.

De acordo com um modo de realização particular, a estrutura geral do componente de marcação isobárico pode ser representada pela fórmula geral RP-X'-BG-Y'-. em que o grupo repórter (RP) é uma parte terminal do componente de marcação isobárico, e tipicamente também dos reagentes de marcação (ver abaixo). X1 e Y' representam ambos uma ligação ou ligador. De acordo com um modo de realização alternativo, o grupo repórter é interno no componente de marcação isobárico, e a estrutura geral do componente de marcação isobárico dentro dos reagentes de marcação pode ser representada pela fórmula geral -X1-RP-X1-BG-Y'-.

O conceito de marcação isobárica é exemplificado na Figura 3. A Figura 3 A provê um exemplo de um componente de marcação isobárico. Neste modo de realização, o componente de marcação isobárico consiste de um grupo repórter baseado em 7V-metilpiperazina, e um grupo de equilíbrio de massa que é uma carbonila. In Figura 3B, o componente de marcação isobárico é ligado diretamente a um peptídeo através de um grupo reativo a peptídeo que é um éster NHS. Enquanto a massa do grupo repórter é específica para cada componente de marcação isobárico dentro de um conjunto, a massa total do grupo repórter e do grupo de equilíbrio dos diferentes componentes de marcação isobáricos é mantida constante.

De acordo com um modo de realização particular a massa diferencial dos grupos repórter nos diferentes componentes de marcação isobáricos de um conjunto de reagentes de marcação é assegurado usando enriquecimento isotópico diferencial com os átomos 13C, 15N, e 18O como indicado, para evitar problemas com a separação cromatográfica encontrados com enriquecimento envolvendo substituição de deutério. Em vista da estrutura idêntica dos diferentes componentes de marcação isobáricos, o número e posição de centros enriquecidos no anel não têm efeito sobre o comportamento cromatográfico ou de MS.

O componente de marcação isobárico pode assim ser ligado diretamente ao peptídeo ou ao grupo isotópico por meio de um ligador amida. Na Figura 3, o componente de marcação isobárico é flanqueado por um grupo reativo a proteína, que é um grupo reativo amina específico. Na reação do grupo reativo amina específico deste reagente de marcação com um peptídeo, o marcador fica conectado via um ligador amida a grupos funcionais amina (N-terminal ou grupo amina de lisina). Estes ligadores amida fragmentam de modo similar ao de ligações peptídicas de cadeia principal quando submetidas a CID. Outros métodos adequados para fragmentar peptídeos incluem CAD (dissociação ativada por colisão), ETD (dissociação por transferência de elétrons), ECD (dissociação por captura de elétrons), IRMPD (dissociação infravermelha multifotônica) e BIRD (dissociação radiativa de corpo negro infravermelha). Após fragmentação do ligador amida quando submetido a CID, a porção de balanceamento (carbonila) é perdida (perda neutra), ao passo que a carga é retida pelo fragmento do grupo repórter.

Na Figura 3A, os números entre parênteses indicam o número de centros enriquecidos em cada seção da molécula. Parte B da Figura 3 ilustra a marcação com quatro combinações isobáricas contendo quatro diferentes massas de grupo repórter. Uma mistura de quatro peptídeos idênticos cada um marcado com um membro do conjunto de multiplexação aparece como um único íon precursor não resolvido em MS (idêntica m/z). Após CID, os quatro íons de grupo repórter aparecem como massas distintas (114-117 Da). Todos os outros fragmentos ionizados informativos de seqüência (b-, y-, etc.) permanecem isobáricos, e seus sinais individuais de corrente de íons (intensidades de sinal) são aditivos. A concentração relativa dos peptídeos pode assim ser deduzida das intensidades relativas dos correspondentes íons repórter. Quando são usados os reagentes de marcação da presente invenção, a quantificação é assim feita no estágio MS/MS e não em MS.

Como indicado acima, o grupo repórter RP de um componente de marcação isobárico é um grupo que tem uma massa (ou relação entre massa e carga) singular que pode ser determinada. Consequentemente, cada grupo repórter de um conjunto de componentes de marcação isobáricos (ou os correspondentes reagentes de marcação) tem uma massa singular. Em modos de realização particulares, cada grupo repórter de um conjunto componentes de marcação isobáricos contém um ou mais isótopos de átomo pesado diferentes para atingir a massa singular. Por exemplo, isótopos de carbono (12C, 13C e 14C), nitrogênio (14N e 15N), oxigênio (16O e 18O) ou hidrogênio (hidrogênio, deutério e trítio) podem ser usados na preparação de diferentes grupos repórter. Exemplos de isótopos estáveis de átomos "pesados"

13 15 IS ι

adequados para uso no grupo repórter incluem C, N, Oe deutério. Estes exemplos não são limitativos pois outros isótopos de átomos leves e pesados são também adequados para incorporação no grupo repórter. Materiais de partida básicos adequados para preparar grupos repórter contendo isótopos de átomos leves e pesados são disponíveis a partir de várias fontes comerciais como Cambridge Isotope Laboratories e Isotec. De acordo com um modo de realização, o grupo repórter fica na faixa de massa de m/z entre 114,1 e 117,1, ao passo que o grupo de equilíbrio fica na faixa de massa de 28 a 31 Da, de modo que a massa combinada permanece constante (145.1 Da) para cada um dos quatro reagentes.

De acordo com a presente invenção, o grupo repórter singular do componente de marcação isobárico dos reagentes de marcação da presente invenção é usado identificar e quantificar os peptídeos em amostras diferentes. Em um modo de realização particular, o grupo repórter singular permanece presente como parte do marcador em um ou múltiplos polipeptídeos de uma amostra. Desta maneira informação a respeito do grupo repórter é associada com informação a respeito dos polipeptídeos marcados da amostra.

Alternativamente, entretanto, como no Exemplo descrito acima, o grupo repórter é removido do polipeptídeo marcado antes de sua identificação. Assim, o grupo repórter não precisa ser conectado fisicamente a um (poli)peptídeo no momento em que o repórter é determinado. Realmente, de acordo com este modo de realização, a massa singular do repórter é, por exemplo, determinada em uma segunda análise de massa de um analisador de massa em série, depois que os íons de um (poli)peptídeo marcado são fragmentados para produzir fragmentos filhos ionizados dos (poli)peptídeo e grupos repórter detectáveis. O grupo repórter particular é usado para identificar a amostra da qual um (poli)peptídeo particular originou. Adicionalmente, a quantidade determinada do grupo repórter singular, seja relativamente ao montante de outros grupos repórter ou relativa a um padrão de calibração (por exemplo, um polipeptídeo marcado com um grupo repórter específico), é opcionalmente usada para determinar o montante relativo ou absoluto (muitas vezes expresso como uma concentração e/ou quantidade) de polipeptídeo na amostra ou amostras. Portanto o grupo repórter que está presente no componente isobárico de cada reagente de marcação usado para marcar cada amostra particular provê diferentes tipos de informação, como o montante de um ou mais polipeptídeos em uma amostra particular.

O grupo repórter ou contém uma carga fixa ou é capaz de ser ionizado. Consequentemente, o reagente de marcação contendo o componente de marcação isobárico é usado para marcar o polipeptídeo reativo em forma salina ou zwitteriônica. Ionização do repórter facilita sua determinação em um espectrômetro de massa.

Consequentemente, em modos de realização particulares o grupo repórter é determinada como um íon, às vezes designado como um "íon de assinatura". Quando ionizado, o repórter compreende uma ou mais cargas líquidas positivas ou negativas. Por exemplo, o grupo repórter compreende um ou mais átomos básicos nitrogênio (carga positiva) ou um ou mais grupos ácidos ionizáveis como um grupo ácido carboxílico, grupo ácido sulfônico ou grupo ácido fosfórico (carga negativa). Exemplos não limitativos de grupos repórter contendo um nitrogênio básico incluem morfolinas, piperidinas ou piperazinas substituídas ou não substituídas.

Em modos de realização particulares, o grupo repórter é um anel heterocíclico de 5, 6 ou 7 membros contendo um átomo de nitrogênio do anel que é N-alquilado com uma porção substituída ou não substituída de ácido acético a que o polipeptídeo é ligado através do carbono da carbonila da porção ácido N-alquil acético e em que cada marcador isobárico diferente compreende um ou mais isótopos de átomos pesados. Este anel heterocíclico é substituído ou não substituído. 0 anel heterocíclico é alifático ou aromático. Possíveis substituintes da porção heterocíclica incluem grupos alquila, alcóxi e arila. Os substituintes contêm grupos protegidos ou não protegidos, como amina, hidroxila ou tiol, adequados para ligar o polipeptídeo a um suporte. Em modos de realização particulares, o anel heterocíclico compreende heteroátomos adicionais como um ou mais átomos de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.

Em modos de realização particulares, o grupo repórter é selecionado de modo que ele não se sub-fragmente substancialmente em condições típicas para a análise do polipeptídeo como eletroforese ou cromatografia. Em outros modos de realização particulares, o grupo repórter é escolhido de forma que ele não se sub-fragmente substancialmente sob as condições de energia dissociativa aplicadas para causar fragmentação das duas ligações, X' e Y', de pelo menos uma porção de íons selecionados de um polipeptídeo marcado em um espectrômetro de massa. Opcionalmente, o grupo repórter é escolhido de modo que eventuais fragmentos do grupo repórter sejam difíceis ou impossíveis de detectar acima do ruído de fundo usando análise por MS. Em modos de realização particulares, a massa de um grupo repórter é intencionalmente selecionada para ser diferente quando comparada com a massa do polipeptídeo cuja determinação é procurada ou da de qualquer dos fragmentos esperados do polipeptídeo. Por exemplo, a massa do repórter é escolhida para ser diferente quando comparada com a de qualquer aminoácido ou peptídeo que ocorre naturalmente, ou de fragmentos esperados dos mesmos. Isto facilita a determinação do polipeptídeo, pois dependendo do polipeptídeo, a falta de quaisquer possíveis componentes da amostra tendo a mesma massa adiciona confiança ao resultado de qualquer análise.

Em modos de realização particulares dos reagentes de marcação da presente invenção, o grupo repórter do componente de marcação isobárico é uma pequena molécula que não é polimérica. Em outros modos de realização particulares, a massa de um repórter é inferior a 250 Daltons. Essa pequena molécula é facilmente determinada na segunda análise de massa, livre de outros componentes da amostra tendo a mesma massa coincidente na primeira análise de massa. Neste contexto, a segunda análise de massa é realizada tipicamente em um espectrômetro de massa em série (tandem), com íons selecionados que são determinados na primeira análise de massa. Como íons de uma relação particular entre massa e carga são especificamente selecionados na primeira análise de massa para possível fragmentação e análise de massa adicional, os íons não selecionados na primeira análise de massa não são levados para a segunda análise de massa e portanto não contaminam o espectro da segunda análise de massa. Além disso, a sensibilidade de um espectrômetro de massa e a linearidade do detector (para fins de quantificação) são bastante robustas nesta faixa massas baixas. Adicionalmente, o atual estado de tecnologia de espectrometria de massa permite resolução de base de massa de menos de um Dalton nesta faixa de massas.

Nos componentes de marcação isobáricos dos reagentes de marcação da presente invenção, o grupo de equilíbrio (BG) liga o grupo repórter ao componente de marcação isotópico ou a um grupo reativo a proteína. Em modos de realização particulares, o grupo de equilíbrio é selecionado para produzir uma espécie neutra quando ambas as ligações X' e Y' são fragmentadas (i.e. sofre perda neutra com a fragmentação de ambas as ligações X' e Y'). Em modos de realização particulares, o grupo de equilíbrio é uma porção muito pequena como um grupo carbonila ou tiocarbonila. Por exemplo, o grupo de equilíbrio compreende pelo menos um isótopo de átomo pesado e compreende a fórmula -CH2-CO-CH2-, CH2-CS-CH2-, CH2-CNH- CH2-Ou CH2-CHR1-CH2-, em que R1 é igual ou diferente e é um grupo alquila contendo um a oito átomos de carbono que opcionalmente contêm um heteroátomo ou um grupo arila substituído ou não substituído em que os átomos de carbono dos grupos alquila e arila têm átomos de hidrogênio, deutério e/ou flúor a eles independentemente ligados. Em modos de realização particulares, o grupo de equilíbrio é uma porção maior. Por exemplo, o grupo de equilíbrio é um polímero ou um biopolímero. Em modos de realização particulares, o grupo de equilíbrio é projetado para sub- fragmentar quando submetido a níveis de energia dissociativa, incluindo sub- fragmentação para produzir apenas fragmentos neutros do grupo de equilíbrio.

Tipicamente, o grupo de equilíbrio dos componentes de marcação isobáricos nos reagentes de marcação da presente invenção compreende um ou mais isótopos de átomo pesado, de forma que sua massa compensa a diferença de massa dos grupos repórteres, obtendo-se assim uma massa idêntica para cada componente de marcação isobárico do conjunto. A massa agregada (i.e. a massa considerada como um todo) da combinação repórter/grupo de equilíbrio é a mesma para cada componente de marcação isobárico e assim a massa de polipeptídeos ou peptídeos idênticos, que se originam de amostras diferentes e marcados com os diferentes reagentes de marcação de um conjunto de acordo com a presente invenção contendo os componentes de marcação isobáricos será a mesma.

Peptídeos ou polipeptídeos idênticos marcados com reagentes de marcação do mesmo conjunto contendo o mesmo componente de marcação isotópico, mas diferentes componentes de marcação isobáricos são isobáricos, i.e. possuem o mesmo peso. Assim, se for selecionado, a partir de uma análise de massa inicial de uma mistura de amostras reunidas, um íon com razão massa para carga particular no espectrômetro de massa, este íon selecionado contém os polipeptídeos idênticos destas amostras na mistura de amostras reunidas que foram marcados com os reagentes de marcação contendo o mesmo etiqueta isotópica, em uma proporção que corresponde à sua respectiva concentração e/ou quantidade na mistura de amostras.

Pelo fato de o grupo de equilíbrio agir como um equilíbrio de massa para o repórter nos componentes de marcação isobáricos, de modo que a massa agregada da combinação grupo repórter/grupo de equilíbrio seja a mesma para todos os reagentes de marcação de um conjunto, quanto maior o número de átomos no grupo de equilíbrio (e repórter), maior o número possível de diferentes componentes isoméricos/isobáricos de marcação que pode ser gerado, i.e. maior o número de combinações com o componente de marcação isotópico que pode ser obtido, resultando em um número maior de reagentes de marcação dentro de um conjunto. Geralmente o grupo repórter não é um fator limitante e quando maior o número de átomos que um grupo de equilíbrio compreende, maior o número de combinações potenciais de grupo repórter/grupo de equilíbrio, já que isótopos podem ser substituídos em quase qualquer posição do grupo de equilíbrio para produzir, desta forma, um conjunto de isômeros ou isobáricos da porção do grupo de equilíbrio em que a porção do grupo de equilíbrio é usada para compensar as diferentes massas da porção repórter e assim criar um conjunto de grupos repórter/balanceamento isômeros ou isobáricos. Esses diversos conjuntos de componentes de reagentes de marcação são particularmente bem adequados para análise por multiplexação de polipeptídeos na mesma amostra e/ou em amostras diferentes.

O número total de diferentes componentes de marcação isobáricos que pode ser usado para gerar combinações de reagentes de marcação isotópicos/isobáricos de acordo com a presente invenção é dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais. Como os reagentes de marcação dupla da presente invenção contêm diferentes combinações dos componentes de marcação isobárico e isotópico (ou alobárico), o número total de reagentes de marcação em um conjunto será determinado pelo produto do número de diferentes componentes de marcação dentro de um conjunto. O número de componentes de marcação isotópicos são usualmente limitados, e tipicamente 2, resultando assim em um número total de reagentes de marcação dupla dentro de um conjunto do dobro do número de componentes de marcação isobáricos. A diversidade de componentes de marcação isobáricos é determinada pelo número de átomos das porções de grupo repórter e de balanceamento, os isótopos pesados de átomo disponíveis para substituir os isótopos leves e as várias configurações de síntese pelas quais os isótopos podem ser sintetizados. Como mencionado, numerosos materiais de partida básicos isotopicamente enriquecidos são prontamente disponíveis em fornecedores como Cambridge Isotope Laboratories e Isotec. Esses materiais de partida básicos isotopicamente enriquecidos são usados nos processos de síntese utilizados para produzir conjuntos de componentes de marcação isobáricos e isoméricos ou para produzir os materiais de partida isotopicamente enriquecidos que são usados nos processos de síntese usados para produzir conjuntos de componentes de marcação isobáricos e isoméricos. A preparação de componentes de marcação isobáricos de acordo com a presente invenção pelo menos em parte corresponde a uma preparação de reagentes isobáricos de marcação divulgados nos exemplos de W02004070352.

Nos reagentes de marcação isobáricos/isotópicos combinados da presente invenção, o grupo repórter e grupo de equilíbrio do componente de marcação isobárico são ligados um ao outro e opcionalmente ao componente de marcação isotópico e/ou grupo reativo a proteína/peptídeo, por ligações designadas como X' e Y', em que X' é uma ligação entre um átomo do grupo repórter e um átomo do grupo de equilíbrio e Y1 é uma ligação entre um átomo do grupo de equilíbrio e um átomo do componente de marcação isotópico e/ou do grupo reativo a proteína/peptídeo do reagente de marcação. Em modos de realização particulares as ligações X1 e Y' dos vários reagentes de marcação isobáricos são dissociadas, quando submetidas a níveis de energia de dissociação. Assim, em modos de realização particulares dos métodos da invenção, o nível de energia de dissociação é ajustado em um espectrômetro de massa de modo que ambas as ligações X' e Y' são dissociadas em pelo menos uma porção dos íons selecionados dos polipeptídeos ou peptídeos isobaricicamente marcados. Quando o grupo repórter é posicionado terminalmente no reagente de marcação, fragmentação da ligação X' libera o grupo repórter do polipeptídeo de modo que o repórter é detectável independentemente do peptídeo ou polipeptídeo. Quando o grupo de equilíbrio é ligado ao polipeptídeo ou peptídeo através de ligação Y', fragmentação da ligação Y' libera a combinação de grupo repórter/grupo de equilíbrio do polipeptídeo ou peptídeo, ou o grupo de equilíbrio do polipeptídeo, dependendo se a ligação X' já foi ou não fragmentada.

O grupo repórter de um marcador isobárico está geralmente presente como a parte terminal dos reagentes de marcação dupla da presente invenção. Neste caso somente uma ligação (X') entre o repórter e o grupo de equilíbrio precisa ser rompida para liberar o repórter. No entanto, em modos de realização particulares, o grupo repórter é uma molécula interna nos reagentes de marcação dupla da invenção, em que as ligações de flanqueamento são tais que permitem a liberação do grupo repórter do reagente de marcação após CID.

Da mesma forma a distribuição do componente de marcação isobárico em modos de realização particulares dos reagentes de marcação dupla da presente invenção é projetada para corresponder ao projeto clássico de reagentes de marcação isobáricos, em que o grupo repórter e o grupo de equilíbrio são posicionados adjacentes um ao outro. Modos de realização alternativos dos reagentes de marcação dupla da presente invenção compreendem um repórter e um grupo de equilíbrio que são separados um do outro por outras partes do reagente de marcação dupla, por exemplo, pelo componente de marcação isotópico. Em todos os modos de realização entretanto, a massa do grupo de equilíbrio compensa a massa do grupo repórter.

Em modos de realização particulares a ligação Y' é mais lábil do que a ligação X'. Em outros modos de realização particulares a ligação X' pode ser mais lábil do que a ligação Y'. Em ainda outros modos de realização particulares, as ligações X' e Y' possuem a mesma labilidade relativa. Em modos de realização particulares, a labilidade relativa das ligações X' e Y' é ajustada com relação a uma ligação amídica (peptídica). A ligação X', ligação Y' ou ambas as ligações X1 e Y' são nesse caso mais lábeis, igualmente lábeis ou menos lábeis comparadas a uma ligação amídica (peptídica) típica. Por exemplo, em condições de energia dissociativa, ligação X' e/ou ligação Y' são menos propensas à fragmentação em comparação com a ligação peptídica de um dímero Z-Pro ou Z-Asp, em que Z é qualquer aminoácido natural e Pro e Asp são respectivamente Prolina e Ácido aspártico. Em alguns modos de realização, as ligações X' e Y' se fragmentarão com aproximadamente o mesmo nível de energia dissociativa de uma ligação amídica típica. Em alguns modos de realização, as ligações X' e Y' se fragmentarão com um maior nível de energia dissociativa em comparação com uma ligação amídica típica.

Em outros modos de realização particulares, as ligações X' e Y1 são escolhidas de modo que a fragmentação da ligação Y1 induza a fragmentação da ligação X', e vice-versa. Desta maneira, ambas as ligações X' e Y1 se fragmentam essencialmente simultaneamente de modo que nenhum montante substancial de polipeptídeo ou peptídeo, ou íon de fragmento filho do mesmo, inclua um marcador parcial na segunda análise de massa. Montante substancial de polipeptídeo refere-se a menos de 25%, e mesmo menos de 10%, de polipeptídeo parcialmente marcado que é determinado no espectro MS/MS. Pelo fato de poder haver uma demarcação clara entre fragmentos marcados e não marcados do polipeptídeo nos espectros da segunda análise de massa (MS/MS), esta característica simplifica a identificação dos polipeptídeos com base em análise assistida por computador do espectro de íons de fragmentos filho. Além disso, pelo fato de fragmentos ionizados de polipeptídeos serem, em alguns modos de realização, totalmente marcados ou não marcados (mas não parcialmente marcados) com a porção repórter/grupo de equilíbrio, existe pouco ou nenhum espalhamento nas massas dos fragmentos filho ionizados causado por distribuição isotópica através das ligações fraturadas, como seria o caso onde isótopos estivessem presentes em cada lado de uma ligação lábil singular de um polipeptídeo parcialmente marcado, rotineiramente determinado na segunda análise de massa.

A reação entre os reagentes de marcação da presente invenção e a proteína ou peptídeo a ser marcado é assegurada pela presença de um grupo reativo a proteína/peptídeo. O grupo reativo a proteína/peptídeo (PRG) no reagente de marcação é um grupo que reage seletivamente com certos grupos funcionais de proteínas ou peptídeos ou é um substrato de uma enzima de interesse. Exemplos de grupos reativos a proteína/peptídeo adequados e os grupos reativos com que eles reagem estão fornecidos abaixo:

-Grupos reativos a tiol reagem com a cadeia lateral de cisteína. Grupos reativos a tiol incluem epóxidos, grupo alfa-haloacila, nitrilas, alquil ou aril tióis sulfonados, halogenetos de alquila, aril amidas e maleimidas. Um exemplo particular é iodoacetamida ou um derivado da mesma.

-Grupos reativos a amino reagem com o grupo épsilon amina da cadeia lateral de lisina ou reagem com a amina do terminal N de um polipeptídeo. Grupos reativos a amino marcam grupos amino em proteínas e incluem halogenetos de sulfonila, isocianatos, isotiocianantes, ésteres ativos, incluindo ésteres tetrafluorofenila, ésteres pentafluorofenila, ésteres N- hidroxisuccinimidila, ésteres N-hidroxisulfosuccinimidila, ésteres 2- nitrofenila, ésteres 4-nitrofenila, 2,4-dinitrofenilésteres e 2,4-di-halofenil ésteres, halogenetos ácidos, anidridos ácidos e anidridos mistos. Além disso, grupos reativos a amino incluem aldeídos ou cetonas na presença ou ausência de NaBH4 ou NaCNBH3.

-Grupos reativos a ácido carboxílico reagem com as cadeias laterais de ácido aspártico e ácido glutâmico ou reagem com o terminal C de um polipeptídeo. Grupos reativos a ácido carboxílico incluem aminas ou alcoóis na presença de um agente de acoplamento como diciclo- hexilcarbodiimida, ou 2,3,5,6-tetrafluorofenil trifluoroacetato e na presença ou ausência de um catalisador de acoplamento como 4-dimetilaminopiridina; e complexos metal de transição-diamina incluindo Cu(II)fenantrolina.

-Grupos reativos a imidazol reagem com histidina.

-Grupos reativos a éster incluem aminas que, por exemplo, reagem com homoserina lactona. Metionina é convertida em homoserina lactona durante clivagem de CNBr.

-Grupos reativos a fosfato reagem com aminoácidos fosforilados como phosphoSer, PhosphoThr e PhosphoTyr. Grupos reativos a fosfato incluem metal quelado onde o metal é, por exemplo Fe(III) ou Ga(III), quelado a, por exemplo, ácido nitrilotriacético ou ácido iminodiacético. Estes agentes reagem com aminoácidos fosforilados (como fosfoserina, fosfotreonina, e fosfotirosina).

-Grupos reativos a aldeído ou cetona incluem amina mais NaBH4 ou NaCNBH3, ou estes reagentes após tratamento em primeiro lugar de um carboidrato com periodato para gerar um aldeído ou cetona. -Grupos reativos a hidroxila reagem com serina e treonina. Grupos reativos a hidroxila incluem tritil-halogenetos ou uma porção reativa a silil-halogeneto que seja substituída ou não substituída.

Os marcadores duplos da presente invenção são ligados a uma proteína ou peptídeo por interação entre o grupo reativo a proteína/peptídeo do reagente de marcação e um grupo funcional presente na proteína ou peptídeo. Este grupo funcional pode ser pré-existente no polipeptídeo presente na amostra ou pode ser criado no mesmo, opcionalmente após o isolamento do polipeptídeo. Por exemplo, um grupo ácido carboxílico pode ser modificado com carbodiimida solúvel em água (por exemplo, cloridrato de 1- (3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida; EDC) para assim obter um grupo eletrofílico que reaja com um nucleófilo como um grupo amina. Ativação do grupo ácido carboxílico de um reagente de marcação com EDC pode ser realizada na presença de uma amina. O uso de carbodiimidas em combinação com NH2-CH2-CH2-NH2 permite a conversão de grupos carboxila em grupos amina. O uso de EDC em combinação com NH2-CH2-CH2-SH assegura a conversão de grupos carboxila em grupos tiol.

Uma lista não limitativa de outros compostos que são adequados para modificar ou introduzir grupos funcionais em um polipeptídeo inclui 2-aminoetil-2'-aminoetanotiol-sulfonato que é um reagente de aminação reativo a tiol que converte um grupo tiol em um grupo amina clivável por agente de redução; reagente aminoetil-8 que converte tióis livres em grupos amina primária; BMPA que modifica grupos tiol em grupos carboxílicos; MSA que é reativo a amina com grupo carboxila latente (converte aminas em carboxilas protegidas. Carboxilas são desmascaradas em pH 9,5 em tampão fosfato); SATA que reage com aminas primárias para adicionar tióis protegidos; Hidroxilamina HCl que é um reagente altamente eficaz para desbloqueio de proteínas modificadas por SATA e SATP para gerar um tiol livre e Reagente de Traut que é um reagente solúvel em água que reage com aminas primárias em pH 7-10 para introduzir grupos tiol. Esses reagentes são disponíveis em por exemplo, Pierce Chemicals (IL, USA).

E também considerado que um ou mais grupos funcionais são criados em um peptídeo ou polipeptídeo por remoção de um grupo protetor. Consequentemente, em modos de realização particulares, grupos funcionais em um polipeptídeo são trocados ou adicionados. Em modos de realização particulares tos grupos funcionais adicionados são grupos que não ocorrem naturalmente em proteínas.

Em outros modos de realização dos reagentes de marcação dupla adequados no contexto da presente invenção, os grupos PRG são na realidade substratos para uma enzima modificadora de proteína particular. Esta enzima pode ser uma enzima que é envolvida, in vivo, em modificações pós-tradução. Algumas destas enzimas são associadas com um estado de doença ou defeito de nascença. Exemplos são fosfatase ácida, fosfatase alcalina, alanina aminotransferase, amilase, enzima conversora de angiotensina, aspartato aminotransferase, creatina quinase, gama- glutamiltransferase, lipase, lactato desidrogenase, e glicose-6-fosfato desidrogenase, proteases, e esterases.

De acordo com modos de realização particulares dos reagentes de marcação da invenção, o componente de marcação isotópico e o componente de marcação isobárico formam diferentes partes do reagente de marcação, separados por uma ligação. Componentes de marcação isotópicos e isobáricos adequados de acordo com estes modos de realização são descritos acima.

Entretanto, para simplificar a fabricação do reagente, em particular a incorporação de isótopos, o isótopo do componente de marcação isotópico pode ser incorporado em outra parte do reagente de marcação, mais particularmente no componente de marcação isobárico, no grupo repórter ou no grupo de equilíbrio do mesmo.

De acordo com um modo de realização particular, o grupo de equilíbrio dos grupos isobáricos possui a estrutura -C-CO-C-(ver Figura 3) (como para os marcadores isobáricos comercialmente disponíveis), ou um grupo maior, como os descritos acima, por exemplo -CH2-CHR1-CH2-, em que R1 é igual ou diferente e é um grupo alquila contendo um a oito átomos de carbono, que inclui o componente de marcação isotópica que é opcionalmente um heteroátomo ou um grupo arila substituído ou não substituído em que os átomos de carbono dos grupos alquila e arila contêm independentemente átomos de hidrogênio, deutério e/ou flúor ligados. Para o grupo de equilíbrio do componente de marcação isobárico funcionar também como componente de marcação isotópico, o grupo -CH2-CHR1 -CH2-por um lado possui o número necessário de isótopos para prover o equilíbrio com o grupo repórter e por outro lado contém o número necessário de substituições de isótopos para gerar uma diferença de massa entre os diferentes reagentes de marcação em um conjunto.

Alternativamente, a diferença de massa entre reagentes de marcação individuais é obtida trocando um ou mais átomos em um reagente de marcação por outros átomos, assegurando, assim que a estrutura química e as características fisicoquímicas do reagente de marcação sejam minimamente alteradas para assegurar o comportamento essencialmente idêntico de peptídeos idênticos diferencialmente marcados antes de MS, i.e. durante eletroforese ou cromatografia, independente do marcador anexado.

Por exemplo, é considerado um conjunto de 8 reagentes de marcação em que um conjunto de 4 reagentes de marcação possuem um componente de marcação isobárico, incluindo um oxigênio como indicado na Figura 3. No outro conjunto de 4 reagentes de marcação, o átomo de oxigênio do componente de marcação isobárico é substituído por enxofre (ver figura 4 e o balanceamento é da mesma maneira que a mostrada na figura 3 pela substituição de 32S por 34S. As conseqüências desta modificação na massa dos componentes de marcação isobáricos é ilustrada na Tabela 2. Tabela 2: Geração de diferença de massa por modificação da estrutura do grupo de equilíbrio de um marcador isobárico.

Marcador 1 2 3 4 5 6 7 8 Massa do grupo repórter 114 115 116 117 114 115 116 117 Grupo de equilíbrio -CO- Grupo de equilíbrio -CS- Massa do grupo de equilíbrio 31 30 29 28 51 50 49 48 Soma 145 145 145 145 165 165 165 165

A ligeira diferença química entre os peptídeos duplamente

marcados que é obtida pela substituição de um único carbono biomarcador por enxofre alterará o comportamento desse peptídeo em sistemas de separação como cromatografia líquida somente em uma extensão limitada. A diferença entre a massa de carbono e enxofre permite a separação de dois conjuntos de peptídeos marcados com base em sua massa. Para cada um destes dois conjuntos, os diferentes grupos repórteres serão gerados em MS/MS como é usual.

Em outro modo de realização da presente invenção, a diferença de massa entre reagentes de marcação diferencial é obtida pela incorporação de isótopos adicionais no grupo repórter do componente de marcação isobárico. No componente de marcação isobárico como indicado na Figura 3, um átomo adicional de deutério pode ser incorporado no grupo metil piperazina, para gerar uma etiqueta isotópica do marcador da Figura 3. Entretanto, quando multiplexação maior é considerada usando conjuntos de reagentes de marcação com 3 ou mais massas diferentes, o grupo metil piperazina se torna pequeno demais para acolher todos estes isótopos adicionais. Assim, como um exemplo, reagentes de marcação são fornecidos com um grupo propil piperazina (ver figura 4C) em que diferentes isótopos

13 ·

deutério e C são incorporados. A Tabela 3 mostra as massas dos grupos repórter e de balanceamento para um conjunto de 8 reagentes de marcação com um grupo propilpiperazina, em que a diferença de massa é obtida por incorporação de dois isótopos 13C e dois 2H na cadeia lateral propila.

Tabela 3: Geração de diferença de massa por modificação do grupo repórter de um marcador isobárico.

Marcador 1 2 3 4 5 6 7 8 Massa do grupo repórter 142 143 144 145 146 147 148 149 sem isótopos na cac eia lateral propila com dois átomos C e dois deutério na cadeia lateral propila Massa do grupo de equilíbrio 31 30 29 28 31 30 29 28 Soma 173 173 173 173 177 177 177 177

Este projeto dos marcadores, apresentado na Tabela 3 possui a

vantagem de que a massa de um grupo repórter é única para cada um dos peptídeos marcados em uma amostra combinada, e serve como um controle interno.

Similarmente, como explicado acima para o grupo de equilíbrio, a diferença de massa entre reagentes de marcação individuais pode também ser obtida substituindo um átomo no grupo repórter por outro átomo desde que a alteração na estrutura e nas propriedades físico-químicas seja mínima.

Em resumo, quando se provê o componente de marcação isotópico no grupo repórter e/ou no grupo de equilíbrio de um componente de marcação isobárico convencional, não há necessidade de se projetar uma parte separada no reagente de marcação para a incorporação de um isótopo. Em modos de realização particulares, os reagentes de

marcação dupla da presente invenção contêm uma etiqueta de afinidade (A), que permite isolar seletivamente aqueles polipeptídeos que reagiram com o reagente de marcação, i.e. foram marcados. Embora a etiqueta de afinidade, em princípio possa estar presente em qualquer posição do reagente, ele é tipicamente colocado em uma posição onde não interfira com a liberação do grupo repórter após CID. Em modos de realização particulares, a etiqueta de afinidade é localizado em uma cadeia lateral do componente de marcação isotópico. Embora etiquetas de afinidade possam ser volumosas, eles podem ser ligados ao reagente de marcação com um grupo clivável. Geralmente etiquetas de afinidade são removidas do marcador do polipeptídeo antes da detecção, deixando apenas uma cicatriz no marcador.

Como indicado acima, a presença de uma etiqueta de afinidade nos reagentes de marcação dupla da presente invenção, permite a ligação seletiva de peptídeos ou polipeptídeos marcados, covalente ou não- covalentemente e com alta afinidade, a um reagente de captura (CR). Tipicamente a ligação da etiqueta de afinidade ao reagente de captura é forte de forma a ser resistente a lavagem extensa e/ou múltipla com qualquer solução ou combinação de várias soluções que assegurem a remoção de peptídeos ou polipeptídeos não especificamente ligados ao reagente de captura. Tipicamente a etiqueta de afinidade não sofre fragmentação do tipo da de peptídeo durante análise por MS.

A remoção de peptídeos ou polipeptídeos ligados ao CR através de uma etiqueta de afinidade pode ser assegurada pela adição de um ligante de deslocamento (DL), descrito abaixo, ou pela alteração da temperatura ou condições de solvente.

De acordo com um modo de realização particular, é considerado que, para reduzir adicionalmente a complexidade da amostra para análise, uma extração das proteínas ou peptídeos duplamente marcados é considerada no contexto dos métodos e ferramentas da presente invenção. Para uso no contexto destes modos de realização, a natureza dos etiquetas de afinidade não é crítica, na medida em que ela permita a ligação seletiva a um reagente de captura (CR) e opcionalmente remoção do mesmo, sem afetar o peptídeo ou polipeptídeo ligado à etiqueta de afinidade. Assim, exemplos não limitativos de pares de etiquetas de afinidade (A) e reagente de captura (CR) incluem:

-d-biotina ou reagentes estruturalmente modificados baseados em biotina, incluindo d-iminobiotina, que se ligam a avidina/estreptavidina (por exemplo como estreptavidina -Agarose, avidina oligomérica -Agarose, ou avidina monomérica -Agarose)

-um 1,2-diol, como 1,2-di-hidróxi-etano (HO-CH2 -CH2 -OH), e outros 1,2-di-hidróxi-alcanos incluindo aqueles de alcanos cíclicos, por exemplo, 1,2-di-hidróxi-ciclo-hexano que se ligam a um ácido alquil ou aril borônico ou ésteres de ácido borônico, como fenil-B(OH)2 ou hexil-B(OEtil)2 (por exemplo ligados por meio de um grupo alquila ou arila a um suporte como agarose)

-maltose que se liga a Proteína de Ligação a Maltose; ou outros pares açúcar/Proteína de Ligação a Açúcar, ou mais geralmente qualquer par ligante/Proteína de Ligação a Ligante que obedeça aos critérios acima mencionados de etiquetas de afinidade.

-um hapteno, como grupo dinitrofenila, que se liga ao anticorpo anti-haptenpo correspondente como anti-dinitrofenil-IgG;

-um ligante que se liga a um metal de transição, por exemplo, uma histidina oligomérica (denominada etiqueta-6His) se ligará a Ni(II), o metal de transição CR é em modos de realização particulares usado na forma de um metal de transição quelado ligado a uma resina, como ácido nitrilotriacético-Ni(II) quelado ou ácido iminodiacético-Ni(II) quelado; -glutationa que se liga a glutationa-S-transferase.

Em modos de realização particulares da presente invenção, uma purificação por afinidade de peptídeos ou polipeptídeos duplamente marcados é realizada antes da análise por MS. Consequentemente, como os peptídeos ou polipeptídeos são necessários para análise adicional, remoção do reagente de captura ou dissociação da etiqueta de afinidade do peptídeo é necessária. Isto pode ser assegurado de diferentes maneiras. Em modos de realização particulares, a etiqueta de afinidade é clivável do reagente de marcação, deixando os componentes de marcação isobárico e alobárico (isotópico) do reagente intactos. Como indicado acima, a localização da etiqueta de afinidade nos reagentes de marcação da presente invenção não é crítica. Assim, a etiqueta de afinidade pode ser ligado ao componente de marcação isotópico ou isobárico do reagente de marcação por meio de uma ligação química ou enzimaticamente clivável.

Em modos de realização particulares, a etiqueta de afinidade é ligada ao reagente de marcação dupla por uma ligação clivável (como, mas não limitada a uma ligação lábil de ácido, lábil de tiol, lábil de base, lábil de periodato, ou lábil de hidroxilamina).

Em outros modos de realização particulares, a ligação entre etiqueta de afinidade e reagente de marcação pode também ser clivável por reação química, térmica ou fotoquímica. Um grupo fotoclivável adequado é 1 - (2-nitrofenil)-etila. Ligações termicamente lábeis são por exemplo, cadeias de ácidos nucléicos de cadeia dupla, cadeias duplas de um ácido nucléico com ácido nucléico peptídico, ou ácido nucléico peptídico de cadeia dupla eu se dissociarão com aquecimento. Grupos cliváveis também incluem aqueles tendo ligações dissulfeto, grupos lábeis ácidos ou básicos, incluindo entre outros, grupos diarilmetila ou trimetilarilmetila, silil éteres, carbamatos, oxiésteres, tiésteres, tionoésteres, e amidas e ésteres alfa-fluorados. Grupos enzimaticamente cliváveis são, por exemplo, amidas ou ésteres sensíveis a protease, análogos de beta-lactama sensíveis a beta-lactamase e ligações que são cliváveis por nuclease, ou cliváveis por glicosidase.

De acordo com este modo de realização, a etiqueta de afinidade pode ser removido por tratamento da proteína ou peptídeo marcado(a) com um reagente adequado. Remoção da etiqueta de afinidade pode também ser desejável por outras razões, por exemplo, para evitar interferência na análise do peptídeo, por exemplo, em MS. Tipicamente, a etiqueta de afinidade é removida por clivagem após o isolamento por afinidade de peptídeos ou polipeptídeos marcados.

Alternativamente, a etiqueta de afinidade pode ser ligada aos reagentes de marcação da presente invenção por uma ligação não clivável. Para assegurar que os peptídeos purificados por afinidade podem ser recuperados, é usado uma etiqueta de afinidade que pode ser dissociado do reagente de captura. Em modos de realização particulares, etiquetas de afinidade de biotina e baseadas em biotina são usadas. São de interesse particular biotinas estruturalmente modificadas como d-iminobiotina, que eluirão de colunas de avidina ou estreptavidina em condições de solvente compatíveis com análise de ESI-MS, como ácidos diluídos contendo 10-20% de solvente orgânico. Foi estabelecido que compostos marcados com d- iminobiotina eluirão em solventes abaixo de pH 4.

Adicionalmente ou alternativamente, ligantes de deslocamento (DL) são usados para deslocar a etiqueta de afinidade (A) (e o peptídeo ou proteína ligado ao mesmo) do reagente de captura (CR). Quando se procede a eluição com um DL pelo menos uma fração deste DL estará presente no eluente contendo o(s) peptídeo(s) de interesse. Em modos de realização particulares os métodos da invenção podem compreender o uso de um DL que é uma molécula que não sofre fragmentação similar a de peptídeo durante análise por MS, e cuja presença em uma amostra não suprime significativamente a ionização dos conjugados de peptídeo marcado, substrato ou produto de reação. Particularmente, o ligante de deslocamento pode ser escolhido de modo que ele mesmo seja minimamente ionizado durante análise por espectrometria de massa e que a formação de íons compostos de clusters de DL seja mínima.

A natureza de um ligante de deslocamento (DL) adequado depende do A e CR que são empregados. Em geral, o DL é selecionado para deslocar A do CR em uma escala de tempo razoável, no máximo dentro de uma semana de sua adição, mas mais preferivelmente dentro de alguns minutos ou até uma hora. A afinidade de DL por CR deve ser comparável ou mais forte que a afinidade dos compostos marcados contendo A por CR. Além disso, o DL deve ser solúvel no solvente usado durante a eluição de compostos marcados contendo a etiqueta de afinidade A, do CR. Em modos de realização particulares e DL corresponde a uma etiqueta de afinidade livre A ou um derivado ou modificação estrutural de A. Exemplos de ligantes de deslocamento incluem, assim, d-biotina ou derivados de d-biotina.

Os componentes de marcação isotópico (IT) e isobárico (IB), grupo reativo a proteína (PRG) e etiquetas de afinidade (A) opcionais que formam as partes dos reagentes de marcação da presente invenção podem ser arranjados em diferentes configurações possíveis. Uma lista não limitativa de possíveis combinações é mostrada na Figura 5. As exigências são de que o PRG do reagente de marcação possa reagir com um grupo funcional de um polipeptídeo e que o grupo repórter do componente de marcação isobárico possa ser liberado por CID.

As ligações entre diferentes partes, a não ser as que ladeiam o grupo repórter podem ser conectadas umas às outras por meio de qualquer química adequada disponível ao especialista. Por exemplo, a estrutura química do componente de marcação isotópico mencionado acima, ou os grupos Bl ou B2 indicados podem ser usados para ligar as diferentes partes do reagente de marcação.

Em outro aspecto da presente invenção são fornecidos métodos e ensaios, em que amostras são diferencialmente marcadas usando os reagentes de marcação dupla da presente invenção, para permitir análise simultânea com MS.

Assim, a presente invenção provê métodos para analisar simultaneamente a presença de um ou mais polipeptídeos contendo um grupo funcional em amostras diferentes. Os métodos da invenção incluem um estágio de marcação em que cada amostra é marcada com um dentre um conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla, permitindo que os reagentes de marcação reajam com um grupo funcional dos um ou mais 5 polipeptídeos das amostras, ou peptídeos gerados a partir dos mesmos. Como descrito em detalhe acima, o conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla possuem a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química e possuem um componente de marcação isotópico e um isobárico. Cada reagente de marcação inclui uma combinação única de um componente de 10 marcação isotópico e um isobárico.

Nos estágios que se seguem à marcação, os peptídeos rotulados são isolados e analisados para cada uma das amostras.

Idealmente, nos métodos de análise considerados no contexto da presente invenção, o estágio de marcação tem como alvo quase todas as proteínas da amostra para obter a cobertura máxima do proteoma da amostra.

Ao mesmo tempo, quando se considera cada proteína individual, o número de grupos funcionais naquela proteína é idealmente baixo, de modo a reduzir a complexidade da análise (número de peptídeos desta proteína a serem analisados na amostra é somente um ou um número limitado).

Cisteína é frequentemente usada como grupo funcional para marcação porque marcação com cisteína proporciona um compromisso entre cobertura máxima (marcação de cada proteína da amostra) e complexidade mínima (marcação de cada proteína da amostra somente uma vez ou um 25 número limitado de vezes). Cisteína está presente em cerca de 85% de todas as proteínas em Genbank e em média ocorre com uma freqüência de 2% (uma em cada 50 aminoácidos) em uma seqüência de polipeptídeos. Além disso, marcação com reagentes reativos à cisteína não modifica outras parte da proteína como é o caso de marcação de grupos amina que ocorrem tanto na lisina quanto nos terminais amino ou como é o caso de marcação de grupos carboxila que ocorrem no ácido aspártico, ácido glutâmico e nos terminais carbóxi. De acordo com um modo de realização dos métodos da invenção, a marcação é, assim, realizada através de um grupo funcional cisteína. Em um 5 modo de realização particular, antes do estágio de marcação, as amostras são reduzidas para assegurar a presença de um grupo funcional tiol acessível nas cisteínas das proteínas da amostra.

Além disso, a chance da cisteína aparecer no peptídeo C- terminal ou no peptídeo N-terminal de um dado digerido enzimático decresce 10 com o número de sítios de reconhecimento para essa enzima em uma proteína. Este número normalmente aumenta proporcionalmente com o comprimento de um polipeptídeo. Assim métodos de marcação em que cisteína é usada como o grupo funcional do reagente de marcação são muito bem adequados para determinar níveis relativos de expressão de uma proteína 15 numa amostra.

De acordo com um modo de realização particular, como indicado acima, os métodos da invenção incluem um estágio de clivagem de proteínas em peptídeos antes ou após o estágio de marcação. Esta é geralmente realizada para permitir a análise de peptídeos menores, ao invés de 20 proteínas de comprimento completo. Será mais fácil separar peptídeos do que proteínas em sistemas de alta produção como LC, e interpretar dados de seqüência dos peptídeos em MS/MS.

Produtos químicos adequados para clivagem de proteína incluem brometo de cianogênio, BNPS escatol (2-(2'-Nitrofenilsulfonil)-3- metil-3-Bromoindolenina), ácido fórmico, hidroxilamina, ácido iodobenzóico, NTCB + Ni (ácido 2 nitro 5 tiocianobenzóico). Enzimas proteolíticas adequadas incluem Asp-N Endopeptidase, Caspase 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou

10, Quimiotripsina; Clostripaína, Enteroquinase, Fator Xa, Glutamil Endopeptidase, Granzima B, LisC Lisil endopeptidase, Papaína, Pepsina, Prolina-Endopeptidase, Proteinase K, peptidase estafilocócica I, Termolisina, Trombina, Tripsina.

Dependendo do tipo de amostra de proteína é realizada uma combinação de clivagem química e enzimática ou uma dupla digestão enzimática.

A despeito da variedade de enzimas e químicos, tripsina ainda permanece a enzima com especificidade (Lisina e Arginina) e eficiência mais altas. Em vertebrados Lisina ocorre em proteínas com uma frequência de 7,4% e Arginina com uma frequência de 4,2%. Um digerido tríptico resulta, assim, em peptídeos com um comprimento médio de 9 aminoácidos em proteínas não modificadas e de 25 aminoácidos quando lisina é modificada em uma extensão onde não há mais substrato para tripsina. Esses peptídeos são bem adequados para técnicas cromatográficas e de MS.

De acordo com um modo de realização particular dos métodos da invenção, a clivagem de proteínas é realizada após a marcação. Isto permite reduzir a complexidade da amostra por isolamento de somente aqueles peptídeos que portam um rótulo em um grupo funcional.

De acordo com um modo de realização particular, proteínas marcadas são digeridas com tripsina. De acordo com um modo de realização mais particular, proteínas marcadas são tratadas com um agente de acetilação para modificar as cadeias laterais de lisina antes de ser realizada uma digestão tríptica. Em conseqüência disso o terminal amino de um polipeptídeo será igualmente acetilado.

De acordo com outro modo de realização particular, proteínas marcadas são digeridas com uma protease específica para lisina. Em resultado disso todos os peptídeos obtidos desse digerido terão um grupo amina em seu terminal amino e na cadeia lateral da lisina carboxiterminal (com exceção do peptídeo carboxiterminal que pode ter outro aminoácido carboxiterminal).

Proteínas que são duplamente marcadas em um estágio de marcação, mas que não incluem um sítio de clivagem de proteína podem participar como tal do restante do procedimento como peptídeos clivados.

De acordo com modos de realização particulares dos métodos da presente invenção, os reagentes de marcação usados incluem uma etiqueta de afinidade, e os métodos incluem o estágio de rotular duplamente as proteínas presentes nas amostras, clivar as proteínas duplamente marcadas e isolar os peptídeos duplamente rotulados baseados na etiqueta de afinidade presente no rótulo dos peptídeos. Este isolamento por afinidade permite a redução da complexidade da amostra para análise posterior. Quando a clivagem da proteína é realizada, os peptídeos que não incluem um grupo funcional e assim não foram rotulados, são removidos.

Os métodos da presente invenção, incluem um estágio de coletar duas ou mais amostras que são diferencialmente marcadas na primeira e segundo estágio de marcação. Com a coleta das diferentes amostras uma mistura de amostras de polipeptídeos é obtida. Isto permite a comparação imediata das diferentes amostras da análise. Onde as amostras de proteína usadas nos métodos da invenção são complexas, a amostra coletada será submetida a uma ou mais técnicas de separação de peptídeos para isolar seletivamente os polipeptídeos duplamente rotulados ou peptídeos com uma mesma seqüência de aminoácidos oriundos da mistura de amostras de polipeptídeos.

De acordo com a presente invenção, a estrutura química dos rótulos isobáricos/isotópicos combinados é a mesma ou é essencialmente a mesma em um conjunto de reagentes de marcação, de modo que ela não gerará uma diferença significativa nas propriedades em técnicas cromatográficas (multidimensionais), entre peptídeos idênticos que são diferentemente rotulados.

Técnicas de separação adequadas, que permitem a separação de uma amostra complexa de proteína ou peptídeo em duas ou mais, até múltiplas frações (no contexto do isolamento de peptídeos duplamente rotulados) são conhecidas do especialista na técnica e incluem, mas não se limitam a focalização isoelétrica, SDS PAGE, eletroforese em gel bidimensional, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia por troca iônica, HPLC de fase reversa, cromatografia de afinidade,... etc.

Quando a amostra consiste de peptídeos maiores (por exemplo entre Mr 3000 e 100 000) pode ser usado 2D GE. Para amostras de peptídeo, obtidas de, por exemplo, digestões proteolíticas, abordagens 2D LC são mais adequadas para separação, e também a automação e produção é significativamente melhor. Foram descritas várias tecnologias para separar digeridos proteína/peptídeo por cromatografia líquida: cromatografia líquida de fase reversa (RP)-HPLC, e cromatografia líquida bidimensional. Além disso eletroforese capilar (CE) é um método adequado para a separação de peptídeos. 2D-LC geralmente usa colunas de troca iônica (usualmente, de troca catiônica forte, S CX) em linha acoplada com uma coluna de fase reversa, operada em uma série de ciclos. Em cada ciclo a concentração de sal é aumentada na coluna de troca iônica, para eluir peptídeos de acordo com sua carga iônica no sistema de fase reversa. Neste caso os peptídeos são separados por hidrofobicidade por, por exemplo, um gradiente com CH3CN.

Muitos parâmetros influenciam a potência de resolução e subsequentemente o número de proteínas que pode ser mostrado por LC-MS. Usualmente, a configuração em linha entre a técnica de separação em primeira dimensão (SCX) e a técnica de separação RP-HPLC em segunda dimensão é estabelecida para fracionamento da amostra. Cromatografia de troca iônica pode ser realizada por eluição em etapas, com concentração crescente de sal ou por um gradiente de sal. Tipicamente, SCX é realizada na presença de, por exemplo até 30% de acetonitrila, para minimizar interações hidrofóbicas durante cromatografia por SCX. Antes da cromatografia por fase reversa, por exemplo em uma coluna C18, solventes orgânicos como acetonitrila são removidos, ou fortemente reduzidos por, por exemplo, evaporação.

Consequentemente, dispositivos adequados para realização dos métodos da presente invenção opcionalmente contêm ou são ligados a um ou mais instrumentos de separação adequados, como instrumentos de eletroforese, instrumentos de cromatografia, como, mas não limitados a instrumentos de eletroforese capilar (CE), instrumentos de cromatografia líquida de fase reversa (RP)-HPLC, e/ou multidimensional,... etc.

A presente invenção provê ferramentas e métodos para a identificação simultânea (por MS/MS) e/ou quantificação (por MS ou MS/MS) de proteínas em amostras diferentes. Mais particularmente, os métodos da presente invenção referem-se à análise da ocorrência relativa dos polipeptídeos ou peptídeos duplamente marcados isolados por espectoscopia de massa, seguida pela identificação de peptídeos.

Consequentemente, os dispositivos para realização dos métodos da presente invenção contêm um ou mais instrumentos de espectrometria de massa.

Medições de massa por espectrometria são realizadas pela ionização de analitos para a fase gasosa. Um instrumento típico de espectrometria de massa consiste de 3 componentes, uma fonte de ionização para gerar íons a partir das moléculas de interesse, um analisador de massa, que determina a razão massa para carga (m/z) das moléculas ionizadas, e um detector que registra e conta o número de íons para cada valor m/z individual. Cada característica em um espectro MS é definida por dois valores, m/z e uma medida do número de íons, que alcançou o detector do instrumento.

A ionização de proteínas ou peptídeos para análise de massa em um espectrômetro é usualmente realizada por ionização por pulverização de elétrons (ESI)) ou ionização/dessorção de matriz assistida (MALDI).

Durante o processo ESI, analitos são diretamente ionizados para fora da solução e ESI é, assim, frequentemente diretamente acoplado às ferramentas de separação de cromatografia líquida (por exemplo, HPLC de fase reversa). MALDI vaporiza via pulsos de laser amostras secas misturadas com pequenas moléculas orgânicas que absorvem a energia do laser como ácido cinâmico para tomar o processo mais eficaz. O analisador de massa é um componente chave do espectrômetro de massa; parâmetros importantes são sensibilidade, resolução, e acurácia de massa. Existem cinco tipos básicos de analisadores de massa correntemente utilizados em proteômica. Estes incluem analisadores de aprisionamento de íons, tempo de vôo (TOF)), quadrupolo, Orbitrap, e ressonância de íon ciclotron com transformada de Fourier (FTICR-MS). MS ou MS/MS em série (tandem) pode(m) ser realizado(s) no tempo (aprisionamento de íons) e no local (com todos os instrumentos híbridos como por exemplo, LTQ-FTICR, LTQ-Orbitrap, Q- TOF, TOF-TOF, triplo quadrupolo (triple quad) e sistema híbrido de triplo quadrupolo/aprisionamento de íons linear (QTRAP).

Como aqui detalhado, o espectro gerado em espectrômetro de massa de um polipeptídeo ou peptídeo que tenha sido previamente isolado de uma combinação de amostras diferencialmente marcadas, contém um conjunto de picos com as diferenças de massa características entre os diferentes componentes de marcação isotópicos (o número de picos será menor se uma proteína em que este polipeptídeo ocorre não for absolutamente expressa em uma das amostras). Cada um destes picos são adicionalmente analisados por MS em série (tandem MS) para liberar o grupo repórter do componente de marcação isobárico para identificação, além de quantificação dos peptídeos marcados diferencialmente. Com base no Mr do polipeptídeo, na composição de aminoácido ou na seqüência de aminoácidos dos peptídeos individuais a identidade dos peptídeos é determinada.

Os métodos da presente invenção são abaixo ilustrados por vários esquemas de marcação. Como detalhado acima e adicionalmente explicado, a seguir, nos diferentes esquemas ilustrativos de marcação, a fragmentação de peptídeos ou o uso de uma etiqueta de afinidade não é essencial para todos os modos de realização da presente invenção.

O esquema de marcação a seguir (ver Figura 6) divulga um modo de realização de uma marcação de 8 amostras de proteínas usando os reagentes de marcação dupla da presente invenção, com um grupo reativo a proteína (PRG), que é um grupo reativo a cisteína.

Em um estágio de pré-processamento as amostras são reduzidas para assegurar a presença de um grupo funcional tiol acessível na cisteína, e são acetiladas para bloquear as aminas da cadeia lateral de lisina.

Os diferentes estágios do esquema de marcação compreendem:

-As 8 amostras de proteínas são marcadas, cada uma, com um de um conjunto de reagentes de marcação dupla, em que cada reagente de marcação possui uma combinação única de uma etiqueta isotópica e uma isobárica, e os reagentes de marcação são marcados com biotina e contêm um grupo reativo a cisteína.

-Após a marcação, já neste estágio todas as amostras são combinadas e tratadas como uma mistura de reação, que reduz as variações devidas à manipulação de amostras individuais.

-As amostras marcadas por cisteína assim obtidas são digeridas com tripsina.

-Para reduzir o número de peptídeos para análise adicional, somente os peptídeos duplamente marcados são isolados por meio da etiqueta de afinidade biotina do marcador usando técnicas de afinidade por (estrept)avidina.

Após o estágio de afinidade, cada peptídeo tem agora um marcador com um componente de marcação isotópico e um isobárico. Consequentemente, todo peptídeo é informativo com análise por MS. O método inclui adicionalmente os estágios em que:

-os peptídeos combinados são separados por, por exemplo, cromatografia líquida. Aqui peptídeos que são idênticos, mas que se originam de uma amostra diferente e são assim diferentemente marcados se comportarão de maneira essencialmente idêntica. A despeito das diferentes combinações de componente de marcação isotópico e isobárico que estão presentes em cada um dos peptídeos de uma amostra diferente, isto não afetará sua eluição já que os diferentes marcadores de cada marcador construído possuem a mesma fórmula química ou essencialmente a mesma fórmula.

-Cada fração de peptídeo separada é analisada por MS, o que deveria gerar dois sinais, com massa diferente, correspondente à presença de um componente de marcação isotópico "leve" ou um "pesado. Depois, cada peptídeo com um isótopo diferente é adicionalmente fragmentado sendo o grupo repórter liberado do componente de marcação isobárico presente em cada um dos peptídeos. O montante relativo de repórter indica o montante relativo de peptídeo que foi marcado com aquele repórter. Dados de MS são adicionalmente usados para determinar a seqüência do peptídeo e identificar a proteína da qual ele é derivado. Um exemplo teórico de determinação do montante relativo de cada peptídeo marcado em uma mistura de peptídeos é mostrado no exemplo 1 deste relatório.

O método da invenção ilustrado acima, usando um conjunto de reagentes de marcação com combinações de 2 diferentes componentes de marcação isotópicos e 4 diferentes componentes de marcação isobáricos, permite multiplexação de amostras diferentes de proteínas até uma complexidade de 8. Quando componentes de marcação isotópicos e/ou isobáricos são usados, isto permite multiplexação aumentada. A multiplexicidade é determinada pelo produto do número de diferentes componentes de marcação isotópicos vezes o número de diferentes componentes de marcação isobáricos O protocolo de marcação exemplar acima descrito é adequado para a determinação, por exemplo, de diferenças no nível de expressão em entre proteínas individuais em amostras diferentes usando peptídeos internos. Protocolos alternativos diferentes são projetados, dependendo de aplicações 5 particulares.

O método mais convencional indicado acima usa uma marcação em uma cadeia lateral de um peptídeo. Tipicamente a marcação na cadeia lateral é realizada em cisteína. Entretanto, como mencionado acima, cerca de 15% de proteínas do banco de dados de proteínas não contém 10 cisteína e não será marcado. A chance de que não ocorra nenhuma cisteína na proteína aumenta com a redução do comprimento da proteína. Isto será igualmente verdadeiro para a marcação em cadeias laterais de aminoácidos que não sejam cisteína. Quanto menor a proteína, menor a chance para marcação na cadeia lateral de um aminoácido.

Para estudar proteínas de baixo Mr, os reagentes de marcação

dupla e métodos da presente invenção em que grupos reativos a proteína/peptídeos interagem com grupos funcionais que são aminas primárias ou grupos carboxila, são de interesse particular. Na realidade, estes grupos sempre ocorrem em cada proteína respectivamente no terminal amino e no 20 terminal carbóxi. De acordo com um modo de realização particular, os métodos da invenção compreendem o estágio de fracionar as amostras em uma ou mais frações de Mr baixo usando métodos de cromatografia de filtração em gel ou exclusão por tamanho (diálise ou ultrafiltração). Depois disso, a fração de proteína de baixo Mr das amostras é marcada sem clivagem adicional de 25 proteína, uma vez que o tamanho limitado dessas amostras de proteínas as tomam diretamente adequadas para técnicas de cromatografia líquida. Neste modo de realização dos métodos da invenção, não é necessário usar etiquetas de afinidade, porque toda proteína da fração de Mr baixo está marcada.

Em outro modo de realização, os reagentes do presente método são usados para marcar especificamente o peptídeo N-terminal ou C-terminal da proteína.

Para o isolamento de peptídeos N-terminais, os grupos amina de uma proteína (Lisina e terminal N) são primeiramente modificados (por exemplo, alquilados ou acetilados). A cadeia lateral de Asp e GIu é também modificada. Depois disso, a proteína é clivada (por exemplo, com tripsina) fazendo com que todos os peptídeos, com exceção do peptídeo N-terminal obtenham um novo grupo amina reativo acessível. Este grupo é reagido com uma etiqueta de afinidade reativa a proteína (por exemplo, NHS-biotina). A partir daqui os peptídeos internos e C-terminais são isolados usando cromatografia de afinidade. O peptídeo N-terminal remanescente é agora reagido em seu terminal C com um reagente de marcação com um grupo reativo a carboxila. Para este procedimento não há necessidade de uma etiqueta de afinidade no reagente de marcação, já que os peptídeos de interesse já foram na realidade previamente purificados por afinidade. O uso de um marcador no reagente de marcação e a subsequente purificação por afinidade pode ainda ser projetada para assegurar que somente peptídeos apropriadamente marcados sejam submetidos a análise adicional. Neste método, a modificação de Asp e GIu antes da clivagem, evita marcação de cadeias laterais de aminoácido, mas não é essencial para o procedimento.

Um método similar pode ser realizado para o isolamento de peptídeos C-terminais, em que grupos carboxílicos são modificados e os peptídeos gerados na clivagem são reagidos com uma etiqueta de afinidade, que porta um grupo que é reativo a grupos carboxílicos. O reagente de 25 marcação consequentemente compreende um grupo reativo a proteína/peptídeo, que é reativo com o novo terminal N gerado na clivagem.

A marcação de peptídeo N-terminal ou peptídeo C-terminal de uma proteína possui certas vantagens.

Em primeiro lugar, todas as proteínas da amostra são detectadas, enquanto marcação na cadeia lateral de um aminoácido passará por cima daquelas proteínas em que essa funcionalidade particular não ocorre. Em segundo lugar, mesmo proteínas com um terminal N bloqueado serão detectadas. Usando este método todos os terminais amino são bloqueados, seja in vivo, seja pelo método de marcação.

Outro esquema exemplar de marcação de acordo com os métodos da presente invenção é um que é considerado particularmente adequado, por exemplo, para estudar o processamento proteolítico de proteínas (denominado degradômica) em amostras. Um exemplo de 10 processamento diferencial N-terminal é mostrado na Tabela 1 para uma proteína hipotética com uma seqüência N-terminal 1-9 em que aminoácido 4 e

9 é Arginina. Quando a proteína não é processada, todos os oito peptídeos N- terminais diferencialmente marcados eluem como uma fração após cromatografia, são divididos em diferentes frações contendo diferentes marcadores isotópicos em MS e cada um deles gera um conjunto de diferentes grupos repórter dos componentes de marcação isobáricos em MS/MS.

Na situação indicada abaixo na Tabela 1, a marcação dos peptídeos N-terminais das proteínas processadas leva a 4 peptídeos N- terminais diferentes, que eluirão em diferentes posições em sistemas de 20 cromatografia de alto desempenho como cromatografia HPLC de fase reversa. Consequentemente, essa fração de peptídeo pode até aparecer como um único pico em MS quando esses peptídeos possuem a mesma etiqueta isotópica, mas portam diferentes marcadores isobáricos.

Tabela 1: Processamento diferencial N-terminal

Amostra Seqüência Processamento Peptídeo tríptico N- terminal 1 123(4R)5678(9R).. nenhum 123(4R) 2 123(4R)5678(9R).. nenhum 123(4R) 3 123(4R)5678(9R).. 1 23(4R) 4 123(4R)5678(9R).. 1 23 (4R) 5 123(4R)5678(9R).. 2 3(4R) 6 123(4R)5678(9R).. 2 3(4R) 7 123(4R)5678(9R).. 123(4R) 5678(9R) 8 123(4R)5678(9R).. 123(4R) 5678(9R) Não obstante, para cada amostra, independente da extensão de processamento, um peptídeo N-terminal é determinado para alguma parte da proteína da qual ele foi derivado.

Nos métodos gerais da presente invenção (i.e. onde a natureza do grupo funcional não é determinada pela natureza da amostra ou pelo resultado desejado), a escolha do grupo funcional a ser modificado em um polipeptídeo pode ser influenciada por diferentes fatores, como

-o tipo de grupos reativos a proteína presentes nos reagentes de marcação disponíveis -a presença ou ausência de uma etiqueta de afinidade no

reagente de marcação disponível.

Os métodos da presente invenção são úteis para a detecção de biomarcadores, por exemplo, no contexto de doença. Dependendo da amostra, um grande número de peptídeos são analisados por MS e MS/MS. Esta 15 quantidade pode ser tão alta como várias centenas ou mesmo mais de mil. Para muitos deles, o montante relativo entre versões diferencialmente marcadas do mesmo peptídeo será constante independente da origem da amostra. No entanto, diferenças significativas serão observadas para um número limitado de peptídeos que estão correlacionados com uma condição 20 da doença representada por uma certa amostra. Análise destes peptídeos em si toma possível determinar a proteína da qual o peptídeo é originado. A análise será ainda mais confiável quando é observado que, para diferentes peptídeos de uma mesma proteína, um nível de expressão idêntico é detectado.

Outro aspecto da invenção refere-se a um dispositivo para 25 análise por multiplexação de amostras de proteínas (100) contendo pelo menos duas fontes de amostra (101), uma unidade de marcação (103), com fontes de marcação correspondentes (104), uma unidade de separação (107), uma unidade de espectrometria de massa (108) e uma unidade de análise de dados e circuito de controle (109). Em modos de realização particulares a unidade de separação (107) compreende dois sistemas de separação acoplados consecutivamente (1107) e (2107), em que o primeiro sistema de separação (1107) é por exemplo, um sistema de eletroforese em gel 2D ou um sistema de 5 cromatografia por troca iônica e sistema de separação, e o segundo sistema de separação (2107) é tipicamente um sistema HPLC de fase reversa.

O elemento espectrômetro de massa 108 é um espectrômetro MS/MS que separa formas isotópicas e em que com CIE), os grupos repórteres dos marcadores isobáricos são diferencialmente detectados e em que seqüenciamento de peptídeo de novo pode ser realizado. Análise por MS/MS pode ser realizada usando 2 instrumentos fundamentalmente diferentes. No primeiro tipo de instrumento, o aprisionamento de íons na qual análise por MS/MS é feita é o mesmo aprisionamento de íons onde é realizado MS, mas MS/MS é realizada em tempo (in time) (o aprisionamento é cheio, todos os íons são ejetados exceto o(s) íon(s) de interesse e CID é realizada e os fragmentos ionizados são submetidos a varredura). O segundo tipo de instrumento, instrumentos híbridos (triple quad, q-tof, ltq-ftms, ltq-orbitrap), separam por MS/MS no local, por exemplo, seleção do pai é feita no primeiro analisador de massa e fragmentos são submetidos a varredura no segundo analisador de massa. O dispositivo pode conter adicionalmente vários elementos

opcionais como uma unidade de preparação de amostra(102) em que ocorre por exemplo, Iise de amostra e imunodepleção, uma unidade de clivagem de proteína (105) e uma unidade de purificação por afinidade (106) para isolar seletivamente polipeptídeos marcados que portam uma etiqueta de afinidade (por exemplo, 25 purificação por afinidade com biotina -avidina). Dispositivos adequados para incorporação nos dispositivos da presente invenção como unidades de espectrometria de massa e unidades de separação são descritos acima.

Será apreciado que os métodos de marcação da presente invenção são aplicáveis em proteômica, caracterização de perfil de expressão de proteína, descoberta de biomarcadores e descoberta de alvos. A alta multiplexação dos métodos da presente invenção permite analisar várias condições diferentes em um único experimento. O método é particularmente útil para estudar ao perfil de expressão de uma amostra obtida de diferentes 5 estados de doença. Amostras que são analisadas são derivadas de uma ou mais entre os seguintes indivíduos: uma pessoa saudável, uma pessoa com um distúrbio benigno, uma pessoa com uma distúrbio maligno (brando ou agressivo), de pessoas respondendo ou não a um tratamento, de pessoas tendo um distúrbio que se manifesta em diferentes partes do corpo, de pessoas antes, 10 durante e após tratamento, de pessoas recebendo um método diferente de tratamento e de pessoas que possuem um ou mais sintomas de um distúrbio e a não ser por isso se encontram saudáveis. Distúrbios que são considerados no contexto da presente invenção incluem infecções bacterianas ou virais, distúrbios imunológicos, distúrbios cardiovasculares e câncer.

Outros arranjos dos sistemas e métodos que formam a

invenção serão óbvios para os especialistas na técnica.

Deve ser entendido que embora modos de realização, construções e configurações específicas, bem como materiais preferidos tenham sido aqui discutidos para os dispositivos de acordo com a presente invenção, várias trocas ou modificações em forma e detalhe podem ser feitas sem se afastar do escopo e espírito desta invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Determinação de níveis de expressão relativa de peptídeos individuais usando marcação isotópica e isobárica.

Usando reagentes de marcação contendo combinações

singulares de componentes de marcação isotópicos e isobáricos é possível determinar o montante relativo de um peptídeo individual numa mistura de peptídeos marcados com diferentes combinações de marcação isobárica e isotópica. Isto é exemplificado pelo seguinte exemplo teórico. Um peptídeo intemo em 8 amostras (1 a 8) é marcado com uma combinação de marcadores isotópicos a ou b e marcadores isobáricos A, B, C e D de acordo com o esquema da Tabela 4.

Tabela 4: Determinação de concentrações relativas de um polipeptídeo marcado em uma mistura

Peptídeo 1 2 3 4 5 6 7 8 Marcação a a a a b b b b isotópica Marcação A B C D A B C D isobárica Amostra laA, 2al 3, 3aC, 4aD, 5bA, 6bB, 7bC, 8bD combinada Primeira laA, 2aB, 3aC, 4aD 5bA, 6bB, 7bC, 8bD separação por MS Razão de 2 3 marcação isotópica Segunda IaA 2aB 3aC 4aD 5bA 6bB 7bC 8bD separação por MS/MS Razão de 1 9 3 7 1 8 6 5 marcação isobárica Razão 1/20 x 9/20 x 3/20 x 7/20 x 1/20 x 8/20 x 6/20 x 5/20 x individual 2/5 = 2/5 = 2/5 = 2/5 = 3/5 = 3/5 = 3/5 = 3/5 = 0,02 1,8 0,06 0,14 0,03 0,24 0,18 0,15 Normalizado 1 9 3 7 1,5 12 9 7,5 Depois disso todas as amostras são combinadas e submetidas a cromatografia em que peptídeos marcados se comportam da mesma maneira, independente da combinação particular de componente de marcação isotópica/isobárica em um peptídeo. Tais versões diferentemente marcadas do IO peptídeo eluem como uma fração única. A fração é aplicada a um MS onde se separará em uma fração com isótopo pesado e uma fração com isótopo leve. A partir destas duas frações o montante relativo pode ser calculado. Na Tabela 4, é medido 50% mais de peptídeo com o isótopo b do que com o isótopo a. Subsequentemente, as duas frações de peptídeos com diferentes 15 marcadores isotópicos são fragmentados, o que permite determinar a razão relativa de peptídeos isobáricos dentro de cada fração de peptídeos com um dado etiqueta isotópica (razões teóricas indicadas na Tabela 4).

Claims

1. Conjunto de reagentes de marcação para análise por espectrometria de massa de polipeptídeos, caracterizado pelo fato de que cada reagente de marcação compreender: -um componente de marcação alobárico, -um grupo reativo a proteína/peptídeo, e -um componente de marcação isobárico contendo um grupo repórter (RP) e um grupo de equilíbrio (BG).

2. Conjunto de reagentes de marcação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de marcação alobárico é um componente de marcação isotópico.

3. Conjunto de reagentes de marcação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o componente de marcação alobárico está contido dentro do grupo repórter e/de equilíbrio do marcador isobárico.

4. Conjunto de reagentes de marcação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o grupo reativo a proteína/peptídeo reage com uma cisteína numa proteína ou polipeptídeo.

5. Conjunto de reagentes de marcação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada reagente de marcação compreende adicionalmente uma etiqueta de afinidade.

6. Conjunto de reagentes de marcação de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de afinidade é clivável.

7. Conjunto de reagentes de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a etiqueta de afinidade é biotina.

8. Método para analisar simultaneamente a presença de um ou mais polipeptídeos contendo um grupo funcional em amostras diferentes, caracterizado pelo fato de compreender os estágios de: a) um estágio de marcação, em que cada amostra é marcada com um de um conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla, permitindo que os reagentes de marcação reajam com um grupo funcional de um ou mais polipeptídeos das amostras, ou peptídeos gerados a partir dos mesmos; e que o conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla possui a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química e contém um componente de marcação alobárico e um isobárico e em que cada reagente de marcação compreende uma combinação única de um componente de marcação alobárico e um isobárico, (b) a combinação das amostras diferentes para obter uma mistura de amostras de polipeptídeos, (c) o isolamento seletivo dos polipeptídeos ou peptídeos duplamente marcados da mistura de amostras de polipeptídeos, e (d) a análise da ocorrência relativa dos polipeptídeos ou peptídeos marcados isolados por espectroscopia de massa.

9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os componentes de marcação alobáricos são componentes de marcação isotópicos.

10. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que os reagentes de marcação do conjunto de reagentes de marcação contêm uma etiqueta de afinidade.

11. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente após o estágio (a) o estágio de clivagem das proteínas em peptídeos.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a clivagem é realizada com tripsina.

13. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que no estágio c) os polipeptídeos ou peptídeos são seletivamente isolados com base na etiqueta de afinidade presente nos referidos polipeptídeos ou peptídeos marcados.

14. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional é um tiol.

15. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o grupo funcional dos polipeptídeos ou peptídeos gerados a partir dos mesmos está presente em resultado de uma modificação de um outro grupo funcional.

16. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o estágio (c) compreende o estágio de isolar uma fração de polipeptídeos ou peptídeos marcados dos referidos polipeptídeos combinados, por eletroforese ou cromatografia.

17. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o estágio (d) compreende o estágio de determinar com MS o montante relativo de diferentes massas na referida fração de polipeptídeos ou peptídeos marcados obtida no estágio (c).

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o estágio (d) compreende adicionalmente o estágio de submeter a referida fração isolada de polipeptídeos marcados a dissociação induzida por colisão (CID) e determinar o montante relativo de diferentes polipeptídeos isobaricicamente marcados na mesma.

19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o montante relativo de diferentes polipeptídeos isobaricicamente marcados é determinado pela determinação do montante relativo de grupos repórter liberados do marcador isobárico após CID.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o estágio de determinação da seqüência do referido polipeptídeo.

21. Método para marcar uma amostra de polipeptídeos com um reagente de marcação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter um componente de marcação isobárico e um alobárico incluindo o estágio de reagir o referido reagente de marcação com um grupo funcional dos polipeptídeos da referida amostra.

22. Uso do método como definido em quaisquer das reivindicações 8 a 21, caracterizado pelo fato de ser para identificar proteínas que são diferencialmente expressas entre uma amostra de proteína de um controle e uma ou mais amostras de proteína experimentais ou de doença.

23. Mistura de polipeptídeos ou peptídeos, caracterizada pelo fato de que cada um contendo um marcador que inclui um componente de marcação isotópico e um componente de marcação isobárico, marcador esse ligado aos polipeptídeos ou peptídeos através de um grupo funcional dos polipeptídeos ou peptídeos.

24. Mistura de polipeptídeos ou peptídeos de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o grupo funcional é selecionado no grupo que consiste de: -uma amina primária do N-terminal ou de Lisina, -um grupo carboxila de Ácido aspártico, Ácido glutâmico ou do C-terminal, e -um grupo tiol de Cisteína.

25. Mistura de peptídeos de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de compreender peptídeos que são peptídeos trípticos de proteínas.

26. Mistura de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que o número de diferentes marcadores presentes nos polipeptídeos ou peptídeos é de pelo menos 4.

27. Kit, caracterizado pelo fato de compreender quatro ou mais reagentes de marcação, e que cada reagente de marcação contendo um componente de marcação isobárico, um componente de marcação alobárico e um grupo reativo a proteína/peptídeo, em que cada reagente de marcação do referido kit tem a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química e em que cada reagente de marcação dentro do referido kit compreende uma combinação única do referido componente de marcação alobárico e referido isobárico.

28. Kit de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que os referidos reagentes de marcação contêm uma etiqueta de afinidade.

29. Método para determinar montantes relativos de polipeptídeos ou peptídeos individuais com a mesma seqüência de aminoácidos em uma mistura combinada dos mesmos, em que cada polipeptídeo ou peptídeo individual, antes da combinação, foi marcado com um de um conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla, em que o conjunto de reagentes diferenciais de marcação dupla possui a mesma ou essencialmente a mesma estrutura química e porta um componente de marcação isobárico e um isotópico e cada reagente de marcação compreende uma combinação única de componentes de marcação isobáricos e isotópicos, caracterizado pelo fato de compreender os estágios de: a) opcionalmente isolar os polipeptídeos ou peptídeos por cromatografia líquida, de modo a obter uma fração isolada contendo os referidos polipeptídeos ou peptídeos individuais tendo a mesma seqüência de aminoácidos, b) separar os polipeptídeos ou peptídeos da mistura combinada ou a fração isolada de polipeptídeos obtida no estágio (a) em frações adicionais de polipeptídeos ou peptídeos cada uma com uma massa diferente, por uma primeira MS e determinar o montante relativo de cada fração de peptídeos com uma massa diferente. c) submeter as frações de peptídeos obtidas no estágio (b) a uma segunda MS sob condições em que os componentes de marcação isobáricos dos polipeptídeos individuais são fragmentados e determinar os montantes de cada um dos componentes de marcação isobáricos fragmentados dos peptídeos individuais nas frações de peptídeos. d) determinar, a partir do montante relativo de cada um dos componentes de marcação isobáricos determinados no estágio (c), o montante relativo de peptídeos individuais na fração de peptídeos obtida no estágio (b), e) calcular, a partir dos montantes relativos de cada fração com massa diferente determinados no estágio (b) e dos montantes relativos dos peptídeos individuais determinados no estágio (d), o montante relativo de cada polipeptídeo individual tendo a mesma seqüência de aminoácidos, presente na referida mistura combinada.

30. Dispositivo (100) para marcação por multiplexação e análise de amostras de proteínas, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos duas fontes de amostras (101), uma unidade de marcação (103) e fontes de marcação correspondentes (104) cada uma contendo um reagente de marcação incluindo: -um componente de marcação alobárico, -um grupo reativo a proteína/peptídeo, e -um componente de marcação isobárico contendo um grupo repórter (RP) e um grupo de equilíbrio (BG), e compreendendo adicionalmente uma unidade de separação (107), uma unidade de espectrometria de massa (108) e uma unidade de análise de dados (109).

31. Dispositivo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente um ou mais elementos selecionados no grupo que consiste de uma unidade de preparação de amostra (102), uma unidade de clivagem de proteína (105) e uma unidade de purificação por afinidade (106).