CN109813914A - 通过质谱分析用复用内标物对蛋白质和蛋白质修饰的绝对定量 - Google Patents

通过质谱分析用复用内标物对蛋白质和蛋白质修饰的绝对定量 Download PDF

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Abstract

本发明涉及通过质谱分析用复用内标物对蛋白质和蛋白质修饰的绝对定量，具体涉及一种通过质谱分析进行绝对蛋白质或肽定量的方法。制备含有目的蛋白质或肽的样品用于质谱分析。使所述样品经历低分辨率下的质谱分析，由此获得单累加质谱分析峰，然后使其经历高分辨率质谱分析，由此获得多个质谱分析峰。通过与内标物集合比较或通过使用针对每个同位素物集合生成的标准曲线，对所述多个质谱分析峰中的每一者的强度进行定量。使用标准曲线进行定量促进了跨越分析物的动态范围的定量。

Description

通过质谱分析用复用内标物对蛋白质和蛋白质修饰的绝对 定量
本申请是中国发明专利申请201480021080.7的分案申请。
本申请要求2013年6月7日提交的共同未决的美国申请第61/832,380号的优先权，其明确地以全文引用的方式并入本文中。
质谱(MS)与用稳定重同位素标记的内标肽结合提供了对生物和其它样品中的肽、多肽和蛋白质的快速、准确并且精确的绝对定量。
本发明MS方法提供了通过高分辨率质谱分析使用复用内标同位素物的靶肽定量。所述方法使用AQUA肽(WO 03/016861)和/或用NeuCode氨基酸合成的重蛋白质(赫伯特(Hebert)等人,用于复用蛋白质组定量的中子编码的质量签名(Neutron-encoded masssignatures for multiplexed proteome quantification),自然美国公司(NatureAmerica,Inc.)2013高级在线出版物(Advance Online Publication))。在一个具体实施方式中，所述方法用于TMT测定。在一个具体实施方式中，所述方法用于通用报告子测定(WO2012/005838；WO 2012/006406)。
发明内容
一个具体实施方式是一种使用复用重肽内标物的至少一个集合通过质谱(MS)在样品中进行绝对蛋白质或肽定量的方法，其中所述集合内的每种肽含有相同氨基酸序列，但所述集合内的所述肽相差质量亏损，所述质量亏损通过在至少一个氨基酸分子内的不同原子上并入重同位素而产生。每个集合内的所述重肽内标物在每种肽内含有相同数目的总中子，但不同在于，所述氨基酸内的重原子分布为每种肽所特有。每个集合内的所述重肽内标物在低分辨率质谱分析下分辨为单峰，并且在高分辨率质谱分析下分辨为多峰。每个集合内的所述重肽内标物在每种肽之间含有小于1道尔顿的质量差异。所述样品可以是生物样品，所述方法用于诊断测定。所述方法可以用于通用报告子测定。所述方法可以用于多样品分析。所述方法可以用于多靶分析。所述方法可以用于多样品分析和多靶分析。所述重肽通过以下方式制备：合成至少两种肽与重氨基酸的同位素物的混合物，产生具有不同质量亏损的重肽。同位素物通过以确定比例混合固相固定的AQUA肽前体而制备。所述样品通过实施所述靶蛋白质或肽的裂解而制备。靶肽峰的量可以通过使用已知量的至少两种同位素物标准肽的标准曲线而获得。所述方法可以用以验证所述靶蛋白质或肽不含同量异位素干扰。
一个具体实施方式是一种通过以下方式通过质谱进行蛋白质或肽定量的方法：(a)制备含有目的靶蛋白质或肽的样品用于质谱分析，(b)制备多种具有所述靶蛋白质或肽的至少一种子序列的重同位素标记的肽，(c)将已知浓度下的所述重同位素标记的肽与所述样品混合，(d)使含有所述制备的样品和所述重同位素标记的肽的混合物经历低分辨率下的质谱分析，由此获得单累加重肽质谱分析峰与相应单轻肽质谱分析峰，(e)使所述低分辨率峰经历高分辨率质谱分析，由此获得多个代表所述重同位素异构体肽的质谱分析峰，(f)生成轻肽强度:重肽强度比，和(g)基于所述重同位素标记的肽的强度对所述多个质谱分析峰中的每一者的强度进行定量以对所述样品中的蛋白质或肽的量进行定量。所述重肽通过以下方式制备：合成至少两种肽与重氨基酸的同位素物的混合物，产生具有质量亏损的重肽。同位素物通过以确定比例混合固相固定的AQUA肽前体而制备。所述样品通过实施所述靶蛋白质或肽的裂解而制备。靶肽峰的量可以通过使用已知量的至少两种同位素物标准肽的标准曲线而获得。步骤(f)可以使用来自MS分析的标准曲线的结果。步骤(f)可以进一步包含制备氨基酸的多种同位素物；使用所述同位素物以生成重肽标准物的集合；以固定比例混合所述多种含同位素物的肽；在低质量分辨率和高质量分辨率下分离所述混合的含同位素物的肽；使用低质量分辨率以测定轻:重肽比；和使用高质量分辨率分离结果制备标准曲线。
一个具体实施方式是一种肽同位素物合成的方法，其中将多种前体氨基酸同位素物，含有α羧酸酯基的氨基酸以确定比例与含有缀合基团的固相肽合成树脂混合，以通过所述α羧酸酯基固定化所述同位素物。在使所述前体氨基酸同位素物缀合之后，所述肽合成树脂混合物包含多种以已知比例缀合到所述树脂的固定化的氨基酸同位素物。包含以已知比例固定化的所述氨基酸同位素物的所述树脂可以进一步用于肽合成，以产生含有多种同位素物的重肽集合。
一个具体实施方式是一种肽同位素物合成的方法，包含将多种前体氨基酸同位素物与含有至少一个已经合成到具有所要序列的前体肽中的氨基酸的固相肽合成树脂混合，其中所述前体氨基酸同位素物使用标准氨基酸合成程序而变得连接到所述肽的N末端。使所述前体氨基酸同位素物缀合到所述固定化肽产生含有已知比例的同位素物混合物的重肽的集合。包含以已知比例固定化的所述氨基酸同位素物的所述树脂可以进一步用于肽合成，以产生含有多种同位素物的重肽集合。
一个具体实施方式是一种蛋白质同位素物合成的方法，包含在体外或基于细胞的蛋白质表达系统中使用多种前体氨基酸同位素物以合成具有所要序列的目的蛋白质，其中所述前体氨基酸同位素物变得并入到所述目的蛋白质中。在所述表达的蛋白质中并入所述前体氨基酸同位素物产生含有多种同位素物的重蛋白质集合。
一个具体实施方式是一种通过高分辨率质谱使用复用内标肽同位素物进行靶向肽定量的方法。
一个具体实施方式是一种通过以下方式生成质谱分析的标准曲线的方法：制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定比例混合所述多种同位素物，以低分辨率定量或高分辨率定量分离所述混合的同位素物，和使用分离结果以制备标准曲线。
一个具体实施方式是一种通过高分辨率质谱使用一种或多种肽进行靶向肽定量的方法，所述一种或多种肽通过蛋白水解消化而来源于复用内标蛋白质同位素物。
一个具体实施方式是一种通过以下方式生成质谱分析的标准曲线的方法：制备氨基酸的多种同位素物以生成重蛋白质标准物，以固定比例混合所述多种同位素物，用蛋白酶消化同位素物集合，以低分辨率定量或高分辨率定量分离所述混合的同位素物，和使用分离结果以制备标准曲线，所有肽通过蛋白水解消化而来源于所述蛋白质同位素物集合。
一个具体实施方式是一种通过以下方式生成质谱分析的标准曲线的方法：制备氨基酸的多种同位素物以生成重蛋白质标准物，以固定比例混合所述多种同位素物，用蛋白酶消化同位素物集合，和添加一种或多种已知量的独特同位素的独特内标肽，以低分辨率定量或高分辨率定量分离所述混合的同位素物，和使用分离结果以制备标准曲线，所有肽通过蛋白水解消化而来源于所述蛋白质同位素物集合，并且用于对相同序列的相应肽进行绝对定量的所述独特同位素肽通过消化天然蛋白质和重同位素物蛋白质集合而得到。
一个具体实施方式是一种通过以下方式合成单同位素物集合的方法：以确定所要比例预混合固相固定前体氨基酸。
一个具体实施方式是一种通过以下方式进行的质谱分析分析物定量方法：(a)由含有具有已知氨基酸序列的肽分析物的样品制备多种包含所述分析物序列的至少部分的重同位素物标记的标准物；(b)添加已知量的步骤(a)的产物到所述样品中；(c)使所述样品中的蛋白质裂解以产生肽；(d)对所述样品中的所述多种重同位素物标记的标准物进行定量；和(e)基于(d)的所述定量，测定所述样品中的分析物的量。所述样品中的所述多种重同位素物标记的标准物的定量通过高分辨率质谱分析行。步骤(a)的每种标准物通过并入不同元素的重原子但具有相同总数目的中子而不同于其它标准物。将不同重原子并入到所述标准物中在所述标准物之间产生质量亏损。所述多种重同位素物标记的标准物的峰值强度在高分辨率MS下含有多个可分辨峰，所述多个可分辨峰中的每一者代表所述多种重同位素标记的标准物的不同地标记的标准物。所述方法使用所述多个可分辨峰作为一系列已知浓度的所述多种重同位素物标记的标准物而生成标准曲线。
一个具体实施方式是多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的肽标准物，所述肽标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同标称质量和化学式但具有13C-、15N-、18O-、34S-或2H-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物。所述重同位素标记的肽标准物用于质谱分析中。
一个具体实施方式是多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的蛋白质标准物，所述蛋白质标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同标称质量和化学式但具有13C-、15N-、18O-、34S-或2H-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物。所述重同位素标记的蛋白质标准物用于质谱分析中以对给定靶蛋白质的每种肽进行定量。
一个具体实施方式是一种对样品中的蛋白质、多肽或肽进行定量的试剂盒。所述试剂盒包含多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的蛋白质和/或肽标准物，所述蛋白质和/或肽标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同标称质量和化学式但具有13C-、15N-、18O-、34S-或2H-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物；和使用所述试剂盒通过质谱对所述样品中的所述蛋白质、多肽或肽进行定量的说明书。所述试剂盒可以具有在复用测定中使用所述标准物的说明书。所述试剂盒可以具有在诊断测定中使用所述标准物的说明书。
一个具体实施方式是一种使用复用重肽内标物通过质谱在样品中进行绝对蛋白质或肽定量的方法，所述重肽内标物使用受保护的氨基酸同位素物作为重同位素物前体用于肽合成而制备。所述受保护的氨基酸同位素物可以包含芴基甲氧羰基(FMOC)保护的重同位素物前体用于肽合成。所述方法可以进一步包括以所要比例混合重同位素物肽的集合以用作复用内标物。将所述FMOC保护的氨基酸前体以确定比例混合，并且随后在单一反应中合成肽同位素物混合物。芴基甲氧羰基(FMOC)保护的同位素物的混合物可以按确定比例用于肽合成中。
一个具体实施方式是一种使用复用重蛋白质内标物通过质谱在样品中进行绝对蛋白质或肽定量的方法，所述重蛋白质内标物使用氨基酸同位素物作为重同位素物前体用于蛋白质合成而制备。所述方法可以进一步包括以所要比例混合重同位素物蛋白质的集合以用作复用内标物。将所述氨基酸前体以确定比例混合，并且随后在单一反应中合成蛋白质同位素物混合物。氨基酸同位素物的混合物可以按确定比例用于蛋白质合成中。
一个具体实施方式是一种使用标准曲线使用质谱分析对样品中的靶蛋白质或肽进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的。所述方法首先以低分辨率并且随后以高分辨率分辨复用内标蛋白质和/或肽同位素物。其可以用于通用报告子测定。所述蛋白质或肽可以用于在全动态范围内诊断患者的医疗或生理状况。
一个具体实施方式是一种使用质谱分析和用标准曲线对样品中的靶蛋白质或肽进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的，所述标准曲线由肽混合物生成，所述肽混合物用重氨基酸的不同同位素物合成，在所述蛋白质或肽中产生至少1mDa的质量亏损。所述方法可以进一步包含获得单低分辨率MS峰，然后获得多个高分辨率峰，和对每种同位素物的强度进行定量以使用所述标准曲线对所述样品中的所述靶蛋白质或肽进行定量。
一个具体实施方式是一种使用质谱分析和用标准曲线对样品中的靶蛋白质或肽进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的，所述标准曲线由蛋白质混合物生成，所述蛋白质混合物用重氨基酸的不同同位素物合成，产生至少1mDa的质量亏损，由蛋白水解消化产生所述蛋白质集合的肽。所述方法可以进一步包含获得单低分辨率MS峰，然后获得多个高分辨率峰，和对每种同位素物的强度进行定量以使用所述标准曲线对所述样品中的所述靶蛋白质或肽进行定量。
一个具体实施方式是一种通过质谱分析相对于AQUA蛋白质或肽定量的增强准确度和/或灵敏度的方法，其使用多于一种肽同位素物，以生成含有用于每个测定的每种标准物的多个浓度的内标曲线。所述方法可以进一步包含制备重靶肽的至少三个同位素物集合，通过MS将重靶肽与轻靶肽分离，在低分辨率下比较所述重靶肽与轻靶肽的峰以测定所述靶肽的浓度，和在高分辨率下分辨同位素物和基于所述内标曲线分析代表不同同位素物浓度的每个峰。
一个具体实施方式是一种通过质谱分析相对于AQUA蛋白质或肽定量的增强准确度和/或灵敏度的方法，其使用多于一种蛋白质同位素物，以生成含有每种标准物的多个浓度的内标曲线，所述每种标准物针对天然蛋白质分析物的每种相应肽。所述方法可以进一步包含制备重靶蛋白质的至少两个同位素物集合，通过MS将重靶肽与轻靶肽分离，在低分辨率下比较所述重靶肽与轻靶肽的峰以测定所述靶肽的浓度，和在高分辨率下分辨同位素物和基于所述内标曲线分析代表不同同位素物浓度的每个峰。
一个具体实施方式是一种基于质量亏损而生成质谱分析的标准曲线的方法。所述方法包含制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果以制备标准曲线。分离可以通过LC-MS进行，并且所述标准曲线可以用完整离子制备。分离可以通过LC-MSn进行，并且所述标准曲线可以用碎片离子制备。所述方法可以用以验证所述靶蛋白质或肽不含同量异位素干扰。
一个具体实施方式是一种基于质量亏损而生成质谱分析的标准曲线的方法。所述方法包含制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果验证MS校准。
一个具体实施方式是一种基于质量亏损而生成质谱分析的标准曲线的方法。所述方法包含制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果验证目标分析物的质量偏移。
一个具体实施方式是一种质谱分析定量方法，包含(a)制备多种蛋白质同位素物，(b)制备重肽内标物，(c)将(a)和(b)加标(spiking)到目标样品中，(d)消化所述目标样品(c)，(e)对由天然靶蛋白质分析物(c)和重蛋白质同位素物(a)消化得到的每种相应轻:重肽进行定量，(f)通过MS分析分离所述肽，和(g)用所述重肽内标物(b)对所述轻和重肽同位素物进行定量，以使用所述内标物和来自目标和内标蛋白质集合的所有相应轻:重同位素物肽对来对所述目标分析物肽进行定量。
一个具体实施方式是一种质谱分析定量方法，包含(a)制备多种质量标签同位素物，(b)制备用所述质量标签同位素物标记的肽内标物，(c)将(a)和(b)加标到目标样品中，(d)消化所述目标样品(c)，(e)用所述标签的轻版本标记所述目标样品和所得通用报告子肽，(f)通过MS分析分离所述肽，和(g)使用所述内标物对目标分析物进行定量。
附图说明
图1展示使用内标物对蛋白质目标的质谱分析(MS)定量。
图2展示两种同位素异构体(isotopomer，具有不同重同位素原子的化学异构体，以便所述异构体具有相同单位质量但同位素元素不同)的低分辨率MS和高分辨率MS。
图3展示不同浓度的三种不同同位素异构体在高MS分辨率下的标准曲线的生成。
图4示意性地说明使用溶液中的或固定化在固体支持物上的前体氨基酸同位素物(isotopologue)的确定混合物而合成内标物。
图5展示赖氨酸+8Da同位素物与两种市售同位素物(填充黑色，来自赫伯特等人2013)的可能重同位素组合和质量。
图6展示赖氨酸+8Da同位素物与七种6毫道尔顿(mDa)间隔的代表性同位素物(加框)的39种可能化学式和质量。
图7a-b展示精氨酸+6Da同位素物与七种6mDa间隔的代表性同位素物(加框，图7a)的37种可能化学式和质量，和精氨酸+10Da同位素物与七种6mDa间隔的代表性同位素物(加框，图7b)的86种可能化学式和质量。
图8展示九种代表性芴基甲氧羰基(FMOC)保护的氨基酸的化学结构，所述氨基酸可以通过在加框区域中同位素标记而用作重同位素物前体用于肽合成。
图9展示三嗪和嘌呤核心分子和相应胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺衍生物的化学结构。
图10a-b展示三嗪核心(图10a)的13种可能同位素物和嘌呤核心(图10b)与六种6mDa间隔的代表性同位素物(加框)的15种可能同位素物。
图11示意性地展示用于质谱定量的肽。
图12示意性地展示待定量的肽键联到报告子肽并且关联到通用肽U的配置，所述肽各自用一种或多种重氨基酸或重氨基酸同位素物标记。
图13示意性地展示多于一种肽的定量的具体实施方式，每种肽键联到单独报告子肽R，其中每种肽和报告子肽用重氨基酸或重氨基酸同位素物标记。
图14示意性地展示三个串接重肽同位素物集合键联到单报告子肽R的具体实施方式。
图15示意性地展示使用单一测定(复用)同时测定样品中的多于一种分析物的具体实施方式，其中三个蛋白质型肽同位素物集合各自可裂解地键联到其自身的报告子肽R并且关联到单通用报告子肽Uplex同位素物集合。
图16示意性地展示组分中间的配置和关系。
图17示意性地展示肽组分中间的配置和关系。
图18示意性地展示SEQ ID NO.22-25的命名规则。
图19示意性地展示靶向定量的天然分析物、键联到报告子肽并且关联到通用肽U的对应于靶向分析物的内标(IS)肽的配置。将串接IS:报告子肽和通用肽各自用化学MS标签的重同位素物集合标记，并且将加标有内标物的消化的样品用相同化学MS标签的轻或特有同位素物版本标记。
图20展示LVALVR(SEQ ID NO.22)+10Da同位素物(图7b中加框)的模拟光谱，与同位素物峰的放大展开图(插图)。
图21a-c示意性地展示使用重氨基酸同位素物与体外蛋白质翻译试剂盒(图21a)或与表达目的蛋白质并且生长于补充有重氨基酸同位素物的标准培养基中的培养细胞(图21b)的混合物合成重蛋白质、接着提纯用作内标物的重蛋白质同位素物用于相对定量(图21c)的方法。
图22展示使用消化的重同位素物标记的蛋白质内标物对混合物中的天然蛋白质目标的所有相应肽进行相对定量的配置。至少一种肽的独特重AQUA版本可以用于对重同位素物标准物和靶蛋白质进行绝对定量。
图23展示使用重蛋白质同位素物集合(1:4比例的13C6 15N2赖氨酸:2H8-赖氨酸用于体外Akt1合成，#)对细胞裂解物中来自Akt1的天然肽SLLSGLLK(SEQ ID NO.64)定量的LC-MS结果，其中有100fmol的双重AQUA肽13C6 15N-亮氨酸，13C6 15N2-赖氨酸，SLL*SGLLK*(SEQ IDNO.64)加标到混合物中用于绝对定量。
本发明的具体实施方式如下。
一种通过以下方式通过质谱(MS)对样品中的靶蛋白质或肽进行绝对定量的方法：使用复用重肽内标物的至少一个集合制备内标同位素物，其中所述至少一个集合内的每种肽含有相同氨基酸序列，但所述集合内的所述肽相差质量亏损而产生内标同位素物，所述质量亏损通过在至少一个氨基酸分子内的不同原子上并入重同位素而产生；和使用所述复用内标同位素物对至少一种靶蛋白质或肽进行定量。在一个具体实施方式中，每个集合内的所述重肽内标物在每种肽内含有相同数目的总中子，但不同在于，所述氨基酸内的重原子分布为每种肽所特有。在一个具体实施方式中，每个集合内的所述重肽内标物在低分辨率质谱分析下分辨为单峰，并且在高分辨率质谱分析下分辨为多峰。在一个具体实施方式中，每个集合内的所述重肽内标物在每种肽之间含有小于1道尔顿的质量差异。在一个具体实施方式中，所述样品是生物样品并且所述方法用于诊断测定。在一个具体实施方式中，所述方法用于通用报告子测定中。在一个具体实施方式中，所述方法用于多样品分析。在一个具体实施方式中，所述方法用于多靶分析。在一个具体实施方式中，所述方法用于多样品分析和多靶分析。在一个具体实施方式中，所述重肽通过以下方式制备：合成至少两种肽与重氨基酸的同位素物的混合物，产生具有质量亏损的重肽。在这个实施例中，所述同位素物通过以确定比例混合固相固定的AQUA肽前体而制备。在这个实施例中，所述样品通过实施所述靶蛋白质或肽的裂解而制备。在一个具体实施方式中，所述方法用以验证所述靶蛋白质或肽不含同量异位素干扰。
一种通过以下方式通过质谱进行蛋白质或肽定量的方法：(a)制备含有目的靶蛋白质或肽的样品用于质谱分析，(b)制备多种具有所述靶蛋白质或肽的至少一种子序列的重同位素标记的肽，(c)将已知浓度下的所述重同位素标记的肽与所述样品混合，(d)使含有所述制备的样品和所述重同位素标记的肽的混合物经历低分辨率下的质谱分析，由此获得单累加重肽质谱分析峰与相应单轻肽质谱分析峰，(e)使所述低分辨率峰经历高分辨率质谱分析，由此获得多个代表所述重同位素异构体肽的质谱分析峰，(f)生成轻肽强度:重肽强度比，和(g)基于所述重同位素标记的肽的强度对所述多个质谱分析峰中的每一者的强度进行定量，以对所述样品中的蛋白质或肽的量进行定量。在一个具体实施方式中，所述重肽通过以下方式制备：合成至少两种肽与重氨基酸的同位素物的混合物，产生具有质量亏损的重肽。在这个具体实施方式中，所述同位素物通过以确定比例混合固相固定化的AQUA肽前体而制备。在这个具体实施方式中，所述样品通过实施所述靶蛋白质或肽的裂解而制备。在一个具体实施方式中，步骤(f)使用来自MS分析的标准曲线的结果。在这个具体实施方式中，所述方法进一步包含制备氨基酸的多种同位素物；使用所述同位素物以生成重肽标准物的集合；以固定比例混合所述多种含同位素物的肽；在低质量分辨率和高质量分辨率下分离所述混合的含同位素物的肽；使用低质量分辨率以测定轻:重肽比；和使用高质量分辨率分离结果以制备标准曲线。在一个具体实施方式中，靶肽峰的量通过使用已知量的至少两种同位素物标准肽的标准曲线而获得。
一种肽同位素物合成的方法，其中将多种前体氨基酸同位素物，含有α羧酸酯基的氨基酸以确定比例与含有缀合基团的固相肽合成树脂进行混合，以通过所述α羧酸酯基固定化所述同位素物。在一个具体实施方式中，在使所述前体氨基酸同位素物缀合之后，所述肽合成树脂混合物包含多种以已知比例缀合到所述树脂的固定氨基酸同位素物。在这个具体实施方式中，包含以已知比例固定的所述氨基酸同位素物的所述树脂进一步用于肽合成，以产生含有多种同位素物的重肽集合。
一种肽同位素物合成的方法，通过将多种前体氨基酸同位素物与含有至少一个已经合成到具有所要序列的前体肽的氨基酸的固相肽合成树脂混合，其中所述前体氨基酸同位素物使用标准氨基酸合成程序而变得连接到所述肽的N末端。在一个具体实施方式中，使所述前体氨基酸同位素物缀合到所述固定化的肽产生含有已知比例的同位素物混合物的重肽的集合。在一个具体实施方式中，包含以已知比例固定化的所述氨基酸同位素物的所述树脂进一步用于肽合成，以产生含有多种同位素物的重肽集合。
一种通过高分辨率质谱使用复用内标肽同位素物进行靶向肽定量的方法。
一种生成质谱分析(MS)分析的标准曲线的方法，通过制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定比例混合所述多种同位素物，以低分辨率定量或高分辨率定量分离所述混合的同位素物，和使用分离结果以制备标准曲线。
一种通过以下方式合成单同位素物集合的方法：以确定所要比例预混合固相固定化的前体氨基酸。
一种MS分析物定量方法，包含(a)由含有具有已知氨基酸序列的肽分析物的样品制备多种包含所述分析物序列的至少部分的重同位素物标记的标准物；(b)添加已知量的步骤(a)的产物到所述样品中；(c)使所述样品中的蛋白质裂解以产生肽；(d)对所述样品中的所述多种重同位素物标记的标准物进行定量；和(e)基于(d)的所述定量，测定所述样品中的分析物的量。在一个具体实施方式中，所述样品中的所述多种重同位素物标记的标准物的定量通过高分辨率质谱分析进行。在一个具体实施方式中，步骤(a)的每种标准物通过并入不同元素的重原子但具有相同总数目的中子而不同于其它标准物。在这个实施例中，将不同重原子并入到所述标准物中在所述标准物之间产生质量亏损。在一个具体实施方式中，所述多种重同位素物标记的标准物的峰值强度在高分辨率MS下含有多个可分辨峰，所述多个可分辨峰中的每一者代表所述多种重同位素标记的标准物的不同地标记的标准物。在这个具体实施方式中，使用所述多个可分辨峰作为一系列已知浓度的所述多种重同位素物标记的标准物生成标准曲线。
多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的肽标准物，所述肽标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物，并且各自具有相同标称质量和化学式但具有13C-、15N-、18O-、34S-或2H-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物。所述多种重同位素标记的肽标准物用于质谱分析中。
一种对样品中的蛋白质、多肽或肽进行定量的试剂盒，所述试剂盒包含多种具有相同氨基酸序列的重同位素标记的肽标准物，所述肽标准物各自包含重氨基酸的不同同位素物并且各自具有相同标称质量和化学式但具有13C-、15N-、18O-、34S-或2H-的不同置换，以产生具有毫道尔顿质量亏损的肽标准物；和使用所述试剂盒通过质谱对所述样品中的所述蛋白质、多肽或肽进行定量的说明书。在一个具体实施方式中，所述说明书用于在复用测定中使用所述标准物。在一个具体实施方式中，所述说明书用于在诊断测定中使用所述标准物。
一种使用复用重肽内标物通过质谱(MS)在样品中进行绝对蛋白质或肽定量的方法，所述重肽内标物使用受保护的氨基酸同位素物作为重同位素物前体用于肽合成而制备。在一个具体实施方式中，所述受保护的氨基酸同位素物包含芴基甲氧羰基(FMOC)保护的重同位素物前体用于肽合成。在一个具体实施方式中，所述方法进一步包含以所要比例混合重同位素物肽的集合以用作复用内标物。在一个具体实施方式中，所述方法进一步包含以确定比例混合多种所述FMOC保护的氨基酸前体，并且随后在单一反应中合成肽同位素物混合物。在一个具体实施方式中，确定比例的芴基甲氧羰基(FMOC)保护的同位素物的混合物用于肽合成中。
一种使用质谱(MS)分析使用标准曲线对样品中的靶蛋白质或肽进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的，所述方法通过首先用低分辨率并且随后用高分辨率来分辨复用内标肽同位素物而进行。在一个具体实施方式中，所述方法用于通用报告子测定。在一个具体实施方式中，所述蛋白质或肽用于在全动态范围内诊断患者的医疗或生理状况。
一种使用质谱分析(MS)分析和用标准曲线对样品中的靶蛋白质或肽进行绝对定量的方法，所述标准曲线在所述MS分析中对所述靶蛋白质或肽是特定的，所述标准曲线由肽混合物生成，所述肽混合物用重氨基酸的不同同位素物合成，在所述蛋白质或肽中产生至少1mDa的质量亏损。在一个具体实施方式中，所述方法进一步包含获得单低分辨率MS峰，然后获得多个高分辨率峰，和对每种同位素物的强度进行定量以使用所述标准曲线对所述样品中的所述靶蛋白质或肽进行定量。
一种通过质谱分析(MS)分析相对于AQUA蛋白质或肽定量的增强准确度和/或灵敏度中的至少一者的方法，通过使用多于一种肽同位素物，以生成含有用于每个测定的每种标准物的多个浓度的内标曲线。在一个具体实施方式中，所述方法进一步包含制备重靶肽的至少三个同位素物集合，通过MS将重靶肽与轻靶肽分离，在低分辨率下比较所述重靶肽与轻靶肽的峰以测定所述靶肽的浓度，在高分辨率下分辨同位素物和基于所述内标曲线分析代表不同同位素物浓度的每个峰。
一种通过以下方式基于质量亏损而生成质谱分析(MS)分析的标准曲线的方法：制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果以制备标准曲线。在一个具体实施方式中，分离通过LC-MS进行，并且所述标准曲线用完整离子制备。在一个具体实施方式中，分离通过LC-MSn进行，并且所述标准曲线用碎片离子制备。在一个具体实施方式中，所述方法用以验证所述靶蛋白质或肽不含同量异位素(isobaric)干扰。
一种通过以下方式基于质量亏损而生成质谱分析(MS)分析的标准曲线的方法：制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果验证MS校准。
一种通过以下方式基于质量亏损而生成质谱分析(MS)分析的标准曲线的方法：制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物，以固定的所要比例混合所述多种同位素物，用低分辨率MS或用高分辨率MS分离所述混合的同位素物，然后使用分离结果验证目标分析物的质量偏移。
一种MS定量方法，包含(a)制备多种质量标签同位素物，(b)制备用所述质量标签同位素物标记的肽内标物，(c)将(a)和(b)加标到目标样品中，(d)消化所述目标样品(c)，(e)用所述标签的轻版本标记所述靶样品和所得通用报告子肽，(f)通过MS分析分离所述肽，和(g)使用所述内标物对目标分析物进行定量。
一种质谱分析(MS)定量系统，包含制备用于MS定量的样品，多种质量标签同位素物，离子源，具有同位素物分离的质量分析仪，和具有同位素物肽内标物分辨率的检测器。
所述方法扩展了已知的AQUA方法的能力，并且通过生成标准曲线而产生增强的定量准确度，这提供了低质量分辨率和高质量分辨率(通常>100,000)能力。所述方法扩展了已知的AQUA方法的能力，并且通过以下方式产生增强的定量准确度：生成针对靶蛋白质中的所有肽的标准曲线，并且使得能够鉴别和定量靶蛋白质的与总蛋白质水平区别地调节(如通过翻译后调节或修饰)的一种或多种肽。本发明方法有利地使用质量亏损(公开于明确地以全文引用的方式并入本文中的赫伯特等人，用于复用蛋白质组定量的中子编码的质量签名(Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteomequantification)，自然美国公司2013高级在线出版物中)在低分辨率下获得单质谱分析峰，然后随后在高分辨率下分辨其它峰，以对当以重同位素标记的氨基酸的不同同位素物作为标准物合成两种或更多种肽的混合物时所得的每种同位素物的强度进行定量。所得重同位素标记的肽(称为重肽)具有相同标称质量和化学式，但具有13C-、15N、18O、34S或2H的不同置换，产生具有毫道尔顿质量亏损的肽。
单同位素物肽集合通过以下方式获得：以确定的所要比例预混合氨基酸同位素异构体前体或固相固定化的AQUA肽氨基酸同位素异构体前体，如随后所解释。可以生成低或高分辨率定量的全响应曲线。
单同位素物蛋白质集合通过以下方式获得：以确定的所要比例预混合氨基酸同位素异构体前体，如随后所解释。可以对于低或高分辨率定量生成靶蛋白质的每种肽的全响应曲线。
所述方法扩展了已知的AQUA方法的能力，并且通过以下方式产生增强的定量准确度：生成标准曲线，针对靶蛋白质的一种或多种肽进行高分辨率测量。
本发明方法因此产生增强的准确度，这特别为诊断质谱测定所需。本发明还公开蛋白质和肽同位素物合成的方法，与报告子肽串接并且用通用报告子标准肽定量的蛋白质型肽同位素物集合的用途，重同位素物蛋白质标准物集合的用途，和通过高分辨率质谱使用复用内标肽同位素物进行靶向肽定量的方法。
绝对蛋白质定量使用一种或多种含有重稳定同位素的加标的内标肽，标准肽的氨基酸序列对应于待测定的靶蛋白质的子序列。此靶蛋白质的绝对定量取决于加标的内标物的准确度和响应线性。
已知的AQUA方法提供了在MS分析期间使用单标记肽作为内标物对蛋白质的定量分析，以对样品中的目标的量(即，相应靶未标记肽或蛋白质的量)进行定量。这展示于图1中。
AQUA依赖于一种肽标准物的加标，因此靶肽或蛋白的定量取决于那一种加标的肽的准确度。定量假定响应因子1，并且假定分析物在线性范围内。对于任何特定测定和/或特定分析物来说假设可能都不准确。每个测量缺乏内标曲线导致在测定间和实验室间水平下都具有高变异系数(CV)和受限动态范围。
本发明方法因此通过使用每种标准物的多个浓度以形成内标曲线(此后称为AQUAplex)，扩展了AQUA的能力，以提供更大定量准确度。AQUAplex使用同位素标记的肽家族，其中所述家族的每个成员通过并入同位素物(即，不同元素的重原子，但具有相同总数目的中子)而不同于其它成员。AQUAplex重峰代表通过低质量分辨率和高质量分辨率分离和定量的同位素标记的肽的家族。在低分辨率MS中获得可更容易检测的单复合峰；因此，AQUAplex允许在MS1水平下定量。在高分辨率MS中获得和定量多个AQUAplex同位素物组分峰。使用多种重同位素物通过使用多个测量值(例如首先以低分辨率获得、然后以高分辨率MS用重内标同位素物集合定量的轻:重肽强度比)而增加测定准确度。如图1中所示，在低分辨率MS1分析中，含有多种同位素物的重峰视为单峰，并且峰高度和面积是构成混合物的同位素物的和。不同同位素物浓度的和在质谱中呈现为比个别同位素物更强的信号，并且可能比分析的靶轻肽的信号更强。以此方式，在低分辨率MS分析下，重峰充当存在靶肽峰的标记物或“标杆”，所述靶肽峰在光谱中在较低m/z位置出现。因为精确已知重峰的质量增加是什么，所以可以在LC-MS或LC-MS/MSn期间准确鉴别靶峰位置和洗脱时间，即使靶峰具有低强度并且可能会在某种程度上在MS光谱的噪声或背景中损耗。因此，所述方法有助于对较低浓度的肽进行分析和更准确定量，所述较低浓度的肽通过质谱仪可能无法立即检测到或可能根本无法检测到。对重与轻肽峰的低分辨率比较可以提供对分析的靶肽的浓度的初始测定。接着，在对重峰的高分辨率分析下，分辨同位素物，并且可以分析代表构成内标曲线的同位素物的不同浓度的每个峰(图2)。这些同位素物的相对浓度可以用以产生内标曲线，以准确测定靶轻肽峰的浓度(图3)。分辨同位素物所需的高分辨率还从干扰物质分辨靶分析物，这改良了目标信噪比、灵敏度和定量准确度。同位素物峰型和绝对质量可以用以验证，恰当的重肽内标物用作内标物，并且这些同位素物的确切质量可以用作质量校准物以能够实现轻靶肽的补偿的绝对测量。因此，本发明方法允许对靶肽进行准确鉴别和绝对定量，即，其提供了比可能使用先前AQUA肽技术更大的准确度和更高的灵敏度。
如图2中所示，AQUAplex重峰代表肽的家族，单峰在低分辨率MS分析下产生，并且多峰在高分辨率分析下产生(图2中所示的两个峰)。通过并入到氨基酸中的重同位素的数目(图2中展示为x道尔顿)分离AQUA轻和重肽峰。重峰用作对照以测定轻肽的浓度。在此实例中，在低分辨率下，可以用较高质量内标峰测定靶肽的绝对浓度的测量，并且相等浓度的两种同位素异构体能够在高分辨率下针对重复测量分辨。这些低和高分辨率测量可以在MS1下进行以对母质量(parent masses)进行定量，或在MSn下进行以在低或高分辨率下对碎片离子验证和进行定量。
在能够进行多离子分离和高分辨率扫描的质谱仪(如Q Exactive混合质谱仪(赛默科技(Thermo Scientific)))上，可以通过分离和储存离子的多个轻:重集合或质量范围、随后进行高分辨率扫描对肽进行复用测定。因此，可以在改良的占空比性能下更高效地进行低和高分辨率下的复用定量(密切尔斯基(Michalski)等人(2011).使用Q Exactive(一种高性能台式四极轨道阱质谱仪)的基于质谱分析的蛋白质组研究(MassSpectrometry-based Proteomics Using Q Exactive,a High-performance BenchtopQuadrupole Orbitrap Mass Spectrometer),《分子细胞蛋白质组研究》(Mol CellProteomics)2011年9月；10(9):M111.011015)。
制备样品以如本领域中已知地用于MS分析，例如使样品肽经历蛋白水解裂解。然后通过质谱在低质量分辨率下分析样品和标准物，由此由标准物获得单累加质谱分析峰，然后在高质量分辨率(>100,000)下分析，其中获得多个质谱分析峰。使用内标物获得每个峰的量，即，通过与已知量的同位素物标准肽的峰值强度比较，或参考外标物使用已知量的至少两种同位素物标准肽以生成标准曲线(图3)。使用标准曲线促进了跨越动态范围的分析物的定量。
所述方法的一个具体实施方式是生成用于MS分析的标准曲线。所述方法包含以下步骤：制备氨基酸的多种同位素物以生成重肽标准物；以固定比例混合所述多种同位素物；然后使用LC-MS或LC-MSn以低质量分辨率或高质量分辨率分离所述混合的同位素物；然后使用分离结果分别用完整或碎片离子制备标准曲线。
一个具体实施方式是一种通过MS用复用内标物进行绝对蛋白质或肽定量的方法。用作测定含有靶肽或蛋白的样品的标准物的重AQUAplex肽通过以下方式制备：合成至少两种肽与重氨基酸的同位素物的混合物，产生具有质量亏损的重肽，如随后所解释。重肽具有靶或分析物的至少一种子序列。然后以所要比例混合重同位素物肽的集合以用作复用内标物。备选地，同位素物的集合通过以下方式制备：以确定比例混合溶液中的芴基甲氧羰基(FMOC)保护的氨基酸前体或固相固定化的AQUA肽前体，并且然后在单一反应中合成肽同位素物混合物(图4)。
对于AQUAplex测定，家族的每个成员通过并入不同元素的重原子但具有相同总数目的中子而不同于其它成员。举例来说，赖氨酸+8Da的39种独特同位素物跨越36mDa的质量范围。理论上，这些同位素物中的每一者可以通过足够高分辨率质谱而分辨(图5)。实心条柱代表市售的两种不同同位素物(剑桥同位素实验室(Cambridge IsotopeLaboratories))。赖氨酸异构体中的一者在其结构中含有六个13C原子和两个15N原子，而另一者含有八个2H原子。两种氨基酸标称具有相同分子量(约154.1Da)，但其归因于与碳原子和氢原子相关的中子之间质量亏损差异而在其准确质量方面相差36mDa。在高分辨率质谱分析下，由这两种赖氨酸同位素物制成的肽可以分辨成两个独特峰，质量上的相差在于相关质量亏损。其它肽可以经设计以在其结构内的不同位点含有重原子。在一个具体实施方式中，一种肽可以含有一个或多个13C-赖氨酸氨基酸，而另一种肽可以含有相等数目的15N-、18O-、34S或2H-赖氨酸氨基酸。在家族的成员之间并入不同重原子导致肽之间出现质量亏损，其使确切质量以mDa略微变化。在足够高MS分辨率下，可以分辨质量更接近的更多同位素物。在一个具体实施方式中，以至少6mDa分隔的FMOC保护的赖氨酸+8Da的七种同位素物可以用以合成并且以内标同位素物的确定比例混合(图6)。此扩展的混合物可以在高分辨率MS下用以产生跨越大于一个数量级的动态范围的标准曲线，以用于对浓度广泛变化的靶肽进行更准确定量。类似地，以超过6mDa分隔的精氨酸+6Da的八种同位素物和以6mDa超过的精氨酸+10Da的分隔八种同位素物可以用以使用FMOC保护的精氨酸+6Da和FMOC保护的精氨酸+10Da合成和产生重内标同位素物的确定混合物(图7a-b)。较高分辨率MS或MSn可以用以进一步增加可以组合以产生重内标肽混合物的标准曲线的可分辨同位素异构体的数目，并且改良定量准确度和定量的动态范围。在一个具体实施方式中，同位素物来自FMOC保护的丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和缬氨酸的集合中的一者或多者(图8)。
在一个具体实施方式中，独特赖氨酸+8Da同位素物可以用以合成重肽标准物。将这些个别肽以确定比例混合，产生单同位素物集合。在一个具体实施方式中，复用AQUAplex肽集合可以在一个反应中使用以指定比例预混合的前体FMOC保护的氨基酸前体或固相树脂进行合成(图4、8)。在一个具体实施方式中，可以按确定比例混合两种或更多种肽同位素物以产生复用内标重肽同位素物混合物。作为一个实例，图3中展示针对如下肽的低分辨率分离，所述肽在一个反应中以四个13C6 15N2、三个13C4 15N2 2H2、二个13C6 2H2和一个2H8的确定比例用AQUAplex赖氨酸(K)同位素物合成。使用受保护的氨基酸前体，例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸、酪氨酸合成肽和修饰的肽作为同位素物(图10a-b)。在一个具体实施方式中，合成通过以下方式实现：以确定或固定比例预混合或组合重肽标准物，使得能够重复标准校准曲线的测量或生成。在低质量分辨率下，重同位素物无法分辨，但实际上被求和或累加。这产生具有较高强度的复合峰，有或无可检测的加权平均质量亏损，并且同位素物峰中的每一者的强度变得在低分辨率单峰内求和，以在质谱中提供较大信号。较高强度峰比靶肽或个别重肽同位素物更容易通过质谱进行检测，允许触发的离子分离和MS富集。本发明因此扩展了质谱分析对较低浓度的灵敏度，因为组合的同位素物峰用作存在轻靶肽峰的标记物或“标杆”，所述轻靶肽峰在无此标记物的情况下归因于低峰强度而可能不被质谱仪注意到。
重肽可以个别地合成，或其可以通过以预定比例组合同位素物氨基酸前体或已经用同位素物前体预活化的固相支持物以混合物形式合成。举例来说，为了制备四同位素物混合物，首先使用本领域中已知的标准方法将由图6的条柱表示的四种赖氨酸衍生物连接到固相肽合成支持物。为了制备含有不同但已知量的这些同位素物赖氨酸残基的四种其它方面相同的肽，然后以所要比例(例如4:3:2:1)混合四种前体支持物(图4)。然后如典型氨基酸合成程序中所进行，通过一次添加一种氨基酸使用同位素物前体的此混合物合成肽。在肽合成完全并且肽从支持物裂解并且被提纯后，所得混合物将含有相同肽的四种同位素物，其中同位素物中的一者是其它同位素物的1/2、1/3或1/4浓度。在另一个位置含有重同位素物的肽同位素物集合可以通过并入受保护的氨基酸同位素物的确定混合物而合成。同位素物的其它混合物可以使用类似方法制备，包括将含有已知浓度的超过两种同位素物以产生多点标准曲线的方法。使用此单一反应或“一锅”合成提供了若干优势：其减少了合成复用同位素物集合所需的反应的数目，其允许活化支持物的相同预定混合物用作多个肽反应的前体，其确保了定量复用肽同位素物集合的增强的合成再现性，并且其允许同位素物混合物的绝对量在一个氨基酸分析中被定量。结果是合成简化并且再现性改良，蛋白质或肽标准物的制造成本降低。
内标物的同位素物集合可以按用于商业用途的形式进行制备，例如与使用说明书一起封装为试剂盒。这种试剂盒可以包括高分辨率质谱的说明书，其可以或可以不具有分离和富集质量区域(例如通过离子阱或四极/六极/八极质量过滤器)的能力和/或用碰撞或化学碎片化方法使经分离的离子碎片化的能力。使用这种试剂盒的方法包括在进行或不进行质量范围分离和/或多级碎片化的情况下的高分辨率质谱。
在肽家族成员之间并入不同重原子导致肽之间出现质量亏损，其使真实质量以mDa略微变化。AQUAplex MS分离的重肽峰在高分辨率MS下含有多个可分辨峰。这些多个可分辨峰代表单肽家族内的同位素异构体肽的多个浓度。因为同位素异构体肽的多个浓度可以含于重AQUAplex峰内，所以标准曲线含于重峰内作为质量亏损标记的肽的一系列已知浓度。
如下生成AQUAplex标准定量曲线。同位素肽的多个浓度(作为质量亏损标记的肽的一系列已知浓度)含于重AQUAplex峰内。标准曲线中的点的数目由用于测定的质谱仪的分辨能力决定。在具体实施方式中，可以分辨两到六个峰。在一个具体实施方式中，使用不同浓度的两种或更多种不同同位素异构体获得用于定量的AQUAplex内标曲线(图3)。可以容易针对测量的每种靶肽生成内标曲线。低质量分辨率峰的高强度充当用于触发的获取策略的分析物的标杆。使用标准曲线改良并验证了使用质谱分析的诊断测定。
在一个类似的具体实施方式中，氨基酸同位素物集合可以用于合成重蛋白质同位素物集合。这些重蛋白质同位素物可以用固定比例的氨基酸前体制作，以便在消化之后，重蛋白质的每种肽的同位素物集合以相同浓度存在。通过对天然蛋白质集合和重蛋白质集合的蛋白水解得到的肽可以用以对靶蛋白质的所有肽进行定量。此重蛋白质集合可以或可以不定量作为绝对内标物。可以包括具有独特质量的AQUA肽以用于对天然蛋白质标准物集合和重蛋白质标准物集合进行绝对定量。在此具体实施方式中，将每种肽的消化效率标准化，并且可以从靶分析物鉴别不依赖于蛋白质水平而被调节(如通过翻译后修饰)的独特肽。靶分析物的天然肽对比经修饰肽的化学计量可以具有比总靶蛋白质浓度更大的诊断效用。
在AQUAplex测定中维持测定间精密度的需求很重要，改良和验证质谱的诊断应用也很需要。本发明方法与使用蛋白质消化和LC-MS用于肽检测的现有定量蛋白质工作流系统相容。其将AQUAplex方法与NeuCode氨基酸或质量标签组合，并且可以例如在通用报告子测定中用以产生多样品和多靶分析具备绝对蛋白质或肽定量。本发明方法提供了重肽内标物的多个复本，而不增加样品的复杂性。本发明方法允许用高分辨率质谱在MS1或MSn水平下进行绝对定量，能够用多级MS验证和定量序列碎片离子。本发明方法允许使用重肽内标同位素物的低分辨率求和峰的质量进行触发的离子分离和MS富集。本发明方法允许在高分辨率下获取重肽复本的集合，提供了更准确的靶肽定量。本发明方法允许在高分辨率下获取重肽标准曲线以便跨越广泛动态范围进行更准确靶肽定量。本发明方法提供了将氨基酸同位素物并入到内标重肽和内标重蛋白质中的能力。本发明方法有助于使用前体氨基酸同位素物或固相前体的预混合集合来复用合成重肽和蛋白质同位素物。本发明方法提供了将氨基酸同位素物并入到通用报告子肽序列中的能力。
当前用于绝对蛋白质定量的基于MS的方法(例如AQUA)利用加标到分析物样品中的重内标重肽，并且目标分析物肽比内标重肽的MS信号强度或AUC的比用以计算样品中的目标分析物的绝对量。理想地，此内标物的浓度在目标分析物的一个数量级内以用于准确定量。临床相关蛋白质生物标记物跨越广泛范围的浓度存在，如心肌肌红蛋白(Mb)以1ng/ml到85ng/ml存在于正常受试者的血浆中，但因心肌梗塞而增加到200ng/ml到1,100ng/ml，并且因治疗梗塞的纤维蛋白溶解疗法而高达3,000ng/ml(安德森和安德森(2002)人类血浆蛋白质组：历史、特性和诊断展望(The human plasma proteome:History,character,anddiagnostic prospects).《分子细胞蛋白质组研究》(Mol.Cell.Proteomics)1,845-867)。高于100pg/ml的截止的肌钙蛋白I是心肌梗塞的另一种认可的标记物，但此截止比Mb低>500倍。临床生物标记物的广泛动态范围的其它实例包括低于1pg/ml的多种白细胞介素、高于500pg/ml的CEA、高于4ng/ml的前列腺特异抗原、高于20ng/ml的α-胎蛋白和高于8pg/ml的B型钠尿肽(BNP)(波兰斯基(Polanski)和安德森(2006)用于靶向蛋白质组研究的候选癌症生物标记物的清单(A List of Candidate Cancer Biomarkers for TargetedProteomics).《生物标记物见解》(Biomarker Insights)1,1-48)。对于这些和其它实例，广泛动态范围的目标分析物需要在MS测定中使用多个内标物浓度以便进行准确分析物定量。所公开的本发明方法在一个测定中解决了此动态范围需求。
经标记的肽内标物(AQUA肽)和重蛋白质内标物
AQUA肽标记的内标物公开于WO 03/016861和美国专利第7,501,286号中，其中的每一者明确地以全文引用的方式并入本文中。重同位素标记的蛋白质作为内标物公开于美国专利第7,939,331号中，并且蛋白水解消化产生了重肽标准物的集合。简单来说并且如这些参考文献中所公开，使用一种或多种标记的氨基酸合成肽(即，标记实际上是肽的一部分)，或不太优选地，可以在合成之后连接标记。标记是改变质量的标记。标记的质量应优选地是独特的以使通过MS分析产生的碎片质量偏移到具有低背景的光谱的区域。离子质量签名组分是标记部分的优选地在质谱分析中展现独特离子质量签名的一部分。标记的构成原子的质量的和优选地独特地不同于所有可能氨基酸的碎片。因此，经标记的氨基酸和肽因其在所得质谱中的离子/质量模式而容易与未标记的氨基酸和肽区分。在一个优选实施例中，离子质量签名组分赋予在质谱碎片化期间产生的蛋白质碎片以不匹配20种天然氨基酸中任一者的残基质量的质量。
标记在MS的碎片化条件下应是稳定的并且不经历不利碎片化。标记化学过程在一系列条件、特别是变性条件下应是高效的，并且经标记的标签优选地保持溶解于所选MS缓冲系统中。优选地，标记不抑制蛋白质的离子化效率。更优选地，标记不改变蛋白质的离子化效率并且不以其它方式具有化学反应性。备选地或另外地，标记含有两种或更多种同位素独特物质的混合物以在每个经标记的碎片位置生成独特质谱模式。
肽内标物包含改变质量的标记，其是稳定同位素，例如氢、氮、氧、碳或硫的同位素。适合的同位素包括但不限于2H、13C、15N、17O、18O或34S。可以提供肽内标物对，其包含相同肽部分但包含可区别的标记，例如可以在多个位点标记肽以提供肽的不同重形式和同位素物。多种经标记的氨基酸可以在合成过程期间并入肽中。标记可以是包含经修饰的氨基酸残基(如磷酸化残基、糖基化残基、乙酰基化残基、核糖基化残基、法呢基化残基或甲基化残基)的肽的一部分。在此实施例中，还可以产生对应于经修饰和未经修饰的肽的肽内标物的对或更大集合。在一个方面，这种对/集合被区别地标记。
肽内标物根据其质荷比(m/z)表征，并且优选地还根据其在色谱柱(例如，如HPLC柱)上的滞留时间表征。选择在30秒内与具有相同序列但不被标记的肽共洗脱的内标物。具有2H的同位素物在HPLC上具有略微不同的滞留，因此这些同位素物将将近同位素物但不与同位素物同时洗脱。更多2H将导致滞留时间偏移更大。
然后通过MS1或通过用多级MS(MSn)使肽碎片化来分析肽内标物。碎片化可以通过借助称为碰撞诱导解离(CID)(也称为碰撞活化解离(CAD))的过程诱导离子/分子碰撞而实现。碰撞诱导解离通过以下方式实现：用质量分析仪选择相关肽离子，并且将所述离子引入到碰撞室中。所选离子然后与碰撞气体(典型地氩气或氦气)碰撞，导致碎片化。一般来说，能够使肽碎片化的任何方法都涵盖于本发明的范围内。除了CID之外，其它碎片化方法包括但不限于高能碰撞解离(HCD)、表面诱导解离(SID)、黑体红外辐射解离(BIRD)、电子捕获解离(ECD)、源后衰变(PSD)、LID等。
然后分析碎片以获得碎片离子光谱。一种如此做的适合方式是在多级质谱(MSn)中通过CID进行。传统地用以表征肽的结构和/或获得序列信息，本发明的一个发现是，高分辨率MS1和/或高分辨率MSn在对蛋白质的绝对量进行定量的方法中提供了增强的灵敏度。因此，在一个方面，针对低丰度蛋白质(例如，低于2000个拷贝/细胞)生成肽内标物。
高分辨率绝对质量MS1可以与滞留时间信息组合用以可靠地验证和定量靶肽。在一个具体实施方式中，低分辨率下的内标同位素物簇可以充当较高强度MS1信号以触发一种或多种靶肽和内标物对的分离和富集。在一个具体实施方式中，对同位素物簇的高分辨率并且准确的质量测量用作MS仪器质量校准标准物以提供靶向肽MS1质量信号的确认。
在一个具体实施方式中，通过质谱的至少两个阶段分析肽内标物以测定肽的碎片化模式和鉴别用于肽验证的肽碎片化签名。获得肽签名，其中肽碎片在m/z比方面具有显著差异，以使得对应于每种碎片的峰能够充分分离。签名宜是独特的，即，可诊断被鉴别并且包含与具有不同氨基酸序列的肽的碎片化模式的最少(如果存在的话)重叠的肽。如果在第一阶段无法获得适合碎片签名，那么进行质谱的额外阶段直到获得独特签名。此碎片化签名确保，相同确切质量的峰不仅仅是相同氨基酸以不同次序的重排。
MS/MS和MS3光谱中的碎片离子对于目的肽通常是高度特异性和诊断性的。与现有技术方法相对比，肽诊断性签名的鉴别提供了一种对复杂蛋白混合物(如其中可能存在超过约100、约1000、约10,000或甚至约100,000种不同种类的蛋白质的细胞裂解物)进行高选择性分析的方式。因此，虽然常规质谱将不能区别具有不同序列但具有类似m/z比的肽(其将倾向于与在分析的任何经标记的标准物共洗脱)，但使用肽碎片化方法和多级质谱结合LC方法提供了一种通过这些诊断签名来检测和定量仅是复杂混合物的一小部分(例如，以小于2000个拷贝/细胞或小于总细胞蛋白的约0.001％存在)的靶蛋白质的方式。
可以合成、标记和碎片化单一蛋白质的多种肽子序列以鉴别最优碎片化签名。在一个具体实施方式中，至少两种不同肽用作内标物以鉴别/定量单一蛋白质，向任何定量系统提供内部冗余。在另一个具体实施方式中，合成对应于靶多肽的单一氨基酸子序列但有一种或多种氨基酸不同的肽内标物。肽内标物可以对应于靶多肽中的已知变体或突变，或可以随机变化以鉴别氨基酸序列中的所有可能突变。
在一个具体实施方式中，合成对应于蛋白质的不同修饰形式的肽，提供内标物以检测和/或定量不同细胞状态下的蛋白质修饰的变化。在一个具体实施方式中，生成对应于分子路径中的不同蛋白质和/或所述蛋白质的修饰形式(例如，信号转导路径、细胞周期、代谢路径、血液凝结路径等中的蛋白质)的肽内标物，提供内标物组以评价蛋白质的调节表达和/或特定路径中蛋白质的活性。上述内标物的组合可以用于给定测定中。
一般来说，样品将具有至少约0.01mg的蛋白质，至少约0.05mg、并且通常至少约1mg的蛋白质，或10mg的蛋白质或更多，典型地浓度在约0.1-10mg/mi范围内。必要时可以将样品调节到适当缓冲浓度和pH。
在一个具体实施方式中，添加已知量的经标记肽内标物到样品(如细胞裂解物)中，所述肽内标物对应于待检测和/或定量的靶蛋白质的。在一个具体实施方式中，将约10飞摩尔加标到样品中。使样品与蛋白酶活性接触，例如，添加一种或多种蛋白酶或适当化学试剂到样品中，并且将加标的样品孵育适合时间段以允许肽消化。如果靶蛋白质存在于样品中，那么消化步骤应释放序列与内标物的肽部分相同的靶肽，并且样品中由靶蛋白质如此释放的靶肽的量应与样品中的靶蛋白质的量成比例。
在一个具体实施方式中，进行分离程序以将经标记的肽内标物和相应靶肽与样品中的其它肽分离。代表性实例包括高压液相色谱(HPLC)、反相-高压液相色谱(RP-HPLC)、电泳(例如，毛细电泳)、阴离子或阳离子交换色谱和开口柱色谱。选择内标物，以便其与其相应靶肽以仅在由改变质量的标记贡献的质量方面不同的肽对形式共洗脱。
然后通过在质谱仪中监测高分辨率绝对质量MS1或所选反应，对每种肽进行检查。这涉及使用通过表征肽内标物获得的先验知识，并且然后需要质谱仪针对目的肽和内标物连续监测MS1、MS/MS或MSn光谱中的特定离子。在洗脱之后，计算肽内标物和靶肽峰的曲线下面积(AUC)。两个面积的比提供了绝对定量，可以针对用于分析的细胞的数目和蛋白质分子量使其标准化，以提供每细胞蛋白质的精确拷贝数。
本发明方法测定了目标多肽中修饰的存在和/或量。在一个具体实施方式中，内标物中的标记连接到包含经修饰的氨基酸残基的肽或连接到目标多肽中经预测要经修饰的氨基酸残基。在一个具体实施方式中，添加代表单一蛋白质的不同修饰形式的多种内标物和/或代表蛋白质的不同修饰区域的肽到样品中，并且检测和/或定量相应靶肽(携带相同修饰)。在一个具体实施方式中，提供了代表蛋白质的经修饰和未经修饰形式的标准物，以将观察到的经修饰蛋白质的量与样品中蛋白质的总量比较。
用于进行所述方法的试剂包含用稳定同位素标记的肽同位素物内标物。在一个具体实施方式中，标准物具有可诊断肽的独特肽碎片化签名。肽是已知蛋白质的子序列，并且可以用以鉴别样品(如细胞裂解物)中的蛋白质的存在和/或对其进行定量。
本发明另外提供了试剂盒，其包含一种或多种用稳定同位素或适用于进行所述标记的试剂标记的肽内标物。在一个具体实施方式中，所述方法利用氢、氮、氧、碳或硫的同位素。适合的同位素包括但不限于2H、13C、15N、17O、18O或34S。在一个具体实施方式中，提供肽内标物对，其包含相同肽部分但包含可区别的标记，例如可以在多个位点标记肽以提供肽的不同重或同位素物形式。还可以提供对应于经修饰和未经修饰的肽的肽内标物的对。
在一个具体实施方式中，试剂盒包含肽内标物，所述肽内标物包含与单一已知蛋白质不同的肽子序列。在一个具体实施方式中，试剂盒包含对应于多肽的不同已知或预测经修饰形式的肽内标物。在一个具体实施方式中，试剂盒包含对应于目的蛋白质的集合的肽内标物，例如所述目的蛋白质如参与分子路径(信号转导路径、细胞周期等)或可诊断特定疾病状态、发育阶段、组织类型、基因型等的蛋白质。对应于集合的肽内标物可以提供于单独容器中或以肽内标物的混合物或“混杂物”形式提供。
在一个具体实施方式中，肽内标物包含与经修饰的氨基酸残基(如磷酸化氨基酸残基、糖基化氨基酸残基、乙酰基化氨基酸残基、法呢基化残基、核糖基化残基等)相关的标记。在另一个方面，提供一对试剂，即对应于经修饰的肽的肽内标物和对应于序列相同但不经修饰的肽的肽内标物。
在一个具体实施方式中，提供一种或多种对照肽内标物。举例来说，阳性对照可以是对应于组成性表达的蛋白质的肽内标物，同时可以提供对应于已知不在正评价的特定细胞或物质中表达的蛋白质的阴性肽内标物。举例来说，在包含用于评估人类中的细胞状态的肽内标物的试剂盒中，可以提供植物肽内标物。
在一个具体实施方式中，一种试剂盒包含如上文所述的经标记的肽内标物和用于分析质谱的软件(例如，SEQUEST)。
优选地，试剂盒还包含用于提供对包含数据文件的计算机存储器的访问的构件，所述数据文件存储关于一种或多种肽内标物的诊断绝对质量MS1和MSn碎片化签名的信息。访问可以呈计算机可读程序产品(包含存储器)形式，或呈URL和/或口令形式，以访问使得用户连接到这种存储器的因特网站点。在一个具体实施方式中，试剂盒包含呈电子或书写形式的诊断性准确质量MS1和MSn碎片化签名(例如，质谱数据)，和/或包含呈电子或书写形式的关于表示一种或多种不同细胞状态的特征并且对应于产生碎片化签名的肽的靶蛋白质的量的数据。
用于复用蛋白质组定量(NeuCode)方法的中子编码的质量签名
中子编码的蛋白质定量方法公开于明确地以全文引用的方式并入本文中的赫伯特等人,用于复用蛋白质组定量的中子编码的质量签名,自然美国公司2013高级在线出版物中。如所公开，其使用由稳定同位素的核结合能变化所产生的细微质量差异。这些质量差异合成地编码到氨基酸中并且通过代谢标记并入酵母和小鼠蛋白质中。高质量分辨率(>100,000)下的质谱分析显示同位素物包埋的肽信号，允许定量。
同量异位素串联质量标签的复用能力已经通过以下方式从六扩展到八：同时将12C调换为13C原子和15N调换为14N原子，产生具有6mDa质量差异的新标签，其用50,000的质量分辨率在130的质荷比(m/z)下可以区分(沃尔纳(Werner)等人(2012)高分辨率实现TMT8复用(High-resolution enabled TMT8-plexing).《分析化学》(Anal Chem)84(16):7188-94；麦卡利斯特(McAllister)等人(2012)使用具有同量异位素质量的报告子离子同位素物增加TMT的复用能力(Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ionisotopologues with isobaric masses).《分析化学》84(17):7469-78)。质量亏损(此细微质量变化的原因)由以下事实引起：核结合能(使核分解成其组分核子所需的能量)对于每种元素的每种同位素不同。串联质量标签方法仍依赖于基于MS/MS的定量，然而，不分辨同量异位素标记的准确度和再现性问题。表明除C和N之外，其它元素可以编码中子质量签名。实际上，质量亏损可以由许多元素和其同位素诱导：例如12C/13C(+3.3mDa)、1H/2H(+6.3mDa)、16O/18O(+4.2mDa)、14N/15N(-3.0mDa)和32S/34S(-4.2mDa)。假设这些同位素向蛋白质组中的计算并入将生成新的MS1-中心定量技术，所述技术将SILAC的准确度与同量异位素标记的复用能力组合。此方法已经称为中子编码(NeuCode)。
与使用NeuCode对蛋白质组进行质量标记相对比，所公开的方法使用质量亏损的概念产生经标记的肽标准物以用于对分析物进行绝对定量。
在经标记的肽标准物的产生中使用这些质量亏损利用了同位素之间的核结合能的细微差异。所述方法有效地将同位素信息压缩到非常窄的m/z空间(约0.0050-0.040)中，以便其容易通过改变质量分辨率而隐蔽或展现。当前傅里叶变换MS系统提供了超高分辨率(>1,000,000)，并且将允许使用分隔少到约6mDa的质量亏损标记的肽。在一个具体实施方式中，产生提供7重定量的定制赖氨酸同位素物的合成：+8Da，在0、6、12、18、24、30和36mDa间距下(图6、7a-b)。此外，所述>7重同位素物集合可以用12个额外中子生成，允许组合多个同位素簇中的同位素物。举例来说，每种肽将存在于三个同位素簇中，就如在传统三重中一样；然而，每个簇在高分辨率扫描分析时将展现5-7个独特峰。通过组合含有赖氨酸的这19种同位素物(5+7+7)的肽，质量亏损标记应促进19重实验。类似地，通过将含有精氨酸同位素物的8重同位素物集合与6和10个额外中子组合，同样可以对含精氨酸的肽进行16重复用定量。通过将相对和绝对定量的质量亏损与质量差示标签组合，实现高度复用定量准确度和精密度。
同位素物质量标签测定
共价质量标签是一种产生内标肽同位素物的同位素物集合的替代性方法。质量标签的化学结构具有较大柔性，并且因此这些化学标签更容易经特定手性氨基酸前体的合成而合成。同位素物质量标签可以用以标记非蛋白质样品，包括核苷酸、聚糖、脂质和代谢物。另外，同位素物质量标签可以并有改良溶解度、色谱滞留性质、离子化效率和/或肽碎片化特性的独特特征。描述两种例示性核心结构和其相关胺反应性标签(图9)。这些例示性标签是基于经胺反应性N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)修饰的三嗪环和嘌呤杂环结构。这些标签可以如本领域中已知在无重同位素的情况下或在重同位素的不同组合的情况下合成。轻和重同位素试剂可以具有4Da的最小质量差异。展示重三嗪和嘌呤核心分子的可能同位素物和质量(图10a-b)。这些同位素物可以用以产生可以在>100,000分辨率下分辨的复用试剂集合。在一个具体实施方式中，以确定比例预混合重同位素物。用蛋白酶(如胰蛋白酶或LysC)消化分析物蛋白质样品，并且将轻标签通过反应性胺在肽和赖氨酸残基的氨基末端处共价连接到肽。将用以对靶分析物肽进行定量的已知绝对浓度的内标肽用重同位素物标签集合标记。在低分辨率下，轻靶向分析物的曲线下面积(AUC)和重同位素物集合的复合AUC可以用以对目标分析物进行定量，并且在高分辨率下，内标同位素物可以用以界定用于对靶分析物进行更准确定量的标准曲线。
通用报告子测定
通用报告子的使用描述于WO 2012/005838和WO 2012/006406中。此方法导致通过MS对分析物进行绝对定量，并且使得能够对参考溶液中的分析物进行简单浓度校准。所述方法使用重同位素标记的分析物(内标物)，其与报告子R(其可以或可以不经重同位素标记)具有等摩尔浓度并且可裂解地缀合到报告子R；和重同位素标记的通用报告子U。分析物包括但不限于肽、多肽和蛋白质。通用报告子U包括但不限于肽(即，氨基酸的聚合物)和其它聚合物。
在一个具体实施方式中，本发明方法使得通过MS对肽、多肽和蛋白质分析物进行绝对定量。所述方法使用重同位素标记的肽(蛋白质型肽，下文描述；内标物)，其以与任选地重同位素标记的报告子肽R等摩尔浓度存在，并且在蛋白水解位点处可裂解地缀合到所述报告子肽R；通过氨基酸分析来分析的重标记的通用报告子肽U。重同位素标记的肽不必经历氨基酸分析。在一个具体实施方式中，分析键联到单独报告子肽R的来自单一蛋白质的若干不同蛋白质型肽。在一个具体实施方式中，分析键联到单报告子肽R的串接到一种多肽中的若干不同蛋白质型肽。
图11展示来自蛋白质或多肽P的蛋白质型肽A、B和C。蛋白质型肽是在MS解离之后碎片化为可预测离子系列，以允许对母蛋白质(无论呈提纯形式还是来自复杂混合物)进行特定鉴别和定量的签名肽(signature peptide)。其具有使其容易定量的特征。签名肽是特定蛋白质的明确标识。任何蛋白质含有10与100种之间的签名肽。任何签名肽都满足大部分以下准则：容易通过质谱检测，可预测地并且稳定地由液相色谱(LC)柱洗脱，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)富集，良好离子化，和良好碎片化。容易定量的肽满足大部分以下准则：容易合成，能够经高度提纯(>97％)，可溶于≥20％乙腈中，低非特异性结合，氧化抗性，合成后修饰抗性，和≥10并且≤40的疏水性或疏水性指数。疏水性指数描述于明确地以引用的方式并入本文中的克罗欣(Krokhin),《分子与细胞蛋白质组研究》(Molecular andCellular Proteomics)3(2004)908中。疏水性指数小于10的肽将无法可再现地通过RP-HPLC分辨。疏水性指数大于40的肽将无法可再现地从RP-HPLC柱洗脱。
本发明方法使用内标物，其是待定量的分析物的重同位素物(标记)形式，也称为AQUAplex重分析物并且展示于图16中。在使用蛋白质型肽同位素物集合的实施例中，内标物是蛋白质型肽的经标记的同位素物集合，也称为重蛋白质型肽同位素物，如图17中所示。
同位素稀释质谱分析(IDMS)是指使用重同位素标记的肽作为内标物以确定浓度对比MS响应关系和对肽进行绝对定量。重同位素标记的肽具有与未标记的肽相同的性质，不同之处在于其质量因并入的同位素偏移。由于此质量偏移，已知量的同位素标记的肽可以用作肽定量的内标物。IDMS方法导致对复杂样品或混合物中的肽进行靶向质谱(选择离子监测(SIM)/选择反应监测(SRM)/多反应监测(MRM))定量。SIM和SRM涵盖MS获取设置以通过分别对来自一系列靶蛋白质的蛋白质型肽的母或特定碎片离子进行定量，来对这些靶蛋白质进行定量。靶向测定开发必须是快速的，具有高通量，是灵敏、特异、靶向、稳定、可再现并且经济的；其典型地使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS，LC/MS2)。然而，在靶向蛋白质组研究实验中使用SRM对大量肽的精确定量由于特异性和占空比需求而保持具挑战性。SRM特异性是指选择针对靶和内标肽以高灵敏度提供特定定量响应的母/碎片离子组合(例如，跃迁)。占空比是指在复用SRM测定中可以通过MS同时监测的SRM跃迁的受限数目。为了解决占空比限制，SRM方法典型地经安排或定时，以便给定靶的跃迁仅在对于给定靶预期的滞留时间窗中监测到。这在数据获取和可再现色谱之前需要复杂SRM方法设置，以确保在用于准确AUC测定的峰前后靶跃迁以充足基线完全监测。SIM监测包括分离和富集靶向肽和内标物以便改良测定的灵敏度。以高分辨率MS1扫描获取的AQUAplex测定不需要安排或选择跃迁，并且所有定量数据分析都可以在获取后进行。
在IDMS中，天然蛋白质型肽仅归因于并入重氨基酸而不同于重蛋白质型肽。重氨基酸含有13C(碳的重同位素)和/或15N(氮的重同位素)、18O(氧的重同位素)和/或2H(氢的重同位素)，并且这些同位素的不同组合可以组合以产生含有相同单位质量但以高分辨率质谱可观察的略不同准确质量的同位素物集合。插入重氨基酸同位素物产生HeavyPeptideAQUAplex，其仅因质量差异而不同于蛋白质型肽。使用制备型高效液相色谱(HPLC)将重肽同位素物混合物的纯度增加到>97％。通过氨基酸分析测定HeavyPeptide AQUAplex的精确量。待定量的肽与HeavyPeptide AQUAplex作为内标物的混合物在低分辨率质谱分析中产生两个峰：两个峰具有相同洗脱时间，但具有不同质量。在高分辨率MS下，HeavyPeptideAQUAplex集合将分辨为因同位素物之间的质量亏损而分隔的独特组分质量。含有2H的肽在反相HPLC上可以展现滞留时间的轻微减少，但这不影响定量准确度，因为其不影响AUC定量。将HeavyPeptide AQUAplex以已知量加标到待分析的样品中，使得可能使用其量从峰面积计算待分析的肽的量。在低MS或MSn分辨率下，所述方法将来自重同位素标记的肽同位素物集合的相应组合MS峰的AUC与具有来源于正在定量的分析物(例如，聚合物、蛋白质、肽或多肽)的确切相同序列的未标记的肽的峰比较。在高MS或MSn分辨率下，所述方法将来自重同位素标记的肽同位素物中的每一者的相应MS峰的面积与具有来源于正在定量的分析物(例如，聚合物、蛋白质、肽或多肽)的确切相同序列的未标记的肽的峰比较。定量精密度与添加到样品中的重肽的量的准确度直接相关。
以下实例(虽然具体用于蛋白质分析物情况)示例说明了可适用于分析物(无论是蛋白质还是非蛋白质)的通用方法。将含有众多蛋白质的样品(例如，生物样品、食物样品)用裂解剂，如蛋白酶(例如，胰蛋白酶)进行处理。胰蛋白酶在每个R氨基酸和K氨基酸处裂解，产生众多碎片，每个碎片具有约13种氨基酸(从6种氨基酸到20种氨基酸变动)。向此待分析的含碎片的样品中引入(加标)一种、两种或三种HeavyPeptide AQUAplex内标物，并且如所述进行定量。在使用蛋白水解消化的实施例中，定量精密度还与消化可预测性和效率直接相关。
在一个具体实施方式中，蛋白质含有一种、两种或三种蛋白质型肽序列，标记为重或轻(HeavyPeptide AQUAplex)。将待分析的样品用蛋白质型肽加标并且通过LC-MS/MS定量。
在AQUAplex IDMS中，内标同位素物集合具有与来自待定量的蛋白质的蛋白质型肽相同的序列，但内标物是具有与蛋白质型肽不同的质量的重同位素物的混合物。内标物的序列因此通过蛋白质序列进行预确定；其不能改变。AQUAplex内标物必须通过氨基酸分析来定量以测定总肽浓度，并且通过高分辨率MS进行定量以测定组分肽同位素物的相对比例和因此绝对浓度。因为待定量的蛋白质或多肽随每个实验而不同，所以用于此蛋白质或多肽的内标物必需也随每个实验而不同，并且需要对每个实验进行氨基酸分析。每个定量需要典型地涵盖六个点的稀释曲线，其可以在一个高分辨率MS分析中通过使用以确定比例混合的AQUAplex内标同位素物以提供标准曲线而实现。氨基酸分析的成本相对高并且程序是费时的。每种肽序列具有特定溶解度，并且其非特异性结合常数基于可能随每个分析而不同的各种因素而变化，所述因素例如容器材料、缓冲液、温度等。所述可变性降低了精密度和再现性。
相比之下，以肽作为非限制性实例，使用经修饰、优化、标记的通用报告子同位素物混合物Uplex和一种分析物、多于一种分析物或若干串接分析物的AQUAplex本发明方法增加了定量的分析精密度，其中内标物的品质对于确保精确定量是决定性的。仅此通用报告子Uplex经历氨基酸分析，而非用于每种待定量的肽的内标物都需要氨基酸分析。此通用报告子是同位素物的混合物，允许完全稀释曲线在一个MS获取中获取。通用报告子同位素物Uplex定量因此需要仅进行一次，而非随每个实验进行，并且可以用以用标准曲线对报告子肽进行定量。通用报告子Uplex可以经储备并且容易变得可用。在一个具体实施方式中，将通用报告子Uplex用荧光团和/或发色团标记，并且通过测量荧光团和/或发色团的吸光度对通用报告子Uplex进行定量，并且通过高分辨率MS测定同位素物的相对比例和因此同位素物的绝对浓度。对于肽分析物，不需要氨基酸分析。在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex含有一个色氨酸，并且通过以下方式测量吸光度对通用报告子肽Uplex进行定量：使用色氨酸的特定消光因子用高分辨率MS测定总肽浓度以测定组分同位素物浓度。
如图12中使用肽分析物所示，在一个具体实施方式中，肽A*(内标物)通过A*与R之间的可裂解位点(例如，蛋白水解位点)与报告子肽R键联。在此实施例中，肽A*和报告子肽R中的每一者含有至少一个用重同位素物标记的氨基酸，称为重氨基酸。当肽A*用同位素物集合标记时，可以通过以低MS分辨率与A*内标物进行AUC比较对靶分析物进行定量，或可以通过以高MS分辨率与A*同位素物集合进行AUC比较对靶分析物进行定量。备选地，当报告子肽R用重同位素标记时，报告子肽R可以用同位素物集合标记，以便可以通过与通用报告子肽U或通用报告子肽同位素物集合Uplex比较对其进行定量。因为通用报告子肽同位素物Uplex必须具有不同质量，所以通用报告子肽Uplex可以用两种重氨基酸或其同位素物表示，并且报告子肽R用一种重氨基酸或其同位素物表示。存在其它获得原子质量差异的方式；例如，对于报告子肽R和通用报告子肽Uplex使用不同重氨基酸以获得原子质量差异，在报告子肽R和通用报告子肽Uplex中使用不同同位素物，或在报告子肽Rplex和通用报告子肽Uplex中使用多种独特同位素物。以此方式，AQUAplex同位素物的概念可以用以改良用A*同位素物对靶肽的定量，改良用Rplex同位素物对报告子肽R的定量，和/或改良用Uplex同位素物对报告子肽R的定量。
肽A*具有与蛋白质型肽A相同的序列，但肽A*由于存在重氨基酸或重氨基酸同位素物作为肽A*plex而具有不同质量。通用报告子肽Uplex是用于报告子肽R的肽标准同位素物集合。通用报告子肽Uplex同位素物不是用以对蛋白质或多肽进行定量的内标物。通用报告子肽Uplex具有与报告子肽R确切相同的序列，但由于并入一种或多种重氨基酸同位素物而具有不同原子质量。
在肽A*与报告子肽R之间的连接产生多肽，报告子肽R可以是A*的C末端，即，R-A*，或报告子肽R可以是A*的N末端，即，A*-R。A*和R中的一者或两者可以是同位素物集合A*plex和Rplex，其可以通过高分辨率MS分辨和定量。术语A*-R用以代表A*-R多肽或R-A*多肽。在任一情况下，当A*是蛋白质型肽时，所得多肽中的肽A*与报告子肽R之间必须存在可裂解(例如，蛋白水解)位点。
将多肽同位素物集合A*plex-R与含有待定量的蛋白质或多肽P的样品混合。添加已知量的通用报告子肽Uplex同位素物到样品中，即，将通用报告子肽Uplex加标到样品中。用使多肽键裂解的蛋白酶(例如胰蛋白酶)消化样品。由于蛋白酶作用，多肽A*-R必须完全消化。在一个具体实施方式中，在裂解(例如，蛋白水解消化)之前添加通用报告子肽或Uplex。在一个具体实施方式中，在裂解(例如，蛋白水解消化)之后添加通用报告子肽或Uplex。
在消化之后，样品中的肽A*plex和报告子肽R的浓度是等摩尔的。也就是说，肽A*的量等于报告子肽R的量。通用报告子肽Uplex同位素物用以使用高分辨率MS定量对报告子肽R进行定量。肽A*plex的标准曲线用以测量样品中由蛋白质或多肽P的蛋白水解消化产生的肽A的量。
在使用图13和14中所示的肽的具体实施方式中，相同方法用于来自蛋白质P的蛋白质型肽B和C，以便增加定量的特异性。肽B*plex具有与蛋白质型肽B相同的序列，但由于存在重同位素物标记的氨基酸而具有不同原子质量，在低MS分辨率下，并且在高MS分辨率下是肽B*的稀释系列。肽C*plex具有与蛋白质型肽C相同的序列，但由于存在重同位素物标记的氨基酸而具有不同原子质量，在低MS分辨率下，并且在高MS分辨率下是肽B*的稀释系列。
使用肽的具体实施方式作为一个实例，A*plex-R在同位素物集合A*plex与R之间包括裂解位点(例如，蛋白水解位点)。多肽同位素物A*plex-R因此可以用作蛋白质或多肽P的假替代以监测单一实验中的蛋白水解消化、样品和实验中间的消化效率，并且在一些情况下，使来自不同样品和/或不同实验的结果标准化。
在使用肽的实例中，可以针对蛋白水解消化优化报告子肽R。作为一个实例，报告子肽R可以经选择和/或修饰，以便其含有容易通过吸收测量而进行定量的特定氨基酸(例如，色氨酸)。如图15中所示，报告子肽R可以含有多于一种重同位素标记的氨基酸或单一重氨基酸的独特同位素物。此实施例通过增加相同报告子肽R序列的可能原子质量的数目增加了所述方法的复用可能性，以便可以在单一实验中使用通用报告子肽U对多种肽进行定量。
在此复用具体实施方式中，使用本领域中已知的标准方法将报告子肽R合成得具有不同原子质量。如图15中所示，在单一实验中分别使用重肽A*plex、B*plex和C*plex和使用报告子肽R1、R2、R3对来自蛋白质或多肽P的肽A、B和C进行定量。在图15中所示的实施例中，报告子肽R1、R2、R3以及通用报告子肽U具有相同序列但具有不同原子质量。为了最大化可用于报告子肽R的质量组合的数目，序列可以由(但不限于)以下氨基酸中的一者或多者组成：丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和缬氨酸。这些氨基酸具有≥4Da的质量偏移，并且可以用重同位素的不同组合进行成以制作同位素物，如在图6-9中。蛋白质型肽(例如，A)与内标物(例如，A*)之间的最小质量差异应超过MS分化的灵敏度阈值测定。在一个具体实施方式中，当4kDa是可以区别的最小原子质量差异时，蛋白质型肽与内标物之间的最小质量差异是4kDa。在一个具体实施方式中，当6mDa是可以通过高分辨率MS区别的最小原子质量差异时，内标物、报告子肽和通用报告子同位素物之间的最小质量差异是6mDa。可以使用通用重肽U同时定量的肽的数目仅受序列内可用的质量差异组合的数目限制。
在使用肽的另一个实例中，报告子肽R可以经设计得具有低疏水性指数，这将增加多肽A*plex-R的水溶性，其中肽A*plex是疏水性指数≥40的同位素物的集合或其中肽A*plex是难溶的。具有使其高度可溶的序列的报告子肽R的一个实例是PVVVPR(SEQ IDNO.1)；其疏水性指数是13.45。具有使其高度可溶的序列的报告子肽R的一个实例是SSAAPPPPPR(SEQ ID NO.2)，其疏水性因子是7.57。在一个实例中，报告子肽R和通用报告子肽Uplex同位素物中的每一者含有用于通过吸光度测量进行定量的发色团和/或荧光团。在通用报告子肽U和报告子肽R两者都包括发色团和/或荧光团的实施例中，通用报告子肽Uplex同位素物可以通过测量发色团和/或荧光团的吸收并且不通过氨基酸分析进行定量，并且同位素物可以通过高分辨率MS进行定量。通过吸光度进行蛋白质或多肽定量的方法比氨基酸分析的方法更稳定。通过吸光度进行蛋白质或多肽定量视为比通过氨基酸分析进行蛋白质或多肽定量更精确。发色团或荧光团的实例和评定其吸光度的方法是本领域中已知的。
在图14中所示的具体实施方式中，多肽含有三种原型肽，各自用重氨基酸标记、与也用重同位素氨基酸标记的单报告子肽R串接，产生C*plex-B*plex-A*plex-R。使用此多肽C*plex-B*plex-A*plex-R保证了等摩尔量的肽A*plex、B*plex和C*plex中的每一者，并且每个同位素物集合提供了肽A、B和C的标准曲线，并且因此与使用个别肽进行定量相比降低了定量可变性。此实施例增加了可以用相同序列作为通用报告子肽U的序列定量的肽的数目。
在一个具体实施方式中，A*plex-R或B*plex-A*plex-R或C*plex-B*plex-A*plex-R可以在引入到待定量的样品中之前进行裂解。
在使用蛋白质型肽的具体实施方式中，肽A*plex、B*plex、C*plex和报告子肽R可以随机排列，只要其通过裂解位点(例如，蛋白水解位点)键联。
图14中所示的多肽含有三种重同位素标记的肽(A*plex、B*plex和C*plex)，其对应于靶肽A、B和C，键联到报告子肽R，还含有重同位素标记。其它实施例是可能的，其中R不含有重同位素标记或含有一种或多种允许多种独特报告子同位素物在复用测定中对多种独特内标肽进行定量的同位素物。其它具体实施方式是可能的，其含有各种数目(n)的标记肽和其对应于一种或多种靶肽的同位素物，与一种或多种报告子肽和同位素物连接。n的范围例如由如本领域技术人员已知的制造可行性、溶解度等决定。在一个具体实施方式中，至多99的n值是可能的。在一个具体实施方式中，至多49的n值是可能的。在一个具体实施方式中，n＝4。在一个具体实施方式中，n＝5。在一个具体实施方式中，n＝6。在一个具体实施方式中，n＝7。在一个具体实施方式中，n＝8。在一个具体实施方式中，n＝9。在一个具体实施方式中，n＝10。在一个具体实施方式中，n＝11。在一个具体实施方式中，n＝12。在同位素物的情况下，这些限制显著增加；可以使用不同重氨基酸、同位素偏移和同位素物的组合。
通用报告子肽U和报告子肽R可以经设计以具有不同序列和同位素物以用于复用定量。通过肽序列测定的质量差异组合的数目是有限的。当待定量的肽的数目超过可用于报告子肽R的质量差异组合的最大数目时，可以使用通用报告子肽U的额外同位素物，并且可以使用额外序列：例如U1、U2、……Un，其中n仅受可以通过仪器同时定量的肽的数目限制。作为一个实例，多肽A*-Rplex可以具有氨基酸序列TTVSKTETSQVAPA SEQ ID NO.3，肽A*具有序列TETSQVAPA SEQ ID NO.4，并且报告子肽Rplex具有序列TTVSK SEQ ID NO.5的图6的可分辨赖氨酸同位素物，如WO/2003/046148中所公开。
因为通用报告子肽Uplex同位素物集合的序列不受约束或限制，并且因为通用报告子肽Uplex同位素物集合是可以容易排序、储备、维持和存储的产品，所以其使用向MS肽定量提供了灵活性。在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex同位素物集合的序列可以经定制以最小化肽、多肽或蛋白质与例如容器、端部、管道等的非特异性结合，通过选择具有低疏水性指数的序列，例如PVVVPR SEQ ID NO.1，其疏水性指数是13.45，或SSAAPPPPPR(SEQ ID NO.2)，其疏水性指数是7.57；并且使用多种精氨酸同位素物或其它重氨基酸前体的同位素物(图9、10a-b)。在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex同位素物集合的序列可以经定制以最大化多肽A*plex-R的溶解度。举例来说，因为使用通用报告子肽U，所以多肽A*plex-R不必在MS分析之前精确定量，并且在合成中使用以确定比例预混合的同位素物提供了跨越稀释曲线的多个数据点以便改良定量。这导致产生多肽A*plex-R的制造时间更短并且成本更低。肽A*plex在极低浓度下定量，在所述浓度下保证其溶解度，导致精密度和可重复性增强。
因为肽A*plex的定量在用于对报告子肽R进行定量的相同仪器上并且在相同MS程序内进行，所以其始终反映了添加到样品中的量，并且与在MS定量之前的样品制备、分级和液相色谱分离期间的多肽A*plex-R的最终变化、降解和部分损耗无关。当扩展WO 03/016861中所述的方法时，A*plex同位素物集合以在不稀释的情况下过高而无法使用的已知浓度提供；因此，典型地将其稀释1000到10,000倍。如果A*plex的序列是相对疏水性的并且倾向于是非特异性结合的，那么与β-类淀粉肽的情况一样，大量标准物将在稀释期间损耗。这降低了方法的精密度。因为通用报告子肽Uplex同位素物集合的序列可以经设计和优化以减少非特异性结合，所以通用报告子肽U的稀释倾向于不是显著非特异性结合的。通用报告子肽Uplex同位素物集合包括在待定量的样品中，并且在稀释的样品中对报告子肽R进行定量，因此标准物(例如，β-类淀粉肽)的非特异性结合将不会降低方法的精密度。
多肽A*plex-R是蛋白质P的假替代，并且可以用以监测裂解(例如，蛋白水解消化)。其可以用以定量和比较样品与样品和/或实验与实验消化效率，因为由确定同位素物集合提供的稀释曲线提供了跨越广泛动态范围的准确定量。其可以用以使来自样品与样品和/或实验与实验的结果标准化。
在一个具体实施方式中，本发明方法适于使用通过可裂解位点缀合到报告子肽R或其它部分的蛋白质型肽对分析物(包括但不限于肽、多肽和蛋白质)进行MS定量。这在图16中对于任何分析物示意性地展示，并且在图17中对于肽分析物示意性地展示。重蛋白质型肽同位素物集合含有与天然蛋白质型肽相同的氨基酸序列，但含有不同的原子质量。集合中的每种重蛋白质型肽同位素物都与报告子肽R具有等摩尔浓度。在一个具体实施方式中，报告子肽R用重同位素或同位素物的集合标记。在一个具体实施方式中，报告子肽R不用重同位素标记。通用报告子肽U具有与报告子肽R相同的序列。通用报告子肽U具有与报告子肽R不同的质量，因为其含有重同位素物集合。仅对通用报告子肽Uplex进行定量。在裂解(例如，蛋白水解消化)之后，以等摩尔浓度将重蛋白质型肽或同位素物集合和报告子肽R释放到样品中。使用重通用报告子肽Uplex同位素物集合的量测定报告子肽R的量。
通用报告子肽Uplex同位素物集合是序列非依赖性的并且用作定量标准物和裂解标准物。通用报告子肽Uplex同位素物集合具有与报告子肽R相同但与待测定的蛋白质无关的肽序列。因为通用报告子肽Uplex同位素物集合和报告子肽R的序列相同，所以使用重标记的报告子肽R和重标记的通用报告子肽Uplex同位素物集合获得通用报告子肽Uplex同位素物集合与报告子肽R之间的原子质量差异。通过在报告子肽R和通用报告子肽Uplex同位素物集合中使用不同重标记，或通过在报告子肽R或通用报告子肽Uplex同位素物集合中使用额外重氨基酸，获得原子质量差异(图15)。与通用报告子肽Uplex同位素物集合相比，报告子肽R可以具有更低原子质量或更高原子质量。
如图18中所表示，用于命名组分的适宜规约如下：蛋白质型肽命名为字母，例如A、B、C；重同位素标记的蛋白质型肽命名为具有星号(说明书重同位素标记)和“plex”后缀(以反映使用多种同位素物)的字母，例如A*plex、B*plex、C*plex；R是报告子；Uplex是通用报告子同位素物集合；携带重同位素标记的氨基酸由度数符号“°”和呈粗体的一或三字母命名的常规氨基酸进行表示，例如R或Arg表示具有重同位素标记的氨基酸精氨酸；携带重同位素物标记的集合的氨基酸由星号符号“*”和呈粗体的一或三字母命名的常规氨基酸进行表示，例如R*或Arg*表示具有一种或多种重同位素物标记的氨基酸精氨酸；以商标HeavyPeptide IGNISTM市售的串接肽和通用报告子的一种组合物是A*plexB*plexC*plexR。
在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex同位素物集合的序列通过优化色谱离子化和碎片化性质进行优化和/或定制以与蛋白质型肽的性质相容。作为一个实例，通用报告子肽Uplex同位素物集合通过引入额外电荷或疏水性性质进行修饰以增强离子化和/或去溶剂化。作为一个实例，通用报告子肽Uplex同位素物集合通过引入天冬氨酸-脯氨酸(DP)基团进行修饰以增强碎片化，所述同位素物集合通过引入天冬氨酸-脯氨酸(DP)基团含有高度易断的键，所述键在串联MS中在比其它二肽键更低的碰撞能下碎片化。作为一个实例，通用报告子肽Uplex同位素物集合通过选择具有与蛋白质型肽类似的疏水性因子的报告子肽进行修饰，以在液相色谱上具有与蛋白质型肽类似的滞留时间。因此，通用报告子肽Uplex同位素物集合可以通过设计进行优化。举例来说，相同肽序列的质量组合和同位素物的数目可以进行优化以增加复用能力，导致多达500种蛋白质能够在单一测定中被定量。但因为肽序列相同，所以同位素物的全集合可以在高MS分辨率下在MS1或MSn水平下分辨，并且肽序列可以通过低MS分辨率下的MS/MS或MSn碎片化验证，仅需要一个稀释曲线对通用报告子肽U进行定量。通过增加具有不同质量和同位素物的相同序列的数目，可以在单一实验中定量的蛋白质的数目增加，仪器使用和资源并不同时增加。
在一个具体实施方式中，针对低特异性结合、高溶解度、高MS信号强度和/或所要液相色谱滞留时间优化通用报告子肽Uplex同位素物集合。在一个具体实施方式中，通用报告肽Uplex同位素物集合肽序列经修饰以改变其色谱滞留性质；这是内部修饰的一个实例。在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex同位素物集合结构通过连接标签进行修饰以改变其色谱滞留性质；这是外部修饰的一个实例。在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex同位素物集合结构通过连接本身已经经修饰的标签而进行修饰以改变其色谱滞留性质；这是外部修饰的另一个实例。
在一个具体实施方式中，使用通用同位素物聚合物集合，其中聚合物广泛定义为单体的连接基团。单体不必是肽，或不必完全是肽，并且可以含有一种或多种同位素。在一个具体实施方式中，多糖(即，聚糖单体)用作通用聚合物(U聚合物)。多糖是两种或更多种单糖通过糖苷键键联的组合，并且多糖由单体的集合合成以便产生同位素异构体集合。所述多糖的实例包括淀粉、纤维素和糖原的同位素物。其结构和合成是本领域中已知的。在一个具体实施方式中，脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)同位素物集合用作通用聚合物(U聚合物)。其结构和合成是本领域中已知的。检测和定量核苷酸的方法是明确的，例如PCR、定量PCR。连接到分析物的核苷酸可以用作分析物的独特标识(即，“条形码”)，并且用于使用高分辨率MS用同位素物集合的同位素稀释的定量目的。
在一个实例中，下表中所示的以下肽序列(当前用作滞留时间校准肽)中的一者的同位素物用作通用报告子肽Uplex同位素物集合。这些肽展现充足离子化并且具有确定的洗脱性质。下文的下表展示其序列、疏水性和在Hypersil Gold C18柱上的色谱特性。
使用用斯派瑟(Spicer)等人(2007).序列特异性滞留计算器(Sequence-specificretention calculator)。反相HPLC中的肽滞留时间预测算法的家族：对于各种色谱条件和柱的适用性(A family of peptide retention time prediction algorithms inreversed-phase HPLC:applicability to various chromatographic conditions andcolumns).《分析化学》79(22):8762-8中所述的算法进行的计算来测定疏水性。
在一个具体实施方式中，重同位素标记并入在C末端氨基酸中。举例来说，使用肽SSAAPPPPPR SEQ ID NO.2，此具体实施方式可以表示为SSAAPPPPPR*，其中末端R含有作为用高分辨率MS可分辨的同位素物的集合并入的重同位素标记。
在一个具体实施方式中，重同位素并入在肽中除C末端以外的位置处。以下氨基酸中的一者或多者可以用重同位素物集合标记：丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸(图8)。这些氨基酸的质量偏移>4Da。另外，肽内的多种氨基酸可以用同位素物集合标记，并且相同氨基酸可以用不同同位素标记，如精氨酸+6Da和精氨酸+10Da同位素物集合，其将分别在低MS分辨率下和以累加复用能力在高分辨率MS下引入6Da和10Da质量偏移(图7a-b)。举例来说，使用肽SSAAPPPPPR SEQ ID NO.2，其中*表示含有重同位素标记的位置的氨基酸，以下位置是可能的：SSA*APPPPPR、SSA*A*PPPPPR、SSA*A*P*PPPPR、SSA*A*P*P*PPPR、SSA*A*P*P*P*PPR、SSA*A*P*P*P*P*PR、SSA*A*P*P*P*P*P*R、SSA*A*P*P*P*P*P*R*。此具体实施方式(其中重同位素物氨基酸位于一个或多个位置处)允许相同报告子序列情况下的更高复用。
对于复用测定，将定制肽一起组合到复杂靶向测定中。每种定制肽具有类似于定制肽洗脱的不同相应通用报告子Uplex同位素物集合。这允许许多肽容易跨越LC梯度被复用和定量而无交叉污染。举例来说，复用分析阵列含有多种不同通用肽Uplex同位素物集合，所述集合具有相同氨基酸序列但由于存在重同位素物或同位素物集合而具有不同原子质量；和多种报告子肽R，每种报告子肽R可裂解地键联到样品中的待定量的不同同位素标记的蛋白质型肽。通用肽Uplex同位素物集合具有与定制肽大体上类似的色谱滞留时间。在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex同位素物集合中的重同位素物标记在多种不同氨基酸处并入。此具体实施方式提供了使用相同通用报告子肽Uplex氨基酸序列的更高复用阵列。
在一个具体实施方式中，通用报告子肽Uplex同位素物集合经定制以用于特定质谱仪和/或特定用途以用于鉴别、表征和定量疾病生物标记物(蛋白质组研究、代谢组研究、药物蛋白质组研究)发现、确认、验证和早期临床诊断和疾病进展监测。举例来说，4-10氨基酸报告子肽将允许并入较少同位素物前体和高分辨率MS下的较低复用能力。备选地，较大11-25氨基酸肽可以允许并入较多同位素物前体和高分辨率质谱仪下的较低复用能力。蛋白质组研究已经通过在测定中并入内标物从鉴别(定性蛋白质组研究)发展到定量。需要内标物，因为质谱中的所得峰高度或峰面由参数(例如，肽量、肽离子化、肽碎片化、离子抑制等)的复杂函数产生。不存在从质谱峰的表面测量肽量的算法。当添加已知量的内标物到待分析的肽中时，通过将其峰表面与内标物峰表面比较来测定肽的量。
一个具体实施方式是经标签修饰的所描述的肽。用以修饰肽的这种标签不同于分别修饰通用报告子U和报告子R所需或任选的重同位素标记。然而，所述标签可以是重同位素物集合，如随后在第一实例中所述。
这种标签的一个实例是重同位素物集合。这种标签的一个实例是同位素物标签。所述标签包括相同化学结构的形式，每种标签具有可以用高分辨率MS分辨的独特同位素物。
这种标签的一个实例是相同肽的不同同位素物。此实例使用天然具有多种同位素的元素作为标签，并且其中同位素具有独特质量亏损。
使用质量亏损标签使报告子肽偏移到质量色谱图的观察不到大部分同位素的区域(有时称为质量安静空间)中。此实例适用于增强具有许多其它背景离子的质量区域中的检测的灵敏度和特异性。
如本领域技术人员已知，细胞培养物中使用氨基酸进行稳定同位素标记(SILAC)和其变体使用质谱以在样品中间对蛋白质进行定量和比较，并且使用结构蛋白、伴侣蛋白或管家酶对生物变异的样品标准化和测量使得众多的样品可被处理和比较。使用串联质量标签(TMT)或用于相对和绝对定量的同量异位素标签(iTRAQ)的同量异位素标记使用质谱以定量和比较蛋白质，以用于对来自细胞和组织裂解物、血清和血浆以及福尔马林固定石蜡包埋组织切片中的蛋白质的肽进行定量。TMT和iTRAQ具有通式结构M-F-N-R，其中M＝质量报告子区域，F＝裂解连接区域，N＝质量标准化区域，并且R＝蛋白质反应性基团。M和N中的各个位置处取代的同位素导致每种标签在M区域中具有不同分子量，在N区域中具有相应质量变化，以便标签的集合具有相同总分子量。仅当TMT经历第二或第三碎片化(如在串联质谱MS/MS或三重质谱MS/MS/MS中)时，其是可区别的，主链碎片化产生序列，并且标签碎片化产生对肽进行定量所需要的质量报告子离子。iTRAQ和TMT共价标记蛋白质消化物中的胺基，并且半胱氨酸反应性TMT标记半胱氨酸的巯基，产生具有独特质量标签的个别消化物。然后将经标记的消化物汇集并且碎片化为肽主链和报告子离子。肽主链离子用以鉴别其所来自的蛋白质。报告子离子用以对组合样品中的每一者中的此蛋白质进行定量。
本领域技术人员已知用于蛋白质定量的不含标记的SILAC、TMT、iTRAQ和其它质谱分析方法用于生物标记物发现中以在包括以下的仪器上生成候选标记物：LTQ Velos(赛默科技(Thermo Scientific))、LTQ Orbitrap Elite(赛默科技)和Q Exactive(赛默科技)混合质谱仪。然后进一步评价候选标记物，并且将其使用选择反应监测(SRM)或选择离子监测(SIM)应用于靶向分析测定中以对许多样品中的肽标记物进行靶向定量。为了确认和验证，如下文所解释，将通用报告子肽U进行定制以用于先前鉴别的标记物，用于用合成稳定同位素标记的肽标准物(HeavyPeptide AQUAplex和其变异，赛默科技)使用现有发现数据以对用于靶向分析的初步选择进行自动化(Pinpoint软件(赛默科技)；TSQ Vantage三级四极质谱仪(赛默科技))而进行绝对定量。将数据输入到用于临床应用的一体式数据管理系统中。
一个具体实施方式是通用报告子肽Uplex同位素物集合，其经合成以向其提供与定制肽类似(例如，±10％到20％)的性质(例如，滞留时间、离子化、最优碎片化能量、检测极限、消化效率等)。在使用此具体实施方式的方法中，通用报告子肽Uplex同位素物集合用以评估消化效率。在使用中，此具体实施方式允许评估蛋白质型肽以及未消化和消化的定制肽和通用报告子肽Uplex同位素物集合。然后将定制和通用肽到个别肽的消化效率用以校正定量的蛋白质型肽的水平，允许对目的蛋白质进行更准确绝对定量和通过针对样品之间的消化效率校正而在样品之间进行更准确定量。
一个具体实施方式是通用肽Uplex同位素物集合的集合。通用肽Uplex同位素物集合的此集合以可预测方式共洗脱。集合中的肽可以或可以不共有公用序列。集合中的肽在独特位置处并有稳定同位素物集合以使得能够对每一者进行特定定量。
一个具体实施方式是通用同位素物肽集合化合物、组合物、配制品和/或试剂盒。在一个具体实施方式中，重同位素物蛋白质型肽集合—报告子肽R可以无水配制。在一个具体实施方式中，重同位素物蛋白质型肽集合—报告子肽R可以在溶液中配制。使重同位素物蛋白质型肽集合—报告子肽R稳定化，并且通过使用本领域技术人员已知的方法将其与非还原糖(例如，山梨糖醇、甘露糖醇等)一起配制而促进溶解。在此形式下，其在阿摩尔(attomole)或飞摩尔(femtomole)量下稳定。在一个具体实施方式中，将重同位素物蛋白质型肽集合—报告子肽R配制为片剂，其可以在环境温度下运输和储存并且在需要用于液体测量时将容易转移到小瓶中。此形式消除了关于肽与管壁的结合非特异性或溶剂蒸发导致肽浓度变化的问题。此具体实施方式减少了所需操作的数目，并且因此减小误差。此具体实施方式促进了自动化。
实施例1
以预定比例的同位素物的含有通用报告子肽Uplex同位素物集合的稳定同位素标记的肽，以及若干与报告子肽串接在一起的肽，用以对临床样品中的蛋白质生物标记物进行检测和定量，其中集中于肺癌的标记物。
为了评估样品制备方法的回收率，在蛋白水解前后，对样品中的人血浆蛋白(LDH、NSE和Myo)的重同位素物标记的合成多肽标准物(包含至多三种蛋白质型肽和通用报告子R)加标。在混合质谱仪仪器(Q Exactive，赛默飞世尔科技(ThermoFisher Scientific))上以SIM模式进行HPLC-MS分析。基于先前鉴别的一系列候选物合成串接参考肽的集合。由赛默飞世尔科技(德国乌尔姆(Ulm Germany))获得合成多肽。
将报告子肽R设计得在C末端处具有胰蛋白酶裂解位点。在肽合成期间，通过使用预定比例的同位素物氨基酸前体的混合物，确定用于通用报告子Uplex肽的同位素物校准曲线标准物。在通过采用1:1化学计量的报告子:靶向分析物串接肽进行胰蛋白酶处理之后，容易测定每种靶向分析物肽与报告子相比的相对响应因子。
选择一组表示肺癌的蛋白质来证实原理证明。为了对特定蛋白质进行精确定量，生成并且分析三种合成串接蛋白质型多肽同位素物混合物，R:A*plex、R:B*plex和R:C*plex。分析来自肺癌患者的血浆样品和对照。
含有通用报告子的串接合成多肽使得能够使用同时多种参考肽，而精确测定样品中所存在的靶向蛋白质的量。用高分辨率MS通过将AUC与通用报告子内标物Uplex的AUC比较，测定在蛋白水解期间释放的报告子肽(R)的绝对量。用高分辨率MS通过将每种靶肽的AUC分别与同位素物内标肽A*plex、B*plex和C*plex的AUC比较，测定样品中的靶分析物肽A、B、C的绝对量。此定量方法容易在大规模靶向蛋白质组研究工作流中实施。
实施例2
含有通用报告子肽R的稳定同位素物标记的肽以及若干串接靶向分析物肽，用以对临床样品中的蛋白质生物标记物进行检测和定量，其中集中于膀胱癌的标记物。
添加来自酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))(ADH、烯醇酶和羧基肽酶)和人类(LDH、NSE、Myo)的外源蛋白质作为尿液样品中的内标物。在蛋白水解之前，对同位素物标记的合成多肽标准物(其是与通用报告子肽R串接的目的蛋白质的蛋白质型肽)加标。通过蛋白质沉淀、还原/烷基化、胰蛋白酶蛋白水解和使用C18滤筒脱盐而制备尿液样品。在蛋白水解之后添加同位素标记的合成肽的第二集合。
在与以复用选择离子监测(mxSIM)模式操作的混合高分辨率MS仪器(Q Exactive，赛默飞世尔科技)联接的RP-HPLC(戴安(Dionex))上进行LC-MS/MS分析。由赛默飞世尔科技(德国乌尔姆)获得合成多肽重同位素物。
为了确定方法，合成含有靶向肽重同位素物和通用报告子R的稳定同位素标记的二肽。将报告子肽R设计得在C末端处具有胰蛋白酶裂解位点。在肽合成中使用氨基酸前体同位素物的预定混合物，确定用于通用报告子肽Uplex的校准曲线。同时，在采用1:1化学计量进行胰蛋白酶处理之后，测定每种肽与报告子相比的相对响应因子。以复用SIM模式(mxSIM)进行LC-MS分析。
为了评价方法，将精确量的参考多肽加标到尿液样品中，用胰蛋白酶消化，并且通过LC-mxSIM进行分析以对靶向人蛋白进行定量。初步结果包括使用两种个别合成稳定同位素标记的肽同位素物集合在通用报告子R：报告子-HEVTGWVLVSPLSK*(SEQ ID NO.20)和报告子-ITVVDALHEIPVK*(SEQ ID NO.21，*-同位素物残基)的情况下，分析尿液样品中的胰岛素样生长因子结合蛋白7。生成汇集的尿液样品的稀释曲线以精确测定相应蛋白质的量。
实施例3
为了进一步证明方法的效用，产生大的合成多肽，由代表目的蛋白质中的每一者的多种肽的串接产生。
选择具有恰当质谱性质(前体m/z、离子化效率、滞留时间、MS/MS光谱)的三种蛋白质型肽/蛋白质以构建串接标准物。这些参考多肽(全部含有通用报告子)允许在一个LC-MS运行中测量多种参考肽的精确量。
实施例4
本发明方法减少了肽合成成本和质谱使用以生成校准曲线，导致仪器使用、操作员时间和加工效率有所节约。为了进一步减少肽合成的成本，合成一种无重同位素的内标肽，并且将此肽用以两倍梯度稀释比(例如4:2:1:0.5:0.25:0.0125)预混合的六种胺反应性三嗪基的质量标签试剂同位素物的集合进行标记。在制备校准曲线时，在一个标记步骤中用预混合的同位素物试剂制备这些不同加标签的肽浓度，并且在LC-MS系统中用高分辨率MS进行分辨。典型校准曲线需要不同肽浓度的六个肽注射，但此处描述的所公开的AQUAplex标签方法将此减少到一个注射。一式三份地(三个复本)进行每个注射。一式三份地生成校准曲线的总LC-MS分析因此是至少三个分析。
合成通用报告子肽X:LVALVR(SEQ ID NO.22)(其中X是目的靶蛋白质的蛋白质型肽并且LVALVR(SEQ ID NO.22)是通用报告子肽)，并且在氨基末端处用以预定比例混合的重同位素物三嗪MS标签集合进行标记。类似地，将已知浓度的通用报告子内标肽U在氨基末端处用以预定比例混合的重同位素物三嗪MS标签集合进行标记。将来自以上的经标记的通用报告子肽和通用报告子内标肽加标到目标分析物样品中，将此混合物用胰蛋白酶消化，并且将所得肽用不含有重同位素的便宜的胺反应性三嗪标签(“轻”标签，图19)进行标记。将最终经消化和标记的混合物注射到LC-MS系统中，所述混合物含有轻标签标记的目标分析物、通用报告子肽(现裂解为同位素物标记的目标内标物和轻标签标记的报告子肽)和通用报告子内标物。三个复制注射足以生成完整校准曲线和对目标分析物进行定量。此方法因此进一步减少了生成校准曲线所需的时间，并且包括充当消化和标记对照的通用报告子肽。
实施例5
同位素标记的蛋白质作为内标物
本发明方法包括使用前体重氨基酸同位素物的预混合集合来合成重蛋白质内标物的集合。用皮尔斯重蛋白质IVT试剂盒(Pierce Heavy Protein IVT Kit，赛默科技，产品号88330)表达重组人类Akt1蛋白激酶。对于此重13C6 15N2赖氨酸，试剂盒补充有1:4比例的重2H8-亮氨酸，以合成重蛋白质同位素物集合(图21a-c)。天然Akt1在用于IVT表达系统的HeLa细胞裂解物中，而重Akt1同位素物根据说明书制作。天然和重Akt1两者都经抗Akt抗体和蛋白A/G涂布的磁珠进行免疫富集。将免疫富集的Akt样品还原，烷基化，用胰蛋白酶消化，并且然后用100-1000fmol的双标记的AKT1AQUA重肽SL(L)SGLL(K)进行加标，其中加括号的氨基酸分别是13C6 15N-亮氨酸和13C6 15N2-赖氨酸(图22)。将这些样品脱盐，并且通过LC-MS/MS在连接到赛默科技Orbitrap XL仪器的15cm长、75μm内部直径的Dionex PepmapC18柱上分析。对于MS分析，15K和100K MS分辨率设置用以对一系列靶向Akt肽进行定量。用赛默科技Xcaliber软件分析所得MS光谱峰，以通过相对定量使用用于绝对定量的SL(L)SGLL(K)重肽内标物来测定天然和重Akt1蛋白质的浓度(图23)。正常分辨率(15K)和高分辨率(100,000K)MS用以分辨重肽同位素异构体以对Akt1特异性肽以及在Akt2和Akt3同工型中保守的Akt肽进行定量。以低分辨率在赛默科技TSQ Vantage三重四极质谱仪上进一步验证轻和重肽的比例。此方法使得能够对蛋白质的所有肽和其具有相应重蛋白质同位素物的同工型进行相对定量，并且其使得能够使用至少一种具有独特可分辨质量的AQUA肽内标物进行绝对定量。
实施例6
同位素标记的肽作为内标物
表1列出了靶向人类尿液和酵母蛋白，和三种所选蛋白质型肽以设计HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex肽。如表1中所示，设计十种HeavyPeptide IGNISTMAQUAplex肽，其对应于九种蛋白质的30种蛋白质型肽(七种人蛋白、三种酵母蛋白)。选择每种HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex肽的稳定同位素标记的氨基酸同位素物集合(纯度>95％，冻干于山梨糖醇中)以具有足以用于MS分析的质量偏移和质量亏损，内源性肽和相应个别合成稳定同位素标记的肽具有以确定比例预混合的C末端精氨酸或赖氨酸同位素物(纯度，冻干，>99原子％同位素富集)；表2列出了鉴别稳定同位素氨基酸重同位素物的HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex肽的全序列。
蛋白质型肽选自蛋白质组研究鸟枪实验。观察的报告数目用作特定蛋白质组中的蛋白质的丰度的替代说明书。通过相对于UniProt数据库对氨基酸序列LVALVR(SEQ IDNO.22)和LVALVK(SEQ ID NO.26)进行blast处理来验证肽报告子的独特性；这些序列与蛋白质不相关。
肽报告子的校准曲线
通过以下方式作出校准曲线：将通用报告子肽Uplex溶液(纯度>97％)与由+0mDa(最左框)、+6mDa、+12mDa、+18mDa、+24mDa、+30mDa、+36mDa和+42mDa的Arg+10Da质量亏损表示的各种同位素标记(R，重精氨酸+10Da，在图7b中使用加框的同位素物)混合。将五μLLVALVR+0mDa(0.5fmol/μL)(SEQ ID NO.22)、15μL LVALVR+6mDa(0.5fmol/μL)(SEQ IDNO.22)、4.5μL LVALVR+12mDa(5fmol/μL)、13.5μL LVALVR+18mDa(5fmol/μL)(SEQ ID NO.22)、40.5μL LVALVR+24mDa(5fmol/μL)(SEQ ID NO.22)、12.2μL LVALVR+30mDa(50fmol/μL)(SEQ IDNO.22)、36.5μL LVALVR+36mDa(50fmol/μL)(SEQ ID NO.22)、109.4μL LVALVR+46mDa(50fmol/μL)(SEQ ID NO.22)和13.6μL 0.1％(v/v)甲酸(于水中)混合以获得250μL的最终体积。这些肽于溶液中的浓度分别是10.0atmol/μL、30.0atmol/μL、90.0atmol/μL、270.0atmol/μL、810.0atmol/μL、2.4fmol/μL、7.3fmol/μL和21.9fmol/μL。LVALVR+10Da(SEQ ID NO.22)的此系列的八种同位素物的理论MS1峰显示，甚至此肽集合的z＝+2电荷态在240,000的MS分辨率下在Q Exactive MS平台上分辨(图20)。此外，复合低分辨率MS峰和高MS分辨率下的独特同位素物质量亏损峰系列的高强度用以验证内标物和提供相关MS区域中的确切质量信息。同位素物系列的高分辨率和准确质量然后用以在低于ppm的质量准确度下计算特定靶分析物的质量补偿，提供实时质量校准数据和验证对靶分析物的定量的特异性。在QExactive平台上通过一个LC-SIM运行一式三份地进行校准曲线的分析。针对报告子肽监测所有这些同位素物峰。
HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex的蛋白水解
用乙腈(ACN)/水(15/85)(体积/体积)溶解每种HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex同位素物肽混合物以获得5pmol/μL的最终蛋白质浓度，并且然后对其超声处理20分钟。在38℃下在搅动(1400rpm)下通过胰蛋白酶1:20(w/w)(赛默科技，伊利诺伊州罗克福德(Rockford IL))个别地消化HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex 3.5小时。通过每15分钟进行反应混合物提取来监测动力学消化。为了停止消化，将所有样品稀释于0.1％v/v甲酸中以获得50fmol/μL的最终肽浓度以用于在LC-MS(以SIM模式)上分析。
对于赛默科技Q Exactive平台上的定量测量，所有HeavyPeptide IGNISTMAQUAplex消化动力学点化学计量地补充有相应合成的稳定同位素标记的和/或稳定同位素物标记的肽和通用报告子肽U＝LVALVR(SEQ ID NO.22)。针对所有肽监测由SIM测定观察到的两种最强MS1电荷态离子。
尿液收集和样品处理
从十名不吸烟的健康志愿者收集随取中段尿液样品，所述志愿者是五名女性和五名男性，年龄在30-40岁范围内。任一受试者都没有肾功能障碍的病史或在样品收集期间的药物施用。将尿液在室温(约19℃-22℃)下每20分钟在1 000g相对离心力(rcf)下离心。将上清液1 000g汇集在一起，在50FalconTM管中分配成等分试样，并且储存在-80℃下。
通过连苯三酚测定估算尿蛋白的量。用1:5比例(v/v)的100％乙腈储备溶液(用于HPLC)使对应于250μg尿蛋白的样品沉淀。在室温下孵育样品过夜。在沉淀之后，将尿液样品在4℃下在14,000g下离心30分钟。将团粒用乙腈洗涤一次，风干，并且用250μL 8M脲和0.1M碳酸氢铵再悬浮。将样品在37℃下用20mM二硫苏糖醇于50mM碳酸氢铵中还原，在800rpm下离心30分钟，然后在37℃下用80mM碘乙酰胺于50mM碳酸氢铵中烷基化，并且在800rpm下离心30分钟。将体积样品用100mM BA调节在2M脲下。然后在37℃下用胰蛋白酶(赛默科技，伊利诺伊州罗克福德)使用1:20(w/w)的比例消化样品过夜。通过添加甲酸获得pH 2-3而停止消化。将Sep-Pak C18反相滤筒100mg(沃特斯(Waters)，马萨诸塞州米尔福德(MilfordMA))用以在蛋白质消化之后清洁样品和对其脱盐。将肽使用1mL的50％乙腈和0.1％甲酸洗脱，干燥，并且存储在-20℃下直到LC-MS分析。
尿液样品中的HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex的校准曲线
在消化的汇集尿液样品(1ug/mL尿蛋白)的混合物中，作出来自消化的HeavyPeptide IGNISTM的重蛋白质型肽的稀释曲线，所述混合物含有各自是100ng/mL的三种消化的外源性酵母蛋白(羧基肽酶Y、烯醇酶1和醇脱氢酶1)。每个稀释系列对应于跨越0.002fmol/μL到40fmol/μL范围内的浓度的三个数据点。通过iSR使用来自消化的HeavyPeptide IGNISTM AQUAplex的重蛋白质型肽，测定加标的消化的酵母蛋白和人尿蛋白的蛋白质水平。
LC-MS条件
在Q Exactive质谱仪(赛默飞世尔，加利福尼亚州圣何塞(San Jose CA))上分析尿和酵母胰蛋白酶肽。仪器配备有纳米电喷雾离子源。在以纳米流模式操作的Ultimate3000(戴安，荷兰(Netherlands))高效液相色谱仪上进行肽的色谱分离。将样品装载于捕集柱(Acclaim PepMap C18，3μm，0.075×20mm，戴安)上，并且在与维持在1.2kV下的PicoTipTM电喷雾发射器(30μm)(New Objective，马萨诸塞州沃本(Woburn MA))联接的分析柱(Acclaim RSLC C18，2μm，0.075×150mm，戴安)上分离。将柱温度固定在35℃下。以乙腈/水的线性梯度(含有0.1％甲酸)在300nL/min的流动速率下分离肽。在33分钟中使用2％到35％乙腈的梯度。注射一μL的每种样品。
申请人以引用的方式并入随附计算机可读序列表中所含的材料，所述序列表标识为073986_281.txt，文件创建日期是2014年6月5日下午1:41，并且文件大小是19.4千字节。
说明书中展示和描述的具体实施方式仅是作为本领域的技术人员的发明人的特定具体实施方式并且不以任何方式具限制性。因此，可以在不脱离本发明精神的情况下在以上权利要求书的范围中对那些实施例作出各种改变、修改或变更。
所有参考文献都明确地以全文引用的方式并入本文中。
　　 序列表
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　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 25
　　Ser Gly Ser Val Ile Asp Gln Ser Arg
　　1 5
　　<210> 26
　　<211> 6
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 26
　　Leu Val Ala Leu Val Lys
　　1 5
　　<210> 27
　　<211> 41
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 27
　　Asp Trp Val Ser Val Val Thr Pro Ala Arg Asp Ser Thr Ile Gln Val
　　1 5 10 15
　　Val Glu Asn Gly Glu Ser Ser Gln Gly Arg Ser Gly Ser Val Ile Asp
　　 20 25 30
　　Gln Ser Arg Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 35 40
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　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 28
　　Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys
　　1 5 10
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　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 29
　　Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys
　　1 5 10
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　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 30
　　Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg
　　1 5 10
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　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 31
　　Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr
　　1 5 10 15
　　Trp Asp Asn Leu Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg
　　 20 25 30
　　Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 35
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　　<220>
　　<221> 来源
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　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 33
　　Ser Asp Leu Ala Val Pro Ser Glu Leu Ala Leu Leu Lys
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　　<220>
　　<221> 来源
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　　<400> 34
　　Glu Leu Ser Glu Ala Leu Gly Gln Ile Phe Asp Ser Gln Arg
　　1 5 10
　　<210> 35
　　<211> 44
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 35
　　Leu Ala Asp Gly Gly Ala Thr Asn Gln Gly Arg Ser Asp Leu Ala Val
　　1 5 10 15
　　Pro Ser Glu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Leu Ser Glu Ala Leu Gly Gln
　　 20 25 30
　　Ile Phe Asp Ser Gln Arg Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 35 40
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　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
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　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
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　　Phe Ala Gly Val Phe His Val Glu Lys
　　1 5
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　　<211> 12
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 37
　　Tyr Gly Phe Ile Glu Gly His Val Val Ile Pro Arg
　　1 5 10
　　<210> 38
　　<211> 10
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 38
　　Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg
　　1 5 10
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　　<211> 37
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 39
　　Phe Ala Gly Val Phe His Val Glu Lys Tyr Gly Phe Ile Glu Gly His
　　1 5 10 15
　　Val Val Ile Pro Arg Ala Leu Ser Ile Gly Phe Glu Thr Cys Arg Leu
　　 20 25 30
　　Val Ala Leu Val Arg
　　 35
　　<210> 40
　　<211> 13
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 40
　　Leu Val Asp Gln Asn Ile Phe Ser Phe Tyr Leu Ser Arg
　　1 5 10
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　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
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　　Val Ser Thr Leu Pro Ala Ile Thr Leu Lys
　　1 5 10
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　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 42
　　Tyr Ser Gln Ala Val Pro Ala Val Thr Glu Gly Pro Ile Pro Glu Val
　　1 5 10 15
　　Leu Lys
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　　<211> 47
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 43
　　Leu Val Asp Gln Asn Ile Phe Ser Phe Tyr Leu Ser Arg Val Ser Thr
　　1 5 10 15
　　Leu Pro Ala Ile Thr Leu Lys Tyr Ser Gln Ala Val Pro Ala Val Thr
　　 20 25 30
　　Glu Gly Pro Ile Pro Glu Val Leu Lys Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 35 40 45
　　<210> 44
　　<211> 11
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
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　　<400> 44
　　Thr Val Gly Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Lys
　　1 5 10
　　<210> 45
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　　<212> PRT
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　　<220>
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　　Tyr Phe Ile Asp Phe Val Ala Arg
　　1 5
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　　<211> 15
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 46
　　Tyr Asn Ser Gln Asn Gln Ser Asn Asn Gln Phe Val Leu Tyr Arg
　　1 5 10 15
　　<210> 47
　　<211> 40
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
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　　<400> 47
　　Thr Val Gly Ser Asp Thr Phe Tyr Ser Phe Lys Tyr Phe Ile Asp Phe
　　1 5 10 15
　　Val Ala Arg Tyr Asn Ser Gln Asn Gln Ser Asn Asn Gln Phe Val Leu
　　 20 25 30
　　Tyr Arg Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 35 40
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　　<211> 16
　　<212> PRT
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　　<220>
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　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 48
　　Leu Leu Leu Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Phe Arg
　　1 5 10 15
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　　<211> 8
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　　<213> 人工序列
　　<220>
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　　<400> 49
　　Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr Arg
　　1 5
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　　<211> 8
　　<212> PRT
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　　<220>
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　　<400> 50
　　Ser Asp Val Phe Glu Ala Trp Arg
　　1 5
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　　<213> 人工序列
　　<220>
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　　<400> 51
　　Leu Leu Leu Thr Ser Ala Pro Ser Leu Ala Thr Ser Pro Ala Phe Arg
　　1 5 10 15
　　Tyr Asp Leu Leu Asp Leu Thr Arg Ser Asp Val Phe Glu Ala Trp Arg
　　 20 25 30
　　Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 35
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　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 52
　　Asn Val Asn Asp Val Ile Ala Pro Ala Phe Val Lys
　　1 5 10
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　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
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　　<400> 53
　　Leu Gly Ala Asn Ala Ile Leu Gly Val Ser Leu Ala Ala Ser Arg
　　1 5 10 15
　　<210> 54
　　<211> 17
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
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　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 54
　　Thr Ala Gly Ile Gln Ile Val Ala Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro
　　1 5 10 15
　　Lys
　　<210> 55
　　<211> 50
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 55
　　Asn Val Asn Asp Val Ile Ala Pro Ala Phe Val Lys Leu Gly Ala Asn
　　1 5 10 15
　　Ala Ile Leu Gly Val Ser Leu Ala Ala Ser Arg Thr Ala Gly Ile Gln
　　 20 25 30
　　Ile Val Ala Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Leu Val Ala Leu
　　 35 40 45
　　Val Arg
　　 50
　　<210> 56
　　<211> 9
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 56
　　Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Ser Gln Lys
　　1 5
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　　<211> 6
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 57
　　His Phe Thr Tyr Leu Arg
　　1 5
　　<210> 58
　　<211> 9
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 58
　　Ala Trp Thr Asp Val Leu Pro Trp Lys
　　1 5
　　<210> 59
　　<211> 30
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 59
　　Tyr Asp Glu Glu Phe Ala Ser Gln Lys His Phe Thr Tyr Leu Arg Ala
　　1 5 10 15
　　Trp Thr Asp Val Leu Pro Trp Lys Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 20 25 30
　　<210> 60
　　<211> 10
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 60
　　Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His Gly Lys
　　1 5 10
　　<210> 61
　　<211> 12
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 61
　　Ser Ile Gly Gly Glu Val Phe Ile Asp Phe Thr Lys
　　1 5 10
　　<210> 62
　　<211> 13
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的肽"
　　<400> 62
　　Val Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile Tyr Glu Lys
　　1 5 10
　　<210> 63
　　<211> 41
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 62
　　Gly Val Ile Phe Tyr Glu Ser His Gly Lys Ser Ile Gly Gly Glu Val
　　1 5 10 15
　　Phe Ile Asp Phe Thr Lys Val Val Gly Leu Ser Thr Leu Pro Glu Ile
　　 20 25 30
　　Tyr Glu Lys Leu Val Ala Leu Val Arg
　　 35 40
　　<210> 64
　　<211> 8
　　<212> PRT
　　<213> 人工序列
　　<220>
　　<221> 来源
　　<223> /注="人工序列的描述: 合成的多肽"
　　<400> 64
　　Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Lys
　　5

Claims (13)

1.一种组合物，其包含以重同位素标记的多种分离肽的至少一个第一预混合集合，其中所述集合内的每种肽具有相同氨基酸序列和相同标称质量，并且所述集合内的肽相差毫道尔顿质量亏损，所述质量亏损通过在氨基酸序列内的不同原子上以重同位素与所述序列的固定比例并入重同位素而产生，其中所述重同位素选自13C-、15N-、18O-、34S-或2H-。
2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含用重同位素标记的多种分离肽的至少一个额外预混合集合，所述集合与第一集合具有不同的氨基酸序列，其中每个额外集合内的肽具有相同氨基酸序列和相同标称质量，并且所述集合内的肽相差毫道尔顿质量亏损，所述质量亏损通过在氨基酸序列内的不同原子上并入重同位素而产生，其中所述重同位素选自13C-、15N-、18O-、34S-或2H-。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中至少一个第一集合中的重同位素标记的肽以不同浓度存在。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中至少一个额外集合中的重同位素标记的肽以不同浓度存在。
5.一种质谱(MS)校准方法，所述方法包括
使用以重同位素标记的多种分离肽的至少一个第一预混合集合基于毫道尔顿质量亏损生成用于MS分析的校准曲线，其中第一集合内的每种重同位素标记的肽具有相同氨基酸序列和相同标称质量，并且所述集合内的肽相差毫道尔顿质量亏损，所述质量亏损通过在氨基酸序列内的不同原子上以重同位素与所述序列的固定比例并入重同位素而产生，其中所述重同位素选自13C-、15N-、18O-、34S-或2H-；和
以高分辨率MS分离混合的重同位素标记的肽，并使用所述分离结果用于MS校准。
6.一种质谱(MS)校准方法，所述方法包括
将单个肽组合物注射到与质谱检测系统联接的第一液相色谱(LC)柱，所述单个肽组合物包含以重同位素标记的多种分离肽的至少一个第一集合，其中第一集合内的每种重同位素标记的肽具有相同氨基酸序列和相同标称质量，并且进一步地，其中第一集合内的每种重同位素标记的肽相差毫道尔顿质量亏损，所述质量亏损通过在至少一个氨基酸分子内的不同原子上并入重同位素而产生，其中所述重同位素选自13C-、15N-、18O-、34S-或2H-；
通过质谱分析共洗脱的肽组合物中的每种肽；
从注射到LC柱的单个肽组合物生成所述分析的至少第一校准曲线；和
使用至少第一稀释曲线的结果评定MS设备的灵敏度。
7.根据权利要求5所述的方法，其中至少一个第一集合中的每种重同位素标记的肽以不同浓度存在。
8.根据权利要求5所述的方法，其中在以高分辨率MS分离之前以低分辨率MS分离混合的重同位素标记的肽。
9.根据权利要求5所述的方法，其中所述校准曲线是标准曲线。
10.根据权利要求5所述的方法，其中所述校准曲线是稀释曲线。
11.根据权利要求6所述的方法，其中至少一个第一集合中的每种重同位素标记的肽以不同浓度存在。
12.根据权利要求6所述的方法，其中所述校准曲线是标准曲线。
13.根据权利要求6所述的方法，其中所述校准曲线是稀释曲线。
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