JP5588584B2 - 修飾ペプチドの定量化方法 - Google Patents
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Description
読み取りとして質量分析法を使用して実行すると、このアプローチはただ一つの実験で数百ないし数千のリン酸化部位の定量化を許容する。例えば、安定同位体での代謝性の標識付けを使用して(SILACアプローチ)、EFGでヒーラ細胞を処理したときに異なるレベルの発現を示す2000よりも多いリン酸化部位の定量化が可能であった(Olsen, J.V. 他、 Cell 127, 635-648 (2006))。しかしながら、細胞が標識されたアミノ酸類を取り入れるために代謝的に活性である必要があるので、1次組織による細胞シグナリングを定量化する一般的ツールとしてこのアプローチを使用できない。また、少ないスループットは有用性を制限する。
(a) サンプルからペプチド類を得る;
(b) 工程(a)で得られたペプチド類に参照修飾ペプチド(reference modified peptides)を追加し、ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物を製造する;
(c) ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物について質量分析法(MS)を行い、サンプル中のペプチド類に関連したデータを得る;および
(d) 修飾ペプチドに関するデータベース内のデータと、サンプル中のペプチド類に関連するデータを、コンピュータプログラムを使用して比較する;
ここで、修飾ペプチドに関するデータベースが、以下を含む方法によってコンパイルされる:
i) サンプルからペプチド類を得る;
ii) 工程(i)で得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する(enriching);
iii) 工程(ii)で得られた富化された修飾ペプチドについて液体クロマトグラフィータンデム質量分析法(LC−MS/MS)を行う。
iv) 修飾ペプチドを同定するために、工程(iii)で検出された修飾ペプチドを、既知のリファレンスデータベースと比較する;および
(v) 工程(iv)で同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。
(1)サンプルに細胞を溶解する;
(2)工程(1)で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する;および
(3)前記タンパク質をペプチド類に分解する。
(i)サンプルからペプチド類を得る;
(ii)工程(i)で得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する;
(iii)工程(ii)で得られた富化された修飾ペプチドに液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析法(LC−MS/MS)を行う;
(iv)修飾ペプチドを同定するために、工程(iii)で検知された修飾ペプチドと、既知のリファレンスデータベースを比較する;および
(v)工程(iv)で同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。
(1)サンプルの細胞を溶解する;
(2)工程(1)で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する;および
(3)上記の工程(a)の工程(3)と同じ方法を使用して、前記タンパク質をペプチド類に分解する。
本発明のこの実施態様の工程(2)では、タンパク質は工程(1)で得られた溶解細胞から抽出される。言い換えれば、タンパク質は溶解細胞の他の成分から分離される。
そのような抗体は、固体マトリックスに結合されて、次に、アセチル化アミノ酸残基に特異的に結合する抗体の能力によって富化される。そして、アセチル化ペプチドが固定された抗体の上に保持されるのに対して、非アセチル化ペプチドは洗浄除去される。
1. Olsen, J.V. 他、 Cell 127, 635-648 (2006)
2. Cutillas, P.R 他、 Mol Cell Proteomics 4, 1038-1051 (2005)
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4. Ross, P.L. 他、 Mol Cell Proteomics 3, 1154-1169 (2004)
5. Gerber, S.A. 他、Proc Natl Acad Sci U S A 100, 6940-6945 (2003)
6. Barglow, K.T. & Cravatt, B.F. Nat Methods 4, 822-827 (2007)
7. Cutillas, P.R. 他、 Proc Natl Acad Sci U S A 103, 8959-8964 (2006)
(a)サンプルからペプチド類を得る;
(b)任意に、工程(a)で得られたペプチド類に参照りん酸化ペプチドを追加して、ペプチド類と参照りん酸化ペプチドとの混合物を形成し、工程(b)で得られたペプチド類と参照りん酸化ペプチドとの混合物からりん酸化ペプチドを富化し、りん酸化ペプチドが富化された混合物を形成する;
(c)ペプチド類と参照りん酸化ペプチドとの混合物、またはりん酸化ペプチドが富化された混合物について質量分析(MS)を行い、サンプル中のペプチド類に関するデータを得る;および
(d)サンプル中のペプチド類に関するデータを、りん酸化ペプチドに関するデータベース内のデータと、コンピュータプログラムを使用して比較する;
ここで、りん酸化ペプチドに関するデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる:
(i)サンプルからペプチド類を得る;
(ii)工程(i)で得られたペプチド類からりん酸化ペプチドを富化する;
(iii)工程(ii)で得られた富化されたりん酸化ペプチドについて液体クロマトグラフ−タンデム質量分析法(LC−MS/MS)を行う;
(iv)りん酸化ペプチドを同定するために工程(iii)で検出されたりん酸化ペプチドを既知のリファレンスデータベースと比較する;
(v) 工程(iv)で同定されたりん酸化ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。
1; ホスファターゼ阻害剤による処理は、リン酸化の化学量論量を増加させ、データベースに含むことができる多量のりん酸化ペプチドに帰結する。
2; プロテアーゼは、典型的にはトリプシン、キモトリプシン、Arg−C、ペプシン、V8、Lys−C、Asp−CまたはAspNである。
3; 多次元的クロマトグラフが、典型的には強カチオン交換を利用する、高速液クロマトグラフ(HPLC)、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)、および二酸化チタン(TiO2)クロマトグラフィーを使用するか、または陰イオン交換を利用する高速液クロマトグラフ(HPLC)、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)および二酸化チタン(TiO2)クロマトグラフィーを使用して行われる。代替手段としては、抗体ベースの方法を使用できる。
4; 生物試料は適当な生物試料で、典型的には細胞ライン(任意に研究薬剤で処理される)であるか、または動物または患者からの1次組織である。
比較できるサンプル数の限界はない。
5; 内部標準は、参照りん酸化ペプチドであり、比較されるサンプルのそれぞれに既知量で追加される。内因のりん酸化ペプチドの信号は、川下の分析で内部標準ペプチドに関する信号に対して規格化される。
(A)実験設計を示す;
(B)得られたデータ(4つの非依存性の生物学的複製)のまとめを与え、確率によって分類されたデータのスナップを撮る(snapshot)。
(C)プロテインホスファターゼ1(PP1)制御サブユニット11からのりん酸化ペプチドの抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)の例である。
(D)PI3Kの川下に先に示されたタンパク質のリン酸化部位の例を示す。
(B)は、同じ細胞ラインに本発明の方法を使用したりんペプチドの定量化の結果を示している。表はりんペプチドと正の相関(より抵抗力がある細胞ラインの高いリン酸化)を示している。
(A)MSスペクトルは、m/z = 751.33939, tR=54.54 分、z = 3に、ミトジェン活性化プロテインキナーゼ3 (mitogen-activated protain kinase:pERKl) ペプチド(IADPEHDHTGFLTEpYVATR)を示している。
(B)この質量/電荷数±25ppmの抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)は4
つの可能な候補をもたらす。
(C); 追加の荷電および同位体分布制限を適用した後に、このペプチドのクロマトグラフ溶出ピークを明確に同定できる(図では、矢印で示される)。なぜなら、最初の3つの同位体のためのXICsにはスペクトルに示されたものに対応する相対強度がある(また、配列データから同位体の相対強度について計算できる)からである。
(D); 更なる特異性は、XICが組み立てられる質量窓(mass window)を狭くする(±7ppm)ことによって、達成される。
本発明の新規な定量化技術は、NIH−3T3線維芽細胞中のリン酸化部位を定量化するのに使用された。3T3線維芽細胞は、飢餓状態にされ(starved)、ついでpan−PI3K阻害剤ウォルトマンニン(wortmannin:WM)の存在下でのプレインキュベーションをしたものとしないものについて、血清によって刺激された。
これらの実験が4回行われた。
本発明のテクニックは、PI−103、脂質キナーゼPBK、およびプロテインキナーゼmTOR阻害剤へある範囲の鋭敏度を有する細胞ラインのパネル内のキナーゼ経路をプロファイルするのに使用された。図4Aに示されたパネルの細胞ラインは、PI−103を滴定してインキュベートされた。その増殖速度が阻害剤濃度の関数として測定された。阻害剤濃度は50%抑制濃度(IC50)として、マイクロモル単位の濃度で示された(図4A)。
分析法
この実施例に使用されるTIQUASアプローチは、先にLC−MS/MSによって同定されたりんペプチドの定量化を目的としたLC−MSの使用から成る。この分析は、本明細書に記載されたコンピュータプログラムPESCAL(Cutillas, P. R.; Vanhaesebroeck, B. MoI Cell Proteomics 6(9), 1560-73, 2007)を使用することで自動化されている。PESCALは所定の分子状イオンの最初の3つの同位体の抽出されたイオンクロマトグラム(XIC)を実行する。これはペプチドイオンの電荷の識別と、次に理論上の同位体分布と相関されることができる同位体の相対強度の計算の両方を許容する。
AML発達、すなわちJAK、MEKおよびPI3K系路について重要なキナーゼのための阻害剤のパネルへの8個のAML細胞ラインの反応が調査された。細胞はLY294002、PIl03、およびIC87114(主要標的としてPI3Kを有する阻害剤)、MEK阻害剤(MEK I、Calbiochem)、JAK阻害剤(JAK I、Calbiochem)、およびFLT3阻害剤(Calbiochem)の濃度を増大させて細胞を処理した。これらのキナーゼはすべてさまざまの型の癌腫の処理のための潜在的薬物標的である。しかしながら、細胞をそれらの阻害に影響されやすくする原因となる機構は不十分にしか理解されていない。患者が制癌剤に異なった程度で応じるかもしれない臨床的症状を反映し、これらのキナーゼ阻害薬の関数としての我々のパネルの細胞ラインの増殖は、さまざまな鋭敏度を示す。
細胞培養
急性骨髄白血病細胞ライン(AML−193、CMK、CTS、HEL、Kasumi-1、KG−1、MV4−11、およびP31/FUJ)とネズミのNIH/3T3線維芽細胞は10%のウシ血清、100単位/mlのペニシリン、100マイクロg/mlのストレプトマイシンが補われた培地で、5%のCO2の湿気のある環境の中、37℃で培養された。AML細胞ラインは、RPMI中、約5から10×105細胞/ミリリットルで、50マイクロモルのβ−メルカプトエタノールを追加補充して維持された。NIH3T3線維芽細胞はDMEM培地で育てられた。
96ウエルプレートで1×105細胞/ミリリットルで、8個の細胞ライン(AML193、CMK、CTS、HEL、Kasumi−1、KG−1、MV4−11、およびP31/FUJ)をシードした。それぞれの条件について3回実験した。2時間の回収時間の後、細胞は増大する濃度(1nM、10nM、100nM、1マイクロMおよび10マイクロM)のFLT3阻害剤、MEK I阻害剤、JAK I阻害剤、LY294002、PI−103、およびIC87114で処理された。コントロールとして、細胞は、ビヒクル(DMSO)で処理されたものと、未処理のものが利用される。72時間の処理の後に、MTSアッセイ (CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation assay, Promega Corporation, Madison, WI, USA)によって細胞生存率が評価された。
サンプルの還元とアルキル化は、暗闇の中の4.1mM DTTおよび8.3mMヨードアセトアミドで室温でそれぞれ15分間、実行された。HEPES pH8.0と2M尿素でサンプルを希釈した後に、トリプシン処理が、5×106細胞あたり10TAME単位の固定されたTLCK−トリプシンを使用して、37℃で16時間行われた。消化は、1%の終末濃度でTFAを加えて停止された。得られたペプチド溶液は、メーカーガイドラインにより、Sep-Pak C18カラムを使用して脱塩した(Waters UK Ltd, Manchester, UK) 。ペプチド溶出は5mlの50%ACN/0.1%TFAで行われた。
りんペプチド分離は、改良されたIMAC富化実験計画書(Alcolea、M.P.他、JProteome Res8(8)、3808(2009))を使用することで達成された。要約すれば、それぞれのサンプルは30分間、室温で、300マイクロリットルのFe(III)−コーティングされたセファロース高性能ビーズを、50%ACN/0.1%TFA中50%のスラリーとして使用して、インキュベートされた。非結合のペプチド類は捨てられ、ビーズは二度50%ACN/0.1%TFAの300マイクロリットルで洗浄された。富化されたりんペプチド画分は300マイクロリットルの1.5%アンモニア水、pH11で溶離された。50%のACNを含む50マイクロリットルの1.5%アンモニア水、pH11で第2の溶出が行われ、さらに富化された。溶出されたペプチド類は、SpeedVacで最終的に乾燥され、−80℃で貯蔵された。
ホスホプロテオミック実験において、乾燥されたりんペプチド富化サンプルは、0.1%のTFAの10マイクロリットルに溶解され、LC−MS/MS装置で分析した。後者は約3000psiの操作背圧で5マイクロリットル/分(ロード)が供給され、400nL/分(溶離)を有する、ナノフロー高速液体クロマトグラフィー(nanoAcquity、Waters/Micromass)にオンラインで接続されたLTQ−Orbitrap XL質量分析計(Thermo Fisher Scientific, Hemel Hempstead, UK) から成る。分離は100μm×100mmののBEHカラム(Waters/Micromass)で実行された。移動相は溶液A、LC−MSグレード水中の0.1%FA、および溶液B、LC−MSグレードACN中の0.1%FAであった。操作勾配は、100分で1%のBから35%のBにし、85%のBで5分間洗浄し、1%のBで7分間平衡させた。完全なスキャン調査スペクトル(m/z350−1600)は、LTQ−Orbitrap XLでm/z 400で、60000の解像度で取得された。データ依存分析(DDA)が利用され、調査スペクトルに存在している5つの最も豊富な多価イオンが、衝突誘起解離(衝突エネルギーを35%に規格化した)によって自動的に質量選択され断片化された。5つのMS/MSスキャン(m/z 50−2000)がMSスキャンのあとに続いた。ダイナミックな除外は500のエントリーに制限された除外リスト、10ppmの質量窓と40秒の除外時間(exclusion duration)により可能にされた。
LTQ−Orbitrap MS/MS データは平滑化されて、Mascot Distillerを使用することでセントロイドされた(centroided)。処理されたファイルは、国際タンパク質インデックス(IPI マウス v3.49, 165169 配列および IPI ヒト v3.56, 76539 配列) をMascotサーチエンジンを使用することで人間またはマウス配列ライブラリに対して検索された。検索はMascot Daemon(v2.2.2; Matrix Science、London,UK)で自動化された。パラメータは、消化酵素としてトリプシンを選び、1回の失敗は許容され、固定された修飾としてカルバミドメチル(C)が設定され、ピロ−グル(Pyro−glu)(N−term)、オキシデェィションまたは酸化(Oxidation)(M)、ホスホ(Phospho)(STY)は可変修飾である。データセットは±7ppmの質量許容度と±800mmuの断片質量許容度で検索された。統計的に有意な閾値(期待値<0.05)(Mascotによって返される)を超えていたとき、ヒットは有意であると考えられた。おとりのデータベースに対する検索で見積もられている偽陽性率は、約2%であった。これらもMascotによって返されて、また、phosphoELMデータベースにも存在していたとき、修飾部位が報告される。そうでない場合には、修飾の場所があいまいであると考えられた。そのような場合には、りんペプチドはタンパク質配列中の、スタート端残基(start-end residue)として報告される。
Claims (19)
- 以下を含む、サンプル中の修飾ペプチドの定量化方法:
(a)サンプルからペプチド類を得る;
(b)工程(a)で得られたペプチド類に参照修飾ペプチドを追加して、ペプチド類と参照修飾ペプチドとの混合物を形成する;
(c)ペプチド類と参照修飾ペプチドとの混合物について質量分析(MS)を行い、サンプル中のペプチド類に関するデータを得る;および
(d)サンプル中のペプチド類に関するデータを、修飾ペプチドに関するデータベース内のデータと、コンピュータプログラムを使用して比較する;
ここで、修飾ペプチドに関するデータベースは、以下を含む方法によってコンパイルされる:
(i)サンプルからペプチド類を得る;
(ii)工程(i)で得られたペプチド類から修飾ペプチドを富化する;
(iii)工程(ii)で得られた富化された修飾ペプチドについて液体クロマトグラフ−タンデム質量分析法(LC−MS/MS)を行う;
(iv)修飾ペプチドを同定するために工程(iii)で検出された修飾ペプチドを既知のリファレンスデータベースと比較する;
(v) 工程(iv)で同定された修飾ペプチドに関連するデータをデータベースにコンパイルする。 - 前記修飾ペプチド類がリン酸化ペプチド類である、請求項1記載の方法。
- 前記サンプルが細胞ラインまたは一次組織である、請求項1または2記載の方法。
- 前記工程(a)が以下を含む、請求項1から3のいずれか1項記載の方法:
(1)サンプルに細胞を溶解する;
(2)工程(1)で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する;および
(3)前記タンパク質をペプチド類に分解する。 - 前記工程(3)が、プロテアーゼを使用して行われる、請求項4記載の方法。
- 前記プロテアーゼがトリプシン、キモトリプシン、Arg−C、ペプシン、V8、Lys−C、Asp−C、およびAspNから成る群から選択される、請求項5記載の方法。
- 前記工程(3)は、5から30のアミノ酸類のペプチド類まで前記タンパク質を分解することを含む、請求項4から6のいずれか1項記載の方法。
- 前記工程(b)が、前記ペプチド類と参照修飾ペプチドの混合物から修飾ペプチドを富化し、富化された修飾ペプチドの混合物を製造し、工程(c)は、該富化された修飾ペプチドの混合物に質量分析法(MS)を行い、サンプル中の修飾ペプチド類に関連したデータを得ることを含む、請求項1から7のいずれか1項記載の方法。
- 前記工程(b)における修飾ペプチドの富化工程が、クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項8記載の方法。
- 前記クロマトグラフィーは固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)、二酸化チタン(TiO2)クロマトグラフィー、および二酸化ジルコニウム(ZrO2)クロマトグラフィーから成る群から選択される、請求項9記載の方法。
- 前記工程(b)における修飾ペプチドの富化工程が、抗体に基づく方法で行われる、請求項8記載の方法。
- 前記サンプル内のペプチド類に関連するデータが、(質量/電荷)比(m/z)、電荷(z)、ペプチド類の相対保持時間である、請求項1から11のいずれか1項記載の方法。
- 前記工程(c)における前記質量分析法(MS)は液体クロマトグラフィー−質量分析法(LC−MS)である、請求項1から12のいずれか1項記載の方法。
- 前記工程(i)が以下を含む、請求項4から7のいずれか1項記載の方法:
(1)サンプルに細胞を溶解する;
(2)工程(1)で得られた溶解細胞からタンパク質を抽出する;および
(3)前記タンパク質を請求項4の工程(3)に記載されたものと同じ方法でペプチド類に分解する。 - 前記工程(ii)が、多次元クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項1から14のいずれか1項記載の方法。
- 前記多次元クロマトグラフィーが、強カチオン交換高速液クロマトグラフィー(SCX−HPLC)、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)、または二酸化チタン(TiO2)クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項15記載の方法。
- 前記多次元クロマトグラフィーが、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィー(SAX−HPLC)、固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC)、または二酸化チタン(TiO2)クロマトグラフィーを使用して行われる、請求項15記載の方法。
- 前記工程(ii)が、抗体に基づく方法を使用して行われる、請求項14記載の方法。
- 前記修飾ペプチドに関連するデータが、修飾ペプチドの同定、(質量/電荷)比(m/z)、電荷(z)、および相対保持時間から成る群から選択される、請求項1から18のいずれか1項記載の方法。
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