CN104931705A - 一种细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法。它通过将细胞内的蛋白质进行稳定同位素的重标标记来区分纳米粒子上吸附的其他蛋白质。通过鸟枪法蛋白质组学技术进行检测时，得到的由包含稳定同位素标记的肽段鉴定到的蛋白和由不含稳定同位素标记的肽段鉴定到的蛋白分别来自细胞和血浆，从而可以准确的鉴定和分辨细胞内纳米粒子表面的蛋白质环冠的组成成分。该方法第一次实现了细胞内纳米材料表面吸附的蛋白质环冠的分析和鉴定，识别了来自不同生物学系统的蛋白质，且简单方便，易于操作，对于纳米材料与蛋白质相互作用的研究提供了新的方法和平台，推动了纳米药物的发展。

Description

一种细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法
技术领域
本发明属于生物纳米医药领域，具体涉及一种细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记的分析方法。
背景技术
近年来，纳米材料因其独特的性质被广泛用作药物和基因载体。研究表明，纳米材料可以综合多靶向定位，传感，诊断和治疗等功能于一体且几乎可以到达生物体的任何部位，从而进入肿瘤细胞内部进而杀死肿瘤细胞（文献1.Moghimi,S.M.;Hunter,A.C.;Murray,J.C.Nanomedicine:Current status and future prospects,Faseb Journal，2005,19,311-330.）。然而，当纳米材料进入生理环境（血液或细胞）时，其表面会迅速被蛋白质覆盖，形成蛋白质环冠（文献2.Lynch,I.;Dawson,K.A.Protein-nanoparticle interactions,Nano Today2008,3,40-47.文献3.Lundqvist,M.;Stigler,J.;Elia,G.;Lynch,I.;Cedervall,T.;Dawson,K.A.Nanoparticle size and surface properties determine theprotein corona with possible implications for biological impacts,Proc.Natl.Acad.Sci.2008,105,14265-14270.）。由于蛋白质环冠在纳米材料表面的吸附，使得材料的尺寸、聚集状态及其表面性质发生改变，同时导致其生物识别性质区别于材料的自身性质（材料合成时所具有的表面化学性质、大小、形状）（文献4.Lynch,I.;Salvati,A.;Dawson,K.A.Protein-nanoparticle interactions what does the cell see?,Nat.Nanotechnol.2009,4,546-547.）。纳米材料的生物识别性质是被生物大分子、细胞、生物界面等识别的材料的形态，决定了材料在生理系统内的运输和活性等，更是引起纳米材料在生物体内的生理反应的决定因素(文献5.Nel,A.E.,et al.,Understanding biophysicochemicalinteractions at the nano-bio interface,Nature Materials,2009,8,543-55.)。只有真正了解纳米材料与蛋白质之间的相互作用机制才能有效的控制纳米材料在生命医药领域的应用，否则可能会导致其错误的靶向正常细胞引起生物体的毒性，因此，有效的控制纳米材料与生命系统之间的相互作用是纳米药物面临的最基本的考验。
纳米材料表面吸附的蛋白质环冠根据蛋白质与纳米材料结合力的强弱，被分为两部分：动态变化快且与纳米材料结合力较弱的“软”蛋白质吸附层；以及不易从材料表面解离的与纳米材料结合力较强的“硬”蛋白质吸附层。其中，仅由一小部分蛋白组成的“硬”蛋白质吸附层环冠是纳米材料表面蛋白质环冠的主要组成部分，对于纳米材料在生物体内的命运起到关键性作用（文献6.Deng,Z.J.;Mortimer,G.;Schiller,T.;Musumeci,A.;Martin,D.;Minchin,R.F.,Differential plasma proteinbinding to metal oxide nanoparticles.Nanotechnology,2009,20(45),455101.文献7.Sund,J.;Alenius,H.;Vippola,M.;Savolainen,K.;Puustinen,A.,Proteomic Characterization of EngineeredNanomaterial-Protein Interactions in Relation to Surface Reactivity.Acs Nano,2011,5(6),4300-4309.）。目前，对于纳米材料表面吸附蛋白质“硬”吸附层的研究主要是围绕聚合物、二氧化硅、金属纳米粒子等纳米材料在特定生物学系统（如血清、血浆或细胞蛋白提取液等）中形成的蛋白质环冠进行体外实验。研究表明，纳米材料表面形成的蛋白质环冠受到多种因素的影响，如：材料表面电荷和亲疏水性质、材料粒径、血清是否灭活、血浆浓度以及纳米材料与血清/血浆的赋予时间等（文献8.Walkey,C.D.;Chan,W.C.W.,Understanding and controlling theinteraction of nanomaterials with proteins in a physiologicalenvironment,Chem.Soc.Rev.,2012,41,2780-2799.）。例如，Tenzer,S.等人研究表明二氧化硅纳米材料的粒径大小会严重影响其表面血浆蛋白质环冠的组成（文献9.Tenzer,S.et al.,Nanoparticle Size Is aCritical Physicochemical Determinant of the Human Blood PlasmaCorona:A Comprehensive Quantitative Proteomic Analysis,Acs Nano,2011,5,7155-7167.）。另外，Lesniak,A.等人研究发现与纳米材料孵育的血清是否灭活会严重影响聚苯乙烯材料表面蛋白质环冠的组成及细胞的吞噬行为。（文献10.Lesniak,A.;Campbell,A.;Monopoli,M.P.;Lynch,I.;Salvati,A.;Dawson,K.A.,Serum heat inactivation affectsprotein corona composition and nanoparticle uptake,Biomater.,2010,31,9511-8.）而且，Walkey,C.D.等人研究表明不同粒径大小的金纳米材料表面PEG修饰链密度的不同会引起材料表面蛋白质环冠的组成及巨噬细胞对材料的吞噬量的不同（文献11.Walkey,C.D.;Olsen,J.B.;Guo,H.;Emili,A.;Chan,W.C.W.,Nanoparticle Size and SurfaceChemistry Determine Serum Protein Adsorption and Macrophage Uptake,J.Am.Chem.Soc.,2012,134,2139-2147.）。综上所述，目前对于纳米材料在单个生物学系统中形成的蛋白质环冠的研究已经比较深入，但是纳米材料在与细胞相互作用时其表面形成的蛋白质环冠的分析却鲜有发现。这是因为在生物体内，当纳米材料进入细胞时，其表面已经覆盖了一层血浆蛋白或其他蛋白，在分析细胞内纳米材料表面形成的蛋白质环冠时，这层血浆蛋白（或其他蛋白）会干扰细胞蛋白质的分析，无法确定这些蛋白是否来自细胞。最近，Lundqvist,M.等人通过聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法分析了二氧化硅纳米材料经过血浆孵育转移至细胞蛋白提取液前后其材料表面的蛋白质环冠的变化，发现了部分经细胞蛋白提取液孵育之后部分变化明显的蛋白质条带，鉴定了部分吸附在材料表面的细胞蛋白质（Lundqvist,M.et al.,The Evolution of the Protein Corona aroundNanoparticles:A Test Study,Acs Nano,2011,5,7503-7509.）。这种方法虽然能够直观的看出二氧化硅材料表面的血浆蛋白质环冠在与细胞蛋白提取液孵育后是否发生变化，但是它却不能完全清楚地分辨出细胞内二氧化硅纳米材料表面蛋白质环冠的组成，即蛋白质究竟是来自血浆还是来自细胞蛋白提取液，限制了我们对于纳米材料表面蛋白质环冠的稳定程度的认识。
发明内容
本发明目的在于提供一种准确方便且可靠的细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，该方法第一次实现了细胞内纳米材料表面吸附的蛋白质环冠的分析和鉴定，识别了来自不同生物学系统的蛋白质，对于纳米材料与蛋白质相互作用的研究提供了新的方法和平台，推动了纳米药物的发展。
本发明具体提供了一种细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：采用稳定同位素标记技术对细胞内的蛋白质进行标记，从而区别来自不同生物学系统中的蛋白质成分，进而进行细胞内纳米材料表面蛋白质环冠的分析。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述同位素标记技术是在细胞培养中加入稳定同位素标记氨基酸进行蛋白质标记的方法。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所用的稳定同位素标记技术需要能够实现对细胞内蛋白质的某一种或几种氨基酸标记完全。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述的细胞内的蛋白质的某一种或几种氨基酸被稳定同位素标记后，采用特异性的蛋白酶使得酶解后得到的肽段中均含有被稳定同位素标记的氨基酸。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述的细胞内的蛋白质的某一种或几种氨基酸被稳定同位素标记后，经过特异性的蛋白酶酶解后得到的肽段分子量大小适合液相色谱质谱平台的分析。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述细胞内的蛋白质被稳定同位素标记的氨基酸为精氨酸(Arg)或赖氨酸(Lys)或者精氨酸和赖氨酸同时被标记。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于，所述细胞内的蛋白质被稳定同位素标记的方式可以为：13C6-Lys,13C6-Arg,D4-Lys,13C6 15N2-Lys,13C6 15N4-Arg,13C6 15N2D9-Lys,13C6 15N4D7-Arg或15N4-Arg。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）、细胞培养：在细胞培养过程中加入稳定同位素标记的氨基酸培养细胞，在细胞培养七代之后，收集部分细胞，提取蛋白质，经胰蛋白酶酶解，液相色谱-质谱鉴定后，计算细胞蛋白的标记效率，当标记效率大于99.5%以上时，收集细胞或提取细胞蛋白提取液，备用；
（2）、取纳米材料与血浆或血清孵育，经缓冲液洗涤后得到表面覆盖了血浆或血清蛋白质环冠的纳米材料（缓冲液洗涤能够去掉材料表面结合力较弱的蛋白质，以得到表面覆盖了结合力较强的血浆或血清蛋白质环冠的纳米材料）；
（3）、将步骤（2）得到的纳米材料与步骤（1）中得到的细胞孵育或细胞蛋白提取液孵育后，收集纳米材料，经缓冲液洗涤，得到表面吸附了不同来源的蛋白质环冠的纳米材料；
（4）、在步骤（3）得到的纳米材料上原位酶解，得到蛋白质环冠对应的酶解肽段，经除盐、冻干后，进行液相色谱质谱分析鉴定。
由鉴定结果分析可知，由不包含稳定同位素标记的肽段鉴定得到的蛋白为血浆（血清）蛋白，由包含稳定同位素标记的肽段鉴定得到的蛋白则为细胞蛋白，由此可以准确的得到细胞内纳米材料表面吸附的蛋白质环冠的信息，对于分析纳米材料在与细胞相互作用时其表面蛋白质环冠的变化情况及其细胞对于纳米材料的响应等具有非常重要的意义，为推进纳米药物的真正实现作出了贡献。
本发明所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法可以应用于细胞内纳米材料表面蛋白质环冠的分析。
附图说明
图1细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法处理流程图。
具体实施方式
实施例1
体外模拟SiO2纳米材料（购自Sigma公司）从血浆进入细胞后其表面蛋白质环冠的分析：在加入13C6-与15N4-标记的精氨酸(R10)和13C6-标记的赖氨酸(K6)的RPMI1640培养基中培养人肝癌细胞系HepG2细胞七代以后（保证标记效率达到99.5%以上），收集细胞，并提取细胞蛋白，备用。100μgSiO2纳米材料与100μL正常人血浆在37℃孵育1h后，用PBS缓冲液洗涤材料三次，去掉SiO2纳米材料表面结合力较弱的蛋白质，得到表面吸附了血浆蛋白质环冠的SiO2材料。将SiO2材料与其表面吸附的血浆蛋白质环冠组成的复合物分散于350μL被稳定同位素标记的细胞蛋白提取液中，37℃孵育1h后，用PBS缓冲液洗涤材料三次，去掉材料表面结合力较弱的蛋白质，得到表面覆盖了由血浆蛋白和细胞蛋白共同组成的蛋白质环冠的SiO2纳米材料。通过Zhang H.等提出的“在材料上原位酶解”（Zhang,H.;Burnum,K.E.;Luna,M.L.;Petritis,B.O.;Kim,J.-S.;Qian,W.-J.;Moore,R.J.;Heredia-Langner,A.;Webb-Robertson,B.-J.M.;Thrall,B.D.;Camp,D.G.,II;Smith,R.D.;Pounds,J.G.;Liu,T.,Quantitative proteomics analysis of adsorbed plasma proteinsclassifies nanoparticles with different surface properties and size,Proteomics2011,11,4569-4577.）的方法将SiO2纳米材料表面的蛋白质环冠酶解之后，得到对应的肽段过SPE柱除盐，冻干，最后复溶在0.1%（v/v）甲酸水中进行液相色谱串联质谱分析。
经数据库搜索，可以得到SiO2纳米材料表面吸附的蛋白质的环冠的组成成分：由含重标同位素标记的肽段鉴定到的来自细胞提取液的细胞蛋白以及由不含重标同位素标记的肽段鉴定到的来自血浆的蛋白。结果表明，SiO2纳米材料表面吸附了52个血浆蛋白和62个细胞蛋白，这说明当表面吸附的血浆蛋白质环冠的SiO2纳米材料在分散于细胞提取液中时，其表面的蛋白质吸附层发生了变化，细胞蛋白进入蛋白质环冠中，而血浆蛋白也没有被完全替换掉，这为纳米材料在生物体内生物学系统之间的转移的研究提供了思路。
实施例2
表面带有血浆蛋白质环冠的TiO2纳米材料（购自Sigma公司）在与细胞孵育后其表面蛋白质环冠的分析：在加入D6-标记的赖氨酸(K4)的RPMI1640培养基中培养人宫颈癌细胞Hela七代以后（保证标记效率达到99.5%以上），待用。50μg TiO2纳米材料与50μL正常人血浆在37℃孵育1h后，用PBS缓冲液洗涤材料三次，去掉TiO2纳米材料表面结合力较弱的蛋白质，得到表面吸附了血浆蛋白质环冠的TiO2纳米材料。将TiO2纳米材料及其表面血浆蛋白质环冠共同组成的复合物分散于不含血清的RPMI1640培养基中，37℃孵育1h后，收集培养基中的TiO2纳米材料，用PBS缓冲液洗涤材料三次，去掉材料表面结合力较弱的蛋白质，得到表面覆盖了蛋白质环冠的TiO2纳米材料。通过“在材料上原位酶解”的方法将TiO2纳米材料表面的蛋白质环冠酶解之后，收集肽段过SPE柱除盐，冻干，最后复溶在0.1%（v/v）甲酸水中进行液相色谱串联质谱分析。
数据库搜索结果表明，表面吸附了血浆蛋白质的TiO2纳米材料在与细胞孵育1h之后，其表面的蛋白质环冠会发生变化，共鉴定到70个由不含重标同位素标记的肽段鉴定到的血浆蛋白和28个由含重标同位素标记的肽段鉴定到的细胞蛋白。这说明当表面吸附了血浆蛋白质环冠的TiO2纳米材料在与细胞孵育时，尽管TiO2纳米粒子没有进入到细胞内，但可能由于少数细胞的破裂或细胞分泌蛋白的原因使其表面的蛋白质环冠发生变化，这证明纳米材料表面的蛋白质环冠在进入细胞前可能已经发生了变化。
实施例3
表面带有血浆蛋白质环冠的Fe3O4纳米材料（购自Sigma公司）进入细胞后其表面蛋白质环冠的分析：在加入13C6-与15N4-标记的精氨酸(R10)和13C6-标记的赖氨酸(K6)的RPMI1640培养基中培养人宫颈癌细胞系Hela细胞七代以后（保证标记效率达到99.5%以上），待用。50μg Fe3O4纳米材料与50μL正常人血浆在37℃孵育1h后，用PBS缓冲液洗涤材料三次，去掉Fe3O4纳米材料表面结合力较弱的蛋白质，得到表面吸附了血浆蛋白质环冠的Fe3O4纳米材料。将Fe3O4纳米材料及其表面血浆蛋白质环冠共同组成的复合物分散于不含血清的RPMI1640培养基中，37℃孵育1h后，弃掉培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞，去掉细胞表面未进入细胞的材料。收集并冰上破碎细胞，通过磁铁收集进入细胞内的Fe3O4纳米材料，用PBS充分洗涤去掉表面结合力较弱的蛋白质，即得到细胞内覆盖蛋白质环冠的Fe3O4纳米材料。将此Fe3O4纳米材料与其表面覆盖的蛋白质环冠组成的复合物分散于8M urea,100mM NH4HCO3溶液中，通过“在材料上原位酶解”的方法将蛋白质环冠酶解，将得到的肽段过SPE柱除盐，冻干，最后复溶在0.1%（v/v）甲酸水中进行液相色谱质谱分析。
经数据库搜索处理数据，发现进入细胞内的Fe3O4纳米材料的蛋白质环冠包含了211个由含同位素标记的肽段鉴定的细胞蛋白质和11个不含同位素标记的肽段鉴定的血浆蛋白质。结果表明，表面吸附了血浆蛋白质的Fe3O4纳米材料在进入细胞后，其表面的预有的血浆蛋白质环冠绝大部分会被细胞内蛋白质替换，而只剩下极少的血浆蛋白。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：采用稳定同位素标记技术对细胞内的蛋白质进行标记，从而区别来自不同生物学系统中的蛋白质成分，进而进行细胞内纳米材料表面蛋白质环冠的分析。
2.按照权利要求1所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述同位素标记技术是在细胞培养中加入稳定同位素标记氨基酸进行蛋白质标记的方法。
3.按照权利要求1所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所用的稳定同位素标记技术需要能够实现对细胞内蛋白质的某一种或几种氨基酸标记完全。
4.按照权利要求1所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述的细胞内的蛋白质的某一种或几种氨基酸被稳定同位素标记后，采用特异性的蛋白酶使得酶解后得到的肽段中均含有被稳定同位素标记的氨基酸。
5.按照权利要求4所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述的细胞内的蛋白质的某一种或几种氨基酸被稳定同位素标记后，经过特异性的蛋白酶酶解后得到的肽段分子量大小适合液相色谱质谱平台的分析。
6.按照权利要求1或4所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于：所述细胞内的蛋白质被稳定同位素标记的氨基酸包括精氨酸和/或赖氨酸。
7.按照权利要求1或6所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于，所述细胞内的蛋白质被稳定同位素标记的方式为：13C6-Lys,13C6-Arg,D4-Lys,13C6 15N2-Lys,13C6 15N4-Arg,13C6 15N2D9-Lys,13C6 15N4D7-Arg或15N4-Arg。
8.按照权利要求1所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法，其特征在于，具体步骤为：
（1）、细胞培养：在细胞培养过程中加入稳定同位素标记的氨基酸培养细胞，在细胞培养七代之后，计算细胞蛋白的标记效率，当标记效率大于99.5%以上时，收集细胞或提取细胞蛋白提取液，备用；
（2）、取纳米材料与血浆或血清孵育，经缓冲液洗涤后得到表面覆盖了血浆或血清蛋白质环冠的纳米材料；
（3）、将步骤（2）得到的纳米材料与步骤（1）中得到的细胞孵育或细胞蛋白提取液孵育后，收集纳米材料，经缓冲液洗涤，得到表面吸附了不同来源的蛋白质环冠的纳米材料；
（4）、在步骤（3）得到的纳米材料上原位酶解，得到蛋白质环冠对应的酶解肽段，经除盐、冻干后，进行液相色谱质谱分析鉴定。
9.一种按照权利要求1所述细胞内纳米粒子表面蛋白质环冠的稳定同位素标记分析方法在细胞内纳米材料表面蛋白质环冠分析方面的应用。
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