CN104062428B - 一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，所述试剂盒采用正电荷包被的基底材料吸附细胞，用肿瘤相关抗体标记肿瘤细胞，实现肿瘤细胞的检测。本发明的试剂盒检测成本低廉，简单高效，易于推广。

Description

一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体来说涉及一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒。
背景技术
循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是肿瘤转移复发的关键，肿瘤细胞由原发灶脱落，侵入血循环，成为CTCs，逃避机体免疫，在远处器官或原发脏器定居，形成转移复发病灶。研究发现，检测CTCs数量有助于早期发现结肠癌，有助于判断肝癌、乳腺癌患者的预后，评估结肠癌、肺癌患者的化疗效果；当CTCs出现上皮间质转换（epithelial-mesenchymal transition, EMT）、过表达上皮细胞粘附分子（epithelial cellular adhesion molecule, EpCAM）时，往往提示肿瘤患者预后不佳，因此检测CTCs被形象地称为“液体活检”，具有重要的临床研究及应用价值。
目前国内外共约有30种分离检测CTCs的技术产品，其中少数是从DNA、蛋白水平去检测CTCs，其余大部分都是直接分离检测CTCs。CTCs直接检测方法大致可分为两类：一类是基于CTCs表面分子标记物的检测，另一类是基于CTCs自身物理性质的分离检测。第一类以哈佛大学的CTC-Chip芯片、强生公司的CellSearch全自动CTCs检测仪为代表，其中CellSearch系统是目前唯一被美国食品药品监督管理局批准用于CTCs临床检测的新技术，目前已在临床上一定范围内应用。此类技术方法的原理是利用抗体标记的微流体芯片或磁珠与表达EpCAM 的CTCs发生特异性的抗原-抗体结合反应来分离CTCs，检测的前提条件是CTCs上表达适量的EpCAM。这类方法的缺陷在于，很多肿瘤细胞不表达或弱表达EpCAM，如某些肝癌、肾透明细胞癌、皮肤鳞癌中EpCAM的表达常呈阴性；乳腺癌细胞EpCAM一般呈高表达，但小叶癌却呈无或弱表达，从而导致检测结果假阴性。目前还没有发现所有肿瘤细胞均能稳定、大量表达的特定分子标记物，所以此类方法不能分离检测患者血液标本中所有的CTCs，存在检测灵敏度较差，漏检率较高的问题；这种技术原理上的缺陷也导致了基于此类方法的研究结果存在较大争议：其次，这类方法成本昂贵，一般患者较难承受相应的检测费用（约4000元/次），这也加重了社会的医疗负担。另一类是基于CTCs物理特性的方法。其中最具代表性是利用一般肿瘤细胞的直径大于正常细胞直径，来分离检测CTCs，例如膜滤过分离技术，是在滤膜上设计了8μm的孔阵列，设想CTCs直径普遍都在10μm以上，且细胞膜弹性差，故可以把CTCs分离出来；但血液中某些正常的白细胞直径要大于8μm，有些超过10μm；不同生长阶段的CTCs，休眠期的CTCs，个别特殊肿瘤细胞，它们的直径要偏小，并有研究发现肿瘤细胞可以轻易穿越5μm直径的通道，所以，利用肿瘤细胞物理特性来分离检测CTCs的方法受到较大的质疑。
综上所述，目前CTCs的检测技术方法均有较大的缺陷，灵敏度较低，漏检率较高，而且一般仅能检测CTCs数量，较少能检测CTCs上肿瘤相关分子的表达，丢失了CTCs携带的重要疾病信息，不能满足临床研究及应用的要求，因此，当前迫切需要研发一种高效、低成本的CTCs检测平台，能够检测血液标本中所有的CTCs数量，同时分析其肿瘤相关分子表达情况，从而为肿瘤的临床诊断、疗效监控和预后判断提供更准确的信息。
发明内容
本发明开发了一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，相比于现有技术的检测方案，本发明的试剂盒更加高效，并且成本低廉，从而降低检测成本和价格。
具体来说，本发明采用的技术方案如下：
一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含正电荷包被的基底材料、肿瘤相关抗体、红细胞裂解材料以及检测相关试剂。
正电荷包被的基底材料可以任何材料修饰基底材料而获得，因此，本发明还提供一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含基底材料、正电荷修饰试剂、肿瘤相关抗体、红细胞裂解材料以及检测相关试剂。
所述正电荷修饰试剂优选是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。
优选地，所述基底材料是具有纳米结构的纳米基底材料。
优选地，所述基底材料的材质是聚苯乙烯基底或者二氧化硅材料基底中的任一种。
优选地，所述肿瘤相关抗体是经过标记的肿瘤相关抗体。
在一个实施方案中，所述经过标记的肿瘤相关抗体是荧光标记的肿瘤相关抗体。
有益效果：本发明的试剂盒成本低廉，检测费用低，并且可以无差别地、高效地捕获所有血液标本中的CTCs，利用相应抗体可以检测血液标本中CTCs表达的分子标记物，而且成本低，设备要求简单，可以广泛推广。
附图说明
图1是利用原子力显微镜观察到的纳米结构基底材料的照片。
图2是利用本发明的试剂盒检测CTCs的过程的示意图。
图3是不同时间细胞在正电荷包被基底材料上的贴附率，其中实心方块为正电荷包被基底上细胞的贴附率，实心圆形代表未修饰载片上细胞的贴附率。
图4是细胞贴附到基底材料上并荧光染色后的照片。
具体实施方式
循环肿瘤细胞(CTCs)是肿瘤转移复发的关键，具有重要研究意义与应用价值。现行基于CTCs表面分子标记物、自身物理性质分离检测CTCs的技术方法在原理上存在一定缺陷，导致检测灵敏度较差，特异性较低。本发明采用普通的聚苯乙烯或二氧化硅材料（例如载玻片、石英、硅片等）作为基底，用氨基硅烷试剂修饰其表面，使其带有强烈的正电荷，通过静电吸附力，物理性地富集悬液中所有细胞到基底表面，然后采用肿瘤相关抗体对细胞进行检测，鉴别肿瘤细胞。在实验中发现，该基底能在30分钟内富集几乎所有人为混入健康人血液中的肿瘤细胞。该方法颠覆了现有CTCs检测的原理，简单高效、成本低。
1.正电荷包被的基底材料的制备：
本发明试剂盒中所用的基底材料利用正电荷修饰材料被覆盖上正电荷，以实现对血液中细胞的物理吸附。在一个优选实施方案中，我们应用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)将基底修饰上正电荷。优选地，在正电荷修饰之前，基底材料可以具有纳米结构。如Chen W, Weng S, Zhang F等人, Nanoroughened surfaces for efficient capture of circulating tumor cells without using capture antibodies. ACS NANO. 2013. 7(1): 566-75所述，在体外无抗体修饰的纳米结构基底也可使肿瘤细胞稳定地附着在其表面，进一步提示，在体外环境下，具有纳米结构的基底适合细胞的贴附。因此在另一个优选实施方案中，我们先应用氧等离子体轰击聚苯乙烯基底，用氧气和C3F8混合气体等离子体轰击二氧化硅基底，制备了聚苯乙烯纳米基底或二氧化硅纳米基底。
以玻片为例，以APTES修饰基底材料的过程如下：将玻片(25×75 mm)在90℃的1:3过氧化氢和浓硫酸溶液中浸泡10分钟，用去离子水清洗三次、氮气吹干。随后在含有2%APTES的乙醇溶液浸泡中30分钟，用乙醇、去离子水彻底清洗各三次，氮气吹干，180℃烘烤1小时。
接下来对玻片表面性质进行测定。首先测量接触角。将10 µL的去离子水分别滴加到正电荷修饰玻片及未经处理的玻片表面，用角度计测量，每个样本测定5次，取平均值。正电荷修饰玻片及未经处理的玻片分别被浸润在1 mM NaCl溶液中，并用电泳光散射仪来测定其界面动电势。最后再利用荧光胺来定性测定玻片表面是否有氨基。900 µL的含有0.1% (重量体积比)荧光胺的丙酮溶液，与150 µL的0.1 M的硼酸盐缓冲液，1.91 mL的去离子混合，并加入到两种玻片表面，在室温下孵育5分钟后，用去离子水清洗干净。荧光照片拍摄后，相关荧光强度用ImageJ软件分析。
APTES修饰玻片是常规实验方法，主要用于基因芯片制备相关领域，其中所涉及的溶液浓度、处理时间等因素已经被广泛接受并应用。1:3过氧化氢和浓硫酸溶液具有极强度氧化能力，可以将玻片表面的有机无机杂质去除干净，同时氧化玻片表面使其富含-OH基团。这些3个-OH基团可以与1个APTES分子中的3个-OCH2CH3基团发生缩合反应，从而将APTES中所携带的氨基以共价键的形式修饰到玻片表面。所以玻片表面的-OH越丰富，APTES修饰后，表面携带的氨基越多。我们首先观察接触角在玻片修饰前与修饰后的变化。修饰前，玻片的接触角为8±1°，显示为亲水性表面。APTES修饰后，玻片表面呈现出疏水性特征，接触角平均值为66±2°，间接说明玻片表面化学基团发生了变化。表面电荷测定中，利用Helmholtz-Smolukowsky等式计算，发现1:3过氧化氢和浓硫酸溶液处理后的玻片界面动电势为-12.63 mV，而APTES处理后的玻片界面动电势为93.82 mV。其主要原因在于带负电荷的-OH-基团被带正电荷的-O-Si-CH2CH2CH2NH2+基团所取代，所有电势值得以显著增加。荧光胺自身不发出荧光，但有氨基出现时可以特异性与之反应，并发生变化从而并发出荧光。其荧光可以在390 nm波段被检测到。荧光胺半定量测定氨基基团数量实验中发现，未处理的玻片荧光值为0.4±0.2，而APTES修饰后的玻片，荧光值增加到22.7±6.3；荧光值显著增加则可以再次确认玻片表面富含氨基。
正电荷修饰基底可以在完成后封装在试剂盒中，或者可以在试剂盒中仅提供修饰材料和未修饰基底材料，由使用者如上所述制备。在这种情况下，可以在试剂盒中具有说明书，说明书中除了具有如何采用本发明的试剂盒检测CTCs的内容外，还可以包括如何采用所提供材料将基底材料修饰上正电荷的内容。
2.循环肿瘤细胞的检测：
采集肿瘤患者外周血标本10ml，储存在EDTA-K3抗凝的真空采血管中备用，1小时内处理。应用红细胞裂解液裂解上述备用的抗凝血标本，离心后抽提CTCs、白细胞，PBS液洗涤细胞3次后，用500μl PBS悬浮细胞后备用；应用500μl PBS液注射到上述正电荷包被纳米基底上，以将备用的细胞接种至如上所述制备的纳米基底上，移液枪吹打混匀，细胞贴附基底材料后，移除PBS液，进行CD45、CK8/18、肿瘤相关抗体1免疫荧光染色，细胞核DAPI染色，随后用细胞荧光扫描仪检测CTCs的数目（CK+DAPI+ CD45-细胞）及肿瘤相关抗体表达情况。
正电荷修饰的玻片可以在短时间内高效富集肿瘤细胞和白细胞到其表面。对所有富集的细胞进行荧光染色后，通过商品化的荧光扫描仪如Perkin Elmer Operetta或GE Cytell系统，可以迅速分析血液中CTCs的数量及蛋白表达，可以满足临床检测需要。本方法不要利用抗体来分离CTCs，也不通过细胞大小来分离CTCs，而是直接将所有血液中有核细胞富集到氨基修饰的玻片表面，再对所有细胞进行荧光染色，用以区分肿瘤细胞和白细胞，方法简单、高效、成本低。
实例应用：
我们测试了在健康人血液标本中检测肿瘤细胞：将一定数量MDA-MB-231人乳腺癌细胞加入到10ml健康人外周血标本，用来模拟肿瘤患者的外周血标本，通过裂解红细胞后，应用本发明试剂盒中的基底材料吸附肿瘤细胞，然后用试剂盒中的抗体对细胞进行检测。
在实验中，我们将一定数量的肿瘤细胞悬浮于100 µL 1×PBS溶液中，将其分别滴加到未修饰的玻片及氨基修饰后的玻片表面，并孵育2小时。在不同时间点细胞贴附率见图3。在孵育30分钟后，氨基修饰的玻片上富集了约97.2%的肿瘤细胞(SD：3.3)，而与此同时未修饰的玻片表面仅仅富集了约9.7%的肿瘤细胞(SD：1.3)。在此后的1.5小时时间内，氨基修饰玻片表面的肿瘤细胞富集率一直稳定在98%左右。而未修饰玻片表面，细胞富集率随着时间的推移而逐渐增加，在2小时时间点其富集率也仅为34.3%(SD：4.2)。结果显示，有氨基修饰的表面因为携带有大量正电荷，可以在短时间内通过静电吸附力的作用，物理性地吸附细胞到其表面，吸附率接近100%。在氨基修饰玻片组中，约有2%的肿瘤细胞无法贴附到基底表面，其主要原因可能是胰蛋白酶收集贴附在培养瓶表面的肿瘤细胞时造成了细胞损伤。我们使用0.25%的胰蛋白酶处理5分钟，再用含10%小牛血清的DMEM培养液来灭活胰蛋白酶，接着用台盼蓝染色这些肿瘤细胞，我们发现约有1.2%的肿瘤细胞(SD：0.1)胞浆被染色，提示细胞膜有破损。可能这部分细胞在30分钟的孵育过程中发生破裂，造成约有2%的细胞丢失。
在检测时，首先采用相关抗体对CTCs进行标记，如利用抗CD45荧光抗体来首先区分肿瘤细胞和白细胞；用DAPI染色细胞核来区分完整细胞和细胞碎片；再用针对肿瘤特异的抗原，采用荧光标记的抗体进行标识，区分出CTCs和白细胞。如此，不仅可以对CTCs进行计数，还可以对相关肿瘤蛋白的表达进行分析。
在以上加入肿瘤细胞到健康人血液中并吸附到基底材料上，接着免疫荧光染色后，用荧光显微镜观察，染色结果如图4所见，其中绿色的为肿瘤细胞。利用细胞荧光扫描仪进行肿瘤细胞计数，结果发现检测到了近100%加入的肿瘤细胞（表1）。
样本 肿瘤细胞数量（理论混入值） 肿瘤细胞数量（实际检测值） 检测率（%）
1a 50 45 90
1b 50 46 92
1c 50 48 96
2a 100 92 92
2b 100 95 95
2c 100 97 97
3a 200 190 95
3b 200 198 99
3c 200 186 93
表1 应用该试剂盒检测MDA-MB-231细胞数量
上面结合附图和具体实施例对本发明的实施方式作了详细的说明，但是本发明不限于上述实施方式，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (5)

1. 一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含正电荷包被的基底材料、肿瘤相关抗体、红细胞裂解材料以及检测相关试剂，其中所述基底材料是具有纳米结构的纳米基底材料，用于对该基底材料进行正电荷包被的正电荷修饰试剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，亦即所述正电荷包被的基底材料是经过APTES修饰的纳米基底材料，所述肿瘤相关抗体是用于对细胞进行检测的抗体。
2. 一种检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含基底材料、正电荷修饰试剂、肿瘤相关抗体、红细胞裂解材料以及检测相关试剂，其中所述基底材料是具有纳米结构的纳米基底材料，正电荷修饰试剂是3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)，所述正电荷修饰试剂用于对该基底材料进行修饰以实现对基底材料的正电荷包被，得到正电荷包被的基底材料，亦即经过APTES修饰的纳米基底材料，所述肿瘤相关抗体是用于对细胞进行检测的抗体。
3. 如权利要求1或2所述的检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述基底材料的材质是聚苯乙烯基底或者二氧化硅材料基底中的任一种。
4. 如权利要求1或2所述的检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述肿瘤相关抗体是经过标记的肿瘤相关抗体。
5. 如权利要求4所述的检测循环肿瘤细胞的试剂盒，其特征在于，所述经过标记的肿瘤相关抗体是荧光标记的肿瘤相关抗体。
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Effective date of registration: 20171013

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Patentee after: Nanjing to Thailand biomedical science and Technology Co., Ltd.

Address before: 210003 Jiangsu city of Nanjing province Nanjing City Zhong Fu 1-1 No. Second Hospital of Nanjing City

Co-patentee before: Wan Yuan

Patentee before: Zheng Qin

Co-patentee before: Wang Lixue