CN111812071A - 一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种新型循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)的鉴定技术，其特征在于：肿瘤患者体液(如外周血)经标准取样、运输存放、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。本发明在原位镜检CTC，既检测肿瘤细胞,又确定循环肿瘤细胞的器官组织来源,解决长期以来CTC形态学鉴定缺乏令人信服的方法，有助于为CTC的检测建立统一的标准。本发明具有易于操作、重复性好、稳定性强等优点,可用于肿瘤高危人群的早期筛查、癌症患者的疗效评估及复发监控。

Description

一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种新型循环肿瘤细胞(CirculatingTumor Cell,CTC)的鉴定技术。
背景技术
肿瘤可分实体瘤及非实体瘤二大类，前者由上皮或内皮组织细胞分化而形成的肿块，而后者是造血系统细胞形成的，如淋巴细胞癌，不形成肿块。肿瘤细胞从实体肿瘤原发灶或转移灶脱落，进入人体循环系统而形成循环肿瘤细胞(CTC)，存在于外周血中。
CTC以游离的单个细胞形式存在，或呈细胞团(Circulating Tumor Microemboli,CTM)形态。这些细胞是肿瘤转移的基础，研究CTC有助于揭示恶性肿瘤发生及转移的机制，CTC也用于临床疗效评估及复发监控。CTC在肿瘤患者外周血中十分稀少,每5毫升外周血仅含数个至数百个CTC，而每毫升成人外周血存在数百万白细胞及数亿红细胞，为此对CTC检测技术的灵敏度和特异性提出了极高的要求。CTC鉴定是肿瘤液体活检(Liquid Biopsis)的重要组成部分,其无创或微创及实时动态检测的优点,是当今肿瘤诊疗的重要方向,有广阔的应用前景。
目前针对CTC，有许多的检测方法，尤其CTC的检测主要包括CTC分离和富集系统以及鉴定系统，合适的分离和富集系统是能否有效检测外周血CTC的前提。用于临床实验研究的CTC分离和富集技术，主要根据CTC物理性质(如大小、密度等性质)和CTC表面与捕获基质的亲和性(如CTC表面的特异性抗原与带有相应抗体的相互作用)。由于CTC的高度异质性,基于某一CTC类型的特性去富集,有可能造成其它CTC类型的缺失而造成漏检。一些血细胞具有CTC相近的物理性质,以此性质来分离CTC,会同时富集这些血细胞。此外不少肿瘤细胞特异性抗原尚未知,理想的抗体常常缺乏。
常用的CTC分离富集技术有以下几类:
(1)密度梯度离心法(Density Gradient Centrifugation，DGC):基于血液中各种细胞与CTC密度的差别，在密度梯度介质中的沉降系数不同，将细胞悬液置于分离液介质的顶部，通过重力或离心力的作用，将CTC与其它细胞层分离。该法操作简便、成本低，但要求血量较大，且灵敏度和特异性均较低，CTC与白细胞等单核细胞在同一密度梯度,且操作过程中会损失CTC。
(2)上皮性肿瘤细胞过滤技术(Isolation by Size of Epithelial TumorCells，ISET):ISET方法是基于细胞大小不同用具有一定孔径的微孔滤膜来筛选。肿瘤细胞的直径一般为15～30μm，大于大多数血细胞的直径(如红细胞5～9μm)，所设计的微孔滤膜(直径8或10μm)过血液样本后将直径大的肿瘤细胞分离出来。该方法对技术、设备要求不高，但不适合直径小于滤膜孔径的肿瘤CTC的分离富集。
(3)免疫磁珠分离技术(Immunomagnetic separation，IMS)：CTC具有某些特殊的生物标志物，如CTC表面的上皮细胞粘附分子(Epithelial Cell Adhesion Molecule，EpCAM)、细胞角蛋白(Cytokeratin，CK)，而带有EpCAM抗体磁珠在外加磁场中捕获EpCAM阳性的CTC。该方法的敏感性受到CTC表面抗原表达的制约，对EpCAM阴性CTC会造成漏检。肿瘤细胞在进入外周血循环的过程中会发生上皮-间质转变(EpithelialMesenchymalTransition,EMT),一些CTC会减少甚至不表达EpCAM蛋白。
(4)细胞粘附技术(Cell Adhesion Techniques，CAT):利用生物化学或物理学原理修饰捕获CTC的基质表面,增强CTC与基质的亲和粘附性，当含有CTC的样本经过捕获表面时，CTC则被吸附在捕获表面，然后冲洗掉未被粘附的其它细胞。比如纳米基质分离技术(Nanoimprint matrix isolation technology)是在纳米尺度对基底表面制备纳米结构设计细胞界面，并修饰相应的特异性识别分子，将血液中的CTC捕获并分离出来。又如微流控技术(Microfluidics)在微流控器件中,从血液样品流入到CTC分选,可以实现连续的过程，极大地简化了操作程序，并可减少目标细胞的损失,且所用血液样本微量,但要克服样本中细胞凝集成团造成阻塞的问题。
(5)微流控芯片技术(Microfluidic chip technology)是将生物医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程，称之谓芯片实验室(lab on a chip)。微流控技术可在微米结构中操控极微量体积液流，基于微流控芯片的CTC分离技术通过在芯片通道内部修饰可识别的细胞表面抗原的抗体或适合配体，当通入含CTC的样本时，CTC与通道表面捕获试剂结合，实现特异性分离。该方法所需样品量小，无需对血液样品进行前处理，且流动的流体环境有利于去除非特异性吸附的其它细胞，从而提高分离纯度。
经过上述方法分选富集的CTC需要进一步分析鉴定，选用特异性的检测技术或方法对CTC及其分子进行确认是循环肿瘤细胞检测的重要步骤。常用的鉴定检测技术包括免疫细胞化学技术(Immunocytochemistry，ICC)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、荧光原位杂交技术(Fluorescence In Situ Hybridization，FISH)和流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等。其中ICC及常规细胞染色技术是最基本的鉴定方法，但目前选择的循环肿瘤细胞的相关抗原包括EpCAM、上皮角质蛋白(CKs)、肿瘤相关蛋白或特异性标志物，该方法人工操作步骤复杂,需人工检测,误差大。
近年来研发出的光纤阵列扫描仪(Fiber scanning technology，FAST)、激光扫描细胞计量仪(Laserscanning cytometry，LSC)、自动细胞显像系统(Automated cellularimaging system，ACIS)等，使检测系统有了很好的协同性，能完成高速扫描、准确定位免疫荧光标记的肿瘤细胞，提高了扫描荧光染色细胞的有效率和灵敏度。由于肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，在一定程度上降低了检测的灵敏度。随着人工智能技术的快速发展,检测的人为差异性将进一步减少。
对于CTC的细胞形态鉴定，仍缺乏共识和公认的标准。流行的方法(CD45-，表明非白细胞；Dapi核染色，表明非红细胞；细胞角蛋白(Cytokeratin 18 or 19,CK18 or CK19或波形蛋白,不少肿瘤细这些蛋白标志物常有过表达的趋势)，但不少正常上皮细胞也具这些蛋白标志物,用这些蛋白标志物，荧光显微检测难以区分肿瘤细胞与正常上皮细胞，由于不能有效快速并且精准地鉴定CTC，是当今该技术在临床应用中面临的主要瓶颈。
银染法是经典的细胞染色技术(Howell W.M.and Black D.A.1980,Experimentia,336,1014-1015)。细胞银染法常用于恶性细胞的核仁嗜银形成区及核型分析，染色原理是基于银离子在甲酸作用下还原成金属银，染色结果是细胞核呈金黄色，胞质色浅，而核仁或核仁嗜银形成区呈黑色或深褐色。用一步染色法进行细胞银染，却存在银染法受染色的温度及时间相关性极强，加上反应非常灵敏，银染法极难掌握的技术问题，有时会着色过深或过浅，不稳定及要去除杂质会造成的假象。其中采用组织病理切片的染色多用苏木精法，后者不适宜细胞核及核仁的精细观察。若采用亚甲蓝/曙红法，染色简单而迅速，胞质为浅蓝色，核呈红色，而核仁呈黑色或黛蓝色，但着色受酸碱度影响，后续的免疫荧光分析会严重影响亚甲蓝染色，且该法对核仁的观察则大为逊色，亚甲蓝及苏木精染色不适宜后续操作及荧光显微检测。目前除了常见的苏木精/伊红(HE)细胞常规染色，暂无银染鉴定CTC的报道。且在鉴定的环节，用亚甲蓝染色，对肿瘤细胞的分辨性低，滤膜上仍有淋巴细胞，一些血液干细胞，亚甲蓝是不能充分区别开的，这样会造成假阳性。
荧光显微镜技术(Fluorescence microscopy)是目前在光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位研究的有力工具之一，主要是用于检测细胞上的特异荧光材料。荧光显微镜技术包括免疫荧光技术和荧光素直接标记技术。例如，将标记荧光素的纯化肌动蛋白显微注射入培养细胞中，可以看到肌动蛋白分子组装成肌动蛋白纤维。可将产生荧光的绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)基因与某种蛋白质基因融合，在表达这种融合蛋白的细胞中，便可直接在活体状态下观察到该蛋白在活细胞内的动态变化。不同荧光素的激发波长范围不同，所以同一样品可以用两种以上的荧光素标记，同时显示不同成分在细胞中的定位。因为在血液中正常的表皮细胞也会表达一定程度的细胞角蛋白(CK18或19)及波形蛋白等常规标志性蛋白，它们在正常的组织细胞中亦有，只是含量在肿瘤细胞中明显高些，而荧光显微是很难精准定量，检测方法的不完善也导致假阳性问题，因而角蛋白等相关蛋白标志物的荧光检测仍不能作为检定CTC的主要依据。
发明内容
为了解决以上技术问题，本发明提供，利用细胞银染结合荧光显微技术检测癌症患者外周血循肿瘤细胞，能有效检测肿瘤患者外周血循环肿瘤细胞(CTC)，高通量处理大量样品,快速有效；捕获率或灵敏度高，特异性较高，降低假阳性或假阴性，避免交叉污染；以及重复性好，CTC富集效率高，易于操作，机械化自动化程度高，且成本低；收集到的CTC可以进行后续的表型和基因型等分析；稳定性重复性好，操作易掌握。
解决以上技术问题,本发明中的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：患者体液经取样、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。所述体液这里特指为外周血。
将癌症患者外周血中稀有的循环肿瘤细胞经过滤富集到微孔膜上，本发明用细胞银染法初步鉴定为肿瘤，结合组织及肿瘤蛋白标志物在原位用免疫荧光技术检测肿瘤细胞的来源，克服CTC临床检测缺乏形态学标准的瓶颈，使CTC技术更有效地应用肿瘤的临床诊疗。
检测方法具体包括以下步骤：
(1)外周血的标准采集取样、运输及存放，及样本前处理；所述外周血的样本量为3-5毫升。
(2)CTC富集分离于微孔滤膜上：CTC的富集及分离，采用微孔膜富集外周血中CTC；
本发明中富集外周血中CTC，将循环肿瘤细胞富集到微孔膜上，富集尽可能去除了红细胞及白细胞，较少的微孔阻塞现象，CTC完好无损等。
(3)固定细胞：采用细胞固定液固定微孔膜上的细胞；富集CTC后，用化学方法固定微孔膜，这样所有在膜上的细胞都固定了位置。
细胞经固定后，保持其形态及内在精细结构，用化学试剂配成的固定液是常规的方法。
(4)细胞银染：先在原位用银染法鉴定为肿瘤细胞，再用结合组织及肿瘤蛋白标志物的免疫荧光技术检测肿瘤细胞的来源。
本发明中原位法，是指对指定的待检细胞，在同一显微镜检视野中，普通光观察银染然后在荧光下观察同一细胞，即镜检时，载玻片可相对不动，仅改变光源：普通光或荧光进行观察。细胞银染法不同于常规苏木精/伊红染色技术，，可以清晰地鉴定细胞核、核仁形态，尤其是嗜银核仁形成区。我们改良的银染法克服了传统方法造成的非特异性染色，不可控性及重复性低的致命缺陷。结合ICC方法，既确认CTC的肿瘤细胞性质，又明确CTC的组织器官来源。此外，一步银染法，减少硝酸银的用量。
(5)免疫荧光原位检测：先银染，初步鉴定是否为肿瘤细胞，然后免疫荧光检测，进一步检测肿瘤细胞的其它标志物及组织器官来源。步骤(3)至步骤(5)为CTC的细胞形态鉴定及免疫荧光检测。
先将肿瘤患者外周血中CTC富集过滤到具有一定直径的微孔膜上，再通过改良的银染法鉴定肿瘤细胞，结合荧光显微技术检测相关肿瘤蛋白标志物。结合细胞免疫显微技术，在同一视野下，对CTC进行原位观察，在普通光镜下观察细胞银染结果，而在荧光镜下确定肿瘤细胞的组织器官来源。采用在原位开展免疫细胞化学技术(ICC)检测CTC的组织器官来源及肿瘤普遍上调的特异性蛋白标志物，既鉴定待检细胞是否是CTC，又能判断肿瘤细胞的组织器官来源。
所述固定细胞步骤和细胞银染步骤之间还有微孔膜的前处理步骤，减少原位银染步骤中硝酸银的用量，增加明胶的用量，也使一步银染法反应效果更好和稳定。
所述微孔膜的前处理为：用0.01N HCl处理3-5min，水洗3次，水洗后用0.05％Triton X-100/PBS处理3-5min，再水洗2次。
所述细胞银染步骤与免疫荧光原位检测步骤之间还设有银染后的再固定步骤及TritonX-100处理步骤，银染后的再固定步骤为用10％乙酸水溶液处理。
银染后用乙酸溶液处理10-15min，是为了停止银染反应。与固定细胞步骤不一样。Triton的再处理，常规操作，增加细胞通透性。
所述微孔膜为圆形或锥形微孔膜，直径0.5-1cm，微孔直径8或10微米。微孔膜多用纳米材料，膜上微孔很多，过滤更有效；微孔膜结合微流孔芯片技术，过滤效果更好。
所述细胞固定步骤为：用1ml固定液加入细胞过滤器，固定至少3-5分钟，再用PBS洗二次，将微孔膜从细胞过滤器中取出，移至12或24孔板中，PBS洗一次.
优化方案中，所述固定液：90％酒精，5％of 1x PBS及5％乙酸，临用配制。
所述细胞原位银染步骤为：在微孔膜上加入150微升的25％硝酸银，然后加入150微升2％明胶含2％甲酸，在室温20℃，约反应30-45分钟,避光；反应完毕，水洗2-3次，最后用10％乙酸处理5-10分钟,水洗2次。
反应中温度越高，反应越快，时间要短些。与微孔膜的前处理步骤结合一起，又明确反应温度的时间，改变了试剂的用量等。
本发明中细胞原位银染法从核质比例及不规则核仁特征及数量，有助于鉴定肿瘤细胞，加上检测白细胞CD45抗原及细胞核荧光染色，排斥血源性细胞，加上检测细胞角蛋白(CK18或19)等肿瘤标记物及器官特异性的蛋白标志物，进一步分析待检细胞的癌变性质及其可能的器官来源。
其中，核质比例视不同肿瘤细胞及阶段有异，肿瘤细胞核较大，而细胞质相对体积小。在12孔板操作，加试剂量取决微孔膜大小，用250毫微升20％硝酸银即可，与CTC量关系不大。不规则核仁即核仁是细胞核中着色较深的区域，正常细胞一般为1-2个，呈球状或椭圆形等，而肿瘤细胞核仁一般多个，不规则形。
所述免疫荧光检测步骤为：多聚甲醛的固定:用4％PFA/PBS液固定5-10分钟，PBS洗2次，然后0.1％Triton X-100处理3-5分钟。其它步骤按安方生物的CTC检测试剂盒的SOP的操作进行。该试剂盒有CD45抗体及CK抗体系列，并加上Dapi染细胞核。
本发明中鉴定技术可应用于癌症患者外周血循肿瘤细胞、血源性恶性细胞以及实体瘤组织切片的形态检测、初步鉴定，还包括其它体液，如淋巴液，尿液，腹水及脑脊液等的检测；也应用于肿瘤高危人群通过检测外周血CTC，进行肿瘤早期筛查和应用手动物肿瘤CTC的检测分析。
本发明利用检测肿瘤细胞的形态学标准(肿瘤细胞核质/细胞质比例大，核仁一个或多个，不规则，核膜常呈粗糙不规则)，先将肿瘤患者外周血中CTC富集过滤到具有一定直径的微孔膜上，再通过细胞原位银染法鉴定肿瘤细胞，结合荧光显微技术检测相关肿瘤蛋白标志物，在原位结合细胞银染及免疫荧光染色技术，既检测了待检细胞是否具有肿瘤的性质，又能通过组织特异性的蛋白标志物，确定CTC的器官来源，有助于为CTC的检测建立统一的标准，以克服当今CTC技术在临床应用中存在的瓶颈问题。
本发明中方法具有易于操作、重复性好、稳定性强等优点,可应用于肿瘤高危人群的早期筛查、癌症患者的疗效评估及复发监控。
附图说明
图1为本发明中为外周血样本、银染检验CTC及区分白细胞及红细胞的免疫荧光检测图
图2为本发明中以人肝癌细胞系(HepG2)为检测、表明银染后不影响核Dapi染色的免疫荧光检测图
图3为本发明中人肝癌细胞系(Huh7.5.1)富集于微孔膜上的亚甲蓝染色图(20X，BF)
图4为本发明中原发性肝癌患者外周血细胞过滤至微孔膜的亚甲蓝染色图
图5为本发明中试验五的荧光染色分析中Dapi及抗CK抗体检测图
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步说明，其中微孔膜多用纳米材料(友芝友及安方生物产品，应用友芝友及安方系统，几乎看不到红细胞，白细胞远比罗氏膜少)，微孔膜多用纳米材料(安方生物及友芝友产品)、CTC检测试剂盒(武汉友芝友或安方生物)：
实施例1
(1)外周血的采集、运输及存放，样本前处理：
按标准的采样程序进行，用BD EDTA抗凝管取3-5毫升，按90度角，轻轻上下轻摇8次，将血样用低温冰袋(8℃)运输。若放置室温，需在2小时内用于实验操作，或可存放于4度冰箱约一天。
(2)CTC的富集及分离：用CTC捕获仪进行富集与分离，分离于微孔滤膜上。
(3)微孔膜上的细胞固定：CTC的细胞形态鉴定及免疫荧光检测；
CTC在膜上富集后需加以固定，其中固定液：90％酒精，5％of 1x PBS及5％乙酸，临用配制，可用1ml固定液加入细胞过滤器，固定至少3分钟，用PBS洗二次。将微孔膜从细胞过滤器中取出，移至12孔板中，PBS洗一次。
微孔膜为圆形微孔膜，直径0.5cm，微孔直径10微米。CTC的微孔膜过滤系统，不但用于已确诊的肿瘤患者的疗效评估、预后及复发监测，也可用于肿瘤高危人群的早筛早诊，是肿瘤早期的一种标志。CTC检出率可在90％以上。
(4)细胞银染：
在微孔膜上加入150微升的20％硝酸银，然后加入150微升2％明胶含2％甲酸，在室温20℃约反应30min,避光。反应完毕，水洗3次，最后用10％乙酸处理10分钟。水洗2次。
(5)免疫荧光检测：
多聚甲醛的固定:用4％PFA/PBS液固定5min，PBS洗2次，然后0.1％Triton X-100处理5分钟。其它步骤按安方生物的CTC检测试剂盒的SOP的操作进行。该试剂盒有CD45抗体及CK抗体系列，并加上Dapi染细胞核。
从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否为肿瘤细胞的标准为肿瘤细胞病理学所公认。
从样本采样、运输、贮存、分离富集、鉴定的各个环节影响其效果，银染及后续检测每一步的重复性非常好。在分离富集后，先对微孔膜进行银染，然后对同一个膜进行免疫荧光检测，银染不影响后续操作及镜检，这样在同一镜检视野内，鉴定出循环肿瘤细胞(CTC)及CTC的器官来源。银染后，可见核及核仁，无须Dapi染，而组织特异性抗体阳性，表明不是白细胞，也不是血液干细胞。所以CD45，CK波形蛋白的检测，不是必须的。如人细胞角蛋白17、18、波形蛋白为阴性，不能就断定不是CTC，若银染给出的是正常细胞的形态学，就可排除是CTC。结合组织特异性抗原检测，可确定其细胞来源。其中假阳性是指正常细胞被检成CTC，这涉及鉴定的准确性；假阴性，是指CTC当成正常细胞而漏检。
外周血中的CTC检测，鉴定血样中涉及定性(是否有CTC)或定量分析(CTC含量)，肿瘤患者外周每毫升含CTC从个位数至数千，因患者肿瘤不同发展时期而异。一般认为若每7.5毫升外周血有1个CTC，患者预后不佳，数值愈高，预后愈差。
实施例2
(1)外周血的采集、运输及存放，样本前处理：
按标准的采样程序进行，用BD EDTA抗凝管取3-10毫升，按90度角，轻轻上下轻摇8次，将血样用低温冰袋(4℃)运输。若放置室温，需在2小时内用于实验操作，或可存放于4度冰箱约一天。
(2)CTC的富集及分离：用CTC捕获仪进行富集与分离，分离于微孔滤膜上。
(3)微孔膜上的细胞固定：CTC的细胞形态鉴定及免疫荧光检测；
CTC在膜上富集后需加以固定，其中固定液：90％酒精，5％of 1x PBS及5％乙酸，临用配制，可用1ml固定液加入细胞过滤器，固定至少5分钟，用PBS洗二次。将微孔膜从细胞过滤器中取出，移至24孔板中，PBS洗一次。
微孔膜为圆形微孔膜，直径1cm，微孔直径8微米。
(4)微孔膜的前处理：
用0.01N HCl处理3min，水洗3次，然后用0.05％Triton-100/PBS，处理5分钟，水洗2次。
建立了在网孔膜上原位鉴定CTC的方法体系，建立了肝癌CTC分离鉴定的临床检测系统。
(5)细胞银染：
在微孔膜上加入150微升的20％硝酸银，然后加入150微升2％明胶含2％甲酸，在室温20℃约反应45min,避光。反应完毕，水洗2-3次，最后用10％乙酸处理5分钟。水洗2次。
(6)免疫荧光检测：
多聚甲醛的固定:用4％PFA/PBS液固定8min，PBS洗2次，然后0.1％Triton X-100处理4分钟。其它步骤按安方生物的CTC检测试剂盒的SOP的操作进行。该试剂盒有CD45抗体及CK抗体系列，并加上Dapi染细胞核。
实施例3
(1)外周血的采集、运输及存放，样本前处理：
按标准的采样程序进行，用BD EDTA抗凝管取3-5毫升，按90度角，轻轻上下轻摇8次，将血样用低温冰袋(6℃)运输。若放置室温，需在2小时内用于实验操作，或可存放于4度冰箱约一天。
(2)CTC的富集及分离：用CTC捕获仪进行富集与分离，分离于微孔滤膜上。
(3)微孔膜上的细胞固定：CTC的细胞形态鉴定及免疫荧光检测；
CTC在膜上富集后需加以固定，其中固定液：90％酒精，5％of 1x PBS及5％乙酸，临用配制，可用1ml固定液加入细胞过滤器，固定至少4分钟，用PBS洗二次。将微孔膜从细胞过滤器中取出，移至24孔板中，PBS洗一次。
微孔膜为锥形微孔膜，直径0.8cm，微孔直径10微米。
(4)微孔膜的前处理：
用0.01N HCl处理5min，水洗3次，然后用0.05％Triton-100/PBS，处理4分钟，水洗2次。
(5)细胞银染：
在微孔膜上加入250微升的20％硝酸银，然后加入250微升2％明胶含2％甲酸，在室温20℃约反应40min,避光。反应完毕，水洗2次，最后用10％乙酸处理5-10分钟。水洗2次。(6)醋酸溶液的再固定：步骤具体为10％乙酸处理8分钟,水洗2次。
Triton处理步骤的具体操作为0.1％Triton X-100处理5分钟。
(7)免疫荧光检测：
多聚甲醛的固定:用4％PFA/PBS液固定10min，PBS洗2次，然后0.1％Triton X-100处理3分钟。其它步骤按安方生物的CTC检测试剂盒的SOP的操作进行。该试剂盒有CD45抗体及CK抗体系列，并加上dapi染细胞核。
实施例4
其它内容如实施例3中，步骤(3)微孔膜上的细胞固定中，微孔膜为圆形微孔膜，直径0.7cm，微孔直径8微米；醋酸溶液的再固定：步骤具体为10％乙酸处理10分钟,水洗2次。Triton处理步骤的具体操作为0.1％Triton X-100处理3分钟。
微孔膜的前处理：用0.01N HCl处理4min，水洗3次，然后用0.05％Triton-100/PBS，处理3分钟，水洗2次。
实施例5
其它内容如实施例3中，步骤(3)微孔膜上的细胞固定中，微孔膜为圆形微孔膜，直径0.6cm，微孔直径10微米；醋酸溶液的再固定：步骤具体为10％乙酸处理5分钟,水洗2次。Triton处理步骤的具体操作为0.1％Triton X-100处理4分钟。
微孔膜的前处理：用0.01N HCl处理3min，水洗3次，然后用0.05％Triton-100/PBS，处理4分钟，水洗2次。
试验一
检测对像共300余例患者，用罗氏公司的醋酸纤维微孔膜，其上孔数有限，用压力泵过滤，操作非常简单，但膜上残留的血细胞太多，不易镜检，阳性率平均80％以上。检测对像：主要是肺癌、乳腺癌、胃癌病人，少数肝癌患者。试验中主要对原发性肝癌患者(HCC，用不同分离系统，检测了几十例，检出率都在90％以上)。
比较文献中所报道的强生CellSearchTM技术，结合本发明的试验结果，总结结果如下表1：
表1 CTC检测比较
Figure BDA0002575242370000111
从以上表中可以看出，本发明中检测方法成本低，易操作，检测范围广，具有高灵敏度和准确测定率，不但能鉴定癌细胞，而且能区别恶性与良性细胞。检测方法重复性、稳定性很好。
试验二肝癌CTC的分离及鉴定
以人肝癌细胞系为检测，用本发明中实施例3中技术(即“外周血的采集、运输及存放，样本前处理--CTC的富集及分离--微孔膜上的细胞固定--微孔膜的前处理--细胞银染--醋酸溶液的再固定步骤--免疫荧光检测”)进行检测，采用了微孔膜过滤法富集肝癌CTC，对CTC的回收率高，如图1和图2。
图1(银染)表明银染法能区分CTC及红细胞，荧光检测表明一些肿瘤标记蛋白在CTC中呈阳性。图2表明银染后，微孔膜可用于Dapi染色，银染后不影响免疫荧光检测。
试验三
人肝癌细胞系(Huh7.5.1)按友芝友CTC细胞捕获仪的标准程序，富集过滤至友芝友的微孔膜上(可含细胞数百至数万个/膜)，甲醇固定后，将膜从CTC过滤器中取出，按公司SOPs，然而将微孔膜小心转移至24孔板的小孔中，膜正面朝上，可用水将膜展开，用0.5毫升甲醇，处理几秒钟，吸取丢尽甲醇，采用友芝友的亚甲蓝/曙红染色试剂盒，先加100微升曙红液，处理1分钟，然后直接加300微升PBS液，轻轻混匀混合液，之后，去除混合液，加入200微升亚甲蓝溶液，染2分钟，去除染液，加入0.5毫升去离子水，重复洗2-3次，可将膜移至载玻片，65度烤箱20-30分钟后，用中性树胶封片，再烤10-15分钟，可永久保存封片。若不封片，微孔膜经镜检后，可做免疫荧光检测，但亚甲蓝染片对溶液的酸碱度敏感，会失去原有颜色，如图3所示。
图3中是一种阳性对照实验，表明对已知的肿瘤细胞可以在微孔膜上经染色而镜检观察。基于亚甲蓝/曙红的染色法，这种方法缺陷明显，核内精细结构看不清，不能区分血细胞的母系/祖系细胞。染色后，做IF(免疫荧光)，亚甲蓝退色或变色。
为此，本发明中的银染法的优势在此，如试验二中所示。
基于亚甲蓝/曙红的染色法，是友芝友公司的主要检测手段，也是卞修武院士等出版了中国CTC研究的第一部专著《循环肿瘤细胞病理学图鉴与应用》的基本方法(华中科技大学出版社，2017)。CTC细胞染色的一种常用方法，不足很多，染核仁不行，亚甲蓝后，再操作，易脱色。
试验四
原发性肝癌患者的外周血2毫升，与8毫升生理盐水(含0.25毫升的8％PFA，多聚甲醛溶液)，经友芝友CTC捕获仪过滤富集，甲醇固定后，移至24孔培养板小孔中，并经上述亚甲蓝染色(如试验三中染色部份内容)，在普通光镜检的结果。如图4所示。
图4(20X，BF：明视野)中可见一个特大的细胞，可能是CTC，核质比例大，但证据不充分，需要银染结合免疫荧光镜检分析。
本发明中对原发性肝癌患者(HCC，用不同分离系统，检测了几十例，检出率都在90％以上，从而证明了外周血有CTC的存在。
对于肝癌CTC的分离，国内外多采用EpCam或一种唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor,ASGPR)的抗体磁珠捕获法(如Fan,J.L.,et al.,CellPhysiol.Biochem.2015.37:629-640中所示)，或显微流式技术(如Ogle,L.F.,et al.,J Hepatol.2016,http://dx.doi.org/10.1016/j.jhep.2016.04.014中所示)。由于尚不明确肝癌细胞表面特异性抗原，不宜采用基于抗体的磁珠或微流控芯片法。肝脏细胞较大，肝癌CTC一般都大于10微米，且肝癌细胞表面特异性抗原不明，用抗体富集(如免疫磁珠法)易产生漏检(不带相应抗原的CTC或假阳性(带有相应抗原的正常细胞)。也有用过滤法进行检测，即采用将CTC富集到微孔膜上，而后进行常用的细胞形态及免疫化学的检测，在缺乏有效抗体捕获特异性的肝癌CTC，过滤法有一定的应用性。
试验五
采集原发性肝癌患者的外周血，不经固定(指样本前处理，不加PFA(固定剂处理)，过滤到膜上后，不经过如甲醇等任何固定剂的处理，膜上为活细胞，然后进行培养)，培养1～2周后，镜检无明显的悬浮细胞，收集细胞培养液，4℃离心1000rpm 15min，离心沉淀物中完整细胞不多，而用无细胞的上清液，加入肝癌细胞系细胞(HepG2)，过滤到微孔膜上，按银染法后，进行抗CK18及19抗体(带FITC荧光标记)的免疫荧光及Dapi染色实验，见图5所示。可知运用本发明中银染后是不会干扰后续的蛋白荧光检测。
银染后(细胞在培养板上、载玻片上或细胞在微孔膜上)，可进入免疫荧光实验，不影响Dapi染细胞核(是DNA荧光染料，因核中富含DNA，且Dapi易于渗透，信号极强，与不银染的作为对照，没有区别。而CK抗体检细胞角蛋白(带FITC的标记)，呈绿色。
本发明首先提出用细胞银染法，先鉴定是否是肿瘤细胞，然后结合细胞免疫荧光显微技术，确定其组织来源，如肝脏特异性蛋白标志物，这样可初步确定CTC的器官来源。
本发明中银染法在显微镜下，用普通光看银染，初步确定是否是肿瘤细胞，而在同一视野用免疫荧光标志，更进一步证明是否是肿瘤细胞，而器官组织特异性的蛋白标记，可表明CTC的器官来源，这在临床检测上非常重要。因为CTC的形态检测，一直缺乏行业标准，是临床应用的主要瓶颈，本发明为CTC的细胞学形态鉴定奠定坚实的基础。依据实验或诊疗的需求,选用适宜的CTC分离及富集方法,用同样的方法比较患者术前及术后动态观察的CTC相对值,大量研究表明其预后及疗效评估的重要临床价值。本发明可应用于肿瘤高危人群的早期筛查、癌症患者的疗效评估及复发监控。除检测实体瘤CTC外，本发明也可能适用于血源性恶性细胞的初步鉴定。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征以及本发明的优点，上述实施例和说明书所描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都将落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：患者体液依次经取样、样本前处理、CTC富集分离于微孔滤膜上、固定细胞、细胞银染和免疫荧光原位检测步骤，从核质比例、不规则核仁特征及数量来确定是否是肿瘤细胞，最后通过组织器官特异性蛋白标志物的荧光免疫检测，确定血液中CTC的器官组织来源。
2.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述固定细胞步骤和细胞银染步骤之间还有微孔膜的前处理步骤。
3.根据权利要求2所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述微孔膜的前处理为：用0.01N HCl处理3-5min，水洗后用0.05％Triton X-100/PBS处理3-5min，再水洗。
4.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞银染步骤与免疫荧光原位检测步骤之间还设有银染后的再固定步骤及Triton处理步骤，银染后的再固定步骤为用醋酸溶液固定处理。
5.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述微孔膜为圆形或锥形微孔膜，直径0.5-1cm，微孔直径8或10微米。
6.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞固定步骤为：用1ml固定液加入细胞过滤器，固定至少3-5min，再用PBS洗二次，将微孔膜从细胞过滤器中取出，移至12或24孔板中，PBS洗一次；所述固定液：90％酒精，5％of 1x PBS及5％乙酸。
7.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述细胞原位银染步骤为：在微孔膜上加入150微升的20％硝酸银，然后加入150微升2％明胶含2％甲酸，在室温20℃，约反应30-45min,避光；反应完毕，水洗2-3次，最后用10％乙酸处理3-5min，水洗2次。
8.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：所述免疫荧光检测步骤为：多聚甲醛的固定:用4％PFA/PBS液固定5-10min，PBS洗2次，然后0.1％Triton X-100处理3-5min。
9.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：应用于癌症患者外周血循肿瘤细胞、血源性恶性细胞以及实体瘤组织切片的形态检测，还包括其它体液，如淋巴液，尿液，腹水及脑脊液的检测。
10.根据权利要求1所述的一种新型循环肿瘤细胞的鉴定技术，其特征在于：不依赖组织活检样本，应用非侵入的方法，用于肿瘤高危人群通过检测外周血CTC，进行肿瘤早期筛查；确诊肿瘤的患者的疗法评估及术后复发监控的CTC检测。
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