CN113466000A - 基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，包括如下步骤：获取病患腹腔肿瘤胸水；通过穿刺引流法使用胸水引流装置将病患的胸腔积水引流出，然后送检；分析胸水获取病理特征；首先使用流式细胞仪对送检胸水进行检测，判断多核细胞的存在，然后通过密度梯度离心法对送检胸水离心获取胸水脱落细胞，结合细胞学免疫组化判定肿瘤的病理类型，最后从胸水脱落细胞中提取DNA，并进行分子基因检测；靶向药确定以及临床治疗确定；根据获取的肿瘤细胞病理类型以及基因突变数据，确定肿瘤细胞的敏感药物和靶向药物。本发明提供基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，具有成本低，操作简单，对病患伤害小的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤诊治技术领域，具体是基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法。
背景技术
目前的数据表明，胸腹水脱落细胞学检查通常经简单离心后获取细胞沉淀后进行涂片，在肿瘤细胞数量较少的情况下，红细胞、炎性细胞等对结果的判定干扰较大，容易发生漏诊，这也是通过胸腹水细胞病理学方法获得肿瘤细胞学诊断的阳性率不足三分之一的主要原因。另外，部分胸水沉淀因肿瘤细胞数量少且呈离散状态，导致难于判断病理类型和细胞分化程度，不易获得病理类型。因此，提高胸水中肿瘤细胞的纯度，将有利于提高恶性胸水细胞学诊断的阳性率。目前，肿瘤细胞的分离有多种方法，以免疫磁珠法和流式分选较为先进，但由于脱落细胞来源不同，因此需特异性肿瘤细胞抗体，以及专用设备，对操作要求比较高，且价格昂贵，不利于临床开展；现今，液基细胞学检查也逐步应用到了胸腹水脱落细胞的分离，其优势在于离心的同时可以使细胞直接粘附在载玻片上，最大限度的保留细胞，然而此方法同样需要专用的设备，价格昂贵。
另外，分子靶向治疗药物已成为多种恶性肿瘤治疗的有效手段，明确肿瘤来源和类型，并进行基因扩增、突变或测序等相关分子病理学检测是筛选靶向药物的必要前提。分子病理基因诊断一般都是基于DNA水平进行测序或者基因扩增，因此有效的提取肿瘤细胞的DNA是进行分子检测的首要条件。以往，对于非小细胞癌进行EGFR突变检测基本都是从组织石蜡标本中提取DNA，由于在石蜡标本制备过程中经过脱水、修复等过程，会导致部分的DNA发生断裂，DNA的完整性遭到破坏。尤其对于胸水细胞沉淀的石蜡标本中肿瘤细胞数量少，加上石蜡包埋处理，不易获取肿瘤细胞完整的DNA，从而导致基于肿瘤细胞DNA分子检测为指导的靶向用药无法开展。
为此，发明人综合各类因素提出了基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，包括如下步骤：
S1：获取病患腹腔肿瘤胸水；通过穿刺引流法使用胸水引流装置将病患的胸腔积水引流出，取量50～200ml，然后送检；
S2：分析胸水获取病理特征；病理特征获取按三步法进行，首先使用流式细胞仪对送检胸水进行检测，判断多核细胞的存在，然后通过密度梯度离心法对送检胸水离心获取胸水脱落细胞，结合细胞学免疫组化判定肿瘤的病理类型，最后从胸水脱落细胞中提取DNA，并进行分子基因检测；
S3：靶向药确定以及临床治疗确定；根据获取的肿瘤细胞病理类型以及基因突变数据，确定肿瘤细胞的敏感药物和靶向药物，结合病患生理状态以及临床数据制定临床治疗流程。
作为本发明的进一步方案：上述三步法具体为：一，由流式细胞仪对胸水进行分析和分选，判断时候存在异性细胞，存在时进行第二步；二，使用密度梯度离心法纯化富集的胸水细胞，然后使用移液器抽取少量胸水至于载玻片上细胞涂片，进行HE染色并显微观察初步诊断胸水中肿瘤细胞的良恶性，再将沉淀细胞制备成石蜡块，并进行检测进一步明确良恶性，同时通过免疫组化对肿瘤细胞进行病理分析；三，从活细胞沉淀中提取DNA并检测，明确为非小细胞肺癌时进行EGFR基因突变检测。
作为本发明的再进一步方案：上述穿刺引流作业流程如下：先让病患面朝椅背左立，双臂向前平展开，前额扶于前臂上，不能起床的病患保持半坐，同时前臂上举；然后选取胸部叩诊实音最明显部位作为穿刺点，穿刺点位皮肤进行常规消毒，操作人员带无菌手套，穿刺位覆盖消毒洞巾；再使用2％利多卡因在穿刺点下侧从皮至胸膜壁层进行局部浸润麻醉；再然后进行穿刺，穿刺时左手食指与中指固定穿刺位皮肤，右手将穿刺针从穿刺点处缓慢刺入，针锋抵抗感消失时即表穿刺到位，打开三通活栓进行排液引流；引流至胸腔无积气或积液，或引流液为少量淡黄色血清样渗液，肺膨胀良好时停止，进行拔针，拔针时病患先深吸气然后屏气，迅速将引流针拔出，创口立即使用准备好的敷料进行覆盖，稍用力压迫，然后进行包扎固定，嘱托病患静卧即可。
作为本发明的再进一步方案：胸水送检时间以胸水引流出开始不超过30min。
作为本发明的再进一步方案：在进行分析检测时，胸水采集至离心，间隔时间不得超过6小时，在对胸水细胞沉淀中获取检测所需DNA时，需要立即进行抽提或将细胞冻存在-20℃以下冰箱中做间歇放置。
作为本发明的再进一步方案：上述HE染色方法包括如下：先使用脱蜡剂进行脱蜡处理，脱蜡处理三次，每次使用松节油处理110～130秒，并使用乙醇洗去残留的松节油；然后进行复水作业，复水使用浓度为90％的乙醇溶液进行处理，处理三次，每次持续60～70秒；最后进行苏木素染色，使用苏木素持续染色150～180秒，然后依次进行乙醇漂洗、蒸馏水漂洗与二甲苯透明即可。
作为本发明的再进一步方案：在复水完成后，同时使用EDTA抗原修复液进行处理。
与现有技术相比，本发明具有以下几个方面的有益效果：
1、本发明提供基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，本发明中通过前期从非小细胞肺癌阳性胸水通过密度梯度离心法分离得到的细胞沉淀中提取DNA，并与其对应的组织标本的EGFR基因突变情况进行对比，相较于从石蜡块中提取出来的DNA，通过密度梯度离心法分离得到的细胞沉淀所提取的DNA浓度高更高、纯度更纯，且DNA更完整性，明显优于从石蜡块中提取出来的DNA，能够较好的满足后续应用实时荧光定量PCR方法检测EGFR基因突变的要求，从而提高最终对肿瘤细胞的病理定型准确度，保障后续的治疗安排；
2、本发明通过病患的胸水来进行病理分型检测，对病患来说，创口小，疼痛以及不适感轻，且胸水为治疗过程中本身就需要引流出，本发明不额外增加创口，因此，不会对病患造成除胸腔穿刺引流过程中出现的不适反应以外的不良反应和并发症，安全可靠；
3、同时本发明成本相比带来的优点，成本提升幅度小，只在常规的胸水细胞学检查费用基础上增加了细胞分离液的价格，而平均一瓶100ml的细胞分离液价格为800元，每次使用量为5ml，因此价格只额外增加了40元的费用；
4、本发明提供的诊治方法专业性要求低，在前期胸水引流时普通医生即可进行操作，且不使用到其他复杂高价设备，后期检测由现有的专业检测人员检测，操作更加简单化经济化。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，包括如下步骤：
步骤一：获取病患腹腔肿瘤胸水；通过穿刺引流法使用胸水引流装置将病患的胸腔积水引流出，取量50～200ml，然后送检，送检时间以胸水引流出开始不超过30min；
步骤二：分析胸水获取病理特征；病理特征获取按三步法进行，首先使用流式细胞仪对送检胸水进行检测，判断多核细胞的存在，然后通过密度梯度离心法对送检胸水离心获取胸水脱落细胞，结合细胞学免疫组化判定肿瘤的病理类型，最后从胸水脱落细胞中提取DNA，并进行分子基因检测；
步骤三：靶向药确定以及临床治疗确定；根据获取的肿瘤细胞病理类型以及基因突变数据，确定肿瘤细胞的敏感药物和靶向药物，结合病患生理状态以及临床数据制定临床治疗流程。
所述三步法具体为：一，由流式细胞仪对胸水进行分析和分选，判断时候存在异性细胞，存在时进行第二步；二，使用密度梯度离心法纯化富集的胸水细胞，然后使用移液器抽取少量胸水至于载玻片上进行细胞涂片，然后进行HE染色并显微观察初步诊断胸水中肿瘤细胞的良恶性，再将沉淀细胞制备成石蜡块，并进行检测进一步明确良恶性，同时通过免疫组化对肿瘤细胞进行病理分析；三，从活细胞沉淀中提取DNA并检测，明确为非小细胞肺癌时进行EGFR基因突变检测；
穿刺引流作业流程如下：先让病患面朝椅背左立，双臂向前平展开，前额扶于前臂上，不能起床的病患保持半坐，同时前臂上举；然后选取胸部叩诊实音最明显部位作为穿刺点，穿刺点位皮肤进行常规消毒，操作人员带无菌手套，穿刺位覆盖消毒洞巾；再使用2％利多卡因在穿刺点下侧从皮至胸膜壁层进行局部浸润麻醉；再然后进行穿刺，穿刺时左手食指与中指固定穿刺位皮肤，右手将穿刺针从穿刺点处缓慢刺入，针锋抵抗感消失时即表穿刺到位，打开三通活栓进行排液引流；引流至胸腔无积气或积液，或引流液为少量淡黄色血清样渗液，肺膨胀良好时停止，进行拔针，拔针时病患先深吸气然后屏气，迅速将引流针拔出，创口立即使用准备好的敷料进行覆盖，稍用力压迫，然后进行包扎固定，嘱托病患静卧即可；
在进行分析检测时，为保证细胞的活性完整性，胸水采集至离心，间隔时间不得超过6小时，在对胸水细胞沉淀中获取检测所需DNA时，需要立即进行抽提或将细胞冻存在-20℃以下冰箱中做间歇放置；
上述HE染色方法包括如下：先使用脱蜡剂进行脱蜡处理，脱蜡处理三次，每次使用松节油处理110～130秒，并使用乙醇洗去残留的松节油；然后进行复水作业，复水使用浓度为90％的乙醇溶液进行处理，处理三次，每次持续60～70秒；最后进行苏木素染色，使用苏木素持续染色150～180秒，然后依次进行乙醇漂洗、蒸馏水漂洗与二甲苯透明即可。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (7)
1.基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：获取病患腹腔肿瘤胸水；通过穿刺引流法使用胸水引流装置将病患的胸腔积水引流出，取量50～200ml，然后送检；
S2：分析胸水获取病理特征；病理特征获取按三步法进行，首先使用流式细胞仪对送检胸水进行检测，判断多核细胞的存在，然后通过密度梯度离心法对送检胸水离心获取胸水脱落细胞，结合细胞学免疫组化判定肿瘤的病理类型，最后从胸水脱落细胞中提取DNA，并进行分子基因检测；
S3：靶向药确定以及临床治疗确定；根据获取的肿瘤细胞病理类型以及基因突变数据，确定肿瘤细胞的敏感药物和靶向药物，结合病患生理状态以及临床数据制定临床治疗流程。
2.根据权利要求1所述的基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，其特征在于，所述三步法具体为：一，由流式细胞仪对胸水进行分析和分选，判断时候存在异性细胞，存在时进行第二步；二，使用密度梯度离心法纯化富集的胸水细胞，然后使用移液器抽取少量胸水至于载玻片上细胞涂片，进行HE染色并显微观察初步诊断胸水中肿瘤细胞的良恶性，再将沉淀细胞制备成石蜡块，并进行检测进一步明确良恶性，同时通过免疫组化对肿瘤细胞进行病理分析；三，从活细胞沉淀中提取DNA并检测，明确为非小细胞肺癌时进行EGFR基因突变检测。
3.根据权利要求1所述的基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，其特征在于，所述穿刺引流作业流程如下：先让病患面朝椅背左立，双臂向前平展开，前额扶于前臂上，不能起床的病患保持半坐，同时前臂上举；然后选取胸部叩诊实音最明显部位作为穿刺点，穿刺点位皮肤进行常规消毒，操作人员带无菌手套，穿刺位覆盖消毒洞巾；再使用2％利多卡因在穿刺点下侧从皮至胸膜壁层进行局部浸润麻醉；再然后进行穿刺，穿刺时左手食指与中指固定穿刺位皮肤，右手将穿刺针从穿刺点处缓慢刺入，针锋抵抗感消失时即表穿刺到位，打开三通活栓进行排液引流；引流至胸腔无积气或积液，或引流液为少量淡黄色血清样渗液，肺膨胀良好时停止，进行拔针，拔针时病患先深吸气然后屏气，迅速将引流针拔出，创口立即使用准备好的敷料进行覆盖，稍用力压迫，然后进行包扎固定，嘱托病患静卧即可。
4.根据权利要求3所述的基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，其特征在于，胸水送检时间以胸水引流出开始不超过30min。
5.根据权利要求1～4任一所述的基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，其特征在于，在进行分析检测时，胸水采集至离心，间隔时间不得超过6小时，在对胸水细胞沉淀中获取检测所需DNA时，需要立即进行抽提或将细胞冻存在-20℃以下冰箱中做间歇放置。
6.根据权利要求3所述的基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，其特征在于，所述HE染色方法包括如下：先使用脱蜡剂进行脱蜡处理，脱蜡处理三次，每次使用松节油处理110～130秒，并使用乙醇洗去残留的松节油；然后进行复水作业，复水使用浓度为90％的乙醇溶液进行处理，处理三次，每次持续60～70秒；最后进行苏木素染色，使用苏木素持续染色150～180秒，然后依次进行乙醇漂洗、蒸馏水漂洗与二甲苯透明即可。
7.根据权利要求6所述的基于多维度纯化富集技术的恶性胸水检测方法，其特征在于，在复水完成后，同时使用EDTA抗原修复液进行处理。
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