CN109182524A - 一种辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物及其应用 - Google Patents
一种辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物，所述的miRNA标志物为miR‑21、miR‑92a、miR‑218、miR‑29a、miR‑375、miR‑34a。本发明宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒，检测样本为宫颈脱落细胞，非侵入，减少病人痛苦，填补宫颈癌标记物方面的空白，检测准确率不低于现有技术，操作简便、样本保存方便、不受取样位置和手法的影响。
Description
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学技术领域，具体涉及一种辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物及其应用。
背景技术
宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占全球女性恶性肿瘤的第二位，仅次于乳腺癌。2011年，Lancet刊出的宫颈癌最新统计结果显示：从1980年到2010年，全球宫颈癌发病率平均以每年0.6％的增幅递增，仅2010年一年中，发展中国家因宫颈癌死亡的女性总数就达到200,000之多，死亡年龄也更趋于年轻化。宫颈癌的高发病率和年轻化趋势严重影响着中国广大妇女的健康和生活质量，因此对宫颈癌或其癌前病变的早期诊断和防治意义十分重大。
宫颈癌的发生是一个缓慢的过程，浸润性宫颈癌发生前通常有10-20年左右的癌前病变阶段，这一浸润前阶段在WHO的分类标准中被称作宫颈上皮内瘤样病变(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)。根据非典型细胞占宫颈上皮全层的厚度，可将CIN进一步分CIN可分为3期，即轻度上皮内瘤样病变(CIN I)，中度上皮内瘤样病变(CIN II)和重度上皮内瘤样病变(CIN III)，而原位癌归类于CIN III期。从CIN I期发展为浸润癌约需8-15年左右的时间，大部分CINI是短暂的，大约有60％左右的CINI还可逆转为正常，而中度和高度CIN进展为癌的可能性却很大，约有超过10％的CINIII会进展为浸润癌。但如果能很好地把握癌前病变这段时间，早期做出准确的诊断，及时采取相应的措施，就可以极大地提高宫颈癌的治愈率和生存率，甚至预防宫颈癌的发生。因此，有效准确的诊断手段显得尤为重要。
目前宫颈癌筛查主要有宫颈细胞学检查以及HPV检查。德国著名医学科学家Harald zur Hausen早在20世纪70年代研究发现高危型人乳头状瘤病毒(HumanPapillomavirus，HPV)感染是宫颈癌的成因。基于高危型HPV与宫颈癌之间存在明确的病因关系，HPV检测已被欧洲生殖道感染和肿瘤研究组织(EUROGIN)推荐作为宫颈癌的初筛手段。然而，HPV检测的最大局限性在于阳性预测值低。有研究表明，近90％的HPV阳性妇女是一过性感染，HPV会在2年内被机体免疫清除，仅有少数发展为持续感染，而在HPV持续感染的妇女中也仅有少数会最终发生宫颈癌，临床上，HPV检测容易导致阴道镜回叫率和宫颈活检的比例增加，造成过度诊疗，从而增加了患者的精神压力及随诊费用。宫颈细胞学检查具有高特异性和高阳性预测值的优点，已经被EUROGIN推荐作为HPV阳性妇女分层筛查方法，但其敏感性及阴性预测值均较低，结果判断有较大的主观性，而且诊断依赖于经过专业培训的细胞病理学医生。因此，我们亟需发现更加明确而有效的生物标志物，对宫颈癌及其癌前病变做出明确的辅助早期诊断，这将有助于对处于癌前病变的患者及时采取相应的措施，使癌前病变逆转为正常情况；同时可以帮助宫颈癌患者做出辅助早期诊断，有助于早期治疗，提高治愈率和生存率。
microRNA(miRNA)是近年来发现的一类非编码小分子RNA，它是一种由内源基因编码的、长度约21～24nt的非编码单链小分子RNA，其前体具有发夹结构，自身不含开放阅读框(ORF)，不能直接编码蛋白质，而是通过与靶基因结合介导其降解或翻译抑制。miRNAs参与了哺乳动物几乎所有的病理和生理活动，如个体发育、组织分化、细胞凋亡以及能量代谢等，与许多疾病的发生、发展存在着紧密的联系。研究表明，miRNA既可以作为抑癌基因，下调原癌基因的活性，也可以作为癌基因，下调抑癌基因的活性，在许多人类恶性肿瘤中均存在miRNA的异常表达。但是宫颈癌中miRNA的异常表达研究的比较晚，最早是2007年Lui等人首次发现宫颈癌中miRNA的差异表达。这些miRNA在宫颈癌及其癌前病变中的异常表达提示它们可作为宫颈癌的生物标记物，在宫颈癌辅助诊断中具有潜在的临床应用价值。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的在于提供一种与宫颈癌及其癌前病变辅助诊断相关的miRNA组合标志物及其引物、探针，该组标志物及其引物、探针可用于制备宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒，为宫颈癌及其癌前病变的筛查和早期诊断提供数据支持。
发明人通过分离和研究宫颈癌患者及与其年龄匹配的健康女性对照宫颈脱落细胞中的miRNAs，同时分离和研究年龄相匹配的CIN I/II/III期患者宫颈脱落细胞中的miRNAs，寻找一组与宫颈癌及其癌前病变高度相关的高特异性和敏感性的miRNAs，并研制出可便于临床应用的宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒，为宫颈癌及其癌前病变的筛查和诊断提供数据支持。
一种辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物，所述的miRNA标志物为miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a。
所述的miRNA标志物miR-21的反转录引物为如序列表SEQ ID NO.1所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，探针如需列表SEQ ID NO.4所示；miR-92a反转录引物如序列表SEQ ID NO.5所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，探针如序列表SEQ ID NO.8所示；miR-218的反转录引物如序列表SEQ ID NO.9所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，探针如序列表SEQ ID NO.12所示；miR-29a反转录引物如序列表SEQ ID NO.13所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，探针如序列表SEQ ID NO.16所示；miR-375反转录引物如序列表SEQ ID NO.17所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，探针如序列表SEQ ID NO.20所示；miR-34a反转录引物如序列表SEQ ID NO.21所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.22和SEQID NO.23所示，探针如序列表SEQ ID NO.24所示。
所述miRNA组合标志物miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a在制备宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒中的应用。
一种宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测宫颈脱落细胞中的miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a的含量。
所述的诊断试剂盒含有标志物miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a的引物及探针。
所述诊断试剂盒还包括逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶，以及标准品和/或对照品。
所述诊断试剂盒辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的方法，具体包括以下步骤：
1.检测样本准备：用液基细胞学检查专用的细胞软刷在宫颈表面顺时转旋转5圈后将刷子浸入液基细胞学检查专用的细胞保存液中，进行Small RNA提取。
2.逆转录：使用逆转录酶、特异性逆转录引物及其他原料，在特定的反应条件下，将宫颈脱落细胞中的Small RNA逆转录成cDNA。
3.PCR扩增：使用DNA聚合酶、特异性引物、探针及其他原料，在特定的反应条件下，使逆转录产物(cDNA)进行聚合酶链式反应(PCR)。通过设定阈值得各个miRNA以及内参(U6)的Ct值。
4.检测结果解释与分析：采用2-△△Ct法计算各miRNA的相对表达水平，ΔCt＝CT样本–CT内参(U6)，2-△△Ct数值越大表明miRNA的表达水平越高，2-△△Ct数值越小表明miRNA的表达水平越低。以SPSS软件(version17.0)进行统计分析，主要统计方法为Student t检验和非参数Mann-Whitney U检验，所有统计分析都采用双侧检验，P＜0.05时差异具有统计学显著性。
本发明的有益效果：本发明提供的miRNA组合作为宫颈癌及其癌前病变辅助诊断的标志物，检测样本为宫颈脱落细胞，非侵入，减少病人痛苦；本发明试剂盒填补宫颈癌标记物方面的空白；检测准确率不低于现有技术，操作简便、样本保存方便、不受取样位置和手法的影响，故总体效果优于现有技术。miRNAs是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类小分子RNA生物标志物的成功开发将为宫颈癌及其癌前病变的早期诊断开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。本发明研究宫颈脱落细胞miRNA在宫颈癌及其癌前病变辅助诊断的应用，阐述异常表达的miRNAs对于宫颈癌及癌前病变进展的影响，揭示其筛查和诊断价值。为临床医生快速准确掌握患者病情，为临床治疗效果评价奠定基础。
附图说明
图1为探针法检测miRNA原理图。
图2为miRNA相对表达量结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
实施例1：引物和探针设计以及反应体系的建立和优化
1.引物和探针的设计
根据miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a相应的序列，设计引物和探针。microRNA所述引物的序列是根据microRNA数据库(http://www.mirbase.org/)中报道的核苷酸序列miRNA-21(MIMAT0000076)、miRNA-92a(MIMAT0000092)、miRNA-218(MIMAT0000275)、miRNA-29a(MI0000087)、miR-375、miR-34a以及GeneBank数据库中的U6序列(108353825)为模板设计的。表1列出了所述miRNA的核苷酸序列。表2列出了所述miRNA及U6的引物及探针序列。
表1.miRNA序列
| miRNA | 序列 | 登录号 |
| miRNA-21 | UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA | MIMAT0000076 |
| miRNA-92a | UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU | MIMAT0000092 |
| miRNA-218 | UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU | MIMAT0000275 |
| miRNA-29a | UAGCACCAUCUGAAAUCGGUUA | MI0000087 |
| miR-375 | UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA | MIMAT0000728 |
| miR-34a | UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU | MIMAT0000255 |
U6序列(序列号：108353825)如下：
AAAGGACGAAACACCGTGCTCGCTTCGGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCATATTTTTACATCAGGTTGTTTTT
表2.miRNA及U6引物及探针序列
1.剂盒反应体系的建立和反应程序的优化
1.1标本采集
收集经阴道镜检查确诊的宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者及宫颈癌等系列人群，检测miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a和U6的表达水平。
1.2 Small RNA的提取及反转录
采用Takara的RNAiso for Small RNA(9753A)提取试剂盒进行Small RNA的提取，具体提取步骤如下：
用液基细胞学检查专用的细胞软刷在宫颈表面顺时转旋转5圈后将刷子浸入液基细胞学检查专用的细胞保存液中。用于进行Small RNA提取，提取方法如下：
(1)将细胞保存液(含宫颈脱落细胞)转移到15ml离心管中，4℃，1500rpm离心10分钟。
(2)弃上清，加入1.0ml 4℃RNAiso for Small RNA溶液。用移液器灭菌枪头反复吹打后转移到1.5ml灭菌离心管中，静置10分钟。
(3)向上述步骤2的匀浆裂解液中加入氯仿(RNAiso for Small RNA的1/5体积量)，盖紧离心管盖，用手剧烈振荡15秒(氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开)。待溶液充分乳化(无分相现象)后，再室温静置5分钟。
(4)12,000g 4℃离心15分钟。
(5)从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液转移至另一新的离心管中(切忌吸出白色中间层)。
(6)向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在15～30℃下静置10分钟。
(7)12,000g 4℃离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75％的乙醇1ml(切勿触及沉淀)，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，12,000g 4℃离心5分钟后小心弃去乙醇(为了更好地控制RNA中的盐离子含量，应尽量除净乙醇)。
(8)室温干燥沉淀2～5分钟(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解，有关RNA溶解可以参考Troubleshooting中的相关说明)，加入适量的RNase-free水溶解沉淀，必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后于-80℃保存。
按照以上提供的方法提取RNA后将其逆转录成cDNA，RNA的逆转录体系如下(表3)：
表3逆转录体系
| 组分 | 含量 |
| 5×逆转录缓冲液 | 2μl |
| 逆转录酶 | 0.5μl |
| 逆转录引物 | 0.5μl |
| RNA模板 | ＜500ng |
| 补水至 | 10ul |
反转录反应条件如下:
37℃15min(反转录反应)
85℃5sec(反转录酶的失活反应)
4℃∞
反转录得到的cDNA可直接用于后续的PCR反应，也可放置于-20℃备用。
1.3 PCR引物浓度的优化
在反应体系中，将miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a和U6的引物浓度分别从0.1μmol/L至0.5μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，其他条件不变，通过试验结果的分析比较，确定miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a和U6最佳引物终浓度分别为0.20μmol/L、0.20μmol/L、0.20μmol/L、0.20μmol/L、0.20μmol/L、0.20μmol/L、0.25μmol/L。
2.4镁离子浓度的优化
在反应体系中其它条件不变的前提下，将MgCl2的浓度从2.0mmol/L至5.0mmol/L以0.5mmol/L递增，其他条件不变，经过多次重复实验选定3.0mmol/L为试剂盒反应体系中的镁离子浓度。
2.5 Taq DNA聚合酶(Taq酶)用量的优化
通过比较Taq酶用量(以单位Unit计)的优化实验结果，选定3U作为试剂盒反应体系中Taq酶的用量。
2.6 dNTP浓度的优化
通过使用不同浓度的dNTP进行检测，综合评估后选0.25mmol/L作为试剂盒反应体系中dNTP的使用量。
2.7探针浓度的优化
在反应体系中，将探针浓度分别从0.05μmol/L至0.2μmol/L作倍比连续稀释后进行检测，其他条件不变，通过试验结果的分析比较，确定miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a和U6最佳探针终浓度为0.10μmol/L、0.10μmol/L、0.10μmol/L、0.10μmol/L、0.10μmol/L、0.10μmol/L、0.15μmol/L。
利用上述引物和探针进行反应体系的建立，最后确定采用的荧光PCR反应体系为20μl体系，所需各组分及相应浓度见表4。
表4.优化后的PCR反应体系
PCR反应程序如下：
实施例2检测样品中miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a、U6的表达量和确定其特异性实验
收集经扬州苏北人民医院经阴道镜检查确诊的宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者及宫颈癌等系列人群，以及宫颈健康人群，选择宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者分别20例、宫颈癌患者20例、正常人20例，共100例宫颈脱落细胞样本，检测miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a的表达水平及特异性。
检测结果判断：
各20例宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者、20例宫颈癌患者、20例健康对照者宫颈脱落细胞中miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a表达量见图2。对各20例宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者、20例宫颈癌患者、20例健康对照者宫颈脱落细胞中miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a和U6表达水平进行数据处理，研究对象中miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a的不同表达水平以2–ΔΔCt表示，其中ΔCt＝CT样本–CT内参(U6)，计算相对表达量。利用SPSS17.0进行统计分析结果得出：宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者和宫颈癌患者宫颈脱落细胞中miR-21、miR-92a相对表达水平随着宫颈癌进程的推展，表达量显著上升，即显示出CIN I＜CIN II＜CIN III＜CC的表达规律，差异具有统计学意义(P<0.05)，宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者和宫颈癌患者宫颈脱落细胞中miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a的相对表达水平随着宫颈癌进程的推展，表达量显著下降，即显示出CIN I＞CIN II＞CIN III＞CC的表达规律，差异具有统计学意义(P<0.05)，参看图2。
综合结果说明：宫颈脱落细胞中miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a表达水平可以作为肠癌诊断的标志物，具有重要的诊断价值。
实施例3 miRNA检测试剂盒的制备
miRNA检测试剂盒的制作和操作流程是基于RT-PCR和real-time PCR等技术。
试剂盒包括miRNA标志物miR-21的反转录引物为：SEQ ID NO.1，qPCR引物为SEQID NO.2和SEQ ID NO.3，探针为：SEQ ID NO.4。miR-92a反转录引物为：SEQ ID NO.5，qPCR引物为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7，探针为：SEQ ID NO.8。miR-218的反转录引物为：SEQID NO.9，qPCR引物为SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11，探针为：SEQ ID NO.12。miR-29a反转录引物为：SEQ ID NO.13，qPCR引物为SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，探针为：SEQ IDNO.16。miR-375反转录引物为：SEQ ID NO.17，qPCR引物为SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19，探针为：SEQ ID NO.20。miR-34a反转录引物为：SEQ ID NO.21，qPCR引物为SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23，探针为：SEQ ID NO.24。还可以有相应PCR反应所需的常用酶和/或试剂，如：逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水，荧光染料或探针、Taq酶等，可根据具体采用的实验方法选用，这些常用酶和/或试剂是本领域技术人员熟知的，另外还有阳性质控品和阴性质控品及正常参考值。此试剂盒的价值在于只需要宫颈脱落细胞而不需要其它组织样品，通过最精简的荧光或探针法检测miRNA的变化趋势，再通过该趋势辅助早期诊断宫颈癌及其癌前病变，不仅稳定，检测方便，且定量精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导临床准确做出辅助早期诊断。
实施例4 miRNA作为检测宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒与常规检测方法比较
分别用本发明试剂盒与传统宫颈癌检测方法宫颈细胞学检查以及目前用的较多的HPV检查进行特异性比较。
收集经扬州苏北人民医院经阴道镜检查确诊的宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者及宫颈癌等系列人群，以及宫颈健康人群，选择宫颈癌前病变CIN I/II/III期患者分别20例、宫颈癌患者20例、正常人20例，共100例宫颈脱落细胞样本，进行3种方法特异性的比较。
由检测结果可见，3种方法检测宫颈癌及其癌前病变的特异性差异较大，对于正常健康对照样本，HPV检测容易出现假阳性结果，而对于宫颈癌前病变不同时期，宫颈细胞学检查及HPV检查特异性明显不如本发明试剂盒，说明这两种方法对于检测宫颈癌癌前病变阶段存在一定的局限性，不能准确检测，而对于宫颈癌检测，3种方法特异性均较高，但相比较而言，本发明试剂盒优势更加明显，所以综上所述，本发明试剂盒能够进行宫颈癌及其癌前病变各个时期的检测，其特异性高。
序列表
<110> 江苏医诺万细胞诊疗有限公司
<120> 一种辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物及其应用
<141> 2018-09-29
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Claims (6)
1.一种辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物，其特征在于,所述的miRNA标志物为miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a。
2.根据权利要求1所述辅助诊断宫颈癌及其癌前病变的miRNA组合标志物，其特征在于,所述的miRNA标志物miR-21的反转录引物为如序列表SEQ ID NO.1所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，探针如需列表SEQ ID NO.4所示；miR-92a反转录引物如序列表SEQ ID NO.5所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，探针如序列表SEQ ID NO.8所示；miR-218的反转录引物如序列表SEQ ID NO.9所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，探针如序列表SEQ ID NO.12所示；miR-29a反转录引物如序列表SEQ ID NO.13所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示，探针如序列表SEQ ID NO.16所示；miR-375反转录引物如序列表SEQ ID NO.17所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示，探针如序列表SEQ ID NO.20所示；miR-34a反转录引物如序列表SEQ ID NO.21所示，qPCR引物如序列表SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示，探针如序列表SEQ ID NO.24所示。
3.权利要求1所述miRNA组合标志物miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a在制备宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒中的应用。
4.一种宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测宫颈脱落细胞中的miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a的含量。
5.根据权利要求4所述的宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述的诊断试剂盒含有标志物miR-21、miR-92a、miR-218、miR-29a、miR-375、miR-34a的引物及探针。
6.根据权利要求4所述的宫颈癌及其癌前病变辅助诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断试剂盒还包括逆转录酶，缓冲液，dNTPs，MgCl2，DEPC水和Taq酶，以及标准品和/或对照品。
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