CN105950768A - 一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法。本发明属于基因工程及肿瘤学领域，其检测方法是：(1)、血清中RNA的提取；(2)、小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化；(3)、加尾产物纯化回收；(4)加尾产物的反转录反应；(5)、荧光定量PCR检验microRNA相对表达量；(6)、对荧光定量PCR结果进行分析；本发明具有高度的保守性、时空特异性、稳定性及组织特异性等特点，在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥重要的作用，而且本发明操作简单、取材方便、安全无创伤，方便用于大量疾病的筛查。

Description

一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂 盒及其检测方法
技术领域
本发明属于基因工程及肿瘤学领域，涉及与人类多种肿瘤相关的血清microRNA标志物及其应用。
背景技术
“谈癌色变”，这是大多数人对癌症的第一大态度；癌症一直以来都是威胁人类健康甚至生命的一大顽症；2016年1月25日，全球癌症领域顶级杂志《CA：临床医师癌症杂志》(CA Cancer J Clin)在线发表了国家癌症中心公布的2015年癌症统计数据显示：2015年中国预计有429.2万例新发肿瘤病例和281.4万例死亡病例，相当于平均每天12000人新患癌症、7500人死于癌症；鉴于此，我们亟需探索出肿瘤诊断和治疗的新方法。
microRNA，又称为微小核糖核酸，是一类长约19至23个核苷酸的非编码单链小核糖核酸分子；它主要通过与靶标基因3’UTR的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动，同时微小核糖核酸也与许多疾病的发生及发展存在着紧密的联系。
细胞学中，每个microRNA可以有多个靶基因，或者几个microRNA也可以调节同一个基因；这种复杂的调节网络既可以通过一个microRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个MicroRNA的组合来精细调控某个基因的表达；microRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性以及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物，并且microRNA在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥越来越重要的作用。
目前已经发现并被miRBase数据库收录的人类microRNA分子有695种，其中绝大部分的microRNA分子在不同病理和生理状况下进行表达，并且多数microRNA能够在人体液中检出；有研究显示应用Solexa测序技术对正常的中国人血清microRNA进行测序分析，在男性和女性血清中分别发现了100种和91种microRNA分子，这就证明在了在人类的血清中存在着大量的microRNA，且这些microRNA在血清中通常是与蛋白质结合在一起，具有良好的稳定性；目前科学技术人员已经研究并研制出了多种有效的microRNA检测方法，如克隆测序、Northern杂交、microRNA芯片、实时荧光定量PCR等，这些检测方法都为microRNA作为生物标记物进行检测提供了依据。
传统的肿瘤检测标志物多是激素类和蛋白类，如人绒毛膜促性腺激素(HCG)；促肾上腺皮质激素(ACTH)；甲胎蛋白(AFP)；癌胚抗原(CEA)；糖蛋白(CA125)和鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等，但传统肿瘤标志物相对于microRNA作为肿瘤标志物进行检测的不足有：(1)传统肿瘤标志物不能在肿瘤发生早期准确检测，多是在中晚期辅助诊断；(2)检测多是针对肿瘤病变组织进行，无法达到无创的程度；(3)检测结果准确度不高；(4)检测不够便捷，步骤较复杂；(5)检测不能进行实时监控等，因此microRNA作为肿瘤标志物进行早期诊断有很大的优势，已经成为研究热点，根据资料及相关研究表明，前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌均受多种microRNA的调控，有的表明这些microRNA可能对于相关肿瘤的诊断具有指示作用，可以被看作为诊断上述癌症的潜在肿瘤标志物；然而，目前上述microRNA组合作为较为稳定的生物标志物用于多种癌症辅助早期诊断并研制相应的辅助早期诊断的试剂盒还未见报道。
发明内容
本发明针对现有技术存在的不足，提供了一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法；与传统的肿瘤检测标志物相比，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，适合应用于前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌高危人群的筛选、鉴定、治疗状况及指导用药的监测等。
本发明为了解决其技术问题所采用的技术方案是：一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒，所述的microRNA生物标志物及其检测的肿瘤包括：
(1)、miR-21-5p、miR-141-3p、miR-221-3p、miR-375用于检测前列腺癌；
(2)、miR-21-5p、miR-122-5p、miR-192-5p、miR-223-3p用于检测肝癌；
(3)、miR-17-3p、miR-92a-3p、miR-29a-3p用于检测结肠直肠癌；
(4)、miR-155-5p、miR-141-3p用于检测肾癌；
(5)、miR-17-5p、miR-106a-5p、miR-378a-5p、miR-21-5p用于检测胃癌；
(6)、miR-21-5p、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-196a-5p用于检测胰腺癌；
(7)、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-223-3p、miR-25-3p、miR-30d-5p、miR-375、miR-499a-5p、miR-486-5p用于检测肺癌；
(8)、miR-10b-5p、miR-16-1-5p、miR-106a-5p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-222-3p、miR-25-3p用于检测乳癌；
(9)、miR-92a-3p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-93-5p、miR-127-3p、miR-126-3p用于检测卵巢癌；
(10)、miR-21-5p、miR-375、miR-17用于检测食管癌；
(11)、miR-21-5p、miR-155-5p用于检测DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤；
(12)、miR-92a-3p、miR-638用于检测白血病；
(13)、miR-15a、miR-16-1-5p用于检测CLL慢性淋巴细胞白血病；
(14)、miR-184、miR-31-5p用于检测舌鳞状细胞癌。
其检测方法，包括以下具体步骤：
(1)、血清中RNA的提取：
抽取14组病患和3名正常人血液各2毫升，每组病患包含3名病患，所述14组病患分别患有前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌；共45例；将上述抽取的各组血液分别放置于45个试剂管中凝血后进行离心5-10min，静置，离心后的血液分为上层血清层、中层白细胞和血小板层、下层红细胞层，共三层；后摄取各试剂管中的上层血清层1ml，将各试剂管中分别摄取的1ml的血清层分别置于新取的45个1.5ml的无DNA和RNA污染的离心管中，再对各试剂管中的血清进行RNA的提取；最后，对提取的各RNA再进行电泳、浓度及纯度的测定；
(2)、小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化：
另取45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，在各离心管中分别加入步骤(1)中所提取的RNA5μg、10×Poly(A)加尾酶缓冲液10μl、Poly(A)加尾酶10U、10mMrATP10μl，无RNA酶的水补足到100μl；得45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA；
(3)、加尾产物纯化回收：
1)、在上述步骤(2)得到的45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA的离心管中分别加入含有酚:氯仿:异戊醇三者、共500ul的混合物，漩涡振荡器振荡离心管10s，后再行冰浴10min，4℃、12000转/秒离心20min，得到小分子RNA、酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，上述混合溶液分成三层，
其中，所述酚:氯仿:异戊醇的比例是25：24：1；
2)、再取新的45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，将步骤1)中所得到的三层溶液中的上层溶液水相吸至新取离心管中，用移液枪计量体积，后在新取离心管中加入1/10体积的醋酸钠和等体积的异丙醇，混匀，-70℃冷却30min，后4℃、12000转/秒离心15min，得到沉淀后的小分子RNA和含有混杂物质的上清溶液；
3)、将步骤2)中所得到的含有混杂物质的上清溶液用移液枪吸取，留置沉淀后的小分子RNA，在上述沉淀后的小分子RNA的离心管中分别中加入500ul、-20℃预冷的75％乙醇，对沉淀后的小分子RNA进行洗涤，后4℃、12000转/秒离心15min，得离心后的小分子RNA和上清溶液,再次吸取离心后的上清溶液，将离心后的小分子RNA置于冰上干燥，后再用DEPC水溶解干燥后的小分子RNA，得到纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA，将纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA存放-20℃备用；
(4)、加尾产物的反转录反应：
再取新的45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，在离心管中加入上述纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA1μl、反转录引物1μl、dNTP混合物1μl，再加入无RNA酶的水7μl，使离心管中混合溶液补足至10μl，将混合后的溶液放置于PCR仪器中65℃反应5min，5min后将反应后的混合溶液取出放置冰上迅速冷却，在冷却后的混合溶液中再加入反转录缓冲液4μl、RNA酶抑制剂0.5μl、反转录酶1μl和无RNA酶的水4.5μl，后放置于PCR仪器中先42℃反应30min，再70℃反应15min，最后再次4℃反应5min，得到产物：cDNA溶液，将得到产物cDNA溶液存放-20℃备用；
(5)、荧光定量PCR检验microRNA相对表达量：
取步骤(4)中通过反转录反应得到的产物cDNA溶液2μl，分别置于新取的45个离心管中，再分别在离心管中加入无RNA酶的水，将cDNA溶液稀释至20μl，后对稀释后的cDNA溶液进行荧光定量PCR扩增及溶解曲线生成反应；荧光定量PCR扩增反应体系的操作步骤如下：取荧光染料试剂12.5μl、内参基因U6的引物以及microRNA的正向引物和反向引物各1μl，再取稀释后的cDNA溶液2μl及无RNA酶的水8.5μl，混合上述各溶液，将上述荧光定量反应溶液混合物放置于荧光定量仪中先95℃反应30s，后95℃反应5s，后再55-65℃反应15s，最后72℃反应20s，上述反应从95℃反应30s到72℃反应20s共反应45个循环，45个循环反应结束后，随即再进行相应的溶解曲线生成反应，其反应程序如下：95℃反应15s，60℃反应1min，95℃反应15s，60℃反应15s；最终得到各样本microRNA的Ct值及其溶解曲线；
其中：Ct值：表示每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
(6)、对荧光定量PCR结果进行分析：
采用2-ΔΔCT法对荧光定量PCR结果得到的Ct值进行相对定量分析，得到不同样本间不同microRNA的相对表达量以及表达差异性。
其中，所述检测方法中涉及的microRNA序列及其特异性正向引物如下：
microRNA序列及其特异正向引物：
所述检测方法中涉及的microRNA反向引物通用为：5’-CTCACAC GACTCACGACAC-3’(SEQ ID NO.65)。
所述检测方法中涉及的反转录引物通用为：5’-CTCACAC GACTCACGACAC d(T)30(A,G,orC)(A,G,C,or T)-3’(SEQ ID NO.66)。
所述检测方法中涉及的内参基因U6的引物通用为：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’(SEQ ID NO.67)及5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’(SEQ ID NO.68)。
所述一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒及其检测方法实际通过检测被试者血清中相关microRNAs的含量，并与正常水平microRNA含量相比较来进行相关癌症的诊断与预测，所述被试者血清中microRNA的含量通过poly(A)-TailedqPCR方法进行检测。
所述每种肿瘤相关标志物用于制备诊断肿瘤的诊断试剂盒包括：血清总RNA提取试剂(细胞裂解液CL、缓冲液GS、缓冲液GB、缓冲液GD、漂洗液PW、洗脱缓冲液TB、吸附柱等)；反转录试剂(dNTP混合物、反转录引物、反转录酶等)；小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化试剂(rATP、多聚腺苷酸化酶、聚腺苷酸化缓冲液)；荧光定量PCR试剂(正向、反向引物、荧光定量混合试剂等)；
其中，引物包括上述的正向引物、反向引物及反转录引物等，所述引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补，在PCR(聚合酶链式反应)技术中，已知一段目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物，利用PCR扩增技术，目的基因DNA受热变性后解链为单链，引物与单链相应互补序列结合，然后在DNA聚合酶作用下进行延伸，如此重复循环，延伸后得到的产物同样可以和引物结合。
本发明的技术优点在于：microRNA因其高度的保守性、时空特异性、稳定性以及组织特异性等特点使其优于蛋白质、DNA片段等其他生物标志物而在疾病发病机制研究、早期诊断、个体化治疗和预后等方面发挥越来越重要的作用。本发明为前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌诊断分别提供了一组新的分子标志物，并将这些分子标志物应用于制备诊断肿瘤的诊断试剂盒中，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，该组分子标志物特别适合应用于肿瘤高危人群的筛选、鉴定、治疗状况的监测、指导用药的监测和以及预后监测等领域用试剂中。
附图说明
图1是本发明检测方法流程示意图；
图2是本发明中所取一例疾患血液样本提取的RNA电泳图与健康人血液样本提取的RNA电泳图的对比图；
图3是本发明中病患及正常人RNA浓度及纯度检测对比图；
图4是本发明中荧光定量PCR检测不同疾病样本中microRNA的表达量的示意图。
具体实施方式
下面就具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解这些实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
为了理解本发明，下面对本发明进行进一步的详细说明。
1、所述的microRNA生物标志物及其检测的肿瘤包括：
(1)、miR-21-5p、miR-141-3p、miR-221-3p、miR-375用于检测前列腺癌；
(2)、miR-21-5p、miR-122-5p、miR-192-5p、miR-223-3p用于检测肝癌；
(3)、miR-17-3p、miR-92a-3p、miR-29a-3p用于检测结肠直肠癌；
(4)、miR-155-5p、miR-141-3p用于检测肾癌；
(5)、miR-17-5p、miR-106a-5p、miR-378a-5p、miR-21-5p用于检测胃癌；
(6)、miR-21-5p、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-196a-5p用于检测胰腺癌；
(7)、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-223-3p、miR-25-3p、miR-30d-5p、miR-375、miR-499a-5p、miR-486-5p用于检测肺癌；
(8)、miR-10b-5p、miR-16-1-5p、miR-106a-5p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-222-3p、miR-25-3p用于检测乳癌；
(9)、miR-92a-3p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-93-5p、miR-127-3p、miR-126-3p用于检测卵巢癌；
(10)、miR-21-5p、miR-375、miR-17用于检测食管癌；
(11)、miR-21-5p、miR-155-5p用于检测DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤；
(12)、miR-92a-3p、miR-638用于检测白血病；
(13)、miR-15a、miR-16-1-5p用于检测CLL慢性淋巴细胞白血病；
(14)、miR-184、miR-31-5p用于检测舌鳞状细胞癌。
2.1、血清中RNA的提取：
抽取14组病患和3名正常人血液各2毫升，每组病患包含3名病患，所述14组病患分别患有前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌；共45例；将上述抽取的各组血液分别放置于45个试剂管中凝血后进行离心5-10min，静置，离心后的血液分为上层血清层、中层白细胞和血小板层、下层红细胞层，共三层；后摄取各试剂管中的上层血清层1ml，将各试剂管中分别摄取的1ml的血清层分别置于新取的45个1.5ml的无DNA和RNA污染的离心管中，再对各试剂管中的血清进行RNA的提取；最后，对提取的各RNA再进行电泳、浓度及纯度的测定；各RNA的完整性主要依据28S rRNA与18S rRNA电泳谱带的特征，如果带型清晰且亮，28S rRNA亮度高于18S rRNA，且约是18S rRNA的1.5-2倍，则表明所提取到的各RNA完整、未降解；另外，采用紫外分光光度计检测了各RNA的纯度和浓度；通常情况下，高纯度的RNA的OD260/OD280应介于1.8～2.0之间。
2.2、poly(A)-Tailed qPCR检测microRNAs的表达：
通过提取得到不同样本血液中的RNA，进行3'多聚腺苷化进行poly(A)加尾反应，得到3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA；接着用反转录引物进行反转录反应，得到cDNA，得到的cDNA用microRNA特异性正向引物及通用反向引物进行PCR反应，以进行后续的实验。
(1)、小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化：
小RNA的3'多聚腺苷化反应体系
得45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA；
(2)、加尾产物纯化回收：
1)、在上述步骤中得到的45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA的离心管中分别加入含有酚:氯仿:异戊醇三者、共500ul的混合物，漩涡振荡器振荡离心管10s，后再行冰浴10min，4℃、12000转/秒离心20min，得到小分子RNA、酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，上述混合溶液分成三层，
其中，所述酚:氯仿:异戊醇的比例是25：24：1；
2)、再取新的45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，将步骤1)中所得到的三层溶液中的上层溶液水相吸至新取离心管中，用移液枪计量体积，后在新取离心管中加入1/10体积的醋酸钠(浓度：2mol/L，PH值:4.0)和等体积的异丙醇，混匀，-70℃冷却30min，后4℃、12000转/秒离心15min，得到沉淀后的小分子RNA和含有混杂物质的上清溶液；
3)、将步骤2)中所得到的含有混杂物质的上清溶液用移液枪吸取，留置沉淀后的小分子RNA，在上述沉淀后的小分子RNA的离心管中分别中加入500ul、-20℃预冷的75％乙醇，对沉淀后的小分子RNA进行洗涤，后4℃、12000转/秒离心15min，得离心后的小分子RNA和上清溶液,再次吸取离心后的上清溶液，将离心后的小分子RNA置于冰上干燥，后再用DEPC水溶解干燥后的小分子RNA，得到纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA，将纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA存放-20℃备用；
(4)、加尾产物的反转录反应：
反转录反应体系如下：
cDNA合成反应体系一
成分 用量
反转录引物 1μl
dNTP混合物 1μl
纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA 1μl
无RNA酶的水 7μl
将混合后的溶液放置于PCR仪器中65℃反应5min，5min后将反应后的混合溶液取出放置冰上迅速冷却，在冷却后的混合溶液中再加入以下需要的体系：
cDNA合成反应体系二
后放置于PCR仪器中先42℃反应30min，再70℃反应15min，最后再次4℃反应5min，得到产物：cDNA溶液，将得到产物cDNA溶液存放-20℃备用；
(5)、荧光定量PCR检验microRNA相对表达量：
取步骤(4)中通过反转录反应得到的产物cDNA溶液2μl，分别置于新取的45个离心管中，再分别在离心管中加入无RNA酶的水，将cDNA溶液稀释至20μl，后对稀释后的cDNA溶液进行荧光定量PCR扩增及溶解曲线生成反应；荧光定量PCR扩增反应体系的操作步骤如下：取荧光染料试剂12.5μl、内参基因U6的引物以及microRNA的正向引物和反向引物各1μl，再取稀释后的cDNA溶液2μl及无RNA酶的水8.5μl，混合上述各溶液，将上述荧光定量反应溶液混合物放置于荧光定量仪中先95℃反应30s，后95℃反应5s，后再55-65℃反应15s，最后72℃反应20s，上述反应从95℃反应30s到72℃反应20s共反应45个循环，45个循环反应结束后，随即再进行相应的溶解曲线生成反应，其反应程序如下：95℃反应15s，60℃反应1min，95℃反应15s，60℃反应15s；最终得到各样本microRNA的Ct值及其溶解曲线；
经试验表明，本发明与传统的肿瘤检测标志物相比，操作简单、取材方便、安全无创伤，且具有高特异性、高灵敏性和易于大量筛查的特点，适合应用于前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌高危人群的筛选、鉴定、治疗状况及指导用药的监测等。
结果分析：
如图1-4所示：图2和图3显示的RNA电泳图以及浓度纯度检测结果；图2显示所提取的RNA的电泳图中28SrRNA与18SrRNA电泳谱带的带型清晰且亮，28SrRNA亮度高于18SrRNA，约是18SrRNA亮度的1.5-2倍，这就表明所提取到的RNA完整、未降解；另外，采用紫外分光光度计检测了总RNA的纯度和浓度，由图3可见我们所提取的RNA的OD260/OD280均介于1.8～2.0之间，纯度较高，无污染；另外所提RNA的浓度也在500-1000μg/ml范围内，符合后续试验的要求。
图4为荧光定量PCR分析后结果，采用2-ΔΔCT法对荧光定量PCR结果进行相对定量分析，得到不同样本间不同microRNA的相对表达量以及表达差异性；得到对应microRNA分别在3名前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌患者及在3名正常人血清中的表达量；由图可见不同microRNA在肿瘤患者及健康人间的表达是具有差异性的，如miR-21-5p在肿瘤患者中的表达量就比在健康人中的表达量高，而miR-221-3p在健康人中的表达量比肿瘤患者中的表达量高；这就提示microRNA在肿瘤的形成过程中其表达量或增加或减少，这与相关的分子机制以及信号传导等有关，基于此，可以判断出microRNA对不同肿瘤的调控作用，作为诊断和预测肿瘤的分子标记物。

Claims (6)

1.一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒,其特征在于，所述的microRNA生物标志物及其检测的肿瘤包括：
(1)、miR-21-5p、miR-141-3p、miR-221-3p、miR-375用于检测前列腺癌；
(2)、miR-21-5p、miR-122-5p、miR-192-5p、miR-223-3p用于检测肝癌；
(3)、miR-17-3p、miR-92a-3p、miR-29a-3p用于检测结肠直肠癌；
(4)、miR-155-5p、miR-141-3p用于检测肾癌；
(5)、miR-17-5p、miR-106a-5p、miR-378a-5p、miR-21-5p用于检测胃癌；
(6)、miR-21-5p、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-196a-5p用于检测胰腺癌；
(7)、miR-21-5p、miR-210-5p、miR-223-3p、miR-25-3p、miR-30d-5p、miR-375、miR-499a-5p、miR-486-5p用于检测肺癌；
(8)、miR-10b-5p、miR-16-1-5p、miR-106a-5p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-195-5p、miR-222-3p、miR-25-3p用于检测乳癌；
(9)、miR-92a-3p、miR-21-5p、miR-29a-3p、miR-155-5p、miR-93-5p、miR-127-3p、miR-126-3p用于检测卵巢癌；
(10)、miR-21-5p、miR-375、miR-17用于检测食管癌；
(11)、miR-21-5p、miR-155-5p用于检测DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤；
(12)、miR-92a-3p、miR-638用于检测白血病；
(13)、miR-15a、miR-16-1-5p用于检测CLL慢性淋巴细胞白血病；
(14)、miR-184、miR-31-5p用于检测舌鳞状细胞癌。
2.一种权利要求1所述的一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒的检测方法,其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)、血清中RNA的提取：
抽取14组病患和3名正常人血液各2毫升，每组病患包含3名病患，所述14组病患分别患有前列腺癌、结肠直肠癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、DLBCL弥漫性大B细胞性淋巴瘤、CLL慢性淋巴细胞白血病、肝癌、肾癌、胰腺癌、乳癌、食管癌、白血病、舌鳞状细胞癌；共45例；将上述抽取的各组血液分别放置于45个试剂管中凝血后进行离心5-10min，静置，离心后的血液分为上层血清层、中层白细胞和血小板层、下层红细胞层，共三层；后摄取各试剂管中的上层血清层1ml，将各试剂管中分别摄取的1ml的血清层分别置于新取的45个1.5ml的无DNA和RNA污染的离心管中，再对各试剂管中的血清进行RNA的提取；最后，对提取的各RNA再进行电泳、浓度及纯度的测定；
(2)、小分子RNA的3'端多聚腺苷酸化：
另取45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，在各离心管中分别加入步骤(1)中所提取的RNA5μg、10×Poly(A)加尾酶缓冲液10μl、Poly(A)加尾酶10U、10mMrATP10μl，无RNA酶的水补足到100μl；得45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA；
(3)、加尾产物纯化回收：
1)、在上述步骤(2)得到的45份3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA的离心管中分别加入含有酚:氯仿:异戊醇三者、共500ul的混合物，漩涡振荡器振荡离心管10s，后再行冰浴10min，4℃、12000转/秒离心20min，得到小分子RNA、酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，上述混合溶液分成三层，
其中，所述酚:氯仿:异戊醇的比例是25：24：1；
2)、再取新的45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，将步骤1)中所得到的三层溶液中的上层溶液水相吸至新取离心管中，用移液枪计量体积，后在新取离心管中加入1/10体积的醋酸钠和等体积的异丙醇，混匀，-70℃冷却30min，后4℃、12000转/秒离心15min，得到沉淀后的小分子RNA和含有混杂物质的上清溶液；
3)、将步骤2)中所得到的含有混杂物质的上清溶液用移液枪吸取，留置沉淀后的小分子RNA，在上述沉淀后的小分子RNA的离心管中分别中加入500ul、-20℃预冷的75％乙醇，对沉淀后的小分子RNA进行洗涤，后4℃、12000转/秒离心15min，得离心后的小分子RNA和上清溶液,再次吸取离心后的上清溶液，将离心后的小分子RNA置于冰上干燥，后再用DEPC水溶解干燥后的小分子RNA，得到纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA，将纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA存放-20℃备用；
(4)、加尾产物的反转录反应：
再取新的45个1.5ml无DNA和RNA污染的离心管，在离心管中加入上述纯化的3'端多聚腺苷酸化的小分子RNA1μl、反转录引物1μl、dNTP混合物1μl，再加入无RNA酶的水7μl，使离心管中混合溶液补足至10μl，将混合后的溶液放置于PCR仪器中65℃反应5min，5min后将反应后的混合溶液取出放置冰上迅速冷却，在冷却后的混合溶液中再加入反转录缓冲液4μl、RNA酶抑制剂0.5μl、反转录酶1μl和无RNA酶的水4.5μl，后放置于PCR仪器中先42℃反应30min，再70℃反应15min，最后再次4℃反应5min，得到产物：cDNA溶液，将得到产物cDNA溶液存放-20℃备用；
(5)、荧光定量PCR检验microRNA相对表达量：
取步骤(4)中通过反转录反应得到的产物cDNA溶液2μl，分别置于新取的45个离心管中，再分别在离心管中加入无RNA酶的水，将cDNA溶液稀释至20μl，后对稀释后的cDNA溶液进行荧光定量PCR扩增及溶解曲线生成反应；荧光定量PCR扩增反应体系的操作步骤如下：取荧光染料试剂12.5μl、内参基因U6的引物以及microRNA的正向引物和反向引物各1μl，再取稀释后的cDNA溶液2μl及无RNA酶的水8.5μl，混合上述各溶液，将上述荧光定量反应溶液混合物放置于荧光定量仪中先95℃反应30s，后95℃反应5s，后再55-65℃反应15s，最后72℃反应20s，上述反应从95℃反应30s到72℃反应20s共反应45个循环，45个循环反应结束后，随即再进行相应的溶解曲线生成反应，其反应程序如下：95℃反应15s，60℃反应1min，95℃反应15s，60℃反应15s；最终得到各样本microRNA的Ct值及其溶解曲线；
(6)、对荧光定量PCR结果进行分析：
采用2-ΔΔCT法对荧光定量PCR结果得到的Ct值进行相对定量分析，得到不同样本间不同microRNA的相对表达量以及表达差异性。
3.根据权利要求2所述的一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法中涉及的microRNA序列及其特异性正向引物如下：
4.根据权利要求2所述的一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法中涉及的microRNA反向引物通用为：5’-CTCACACGACTCACGACAC-3’(SEQ ID NO.65)。
5.根据权利要求2所述的一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法中涉及的反转录引物通用为：5’-CTCACACGACTCACGACAC d(T)30(A,G,or C)(A,G,C,or T)-3’(SEQ ID NO.66)。
6.根据权利要求2所述的一种microRNA组合作为肿瘤标志物辅助诊断多种肿瘤的试剂盒的检测方法，其特征在于，所述检测方法中涉及的内参基因U6的引物通用为：5’GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT3’(SEQ ID NO.67)及5’CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3’(SEQ IDNO.68)。
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