CN109182507B

CN109182507B - 用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN109182507B
Application number: CN201811224113.4A
Authority: CN
Inventors: 陈坤; 金明娟; 叶丁; 蒋丹捷; 王建炳; 唐梦龄; 李其龙; 顾思萌; 林淑娟; 章晓聪
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-10-19
Filing date: 2018-10-19
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2038-10-19
Also published as: CN109182507A

Abstract

本发明公开了一种用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物，所述miRNA为miR‑451a、miR‑223‑3p、miR‑21‑5p和miR‑16‑5p中的一种或多种。本发明首次发现SEQ ID NO.1～4所示的miRNA分子标志物能够用于诊断结直肠息肉，获得的诊断模型具有较高的诊断效率，尤其是合并4条miRNA的诊断模型，其AUC(95％CI)为0.838(0.806,0.870)。使用本发明提供的miRNA分子标志物诊断结直肠息肉，不仅操作简单、安全无创伤，而且具有高灵敏度、高特异性以及易于大量筛查的特点。

Description

用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及临床检验诊断技术领域，尤其涉及一种用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物、试剂盒及其应用。

背景技术

结直肠息肉指结直肠粘膜面突向肠腔的隆起，可分为腺瘤性息肉和非腺瘤性息肉，是一种非常常见的疾病。患者常无任何临床症状，多数在进行其他检查时偶然发现，部分患者可表现为便血、腹泻、腹痛、粘液便或脓血便。许多研究表明，结直肠息肉是结直肠癌的癌前病变，摘除息肉能有效降低结直肠癌的发病率。因此，结直肠息肉的早发现、早诊断、早治疗具有重要的意义。

目前，用于结直肠息肉的诊断方法主要有粪便隐血试验、直肠指诊、气钡双重造影和结肠镜检查。粪便隐血试验简单经济，但该法假阴性率高，可作为人群筛查的基本手段。气钡双重造影是诊断低位胃肠疾病的主要方法，阳性率较低，且直径小于1.0cm的息肉不容易被发现。结肠镜检查是发现结直肠息肉最重要的方法，但这是一种侵入性的检查方法，患者需承受一定的痛苦，可能出现一定的并发症，且价格昂贵，无法大规模推广。随着分子生物学的发展，结直肠息肉分子标志物的研究越来越深入。

miRNA是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的小分子RNA，广泛存在于真核细胞，不具备编码功能，通过翻译抑制调控基因的表达，具有高度保守性、时序性和组织特异性。miRNA参与细胞分化、生物发育以及疾病的发生发展过程，在很多疾病的诊断和治疗中发挥了重大作用。结直肠息肉miRNA标志物的研究能辅助诊断结直肠息肉，且此方法更加简单经济、安全无创。

目前，关于结直肠癌相关的miRNA标志物的研究已有大量报道，例如：

申请公告号为CN106367477A和CN107746886A的发明专利申请文献公开了一种与结直肠癌辅助诊断相关的血清miRNA标志物及其应用，标志物为miR-19a-3p、miR-21和miR-425-5p中的一种或多种；以及miR-103a-3p、miR-127-3p、miR-151a-5p、miR-17-5p、miR-181a-5p、miR-18a-5p和miR-18b-5p中的一种或多种。

申请公告号为CN105624271A的发明专利申请文献公开了一种与结直肠癌相关的miRNA及其应用，该标志物为miR-1290。

申请公告号为CN108088999A的发明专利申请文献公开了一种与结直肠癌相关的miRNA标志物及其应用，所述标志物为miR-16、miR-21和miR-92a的组合。

申请公告号为CN108004323A的发明专利申请文献公开了组织中与结直肠癌转移相关的miRNA标志物及其应用，标志物为miR-96、miR-99b、miR-155、let-7a和let-7b中的任意一种或几种。

然而，以上研究均是针对于诊断结直肠癌的分子标志物的研究，对于结直肠息肉的诊断标志物却少有研究；而且，结直肠息肉为结直肠癌的癌前病变，诊断难度大于结直肠癌，结直肠癌适用的miRNA标志物不一定适用于结直肠息肉。结直肠癌的发生发展是一个多阶段的漫长过程，研究发现，近95％的结直肠癌是由息肉演变而来，经历正常黏膜→增生→腺瘤形成→腺瘤癌变的过程，一般需要5～10年的时间。这就为结直肠癌的预防提供了极有利的机会，如果能够在息肉腺瘤阶段就斩草除根，就能有效防止结直肠癌的发生。

因此，有必要专门针对结直肠息肉的诊断标志物进行研究，以实现结直肠息肉的早发现、早诊断和早治疗，提前摘除息肉，有效降低结直肠癌的发病率。

发明内容

基于上述目的，本发明提供了一种用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物、试剂盒及其应用，能够辅助诊断结直肠息肉实现结直肠息肉的早发现和早诊断。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物，所述miRNA为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p中的一种或多种。

所述miR-451a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述miR-223-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述miR-21-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述miR-16-5p的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

与健康对照相比，上述miRNA在结直肠息肉病人的血浆中存在差异表达，能够用于诊断结直肠息肉，获得的诊断模型具有较高的诊断效率，尤其是合并4条miRNA的诊断模型，其AUC(95％CI)为0.838(0.806,0.870)。

本发明提供了血浆miRNA作为分子标志物在诊断结直肠息肉中的应用，所述miRNA为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p中的一种或多种。

更优选，所述miRNA为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p的组合。

本发明还提供了血浆miRNA作为分子标志物在制备诊断结直肠息肉的试剂盒中的应用，所述miRNA为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p中的一种或多种。

本发明还提供了一种基于血浆miRNA分子标志物诊断结直肠息肉的试剂盒，所述miRNA为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明首次发现SEQ ID NO.1～4所示的miRNA分子标志物能够用于诊断结直肠息肉，获得的诊断模型具有较高的诊断效率，尤其是合并4条miRNA的诊断模型，其AUC(95％CI)为0.838(0.806,0.870)。

(2)使用本发明提供的miRNA分子标志物诊断结直肠息肉，不仅操作简单、安全无创伤，而且具有高灵敏度、高特异性以及易于大量筛查的特点。

附图说明

图1为实施例1中四种miRNAs在结直肠息肉组和健康对照组、结直肠癌组中的表达水平。

图2为实施例1中四种miRNAs对结直肠息肉的诊断ROC曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

1、研究对象

血浆样本共包括300例结直肠息肉病例、300例结直肠癌病例和300例健康对照。

所有结直肠息肉病例和健康对照均来自嘉善结直肠癌筛查队列，结直肠癌病例来自于浙江大学绍兴医院的肛肠科住院病例。病例组经病理学检查证实为结直肠息肉和结直肠癌，未曾接受任何药物或手术治疗，现病史、个人史、家族史、体格检查等资料详尽。

2、标本采集

每位研究对象抽取静脉血5ml装入抗凝真空采血管中，在1小时室温条件下进行下面的操作：将离心机转速调至3000转，4℃，离心10分钟。吸取上清至RNase-free的收集管中以备RNA提取实验。旋紧收集管管盖，在管壁上做好标记，至于-80℃冰箱保存备用。

3、miRNA的定量检测

3.1miRNA的提取

采用天根生化科技有限公司miRcult Serum/plasma isolation kit(型号：DP503)，用于提取血浆样品中的RNA，具体步骤如下：

(1)在1.5ml Eppendorf管中，加入200μl血浆和900μl裂解液MZA，振荡器振荡30sec至完全匀浆，加入0.05mol/L cel-mir-39溶液5μl，颠倒混匀；

(2)室温放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；

(3)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15sec，室温放置5min；

(4)4℃，13400g离心15min，样品会分成三层：黄色的有机相，白色的中间层和无色的水相，RNA主要在水相中，把水相转移到新管中，进行下一步操作；

(5)吸取400μl转移液，缓慢加入800μl的无水乙醇，将得到的溶液和沉淀分两次转移至吸附柱，室温放置2min，第一次为700μl，第二次为余下的所有液体，将吸附柱置于室温下13400g离心30sec，离心后弃掉流出液，保留吸附柱；

(6)向吸附柱中加入700μl去蛋白液MRD，室温静置2min，13400g离心30sec，弃废液；

(7)向吸附柱中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，13400g离心30sec，弃废液，并重复该步骤一次；

(8)室温13400g离心2min，弃收集管；

(9)将吸附柱转移至一个新的1.5ml的收集管中，向吸附柱膜中心位置加入80μlRNase-free ddH₂O，室温放置2min，室温13400g离心2min。

3.2逆转录

逆转录反应体系为7.5μl，检测基因包括一个外参基因cel-mir-39和一个待测基因。

外参基因cel-mir-39序列：UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG(SEQ ID NO.9)

待测基因为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p、miR-16-5p，其序列参见SEQ IDNO.1～4。

miR-451a：AAACCGUUACCAUUACUGAGUU(SEQ ID NO.1)

miR-223-3p：UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA(SEQ ID NO.2)

miR-21-5p：UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA(SEQ ID NO.3)

miR-16-5p：UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG(SEQ ID NO.4)

逆转录茎环法的前体序列如下所示：

miR-451a：CUUGGGAAUGGCAAGGAAACCGUUACCAUUACUGAGUUUAGUAAUGGUAAUGGUUCUCUUGCUAUACCCAGA(SEQ ID NO.5)

miR-223-3p：CCUGGCCUCCUGCAGUGCCACGCUCCGUGUAUUUGACAAGCUGAGUUGGACACUCCAUGUGGUAGAGUGUCAGUUUGUCAAAUACCCCAAGUGCGGCACAUGCUUACCAG(SEQ ID NO.6)

miR-21-5p：UGUCGGGUAGCUUAUCAGACUGAUGUUGACUGUUGAAUCUCAUGGCAACACCAGUCGAUGGGCUGUCUGACA(SEQ ID NO.7)

miR-16-5p：GUCAGCAGUGCCUUAGCAGCACGUAAAUAUUGGCGUUAAGAUUCUAAAAUUAUCUCCAGUAUUAACUGUGCUGCUGAAGUAAGGUUGAC(SEQ ID NO.8)

采用赛默飞科技有限公司TaqMan^TMMicroRNA Assay试剂盒(cel-miR-39 AssayID:000200,hsa-miR-16-5p Assay ID:000391,hsa-miR-21-5p Assay ID:000397,hsa-miR-451a Assay ID:001141,hsa-miR-223-3p Assay ID:002295)。

具体步骤如下：

(1)根据样本数量预混除RNA样品外的逆转录反应体系(表1)，混合均匀；

(2)每管加入2.92μl预混液和4.58μl RNA样品；

(3)逆转录PCR反应程序：16℃30min；42℃30min；85℃5min；4℃forever；

(4)合成的cDNA在-20℃保存。

表1 miRNA逆转录体系的组分和体积

3.3荧光定量PCR

荧光定量PCR反应采用赛默飞科技有限公司TaqMan^TMMicroRNA Assay试剂盒(cel-miR-39Assay ID:000200,hsa-miR-16-5p Assay ID:000391,hsa-miR-21-5p Assay ID:000397,hsa-miR-451a Assay ID:0011 41,hsa-miR-223-3p Assay ID:002295)。

具体步骤如下：

(1)根据样品数量预混除cDNA样品外的荧光定量PCR反应体系(表2)，混合均匀；

(2)白色384孔板画板，每孔先加5μl预混液，再加1μl cDNA样品；

(3)封膜，避光，2000rpm离心2min；

(4)启动Roche LightCycler 480II定量PCR仪，反应程序为95℃30sec(Ramp rate4.4℃/sec)；50cycles{95℃5sec(Ramp rate 4.4℃/sec)，60℃30sec(Ramp rate 2.2℃/sec)}；50℃30sec(Ramp rate 2.2℃/sec)；

(5)程序结束后，导出数据并分析。

表2 miRNA荧光定量体系的组分和体积

4、统计分析

数据采用SPSS 18.0软件进行统计分析，样本miRNAs表达水平的差异用T检验进行比较，P<0.05被认为具有统计学差异。

多元logistic回归分析用于建立miRNAs诊断模型，模型公式如下：Logit(polyp)＝-1.370-0.035*(miR-451a)-0.017*(miR-223-3p)+0.025*(miR-21-5p)+0.396*(miR-16-5p)；公式中的“(miR-451a)”、“(miR-223-3p)”、“(miR-21-5p)”、“(miR-16-5p)”分别表示相对应的miRNAs的表达量。

将四种miRNAs的表达量分别代入上述公式，计算Logit(polyp)，当Logit(polyp)＝1时，可以判断为结直肠息肉；当Logit(polyp)＝0时，则判断为非结直肠息肉。

采用ROC曲线及曲线下面积AUC进行评价。

5、实验结果：

如图1所示，在miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p的表达水平中，结直肠息肉均显著高于结直肠癌及正常对照(P<0.01)，而结直肠癌与正常对照表达水平之间无统计学差异(P>0.05)。

如图2所示，miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p的AUC(95％CI)分别为0.726(0.686,0.767)，0.755(0.716,0.793)，0.718(0.678,0.758)和0.823(0.788,0.857)，合并4条miRNAs的诊断模型的AUC(95％CI)为0.838(0.806,0.870)。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 用于诊断结直肠息肉的血浆miRNA分子标志物、试剂盒及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

aaaccguuac cauuacugag uu 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

ugucaguuug ucaaauaccc ca 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 5

<211> 72

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

cuugggaaug gcaaggaaac cguuaccauu acugaguuua guaaugguaa ugguucucuu 60

gcuauaccca ga 72

<210> 6

<211> 110

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ccuggccucc ugcagugcca cgcuccgugu auuugacaag cugaguugga cacuccaugu 60

gguagagugu caguuuguca aauaccccaa gugcggcaca ugcuuaccag 110

<210> 7

<211> 72

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ugucggguag cuuaucagac ugauguugac uguugaaucu cauggcaaca ccagucgaug 60

ggcugucuga ca 72

<210> 8

<211> 89

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

gucagcagug ccuuagcagc acguaaauau uggcguuaag auucuaaaau uaucuccagu 60

auuaacugug cugcugaagu aagguugac 89

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ucaccgggug uaaaucagcu ug 22

Claims

1.血浆miRNA作为分子标志物在制备诊断结直肠息肉的试剂盒中的应用，其特征在于，所述miRNA为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p的组合。

2.一种基于血浆miRNA分子标志物诊断结直肠息肉的试剂盒，其特征在于，所述miRNA为miR-451a、miR-223-3p、miR-21-5p和miR-16-5p的组合。