CN109517894B

CN109517894B - 一种与肝癌相关的非编码rna生物标志物及其应用

Info

Publication number: CN109517894B
Application number: CN201811009464.3A
Authority: CN
Inventors: 鲁志; 曹静怡; 谈畅
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2018-08-31
Filing date: 2018-08-31
Publication date: 2020-01-21
Anticipated expiration: 2038-08-31
Also published as: CN109517894A

Abstract

本发明公开了一种与肝癌相关的非编码RNA生物标志物及其应用。本发明公开的与肝癌相关的非编码RNA为如下a1)或a2)或a3)：a1)RN7SL1S结构域片段，为序列表中序列1的第242‑299位所示的RNA分子；a2)RN7SL1，为序列表中序列1所示的RNA分子；a3)RN7SL1S结构域，为序列表中序列1的第100‑260位所示的RNA分子。利用本发明的与肝癌相关的非编码RNA生物标志物可以用于诊断肝癌，灵敏度和特异度高，可以用来制备肝癌临床诊断试剂盒，还可以用于筛选人类肝癌药物的治疗靶点。

Description

一种与肝癌相关的非编码RNA生物标志物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物和肿瘤学领域中，一种与肝癌相关的非编码RNA生物标志物及其应用。

背景技术

肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大常见的消化道恶性肿瘤，也是全球第三大致死性癌症。我国肝癌病发率位居全球首位，肝癌已成为严重威胁我国人民健康和生命的疾病。由于在早期诊断期间缺乏可靠的生物标志物，HCC患者通常在肝癌晚期才被诊断。目前肝癌诊断主要依赖影像学检查或者血液中的标志物甲胎蛋白(AFP)的检测等手段。影像学检查虽然比较直观，但对于癌变早期存在敏感性低、特异性低和检查费用高等局限性；分子标志物甲胎蛋白往往到了癌症晚期才能检测到其含量升高，因此会延误最佳治疗时机。因此深入了解肝癌的发生发展机制，探寻肝癌早期诊断和治疗的新靶标意义重大。

体液无创检测作为一门新型的检测技术，越来越受到关注。目前可以作为无创检测的生物标志物大多数蛋白质分子和DNA分子，但这些标志物在灵敏度、误诊率和经济成本上的缺陷导致它们很难被普及。RNA分子在细胞中拥有多个拷贝并且存在多种转录调控形态，可以更加准确地反映细胞状态和癌症动态发展过程。大规模体液RNA表达谱测定可以提供基因组差异表达和转录组动态变化的双重信息，因此在疾病发生发展过程中可以做为一种更有优势的分子标志物，具有更大的科研价值和临床应用前景。体液中游离RNA(extracellular RNA,exRNA)除了mRNA片段，还有多种非编码RNA：如miRNA、piRNA、Y_RNA、snRNA、lncRNA、circRNA等。之前关于exRNA生物标志物的研究大都关注于miRNA，随着二代测序技术的发展，其他类型的非编码RNA作为分子标志物的的潜能也被发掘。血液中的非编码RNA(ncRNA)可以自身形成二级结构，或者和RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)结合，从而可以稳定存在于血液中，因此可以作为体液无创检测的分子标志物。

发明内容

本发明的目的是提供一种与肝癌相关的非编码RNA生物标志物。

本发明首先提供了检测RNA含量的系统在下述b1)或b2)中的应用：

b1)制备诊断或辅助诊断肝癌产品；

b2)诊断或辅助诊断肝癌；

所述RNA为如下a1)或a2)或a3)：

a1)RN7SL1S结构域片段，所述RN7SL1S结构域片段为a31)、a32)或a33)：a31)序列表中序列1的第242-299位所示的RNA分子；a32)与a31)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的RNA分子；a33)在严格条件下与a31)或a32)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的RNA分子；

a2)RN7SL1，所述RN7SL1为a11)、a12)或a13)：a11)序列表中序列1所示的RNA分子；a12)与a11)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的RNA分子；a13)在严格条件下与a11)或a12)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的RNA分子；

a3)RN7SL1S结构域，所述RN7SL1S结构域为a21)、a22)或a23)：a21)序列表中序列1的第100-260位所示的RNA分子；a22)与a21)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的RNA分子；a23)在严格条件下与a21)或a22)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的RNA分子。

所述具有75％或75％以上同一性可为具有75％、具有80％、具有85％、具有90％、具有95％、具有96％、具有97％、具有98％或具有99％的同一性。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO₄和1mMEDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5MNaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次；也可为：2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；也可为：0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述检测RNA含量的系统可包括利用定量PCR检测所述RNA含量的系统。

上述应用中，所述利用定量PCR检测所述RNA含量的系统可包括用于检测所述RNA含量的引物和/或进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器；

用于检测所述RN7SL1含量的引物由名称分别为RN7SL1-F和RN7SL1-R的两条单链DNA组成；

所述RN7SL1-F为c1)、c2)或c3)：

c1)序列表中序列2所示的单链DNA；

c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的单链DNA；

c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的单链DNA；

所述RN7SL1-R为d1)、d2)或d3)：

d1)序列表中序列3所示的单链DNA；

d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的单链DNA；

d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的单链DNA；

用于检测所述RN7SL1S结构域含量的引物由名称分别为S-F和S-R的两条单链DNA组成；

所述S-F为e1)、e2)或e3)：

e1)序列表中序列5所示的单链DNA；

e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的单链DNA；

e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的单链DNA；

所述S-R为f1)、f2)或f3)：

f1)序列表中序列6所示的单链DNA；

f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的单链DNA；

f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的单链DNA；

用于检测所述RN7SL1S结构域片段含量的引物为名称为SF-F的单链DNA；

所述SF-F为g1)、g2)或g3)：

g1)序列表中序列7所示的单链DNA；

g2)与g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且具有相同功能的单链DNA；

g3)在严格条件下与g1)或g2)限定的核苷酸序列杂交，且具有相同功能的单链DNA。

所述利用定量PCR检测所述RNA含量的系统可由所属用于检测所述RNA含量的引物和/或所述进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器组成。

所述系统可为试剂盒。

上述应用中，所述RNA含量可为i1)、或i2)：

i1)人血液中所述RNA的含量；

i2)人血浆中所述RNA的含量。

本发明还提供了以所述RNA作为肝癌标志物的诊断或辅助诊断肝癌的系统在下述b1)或b2)中的应用：

b1)制备诊断或辅助诊断肝癌产品；

b2)诊断或辅助诊断肝癌。

上述应用中，所述诊断或辅助诊断肝癌的系统为所述检测RNA含量的系统。

以所述RNA作为肝癌标志物在诊断或辅助诊断肝癌中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述检测RNA含量的系统也属于本发明的保护范围。

本发明中，确定待测对象是否为肝癌患者的方法如下：如果所述待测对象的血浆中S结构域片段的含量大于5.7amol/微升血浆，所述待测对象为或候选为肝癌患者，如果所述待测测对象的血浆中S结构域片段的含量小于或等于5.7amol/微升血浆，所述待测对象为或候选为非肝癌患者。

本发明公开的一种与肝癌相关的非编码RNA生物标志物可以用于诊断肝癌，且灵敏度和特异度高，可以用于制备肝癌临床诊断试剂盒。

附图说明

图1为各组RN7SL1及其中各个片段的ΔCt比较。*表示差异显著，p<0.05；****表示差异显著，p<0.0001；“不显著”均为差异不显著。

图2为ROC曲线分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应DNA的5′末端核苷酸，末位均为相应DNA的3′末端核苷酸。

灵敏度(真阳性率)：实际有病而按试验标准被正确判断为有病的百分率，灵敏度越大越好，理想灵敏度为100％。

特异度(真阴性率)：实际无病而按试验标准被正确判断为无病的百分率，特异度越大越好，理想特异度为100％。

实施例1、RN7SL1是一种与肝癌相关的非编码RNA

本实施例发现RN7SL1是一种与肝癌相关的非编码RNA，RN7SL1的序列为序列表中序列1，RN7SL1含有Alu结构域和S结构域，Alu结构域为序列表中序列1的第1-80位，S结构域为序列表中序列1的第100-260位。

一、研究对象

肝癌(HCC)患者组：100例肝癌患者入选，入选标准为：活检标本病理学检查以及临床诊断确认为肝癌患者。

乙肝(CHB)患者组：20例慢性乙型肝炎患者入选，入选标准为：HBsAg+(即HBsAg检测为阳性)，HBV DNA-(即HBV DNA检测为阴性)。

健康(HD)组：30个健康人入选，入选标准为：不患有肝癌，无乙肝丙肝感染史，无肝纤维化，无干扰素或其他抗病毒药物治疗。

二、实验过程

1、RNA的定量检测

RNA的定量检测采用两种方法，第一种采用双引物进行的定量检测，该方法首先使用TRIzol提取血浆中全部RNA，即总RNA的提取，随后进行随机引物的反转录，最后使用双引物进行qPCR实验；第二种是采用单引物进行的定量检测，该方法首先使用血清/血浆miRNA提取分离试剂盒(TIANGEN)提取血浆中的miRNA，随后使用miRNA cDNA第一链合成试剂盒和miRNA荧光定量检测试剂盒(polyA法)进行单引物qPCR实验。两种方法中均采用miR-192-5p(MiR-192)为阳性对照，miR-192-5p使用单引物的试剂盒和方法进行检测。

利用双引物进行的检测中用到的试剂盒有：RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit(Thermo Scientific)；2×KAPA

FAST qPCR Master Mix(KAPABIOSYSTEMS)。

利用单引物进行的检测中用到的试剂盒有：miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒，miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒，血清/血浆miRNA提取分离试剂盒，这三种试剂盒均为天根生化科技(北京)有限公司产品。

本发明定量检测了RN7SL1全长、RN7SL1中Alu结构域片段(序列1的第1到72位)、RN7SL1中S结构域以及RN7SL1中S结构域片段(序列1的第242-299位)在血浆中的含量，其中，RN7SL1全长以及RN7SL1中S结构域采用双引物的方法进行检测，RN7SL1中Alu结构域片段与S结构域片段均采用单引物的方法进行检测，所用引物如表1所示。

表1、引物序列

1.1利用双引物定量检测RNA在血浆中的含量

使用TRIzol提取血浆总RNA：

1)取500μl血浆加入1mLTRIzol，混匀后室温静置5分钟；

2)加入200μl氯仿，震荡混匀后室温静置5分钟，在4℃下12000×g离心15分钟；

3)吸取上述离心所得上清液500μl，加入500μl异丙醇混匀后-20℃冰箱冻存30分钟；

4)在4℃下12000×g离心15分钟上述体系，可见少量白色沉淀在管底；

5)弃上清液，向沉淀中加入1mL 75％(体积百分比)乙醇水溶液清洗沉淀，在4℃下12000×g离心5分钟；

6)弃上清液，保留沉淀并在超净台中干燥5分钟；

7)向沉淀中加入10μl DNase/RNase-Free Water重悬沉淀，得到血浆总RNA；

8)进行下游实验和分析，或储存到-80℃冰箱备用。

总RNA的反转录：

1)使用Qubit3(invitrogen)对上述得到的血浆总RNA进行浓度测定后吸取5ng总RNA进行随机引物反转录实验，反转录所用试剂盒为RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit(Thermo Scientific)，反转录体系如下：

表2、总RNA反转录反应体系

表2中，随机引物、10mM dNTP mix、RiboLock RNase Inhibitor、RevertAid M-MuLV RT、5×Reaction Buffer均为RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit中试剂。

2)将上述体系在PCR仪中25℃孵育5分钟，42℃孵育60分钟，70℃孵育5分钟进行热失活，得到血浆cDNA。

利用双引物进行qPCR：

1)按照表3制备qPCR反应体系：

表3、双引物qPCR反应体系

表3中，2×KAPA qPCR Mix为2×KAPA

FAST qPCR Master Mix。

2)将上述体系在荧光定量PCR仪器中进行如下反应：

94℃30秒；94℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，重复40个循环。

根据仪器输出的Ct值，使用2^-ΔΔCt法，并以GAPDH spikein作为内参，对样本中目标片段含量进行相对定量计算。

2)利用单引物定量检测RNA在血浆中的含量

血浆中的miRNA的提取和反转录：

1)使用血清/血浆miRNA提取分离试剂盒对血浆中的小片段RNA进行提取，得到血浆小片段RNA；

2)使用miRcute增强型miRNA cDNA第一链合成试剂盒对上述得到的血浆小片段RNA进行反转录，反转录体系如表4所示，2×miRNA RT Reaction Buffer和miRNA RTEnzyme Mix均为试剂盒中试剂。

表4、microRNA反转录反应体系

3)将上述体系在PCR仪中42℃孵育60分钟，95℃孵育3分钟进行热失活，得到反转录产物；

单引物qPCR：

1)利用miRcute增强型miRNA荧光定量检测试剂盒进行，按照表5混合qPCR反应体系，其中，通用反向引物与2×miRcute Plus miRNA Premix(with SYBR&ROX)均为试剂盒中试剂：

表5、单引物qPCR反应体系

2)将上述体系在荧光定量PCR仪器中进行如下反应：

95℃15分钟；94℃20秒，60℃34秒，重复40个循环。

根据仪器输出的Ct值，使用2^-ΔΔCt法，并以mir1228作为内参，对样本中的mirRNA和目的片段的含量进行相对定量计算。

对各组各片段在血浆中的含量进行定量分析，结果如图1所示，结果显示：

RN7SL1全长在肝癌患者组中的ΔCt为健康组的2.18倍，均显著高于健康组与乙肝患者组，表明，肝癌患者组血浆中RN7SL1全长的含量均显著高于健康组与乙肝患者组；

RN7SL1中Alu结构域片段在肝癌患者组中的ΔCt与健康组、乙肝患者组均无显著差异，表明，肝癌患者组血浆中Alu结构域片段的含量与健康组、乙肝患者组均无显著差异；

RN7SL1中S结构域在肝癌患者组中的ΔCt为健康组的2.08倍，均显著高于健康组与乙肝患者组，表明，肝癌患者组血浆中RN7SL1中S结构域的含量均显著高于健康组与乙肝患者组；

RN7SL1中S结构域片段在肝癌患者组中的ΔCt为健康组的10.29倍，均显著高于健康组与乙肝患者组，表明，肝癌患者组血浆中RN7SL1中S结构域片段的含量均显著高于健康组与乙肝患者组。

肝癌患者组血浆中RN7SL1全长、S结构域以及S结构域片段的含量均与健康组及乙肝患者组具有显著差异，表明，血浆中RN7SL1全长、S结构域以及S结构域片段的含量均可以作为肝癌标志物用于诊断肝癌。

以乙肝(CHB)患者组和健康(HD)组为对照，利用SPSS 16.0软件对肝癌(HCC)患者组中S结构域片段的含量进行ROC曲线分析，结果如图2所示，曲线下面积AUC＝0.8634，灵敏度为0.636、特异度为0.935。此时，判定为肝癌患者的阈值为血浆中S结构域片段含量>5.7amol/微升血浆。具体的，根据上述结果，得到检测结果判定标准如下：如果所述检测对象的血浆中S结构域片段的含量大于5.7amol/微升血浆，该检测对象疑似为肝癌患者，如果所述检测对象的血浆中S结构域片段的含量小于或等于5.7amol/微升血浆，该检测对象候选为非肝癌患者。

<110> 清华大学

<120> 一种与肝癌相关的非编码RNA生物标志物及其应用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 335

<212> RNA

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

cgccgggcgc gguggcgcgu gccuguaguc ccagcuacuc gggaggcuga ggcuggagga 60

ucgcuugagu ccaggaguuc ugggcuguag ugcgcuaugc cgaucgggug uccgcacuaa 120

guucggcauc aauaugguga ccucccggga gcgggggacc accagguugc cuaaggaggg 180

gugaaccggc ccaggucgga aacggagcag gucaaaacuc ccgugcugau caguaguggg 240

aucgcgccug ugaauagcca cugcacucca gccugggcaa cauagcgaga ccccgucucu 300

uuugaacaau aaauacguua auuuuggacu cucaa 335

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcgtgcctgt agtcccagct actcg 25

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gctggagtgc agtggctatt cacagg 26

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcgtgcctgt agtcccagct actcg 25

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

cgggggacca ccaggttgcc 20

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gctggagtgc agtggctatt cacagg 26

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tcgcgcctgt gaatagccac tgc 23

<210> 8

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgcctgacc tatgaattga cagcc 25

Claims

1.检测RNA含量的系统在制备诊断或辅助诊断肝癌产品中的应用：

所述RNA为RN7SL1 S结构域片段，所述RN7SL1 S结构域片段为序列表中序列1的第242-299位所示的RNA分子；

所述RNA含量为i1）或i2）：

i1）待测对象血液中所述RNA的含量；

i2）待测对象血浆中所述RNA的含量；

所述待测对象为候选肝癌患者；

所述检测RNA含量的系统包括利用定量PCR检测所述RNA含量的系统；

所述利用定量PCR检测所述RNA含量的系统包括用于检测所述RNA含量的引物，和进行定量PCR所需的其他试剂和/或仪器；

用于检测所述RN7SL1 S结构域片段含量的引物为名称为SF-F的单链DNA；

所述SF-F为序列表中序列7所示的单链DNA；

当所述待测对象的血浆中RN7SL1 S结构域片段的含量大于5.7amol/微升血浆，所述待测对象为或候选为肝癌患者，当所述待测测对象的血浆中RN7SL1 S结构域片段的含量小于或等于5.7amol/微升血浆，所述待测对象为或候选为非肝癌患者。