CN102433326A - 一种长非编码rna及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种新的、分离的长非编码RNA，该长非编码RNA具有SEQ ID No1所示的序列。本发明还提供了该长非编码RNA用作肿瘤标志物的用途，以及检测该长非编码RNA的探针和引物。本发明还提供了该长非编码RNA的抑制剂，该抑制剂能够抑制长非编码RNA的表达及肿瘤细胞增殖。本发明还提供了包含该抑制剂的药物组合物。

Description

一种长非编码RNA及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种新的肿瘤标志物及其用途等。

背景技术

人体中编码蛋白质的基因大约有2-3万个，仅占人类基因组的2％，其余98％不编码蛋白质的基因组DNA最初被认为是没有功能的，是生物体中的垃圾，通常被称为“垃圾DNA。但目前的研究表明，这些垃圾DNA大多可转录产生非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)。根据成熟转录本大小的不同，ncRNA可分为小分子ncRNA(如siRNA，miRNA，piRNA等)，中等长度ncRNA(70-200nt)和长ncRNA(long ncRNA，IncRNA，＞200nt)。目前，ncRNA领域研究较多的是小分子ncRNA，而对IncRNA的研究还处于起步阶段。由于序列内部存在过多的终止密码子，IncRNA不能被翻译成蛋白质，他们通常是以RNA转录本的形式行使其生物学功能，如发育过程中的细胞分化、细胞增殖、细胞凋亡和类固醇代谢等，越来越多的证据表明IncRNA在细胞中起着调控基因表达的重要作用。最近的研究发现IncRNA与细胞的癌变有着极为密切的联系，起肿瘤抑制基因作用的IncRNA表达下降或者缺失会导致肿瘤的发生，已经发现IncRNA与肺癌、非霍杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤和慢性淋巴细胞白血病等肿瘤疾病有关。这些研究结果都表明IncRNA在细胞增殖、分化和癌变中发挥着重要的作用，肿瘤相关IncRNA的发现可能会对肿瘤的诊断及基因治疗产生重大的影响。通过大范围分析肿瘤和正常组织的IncRNA，可以鉴定与肿瘤特异相关的IncRNA，使其成为潜在的病理诊断标记。通过引入针对具有癌基因特性的IncRNA的shRNA可以有效地表达特异性的siRNA并抑制IncRNA作用的发挥，比其他的治疗手段的毒副作用会更低。相反，通过病毒载体或质粒载体过表达具有肿瘤抑制基因作用的IncRNA，进而抑制其调控的特定靶基因的表达，也可以达到抑制肿瘤生长的效果。因此，发现肿瘤特异性表达的IncRNA对基于IncRNA的肿瘤诊断和治疗具有十分重要的意义。

发明内容

本发明涉及以下按顺序编号的段落中定义的主题：

1.一种分离的寡聚核酸分子，其特征在于所述核酸分子选自：

1)序列表中SEQ ID No1所示的核酸分子；

2)与序列表中SEQ ID No1所示的核酸序列具有90％或以上同源性的寡聚核酸分子。

2.段落1所述的寡聚核酸分子作为肿瘤标志物的应用。

3.根据段落2所述的寡聚核酸分子作为肿瘤标志物的应用，其特征在于所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。

4.一种在分离的样本中检测段落1所述的寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述方法为杂交法、扩增法或测序法。

5.根据段落4所述的检测寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述杂交法为Northern杂交或者基因芯片杂交。

6.一种探针，其特征在于，该探针能够检测段落1所述的寡聚核酸分子。

7.根据段落6所述的探针，其特征在于，所述探针具有SEQ ID No 6所示的核酸序列。

8.段落6或7所述探针在制备肿瘤检测试剂中的应用。

9.一种诊断肿瘤的检测系统，其特征在于该检测系统包含段落6或7所述的探针。

10.根据段落4所述的检测寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述扩增法为实时荧光定量聚合酶链式反应。

11.一组寡聚核酸分子，其特征在于，所述寡聚核酸分子为：

逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；

上游引物：5’-AGATTCCCATTTTGGCTTTG；

下游引物：5’-GGTGACATGGTGCTGTTTCA；

12.段落11所述的寡聚核酸分子组合在制备肿瘤检测试剂中的应用。

13.一种诊断肿瘤的检测系统，其特征在于所述检测系统包含段落11中所述的寡聚核酸分子。

14.根据段落13所述的检测系统，其特征在于该系统还包括逆转录酶及其反应缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲液、人工合成的内参及正常人对照品。

15.根据段落4所述的检测寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述测序法为高通量测序。

16.一种诊断肿瘤的方法，其特征在于，该方法包含以下步骤：

1)测定离体样本中段落1所述的寡聚核酸分子的水平；

2)比较被测定样本中段落1所述的寡聚核酸分子的水平与参考样本中的段落1所述的寡聚核酸分子的水平，如果与参考样本相比，被测定样本中该寡聚核酸分子的水平有显著改变，说明肿瘤的存在。

17.根据段落16所述的诊断肿瘤的方法，其特征在于所述方法为杂交法、扩增法或测序法。

18.根据段落17所述的诊断肿瘤的方法，其特征在于所述杂交法为Northern杂交或者基因芯片杂交。

19.根据段落17所述的诊断肿瘤的方法，其特征在于所述扩增法为实时荧光定量聚合酶链式反应。

20.根据段落17所述的诊断肿瘤的方法，其特征在于所述测序法为高通量测序。

21.根据段落16-20任一项所述的诊断肿瘤的方法，其特征在于所述显著改变为显著增加。

22.根据段落16-20任一项所述的诊断肿瘤的方法，其特征在于所述离体样本选自分离的体液、淋巴结样本或组织样本。

23.根据段落16-22任一项所述的诊断肿瘤的方法，其特征在于所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。

24.一种试剂，其特征在于能够降低SEQ ID No1所示寡聚核酸分子的水平。

25.根据段落24所述的试剂，其特征在于所述试剂为小干扰核酸。

26.根据段落24所述的试剂，其特征在于所述试剂为反义核酸。

27.根据段落25所述的试剂，其特征在于所述小干扰核酸选自SEQ ID No15-24所示的序列或所示序列的修饰产物。

28.根据段落26所述的试剂，其特征在于所述反义核酸选自SEQ ID No 25-26所示的序列或所示序列的修饰产物。

29.根据段落27或28所述的试剂，其特征在于所述修饰为如下修饰中的至少一种：

1)对核酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

2)对核酸序列中核苷酸的核糖的2’-OH的修饰；

3)对核酸序列中核苷酸的碱基的修饰。

30.一种肿瘤细胞增殖抑制剂，其特征在于包含有效量的段落24-29任一项所述的试剂。

31.一种药物组合物，其特征在于包含有效量的段落24-29任一项所述的试剂及药学上可接受的载体。

32.段落24-29任一项所述的试剂在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

33.根据段落32所述的应用，其特征在于所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。

34.一种治疗肿瘤的方法，其特征在于包含步骤：给需要治疗的对象应用0.1-50mg/kg体重/天的段落24-29任一项所述的试剂。

35.根据段落34所述的治疗肿瘤的方法，其特征在于所述肿瘤为高表达SEQ ID No1所示序列的肿瘤类型。

36.根据段落35所述的治疗肿瘤的方法，其特征在于所述肿瘤为高表达SEQ ID No1所示序列的肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。

本发明要解决的技术问题是根据个体样本中非编码RNA的表达水平进行肿瘤的诊断，特别是乳腺癌、肝癌、肺癌、食管癌等的诊断。本发明要解决的问题还涉及提供用于肿瘤诊断的方法及相应诊断试剂。

本发明要解决的另一个问题是提供用于抑制肿瘤细胞增殖的抑制剂及用于肿瘤治疗的药物组合物。

本发明经过广泛而深入的研究，发现并分离出新的可做为肿瘤标志物的寡聚核酸分子：Yiya。该寡聚核酸分子在正常组织或者癌旁组织中不表达或表达量很低，在肿瘤组织中广泛表达。在此基础上完成了本发明。

在本发明的第一方面，提供了一种新颖的分离的寡聚核酸，它包含具有SEQ ID NO 1所示序列的寡聚核酸；或者与序列表中SEQ ID NO 1所示的核酸序列具有90％或以上同源性的寡聚核酸序列。上述寡聚核酸可通过杂交法、扩增法或测序法进行检测。具体地说，扩增法包括荧光实时定量聚合酶链式反应，杂交法包括芯片杂交和Northern杂交，测序法包括高通量测序法。

本发明第二方面提供了检测SEQ ID No1所示序列寡聚核酸的探针或者特异性引物。优选的，所述检测探针具有下述序列(SEQ ID No 6)：

5’-ATCACTTCTCATCTAGATTCCCATTTTGGCTTTGTCATCTTTCTCCCCACTACATTCCAGCTATGTAGTCCTTCATATAGTTTCTAGAACGTGCCAAGATTTCTCTTCTAGATCTTTGCATTTGAAATTCCCTTTGCTTATAATGCTCTTGCCTAGCTCTTCATATATCTGGCTTGAGGGCATCTCTTAAGAGAGGACTTCGACTTCACCAATCTGAAACAGCACCATGTCAC-3’；

所述检测引物具有如下序列：

逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；

Yiya正向引物(SEQ ID No 7)：5’-AGATTCCCATTTTGGCTTTG；

Yiya反向引物(SEQ ID No 8)：5’-GGTGACATGGTGCTGTTTCA。

本发明第三方面提供了一种诊断肿瘤的检测系统，该系统包含上述检测探针；或该系统包含上述检测引物，在较佳的实施方式中，该系统还包括逆转录酶及其反应缓冲液、四种脱氧核糖核苷酸底物、DNA聚合酶、荧光定量PCR反应缓冲液、人工合成的内参及正常人对照品。

本发明第四方面提供了一种诊断肿瘤的方法，该方法包含以下步骤：

1)测定离体样本中SEQ ID No1寡聚核酸分子的表达水平；

2)比较被测定样本中SEQ ID No1寡聚核酸分子的水平与参考样本中的SEQ IDNo1寡聚核酸分子的水平，如果与参考样本相比，被测定样本中该寡聚核酸分子的水平有显著改变，说明肿瘤的存在。

测定离体样本中SEQ ID No1寡聚核酸分子的表达水平的方法，可以为杂交法、扩增法或测序法。具体地说，扩增法包括荧光实时定量聚合酶链式反应，杂交法包括芯片杂交和Northern杂交，测序法包括高通量测序法。如果通过上述方法测定的离体样本中SEQID No1寡聚核酸分子的表达水平比参考样本中该寡聚核酸分子的表达水平升高，则说明有肿瘤的存在。“升高”在此指的是SEQ ID No1寡聚核酸分子的表达水平至少增加5％，包括例如至少6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，30％，40％，50％或更多。所述离体样本可选自分离的体液、淋巴结样本或组织样本。上述的诊断肿瘤的方法，所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。

第五方面，本发明还提供了一种试剂(称为Yiya拮抗剂或Yiya抑制剂)，该试剂能够降低SEQ ID No1所示寡聚核酸分子的水平。较佳地，该试剂是Yiya的反义核酸或者小干扰RNA(siRNA)。这些化合物不仅能够抑制Yiya的表达，也能够抑制肿瘤细胞的增殖。具体来讲，所述小干扰核酸选自SEQ ID No15-24所示的序列或所示序列的修饰产物；所述反义核酸选自SEQ IN No 25-26所示的序列或所示序列的修饰产物。上述修饰为如下修饰中的至少一种：

1)对核酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；

2)对核酸序列中核苷酸的核糖的2’-OH的修饰；

3)对核酸序列中核苷酸的碱基的修饰。

反义核酸研究中，各种化学修饰方法很多。本发明采用选自核糖修饰、碱基修饰和磷酸骨架修饰中的一种或几种组合修饰的反义核酸，硫代、甲氧修饰方式的反义核酸的药理学、药代动力学、毒理学等临床前研究是各种化学修饰反义核酸中研究最为全面的，修饰的反义核酸在体内可以有效地防止人体内大量核酸外切酶对反义核酸的酶切而降解，从而避免反义核酸失去应有的生物学活性。此外硫代反义核酸还可激发RNA酶的活性，降解与其杂交的RNA链，因此优选这两种修饰方式的反义核酸在实验中应用。应当明确的是，任何能够增加反义核酸稳定性和生物利用度的修饰方法都可以应用，如胆固醇修饰、PEG修饰等。优选本发明反义核酸修饰选自硫代修饰、2’-甲氧基修饰和胆固醇修饰中的一种或几种。

对于小干扰核酸(siRNA)来讲，所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。

所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2’-OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某些取代基，例如，2’-氟代修饰，如式3所示；2’-氧甲基修饰，如式4所示；2’-氧亚乙基甲氧基修饰，如式5所示；2，4’-二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸(LNA)，如式7所示；2’-氨基修饰，如式8所示；2’-脱氧修饰，如式9所示。

所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5′-溴尿嘧啶修饰，如式10所示；5′-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2，6-二氨基嘌呤修饰，如式13所示。

这些修饰可以增加所述siRNA的生物可利用性，提高与靶序列的亲和性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。

此外，为了促进siRNA进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在siRNA正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细胞膜与细胞内的mRNA发生作用。

在本发明的第六方面，还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明Yiya的拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。优选的Yiya拮抗剂是反义核酸或者小干扰核酸。这些药物组合物可用于治疗肿瘤，尤其是Yiya高表达的肿瘤。优选的，所述Yiya高表达的肿瘤为乳腺癌、肝癌、肺癌、食管癌。这类载体或赋形剂包括但不限于：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合、药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性且可被人和/或动物所接受的量。所述“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明还提供了一种治疗肿瘤的方法，包含步骤：给需要治疗的对象应用0.1-50mg/kg体重/天的Yiya拮抗剂。在较佳的实施方案中，所述肿瘤为高表达SEQ IDNo1所示序列的肿瘤类型，优选为高表达SEQ ID No1所示序列的肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。

本发明的有益效果

本发明分离并制备了一种新的长非编码RNA，该RNA可作为肿瘤诊断的特异性标志物。另外，本发明提供的抑制该长非编码RNA表达的反义核酸和小干扰RNA(siRNA)，能够高效、特异地抑制该RNA表达，进而抑制肿瘤细胞增殖，同时具有较低的毒副作用。

附图说明

图15’-RACE和3’-RACE反应的产物电泳结果

图2Northern杂交检测Yiya在肿瘤及对照组织中的差异表达

图3Yiya在细胞总RNA及细胞核RNA中的表达情况

图4实时荧光定量RT-PCR检测Yiya在肿瘤样本中的表达

图5实时荧光定量PCR检测Yiya在肿瘤样本中拷贝数的扩增

图6Yiya在细胞周期中的表达变化

图7Yiya过表达实验

图8利用siRNA降低Yiya的表达

图9肿瘤患者血清样本中Yiya高表达

图10利用反义核酸抑制Yiya的表达

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本发明所使用的DNA寡聚核酸由Invitrogen北京分公司合成，所使用的RNA寡聚核酸由广州市锐博生物科技有限公司合成。

实施例一.长非编码RNA Yiya全长cDNA的获得及鉴定

1.Yiya基因的核酸序列(SEQ ID No1)：

5’-TTTGGGATGGAGGAAGTGAGGGAGAAGTGCTTCAGAGGTGGCAGCAATGTGCTTCTGAGCGTGGCTGCGTGGCTCCCTATTTCAATCTGCCTGTGAAGATTTCCTGAGGCATATGACCCTTCCTGCCATGACCCTTGGTTTCCAGAGGCATCTGCTGGTCAGCCCCTAGGCAACACTTAAATAGGAAAACTTTTGCCTATCTGTTACTAAGACATGCTGATTTCCAGATATCTTAGTACCCTTTTTATTATCTCTCTGCCTGGGGTTTAATAACAGTTAAAAGAGACAATTCATGCAATGTGCAACAAAGTTTACTTTGTGTACATATATTTGCTCTGCACATAGCTGGCATATAGTAACTGCTCAATAAATATCAGTGGCTATTATAATCTAGAGCTTGTTGGGGAGTTGTCTGAGTGAGAAAAGAACAAAAGATACTCGTTTTACAAACAATTTTTGCTTCATCTCTGGATGGCATATTCATTTCTGAAGCATCTTCACACTCAGTTGCTAAGAATAGGATATATTCTTTCCATTGTACAGATGGAGTAACCGAGAGACTGGAAAGTGACATCACCAACAGGCGGTGACCTAGGGAGTCAGGGCCAGAACCAGGTCTGGAATACAGACTTCCTGACTCCTGACCCAGGTTCCCTTCTGCCCTGTGGCCTTCACAGGACGCCTGGAGAGACCAGGGAAGTATCTGTTTCAGGGCTCTCTGAGTTGCCCTTGGAAGTTTATCATCTATCAACTGACTGTTGACCAAAAACACACTGATTCCTGAGGAGACCTTACAGGATGTCCTGTTGAGACTTTTCCTCCTCTTTTCATTAGTGCTTTGCTGGCAGATTAAAATTCAGCGGATCCCATTTGTAGGAAGTCTGATAAAATATTCTCATCTCTATTGCAAACAACTTCTCCATCTGCCACTTGGCTGAGAGGATCCGACTCAAACACTCTCAAAGAGGAGAGAGTGATACCAGGCAGAAGAAGGTACAGGAAGCAGCAAGGGGTTTGTGTCTGGACGTGTCTACCTGATCTATTGTCTGATGGAGCTGACTAGCCAGCTCTGTTAAGCTGCTGGCTTTTCTTCCCTAAAATGCCTGAATGCACCTATAATTACTTACCCTATTATTTGGTATCTTATAGATGCGGCTCTATATATGCAGTGTACAAATCTCTAAGAGAAACAACACATTTGGCATTGGGCCTAGGATATAGATGAGCTATGGGAGGAAAAGATTGGAGAATATATGTAGTGAGATCAGAAAAGCTGATTTGAGAAAGGTAAGGCAGCTTGCAAATTGCAAAGCATTGAGGGAAGTCAGTGCAATTCACCTGAGAAGACATTTATACTAGTATTTGCAAAGAACTGTATTGGGATGAATAGAAAATGAAAAAGACATGACCCTAGATTTAAATTTGTAAGGGTAACATTCCTTCCTTCTACACATGCTCATGCTCAGTAAGTACCTATTATGTGCAAGGCACTTTGCTGGATCCTGGAGGTATACTGGTGAACAAGAAAGATGTGAGTCCACCCTCTCAGAACTTACAATTTACTGGGAGAGAGCAACAAGGAAAATAAGATCACAGTTTGGGATAAATCCTAAGAAGGTAATAAAGAAATTGGTGTGCTAGAAAGTCTAAGGGTTGGTGGGGTGGGTGGGGGGTGACATGGTGCTGTTTCAGATTGGTGAAGTCGAAGTCCTCTCTTAAGAGATGCCCTCAAGCCAGATATATGAAGAGCTAGGCAAGAGCATTATAAGCAAAGGGAATTTCAAATGCAAAGATCTAGAAGAGAAATCTTGGCACGTTCTAGAAACTATATGAAGGACTACATAGCTGGAATGTAGTGGGGAGAAAGATGACAAAGCCAAAATGGGAATCTAGATGAGAAGTGATG-3’

Y-5AS1 primer(SEQ ID No2)：5’-GGCTTTGTCATCTTTCTCCCCACTAC

Y-5AS2 primer(SEQ ID No3)：5’-GAGAGGACTTCGACTTCACCAATCTG

Y-3AS1 primer(SEQ ID No4)：5’-GGTGCTGTTTCAGATTGGTGAAGTCG

Y-3AS2 primer(SEQ ID No5)：5’-GCCCTCAAGCCAGATATATGAAGAGC

2.长非编码RNA Yiya的克隆及鉴定

获得1×10⁶体外培养的HEK-293细胞，利用北京博迈德生物生物技术发展公司的离心柱型RNApure试剂盒提取细胞总RNA；然后利用北京坚诚达科技有限公司提供的核糖体RNA去除试剂盒去除18s和28s核糖体RNA，用oligo-dT杂交分离法去除信使RNA，随后使用NEB公司的RNase free的DNase I(Cat：M0303S)对获得的poiyA-minus RNA组分进行基因组DNA消化。按照分子克隆的说明，对富集的polyA-minus RNA组分进行酚氯仿异戊醇抽提及乙醇沉淀，RNA回溶定量后，用Promega公司的cDNA合成系统(Cat：4360)进行cDNA合成，具体如下。取1μg RNA样本作为模版，加入2μl(500ug/ml)6碱基随机逆转录引物，按照产品说明书要求进行双链cDNA的合成。将合成的双链cDNA与平末端的双链DNA接头相连，使用Takara公司的LA-Taq DNA聚合酶(Code：DRR200A)及接头上的通用引物进行PCR扩增。用天根生化科技(北京)有限公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(Cat：DP214-03)纯化回收PCR产物，将PCR产物与天根天根生化科技公司的pGM-T载体(Cat：VT202-02)以1∶5的比例在16℃条件下进行过夜连接，将连接产物交由上海博尚生物技术有限公司进行序列测序，然后将测序得到的序列与NCBI数据库进行比对。

根据克隆到的233bp长的Yiya cDNA片段序列，按照Clontech公司的SmarterRACE cDNA扩增试剂盒(Cat：634914)说明书的要求，设计用于5’-RACE和3’-RACE反应的引物序列，按照试剂盒的使用说明用人源总RNA做模版进行第一链cDNA合成，然后使用Y-5AS1引物及试剂盒自带的接头序列引物，使用梯度PCR扩增程序进行快速末端扩增，PCR扩增的反应程序为：5×(94℃，30秒；72℃，3分钟)；5×(94℃，30秒；70℃，30秒；72℃，3分钟)；5×(94℃，30秒；68℃，30秒；72℃，3分钟)；25×(94℃，30秒；66℃，30秒；72℃3分钟)；1×(72℃，10分钟)。第二轮PCR以0.5μl第一轮PCR产物作为模版，使用巢式引物Y-5AS2，用同样的PCR程序以50μl反应体系进行二轮PCR扩增，将得到的PCR产物用天根生化科技公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(Cat：DP214-03)进行纯化回收，然后将纯化产物与天根生化科技公司的pGM-T载体(Cat：VT202-02)在16℃条件下以1∶7的比例连接50小时，然后按说明书要求进行转化，涂板，挑取阳性单克隆并进行菌落PCR鉴定及测序。以同样的方式完成3’-RACE反应。

5’-RACE及3’-RACE反应的产物电泳结果如图1所示，5’-RACE反应获得了一条长度在1.8kb左右的cDNA片段，3’-RACE没有获得明显的特异性扩增片段。这说明通过cDNA克隆得到的233bp长的片段位于Yiya cDNA的3’末端，将233bp片段与5’-RACE扩增片段进行拼接，我们得到Yiya基因的全长核酸序列(SEQ ID No1)。

实施例二.Northern杂交检测Yiya在肿瘤及正常组织中的表达差异

1.Yiya杂交探针序列(SEQ ID No 6)

5’-ATCACTTCTCATCTAGATTCCCATTTTGGCTTTGTCATCTTTCTCCCCACTACATTCCAGCTATGTAGTCCTTCATATAGTTTCTAGAACGTGCCAAGATTTCTCTTCTAGATCTTTGCATTTGAAATTCCCTTTGCTTATAATGCTCTTGCCTAGCTCTTCATATATCTGGCTTGAGGGCATCTCTTAAGAGAGGACTTCGACTTCACCAATCTGAAACAGCACCATGTCAC-3’

2.Northern杂交检测Yiya在肿瘤样本中的表达

1)组织样本总RNA提取：称取经手术分离的8对人体肿瘤组织及癌旁正常组织样本(包括肝癌、食管癌、卵巢癌及乳腺癌)各1克，用NORGEN公司的动物组织RNA纯化试剂盒提取总的RNA；将20微克总RNA经甲醛变性后，上样到1％的甲醛变性琼脂糖凝胶上，在100V和67mA条件下进行电泳，电泳时间为1小时15分钟。随后将总分离的RNA条带转移到带正电的硝酸纤维素尼龙膜上，转膜时间为18个小时。

2)探针制备包括探针克隆质粒的线性化和体外转录两个步骤，具体如下。

质粒线性化：将5μg含有探针序列的克隆载体加入到10μl 10×限制性内切酶的缓冲液中，加入1μl BSA和2μl Sal I限制性内切酶(NEB公司)，用蒸馏水将反应体系补充到100μl，在37℃水浴中消化3-4小时，取小量消化产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，确认线性化完全。最后，使用天根生化科技公司的通用型DNA纯化回收试剂盒(Cat：DP214-03)对消化产物进行纯化回收，将片段化的质粒用35μl蒸馏水洗脱并进行定量。

体外探针转录：利用如下反应体系和条件制备用于杂交的RNA探针。反应体系包括1μg质粒模板(5μl)，1μl rNTP(10mM，Promega)，1μl Biotinylated UTP(1mM，Roche)，2μl DTT(100mM，Promega)，1μl T7 polymerase(Promega)，4μl 5×transcription buffer(Promega)，1μl Ribonuclease inhibitor(Promega)，加入DEPC水将反应体系补至20μl。

将该反应体系在37℃水浴中孵育1小时；加入1μl RNAse-free的DNase I(NEB公司，Cat：M0303S)，37℃下孵育15分钟，消化DNA模板；使用Sigma公司的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提体外转录得到的RNA。具体过程是用DEPC水将反应体系补充到100μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，剧烈震荡15秒，4℃条件下13000rpm离心5分钟；取上清(约100μl)置于一个新的无RNase的离心管中，加入250μl预冷的无水乙醇，加入10μlNaAc(3M)，-80℃条件下沉淀半小时以上；4℃条件下，以最高转速(约14000rpm)离心15分钟，弃上清；向沉淀中再加入500μl的80％的乙醇洗涤，沉淀一次，4℃条件下，13000rpm离心5分钟，弃上清；冰上晾干5-10分钟，加入20μl DEPC水回溶，测定浓度，保存于-80℃冰箱备用。

3)探针杂交：将带正电的尼龙膜用切纸刀切成7cm×8.3cm大小；将分离的总RNA样本条带转移至尼龙膜上；将尼龙膜放入杂交瓶中，加入5ml DIG EasyHyb(Roche，Cat：11603558001)，在68℃下预杂半小时；预杂过程中，取biotin-UTP标记的RNA探针1μg，在95℃条件下变性5分钟，随后冰浴5分钟；预杂交半小时后更换5ml新的杂交液，并将探针迅速加入到杂交液中，在68℃条件下进行过夜杂交。杂交结束后，先在2×SSC中室温洗涤两次，每次5分钟；然后在0.1×SSC中，68℃下洗涤两次，每次15分钟；用Roche公司的封闭液室温封闭至少半小时，然后加上奥德赛公司的Streptavidin标记的荧光染料(Cat：926-32230)，室温孵育半小时；用PBST洗涤3次后，再用1×PBS洗涤一次，然后用奥德赛远红外双荧光检测仪进行检测，比较正常与对照样本之间的信号强弱。图2所示的实验结果表明，该转录本在肿瘤样本中的表达明显高于正常样本中的表达量，提高倍数为2倍左右。

实施例三.Yiya转录本的亚细胞定位

提前一天将5×10⁵的HEK293细胞以适量密度种到直径为10cm的细胞培养皿中，细胞长到大约75％的密度时，收集细胞；吸尽培养基，以2ml预冷的PBS洗涤两次；向培养皿中加入5ml预冷的PBS，用细胞刀刮取细胞，吸入15ml的离心管里；4℃，1850g离心10分钟，弃上清；加入5倍细胞沉淀体积的低渗缓冲液重悬，洗涤细胞；4℃，1850g离心5分钟，弃上清；以两倍细胞沉淀体积的低渗缓冲液重悬细胞，冰浴静置10分钟；以Dounce匀浆器缓慢匀浆30-40次；4℃，3300g离心15分钟，弃上清，收集的沉淀即为细胞核。(新鲜制备的低渗缓冲液：10mM Kcl，10mM HEPES(pH＝7.9，Tm＝4℃)，1.5mM Mgcl2)。

然后用Trizol(Sigma)试剂按照说明书中的说明提取细胞核中总的RNA，再按照实施例二中所述的实验步骤，利用Northern杂交检测Yiya在总RNA和细胞核RNA的表达情况。实验结果如图3所示。

实施例四.实时荧光定量RT-PCR检测肿瘤组织中Yiya的表达和拷贝数变化

1.检测引物组合。委托Invitrogen北京分公司合成以下用于检测的引物。

引物组合一：

逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；

Yiya正向引物(SEQ ID No7)：5’-AGATTCCCATTTTGGCTTTG；

Yiya反向引物(SEQ ID No8)：5’-GGTGACATGGTGCTGTTTCA；

引物组合二：

逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；

内参正向引物1(SEQ ID No9)：5’-AGACTAGGGCCAGAGGCGGC

内参反向引物1(SEQ ID No10)：5’-CCCTGCGGGGTACCTCACCT

引物组合三：

逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；

内参正向引物2(SEQ ID No11)：5’-GGACTTCGAGCAAGAGATGG

内参反向引物2(SEQ ID No12)：5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG

2.肿瘤及对照组织样本的获得及总RNA提取

获得经手术分离的人体肝癌、食管癌、卵巢癌及乳腺癌肿瘤组织及癌旁正常组织样本各二十对，用NORGEN公司的动物组织RNA纯化试剂盒提取总的RNA，对提取的总RNA进行定量。

3.实时荧光定量RT-PCR检测Yiya在肿瘤样本中的表达

利用实时荧光定量RT-PCR检测步骤2中获得的二十对肿瘤及癌旁组织样本中Yiya的表达情况，具体步骤如下：

1)RNA逆转录：使用天根生化科技公司的逆转录试剂盒(TIANScript M-MLV，cat：ER104-03)进行RNA样本的逆转录反应，具体按照试剂盒说明书的方法进行，步骤如下：取1微克提取的总RNA样本，加入2μl(10μM)6碱基随机逆转录引物，2μl dNTP(10mM)，混匀后置70℃水浴变性5分钟；冰上放置3分钟后取出，加入4μl5×First-Strand Buffer，0.5μl RNase inhibitor(40U/μl)，1μl M-MLV(200U/μl)，总体积为20μl；混匀后短暂离心，置于Eppendorf PCR仪中进行逆转录反应，反应参数为25℃，10分钟；42℃，50分钟；95℃，5分钟；随后置于4℃保存。其中，RNase inhibitor(cat# N211)为Promega公司的产品。

2)实时荧光定量PCR：使用天根生化科技公司的的HotMaster Taq DNA polymerase(cat#：ET106-01-01)对样本中Yiya的表达进行定量检测，具体方法按产品说明书进行，步骤如下：取2μl逆转录产物，加入2.5μl 10×HotMaster Taq Buffer，0.5μl(10μM)上游引物，0.5μl(10μM)下游引物，1μl dNTP混合物(各2.5μM)，1μl SYBR Green I(5×)，0.2μl HotMaster Taq DNA polymerase(2.5u/μl)，最后加入17.3μl ddH2O，反应总体积为25μl。混匀后短暂离心，置于Eppendorf PCR仪中进行PCR扩增反应，反应参数为95℃预变性2分钟，95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒；循环次数为40个循环。每个反应设置3个重复。

3)数据分析：对同一样本分别检测其中目标RNA及内参RNA的表达，用引物组合一检测Yiya的表达，用引物组合二和引物组合三检测内参的表达；以内参的表达量为基准，对目标RNA的表达进行归一化处理；随后使用本领域通常使用的delta delta Ct法对目标RNA的表达量进行定量。本实验的内参为beta-actin。具体方法和步骤可以参见文献：Livak KJ and Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-timequantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T))Method.Methods.2001Dec；25(4)：402-408。实验结果如图4所示，与Northern杂交结果类似，实时荧光定量检测表明Yiya在肿瘤组织中的表达量显著高于癌旁正常组织中的表达量。

4.实时荧光定量PCR检测Yiya在肿瘤样本中的拷贝数变化

1)组织样本中Yiya基因组DNA的提取：通过外科手术获得5对肿瘤及癌旁正常组织样本，制备样本的冰冻切片并进行HE染色，用27G针头分离3000-5000个细胞核，用蛋白酶K在42℃消化72小时后，用酚/氯仿进行抽提基因组DNA，乙醇沉淀后用15μl TE回溶。

2)Yiya在肿瘤样本中拷贝数的检测：利用实时荧光定量PCR检测肿瘤及癌旁正常组织中Yiya的DNA拷贝数，以RNase P为内参基因。荧光定量PCR体系为25ul，2.5ng的基因组DNA模板，每种引物浓度为400nmol/L，1×缓冲液，0.2×Sybgreen荧光染料，PCR程序为95℃两分钟变性；40个循环，每个循环进行95℃变性15秒，58℃退火15秒，72℃延伸30秒。在每个循环结束后检测荧光信号，样品的荧光强度超过基准线所需的循环数被定义为Ct值，其与靶基因的丰度成一定比例。各个样本中基因的拷贝数用下面的公式计算获得：Q(拷贝数)＝2X2-[Ct(肿瘤样本-参考基因)-Ct(正常样本-参考基因)]，其中参考基因为RNase P。实验结果如图5所示，相比与癌旁正常组织样本，肿瘤组织中Yiya基因的拷贝数明显升高，为正常组织的3-4倍。

实施例五.Yiya在细胞周期中的表达变化

按照参考文献“Stem-Loop Binding Protein，the Protein That Binds the 3` End ofHistone mRNA，Is Cell Cycle Regulated by Both Translational and PosttranslationalMechanisms.MOLECULARAND CELLULAR BIOLOGY.2000Jun；20(12)：4188-4198”中所述的细胞周期同步化方法。用Thymidine和Nocodazole(Sigma)两种抗肿瘤药物将Hela细胞阻滞在不同的细胞周期，然后用实施例二所述的Northern blot检测不同细胞周期中Yiya转录本的表达水平。S期与G2期细胞的制备：提前一天将Hela细胞接种到6孔培养板上，待细胞生长到25-30％密度时，用胸腺嘧啶核苷双阻断法阻滞获得S期与G2期细胞。用1×PBS洗涤两次，加入含有2mM Thymidine的DMEM培养基培养16小时后，去除Thymidine，用1×PBS洗涤两次后再加入新鲜的DMEM培养基培养12小时；然后再加入含2mM Thymidine的DMEM培养基培养16小时，在第二次阻断后，去除Thymidine，用1×PBS洗涤2次，加入新鲜的DMEM培养基，培养4小时后收集的细胞即为S期细胞；培养10小时后收集的细胞，即为G2期细胞。Thymidine-Nocodazole联合阻断获得G1和M期细胞：在细胞生长至40％密度时，加入含有2mM Thymidine的DMEM培养基培养20-24小时，去除Thymidine，用1×PBS洗涤2次，加入新鲜的DMEM培养基，培养3-4小时，然后换成含100ng/ml Nocodazole的DMEM培养基，培养12小时，随后收集的细胞即为M期细胞；若此时去除Nocodazole，用1×PBS洗涤2次，加入新鲜的DMEM培养基培养4个小时，随后收集的细胞即为G1期细胞。用无血清培养基培养细胞，获得G0期细胞。用Trizol(Sigma)试剂提取所收集细胞的总RNA，按照实施例二所述的方法，用Northern杂交检测Yiya基因在细胞周期各期的表达水平，实验结果如图6所示，Yiya基因在S期的表达量最高，是其他期的2倍左右。

实施例六.用于检测Yiya表达水平的实时荧光定量RT-PCR试剂盒

用于检测Yiya表达水平的实时荧光定量RT-PCR试剂盒包括以下成分：

1.逆转录酶及其反应缓冲液，缓冲液成分及浓度如下：1M Tris(pH 8.5)，10mM；1MHCl，2.94mM；1M KCl，50mM；1M MgCl₂，2.5mM；10mM dNTP，200μM；50×ROX，0.02×；ddH2O；

2.Yiya的逆转录及PCR扩增引物组合：

逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；

正向引物：5’-AGATTCCCATTTTGGCTTTG；

反向引物：5’-GGTGACATGGTGCTGTTTCA

3.DNA聚合酶；

4.参考样本；

5.试剂盒使用说明书。

实施例七.Yiya过表达实验

1.Yiya全长cDNA扩增引物组合

正向引物(SEQ ID No13)：5’-AAAAAGCTTCATCACTTCTCATCTAGATTCCCAT

反向引物(SEQ ID No14)：5’-AAACTCGAGTTTGGGATGGAGGAAGTGAGGGAGA

2.全长cDNA克隆：利用上述引物组合，对Yiya全长cDNA序列进行扩增，将扩增片段克隆到pEGFP-C(Clontech)表达载体中。使用全式金公司的高保真酶试剂盒(Code：AP221-11)按照说明书以100ng人的基因组DNA为模版，在50ul的反应体系里进行PCR反应，PCR反应程序为：94℃，5分钟；30×(94℃，30秒；60℃，30秒；72℃，2分钟)；72℃，10分钟。取3ul PCR产物上样1％琼脂糖胶，确认出现1.9Kb左右特异性目的条带的扩增后，用天根生化科技公司的通用型DNA纯化回收试剂盒进行纯化，测定浓度。取4.5ug的PCR产物用Hindlll和Xhol(NEB)限制性内切酶在100ul体系里进行37℃过夜双酶切，同时用同样的酶切条件线性化pEGFP-C表达载体。分别用天根生化科技公司的试剂盒进行纯化回收，以1∶5的载体：目的片断的比例设定连接反应，16℃连接过夜，第二天进行转化及菌落PCR鉴定，以及测序测定，挑选出序列完全正确的载体进行后面的过表达实验。

3.过表达载体的转染实验：过表达实验在6孔培养板中培养的Hela细胞上进行，对于每个培养孔设立转染体系，以不含目的基因的空载体为阴性对照。(1)将1ug含有目的基因的表达载体加入到200ul Opti-MEM(Hyclone)培养基中混匀，室温放置5分钟；(2)将4ul Lipo2000(invitrogen)与200ul的Opti-MEM在另一个离心管中混匀，室温放置5分钟；(3)将(1)(2)两管中的溶液进行混合，室温放置20分钟；(4)在等待的20分钟期间，给待转染的细胞进行换液，将每个孔中的DMEM(Gibco)培养基换为200ul的Opti-MEM无血清培养基；(5)20分钟后，将表达载体与Lipo2000的混合物均匀滴加到细胞培养板的每个孔中；(5)待细胞在0.5％的CO₂培养箱中培养24小时后，收集细胞，用1×PBS洗涤2次，取一部分细胞直接用Trizol(Invitrogen)提取总RNA，按实施例二所述的方法用Northern杂交检测Yiya的过表达情况。另一部分细胞加入0.25％的胰酶500ul，在37℃条件下孵育3-5分钟；加入1ml DMEM中和胰酶反应，转移到1.5ml离心管中，1000rpm离心5分钟；用1×PBS洗涤一次，加入70％乙醇，4℃固定过夜；2000rpm离心10分钟，弃上清；加入400ul含0.1％Triton X-100的1×PBS，再加入1-2ul 25mg/ml的RNase和8ul 10ug/ul的PI，轻轻混匀，37℃消化30分钟，转移到流式管中用流失细胞仪进行检测。数据用CELL Quest和ModFit等软件进行细胞周期分析。图7所示的实验结果表明，过表达Yiya使细胞阻滞在S期。

实施例八.利用siRNA降低Yiya的表达

1.siRNA序列

委托广州锐博生物科技有限公司合成以下修饰的和未修饰的siRNA序列。

Yiya siRNA-1正义链(SEQ ID No15)：5’-GCCCUCAAGCCAGAUAUAUTT

Yiya siRNA-1反义链(SEQ ID No16)：5’-AUAUAUCUGGCUUGAGGGCTT

Yiya siRNA-2正义链(SEQ ID No17)：5’-GCUAGGCAAGAGCAUUAUATT

Yiya siRNA-2反义链(SEQ ID No18)：5’-UAUAAUGCUCUUGCCUAGCTT

Yiya siRNA-3正义链(SEQ ID No19)：5’-GCAUUAUAAGCAAAGGGAATT

Yiya siRNA-3反义链(SEQ ID No20)：5’-UUCCCUUUGCUUAUAAUGCTT

Yiya siRNA-4正义链(SEQ ID No21)：5’-GCAAAGAUCUAGAAGAGAATT

Yiya siRNA-4反义链(SEQ ID No22)：5’-UUCUCUUCUAGAUCUUUGCTT

Yiya siRNA-5正义链(SEQ ID No23)：5’-GCACGUUCUAGAAACUAUATT

Yiya siRNA-5反义链(SEQ ID No24)：5’-UAUAGUUUCUAGAACGUGCTT

2.RNA干扰实验

实验前一天，将3×10⁵HEK293(人胚胎肾细胞)以适当密度接种到6孔细胞培养板中，培养基为含有2mM L-glutamine、10％胎牛血清(Sigma)、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM培养基。当细胞生长至30-50％密度时，进行转染实验。对于6孔培养板的每个孔，(1)将100pmol siRNA加入到200ul Opti-MEM(HycIone)培养基中混匀，室温放置5分钟；(2)在另一个离心管中，将4ul Lipo2000(invitrogen)加入到200ul Opti-MEM(Hyclone)中混匀，室温放置5分钟；(3)五分钟后，将(1)(2)的两管溶液再次混匀，室温放置20分钟；(4)在等待的20分钟期间，给待转染的细胞进行换液，即将每个空中的DMEM(Gibco)培养基换为200ul的Opti-MEM(Hyclone)无血清培养基；(5)20分钟之后将siRNA与Lipo2000的混合物均匀滴加到细胞培养板的每个孔中。细胞在CO2培养箱中37℃温育24h后，按实施例二所述的方法利用Norrhern杂交检测该基因被抑制的情况。图8所示的实验结果表明，siRNA-2、siRNA-4和siRNA-5能显著降低Yiya的表达量。

实施例九.检测血清样本中Yiya的表达情况

1.血清及血浆样本的分离及RNA提取

获得来源于被检测个体及作为参考的健康个体的血液样本，从中分离血浆或血清成分，用于Yiya的表达检测，具体步骤如下：

1)血清的分离：将获得的血液样本静置于室温，使其自然凝固，然后将其进行离心分离，得到的上清液即为血清。离心条件为4℃，500×g，离心时间为10分钟。

2)血浆的分离：按本领域公知的技术对获得的血液样本进行抗凝处理，随后进行离心分离，去除血细胞，所得的上清液即为血浆。离心条件为4℃，500×g，离心时间为10分钟。

2.血清及血浆样本中RNA成分的分离

分离血清或血浆样本中的RNA组分，用Nanodrop核酸定量仪将提取的RNA进行定量后，用于RNA组分的定量检测。

3.实时荧光定量RT-PCR方法检测血清样本中Yiya的表达

利用实施例四中所述的方法，分别检测二十例肝癌和二十例乳腺癌患者来源的血清样本中Yiya的表达情况，二十例来源于健康个体的血清样本用作对照，图9所示的实验结果表明，与健康对照样本相比，Yiya在来源于肿瘤样本患者的血清及血浆中显著高表达，平均上升3倍以上。

实施例十.利用反义核酸抑制Yiya的表达

1.反义核酸序列

委托Invitrogen北京分公司合成以下修饰的和未修饰的反义核酸序列。

YiYa ASO-1(SEQ ID No25)：5’-GAGAGGACTTCGACTTCACC

YiYa ASO-2(SEQ ID No26)：5’-GCTCTTGCCTAGCTCTTCAT

2.反义核酸降低Yiya的表达的实验

实验前一天，将3×10⁵HEK2g3(人胚胎肾细胞)以适当密度接种到6孔细胞培养板中，培养基为含有2mM L-glutamine、10％胎牛血清(Sigma)、100U/ml青霉素和100ug/ml链霉素的DMEM培养基。当细胞生长至30-50％密度时，进行转染实验。对于6孔培养板的每个孔，(1)将100pmol反义核酸加入到200ul Opti-MEM(Hyclone)培养基中混匀，室温放置5分钟；(2)在另一个离心管中，将4ul Lipo2000(invitrogen)加入到200ul Opti-MEM(Hyclone)中混匀，室温放置5分钟；(3)五分钟后，将(1)(2)的两管溶液再次混匀，室温放置20分钟；(4)在等待的20分钟期间，给待转染的细胞进行换液，即将每个空中的DMEM(Gibco)培养基换为200ul的Opti-MEM(Hyclone)无血清培养基；(5)20分钟之后将siRNA与Lipo2000的混合物均匀滴加到细胞培养板的每个孔中。细胞在CO2培养箱中37℃温育24h后，按实施例二所述的方法利用Northern杂交检测该基因被抑制的情况。图10所示的实验结果表明，YiYa ASO-1及YiYa ASO-2均能显著降低Yiya的表达量。

实施例十一针对Yiya的siRNA和反义核酸抑制肿瘤细胞增殖

细胞培养：

Hela细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，10％FBS-DMEM培养基(FBS购自Gibco，DMEM购自Hyclone)培养，37℃，5％CO₂培养。收集生长状态良好的Hela细胞，离心计数，以2×10³每孔铺于96孔板内，37℃，5％CO₂培养24h。

转染：

1)转染前一天，在96孔板中用适量不含抗生素的培养基接种培养细胞，使转染时细胞的汇合度达到30～50％；

2)转染样品按照如下方法准备寡聚物-Lipofecta mine^TM2000复合物：

a.用25μl不含血清的

培养基(Gibco)分别稀释Yiya的反义核酸(SEQ IDNO 25和26)、Yiya的siRNA(Yiya siRNA1-5)、siRNA阴性对照、反义核酸阴性对照，加入孔内后终浓度为100pmol，轻轻混匀，每个转染设3个复孔；

b.使用前轻轻混匀Lipofecta mine^TM2000(Invitrogen)，然后取0.25μl稀释到25μl的

培养基，轻轻混匀后在室温下孵育5min；

c.孵育5min后，稀释的Lipofecta mine^TM2000分别与稀释的反义核苷酸及对照混合，轻轻混匀后在室温下孵育20min，以允许复合物的形成；

3)将复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中，轻轻地前后摇动培养板混合；

4)37℃，5％CO₂培养箱继续孵育72小时。

基于MTT的细胞毒性实验：

向上一步骤中得到的细胞，加入配制好的MTT(Sigma)5mg/ml(用0.9％的生理盐水配制)，每孔加入20μl，37℃，5％CO₂孵育4小时后吸去培养基及MTT，每孔加入DMSO100μl并通过酶标仪读取OD570-OD630的吸光度值。

计算抑制率：

计算得到细胞生长抑制率如表1所示。

表1Yiya siRNA和反义核酸对Hela细胞生长抑制率

抑制剂	细胞生长抑制率
		Yiya siRNA-1	3％
Yiya siRNA-2	67％
		Yiya siRNA-3	9％
Yiya siRNA-4	72％
		Yiya siRNA-5	48％
Yiya ASO-1	56％
		Yiya ASO-2	44％

Claims (10)

1.一种分离的寡聚核酸分子，其特征在于所述核酸分子选自：

1)序列表中SEQ ID No1所示的核酸分子；

2)与序列表中SEQ ID No1所示的核酸序列具有90％或以上同源性的寡聚核酸分子。

2.权利要求1所述的寡聚核酸分子作为肿瘤标志物的应用。

3.根据权利要求2所述的寡聚核酸分子作为肿瘤标志物的应用，其特征在于所述肿瘤选自肝癌、乳腺癌、卵巢癌或食管癌。

4.一种在分离的样本中检测权利要求1所述的寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述方法为杂交法、扩增法或测序法。

5.根据权利要求4所述的检测寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述杂交法为Northern杂交或者基因芯片杂交。

6.一种探针，其特征在于，该探针能够检测权利要求1所述的寡聚核酸分子。

7.根据权利要求6所述的探针，其特征在于，所述探针具有SEQ ID No 6所示的核酸序列。

8.权利要求6或7所述探针在制备肿瘤检测试剂中的应用。

9.一种诊断肿瘤的检测系统，其特征在于该检测系统包含权利要求6或7所述的探针。

10.根据权利要求4所述的检测寡聚核酸分子的方法，其特征在于所述扩增法为实时荧光定量聚合酶链式反应。

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