CN114164278B - 一种用于胃癌辅助诊断的标志物及试剂盒 - Google Patents

一种用于胃癌辅助诊断的标志物及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药生物技术领域，公开了一种用于胃癌辅助诊断的分子标志物——LncRNA PAX8‑AS1。LncRNA PAX8‑AS1在胃癌的癌组织中高表达，在癌旁正常组织中低表达；而且，LncRNA PAX8‑AS1在胃癌细胞系中的表达水平显著高于正常胃黏膜细胞株；通过敲低LncRNA PAX8‑AS1基因的表达水平，能明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭。因此，LncRNA PAX8‑AS1可以作为胃癌辅助诊断的分子标志物；通过检测样本中LncRNA PAX8‑AS1的表达水平，可以对胃癌进行辅助诊断，为临床医生对胃癌的诊断提供参考依据。

Description

一种用于胃癌辅助诊断的标志物及试剂盒
技术领域
本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于胃癌辅助诊断的标志物及试剂盒。
背景技术
胃癌是危及世界尤其是我国国民的最常见的消化道恶性肿瘤，近年来其发病率及死亡率不断升高。根据最新全球癌症数据显示，中国年癌症新发病例已达457万，其中胃癌约有48万，占10.8％，死亡例数约37万，占12.4％，发病率及死亡率位均位列前三。因此，揭示胃癌发生发展的分子机制对胃癌的早期诊断及探寻有效的治疗靶点具有重大的科学意义及临床意义。
近年来关于长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在肿瘤中的功能越来越受到重视，长链非编码RNA是一类真核生物中长度大于200nt的非编码RNA分子。根据其与邻近基因的位置可以分为反义lncRNA、增强子lncRNA、基因间lncRNA、双向lncRNA和内含子lncRNA。它具有多种生物学功能，比如在细胞核中作为分子支架、协助可变剪接、调节染色体结构，或在细胞质中调控翻译、促进或抑制mRNA降解等。这些功能显示lncRNA可能与肿瘤的发生、发展密切相关，可以作为新的肿瘤标记物及特异性的治疗靶点。
PAX8-AS1是一种反义lncRNA，位于2号染色体q14.1。近年来有研究表明PAX8-AS1在甲状腺癌发挥抑癌基因作用，PAX8-AS1亚型PAX8-AS1-N在乳腺癌中抑制肿瘤的生长，且与骨质疏松症、糖尿病肾病等疾病相关，但PAX8-AS1在胃癌中的作用及机制未有报道。
发明内容
本发明的目的之一旨在提供一种用于胃癌辅助诊断的分子标志物——LncRNAPAX8-AS1；本发明的目的之二旨在提供一种LncRNA PAX8-AS1的检测试剂在制备用于胃癌辅助诊断的产品中的应用；本发明的目的之三旨在提供一种用于胃癌辅助诊断的试剂盒；本发明的目的之四旨在提供一种抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质在制备治疗胃癌的药物中的应用；本发明的目的之五旨在提供一种治疗胃癌的药物。
为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明第一方面提供了一种可用于胃癌辅助诊断的分子标志物，所述分子标志物为LncRNA PAX8-AS1(NCBI基因ID：654433)。
通过实时荧光定量PCR检测LncRNA PAX8-AS1在胃癌组织和癌旁正常组织中表达情况，发现LncRNA PAX8-AS1在胃癌的癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织；说明LncRNA PAX8-AS1在胃癌组织中均有不同程度的表达上调。
通过实时荧光定量PCR检测LncRNA PAX8-AS1在胃癌细胞系SNU-16、MGC-803、MKN-7、MKN-45、MKN-28以及正常胃黏膜上皮细胞株GSE-1中的表达情况，发现LncRNA PAX8-AS1在胃癌细胞系中的表达水平显著高于正常胃黏膜细胞株；说明LncRNA PAX8-AS1在胃癌细胞系中均有不同程度的表达上调。
本发明第二方面提供了LncRNA PAX8-AS1的检测试剂在制备用于胃癌辅助诊断的产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述产品通过实时荧光定量PCR、原位杂交、Northernblotting、芯片或高通量测序平台检测样本中LncRNA PAX8-AS1基因的表达水平。
根据上述的应用，优选地，所述产品中含有扩增LncRNA PAX8-AS1的特异性引物或与LncRNA PAX8-AS1杂交的探针。
根据上述的应用，优选地，通过实时定量PCR检测样本中LncRNA PAX8-AS1基因的表达水平的产品包含一对扩增LncRNA PAX8-AS1的特异性引物。
根据上述的应用，优选地，通过原位杂交检测样本中LncRNA PAX8-AS1的表达水平的产品包含与LncRNA PAX8-AS1核苷酸序列杂交的探针。
根据上述的应用，优选地，通过Northern blotting检测样本中LncRNA PAX8-AS1的表达水平的产品包含与LncRNA PAX8-AS1核苷酸序列杂交的探针。
根据上述的应用，优选地，通过芯片检测样本中LncRNA PAX8-AS1的表达水平包含与LncRNA PAX8-AS1基因核苷酸序列杂交的探针。
根据上述的应用，优选地，扩增LncRNA PAX8-AS1基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(5’-CTCACCATGCCTCCCTCTCCTAC-3’)和SEQ ID NO.2(5’-CCTCTGCCTTCGTGCTGACATTC-3’)。
根据上述的应用，优选地，所述样本为所述样本包括(但不限于)组织、细胞、体液(血液、淋巴液)。更加优选地，所述样本为组织、血液。
根据上述的应用，优选地，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。
本发明第三方面提供了一种用于胃癌诊断的试剂盒，所述试剂盒包括检测样本中LncRNA PAX8-AS1表达水平的试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂包括通过RT-PCR、实时荧光定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片或高通量测序平台检测LncRNA PAX8-AS1表达水平的试剂。
根据上述的试剂盒，优选地，通过实时定量PCR检测LncRNA PAX8-AS1表达水平的试剂包括一对扩增LncRNA PAX8-AS1的特异性引物。
根据上述的试剂盒，优选地，通过原位杂交检测LncRNA PAX8-AS1表达水平的试剂包括与LncRNA PAX8-AS1核苷酸序列杂交的探针。
根据上述的试剂盒，优选地，通过Northern blotting检测LncRNA PAX8-AS1表达水平的试剂包括与LncRNA PAX8-AS1核苷酸序列杂交的探针。
根据上述的试剂盒，优选地，通过芯片检测LncRNA PAX8-AS1表达水平的试剂包括与LncRNA PAX8-AS1核苷酸序列杂交的探针。
根据上述的试剂盒，优选地，扩增LncRNA PAX8-AS1基因的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(5’-CTCACCATGCCTCCCTCTCCTAC-3’)和SEQ ID NO.2(5’-CCTCTGCCTTCGTGCTGACATTC-3’)。
根据上述的试剂盒，优选地，所述样本包括(但不限于)组织、细胞、体液(血液、淋巴液)。更加优选地，所述样本为组织、血液。
本发明中，除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。本发明中，术语“引物”是指能够互补地与模板结合并使逆转录酶或DNA聚合酶能够启动模板复制的具有自由3’羟基的核酸序列。引物是具有与特定基因核酸序列互补的序列的核苷酸。
本发明第四方面提供了一种抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质在制备用于治疗胃癌的产品中的应用。
根据上述的应用，优选地，所述抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质包括特异靶向LncRNA PAX8-AS1的siRNA。
根据上述的应用，优选地，所述特异靶向LncRNA PAX8-AS1基因的siRNA包括siRNA1和siRNA 2，siRNA 1和siRNA 2均由正义链和反义链组成；siRNA 1正义链的序列如SEQ IDNO.3(5’-GGUGAGGACACAUCAUAAA-3’)所示，siRNA1反义链的序列如SEQ ID NO.4(5’-UUUAUGAUGUGUCCUCACC-3’)所示；siRNA2正义链的序列如SEQ ID NO.5(5’-GCACCAUAUUGUGUAUAAU-3’)所示，siRNA 2反义链的序列如SEQ ID NO.6(5’-AUUAUACACAAUAUGGUGC-3’)所示。
本发明第五方面提供了一种抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质在如下任一中的应用：
(a1)制备用于抑制肿瘤生长的产品，或抑制肿瘤生长中的应用；所述肿瘤为胃癌；
(a2)制备用于抑制胃癌细胞增殖的产品，或抑制胃癌细胞增殖；
(a3)制备用于抑制胃癌细胞侵袭的产品，或抑制胃癌细胞侵袭；
(a4)制备用于抑制胃癌细胞迁移的产品，或抑制胃癌细胞迁移。
根据上述的应用，优选地，所述抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质包括特异靶向LncRNA PAX8-AS1的siRNA。
根据上述的应用，优选地，所述特异靶向LncRNA PAX8-AS1基因的siRNA包括siRNA1和siRNA 2，siRNA 1和siRNA 2均由正义链和反义链组成；siRNA 1正义链的序列如SEQ IDNO.3(5’-GGUGAGGACACAUCAUAAA-3’)所示，siRNA1反义链的序列如SEQ ID NO.4(5’-UUUAUGAUGUGUCCUCACC-3’)所示；siRNA 2正义链的序列如SEQ ID NO.5(5’-GCACCAUAUUGUGUAUAAU-3’)所示，siRNA 2反义链的序列如SEQ ID NO.6(5’-AUUAUACACAAUAUGGUGC-3’)所示。
本发明第六方面提供了一种治疗胃癌的药物，所述药物中含有抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质。
根据上述的药物，优选地，所述抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质包括特异靶向LncRNA PAX8-AS1的siRNA。
根据上述的药物，优选地，所述特异靶向LncRNA PAX8-AS1基因的siRNA包括siRNA1和siRNA 2，siRNA 1和siRNA 2均由正义链和反义链组成；siRNA 1正义链的序列如SEQ IDNO.3(5’-GGUGAGGACACAUCAUAAA-3’)所示，siRNA 1反义链的序列如SEQ ID NO.4(5’-UUUAUGAUGUGUCCUCACC-3’)所示；siRNA 2正义链的序列如SEQ ID NO.5(5’-GCACCAUAUUGUGUAUAAU-3’)所示，siRNA 2反义链的序列如SEQ ID NO.6(5’-AUUAUACACAAUAUGGUGC-3’)所示。
根据上述的药物，优选地，所述药物组合物还包括与所述抑制剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。
进一步，所述载体/辅料包括(但并不限于)：稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等；表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等；致湿剂如甘油、淀粉等；吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：
(1)本发明首次发现LncRNA PAX8-AS1在胃癌的癌组织中表达量较癌旁正常组织显著上调，LncRNA PAX8-AS1在胃癌细胞系中的表达水平显著高于正常胃黏膜上皮细胞株，因此，LncRNA PAX8-AS1可以作为胃癌辅助诊断的分子标志物；通过检测样本中LncRNAPAX8-AS1的表达水平，实现胃癌的早期诊断，为临床医生对胃癌的诊断提供参考依据。
(2)本发明还发现LncRNA PAX8-AS1与胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力相关，LncRNA PAX8-AS1能够促进胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，通过沉默LncRNA PAX8-AS1基因对胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭具有明显的抑制作用；因此，通过抑制胃癌患者中LncRNAPAX8-AS1的表达水平，可以达到治疗胃癌的效果。
(3)本发明提供的特异靶向LncRNA PAX8-AS1基因的siRNA序列可以高效的抑制或敲低靶细胞中LncRNA PAX8-AS1的表达，抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，进而抑制胃癌细胞的生长，因此，可以用于治疗胃癌，在胃癌治疗中具有重要的意义。
附图说明
图1为LncRNA PAX8-AS1在胃癌组织中及其癌旁正常胃黏膜组织中的表达水平图；
图2为LncRNA PAX8-AS1在胃黏膜上皮细胞和胃癌细胞系中的表达水平图；
图3为LncRNA PAX8-AS1的沉默效率检测结果图；
图4为CCK8实验检测沉默LncRNA PAX8-AS1后胃癌细胞增殖能力的结果图；
图5为克隆形成实验检测沉默LncRNA PAX8-AS1后胃癌细胞增殖能力的结果图；
图6为LncRNA PAX8-AS1对胃癌细胞系的细胞迁移的影响结果图；
图7为LncRNA PAX8-AS1对胃癌细胞系的细胞侵袭的影响结果图。
具体实施方式
以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、部件和/或它们的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均采用本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例一：LncRNA PAX8-AS1在胃正常粘膜组织及胃癌组织中的表达情况研究
1.样本采集：
共收集19例手术胃癌组织及15例癌旁正常胃粘膜组织，胃癌组织及癌旁正常粘膜组织均由术后病理诊断确诊，为防止RNA降解，在手术切下时立即切取标本，用PBS清洗两次后放入冻存管立即置入液氮，最后转运至-80℃冰箱长期保存。患者均为首诊患者，术前未进行放疗和化疗，手术是首选治疗方案。按照伦理审查委员会规定的制度，每个病人在取样前均签署了知情同意书。
2.实验方法
采用qRT-PCR检测19例手术胃癌组织及15例癌旁正常胃粘膜组织中LncRNA PAX8-AS1的表达水平，具体操作步骤如下：
(1)总RNA抽提：
1)将采集的胃癌的癌组织和其对应的癌旁正常组织样品从液氮中取出，放于冰上，取绿豆粒大小组织由无菌剪刀剪碎，每管按加入1毫升TRIzol，然后加入两粒小钢珠，盖紧盖子，放入多样品组织研磨仪配制的架子后放入研磨仪，旋紧螺丝，调整参数60Hz，1min，使组织充分研碎，若研磨不充分，可放在冰上冷却后再次研磨直至匀浆状态。
2)将研磨好的样品取出后放冰上20min，充分裂解。
3)将TRIzol消化好的组织或细胞样品对称放入4℃离心机，12000rpm，10min，8℃。
4)用RNase喷雾清除剂喷洒桌面，停留5min后纸巾擦干。取出离心机内样品，上清转移至新的标记好的1.5mL EP管，加氯仿(1mL TRIzol浸润的组织需要加入0.2mL的氯仿)，盖紧盖子剧烈震荡15s，静置5min。
5)静置结束后重新将样品入4℃离心机，12000rpm，15min，8℃。
6)离心结束后取出样品，小心将上层水相吸出到新的EP管，遵从宁少勿多原则。
7)加入等量的异丙醇，颠倒混匀15s，置于-20℃冰箱1h以上或者过夜；
8)1h后或次日取出EP管，放入4℃离心机，12000rpm，10min，8℃(提前用无水乙醇和DEPC水配制75％的乙醇，放置冰上预冷)。
9)离心结束后弃上清，每管加入预冷好的75％乙醇1mL，盖紧盖子，轻弹管壁，使白色沉淀脱离管壁，4℃离心机内12000rpm，5min。
10)尽量将EP管内的乙醇吸干净，将管内白色沉淀晾至半透明。
11)加入50-100u1RNase free H2O，溶解，混匀，轻柔吹打使RNA完全溶解。
12)使用NanoDrop 2000检测RNA的浓度和纯度。
(2)逆转录合成cDNA：
1)将抽提好的RNA置于冰上解冻，按浓度计算好不超过1000ng的体积。
2)将镊子在酒精灯上燃烧10s左右，冷却后从饭盒里取出RNase free的0.2毫升的PCR管。
3)取出HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)中的4×gDNA wiperMix、5×HiScript III qRT SuperMix，短暂离心，置于冰上。
4)按表1中组份配制去除基因组DNA的反应液，在冰上进行，配制好后用移液器轻轻吹打混匀。上机反应条件：42℃2min。
表1去除基因组DNA的反应液体系
试剂 使用量
4×gDNA wiper Mix 4μl
Total RNA 100ng-1μg
RNase Free dH2O up to 20μl
5)反应结束后，按下表2中组份配制RT反应液，在冰上进行：
表2反转录反应体系
试剂 使用量
步骤4)的反应液 16μl
5×HiScript III qRT SuperMix 4μl
Total 20μl
6)配置好的混合液用移液器轻轻吹打混匀，打开PCR仪，将样品逐个放进仪器中，按下列循环设置好程序，开始反转录反应，反转录反应程序为：37℃15min(反转录反应)，85℃5sec(反转录酶的失活反应)。反应结束后及时取出RT反应液即cDNA，1:10稀释用于qPCR反应(RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系时，其加入量不要超过Real TimePCR反应体积的1/10(V/V)量)。上述逆转录反应kit由诺唯赞公司提供。
(3)荧光定量检测：
以ACTIN为内参，通过Real Time PCR反应检测胃癌患者癌组织和胃粘膜正常组织中LncRNA PAX8-AS1的相对表达量，测定二者之间的表达差异。
LncRNA PAX8-AS1的特异性扩增引物的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CTCACCATGCCTCCCTCTCCTAC-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-CCTCTGCCTTCGTGCTGACATTC-3’(SEQ ID NO.2)。
ACTIN的特异性扩增引物的核苷酸序列如下：
上游引物：5’-CACCATTGGCAATGAGCGGTTC-3’；
下游引物：5’-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3’。
LncRNA PAX8-AS1、ACTIN的特异性扩增引物均由生工生物工程(上海)公司设计合成。
按表3的比例配置Real-time PCR反应体系(20uL体系)。
表3 Real-time PCR反应体系
名称 体积
FastStart Universal SYBR Green Master(Rox) 25μl
上游引物(10μM) 1.5μl
下游引物(10μM) 1.5μl
cDNA 5μl
ddH2O 至50μl
两步法进行Real-Time PCR，并制作熔解曲线，程序设定如表4。
表4两步法Real-Time PCR反应体系程序设定
Figure BDA0003442536780000091
根据RealTimePCR原始检测结果，按照2^-ΔΔCт法计算LncRNA PAX8-AS1的相对表达水平，即癌组织样品相对于癌旁正常组织对照样品，目的基因LncRNA PAX8-AS1转录水平的差异。
3.数据处理及分析：
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差(mean±SD)的方式来表示，采用SPSS22.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异符合正态分布采用t检验，不符合正态分布采取秩和检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4.实验结果
Real-Time PCR检测了19例胃癌组织和15例癌旁正常组织中LncRNA PAX8-AS1的表达水平，其检测结果如图1所示。由图1可知，胃癌癌组织中LNCRNA PAX8-AS1的表达水平显著高于癌旁正常组织中的表达水平，差异具有显著统计学意义(P<0.05)。由此说明，LncRNA PAX8-AS1表达水平与胃癌的发生相关，并且能够作为胃癌的分子标志物，用于胃癌的临床辅助诊断。
实施例二：LNCRNA PAX8-AS1在胃癌细胞和正常胃细胞株中的表达情况研究
1.细胞选取及培养：
培养人类正常胃黏膜上皮细胞株GSE-1，胃癌细胞系SNU-16、MGC-803、MKN-7、MKN-45、MKN-28；细胞常规培养于含10％的FBS、1％的青霉素和链霉素的1640细胞培养基中，其中GSE-1用高糖DMEM培养基而非1640培养基，在37℃、5％CO2以及饱和湿度的条件下培养。细胞每2天换液，按1：3传代。
2.实验方法：
采用qRT-PCR检测胃癌细胞和正常胃细胞株中LNCRNA PAX8-AS1的表达水平，具体操作步骤如下：
(1)细胞RNA提取：
采用TRIzo1法提取细胞总RNA。
收集6cm培养皿内对数期生长的细胞，冷PBS洗涤两次后加入1mL TRIzo1；冰上裂解10min，剩余步骤同实施例一，在此不再赘述。
(2)逆转录合成cDNA：
逆转录合成cDNA的具体操作步骤与实施例一相同，在此不再赘述。
(3)荧光定量检测：
荧光定量检测的具体操作步骤与实施例一相同，在此不再赘述。
3.数据处理分析
所有数据采用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用双侧Students't检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用GraphPad Prism 9Software软件进行分析绘图，以P<0.05为检验水准，当P<0.05时认为具有显著统计学意义。
4.实验结果
qRT-PCR检测胃癌细胞和正常胃粘膜上皮细胞株中LncRNA PAX8-AS1基因的表达水平，其检测结果如图2所示。由图2可知，与胃黏膜正常细胞GSE-1细胞相比，LncRNA PAX8-AS1基因在胃癌细胞株SNU-16、MGC-803、MKN-7、MKN-45、MKN-28表达显著升高，说明LncRNAPAX8-AS1基因在胃癌细胞中表达水平显著上调。
其中，以MKN-45、MKN-7、MKN-28细胞中LncRNA PAX8-AS1基因的表达水平较高，结合细胞培养特点，选择MKN-28细胞系作为工具细胞用于后续的实验研究。
实施例三：LNCRNA PAX8-AS1基因的沉默
1.细胞培养：
人胃癌细胞系MKN-28，以含10％胎牛血清和1％的青霉素和链霉素的1640细胞培养基在37℃、5％CO2、相对湿度为90％的培养箱中培养。细胞每2天换液1次，采用以typsin-EDTA(赛默飞公式提供)进行消化传代。
2.siRNA设计
针对LncRNA PAX8-AS1基因的siRNA序列：
阴性对照siRNA(记作siRNA-NC)序列：siRNA-NC序列由上海吉玛制药
技术有限公司提供：
siRNA-NC的正义链为：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3；
siRNA-NC的反义链为：5'-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3'。
siRNA 1：
siRNA 1的正义链为：5’-GGUGAGGACACAUCAUAAA-3’(SEQ ID NO.3)；
siRNA 1的反义链为：5’-UUUAUGAUGUGUCCUCACC-3’(SEQ ID NO.4)。
siRNA 2：
siRNA 2的正义链为：5’-GCACCAUAUUGUGUAUAAU-3’(SEQ ID NO.5)；
siRNA 2的反义链为：5’-AUUAUACACAAUAUGGUGC-3’(SEQ ID NO.6)。
3.细胞转染：
根据转染试剂Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)说明书转染细胞。具体步骤如下：
(1)将细胞按1.0×105/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％CO2培养箱中细胞培养24h，使细胞融合度达到30-40％，转染前更换新鲜培养基1.8mL。
(2)转染：提前将Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)从4℃冰箱取出，将siRNA1、siRNA2、siRNA-NC从-20℃冰箱取出，放在冰上溶解，提前准备好EP管，并做好标记，每个EP管中分别加入125ul Opti-MEM培养基。
1)、siRNA组：
a、将5ul siRNA加入含有125ul Opti-MEM培养基的EP管中(①号管)；
b、将5ul Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)加入含有125ul Opti-MEM培养基的EP管中(②号管)；
c、将①号管中的液体用移液枪全部吸出，加入到②号管中，室温孵育5min；
d、然后用移液枪将②号管中的液体全部吸出，均匀滴入六孔板中，摇晃混匀，将六孔板放回37℃细胞培养箱继续培养。
2)、阴性对照组(siRNA-NC组)：
a、将5ul siRNA-NC加入含有125ul Opti-MEM培养基的EP管中(③号管)；
b、将5ul Lipofectamine 3000Reagent(invitrogen)加入含有125ul Opti-MEM培养基的EP管中(④号管)；
c、将③号管中的液体用移液枪全部吸出，加入到④号管中，室温孵育5min；
d、然后用移液枪将④号管中的液体全部吸出，均匀滴入六孔板中，轻轻混匀，将六孔板放回37℃细胞培养箱继续培养。
4.qRT-PCR检测LNCRNA PAX8-AS1的表达水平：
(1)细胞RNA提取：
细胞RNA提取的具体操作与实施例二相同，在此不再赘述。
(2)逆转录合成cDNA：
逆转录合成cDNA的具体操作步骤与实施例一相同，在此不再赘述。
(3)荧光定量检测：
荧光定量检测的具体操作步骤与实施例一相同，在此不再赘述。
5.实验结果：
实验结果如图3所示。由图3可知，与阴性对照组相比，转染siRNA的实验组的LncRNA PAX8-AS1的表达水平显著下调，siRNA 1、siRNA 2的干扰效果好。
实施例四：LncRNA PAX8-AS1基因对胃癌细胞的细胞增殖、迁移和侵袭的影响
1、CCK8检测细胞增殖实验
(1)细胞培养：
细胞培养的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。
(2)细胞转染：
细胞转染的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。
(3)CCK8检测细胞增殖
1)、实验分为3组，分别为阴性对照组(siRNA-NC组)、siRNA 1组、siRNA 2组，每组均设4个复孔。
2)、转染后的MKN-28细胞培养72h，分别用0.25％胰酶对各组细胞消化后进行细胞计数，将细胞接种于96孔板中，接种前浓度调整为5×104/m1，每孔加100u1。
3)、8小时后弃掉每组4个孔的旧培养基，避光条件下，96孔板中每孔加入含有20u1CCK8试剂新鲜培养基，轻轻晃动培养板，然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定OD值。并以此时间点同样的方法分别检测24h、48h及72h的细胞的吸光度值。
(4)实验结果
CCK8检测细胞增殖的实验结果如图4所示。由图4可知，与阴性对照组(siRNA-NC组)相比，转染siRNA 1和siRNA 2的实验组细胞增殖受到明显的抑制(P<0.05)。由此说明，敲低LncRNA PAX8-AS1对MKN-28细胞增殖能力有明显的抑制作用。
2、克隆形成实验检测细胞增殖能力
(1)细胞培养：
细胞培养的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。
(2)细胞转染：
细胞转染的具体操作与实施例三相同，在此不再赘述。
(3)克隆形成实验步骤
1)、实验分为3组，分别为阴性对照组(siRNA-NC组)、siRNA 1组、siRNA 2组，每组均设3个复孔。
2)、转染后的细胞继续培养48h后分别用0.25％胰酶消化进行细胞计数，根据计数数值将细胞浓度调整为1×106/m1，梯度稀释，获得1×104/m1，取新的六孔板，每孔加入2毫升新鲜培养基，分别取每组稀释好的浓度为1×104/m1细胞100u1加入六孔板中，轻柔晃动板子至均匀状态，并放置细胞培养箱继续培养。
3)、每3天更换新鲜培养基，镜下观察克隆大小，14天后终止。
4)、终止培养的六孔板每孔用PBS轻柔洗3遍，4％多聚甲醛固定30min以上，结晶紫染色10分钟，镜下观察，弃掉结晶紫，纯净水清洗至未着色区域为无色，晾干拍照。
(4)实验结果
CCK8检测细胞增殖的实验结果如图5所示。由图5可知，与阴性对照组(siRNA-NC组)相比，转染siRNA 1和siRNA 2的实验组细胞增殖受到明显的抑制(P<0.05)。由此说明，敲低LNCRNA PAX8-AS1对MKN-28细胞增殖能力有明显的抑制作用。
3、Transwell小室迁移和侵袭实验
通过检测目的细胞在Transwell小室中向含血清培养基的迁移情况来验证目的基因对细胞迁移能力的影响。
(1)实验方法：
1)、无菌条件下Matrigel冰浴融化后用无血清1640培养基按1：7比例稀释Matrige1胶(迁移实验无需铺胶，侵袭实验需铺胶)，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后将再有Transwell孔的24孔板平移入37℃的细胞培养箱中温育或室温放至水平处至其凝固成胶状。
2)、实验分为3组，分别为阴性对照(siRNA-NC组)、siRNA 1组、siRNA 2组，每组均设3个复孔，上室加入细胞数量为5×104个细胞不含血清的细胞悬液(迁移实验)、1×105个细胞不含血清的细胞悬液(侵袭实验)，下室加入700u1含10％胎牛血清培养基，37℃下恒温培养箱内培养24-48h(根据不同细胞种类调整时间，MKN-7需28小时)。
3)、取出Transwell小室，PBS清洗3遍，使用4％多聚甲醛固定30min，加入结晶紫染色8-12min后显微镜下观察着色强度，弃掉结晶紫溶液，用纯净水清洗，放入荧光显微镜下观察，晾干后拍照并计数。
(2)数据处理及分析：
所有数据采用均数士标准差表示。两组间比较采用双侧Students't检验。所有结果均采用GraphPad Prism 9Software软件进行绘图，以P<0.05为检验水准，当P<0.05为差异有统计学意义。
(3)实验结果：
Transwell小室细胞迁移实验的检测结果如图6所示。由图6可知，与阴性对照组(siRNA-NC组)相比，转染siRNA 1、siRNA 2的实验组细胞迁移能力明显降低(P<0.05)。由此说明，敲低LncRNA PAX8-AS1对MKN-28细胞迁移能力有明显的抑制作用。
Transwell小室细胞侵袭实验的检测结果如图7所示。由图7中可知，与阴性对照组(siRNA-NC组)相比，转染siRNA 1、siRNA 2的实验组细胞侵袭能力明显降低(P<0.05)。由此说明，敲低LNCRNA PAX8-AS1对MKN-28细胞侵袭能力有明显的抑制作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，但不仅限于上述实例，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 河南省人民医院
<120> 一种用于胃癌辅助诊断的标志物及试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctcaccatgc ctccctctcc tac 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctctgcctt cgtgctgaca ttc 23
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggugaggaca caucauaaa 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uuuaugaugu guccucacc 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaccauauu guguauaau 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
auuauacaca auauggugc 19

Claims (9)

1.LncRNA PAX8-AS1表达水平的检测试剂在制备用于组织样本胃癌辅助诊断的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过实时定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片或高通量测序平台检测样本中LncRNA PAX8-AS1的表达水平。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品中含有扩增LncRNA PAX8-AS1的特异性引物或与LncRNA PAX8-AS1杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，扩增LncRNA PAX8-AS1的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。
6.抑制LncRNA PAX8-AS1表达的物质在制备用于治疗胃癌的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制LncRNA PAX8-AS1表达的物质为特异靶向LncRNA PAX8-AS1的siRNA。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述特异靶向LncRNA PAX8-AS1基因的siRNA包括siRNA 1和siRNA 2，siRNA 1和siRNA 2均由正义链和反义链组成；siRNA 1正义链的序列如SEQ ID NO.3所示，siRNA 1反义链的序列如SEQ ID NO.4所示；siRNA 2正义链的序列如SEQ ID NO.5所示，siRNA 2反义链的序列如SEQ ID NO.6所示。
9.一种治疗胃癌的药物，其特征在于，所述药物中含有抑制LncRNA PAX8-AS1表达和/或功能的物质；所述抑制LncRNA PAX8-AS1表达的物质为特异靶向LncRNA PAX8-AS1的siRNA。
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