CN111893188B - 生物标志物linc01356在宫颈癌诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生物标志物LINC01356在宫颈癌诊断和治疗中的应用，本发明通过高通量测序，首次发现了LINC01356在宫颈癌患者癌组织中的表达显著下调，进一步对所述基因进行了QPCR验证和ROC分析，结果提示LINC01356可作为生物标志物用于宫颈癌的诊断，通过上调LINC01356的表达水平可以抑制宫颈癌细胞的增殖和降低癌细胞的迁移率，提示LINC01356可应用于宫颈癌的治疗。

Description

生物标志物LINC01356在宫颈癌诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与宫颈癌相关的LncRNA生物标志物，具体地，所述LncRNA生物标志物为LINC01356。

背景技术

宫颈癌(Cervical cancer)是妇女常见的癌症相关死因之一，主要原因是由于初筛延迟、缺乏早期诊断、细胞学筛查不广泛，且主要发生在发展中国家。我国作为最大的发展中国家，每年大约58,000例宫颈癌被诊断，其中有约20,000例患者死亡(Yuan W,XiaoyunH,Haifeng Q,et al.Micro RNA-218enhances the radiosensitivity of humancervical cancer via promoting radiation induced apoptosis[J].Int J MedSci.2014,11(7):691–696.)。宫颈癌的发病缓慢且复杂，从正常的宫颈上皮发展到癌前病变(CIN)，再发展为侵袭性宫颈癌，其中有约20％的CIN2级发展为CIN3级，10％-40％的CIN3级最终发展为宫颈癌。宫颈癌患者的肿瘤分期与其总生存率关系紧密，相关的研究报道显示分期越高的宫颈癌患者其总生存率就越低。从临床角度分析，如果宫颈癌能被早期诊断，临床治疗效果更佳，甚至可以被治愈。

巴氏涂片是临床上一种对宫颈病变进行细胞学筛查的方法，常规巴氏涂片筛查的特异性为98％，但敏感性仅为51％，且对腺癌的检出率较低(Wright TC Jr,Schiffman M,Solomon D,et al.Interim guidance for the use of human papillomavirus DNAtesting as an adjunct to cervical cytology for screening[J].ObstetGynecol.2004,103(2):304–309.)。阴道镜也常用来进一步检查可疑的宫颈癌，但为侵入性手段，比较难普及。鳞状细胞癌(SCC)抗原和碳水化合物抗原125(CA125)是临床上两种常用的检测和监测宫颈癌的血清肿瘤生物标志物，然而，两者均不是宫颈癌的特异性诊断标记物。此外，这两种标志物在宫颈癌诊断中的敏感性(分别为26％和23％)较差(Avall-Lundqvist EH,

K,Nilsson BR,et al.Prognostic significance of pretreatmentserum levels of squamous cell carcinoma antigen and CA125in cervicalcarcinoma[J].Eur J Cancer.1992,28A(10):1695–1702.)，很容易导致漏诊。病理活组织检查是诊断宫颈癌的金标准，但标本的获取为侵入性操作，很难成为早期广泛筛查宫颈癌的方法。而血液标本的采集相对简便、经济且易获取。因此，为了早期诊断宫颈癌，迫切需要诊断宫颈癌高特异性和敏感性的无创生物标志物。

随着高通量转录组测序技术的发展，研究者们发现人类基因组中超过90％的转录组为非编码RNA，其中的microRNAs(miRNAs)已被认为参与多个生物过程，包括癌症的发生和发展过程。随着与宫颈癌相关的miRNA不断发现，研究者们开始把目光集中在另一种非编码RNA，即长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNAs)。LncRNAs长度超过200个核苷酸单位，没有或仅有有限的蛋白编码能力。依据所在细胞内的位置不同，LncRNAs具有调节染色质及基因调节的功能。LncRNAs不仅能在细胞系和组织中稳定表达，而且在各种体液中性质相对稳定，尤其是循环中的LncRNAs，可抵抗冷冻、解冻或酶降解等因素，因此，研究宫颈癌相关的新型LncRNAs的功能及其发生发展机制为寻找早期发现宫颈癌高特异性且敏感的非侵入性生物标志物提供了科学依据，并为发展新的更有效的治疗提供了可能性。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与宫颈癌相关的生物标志物，通过检测生物标志物的表达水平可以实现宫颈癌的早期诊断，同时，所述生物标志物还可以应用于临床上宫颈癌的治疗。

为了实现上述目的，本发明通过高通量测序技术检测LncRNA在宫颈癌组织和癌旁组织中的表达情况，发现其中具有明显表达差异的LncRNA，从而为宫颈癌的早期诊断和治疗提供了新的策略。

本发明的第一个方面提供了一种宫颈癌的生物标志物。

进一步，所述生物标志物为LINC01356。

本发明的第二个方面提供了本发明的第一个方面所述的生物标志物在制备诊断宫颈癌的产品中的应用。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测LINC01356表达水平的试剂。

本发明的第三个方面提供了一种诊断宫颈癌的产品。

进一步，所述产品包括试剂盒或芯片，其中，所述试剂盒或芯片包括检测LINC01356表达水平的试剂。

进一步，所述试剂选自：

特异性识别LINC01356的探针；或

特异性扩增LINC01356的引物。

进一步，所述特异性扩增LINC01356的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第四个方面提供了LINC01356在制备治疗宫颈癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括促进LINC01356表达的试剂、与促进LINC01356表达的试剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

本发明的第五个方面提供了一种药物组合物。

进一步，所述药物组合物包括促进LINC01356表达的试剂，和/或药学上可接受的载体和/或辅料。所述促进LINC01356表达的试剂包括提高LINC01356基因稳定性、上调LINC01356基因表达水平、增加LINC01356基因有效作用时间的物质；所述药物组合物还可以包括稳定剂、杀菌剂、缓冲剂、等渗剂、螯合剂、PH控制剂及表面活性剂等添加剂。

进一步，所述的促进LINC01356表达的试剂为含有LINC01356的载体。

进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料，包括(但不限于)稀释剂、粘合剂、表面活性剂、致湿剂、吸附载体、润滑剂、填充剂、崩解剂。

本发明的第六个方面提供了LINC01356在筛选治疗宫颈癌的候选药物中的应用。

本发明提供了一种筛选用于治疗或预防宫颈癌或抑制宫颈癌细胞生长的候选物质的方法，所述方法包括：

用候选物质处理表达或含有LINC01356基因的体系；和

检测所述体系中LINC01356基因的表达水平。

所述候选物质包括(但不限于)：针对LINC01356基因或其上游或下游基因设计的促进LINC01356表达的试剂、结合分子、小分子化合物等。

所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

其中，若所述候选物质可上调LINC01356基因的表达水平(优选显著上调，如上调20％以上，较佳的上调50％以上，更佳的上调80％以上)，则表明该候选物质是治疗或预防宫颈癌的潜在物质。

在本发明中，所述方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验和/或动物实验，以从候选物质中进一步选择和确定对于治疗、预防或缓解宫颈癌有效的物质。

本发明的LncRNA使用本领域技术人员已知的多种核酸技术进行检测，包括但不限于测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

除非另有定义，本发明上下文中的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。此外，对部分术语解释如下。

本文中使用的术语“标志物”指代具有特异性生物学特性、生物化学特征或者方面的分子指示物，其可用于确定存在或不存在特定疾病或状况和/或特定疾病或状况的严重程度。其和“生物标志物”、“基因标志物”可以通用。

本文中使用的术语“引物”是指能够形成与模板链互补的碱基对(basepair)，并且起到用于复制模板链的起始点作用的7～50个核酸序列。引物通常合成而得，但也可以使用自然生成的核酸。引物的序列并不一定需要与模板的序列完全相同，只要充分互补而能够与模板杂交即可。可以混入不改变引物的基本性质的追加特征。作为可以混入的追加特征的例子，有甲基化、带帽、一个以上的核酸被同系物取代和核酸间的修饰，但不限于此。

本文中使用的术语“探针”指短至几个到长达数百碱基的核酸片段如RNA或DNA，所述核酸片段可以与mRNA建立特异性结合并且可以因Labeling作用而确定特定mRNA的存在。探针可以按寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针和RNA探针等形式制备。在本发明中，可以通过使用本发明的标记多核苷酸及互补探针实施杂交，借助是否杂交来预测宫颈癌。可以基于本领域已知内容修改对探针和杂交条件的恰当选择。

本文中使用的术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。

本文中使用的术语“差异表达”或“表达差异”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定mRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。

本文中使用的术语“表达差异增加”或“上调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

本文中使用的术语“表达差异降低”或“下调”表示基因相对于对照而言，基因表达(以RNA表达或蛋白质表达测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少的基因。

在本发明的具体实施例中，所有实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS统计软件来进行统计分析的，两组间比较采用配对T检验，三组及以上采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LINC01356基因在宫颈癌患者中差异表达，通过检测LINC01356的表达水平，可以判断受试者是否患有宫颈癌。为宫颈癌的早期诊断提供了分子手段，为寻找早期发现宫颈癌高特异性且敏感的非侵入性生物标志物提供了科学依据。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示的是利用QPCR检测LINC01356基因在宫颈癌组织中的表达情况图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1筛选与宫颈癌相关的基因标志物

1、样本收集

收集30例医院妇产科提供的宫颈鳞癌组织样本及与之相对应的癌旁组织样本，从中随机选取5例进行高通量测序与分析，所有样本来源于经子宫切除术(锥切或全切)术后病理诊断为宫颈鳞癌的患者，其中癌旁正常组织作为对照组。所有病例术前均未做任何免疫抑制剂治疗、放疗以及化疗，排除其他肿瘤性疾病、自身免疫性疾病和严重慢性疾病，所有患者均已知情同意，并通过组织伦理委员会的同意。

2、组织RNA提取

取-80℃冻存的癌组织和周边癌旁组织约50mg，放入液氮中进行研磨，至无大颗粒组织时转移至1.5mL EP管中，加入1mL Trizol用于总RNA提取和实时定量PCR分析，具体流程如下：

1)在上述含有1mL Trizol的组织悬液中加入200μL氯仿，手动充分震荡混匀后室温下静置10min；

2)12000rpm，4℃的条件下，离心20min；

3)待离心完毕后，轻柔吸取EP管上层水相至新的1.5mL EP管中，加入400μL异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温下放置20min(或-20℃放置2h，可增加RNA的析出)；

4)12000rpm，4℃的条件下，离心20min；

5)弃去上清，向EP管中加入1mL预冷的75％的无水乙醇，12000rpm，4℃的条件下，离心10min，上述步骤重复2次；

6)弃去上清，用枪头吸取残存的液体，室温下晾置5min；

7)取20μL RNAase-free水溶解沉淀，定量后使用或冻存-80℃冰箱待用。

3、总RNA的定量与纯度分析

将提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Nanodrop2000对所提取的RNA的浓度和纯度进行测定，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，Agilent 2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg，浓度≥200ng/μL，OD值A260/A280在1.8～2.0之间，测定后-80℃储存。

4、构建cDNA文库

使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA；对完整的RNA序列，利用金属离子进行随机打断，将RNA随机断裂成200bp左右的小片段；采用IlluminaTruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建。

5、测序

使用Illumina X-Ten测序平台，进行2*150bp测序。

6、高通量转录组测序数据分析

删除不易检测到的LncRNA，使用R-3.3.3工具中的DESeq2对reads数进行差异表达分析，差异表达LncRNA筛选标准：FDR<0.05，abs(log2FC)>2。

7、结果

结果显示，与癌旁组织相比，LINC01356在宫颈鳞癌组织中的表达水平显著下调。

实施例2QPCR验证LINC01356基因的差异表达

1、组织收集：利用实施例1中收集的30例宫颈鳞癌的组织样本及其对应的癌旁组织样本，对LINC01356进行大样本差异表达基因的验证。

2、组织RNA的提取：步骤同实施例1。

3、QPCR实验

1)逆转录反应

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行LncRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μL，总RNA1μg，加RNase Free ddH₂O使总体积至10μL，水浴锅中42℃加热3min。

将10×Fast RT Bμffer 2.0μL，RT Enzyme Mix 1.0μL，FQ-RT Primer Mix 2.0μL，RNase Free ddH₂O 5.0μL，混合后加入上述试管中一起混合共20μL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

2)引物的设计与制备

根据Genebank中LINC01356基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，在进行LINC01356的引物设计时，选择不同转录产物序列的共同序列进行设计，具体引物序列如下：

LINC01356基因：

正向引物为5’-TGCCTAACAGAGAACAAT-3’(SEQ ID NO.1)；

反向引物为5’-GAGTCAGTGAATGGAGAT-3’(SEQ ID NO.2)。

GAPDH基因：

正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

3)实时定量PCR反应

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增。

采用20μL反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10μL，正反向引物(10μM)各0.6μL，5×ROX Reference Dye^△2μL，DNA模板2μL，灭菌蒸馏水4.8μL。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证实验结果的可靠性。

扩增程序为：95℃15min，(95℃10s，50℃30s，72℃32s)×45个循环。

4、统计学分析

采用统计学软件SPSS20.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用配对T检验，三组及以上采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。所有实验重复三次，以P<0.05为差异具有统计学意义。

5、结果

QPCR结果如图1所示，相比癌旁组织，宫颈癌组织中LINC01356的表达量显著下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，提示LINC01356可作为分子标志物用于宫颈癌的诊断和治疗。

ROC曲线分析表明LINC01356可以作为分子标志物应用于宫颈癌的诊断，其曲线下面积为0.981，说明LINC01356的表达对宫颈癌的诊断具有高敏感性和高特异性。

实施例3LINC01356的过表达与宫颈癌细胞增殖、迁移的关系研究

1、细胞培养

将液氮中保存的人宫颈癌SiHa细胞取出后进行复苏接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃、95％湿度及含5％CO₂的培养箱中传代培养，取对数生长期的细胞用于实验。转染前1d将细胞按2×10⁵/孔接种于6孔细胞培养板中，当细胞融合度达60％～70％时可进行转染。

2、基因过表达载体的构建

根据LINC01356的cDNA序列合成特异的PCR扩增引物，在5’端引物和3’端引物分别添加HindIII和XhoI两个限制性酶切位点。以宫颈癌患者组织提取和反转录得到的cDNA作为扩增模板，上述cDNA序列经限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切后插入到经HindIII和XhoI双酶切的真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-1用于后续实验。

3、细胞转染

按照Lipofectamine3000脂质体说明书的指示转染细胞。将实验设3个组：空白对照组(SiHa细胞)，阴性对照组(转染pcDNA3.1-NC)和实验组(转染pcDNA3.1-1)。

4、QPCR检测细胞中LINC01356的表达水平

使用Trizol法提取细胞总RNA，按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。

5、细胞增殖实验

CCK-8细胞增殖实验检测LncRNA表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。

将转染pcDNA3.1-1的宫颈癌细胞作为实验组，转染pcDNA3.1-NC的细胞作为对照组，加入到96孔板中，每孔加入的细胞数量为1000个，每组设置5个复孔，培养72h时，细胞孔中加入10μL的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据，根据检测的OD值，检测细胞的增殖情况。

6、细胞迁移实验

划痕实验检测LncRNA表达对宫颈癌SiHa细胞迁移能力的影响。

将转染后对数生长状态良好的细胞，用1×PBS冲洗3遍，去掉死细胞，胰酶消化，制备单细胞悬液，对细胞悬液进行稀释，调整密度为5×10⁵个/mL，用记号笔在培养皿背面画一条横线作为标志，向每个培养皿中加入1mL细胞悬液，摇匀，放入培养箱中培养，当细胞覆盖面积为95％时，进行下一步操作，用100μL移液器枪头在单层细胞中间划“一”字形划痕，然后用PBS液冲洗细胞3遍，加入DMEM培养基后放入培养箱内培养。24h后取出培养皿，去掉培养基，用PBS液清洗培养皿3遍，观察细胞情况，测量伤痕距离并记录。

7、统计学分析

采用统计学软件SPSS20.0进行统计分析，计量资料以均数±标准差(mean±SD)表示。两组间比较采用配对T检验，三组及以上采用单因素方差分析，多重比较采用LSD-t检验。所有实验重复三次，以P<0.05为差异具有统计学意义。

8、结果

转染结果显示，以空白对照组LINC01356的表达水平作为参比设为1，相比空白对照组的LINC01356的表达量(相对表达量为1)与转染pcDNA3.1-NC阴性对照组的LINC01356的表达量(相对表达量为1.020±0.045)，转染pcDNA3.1-1实验组的LINC01356的表达量(相对表达量为3.625±0.033)显著上调，差异具有统计学意义(实验组vs空白对照组，P<0.05；实验组vs siRNA-NC组，P<0.05)，而siRNA-NC组和空白对照组之间没有显著的差异(P>0.05)。

CCK-8细胞增殖活性结果显示，转染pcDNA3.1-1的实验组的OD450(0.857±0.036)明显低于转染pcDNA3.1-NC的对照组(1.430±0.039)，且差异具有统计学意义(P<0.05)，说明LINC01356能影响宫颈癌细胞的增殖活性，改变LINC01356的表达水平可改变宫颈癌细胞的增殖能力，过表达LINC01356可以抑制宫颈癌细胞的增殖。

划痕实验的结果表明，与空白对照组(愈合率％：74.24±5.24)及转染pcDNA3.1-NC阴性对照组(愈合率％：72.61±3.59)相比，转染pcDNA3.1-1实验组(愈合率％：25.50±2.17)上调LINC01356在宫颈癌细胞内的表达水平后，宫颈癌的细胞迁移能力显著下降(P<0.05)，而空白对照组和阴性对照组的细胞迁移率差异无统计学意义(P<0.05)，提示LINC01356的过表达可以显著抑制宫颈癌细胞的迁移能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 河北医科大学第二医院

<120> 生物标志物LINC01356在宫颈癌诊断和治疗中的应用

<141> 2020-08-20

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tgcctaacag agaacaat 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gagtcagtga atggagat 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

Claims (5)

1.检测LINC01356表达水平的试剂在制备诊断宫颈癌的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测LINC01356表达水平的试剂。

3.促进LINC01356表达的试剂在制备治疗宫颈癌的药物组合物中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

5.检测LINC01356表达水平的试剂在筛选治疗宫颈癌的候选药物中的应用。

Images