CN111500738B - 生物标志物在癌症诊断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物标志物在癌症诊断中的应用，本发明公开了CTD‑2540F13.2作为生物标志物的用途，尤其涉及一种制备诊断胃腺癌的产品的用途，其通过在体外测量样本中CTD‑2540F13.2来进行。本发明还公开了CTD‑2540F13.2作为生物标志物的另一种用途，尤其涉及一种制备治疗胃腺癌的药物组合物的用途。

Description

生物标志物在癌症诊断中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及生物标志物在癌症诊断中的应用，具体的涉及CTD-2540F13.2在胃癌诊断中的应用。

背景技术

胃癌是常见恶性肿瘤之一，在全球范围内，胃癌发病率和死亡率分别位居第四位和第二位(Tome LA,Bray F,Siegel RL,Ferlay J,Lortet-Tieulent J and JemalA.Global cancer statistics,2012.CA Cancer J Clin 2015；65:87-108)。在我国，胃癌发病率占恶性肿瘤的第二位，死亡率占恶性肿瘤的14.33％，位居第三位。胃癌早期症状不典型，许多病人一经发现即为晚期，失去手术机会，并且将近一半的病人术后出现复发，缺乏有效的治疗手段(Pasechnikov V,Chukov S,Fedorov E,Kikuste I and LejaM.Gastric cancer:prevention,screening and early diagnosis.World JGastroenterol 2014；20:13842-13862.)。尽管采用多学科综合治疗手段和靶向药物等新药研究取得了一定的进展，但胃癌的早期发现、早期诊断率及手术根治率较低，导致胃癌5年存活率仍很低(Orditura M,Galizia G,Sfo rza V et a1.Treatment of gastriccancer.World J Gastroenterol 2014；20:1635-1649.)。因此，胃癌的诊治仍面临着很大的挑战，进一步理解胃癌的发生发展的分子机制，寻找新的生物标志物和治疗靶点迫在眉睫。

随着基因测序技术如高通量测序或全基因组高密度芯片的发展，研究者发现，蛋白质编码基因只占人类基因组的不到2％，其余98％为不具有蛋白编码功能的RNA，被称为非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)，最初这些ncRNA被认为是转录“噪声”、“垃圾”，但最近的研究表明，这些“垃圾”可能在细胞的发育、代谢及肿瘤等多种疾病的发生、发展方面发挥着重要的生物学作用(Wang J,Sun J,Wang J,Song Y,Gao P,Shi J,Chen P,Wang Z.Longnoncoding RNAs in gastric cancer:functions and clinical applications.OncoTargets Ther 2016；9:681-697.)。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，与miRNAs相比，LncRNA是mRNA类转录体，长度在200nt-100kb之间，缺乏明显的开放性阅读框架，外显子少，表达水平比蛋白质编码基因低，但是，78％的LncRNA呈现出组织特异性表达方式，一些LncRNA只在特定的组织中优先表达，这是LncRNA的一个重要特征。根据LncRNA在基因组中的位置及特征，可以将其分为5个亚类：正义LncRNA(sense LncRNA)、反义LncRNA(antisense LncRNA)、双向LncRNA(bidirectionalLncRNA)、内含子LncRNA(intronic LncRNA)、基因间LncRNA(intergenic LncRNA)。LncRNA在胃癌中的研究较少，研究与胃腺癌发生发展相关的lncRNA，对于进一步解释胃腺癌的发病机理，实现胃腺癌的更精细的基因分型、以及达成胃腺癌患者的个性化精准治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种与胃癌相关的基因，为胃癌的早期诊断提供了一种产品和手段，相比传统的胃癌的诊断方法，使用标志物来诊断胃腺癌具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种CTD-2540F13.2的用途，用于制备诊断胃腺癌的产品。

进一步，所述产品通过测定样本中CTD-2540F13.2的表达水平与参考水平相比上调而确定。

进一步，所述产品通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测CTD-2540F13.2基因的表达水平。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。

本发明提供了一种体外检测样本中CTD-2540F13.2表达水平的产品，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针。所述试剂盒包括基因芯片或聚合酶链式反应体系。

进一步，所述体外检测样本中CTD-2540F13.2表达水平的产品包括：

特异性识别CTD-2540F13.2的探针；或

特异性扩增CTD-2540F13.2的引物。

进一步，所述特异性扩增CTD-2540F13.2的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

本发明提供了体外检测样本中CTD-2540F13.2表达水平的产品在制备诊断胃腺癌工具中的用途。

本发明提供了一种诊断胃腺癌的试剂盒，包括：

检测CTD-2540F13.2的一种或多种试剂；和

选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述试剂盒用于通过下组的方法检测CTD-2540F13.2的表达水平：qRT-PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法原位杂交法。

本发明提供了CTD-2540F13.2在构建预测胃癌的计算模型中的用途。

本发明提供了CTD-2540F13.2在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括CTD-2540F13.2的抑制剂。

进一步，所述抑制剂降低CTD-2540F13.2的表达水平。优选的，所述抑制剂选自核酸抑制物，所述核酸抑制物以CTD-2540F13.2或其转录本为靶序列、且能够抑制CTD-2540F13.2基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为干扰RNA或其构建物。

进一步，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明提供了一种治疗药物组合物，所述药物组合物包括CTD-2540F13.2的抑制剂。

进一步，所述抑制剂降低CTD-2540F13.2的表达水平。优选的，所述抑制剂选自核酸抑制物，所述核酸抑制物以CTD-2540F13.2或其转录本为靶序列、且能够抑制CTD-2540F13.2基因表达或基因转录的干扰分子，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂为干扰RNA或其抑制物。

进一步，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

根据靶向CTD-2540F13.2可以治疗胃癌这一发现，本发明还提供了CTD-2540F13.2在筛选治疗胃腺癌的候选药物中的应用。

进一步，筛选治疗胃腺癌的候选药物的方法包括：

(1)用待筛选物质处理表达或含有CTD-2540F13.2基因的体系；和

(2)检测所述体系中CTD-2540F13.2基因的表达水平；

若所述待筛选物质可降低CTD-2540F13.2基因的表达水平，则表明该待筛选物质为预防或治疗胃腺癌的候选药物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了CTD-2540F13.2基因的表达水平与胃腺癌相关，CTD-2540F13.2在胃腺癌患者中表达上调，通过检测受试者样本中CTD-2540F13.2的表达水平，可以判断受试者是否患有胃腺癌，以及患胃腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，采用分子标记物进行诊断，具有及时性、灵敏性、特异性。

附图说明

图1是利用QPCR检测CTD-2540F13.2基因在胃腺癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序结合生物信息学分析的方法，检测lncRNA在胃腺癌样本和对照样本中的表达水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与胃腺癌的发生之间的关系，从而为胃腺癌的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了胃腺癌患者中CTD-2540F13.2显著性上调，提示CTD-2540F13.2可作为检测指标应用于胃腺癌的临床诊断，同时根据CTD-2540F13.2与胃腺癌的关系，通过设计siRNA、shRNA等可以降低CTD-2540F13.2表达水平的方法治疗胃腺癌。

术语“表达的水平”或“表达水平”一般指生物学样品中生物标志物的量。“表达”一般指信息转化成细胞中存在并运行的结构的过程。因此，如本文中使用的，“表达”可以指转录成多核苷酸，翻译成多肽，或甚至多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)。转录的多核苷酸的，翻译的多肽的，或多核苷酸和/或多肽修饰(例如多肽的翻译后修饰)的片段也应视为表达的，无论它们是源自通过可变剪接生成的转录物或经过降解的转录物，或者是源自多肽的翻译后加工(例如通过蛋白水解)。“表达的基因”包括转录成多核苷酸(如mRNA)，然后翻译成多肽的基因，还有转录成RNA但不翻译成多肽的基因(例如转运和核糖体RNA、miRNA、lncRNA、circRNA)。在本发明的特定的实施方式中，“表达的基因”是指转录成RNA但不翻译成多肽的基因。

增加的表达”，“增加的表达水平”，“增加的水平”，“升高的表达”，“升高的表达水平”或“升高的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体，内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的增加的表达或增加的水平。

“减少的表达”，“减少的表达水平”，“减少的水平”，“降低的表达”，“降低的表达水平”或“降低的水平”指相对于对照诸如不具有疾病或病症(例如癌症)的个体或内部对照(例如持家型生物标志物)，或来自一个患者组/群体的样品中生物标志物的中值表达水平，个体中生物标志物的降低的表达或降低的水平。在一些实施方案中，降低的表达是很少的表达或不表达。

CTD-2540F13.2基因

CTD-2540F13.2基因位于人19号染色体上，包括CTD-2540F13.2基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的CTD-2540F13.2，以及源自细胞中加工的任何形式的CTD-2540F13.2。该术语涵盖CTD-2540F13.2的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的CTD-2540F13.2的序列如转录本ENST00000602255.1所示。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

本发明中核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(Sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于RNA在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将RNA逆转录成DNA。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些DNA片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板DNA进行测序。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、试剂盒

本发明所述的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于CTD-2540F13.2所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的lncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“同源性”是指互补性的程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源的”靶核酸杂交的核酸分子。完全互补序列与靶序列的杂交的抑制可通过在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、液相杂交等)进行检查。基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的核酸分子在低严格性条件下与靶标的结合(即，杂交)。这并非是说，低严格性条件是使得允许非特异性结合的条件；低严格性条件要求两个序列彼此之间的结合为特异性(即，选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用基本上非互补(例如，低于约30％同一性)的第二靶标进行测试；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补靶标杂交。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。在其结构内含有互补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。

本发明针对CTD-2540F13.2基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明的试剂盒包括检测有效量的检测CTD-2540F13.2基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测CTD-2540F13.2：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。

本发明的芯片或试剂盒可用于检测包括CTD-2540F13.2基因在内的多个基因(例如与胃腺癌相关的多个基因)的表达水平。

样本

在本发明中，“样本”意指任何在其中可以检测内在基因表达的细胞、组织、或体液的取样。这种样本的实例包括，但不限于活组织检查和涂片。可用于本发明的体液包括血液、淋巴液、尿液、唾液或任何其它身体分泌液或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，通过，例如，细针抽吸活检，穿刺活检，或切除活检获得胃组织样品。可以对细胞或组织应用固定剂和染色液以保存样本并便于检查。生物样品，特别是胃组织样品，可以转移至载玻片以进行放大观察。在一个实施方案中，生物样品是福尔马林固定、石蜡包埋的胃组织样品。在不同的实施方案中，从病理学家指导的组织核心样品获得组织样品。

本发明中的术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与胃腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集4例胃腺癌的癌组织及相对应的癌旁组织样本，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取，步骤详见说明书。

1)匀浆处理

每10-20mg组织加300μl裂解液RL，用研磨杵将组织彻底研磨；随后向匀浆液中加入590μl RNase-Free ddH₂O和10μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20min。

2)12,000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。

3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

5)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

6)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

8)重复步骤7)。

9)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。

11)RNA的质量检测

用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性(电泳条件：胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15min)检测完整性。28S rRNA是18S rRNA的两倍时，说明RNA的完整性较好。

用分光光度计检测RNA的浓度及纯度，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，RNA的质量较高。

3、cDNA文库的构建及测序

cDNA文库的构建及测序由华大基因完成，步骤如下：

1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

7)cDNA3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；

8)cDNA5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。

11)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；

12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。

4、生物信息学分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)tophat比对到参考基因组上，参考基因组版本为GRCh37.p13；

3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；

4)cuffdiff包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异。

5、结果

测序结果显示，CTD-2540F13.2在胃腺癌患者中表达显著上调，提示CTD-2540F13.2可能作为检测靶标应用于胃腺癌的早期诊断。

实施例2 QPCR测序验证CTD-2540F13.2基因的差异表达

1、按照实施例1的收集方式收集的31例胃腺癌患者癌组织样本和癌旁组织样本对CTD-2540F13.2基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取，具体步骤参见实施例1。

3、QPCR

根据CTD-2540F13.2和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如下：

CTD-2540F13.2：

正向引物：5′-GAGACAGAGACAGAGACAA-3′(SEQ ID NO.1)

反向引物：5′-CTAACTCCTTCACTCATTCATT-3′(SEQ ID NO.2)

GAPDH：

正向引物：5′-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3′(SEQ ID NO.3)

反向引物：5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′(SEQ ID NO.4)

使用天根公司的Quant一步法反转录-荧光定量试剂盒(SYBR Green)试剂盒(目录号：NG105)进行PCR反应，反应体系和反应条件如表1所示。在Thermal Cycler

Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，2^-ΔΔCT法进行相对定量：△CT＝CT_目的基因-CT_内参，△△CT＝△CT_处理组-△CT_对照组，处理组的相对表达值＝2^－△△CT，对照组的相对表达量＝1。

表1 QPCR反应体系和反应条件

4、结果

QPCR结果如图1所示，与对照相比，CTD-2540F13.2在胃腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，提示可通过检测CTD-2540F13.2的水平判断受试者是否患有胃腺癌，当CTD-2540F13.2的水平显著增加时，受试者患有胃腺癌或者存在患有胃腺癌的风险，通过CTD-2540F13.2与胃腺癌之间的关系可以设计降低CTD-2540F13.2水平的干扰RNA从而治疗胃腺癌，同时可以基于CTD-2540F13.2与胃腺癌的关系，构建预测胃腺癌的计算模型。

实施例3 CTD-2540F13.2的沉默及对胃腺癌细胞的影响

1、瞬时转染

由上海吉码制药技术有限公司设计及合成针对CTD-2540F13.2基因的siRNA干扰片段，阴性对照为通用siRNA-NC，CTD-2540F13.2-siRNA组：5′-AUUUCUCAUUCUGUGUUAGUG-3′(SEQ ID NO.5)；5′-CUAACACAGAAUGAGAAAUAA-3′(SEQ ID NO.6)。转染前24h接种胃腺癌MGC-803细胞于六孔板中，在细胞密度达50％～70％汇合度时，将培基换成无血清培基。将稀释好的干扰片段与Lipofectamine^TM2000脂质体轻柔混匀，室温孵育20min，形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，在5％CO2、37℃培养箱中培养，6～8h后更换完全培养基。48h后检测干扰效率。

2、QPCR检测干扰效率

转染48h后收集各组细胞，提取细胞RNA，检测RNA浓度和纯度后，按照实施例2所述的方法进行QPCR。

3、MTT法检测细胞增殖能力

取CTD-2540F13.2-siRNA和阴性对照组细胞，转染后24h，将细胞消化下来，以每孔4×10³个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μL，每组5个复孔，同时设空白对照(仅加培养基)，培养72h，每孔加入5g/L的MTT 20μl，37℃继续培养4h后弃掉孔内培养基，加入DMSO150μl，室温孵育10min，微振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，酶标仪上490nm测定各孔光密度(OD)值，以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。各组取5个孔平均值，重复3次。

4、Transwell检测细胞迁移能力

无血清培养基调整各组细胞密度为5×10⁵/ml，加入100μl至Transwell上室，下室加入含15％血清的培养基500μl培养24h后，弃去小室内培养基，PBS洗涤并用棉签轻轻擦拭滤膜上层。甲醇和结晶紫分别进行固定和染色，时长均为20min，显微镜下进行细胞计数。

5、统计学分析

所有的实验均独立重复3次，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

6、结果

6.1QPCR检测CTD-2540F13.2的表达水平

将CTD-2540F13.2-siRNA和siRNA-NC分别转染MGC-803细胞检测3组细胞中CTD-2540F13.2的表达水平。结果显示，转染CTD-2540F13.2-siRNA组细胞中CTD-2540F13.2的表达水平(0.180±0.0265)较空白对照组(1)和阴性对照组(0.983±0.0252)明显下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

6.2MTT法检测细胞增殖能力

MTT检测结果显示，CTD-2540F13.2-siRNA组细胞在72h的增殖效率(OD值：0.427±0.0321)明显低于阴性对照组(OD值：0.823±0.0416)，差异具有统计学意义(*，P＝0.0113)。

6.3Transwell检测细胞迁移能力

Transwell迁移结果显示，24h阴性对照组和CTD-2540F13.2-siRNA组的细胞穿膜数分别为(229.3±14.64)、(143.3±6.658)，差异具有统计学意义(*，P＝0.0120)。这表明干扰CTD-2540F13.2基因表达能够明显减弱MGC-803细胞的迁移能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 生物标志物在癌症诊断中的应用

<150> 201910490077.4

<151> 2019-06-06

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gagacagaga cagagacaa 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctaactcctt cactcattca tt 22

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

auuucucauu cuguguuagu g 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cuaacacaga augagaaaua a 21

Claims (10)

1.检测CTD-2540F13.2表达水平的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品通过测定样本中CTD-2540F13.2的表达水平与相对应的癌旁组织中的表达水平相比上调而确定。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述产品通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测CTD-2540F13.2基因的表达水平。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述产品包括：特异性识别CTD-2540F13.2的探针；或特异性扩增CTD-2540F13.2的引物。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述特异性扩增CTD-2540F13.2的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

7.CTD-2540F13.2在构建预测胃腺癌的计算模型中的用途。

8.CTD-2540F13.2的抑制剂在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的用途，其特征在于，所述抑制剂降低CTD-2540F13.2的表达水平。

9.根据权利要求8所述的用途，所述抑制剂为干扰RNA。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5和SEQID NO.6所示。

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