CN110684847B

CN110684847B - 一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物的用途

Info

Publication number: CN110684847B
Application number: CN201911008102.7A
Authority: CN
Inventors: 蒋雪梅; 贾新建; 罗雪; 易瑛
Original assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Current assignee: Peoples Hospital of Deyang City
Priority date: 2019-04-15
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2020-11-06
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN110684847A; CN109825592A

Abstract

本发明公开了一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物的用途，具体涉及生物标志物LINC01612在乳腺癌诊断和治疗中的应用。

Description

一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物的用途，具体的涉及生物标志物为LINC01612。

背景技术

乳腺癌是全球女性中最常被诊断出的癌症，也是癌症死亡的主要原因，其中女性乳腺癌发病最多。据最新报道，全球每年新增的乳腺癌患者约167.1万，每年死于乳腺癌的患者约52.2万(Desantis C,Ma J,Bryan L,et al.Breast cancer statistics,2013[J].Ca A Cancer Journal for Clinicians,2014,64(1):52-62.)。在中国，乳腺癌发病率为42.55/10万人，占女性全部恶性肿瘤发病的17.10％。目前乳腺癌治疗的主要方式为改良根治术，但治疗效果欠佳，且对达到延长患者的生存期及提高生活质量的目标尚有差距。根据ER(雌激素受体),PR(孕激素受体)及Her-2(人类表皮生长因子受体2)的表达情况不同可以将乳腺癌分为4个亚型(Luminal A型、Luminal B型、Her-2过表达型及Basal-like型)，而不同亚型的乳腺癌患者表现出不同的放疗敏感性，在现有基础上研究不同亚型与病理特征之间的关系以及不同亚型与放疗预后情况，需要进一步探索研究。

目前关于乳腺分子亚型表达情况与临床病理特征关系以及与改良根治术后腋窝淋巴结阳性的乳腺癌患者对放疗反应的影响研究尚不多见，在肿瘤大小、淋巴结转移乳腺癌TNM分期、临床分期等组织中表达状况与淋巴结转移和预后的关系尚不明确。

随着生物技术的发展，人们发现中介RNA(mRNA)只是总RNA的一小部分。非编码RNA不能编码蛋白质，但在结构、功能、调控方面发挥作用。基于表达和功能，非编码RNA能够被分为持家RNA(核糖体RNA、转运RNA、核仁小RNA)、低表达的调控RNA和一些特点不明确的RNA。根据大小，调控RNA可以进一步被分为短链非编码RNA(<200bp，如miRNAs,siRNAs、和piRNAs)和长链非编码RNA(>200bp，如lincRNAs、macroRNAs)，即1ncRNA(A.Pauli,J.L.Rinn,A.F.Schier.Non-coding RNAs as regulators of embryogenesis[J].NatureReviews Genetics,2011,12(2):136-149)。研究与乳腺癌发生发展相关的lncRNA，对于进一步解释乳腺癌的发病机理，实现乳腺癌的更精细的分型、以及达成乳腺癌患者的个性化精准治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种与乳腺癌发生发展相关的基因，为乳腺癌的早期诊断提供了一种产品和手段，相比传统的乳腺癌的诊断方法，使用标志物来诊断乳腺癌具有及时性、灵敏性，从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险，从而采取相应的预防和治疗措施。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种LINC01612的用途，用于制备诊断乳腺癌的产品。

进一步，所述产品通过测定样本中通过测定样本中LINC01612的表达水平与参考水平相比下调而确定。

进一步，所述产品通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测LINC01612基因的表达水平。

进一步，所述乳腺癌为Luminal A型乳腺癌。

进一步，所述核酸扩增技术选自聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。其中，PCR需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(RT-PCR)，TMA和NASBA直接扩增RNA。

本发明提供了一种体外检测样本中LINC01612表达水平的产品，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。其中，所述芯片包括固相载体；以及固定在固相载体上的寡核苷酸探针。所述试剂盒包括基因芯片或聚合酶链式反应体系。

进一步，所述体外检测样本中LINC01612表达水平的产品包括：

特异性识别LINC01612的探针；或

特异性扩增LINC01612的引物。

进一步，所述特异性扩增LINC01612的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

本发明提供了体外检测样本中LINC01612表达水平的产品在制备诊断乳腺癌工具中的用途。

本发明提供了一种诊断乳腺癌的试剂盒，包括：

检测LINC01612的一种或多种试剂；和

选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述试剂盒用于通过下组的方法检测LINC01612：qRT-PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法原位杂交法。

本发明提供了LINC01612在制备治疗乳腺癌、乳腺癌转移、乳腺癌侵袭的药物中的应用。

进一步，所述药物包括LINC01612的促进剂。所述促进剂是指任何可提高LINC01612基因或表达产物稳定性、上调LINC01612的表达、增加lncRNALINC01612的有效作用时间或促进LINC01612基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调LINC01612基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗乳腺癌。

作为一种优选的实施方式，所述促进剂包括过表达LINC01612的载体。进一步，所述的载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了LINC01612基因的表达水平与乳腺癌相关，LINC01612在乳腺癌患者中表达下调，通过检测受试者样本中LINC01612的表达水平，可以判断受试者是否患有乳腺癌，以及患乳腺癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案，采用分子标记物进行诊断，具有及时性、灵敏性、特异性。

附图说明

图1是利用QPCR检测LINC01612基因在乳腺癌组织中的表达情况图。

图2是利用QPCR检测过表达LINC01612的情况图。

图3是利用CCK检测LINC01612对MCF-7细胞的增殖影响图。

图4是利用Transwell小室检测LINC01612对MCF-7细胞迁移侵袭能力的影响图，其中图A是细胞迁移图，图B是细胞侵袭图。

具体的实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，通过高通量测序结合生物信息学分析的方法，检测lncRNA在乳腺癌样本和正常样本中的转录水平，发现其中具有明显表达差异的lncRNA片段，探讨其与乳腺癌的发生之间的关系，从而为乳腺癌的早期检测寻找更好的途径和方法。通过筛选，本发明首次发现了乳腺癌患者中LINC01612显著性下调，提示LINC01612可作为检测指标应用于乳腺癌的临床诊断，同时根据LINC01612与乳腺癌的关系，通过设计过表达载体等可以增加LINC01612表达水平的方法治疗乳腺癌。

LINC01612基因

LINC01612基因位于人4号染色体上，基因ID为101928223，本发明中LINC01612包括LINC01612多核苷酸或其片段、同系物、变体或衍生物。一种代表性的LINC01612基因的核苷酸序列如genebank中NR_125889.1所示。

本领域技术人员将认识到，本发明的实用性并不局限于对本发明的靶标基因的任何特定变体的基因表达进行定量。如果当核酸或其片段与其它核酸(或其互补链)最佳比对时(具有适当的核苷酸插入或缺失)，在至少大约60％的核苷酸碱基、通常至少大约70％、更通常至少大约80％、优选至少大约90％、及更优选至少大约95-98％核苷酸碱基中存在核苷酸序列相同性，则这两个序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。

检测技术

本发明的lncRNA使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

本发明可在检测前或与检测同时地对核酸(例如，ncRNA)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(PCR)、逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链式反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，PCR)需要在扩增前将RNA逆转录成DNA(例如，RT-PCR)，而其他扩增技术则直接扩增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常，PCR使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；RT-PCR则将逆转录酶(RT)用于从mRNA制备互补的DNA(cDNA)，然后将cDNA通过PCR扩增以产生DNA的多个拷贝；TMA在基本上恒定的温度、离子强度和pH的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个RNA拷贝自身催化地生成另外的拷贝，TMA任选地包括使用阻断，部分、终止部分和其他修饰部分，以改善TMA过程的灵敏度和准确度；LCR使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补DNA寡核苷酸。DNA寡核苷酸在热变性、杂交和连接的重复多个循环中通过DNA连接酶共价连接，以产生可检测的双链连接寡核苷酸产物；SDA使用以下步骤的多个循环：引物序列对与靶序列的相反链进行退火，在存在dNTPαS下进行引物延伸以产生双链半硫代磷酸化的(hemiphosphorothioated)引物延伸产物，半修饰的限制性内切酶识别位点进行的核酸内切酶介导的切刻，以及从切口3'端进行的聚合酶介导引的物延伸以置换现有链并产生供下一轮引物退火、切刻和链置换的链，从而引起产物的几何扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

本发明中的核酸杂交技术包括但不限于原位杂交(ISH)、微阵列和Southern或Northern印迹。原位杂交(ISH)是一种使用标记的互补DNA或RNA链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ISH)中的特异性DNA或RNA序列的杂交。DNA ISH可用于确定染色体的结构。RNA ISH用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mRNA和其他转录本(例如，ncRNA)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ISH也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将Southern和Northern印迹分别用于检测特异性DNA或RNA序列。使从样本中提取的DNA或RNA断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的DNA或RNA与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向Northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的DNA片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的RNA。

芯片、试剂盒

本发明所述的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC01612所示的部分或全部序列。

具体地，可根据本发明所述的lncRNA，设计出适合的探针，固定在固相载体上，形成“寡核苷酸阵列”。所述的“寡核苷酸阵列”是指具有可寻址位置(即以区别性的，可访问的地址为特征的位置)的阵列，每个可寻址位置均含有一个与其相连的特征性寡核苷酸。根据需要，可将寡核苷酸阵列分成多个亚阵。

在本发明中，所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

所述探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA(Polyamide nucleicacid，肽核酸)、LNA(注册商标，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交联化核酸)、ENA(注册商标，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerolnucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，苏糖核酸)等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“同源性”是指互补性的程度。可以存在部分同源性或完全同源性(即，同一性)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的核酸分子与“基本上同源的”靶核酸杂交的核酸分子。完全互补序列与靶序列的杂交的抑制可通过在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、液相杂交等)进行检查。基本上同源的序列或探针将竞争并抑制完全同源的核酸分子在低严格性条件下与靶标的结合(即，杂交)。这并非是说，低严格性条件是使得允许非特异性结合的条件；低严格性条件要求两个序列彼此之间的结合为特异性(即，选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用基本上非互补(例如，低于约30％同一性)的第二靶标进行测试；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补靶标杂交。

本发明中的术语“杂交”用于指代互补核酸的配对。杂交和杂交强度(即，核酸之间的缔合强度)受诸如以下的因素影响：核酸之间的互补程度、所涉及的条件的严格性、形成的杂交体的Tm和核酸内的G:C比率。在其结构内含有互补核酸的配对的单个分子称为“自我杂交的”。

本发明针对LINC01612基因的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明的试剂盒包括检测有效量的检测LINC01612基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对疾病发展进行判断。

采用本发明的试剂盒，可通过选自下组的各种方法(包括但不限于)检测LINC01612：实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、或RNA印迹法或原位杂交法。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式进行调整和改变。

本发明的芯片或试剂盒可用于检测包括LINC01612基因在内的多个基因(例如与乳腺癌相关的多个基因)的表达水平。

样本

在本发明中，“样本”意指任何在其中可以检测内在基因表达的细胞、组织、或体液的取样。这种样本的实例包括，但不限于活组织检查和涂片。可用于本发明的体液包括血液、淋巴液、尿液、唾液、乳头抽吸液、妇科液体、或任何其它身体分泌液或其衍生物。血液可以包括全血、血浆、血清或任何血液衍生物。在一些实施方案中，生物样品包括乳腺细胞，特别是来自活组织检查的乳腺组织，例如乳腺肿瘤组织样品。可以通过多种技术从主体获得生物样品，包括，例如通过刮擦或擦抹一个区域、通过使用针抽吸细胞或体液、或者通过移除组织样品(即活组织检查)。收集各种生物样品的方法是本领域熟知的。在一些实施方案中，通过，例如，细针抽吸活检，穿刺活检，或切除活检获得乳腺组织样品。可以对细胞或组织应用固定剂和染色液以保存样本并便于检查。生物样品，特别是乳腺组织样品，可以转移至载玻片以进行放大观察。在一个实施方案中，生物样品是福尔马林固定、石蜡包埋的乳腺组织样品，特别是原发乳腺肿瘤样品。在不同的实施方案中，从病理学家指导的组织核心样品获得组织样品。

本发明中的术语“诊断”是指通过疾病的体征和症状或遗传分析、病理分析、组织学分析等识别疾病。

本发明的药物包括LINC01612的促进剂、和/或与所述促进剂配伍的其他药类以及药学上可接受的载体和/或辅料。

所述的LINC01612的促进剂是指任何可提高LINC01612基因或表达产物稳定性、上调LINC01612的表达、增加lncRNA LINC01612的有效作用时间或促进LINC01612基因的转录的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调LINC01612基因的表达有用的物质，从而可用于预防或治疗乳腺癌。

作为本发明的一种优选方式，所述的LINC01612的促进剂是一种含有LINC01612的表达载体。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

在本发明中，是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、粘粒、噬菌体、病毒等。表达载体向宿主细胞中的导入可以使用电穿孔法、磷酸钙法、脂质体法、DEAE葡聚糖法、显微注射、病毒感染、脂质体转染、与细胞膜透过性肽的结合等周知的方法。

术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与乳腺癌相关的基因标志物

1、样品收集

分别收集4例Luminal A型乳腺癌的癌组织及相对应的正常组织样本(距离肿瘤边缘5公分)，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗，所有患者均知情同意，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意，病人信息如表1所示。

表1 样本信息

2、RNA样品的制备及质量分析

使用Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取组织中的RNA，步骤如下：

1)将新鲜的或超低温冻存的动物组织样品迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研杵研磨组织，其间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。将研磨成粉末状的样品加入到含有裂解Buffer RL的1.5ml灭菌离心管中，用移液器反复吹打直至裂解液中无明显沉淀。

2)将裂解液在12,000rpm，4℃离心5min。

3)小心吸取上清液到新的1.5ml RNase Free Tube中。

4)加入与液体等体积的70％乙醇，使用移液枪将溶液混合均匀。

5)立即将混合液全部转入到RNA Spin Column中。

6)12,000rpm，离心1min，弃滤液。将RNA Spin Column放回到2ml收集管中。

7)将500μl的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。

8)将600μl的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12,000rpm离心30s，弃滤液。

9)重复步骤8)。

10)将RNA Spin Column重新安置于2ml收集管上，12,000rpm离心2min。

11)将RNA Spin Column安置于1.5ml的无RNA酶收集管上，在RNA Spin Column膜中央处加入50～200μl的RNase Free dH₂O或0.1％DEPC处理水，室温静置5min。

12)12,000rpm离心2min洗脱RNA。

13)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。

3、cDNA文库的构建及测序

1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

7)cDNA3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；

8)cDNA5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。

11)文库质量检测：使用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；

12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。

4、生物信息学分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)hisat2比对到参考基因组上。参考基因组来自于Ensembl数据库，基因组版本GRCh38，基因注释信息为Ensemble 92；

3)stringtie定量lncRNA的表达量并标准化输出；

4)edgeR包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异，差异变动lncRNA的筛选标准是|log₂FC|>1且pvalue<0.05。

5、结果

测序数据如表2所示，生物信息学分析发现，LINC01612在乳腺癌患者中表达显著下调，提示LINC01612可能作为检测靶标应用于乳腺癌的早期诊断。

表2 测序数据

实施例2 QPCR测序验证LINC01612基因的差异表达

1、按照实施例1的收集方式收集的25例Luminal A型乳腺癌患者癌组织样本和正常组织样本对LINC01612基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取组织中的RNA，具体步骤参见实施例1。

3、QPCR

根据LINC01612和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如表3所示。

表3 扩增引物

使用TaKaRa One Step TB Green^TM Prime Script^TM RT-PCR试剂盒(CodeNo.RR066A)进行PCR反应，反应体系和反应条件如表4所示。在Thermal Cycler

Time System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，ΔΔCT法进行相对定量。

表4 QPCR反应体系和反应条件

4、结果

QPCR结果如图1所示，与正常组织相比，LINC01612在乳腺癌组织中表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，其中50例样本中共有23例样本中的LINC01612表达显著下调，27例样本中则无显著变化，显著下调的23例样本中，乳腺癌组织有22例，正常组织有1例，无显著变化的27例样本中，乳腺癌组织有3例，正常组织有24例，提示可通过检测LINC01612的水平判断受试者是否患有乳腺癌，当LINC01612的水平显著降低时，受试者患有乳腺癌或者存在患有乳腺癌的风险，通过LINC01612与乳腺癌之间的关系可以设计增加LINC01612水平的过表达载体从而治疗乳腺癌，同时可以基于LINC01612与乳腺癌的关系，构建预测乳腺癌的计算模型。

实施例3 LINC01612在乳腺癌细胞系中的表达情况

1、细胞培养

培养Luminal A型乳腺癌的MCF-7细胞系，于5％CO₂，37℃的恒温培养箱中进行培养，所有细胞培养基中加10％胎牛血清以及1％P/S。2-3天换液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶进行常规消化，按1:3的比例将细胞进行传代。

2、转染

LINC01612过表达载体和阴性对照质粒购自上海吉凯基因化学技术有限公司，使用Invitrogen公司的Lipofectamin^TM2000试剂进行细胞转染，分别转染LINC01612过表达载体(实验组)和阴性对照质粒(对照组)。

细胞转染前准备取培养箱中提前种植在6孔板中的细胞，用无血清的OPTI-MEM转染液冲洗转染细胞两次后，每孔中加入1500μl OPTI-MEM转染液，6孔板放回细胞培养箱中继续培养，转染时培养基内含有血清。将使用无血清的OPTI-MEM稀释的质粒与Lipofectamine^TM试剂混匀后孵育15min，将孵育好的转染复合物加入细胞中于培养箱中进行培养，6h后弃掉转染液，细胞放回到培养箱内继续培养。

4、QPCR检测LINC01612的表达水平

1)RNA的提取

使用Takara RNA提取试剂盒(Code NO.9767)提取培养细胞中的总RNA。

2)QPCR检测步骤同实施例2

5、结果

实验组的LINC01612的表达水平显著升高(图2)，差异具有统计学意义(P<0.05)，本实验中所有细胞实验均重复3次。

实施例4CCK-8法检测LINC01612基因对乳腺癌细胞增殖的影响

用过表达LINC01612质粒转染的乳腺癌细胞作为实验组，阴性对照质粒转染的细胞作为对照组，加入到96孔板中，每孔加入的细胞数量为3000个，每组设置5个复孔。分别用于24h、48h、72h、96h检测时间点检测。每隔24h细胞孔中加入10μl的CCK-8检测液，将96孔板继续放入细胞培养箱中孵育4h左右，用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光度值并记录数据，连续测到96h。根据检测的OD值的平均值，绘制生长曲线。

生长曲线结果显示，实验组在转染过表达LINC01612的质粒后，细胞的增殖能力明显低于对照组(图3)，说明LINC01612影响乳腺癌细胞的增殖，通过改变LINC01612的表达水平可以改变乳腺癌细胞的增殖能力。

实施例5 Transwell小室检测LINC01612对细胞迁移及侵袭的影响

1、Transwell小室制备

无菌条件下Matrigel冰浴融化后按1:8比例稀释Matrigel胶，在Transwell上室内部缓慢加入上室底部，铺胶后迅速移入37℃的细胞培养箱中温育至其凝固成胶状。

2、迁移实验中，上室加入数量为5×10⁴的100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，每组设置3个复孔；侵袭实验中，向铺有Matrigel胶的上室中加入数量为1×10⁵的100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％胎牛血清培养基，每组设置3个复孔；Transewll小室放入细胞培养箱内继续培养24h。

3、染色

取出Transwell用PBS洗2遍，使用多聚甲醛进行固定，加入结晶紫染色，室温染色20min，用PBS漂洗2遍，放入荧光显微镜下观察并计数。

4、结果

Transwell实验结果显示，转染过表达LINC01612质粒组的迁移细胞数(图4A)、侵袭细胞数(图4B)显著降低，说明细胞的迁移、侵袭能力较对照组受到明显的抑制(P<0.05)，LINC01612与乳腺癌细胞的迁移、侵袭有关，改变LINC01612的表达可以影响乳腺癌细胞的迁移、侵袭能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 德阳市人民医院

<120> 一种与乳腺癌发生发展相关的生物标志物的用途

<150> 201910298598X

<151> 2019-04-15

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gttaattgtg acctctatga t 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttctacagcc tcttatctc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

Claims

1.检测组织样本中长链非编码RNA LINC01612表达水平的试剂在制备诊断乳腺癌的产品中的用途，其特征在于，癌组织中LINC01612的表达水平低于正常组织中LINC01612的表达水平。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术的方法检测LINC01612的表达水平。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述产品包括制剂、芯片或试剂盒。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂包括：

特异性识别LINC01612的探针；或

特异性扩增LINC01612的引物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述特异性扩增LINC01612的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括：

选自以下一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂盒通过qRT-PCR、生物芯片检测法、RNA印迹法或原位杂交法检测LINC01612表达水平。

8.LINC01612表达水平的促进剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促进剂包括过表达LINC01612的载体。