CN111424095B

CN111424095B - 分子标志物及其在癌症中的应用

Info

Publication number: CN111424095B
Application number: CN202010499021.8A
Authority: CN
Inventors: 董东; 郑骏年
Original assignee: Xuzhou Medical University
Current assignee: Xuzhou Medical University
Priority date: 2019-06-26
Filing date: 2020-06-04
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2040-06-04
Also published as: CN111424095A; CN110241213A

Abstract

本发明公开了分子标志物及其在癌症中的应用，本发明公开了分子标志物RP11‑259N19.1在制备诊断和治疗胃腺癌的产品中的应用，本发明同时公开了检测胃腺癌的产品，所述产品包括检测RP11‑259N19.1的试剂。

Description

分子标志物及其在癌症中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及分子标志物及其在癌症中的应用，具体的涉及RP11-259N19.1在胃癌中的应用。

背景技术

胃癌(Gastric Cancer,GC)是起源于胃粘膜的恶性肿瘤，是目前世界第四最常见肿瘤，致死率高居恶性肿瘤第二位，全球每年新发胃癌病例约100万例，严重威胁人体健康和生命质量，其中胃癌新发病例近一半来自我国。胃癌的发展是一个逐渐发展的过程，从正常胃粘膜细胞发展为胃癌需要经历相当长时间的变化渐进过程，包括胃炎、肠化、高级别上皮内瘤变。胃癌是一种多因素参与的复杂疾病，胃癌发生发展中涉及了一系列分子改变，包括原癌基因激活以及抑癌基因失活，另外还与相关信号通路的异常表达相关。但是胃癌发病机制复杂，目前仍然有许多未知领域。所以，探索胃癌发生发展的机制，寻求新的诊断标志及治疗方法尤为重要。

一般把胃镜下观察和组织病理学诊断作为胃癌诊断的金标准，但是这些由于胃癌的隐匿性，早期胃癌诊断率较低，我国仅为7.5％，当病人因身体不适就诊时，往往已经发展为进展期胃癌，术后5年生存率仅达15％(Zanotti L,Bottini A,Rossi C,etal.Diagnostic tests based on gene expression profile in breast cancer:frombackground to clinical use[J].Tumour Biol,2014,35(9):8461-8470.)。研究证实，组织形态改变是基于基因、分子水平改变的积累集合后的结果(Yanaihara N,Caplen N,Bowman E,et al.Unique microRNA molecular profiles in lung cancer diagnosisand prognosis[J].CANCER CELL,2006,9(3):189-198.)，因此全面研究胃癌基因水平改变，深入研究胃癌机制是亟待解决的问题。随着目前医学知识的不断更新，现在医学已经进入崭新的分子生物学时代，高质量、系统的基因检测平台为分子肿瘤学的发展提供了基础，科学家们在此基础上深入探索胃癌发生发展的机制(Esteller M.Non-coding RNAs inhuman disease[J].NAT REV GENET,2011,12(12):861-874.)。

人类基因组测序结果分析表明，全基因组中70％-90％基因进行转录，但只有不到2％基因最终翻译为蛋白，剩下的绝大部分转录本被命名为非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)(Xu Z,Yan Y,Qian L,et al.Long non-coding RNAs act as regulators of cellautophagy in diseases(Review)[J].ONCOL REP,2017,37(3):1359-1366.)。其中含有小于200个核苷酸的微小RNA(microRNA,miRNA)和大于200个核苷酸的长链非编码RNA(longnon-coding RNA，lncRNA)。目前，关于miRNA功能研究已有大量结果，1ncRNA也成为现今的研究热点。1ncRNA可在表观遗传、转录及转录后多水平、多途径地调节基因表达，从而影响肿瘤在内的多种疾病的发生发展。深度挖掘与胃癌相关的lncRNA，对于揭示胃腺癌的发病机制，实现胃腺癌的早期诊断具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明通过高通量测序技术结合及生物信息学的方法，筛选在胃腺癌中呈现差异表达的lncRNA分子标志物，并通过QPCR进一步的进行验证，以判断筛选出来的lncRNA作为分子标志物的可能性，为胃腺癌的早期诊断提供分子基础，为胃腺癌发病机制的揭示提供理论基础。

“差异表达分子标志物”和“差异表达”可互换使用，指相对于其在正常对象中的表达，或相对于其在对特定治疗不同地应答的或具有不同的预后的患者中的表达，其表达在患有特定疾病的对象中被激活为较高或较低水平的分子标志物。该术语还包括其表达在相同的疾病的不同的阶段被激活为较高或较低水平的分子标志物。还要理解的是差异表达分子标志物可在核酸水平或蛋白水平上被激活或被抑制，或可经受选择性剪接以产生不同的多肽产物。这种差异可通过包括mRNA水平、微小RNA水平、lncRNA水平、反义转录物水平或蛋白表面表达、分泌或多肽的其他划分的多种改变来证实。差异分子标志物表达可包括两个或更多个基因之间或其基因产物之间的表达的比较；或两个或更多个基因之间或其基因产物之间的表达的比率的比较；或甚至相同基因的两个不同加工的产物的比较，其在正常对象和患病对象之间是不同的；或在相同疾病的不同阶段是不同的。差异表达包括例如在正常细胞和病态细胞之间或在经历不同的疾病事件或疾病阶段的细胞之间，在分子标志物中瞬时表达模式或细胞表达模式中的定量和定性的差异。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测分子标志物的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，所述分子标志物为RP11-259N19.1。

在本发明中，RP11-259N19.1基因位于2号染色体上，包括RP11-259N19.1基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的RP11-259N19.1，以及源自细胞中加工的任何形式的RP11-259N19.1。该术语涵盖RP11-259N19.1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的RP11-259N19.1的序列如ENST00000610008.1所示。

进一步，RP11-259N19.1在胃腺癌患者中表达上调。

进一步，所述试剂包括与RP11-259N19.1特异性结合的物质。

进一步，所述特异性结合的物质是与RP11-259N19.1特异性结合的核酸。

进一步，与RP11-259N19.1特异性结合的核酸是寡核苷酸探针或引物。

术语“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

作为探针，可以使用荧光标记、放射标记、生物素标记等对癌检测用多核苷酸进行了标记的标记探针。多核苷酸的标记方法本身是公知的。可通过如下方法检查试样中是否存在受试核酸：固定受试核酸或者其扩增物，与标记探针进行杂交，洗涤，以及然后测定与固相结合的标记。备选地，还可固定癌检测用多核苷酸，使受试核酸与其杂交，然后应用标记探针等检测结合于固相上的受试核酸。在这种情况下，结合于固相上的癌检测用多核苷酸也称为探针。使用多核苷酸探针测定受试核酸的方法在本领域也是公知的。可以如下进行该方法：在缓冲液中使多核苷酸探针与受试核酸在Tm或者其附近(优选在±4℃以内)接触用于杂交，洗涤，然后测定杂交的标记探针或者与固相探针结合的模板核酸。

在作为探针使用的多核苷酸的大小优选为18个或更多个核苷酸、更优选为20个或更多个核苷酸，以及编码区域的全长或更少。作为引物使用时，该多核苷酸大小优选为18个或更多个核苷酸，以及50个或更少核苷酸。这些探针具有与靶点基因的特定的碱基序列互补的碱基序列。这里，所谓“互补”，只要是杂交即可，可以不是完全互补。这些多核苷酸通常相对于该特定的碱基序列具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选100％的同源性。这些探针可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以为在其一部分或全部中核苷酸通过PNA、LNA、ENA、GNA、TNA等人工核酸置换得到的多核苷酸。

术语“引物”指短核酸序列，作为具有短的游离3’末端羟基(游离3’羟基)的核酸序列，它可以与互补模板(template)形成碱基对(basepair)并充当复制模板的起点。引物可以是单链或双链，并且必须足够长以在诱导剂存在下引发合成预期的延伸产物。引物的确切长度依赖于很多因素，其中包括温度、引物来源和使用方法。例如，对于诊断应用，依赖于靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有15-25个或更多核苷酸，尽管它可以含有更少核苷酸。参与确定引物适当长度的因素对于本领域技术人员容易知道。

本发明的引物或探针可以使用磷酰亚胺固相支持法或其他熟知方法化学合成。也可以使用本领域已知的许多手段修饰所述核酸序列。这些修饰的非限制性实例是甲基化、加帽、用天然核苷酸的一种或多种类似物进行的置换和在核苷酸之间的修饰，例如，修饰不带电荷的连接体(例如，磷酸甲酯、磷酸三酯、磷酰亚胺、氨基甲酸酯等)，或修饰带电荷的连接体(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)。

进一步，所述引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。

本发明提供了一种诊断胃腺癌的产品，所述产品包括检测RP11-259N19.1的试剂。

进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。

进一步，所述芯片包括：固相载体，以及附着于其上的特异性识别RP11-259N19.1的探针。所述固相载体包括但不限于塑料制品、微颗粒、膜载体等，所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

进一步，所述试剂盒包括：特异性扩增RP11-259N19.1的引物，特异性识别RP11-259N19.1的探针的探针或特异性分析RP11-259N19.1的芯片。

本发明提供了RP11-259N19.1在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的应用，所述药物组合物包括RP11-259N19.1的抑制剂。所述抑制剂为可以降低RP11-259N19.1水平的任何试剂。

作为非限制性的实施例，包括：shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸，或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。

进一步，所述抑制剂选自干扰RNA。

进一步，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5-6所示。

本发明提供了一种治疗胃腺癌的药物组合物，所述药物组合物包括RP11-259N19.1的抑制剂。所述抑制剂为可以降低RP11-259N19.1水平的任何试剂。

进一步，所述抑制剂选自干扰RNA。

进一步，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5-6所示。

在本发明中，术语“芯片”也称为“阵列”，指包含连接的核酸或肽探针的固体支持物。阵列通常包含按照不同的已知位置连接至基底表面的多种不同的核酸或肽探针。这些阵列，也称为“微阵列”，通常可以利用机械合成方法或光引导合成方法来产生这些阵列，所述光引导合成方法合并了光刻方法和固相合成方法的组合。阵列可以包含平坦的表面，或者可以是珠子、凝胶、聚合物表面、诸如光纤的纤维、玻璃或任何其它合适的基底上的核酸或肽。可以以一定的方式来包装阵列，从而允许进行全功能装置的诊断或其它方式的操纵。

“微阵列”是杂交阵列原件有序排列在基质上，所述杂交阵列原件诸如聚核苷酸探针(例如寡核苷酸)或结合剂(例如抗体)。所述基质可以是固体基质，例如，玻璃或二氧化硅玻片、珠、纤维光学粘结剂或半固态基质，例如硝酸纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其中的任何排列。

各种探针阵列已经描述在文献中并且可以用于本发明上下文中检测可能与本文所述表型相关的标志物。例如，DNA探针阵列芯片或较大的DNA探针阵列晶片(否则，可以通过打断晶片而获得各个体芯片)用于本发明的一个实施方案。DNA探针阵列晶片一般包含玻璃晶片，其上放置了高密度DNA探针(短DNA片段)阵列。这些晶片各自可以保持例如约6000万个用于识别较长样品DNA序列(例如，来自个体或群体，例如，包含所关注的标志物)的DNA探针。用玻璃晶片上的DNA探针组识别样品DNA通过DNA杂交进行。当DNA样品与DNA探针阵列杂交时，样品结合于样品DNA序列互补的那些探针。通过评价个体样品DNA与那些探针更稳固地杂交，有可能确定已知的核酸序列是否存在于样品中，由此确定核酸中发现的标志物是否存在。

本发明的试剂盒包括检测RP11-259N19.1基因的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

作为非限制性实施例，本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

作为非限制性实施例，本发明的试剂盒的组分可以以水介质的形式或以冻干的形式来包装。试剂盒中适当的容器通常至少包括一种小瓶、试管、长颈瓶、宝特瓶、针筒或其它容器，其中可放置一种组分，并且优选地，可进行适当地等分。在试剂盒中存在多于一种的组分时，试剂盒中通常也将包含第二、第三或其它附加的容器，其中分离地放置附加的组分。然而，不同组合的组分可被包含在一个小瓶中。本发明的试剂盒通常也将包括一种用于容纳反应物的容器，密封以用于商业销售。这种容器可包括注模或吹模的塑料容器，其中可保留所需的小瓶。

本发明包括任何本领域可用的用于检测本文所述的内在基因表达的方法。“检测表达”是指确定内在基因的RNA转录物或其表达产物的量或存在。检测本公开的内在基因表达，即基因表达概况分析的方法包括基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法。这些方法通常检测本文所述的内在基因的表达产物(例如RNA)。在优选的实施方案中，使用基于PCR的方法，例如逆转录PCR(RT-PCR)，和基于阵列的方法例如微阵列。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

附图说明

图1是利用QPCR检测RP11-259N19.1基因在胃腺癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与胃癌相关的基因标志物

1、样品收集

收集4例胃腺癌的癌组织及相对应的癌旁组织样本，进行高通量测序，所有患者术前未进行化疗、放疗以及内分泌治疗。

2、RNA样品的制备及质量分析

使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取，步骤详见说明书。

1)匀浆处理

每10-20mg组织加300μl裂解液RL，用研磨杵将组织彻底研磨；随后向匀浆液中加入590μl RNase-Free ddH₂O和10μl Proteinase K，混匀后56℃处理10-20min。

2)12,000rpm离心2-5min，取上清进行以下操作。

3)缓慢加入0.5倍上清体积无水乙醇，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱放在收集管中)，12,000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

4)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

5)向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。

6)向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱放回收集管中。

7)向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室温静置2min，12,000rpm离心30s，弃废液，将吸附柱CR3放回收集管中。

8)重复步骤7)。

9)12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

10)将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加30-100μl RNase-Free ddH₂O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，得到RNA溶液。

11)RNA的质量检测

用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性(电泳条件：胶浓度1.2％；0.5×TBE电泳缓冲液；150V，15min)检测完整性。28S rRNA是18S rRNA的两倍时，说明RNA的完整性较好。

用分光光度计检测RNA的浓度及纯度，OD260/OD280读数在1.8-2.1之间，RNA的质量较高。

3、cDNA文库的构建及测序

cDNA文库的构建及测序由华大基因完成，步骤如下：

1)总RNA DNase I消化：利用DNase I消化Total RNA样品中存在的DNA片段，磁珠纯化回收反应产物，最后溶解于DEPC水；

2)去除rRNA：取消化好的Total RNA样品，使用Epicentre的Ribo-Zero试剂盒去除rRNA，去除之后进行Agilent 2100检测，验证rRNA去除效果；

3)RNA打断：取上一步样品，加入打断Buffer，置于PCR仪中进行热打断，打断到140-160nt；

4)反转录一链的合成：向打断后的样品中加入适量引物，充分混匀后在Thermomixer适温反应一定时间，使之打开二级结构并与引物结合，再加入提前配制的一链合成反应体系Mix，在PCR仪上按相应程序合成一链cDNA；

5)反转录二链的合成：配制二链合成反应体系，在Thermomixer上适温反应一定时间，合成带有dUTP的二链cDNA，反应产物用磁珠进行纯化回收；

6)末端修复：配制末端修复反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，对反转录得到的cDNA双链的粘性末端进行修复，末端修复产物用磁珠进行纯化回收，最后将样品溶于EB Solution；

7)cDNA3’末端加“A”：配制加“A”反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使末端修复的产物cDNA的3’末端加上A碱基；

8)cDNA5’adapter的连接：配制接头连接反应体系，在Thermomixer中适温反应一定时间，在酶的作用下，使接头与A碱基连接，产物用磁珠进行纯化回收；

9)UNG消化cDNA二链：配制UNG消化反应体系，通过UNG酶消化掉双链DNA中的二链，并用磁珠对产物进行纯化回收；

10)PCR反应及产物回收：配制PCR反应体系，选择适当的PCR反应程序，对上步骤得到的产物进行扩增，对PCR产物进行磁珠纯化回收，回收产物溶于EB溶液中，贴上标签。

11)文库质量检测：使用Agilent 2100Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System对文库质量进行检测；

12)上机测序：检测合格的文库，加入NaOH变性成单链，按照预期上机数据量，稀释至一定的上机浓度。变性稀释后的文库加入到FlowCell内，与FlowCell上的接头杂交，在cBot上完成桥式PCR扩增，最后使用Illumina Hiseq x-ten平台进行测序。

4、生物信息学分析

1)用cutadapt对reads的5’和3’段进行trim，trim掉质量<20的碱基，并且删掉N大于10％的reads；

2)tophat比对到参考基因组上，参考基因组版本为GRCh37.p13；

3)cuffquant定量lncRNA的表达量并标准化输出；

4)cuffdiff包比较对照组跟疾病组lncRNA的表达差异。

5、结果

测序结果显示，与癌旁组织相比，RP11-259N19.1在胃腺癌患者中表达显著上调，提示RP11-259N19.1可能作为检测靶标应用于胃腺癌的早期诊断。

实施例2QPCR测序验证RP11-259N19.1基因的差异表达

1、按照实施例1的收集方式收集的31例胃腺癌患者癌组织样本和癌旁组织样本对RP11-259N19.1基因差异表达进行大样本QPCR验证。

2、RNA提取

使用天根的动物组织总RNA提取试剂盒(目录号为DP431)进行总RNA的提取，具体步骤参见实施例1。

3、QPCR

根据RP11-259N19.1和GADPH的基因序列设计引物，引物序列如下：

RP11-259N19.1：

正向引物：5′-TCTAAGAGCCAGAGAAGTA-3′(SEQ ID NO.1)

反向引物：5′-CCAGTTCATTCACATCATC-3′(SEQ ID NO.2)

GAPDH：

正向引物：5′-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3′(SEQ ID NO.3)

反向引物：5′-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′(SEQ ID NO.4)

使用天根公司的Quant一步法反转录-荧光定量试剂盒(SYBR Green)试剂盒(目录号：NG105)进行PCR反应，反应体系和反应条件如下面所示。在Thermal Cycler

RealTime System扩增仪上进行PCR扩增，反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和溶解曲线，2^-ΔΔCT法进行相对定量：△CT＝CT_目的基因-CT_内参，△△CT＝△CT_处理组-△CT_对照组，处理组的相对表达值＝2^－△△CT，对照组的相对表达量＝1。

50μl反应体系的配置

向EP管中加入下列试剂并混匀：2×Quant One Step RT-qPCR Mix(SYBR)25μl、Hotmaster Taq Polymerase 2.5U/μl 2.5μl、Quant RTase 0.4μl、正(反)向引物0.2μM、总RNA 50ng，加无核酶水至50μl。

反应条件

50℃30min，95℃2min；

(94℃20s，55℃20s，68℃20s)×40

4、结果

QPCR结果如图1所示，与对照相比，RP11-259N19.1在胃腺癌组织中表达上调，上调约2.76倍，差异具有统计学意义(P<0.05)，同高通量测序结果一致，提示可通过检测RP11-259N19.1的水平判断受试者是否患有胃腺癌，与正常对照相比，当RP11-259N19.1的水平显著增加时，受试者患有胃腺癌或者存在患有胃腺癌的风险。

根据RP11-259N19.1与胃腺癌之间的关系可以设计降低RP11-259N19.1水平的siRNA、shRNA等用于治疗胃腺癌。

实施例3RP11-259N19.1的沉默及对胃腺癌细胞的影响

1、瞬时转染

由上海吉码制药技术有限公司设计及合成针对RP11-259N19.1基因的siRNA干扰片段，阴性对照为通用siRNA-NC，RP11-259N19.1-siRNA组：5′-UUCAUUCUUGCCAGUUUCCAC-3′(SEQ ID NO.5)；5′-GGAAACUGGCAAGAAUGAAAU-3′(SEQ ID NO.6)。转染前24h接种胃腺癌MGC-803细胞于六孔板中，在细胞密度达50％～70％汇合度时，将培基换成无血清培基。将稀释好的干扰片段与Lipofectamine^TM2000脂质体轻柔混匀，室温孵育20min，形成转染复合物；然后将上述混合物加到细胞培养基中，轻轻混匀，在5％CO₂、37℃培养箱中培养，6～8h后更换完全培养基。48h后检测干扰效率。

2、QPCR检测干扰效率

转染48h后收集各组细胞，提取细胞RNA，检测RNA浓度和纯度后，按照实施例2所述的方法进行QPCR。

3、MTT法检测细胞增殖能力

取RP11-259N19.1-siRNA和阴性对照组细胞，转染后24h，将细胞消化下来，以每孔4×10³个细胞接种于96孔板中，每孔体积200μL，每组5个复孔，同时设空白对照(仅加培养基)，培养72h，每孔加入5g/L的MTT 20μl，37℃继续培养4h后弃掉孔内培养基，加入DMSO150μl，室温孵育10min，微振荡器振荡10min，使结晶物充分溶解，以空白对照孔调零，酶标仪上490nm测定各孔光密度(OD)值，以相对应OD比值表示细胞增殖能力大小。各组取平均值，重复3次。

4、Transwell检测细胞迁移能力

无血清培养基调整各组细胞密度为5×10⁵/ml，加入100μl至Transwell上室，下室加入含15％血清的培养基500μl培养24h后，弃去小室内培养基，PBS洗涤并用棉签轻轻擦拭滤膜上层。甲醇和结晶紫分别进行固定和染色，时长均为20min，显微镜下进行细胞计数。

5、统计学分析

所有的实验均独立重复3次，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，组间比较使用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

6、结果

6.1QPCR检测RP11-259N19.1的表达水平

将RP11-259N19.1-siRNA和siRNA-NC分别转染MGC-803细胞检测3组细胞中RP11-259N19.1的表达水平。结果显示，转染RP11-259N19.1-siRNA组细胞中RP11-259N19.1的表达水平(0.453±0.0153)较空白对照组和阴性对照组(0.97±0.0173)明显下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

6.2MTT法检测细胞增殖能力

MTT检测结果显示，RP11-259N19.1-siRNA组细胞在72h的增殖效率(OD值：0.393±0.0252)明显低于阴性对照组(OD值：0.823±0.0416)，差异具有统计学意义(**，P＝0.0055)。

6.3Transwell检测细胞迁移能力

Transwell迁移结果显示，24h阴性对照组和RP11-259N19.1-siRNA组的细胞穿膜数分别为(229.3±14.64)、(173.3±10.26)，差异具有统计学意义(*，P＝0.0199)。这表明干扰RP11-259N19.1基因表达能够明显减弱MGC-803细胞的迁移能力。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 徐州医科大学

<120> 分子标志物及其在癌症中的应用

<150> 2019105581371

<151> 2019-06-26

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctaagagcc agagaagta 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccagttcatt cacatcatc 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uucauucuug ccaguuucca c 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggaaacuggc aagaaugaaa u 21

Claims

1.检测分子标志物的试剂在制备诊断胃腺癌的产品中的应用，其特征在于，所述分子标志物为RP11-259N19.1。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，RP11-259N19.1在胃腺癌患者中表达上调。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括与RP11-259N19.1特异性结合的物质。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性结合的物质是与RP11-259N19.1特异性结合的核酸。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，与RP11-259N19.1特异性结合的核酸是寡核苷酸探针或引物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO.1-2所示。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片、试剂盒。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述芯片包括：固相载体，以及附着于其上的特异性识别RP11-259N19.1的探针。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括：特异性扩增RP11-259N19.1的引物，特异性识别RP11-259N19.1的探针或特异性分析RP11-259N19.1的芯片。

10.RP11-259N19.1的抑制剂在制备治疗胃腺癌的药物组合物中的应用，其特征在于，所述抑制剂降低RP11-259N19.1的表达水平。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述抑制剂为干扰RNA。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于，所述干扰RNA的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。