CN111518904B

CN111518904B - 检测及靶向ctd-3060p21.1的试剂及其应用

Info

Publication number: CN111518904B
Application number: CN202010387108.6A
Authority: CN
Inventors: 徐红玉; 杜泽东; 刘贤国; 廖洪飞; 蒙荣钦; 虞晓林; 曹鹏; 石雨卉; 余研忻
Original assignee: 363 Hospital
Current assignee: 363 Hospital
Priority date: 2020-05-09
Filing date: 2020-05-09
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2040-05-09
Also published as: CN111518904A

Abstract

本发明公开了检测及靶向CTD‑3060P21.1的试剂及其应用。本发明公开了CTD‑3060P21.1在肺腺癌中差异表达，且该基因作为检测变量在肺腺癌中具有较高的特异性和敏感性。本发明同时公开了CTD‑3060P21.1的表达的改变影响肺腺癌细胞的增殖和迁移，说明CTD‑3060P21.1可作为分子靶标应用于肺腺癌的治疗。

Description

检测及靶向CTD-3060P21.1的试剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及检测及靶向CTD-3060P21.1的试剂及其应用。

背景技术

近年来，肺癌的发病率和病死率均呈上升趋势，严重危害人类的生命和健康。据统计，肺癌患者5年生存率仅18.1％，其中肿瘤的复发和转移是影响患者生存期的主要原因。根据组织病理学分型，肺癌可分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌，其中以非小细胞肺癌最常见，非小细胞肺癌可分为鳞癌、腺癌、大细胞癌、腺鳞癌、类癌等，又以肺鳞癌最为常见。肺癌的发生进展是一个缓慢复杂的过程，肺癌形成一般要经过局部浸润、循环扩散、远处侵袭、新生血管形成等步骤，其中肿瘤细胞进入外周血是肿瘤发生远处转移和复发的关键一步。尽管随着医疗科技的发展，肺癌患者的诊断、治疗、护理均得到很大提高，但是这几十年来肺癌死亡率依然居高不下，肺癌患者总体生存预后依然不佳。这其中导致肺癌患者预后不佳的主要原因是当患者就诊时疾病已经处于晚期或者已经发生转移，即肺癌患者已经失去了最佳治疗时机。但是，对原位癌或者早期肺癌的患者治疗后随访发现生存期和预后都得到很大改善，甚至不少患者达到了治愈。研究表明:如果早期发现肿瘤形成，许多肿瘤都是可以治疗甚至治愈的。因此，肺癌防治的关键是在早期筛查，早期诊断，只有这样才能早期治疗提高患者的治愈率。早期治疗不仅可以节约医疗费用，减少病人创伤，减轻病人痛苦，而且可以延长病人寿命，提高生活质量。目前肺癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗、生物靶向治疗等，但是这些方法目前仍难以提高肺癌患者的治愈率。许多患者由于肿瘤转移或复发从而错过了最好的治疗时机，因此，如何提高肺癌患者的早期诊断率，如何提高肺癌早期诊断方法一直以来是医学领域中科研人员不断努力的方向。

近年来，表观遗传分子的调控在肺腺癌的发生发展中的作用越来越引起重视，表观遗传学是在非基因序列改变的基础上研究基因表达的改变。研究发现，肺腺癌发生发展过程中，存在表观遗传学关键基因/蛋白的改变，进而影响相关通路，最终对细胞的增殖、凋亡和周期产生不同程度的影响。表观遗传调控领域研究包括DNA甲基化、微小RNA(microRNA，miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)、环状RNA(circleRNA，circRNA)等。

基于以上认识，综合国内外最新肺腺癌标志研究进展及前期研究基础，本申请以lncRNA切入点，以研究肺腺癌诊断和治疗相关的lncRNA，并探索lncRNA在肺腺癌发病机制中的可能作用。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肺腺癌相关的lncRNA生物标志物，通过检测该生物标志物的水平可以判断受试者是否患有肺腺癌，从而为肺腺癌的早期诊断和治疗提供一种新手段。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种检测试剂，所述试剂为检测CTD-3060P21.1水平的试剂。

进一步，所述试剂选自特异性针对CTD-3060P21.1的探针或引物。

进一步，所述特异性扩增CTD-3060P21.1的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。

本发明的第二方面提供了一种产品，所述产品包括本发明第一方面所述的试剂。

进一步，所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

本发明的第三方面提供了一种组合物，所述组合物包括有效量的CTD-3060P21.1的抑制剂。所述抑制剂选自核酸分子、碳水化合物、小分子化合物或干扰慢病毒。

进一步，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、双链RNA、小干扰RNA或短发夹RNA。

进一步，所述抑制剂为核酸分子。

进一步，所述核酸分子为siRNA。

进一步，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。

本发明的第四方面提供了一种预测肺腺癌的计算模型，所述计算模型包括CTD-3060P21.1的计算分析模块，计算分析模块处理检测的CTD-3060P21.1的数据，并与设定诊断值进行比较。

本发明的第五方面提供了一种筛选治疗肺腺癌的候选药物的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理表达或含有CTD-3060P21.1基因的体系；和检测所述体系中CTD-3060P21.1基因的表达；其中，若所述待筛选的物质可以抑制CTD-3060P21.1基因的水平，则表明该待筛选物质是治疗肺腺癌的候选药物。

进一步，所述体系选自：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

所述候选物质包括(但不限于)：针对CTD-3060P21.1基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。

本发明的第六方面提供了如下任一项应用：

a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肺腺癌的工具中的应用；

b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断肺腺癌的工具中的应用；

c.CTD-3060P21.1在构建诊断肺腺癌的计算模型中的应用；

d.CTD-3060P21.1在制备治疗肺腺癌的药物中的应用；

e.CTD-3060P21.1在筛选治疗肺腺癌的候选药物中的应用；

f.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。

附图说明

图1是利用QPCR检测CTD-3060P21.1基因在肺腺癌组织中的表达情况图。

具体的实施方式

本发明通过检测肺腺癌样本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织中的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与肺腺癌的发生发展之间的关系，从而为肺腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。本发明首次发现了肺腺癌中CTD-3060P21.1显著性上调，并通过实验证明了CTD-3060P21.1与肺腺癌的发生发展相关，为肺腺癌的早期诊断及治疗提供了新的肿瘤标志物和治疗靶点。

CTD-3060P21.1

转录CTD-3060P21.1的基因是位于人17号染色体上，本发明中的CTD-3060P21.1包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道，在进行测序分析时，会将原始测序结果比对到人的参考基因组上，因此筛选结果中的CTD-3060P21.1可能会包含不同的转录本，只要可以比对到参考基因组上的CTD-3060P21.1即可。一种代表性的CTD-3060P21.1的序列如ENST00000574885.1所示。

本发明技术人员应当理解，可以利用本领域内已知的任何方法来测定基因的表达水平，包括但不限于核酸测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。

许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取RNA(例如mRNA)。

RNA提取的一般方法是本领域熟知的。特别地，可以使用来自商业制造商，例如Qiagen(Valencia,CA)的纯化试剂盒、缓冲剂套组和蛋白酶进行RNA分离，按照制造商的说明进行。例如，可以使用Qiagen RNeasy微型柱从培养细胞分离总RNA。其它可商购的RNA分离试剂盒包括MASTERPURE^TM Complete DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre,Madison,Wis.)和Paraffin Block RNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX)。例如，可以使用RNA Stat-60(Tel-Test,Friendswood,TX)从组织样品中分离总RNA。例如，可以使用高纯FFPE RNAMicrokit,货号04823125001(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)从FFPE中分离总RNA。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的RNA。此外，可以通过使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量组织样品。

试剂盒、芯片、核酸膜条

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测CTD-3060P21.1的试剂，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对肿瘤发展进行判断、对治疗方案进行选择。

本发明中的芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于CTD-3060P21.1所示的部分或全部序列。

术语“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体、和有机分子。

本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料，例如包括但不限于尼龙膜，经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。

所述的CTD-3060P21.1芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如，如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明的lncRNA芯片。

在本发明中，核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别CTD-3060P21.1寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。

本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括CTD-3060P21.1基因在内的多个基因(例如，与肺腺癌相关的多个基因)的表达水平，将肺腺癌的多个标志物同时进行检测，可大大提高肺腺癌诊断的准确率。

基于本发明人的发现，本发明提供了CTD-3060P21.1在制备治疗肺腺癌的药物组合物中的应用，所述药物组合物包括特异性抑制CTD-3060P21.1的试剂。所述试剂包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药或干扰慢病毒。

在制备本发明的药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

作为本发明的一种优选的实施方案，所述核酸分子包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、小干扰RNA(siRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。

优选地，所述小干扰RNA(siRNA)包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体。

本发明所述的小干扰RNA可以是化学合成的双链RNA；也可以是载体或表达框架表达的双链RNA，所述载体或表达框架中可采用例如RNA聚合酶III启动子和RNA聚合酶III终止子调控小干扰RNA在哺乳动物细胞中的表达，RNA聚合酶III启动子包括人源或鼠源的U6启动子和人H1启动子等。

该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。

本发明的药物还可与其他治疗肺腺癌的药物联用，其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

统计学分析

在本发明的具体实施例中，实验都是按照至少重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用graphpad统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1QPCR检测CTD-3060P21.1基因表达

1、分别收集33例肺腺癌组织及配对的癌旁组织的手术样本，全部患者在手术前均未接收化疗、放疗、靶向治疗、肿瘤免疫治疗及其他治疗，无其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病。

2、RNA提取

用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解；然后加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min后，4℃，11000rpm离心15min；将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min后4℃，11000rpm离心15min；用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次，4℃，8000rpm离心5min；然后将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

3、QPCR

1)逆转录反应

采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，反应体系和反应条件如表1所示。

表1逆转录反应体系和反应条件

2)引物设计

根据Genebank中CTD-3060P21.1基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由博迈德生物公司合成，具体引物序列如表2所示。

表2引物序列

3)QPCR扩增检验

用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行，试剂和反应体系如表3所示。

表3 QPCR扩增反应体系和反应条件

4)样品RealTime PCR检测

将各样品分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

QPCR结果如图1所示，与癌旁组织相比，CTD-3060P21.1在肺腺癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(P<0.05)；CTD-3060P21.1在30例样本中表达上调，其中在肺腺癌组织中表达上调的有28例，在癌旁组织中表达上调的有2例。以表达上调视为阳性(+)，无显著变化或者下调视为阴性(-)，具体统计情况如表4所示。

表4基因在样本中的表达情况表

实施例3 CTD-3060P21.1的功能性验证

1、细胞培养

人肺癌细胞株A549，以含10％胎牛血清和1％P/S的DMEM培养基在37℃、5％CO₂的恒温培养箱中培养。

2、转染

2.1siRNA的设计

由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对CTD-3060P21.1的干扰siRNA-CTD-3060P21.1，序列如表5所示，对照为通用的siRNA-NC。

表5 siRNA序列

2.2转染

按照invitrogen Lipo2000转染试剂的说明书的步骤操作，常规将细胞消化后均匀铺于6孔板内，第二天贴壁后，更换为不含血清的培养基饥饿12h，次日按照每孔的量，先用无血清培养基分别孵育lipo2000、siRNA约5min,然后轻轻混匀lipo2000和siRNA，孵育20min，然后将混合液均匀加入到6孔板内摇匀，转染4h后换含10％胎牛血清培基，继续培养。实验分为三组：对照组(A549)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-CTD-3060P21.1)

3、QPCR检测

3.1细胞RNA的提取步骤同实施例1

3.2荧光定量PCR检测步骤同实施例1

4、细胞增殖活力检测(CCK-8)

取生长状态良好的对照组和实验组肺腺癌细胞，消化离心后加入DMEM培养基吹打成单细胞悬液，然后计数。96孔板中每孔接种1000个细胞，每组细胞设5个复孔。72h后进行CCK-8检测。在测定前，弃去孔内旧的培养基，避光每孔重新加入90μL的培养基和10μL的CCK8。37℃,5％CO₂的培养箱中孵育2h。酶标仪设定为450nm单波长，测定吸光度值，然后进行统计分析。

5、Transwell小室检测细胞运动能力

5.1Transwell细胞迁移实验

计数细胞数量，调整细胞的密度至5×l0⁵个/ml，上室内加入200μL细胞悬液，下室为500μL含20％胎牛血清培养基，继续培养48h后取出小室，擦掉小室内侧未穿过膜的细胞，甲醇固定30min，结晶紫染色液浸染至少30min，自来水冲洗，室温下自然风干。显微镜下观察并计数各组穿过膜的细胞数量。

5.2Transwell细胞侵袭实验

方法和步骤同Transwell细胞迁移实验，区别是首先在上室的聚碳酸酷膜室侧铺上一层基质胶。铺胶过程在冰上进行，所用枪头均需提前预冷，Matrigel胶提前在4℃冰中过夜溶解。

6、统计分析

实验结果采用graphpad进行统计分析，采用双侧检验，P<0.05认为有统计学意义。

7、结果

以CTD-3060P21.1在空白对照组的表达水平作为基准定为1，转染结果显示如表6所示，实验组的siRNA对CTD-3060P21.1具有较好的沉默效果。

表6 CTD-3060P21.1的相对表达量

注：P值是siRNA-NC/siRNA-CTD-3060P21.1 vs空白对照组

CCK-8检测结果如表7所示，实验组(siRNA-CTD-3060P21.1)的OD值相对于阴性对照组显著降低，说明CTD-3060P21.1在肺腺癌细胞的增殖中起着重要的作用。

表7 OD值

Transwell检测结果如表8所示，在肺腺癌细胞转染siRNA-CTD-3060P21.1后，细胞的迁移和侵袭能力显著降低，说明CTD-3060P21.1的表达影响肺腺癌细胞的迁移和侵袭，提示可将CTD-3060P21.1应用于肺腺癌转移和浸润的治疗。

表8细胞迁移和侵袭能力检测

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 三六三医院

<120> 检测及靶向CTD-3060P21.1的试剂及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tctctgtgac tcaatgttct 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agtgttccaa gtgctcaa 18

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagccccagc cttctccat 19

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

uugucauugu caucaguagc a 21

<210> 6

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cuacugauga caaugacaac g 21

Claims

1.一种筛选治疗肺腺癌的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有CTD-3060P21.1 基因的体系；和检测所述体系中CTD-3060P21.1 基因的表达；其中，若所述待筛选物质降低CTD-3060P21.1基因的水平，则表明该待筛选物质是治疗肺腺癌的候选药物。

2.如下任一项应用：

a.一种试剂在制备诊断肺腺癌的工具中的应用，其特征在于，所述试剂为检测样本中CTD-3060P21.1水平的试剂；

b.一种产品在制备诊断肺腺癌的工具中的应用，其特征在于，所述的产品包括检测样本中CTD-3060P21.1水平的试剂；

c. CTD-3060P21.1在构建诊断肺腺癌的计算模型中的应用；

d. CTD-3060P21.1抑制剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用；

e. CTD-3060P21.1在筛选治疗肺腺癌的候选药物中的应用；

f.一种组合物在制备治疗肺腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述组合物包括有效量的CTD-3060P21.1的抑制剂。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂选自特异性针对CTD-3060P21.1的探针或引物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述特异性针对CTD-3060P21.1的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，b中所述产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，f中所述抑制剂为核酸分子。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述核酸分子为siRNA。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述siRNA的序列如SEQ ID NO.5~6所示。