lncRNA在肺腺癌诊疗中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及lncRNA在肺腺癌诊疗中的应用,具体的涉及LINC01983在肺腺癌诊疗中的应用。
背景技术
肺癌是一个全球性的问题,每年吞噬着数百万人的生命,是世界范围内癌症死亡的主要原因(Denisenko TV,Budkeveh IN,Zhivotovsky B.Cell death-based treatmentof lung adenocarcinoma[J].Cell Death Dis.2018,9(2):117.)。在男性和女性恶性肿瘤中,肺癌发病率虽然均是第二位,但是死亡率上均居所有恶性肿瘤之首(RebeccaL.Siegel,MPH,et al.Cancer statistics,2018.CA Cancer J C1in.2018;68:7-30.)。近些年来随着经济的发展、卫生条件的改善、医疗诊治水平的不断提高,恶性肿瘤的诊出率和治愈率均得到显著提高,患者的五年生存率得到大幅度改善;但是由于肺癌的早期临床症状隐匿和进展迅速,肺癌患者早期诊断及远期存活率仍然不高(Zhuang H1,Wang J,ZhaoL,et al.The theoretical foundation and research progress for WBRT combinedwith erlotinib for the treatment of multiple brain metastases in patientswith lung adenocarcinoma[J].Int J Cancer.2013,133(10):2277-83.),多数肺癌患者就诊时已属临床晚期,治疗及预后效果较差。随着肺腺癌特异性突变基因的发现,靶向药物为肺癌治疗带来了新的希望,但由于个体差异和耐药,其远期疗效并不令人满意(Cardarella S,Johnson BE.The impact of genomic changes on treatment of lungcancer[J].Am J Respir Crit Care Med.2013,188(7):770-5.)。因此,进一步探讨肺腺癌发病相关分子机制,探寻更有效的治疗手段对改善肺腺癌的预后尤为重要。
疾病的病理生理过程受基因的调控,真核细胞基因组由庞大复杂的DNA序列构成,通过转录成RNA表达和传递生物遗传信息。人类全基因组测序结果发现,仅有不到2%的基因序列参与蛋白质编码,而绝大多数非编码序列被转录成长度大于200个碱基的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA),参与基因表达的调控,促进或抑制多种肿瘤的发生、发展。一直以来,分子生物学研究的焦点均集中在编码蛋白质的信使RNA(messengerRNA,mRNA),而大量无蛋白编码功能的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)被视为无生物学功能的“垃圾序列”而被长期忽视(Li CH1,Chen Y.Targeting long non-coding RNAs incancers:progress and prospects[J].Int J Biochem Cell Biol.2013,45(8):1895-910.)。ncRNA不具备典型的启始密码子、开放阅读框、启动子保守区及终止密码子等特性。根据ncRNA长度不同,ncRNA被分为小非编码RNA(small non-coding RNA,snRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA),其中1ncRNA占80%。LncRNA由RNA聚合酶II转录,参与表观遗传、可变剪接、入核转运等过程,其转录和功能失调可作为肿瘤抑制因子或促癌因子行使功能(Yuan J P,Zhang H W,Lu Z.Progress on Bioinformatic Research of1ncRNA[J].Progress In Biochemistry And Biophysics,2013,40:634-640)。因此,深入研究1ncRNA生物学功能及其与疾病关系可为临床诊治提供新的思路。
目前,lncRNA在肺腺癌早期诊断及预后预测中的应用研究还比较少。虽然lncRNA在肺腺癌发生发展过程中具有重要作用,并且部分lncRNA可以作为肺腺癌诊断及预后预测指标,但是仍然有大量lncRNA未被发现,仍然需要进一步研究1ncRNA在肺腺癌表达及其调控肿瘤发生发展中的机制。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的之一在于提供一种与肺腺癌发生发展相关的lncRNA生物标志物及其在肺腺癌诊断和治疗中的应用。
本发明的目的之二在于提供一种筛选治疗肺腺癌的候选药物的方法。
本发明的目的之三,在于提供一种诊断肺腺癌的产品。
本发明的目的之四在于提供一种治疗肺腺癌的药物组合物。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面提供了一种检测试剂,所述试剂为检测LINC01983水平的试剂。
进一步,所述试剂选自:
特异性识别LINC01983的探针;或
特异性扩增LINC01983的引物。
进一步,所述特异性扩增LINC01983的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
本发明的第二方面提供了一种产品,所述产品检测LINC01983水平的试剂。
进一步,所述试剂选自:
特异性识别LINC01983的探针;或
特异性扩增LINC01983的引物。
进一步,所述特异性扩增LINC01983的引物序列如SEQ ID NO.1~2所示。
进一步,本发明第二方面所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
本发明的第三方面提供了一种组合物,所述组合物包括有效量的LINC01983的抑制剂。所述抑制剂选自:以LINC01983或其转录本为靶序列、且能够抑制LINC01983基因表达或基因转录的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。
进一步,所述抑制剂为siRNA。
进一步,所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7~12所示。
优选的,所述siRNA的序列如SEQ ID NO.7~8所示。
本发明的第四方面提供了一种筛选治疗肺腺癌的候选药物的方法,所述方法包括:
用待筛选物质处理表达或含有LINC01983基因的体系;和
检测所述体系中LINC01983基因的表达;
其中,若所述待筛选的物质可以抑制LINC01983基因的水平,则表明该待筛选物质是治疗肺腺癌的候选药物。
所述体系选自:细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
所述候选物质包括(但不限于):针对LINC01983基因或其上游或下游基因设计的干扰分子、核酸抑制物、小分子化合物等。
本发明的第五方面提供了如下任一项应用:
a.本发明第一方面所述的试剂在制备诊断肺腺癌的工具中的应用;
b.本发明第二方面所述的产品在制备诊断肺腺癌的工具中的应用;
c.LINC01983在构建诊断肺腺癌的计算模型中的应用;
d.LINC01983在制备治疗肺腺癌、或肺腺癌侵袭、或肺腺癌腺转移的药物中的应用;
e.本发明第三方面所述的组合物在制备治疗肺腺癌、或肺腺癌侵袭、或肺腺癌转移的药物中的应用;
f.LINC01983在筛选治疗肺腺癌的候选药物中的应用;
g.本发明第四方面所述的方法在筛选治疗肺腺癌的候选药物中的应用。
附图说明
图1是利用QPCR检测LINC01983基因在肺腺癌组织中的表达情况图;
图2是检测siRNA对LINC01983的沉默效果图;
图3是CCK8法检测LINC01983对肺腺癌细胞增殖的影响图;
图4是利用划痕实验检测LINC01983对肺腺癌迁移的影响图;
图5是利用Transwell小室检测LINC01983对肺腺癌细胞侵袭的影响图。
具体的实施方式
本发明经过广泛而深入的研究,通过高通量测序以及生物信息学分析方法,检测肺腺癌标本中lncRNA在肿瘤组织和癌旁组织的表达,发现其中具有明显表达差异的lncRNA,探讨其与肺腺癌的发生发展之间的关系,从而为肺腺癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。通过筛选,本发明首次发现了肺腺癌中LINC01983显著性上调,并通过实验证明了LINC01983与肺腺癌的发生发展相关,为肺腺癌的早期诊断及治疗提供了新的肿瘤标志物和治疗靶点。
LINC01983
转录LINC01983的基因是位于人3号染长臂2区9带上,本发明中的LINC01983包括野生型、突变型或其片段。本领域技术人员知道,在进行测序分析时,会将原始测序结果比对到人的参考基因组上,因此筛选结果中的LINC01983可能会包含不同的转录本,只要可以比对到参考基因组上的LINC01983(基因ID 101929697)即可。在本发明的实施例中,一种代表性的转录LINC01983基因的核苷酸序列如目前国际公共核酸数据库GeneBank中LINC01983基因(NR_134939.1)所示。
本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因的表达水平。本领域技术人员应当理解,测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。
lncRNA水平的一些检测或定量方法是本领域已知的并且都适合用于本文提供的方法以测量生物标志物的水平。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(northern blots)、核糖核酸酶保护试验和基于PCR的方法。当生物标志物是lncRNA分子时,lncRNA序列或其片段可以用于制备至少有部分互补的探针。然后采用例如基于PCR的方法、RNA印迹法(Northernblotting)或试纸条检测(dipstick assay)等任何合适的测定法,可以用探针检测样品中的lncRNA序列。
所述测定方法可以根据所需lncRNA信息的类型而变化。示例性的方法包括但不限于RNA印迹(Northern blots)和基于PCR的方法(例如,qRT-PCR)。qRT-PCR等方法也可以对样品中lncRNA的量进行准确定量。
任何合适的测定平台均可用于确定样品中lncRNA的存在。例如,测定可以呈试纸条(dipstick)、膜(membrane)、芯片(chip)、盘(disk)、测试条(test strip)、滤器(filter)、微球(microsphere)、载片(slide)、多孔板(multiwell plate)或光纤(opticalfiber)的形式。测定系统可以具有其上附着有与lncRNA对应的核酸的固相支持物。所述固相支持物可包含例如塑料、硅片、金属、树脂、玻璃、膜、颗粒、沉淀物(precipitate)、凝胶、聚合物、薄片(sheet)、球、多糖、毛细管、胶片(film)、板或载片。所述测定组件可以制备后包装在一起作为用于检测lncRNA的试剂盒。
核酸如果需要可以被标记以制作被标记的lncRNA群体。一般而言,样品可以采用本领域众所周知的方法进行标记。在某些实施方案中,所述样品被荧光标记物标记。示例性的荧光染料包括但不限于呫吨(xanthene)染料、荧光素染料、罗丹明染料、异硫氰酸荧光素(FITC)、6-羧基荧光素(FAM)、6-羧基-2',4',7',4,7-六氯荧光素(HEX)、6-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素(JOE或J)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA或T)、6-羧基-X-罗丹明(ROX或R)、5-羧基罗丹明6G(R6G5或G5)、6-羧基罗丹明6G(R6G6或G6)和罗丹明110;花菁染料,例如Cy3、Cy5和Cy7染料;Alexa染料,例如Alexa-fluor-555;香豆素、二乙氨基香豆素、伞形酮;苯甲亚胺染料,例如Hoechst 33258;菲啶染料,例如德克萨斯红(Texasred);乙锭染料;吖啶染料;咔唑染料;吩噁嗪染料;卟啉染料;聚甲炔染料、BODIPY染料、喹啉染料、芘(pyrene)、荧光素氯三嗪基(fluorescein chlorotriazinyl)、R110、Eosin、JOE、R6G、四甲基罗丹明、lissamine、ROX和萘并荧光素。
核酸可存在于固相支持物上的特定可寻址位置中;每一个位置对应于生物标志物的lncRNA序列的至少一部分。
在某些实施方案中,lncRNA测定包括以下步骤:1)获得一种或多种生物标志物的表面-结合的探针;2)使lncRNA群体与表面-结合的探针在足以提供特异性结合的条件下杂交;3)去除杂交步骤中未结合的核酸;和4)检测杂交的lncRNA。
杂交可以在合适的杂交条件下进行,该条件的严格性可视需要而变化。典型的条件是在固体表面上在互补的结合成员之间,即在表面-结合的探针和样品中的互补lncRNA之间足以产生探针/靶复合物。
在某些实施方案中,使用严格的杂交条件。包括温度、盐浓度、多核苷酸浓度、杂交时间和洗涤条件的严格性在内的适当条件的选择,取决于实验设计,包括样品来源、捕获剂的种类、预期互补性的程度等等,并且可以作为常规实验手段由本领域普通技术人员来确定。
在lncRNA杂交程序之后,将表面结合的多核苷酸洗涤以去除未结合的核酸。可以采用任何方便的洗涤方案进行洗涤。在某些实施方案中,洗涤条件是严格的。然后可以采用标准技术检测靶lncRNA与探针的杂交。
试剂盒、芯片、核酸膜条
本发明提供了一种试剂盒,所述试剂盒可用于检测LINC01983的表达。
作为优选的实施方案,所述试剂盒包含与生物标志物的lncRNA特异性结合的一种或多种探针或引物。
作为更为优选的实施方案,所述试剂盒还包含洗涤溶液。
作为更为优选的实施方案,所述试剂盒还包含进行杂交试验的试剂、lncRNA分离或纯化工具、检测工具以及阳性和阴性对照。
作为进一步优选的实施方案,所述试剂盒还包含使用该试剂盒的说明书。所述试剂盒可以定制供在家使用、临床使用或研究使用。
所述试剂盒包括用于扩增LINC01983的特异性引物对;标准DNA模板;PCR反应液。
本发明中的芯片包括:固相载体;以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针,所述的寡核苷酸探针特异性地对应于LINC01983所示的部分或全部序列。
本发明中所述固相载体可采用基因芯片领域的各种常用材料,例如但不限于尼龙膜,经活性基团(如醛基、氨基等)修饰的玻片或硅片、未修饰的玻片、塑料片等。
所述的LINC01983芯片的制备可采用本领域已知的生物芯片的常规制造方法。例如,如果固相载体采用的是修饰玻片或硅片,探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串,可将寡核苷酸探针配制成溶液,然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上,排列成预定的序列或阵列,然后通过放置过夜来固定,就可得到本发明的lncRNA芯片。
在本发明中,核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的特异性识别LINC01983寡核苷酸探针;所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底,例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等。
本发明中基因检测试剂盒或基因芯片或核酸膜条可用于检测包括LINC01983基因在内的多个基因(例如,与肺腺癌相关的多个基因)的表达水平,将肺腺癌的多个标志物同时进行检测,可大大提高肺腺癌诊断的准确率。
在本发明中,正如熟练技术人员知道的,可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地,在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度,并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。
优选地,在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地,应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题,能容易地将此类值与例如个体关于肺腺癌的风险或与有助于评估肺腺癌患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式,此类对数函数是如下获得的:a)将个体分类入组,例如正常人、有肺腺癌风险的个体、具有肺腺癌的患者等等,b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物,c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值,并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中,标志物不再是独立的,而是代表一个标志物组合。
用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如,适宜的统计方法是判别分析(DA)(即线性、二次、规则DA)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即SIMCA)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中,用于获得评估肺腺癌中使用的数学算法的统计方法选自DA(即线性、二次、规则判别分析)、Kernel方法(即SVM)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、PLS(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、CART、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。
抑制剂和药物
基于发明人的发现,本发明提供了一种LINC01983的抑制剂,所述抑制剂的性质对本发明来说并不重要,只要它抑制LINC01983基因的功能性表达即可,举例来说,本发明的抑制剂可以是以LINC01983基因为靶序列、且能够抑制LINC01983基因的干扰分子,包括:shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)、dsRNA、微小RNA、反义核酸,或能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA、dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物。这些抑制剂作为对于下调LINC01983有用的物质,可用于治疗肺腺癌。
作为本发明的一种优选方式,所述LINC01983的抑制剂是一种LINC01983特异性的小干扰RNA分子。如本文所用,所述的“小干扰RNA”是指一种短片段双链RNA分子,能够以同源互补序列的lncRNA为靶目标降解特定的lncRNA,这个过程就是RNA干扰(RNAinterference)过程。小干扰RNA可以制备成双链核酸的形式,它含有一个正义链和一个反义链,这两条链仅在杂交的条件下形成双链。一个双链RNA复合物可以由相互分离的正义链和反义链来制备。因此,举例来讲,互补的正义链和反义链是化学合成的,其后可通过退火杂交,产生合成的双链RNA复合物。
在筛选有效的siRNA序列时,本发明人通过大量的比对分析,从而找出最佳的有效片段。本发明人设计合成了多种siRNA序列,并将它们分别通过转染试剂转染肺腺癌细胞系进行验证,选出干扰效果最佳的siRNA,在本发明的具体实施例中,该siRNA的序列如SEQ IDNO.7~8所示,进一步地在细胞水平实验,结果证明对于该siRNA在能有效的抑制细胞中LINC01983基因的表达水平,以及肺腺癌细胞的增殖。本领域技术人员可以认识到,选择效果最佳的siRNA进行后续的实验并不意味着其他的siRNA不能起到相似的效果,进行siRNA干扰实验的目的是为了证明LINC01983的表达水平确实与肺腺癌细胞的增殖及侵袭和迁移相关,为了减少成本,通常会选择具有代表性的siRNA进行实验。
本发明的核酸抑制物如siRNA可以化学合成,也可以通过一个重组核酸结构里的表达盒转录成单链RNA之后进行制备。siRNA等核酸抑制物,可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内,或还可采用本领域已知的多种技术被输送到细胞内。
在本发明中,“药物”、“药物组合物”可以通用。作为可选择的实施方案中,药物组合物包括LINC01983基因的抑制剂以及药学上可接受的载体。药学上可接受的载体包括(但并不限于):稀释剂、赋形剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等、填充剂如淀粉、蔗糖等;粘合剂如单糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮;湿润剂如甘油;崩解剂如干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸钙和碳酸氢钠;吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等;表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇等;致湿剂如甘油、淀粉等;吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土等;润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼酸粉末等。
在本发明中,药物组合物可以使用不同的添加剂进行制备,例如缓冲剂、稳定剂、抑菌剂、等渗剂、螯合剂、pH控制剂及表面活性剂。
本发明所述的药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、肺腺癌给药、鼻给药、颊给药、阴道给药或通过植入的贮药装置给药。优选口服给药或注射给药。本发明的药物组合物可含有任何常用的无毒可药用载体、辅料或赋形剂。在某些情况下,药用酸、碱或缓冲剂可用来调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药剂型的稳定性。本文所用术语非胃肠道包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞠内、损伤部位内、和颅内注射或输注技术。只要能达到目标组织,本发明所述药物组合物可以通过任何途径给予受体。
本发明药物组合物可以以任何口服剂型的形式口服给药,包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散剂和溶液。对于口服片剂,常用载体包括乳糖和玉米淀粉。一般还加入润滑剂例如硬脂酸镁。为了以胶囊形式口服给药,适用的稀释剂包括乳糖和无水玉米淀粉。当口服施用水悬浮液和/或乳液时,可将活性组分悬浮或溶解在油相中,并与乳化剂和/或悬浮剂合并。如果需要的话,可加入一些甜味剂和/或矫味剂和/或着色剂。适当时,可将用于口服给药的剂量单位制剂包微囊。例如,通过在聚合物、蜡等中将颗粒物质包衣或包埋,也可制备所述制剂已延长或维持释放。本发明的药物组合物可以用于降低内源性的LINC01983过表达,通过降低LINC01983的表达,从而治疗因LINC01983表达上调导致的肺腺癌。
在本发明中,可将抑制LINC01983表达的化合物作为裸RNA与递送试剂一起作为核酸(如重组质粒或病毒载体)给受试者施用,所述核酸包含抑制LINC01983表达的序列。递送试剂可以是亲脂试剂、聚阳离子、脂质体等。
在本发明中,术语“有效量”是指其用量足以治疗疾病,以适用于任何医学治疗的合理的利益/风险比率。组合物的有效剂量水平可以根据受试者的类型、疾病的严重程度、受试者的年龄和性别、药物活性、对药物的敏感性、给药时间,给药途径、排泄率、治疗时间、与组合物联用的药物和医疗领域中其他已知因素来确定。本发明的药物组合物可单独使用或与其它治疗剂组合施用,并且可以与常规的治疗剂依次或同时给药。可采用一种或多种剂型中施用组合物。考虑所有上述因素,在能够表现出最大效果而不引起副作用的最小量下施用组合物至关重要,该最小量可由本领域技术人员容易地确定。
本发明的药物组合物还可与其他治疗肺腺癌的药物联用,其他治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药,甚至在同一组合物中同时给药。
统计学分析
在本发明的具体实施例中,实验都是按照至少重复3次来完成的,结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS18.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
下面结合具体的实施例进一步说明本发明,本发明的实施例仅用于解释本发明,并不意味着限制本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1筛选与肺腺癌相关的基因标志物
1、样品收集
分别收集4例肺腺癌组织及配对的癌旁组织(距肿块边缘≥5cm)的手术标本,全部患者在手术前均未接收化疗、放疗、靶向治疗、肿瘤免疫治疗及其他治疗,无其他肿瘤性疾病、自身免疫疾病和严重的慢性疾病,所有的患者均已知情同意,并通过组织伦理委员会的同意。
2、RNA样品的制备
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒进行组织RNA的提取,具体操作按说明书进行。
3、总RNA定量与纯度分析
将上述提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳,利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5μg,浓度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8~2.2之间。
4、构建cDNA文库
1)去除rRNA
使用Ribo-Zero试剂盒除去总RNA中的核糖体RNA;
2)片段化RNA
对完整的RNA序列,利用金属离子进行随机打断,将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
3)反转合成cDNA
利用Illumina的TruseqTM RNA sample Prep Kit进行cDNA文库的构建,在逆转录酶的作用下,利用随机引物,以lncRNA为模板反转合成一链cDNA,进行二链合成时,dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP,使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
4)连接adaptor
加入End Repair Mix将双链cDNA的粘性末端补成平末端,随后在3’末端加上一个A碱基,用于连接Y字形的接头。
5)UNG酶消化cDNA二链
用UNG酶将cDNA第二链消化,从而使文库中仅包含cDNA第一链。
5、测序
使用Illumina X-Ten测序平台,进行2*150bp测序。
6、高通量转录组测序数据分析
删除不易检测到的lncRNA(即该lncRNA的read count值在case中为0的样本数大于总的case样本量的20%或该lncRNA的read count值在normal中为0的样本数大于总的normal样本量的20%)后,使用R-3.3.3工具的DESeq2进行差异表达分析,差异表达lncRNA筛选标准:FDR<0.05,abs(log2FC)>2。
7、结果
结果显示,与癌旁组织相比,LINC01983在肺腺癌组织中的表达水平显著上调。
实施例2 QPCR测序验证LINC01983基因的差异表达
1、对LINC01983基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式选择肺腺癌癌旁组织和肺腺癌组织各35例。
2、RNA提取
利用QIAGEN的组织RNA提取试剂盒提取RNA样品,具体操作详见说明书。
3、QPCR
1)逆转录反应
采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号:KR106)进行lncRNA反转录,首先去除基因组DNA反应,在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl,总RNA 1μg,加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl,水浴锅中42℃加热3min.
将10×Fast RT Bμffer 2.0μl,RT Enzyme Mix 1.0μl,FQ-RT Primer Mix 2.0μl,RNase Free ddH2O 5.0μl,混合后加入上述试管中一起混合共20μl,水浴锅中42℃加热15min,95℃加热3min。
2)引物设计
根据Genebank中LINC01983基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物,由博迈德生物公司合成。具体引物序列如下:
LINC01983基因:
正向引物为5’-GTAATCGTTACGCACCAG-3’(SEQ ID NO.1);
反向引物为5’-CCATCACATCAGCACAAC-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因:
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3);
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
3)QPCR扩增检验
用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号:FP205),进行扩增,实验操作按产品说明书进行。
采用20μl反应体系:2×SuperReal PreMix Plus 10μl,正反向引物(10μM)各0.6μl,5×ROX Reference Dye△2μl,DNA模板2μl,灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管,所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
扩增程序为:95°15min,(95℃10s,55℃30s,72℃32s)×40个循环,95℃15s,60℃60s,95℃15s)。
4)cDNA模板浓度的筛选
将各样本cDNA混合后,以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释,稀释后样品各取2μl作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增,同时在60-95℃进行融解曲线分析,根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。
根据溶解曲线,可以看出,当cDNA的进行10倍稀释时,PCR的扩增效率较高,溶解曲线单峰比较好。
5)样品RealTime PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板,分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析,通过融解曲线分析和电泳确定目的条带,2-ΔΔCT法进行相对定量。
4、结果
QPCR结果如图1所示,与癌旁组织相比,LINC01983在肺腺癌组织中表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05);阳性检出率=上调表达例数/总检测例数×100%=33/35=94.2%,提示LINC01983在肺腺癌的诊断中具有较高的应用价值。
实施例3 LINC01983基因的沉默
1、细胞培养
人肺腺癌细胞株A549,以含10%胎牛血清和1%P/S的RPMI1640培养基在37℃、5%CO2、相对湿度为90%的培养箱中培养。2-3天换液1次,使用0.25%含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
2、siRNA的设计
针对LINC01983基因的序列设计siRNA,设计的siRNA序列如下所示:
阴性对照siRNA-NC的序列:
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.5),
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.6);
siRNA1:
正义链:5’-ACUCAAAUUGGAAAGCUUGAC-3’(SEQ ID NO.7),
反义链:5’-CAAGCUUUCCAAUUUGAGUCU-3’(SEQ ID NO.8);
siRNA2:
正义链:5’-UUUUUUGCUUCAUUUGCAGGU-3’(SEQ ID NO.9),
反义链:5’-CUGCAAAUGAAGCAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.10);
siRNA3:
正义链为5’-UUUUUUUUGCUUCAUUUGCAG-3’(SEQ ID NO.11),
反义链为5’-GCAAAUGAAGCAAAAAAAAAA-3’(SEQ ID NO.12)
3、转染
将培养瓶中的细胞用胰酶进行消化并接种在6孔板中,保证细胞数为2-8×105个/孔,加入细胞培养基。过夜,第二天观察细胞密度,细胞密度为70%以上可进行转染。
将实验分为三组:对照组(A549)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA1-3),其中阴性对照组siRNA-NC与LINC01983基因的序列无同源性,浓度为20nM/孔,同时分别进行转染。使用Invitrogen公司的Lipofectamine 3000试剂盒进行转染,具体转染方法按照说明书的指示进行。
4、QPCR检测LINC01983基因的转录水平
1)细胞总RNA的提取
使用QIAGEN细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的总RNA,具体步骤详见说明书。
2)逆转录步骤同实施例2。
3)QPCR扩增步骤同实施例2。
5、结果
结果如图2显示,与A549和siRNA-NC组相比,实验组(siRNA1~3)能降低LINC01983的水平,其中siRNA1的效果最为显著,因此选择siRNA1进行后续实验。
实施例4 LINC01983对肺腺癌细胞增殖的影响
1、肺腺癌细胞A549接种于6孔板中培养,待细胞密度达到85%-90%,使用脂质体2000转染siRNA1。无血清培养基培养4-6h后更换新培养基。
2、转染siRNA1后培养24h,将干扰组细胞和对照组细胞消化,在96孔板中接种转染后的A549细胞悬液以及各对照组100μl(1×104个/孔),在转染12h、24h、48h、72h后进行检测。
3、向每孔加入10μl CCK8溶液。
4、将培养板放在培养箱内培养1-4h。
5、使用酶标仪测定在450nm处的吸光度,以吸光度值为纵轴、时间为横轴,绘制细胞生长活性曲线。
6、结果
结果如图3所示,与对照组相比,随着生长时间的延长,siRNA1转染组细胞活性明显降低,差异具有显著统计学意义(P<0.05),提示LINC01983与肺腺癌细胞的增殖相关,可将其作为可能的潜在靶标应用与肺腺癌的治疗中。
实施例5划痕实验检测转染siRNA后肺腺癌细胞增殖、迁移能力
1、以50%的密度将不同组别的转染A549细胞接种于六孔板中进行培养,待细胞密度达到60%~70%,用10μl移液器枪头对准孔板保持垂直角度进行细胞划痕,尽可能使每个划痕的宽度相同。
2、去除细胞原培养液,用磷酸盐缓冲液对孔板进行冲洗,将由于细胞划痕形成的碎片洗去,加入无血清培养基,进行拍照,留取数据。
3、培养板置于细胞培养箱进行培养,培养24h后将培养板取出,再次拍照、记录数据,计算划痕愈合率。
4、结果
结果如图4所示,随着培养时间的增长,siRNA1组的划痕愈合率明显低于siRNA-NC组和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。此结果表明,抑制LINC01983的表达可以降低肺腺癌细胞的迁移,提示可将LINC01983作为可能的靶标应用于肺腺癌的转移的治疗。
实施例6 Matrigel侵袭实验
1、Transwell小室制备
无菌条件下Matrigel冰浴融化,用PBS进行20倍稀释,以50μl/孔的体积铺在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h,待Matrigel胶聚合成凝胶后取出,轻轻吸出上层析出液。每孔中加入50μl的含BSA的无血清培养液对基底膜进行水化处理,37℃放置30min。
2、细胞接种
胰酶消化不同组别的A549细胞,调整细胞的密度至5×l05个/ml,取细胞悬液200μ1加入到Transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含FBS的培养基。把细胞放入细胞培养箱中培养24h。
3、染色
细胞在培养结束后使用DAPI染色。把小室细胞先用PBS漂洗2遍,放入DAPI工作液中室温染色5-20min。用PBS漂洗2遍,放入荧光显微镜下观察并计数。
4、结果
结果如图5所示,在肺腺癌细胞转染干扰RNA之后,与对照组相比,实验组的侵袭能力均有明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05),结果说明LINC01983表达影响肺腺癌细胞的侵袭,提示可将LINC01983应用于肺腺癌浸润的治疗中。
能够促进肺腺癌的侵袭。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> lncRNA在肺腺癌诊疗中的应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtaatcgtta cgcaccag 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccatcacatc agcacaac 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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uucuccgaac gugucacgu 19
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<212> RNA
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<400> 6
acgugacacg uucggagaa 19
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<212> RNA
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acucaaauug gaaagcuuga c 21
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<212> RNA
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<400> 8
caagcuuucc aauuugaguc u 21
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<212> RNA
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uuuuuugcuu cauuugcagg u 21
<210> 10
<211> 21
<212> RNA
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cugcaaauga agcaaaaaaa a 21
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<212> RNA
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gcaaaugaag caaaaaaaaa a 21