CN111826442B - 预防肺癌靶标plekhn1及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及PLEKHN1作为预防和诊断由砷化物诱发的肺癌的新靶标及其应用。具体而言，本发明公开了PLEKHN1表达抑制剂在制备预防/治疗肺癌药物中的应用；敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺正常细胞的恶变作用。

Description

预防肺癌靶标PLEKHN1及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及PLEKHN1作为预防和诊断由砷化物诱发的肺癌的新靶标及其应用。
背景技术
据2018年全球癌症分析数据显示肺癌的发病率占所有癌症的11.6％，而死亡率占所有癌症的18.4％。其发病率和死亡率均位列各大癌症的首位。而依据2015年中国癌症发病率数据显示肺癌发病率达到了20.03％，死亡率更是高达26.99％。因此肺癌的预防和治疗对中国乃至世界都是刻不容缓的。砷是一种非金属元素，广泛存在于自然界当中，大量被应用到人们的生产和生活当中，包括农药、杀虫剂、除草剂和合金等。然而砷及其化合物就像一把双刃剑，在我们受益的同时，其带来的危害也不容小觑。砷化物在2017年被世界卫生组织国际癌症研究机构列为一类致癌物，有大量研究报道其能诱发多种癌症，包括人类的头号杀手--肺癌。因砷化物既是重要的环境致肺癌化合物，又是重要的实验室诱导肺癌的模式化合物，因此研究其致癌机制对于砷化物的生物学效应(即砷化物诱导肺癌)及肺癌发生的普遍机制可能有着同等重要的作用，然而砷化物诱发肺癌的具体作用机制尚不完全明确，这无疑为我们预防肺癌尤其是砷化物诱发的肺癌增加了莫大的阻力。机制研究的持续进展与突破，有可能为寻找肺癌的预防措施提供理论支持，因此深入研究砷诱发肺癌的相关分子机制迫在眉睫。
PLEKHN1(Pleckstrin Homology Domain Containing N1)又名CLPABP是一种定位于1号染色体，编码623个氨基酸的心磷脂和磷脂酸结合蛋白。之前有研究发现PLEKHN1可以通过调节瘦素来控制老年雄性小鼠的体重。还有研究报道在结直肠癌细胞中敲除PLEKHN1后，可以抑制结直肠癌细胞的凋亡，说明PLEKHN1在结直肠癌中有抑制肿瘤进展的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供PLEKHN1作为预防和诊断由砷化物诱发的肺癌的新靶标及其应用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种PLEKHN1表达抑制剂在制备预防/诊断肺癌药物中的应用。
作为本发明应用的改进：敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺正常细胞的恶变作用。
作为本发明应用的进一步改进：PLEKHN1表达抑制剂为敲低PLEKHN1质粒。
本发明还同时提供了一种预防肺癌的组合物：包括PLEKHN1表达抑制剂、药剂学上能够接受的载体；
所述PLEKHN1表达抑制剂为敲低PLEKHN1质粒。
本发明还同时提供了一种检测PLEKHN1表达的试剂：包含基于荧光定量PCR定量检测方法的试剂，荧光定量PCR定量检测方法的试剂包含一对特异性引物：Forward:5’-GCCGCCAACAAGCTCTTCCACT-3’Reverse:5’-GCTGGACCTTGGCGTAATGCAC-3’；或包含检测PLEKHN1蛋白表达的抗体。
本发明前期实验发现在肺正常细胞中PLEKHN1可以被砷化物诱发增加，且在临床肺癌组织中PLEKHN1的mRNA和蛋白表达水平显著高于其正常组织。依据这个现象，进行了相关探究。探究初步表明PLEKHN1在砷化物诱发肺细胞恶变的过程中发挥了一定的作用，这为理解砷化物如何诱发肺癌提供了一定的思路。
本发明所采取的技术方案如下：
(1)通过细胞短期染毒实验和Western Blot实验对肺正常细胞分别使用合适浓度梯度的砷化物，发现在一定浓度范围内PLEKHN1特异性的随砷化物浓度增加而表达上调。然后固定砷化物浓度发现PLEKHN1表达量随时间增加而上调。
(2)通过生物信息学分析TCGA数据库(Cancer Genome Atlas)中的肺癌数据，发现PLEKHN1在肺癌组织中表达上调，进一步采用荧光定量PCR技术和免疫组织化学染色技术检测到在临床配对肺癌组织中PLEKHN1表达也显著上调。这表明可通过检测PLEKHN1表达来诊断肺癌。
(3)通过细胞长期染毒实验和软琼脂克隆集落形成实验发现，敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺细胞恶变作用，过表达PLEKHN1后可显著促进砷化物诱发的肺细胞恶变作用。这表明PLEKHN1表达抑制剂可以预防由砷化物诱发的肺癌。
(4)通过裸鼠皮下成瘤实验进一步在体内验证，敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺细胞恶变作用。这表明PLEKHN1表达抑制剂可以预防由砷化物诱发的肺癌。
本发明具有如下技术优势：
本发明以肺正常细胞Beas-2B细胞为模型，敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺细胞恶变作用；过表达PLEKHN1后可显著促进砷化物诱发的肺细胞恶变作用。这表明，可以通过敲低PLEKHN1来预防砷化物诱发的肺癌。
利用生物信息学分析TCGA数据库、实时荧光定量PCR技术和免疫组织化学染色技术等方法检测临床肺癌组织中PLEKHN1表达均呈显著上调趋势。因此，通过检测PLEKHN1的表达有助于对肺癌的诊断；即，通过检测PLEKHN1的表达可以辅助诊断肺癌。综上所述，PLEKHN1有望作为预防和诊断肺癌的新靶标。
虽然现有研究报道在结直肠癌细胞中敲除PLEKHN1后，可以抑制结直肠癌细胞的凋亡，但是这与本发明PLEKHN1中在肺癌发生过程中的作用截然相反，本发明是敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺正常细胞的恶变作用。目前临床上尚无公认的药物靶点可以预防肺癌或者砷化物诱发的肺癌，本发明的PLEKHN1针对肺癌至少是砷化物诱发的肺癌具有潜在的预防作用；因此，PLEKHN1有望在临床上进一步发挥其预防肺癌的作用。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明:
图1表明砷化物处理正常肺上皮细胞Beas-2B后PLEKHN1表达的检测；
图1中：
A为利用蛋白质免疫印迹实验，检测PLEKHN1在不同浓度砷化物对Beas-2B细胞急性处理后的蛋白表达量；
B为利用蛋白质免疫印迹实验，检测PLEKHN1在砷化物对Beas-2B细胞处理不同时间的蛋白表达量；
C为通过荧光定量PCR技术，检测PLEKHN1在急性砷化物处理不同时间后的mRNA相对表达量；
根据图1，可得知：砷化物暴露导致肺支气管上皮细胞中PLEKHN1(蛋白及mRNA)表达的上调。
图2为临床肺癌组织中PLEKHN1表达的检测图；
图2中：
A为通过公共数据库TCGA，分析肺癌组织中PLEKHN1的mRNA表达水平；
B为通过荧光定量PCR技术，检测临床肺癌组织样本中PLEKHN1的mRNA相对表达量；
C为通过免疫组化技术，检测在临床肺癌组织样本中PLEKHN1的蛋白表达水平；
根据图2，可得知：PLEKHN1在临床肺癌组织中的mRNA和蛋白表达水平总体呈上调趋势。
图3为探究PLEKHN1是否影响砷化物长期诱导的Beas-2B细胞恶性转化(克隆集落的形成)；
A为通过蛋白免疫印迹技术检测构建的敲低PLEKHN1的Beas-2B稳转细胞系，对照组：nonsense，敲低组：shPLEKHN1#1、shPLEKHN1#2、shPLEKHN1#3、shPLEKHN1#4，其中#1和#2为有效；
B为通过蛋白免疫印迹技术检测构建的过表达PLEKHN1的Beas-2B稳转细胞系，对照组：vector，PLEKHN1过表达组：PLEKHN1；
C为通过软琼脂克隆集落形成实验评估细胞的恶变水平，检测砷化物(0.5μM)同样处理60代后的Beas-2B(GFP-PLEKHN1)和Beas-2B(vector)稳转细胞系的恶变情况；
D为通过软琼脂克隆集落形成实验，检测砷化物(0.5μM)同样处理60代的Beas-2B(shPLEKHN1)及对照Beas-2B(nonsense)稳转细胞系的恶变情况；
根据图3，可得知：敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺细胞恶变作用，过表达PLEKHN1后则可显著促进砷化物诱发的肺细胞恶变作用。
图4为通过裸鼠皮下成瘤实验进一步验证PLEKHN1能显著促进砷化物长期诱导的肺正常细胞的恶性转化；
A为通过将24只裸鼠随机分成4组，分别注射砷化物(0.5μM)长期诱导72代的Beas-2B(Nonsense)、Beas-2B(shPLEKHN1#1)、Beas-2B(shPLEKHN1#2)和砷未处理的72代Beas-2B(Nonsense)细胞至裸鼠皮下；
B为23天后，通过拍照记录取下裸鼠的肿瘤；
C为通过作图展示肿瘤的重量。(*)表示差异具有统计学意义(p<0.05)；
根据图4，可得知：敲低PLEKHN1会显著抑制砷化物长期诱导的肺正常细胞的恶性转化。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1、砷化物处理正常肺上皮细胞，以浓度和时间依赖性上调PLEKHN1的蛋白表达水平
1细胞染毒处理
(1)细胞短期砷染毒处理：
a)细胞种板六孔板多个孔，每孔20万个Beas-2B细胞，采用含10％FBS的DMEM培养基，于37℃恒温CO2培养箱中进行培养；24h后细胞密度达到70％左右。
b)种板24h后，开始用含有0.1％FBS的DMEM培养基进行换液，按照上述同样的培养条件处理12h。
c)12h后，分别加浓度为对照(0)、0.5、1和2μM的砷化物进行染毒处理12h(图1A)；固定砷化物浓度为1μM，处理对照组(0)、6、12和24h(图1B)。结果如图1的A和B所述。
d)收RNA和相应的蛋白。
(2)mRNA的提取：
a)弃去步骤(1)c)所得物的细胞培养基，1ml PBS清洗并弃去，重复一次PBS清洗步骤，取1ml的Trizol试剂吹打裂解细胞，转移至1.5ml去酶EP管中。
b)将200μl氯仿(三氯甲烷)加入至1.5ml EP管中，剧烈震荡1min后冰上放置3min。
c)4℃，12000g，离心15min。
d)吸取上清转移至新的1.5ml去酶EP管中，并测量相应体积。
e)将等体积的异丙醇加入到去酶EP管中，上下混匀后冰上静置15min。
f)4℃，12000g，离心15min，弃去上清。
g)将1ml 75％乙醇加入到去酶EP管中，洗涤沉淀。
h)4℃，10000g，离心10min，弃去上清，空离3min。
i)超净工作台内开盖吹风15min挥发乙醇。
j)用20μl无RNA酶水4℃溶解10min，并充分混匀。
k)用NanoDrop分光光度计测RNA纯度和浓度。
(3)mRNA的逆转录：
a)SuperScript IVTM First-Strand Synthesis体系：
Figure BDA0002552395420000051
将上述体系充分混匀后点离，放入PCR仪中，65℃，5min，取出置于冰上5min，加入配制的RT反应体系。
b)RT反应体系：
Figure BDA0002552395420000061
两者充分混匀点离后，放入PCR仪中，反应条件为：55℃10min，80℃10min，获得cDNA可用于后续实验，并-80℃保存。
2荧光定量PCR
荧光定量PCR体系：
Figure BDA0002552395420000062
将上述体系充分混匀后，加入至384孔板中，GAPDH作为内参，3个平行孔。荧光定量PCR仪中进行检测。
主要qPCR引物：
Figure BDA0002552395420000063
qPCR反应体系如下：
Figure BDA0002552395420000071
每个实验组别所得的结果为相对于对照组的倍数；据此，可得知：砷化物暴露导致肺正常细胞中PLEKHN1基因的mRNA水平表达上调(图1C)；肺癌组织相对于肺正常组织中PLEKHN1基因的mRNA水平表达呈上调趋势(图2B)。结果如图1的C和图2的B所述。
3蛋白质免疫印迹技术
(1)蛋白处理：
a)弃去步骤(1)c)所得物的大皿中的培养基，用预冷的PBS清洗并弃去，重复使用PBS清洗一次。
b)将大皿放于冰盒上，根据细胞密度加入相应的细胞裂解液BB，并使其充分接触细胞表面，冰上裂解1min后，使用细胞刮将蛋白彻底刮取，并收集到1.5ml去酶EP管中(做好标记)。
c)100℃水浴加热5min，中间开盖一次，后放置于冰上冷却。
d)进行超声处理振幅25，1s/次，间隔1s，连续40次(全程在冰上操作)，超声结束需要到达细胞液不黏稠。超声结束后充分混匀，使用NanoDrop 2000分光光度计进行测量蛋白样本的浓度。每个蛋白样本测两次后无明显误差时，取两者平均值，再用移液器量取蛋白样本的体积，将同一组的蛋白样本调整到尽可能大的相同浓度，根据公式计算出所需的BB以及6X Sample Buffer。将蛋白样本充分混匀后，100℃加热5min，4℃备用或储存于-20℃冰箱。
(2)配胶：
a)根据蛋白的分子量大小选择不同浓度的分离胶进行配制，一般检测30KD以下的蛋白，就用12％的分离胶，80KD以上的蛋白，就用8％的分离胶，中等大小的蛋白就用10％的分离胶。
b)先检查胶板的密闭性，固定好胶板后，开始配分离胶。配完分离胶后，用甲醇缓慢左右移动进行液封。
c)室温凝固1h后，将甲醇弃去，用滤纸吸去多余甲醇。按照配方配制5％的浓缩胶，插入梳子时应避免气泡产生，0.5min后再向梳子周围添一些浓缩胶避免胶下漏。待室温凝固40min至1h后，可及时使用或可储存于4℃冰箱不超过1周时间。
(3)SDS-PAGE电泳(SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)：
a)准备好电泳槽、盖子、电源、Running Buffer等，拔出梳子，开始上样。跑浓缩胶电压为150V，条带完全进入分离胶后将电压调整为125V。等溴酚蓝指示剂跑到胶板底部时，可以将电泳停止。
b)转膜：转膜前新配好的转膜缓冲液需在冰水混合物中预冷。将转膜的电泳模块、海绵和滤纸等准备好，海绵、滤纸浸在转膜液中，并排空气泡。将PVDF膜放在纯甲醇中活化15s以上，后在转膜缓冲液中清洗几次。从阴极至阳极的转膜顺序依次为：海绵-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵，注意不能有气泡，转膜电压为25V，时间4.5h。
c)封闭：转膜时间结束后，小心卸下膜并在背面做好标记，放入1X TBS中，在摇床上洗膜3次5min。然后加入脱脂牛奶(5％)在摇床上，室温封闭1h。封闭结束后倒掉牛奶，换3次1X TBS在摇床上洗膜5min。
d)孵育一抗：甩干TBS后，加入1:500-1:1000稀释比的PLEKHN1、GAPDH或α-Tubulin抗体，4℃孵育12-16h。
e)二抗孵育：回收一抗，换3次1X TBS在摇床上洗膜5min。甩干TBS后，加入稀释的对应牛奶二抗(比例为1:1000-1:2000)，4℃孵育2.5-3h。孵育结束后，再回收二抗，换3次1XTBS在摇床上洗膜15min。再换3次1X TBST在摇床上洗膜45min。最后使用1X TBS摇床上清洗10min。
f)显影：稀释ECF显影液(500μl ECF+6ml 1X TBS)，根据不同蛋白检测的灵敏度差异，将PVDF膜完全浸入显影液中，左右摇晃5s至1min不等，放置于塑料薄膜中，排空气泡。用Typhoon 7000(GE)扫膜仪，进行显影。扫膜结果保存于命名好的文件夹中，并用软件进行分析保存于PPT中。结果如图1的A、B和图3的A、B所述。
实施例2、PLEKHN1在临床肺癌组织中的表达水平总体呈上调趋势。
1、TCGA数据库数据分析
下载TCGA数据库(https://tcga-data.nci.nih.gov/)中的肺癌测序数据和临床数据。使用R包edgeR对数据进行预处理，将raw count标化为log-CPM值，进行线性建模，并且使用由voom函数计算的精度权重来调节平均方差关系。使用limma包提供的线性回归和经验贝叶斯方法，对mRNA数据中Tumor VS Normal进行差异表达分析。经过统计计算得到相应的P.Value值，使用Benjamini&Hochberg方法进行多重检验校正，得到校正后P值即adj.P.Value。差异表达阈值均为adj.P.Value<0.05且|log2FC|>2。结果如图2的A所述。本发明率先利用生物信息技术分析了TCGA数据库，分析出PLEKHN1在肺癌组织中呈表达上调趋势，并利用实验方法结合收集到的50对临床肺癌配对标本进行了进一步的确认。最后通过功能实验首次发现PLEKHN1能促进砷化物对正常肺细胞的恶性转化，其PLEKHN1抑制剂可以有效抑制砷化物对肺正常细胞的恶性转化。
2、临床组织免疫组化
(1)石蜡包埋切片：
a)组织收集：收取肺癌组织以及其相应癌旁组织。此操作严格遵守温州医科大学医学伦理委员会相关规定。
b)组织固定：4％PFA固定肺癌组织，4℃固定24-48h。
c)组织脱水：将固定好的肺癌组织流水冲洗，将PFA清洗干净。然后将标本依次放入30％乙醇30min，50％乙醇30min，70％乙醇1h，80％乙醇1h，85％乙醇1h，95％乙醇1h，95％乙醇1h，100％乙醇Ⅰ1h，100％乙醇Ⅱ1h，中进行脱水。
d)组织透明：组织脱水后，将组织放入1/2无水乙醇和1/2二甲苯混合的溶液中5-10min左右，然后将组织放入100％二甲苯Ⅰ液中10-15min，100％二甲苯Ⅱ液中10-15min。
e)组织浸蜡：组织经过脱水透明之后，将组织转移进预先熔化的软蜡中，软蜡Ⅰ1h，软蜡Ⅱ1h，使软蜡充分浸入组织当中，并能充分取代透明剂。
f)组织包埋：组织经过脱水透明浸蜡之后，将包埋盒和组织一起放入已融化的硬蜡中，浸泡待石蜡浸入组织内达到饱和程度时，充分冷却，凝固成为蜡块。
g)组织切片：组织周围保留2-3mm的石蜡，石蜡的切面需平整且对称。将蜡块与切片刀安装到石蜡切片机上。将组织切成厚度均匀为5μm的切片。将切片用镊子平整地放入冷水中，将其展开。使用防脱载玻片平稳的捞出薄片，放入42℃的热水中，薄片平整铺开后即可捞起。将切片放于4℃冰箱保存或进行烤片。
(2)免疫组织化学染色：
a)组织包埋：组织经过脱水透明浸蜡之后，将包埋盒和组织一起放入已融化的硬蜡中，浸泡待石蜡浸入组织内达到饱和程度时，充分冷却，凝固为蜡块。
b)组织脱蜡：将从65℃烘箱中取出的切片，放入二甲苯Ⅰ液10min，二甲苯Ⅱ液10min，1/2乙醇+1/2二甲苯2min，进行脱蜡。
c)组织复水：将切片放入不同梯度浓度的乙醇中进行复水，依次为：100％乙醇Ⅱ，100％乙醇Ⅰ，95％乙醇，90％乙醇，80％乙醇，70％乙醇，50％乙醇，去离子水，时间均为1-2min。
d)抗原修复：将玻片插入10mM的柠檬酸钠中，微波炉加热7min/次，共4次。后放置于室温冷却30-45min。
e)圈画组织：将抗原修复液甩去，使用1X TBS清洗3次，每次5min。甩去水渍后使用组化笔圈出组织。
f)H2O2封闭：将3％H2O2滴加于组织上，室温避光孵育30min，后将3％H2O2甩去，使用1X TBS清洗3次，每次5min。
g)5％BSA封闭：将5％BSA滴加于组织上，室温孵育30min。
h)孵育一抗：将5％BSA甩去，不用清洗，将免疫组化的PLEKHN1抗体滴加覆盖于组织上，4℃孵育过夜。
i)回收一抗：将湿盒室温复温30min后，回收PLEKHN1抗体，并使用1X TBS清洗3次，每次5min。
j)孵育二抗：一抗清洗完后，将对应免疫组化的二抗滴加于组织上，37℃孵育30min。
k)孵育SABC：使用1X TBS清洗组织3次，每次5min。然后将SABC滴加于组织上，37℃孵育30min。
l)DAB显色：使用1X TBS清洗组织3次，每次5min。然后将DAB滴加于组织上，镜下观察，待组织变黄时，ddH2O终止显色。
m)苏木素染色：将苏木素滴加于组织上，染色1-2min。
n)返蓝：自来水冲洗5-10min，期间换水3次。
o)脱色：50％乙醇，70％乙醇，80％乙醇，90％乙醇，95％乙醇，100％乙醇Ⅰ，100％乙醇Ⅱ，时间均为90s。
p)透明：1/2乙醇+1/2二甲苯，二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，各2-5min。
q)封片：通风橱晾干30min后，使用适量的中性树胶进行封片，需防止气泡。
r)封片后晾干，镜下拍照并进行分析。结果如图2的C和D所述。
实施例3、PLEKHN1会显著促进砷化物长期诱导的Beas-2B细胞克隆集落形成。
1细胞转染相关步骤(1)脂质体转染法：
a)Beas-2B细胞种板24h，待细胞长到80％，提前1h换1ml全培。
b)将1μg目的DNA(GFP-PLEKHN1质粒或PEGFP-C1质粒，均购买自上海桑尼生物科技有限公司)加入50μl无血清含高葡萄糖的DMEM中充分混匀。
c)取3μl PolyJetTM reagent加入50μl无血清含高葡萄糖的DMEM，用枪轻轻混匀3-4下。
d)立即将稀释的PolyJetTM试剂加入稀释的DNA溶液中，轻轻吸上下混匀3-4次。(顺序只能PolyJetTM加DNA)
e)室温下孵育10-15min，不能超过20min。
f)将100μl PolyJetTM和DNA混合物逐滴加入6孔板的培养基中，边加边轻轻旋转混匀。
g)培养12-18h换新的2ml全培，若细胞比较敏感6h后可以换新的全培。转染24-48h，检测转染效率，如带GFP标签可以在荧光显微镜下看荧光。
当转染效率满足大于30％时，则进行后续的细胞药物筛选；反之，则重新转染。
(2)慢病毒转染法：
a)293T细胞种板24h，待细胞长到80％，提前1h换1ml全培
b)将1μg目的DNA(shPLEKHN1#1-4质粒或PGIPZ质粒，均购买自Open Biosystems公司)0.6μg PMD2.G和0.6μg PSPAX.2质粒加入50μl无血清含高葡萄糖的DMEM充分混匀。
c)取3μl PolyJetTM reagent加入50μl无血清含高葡萄糖的DMEM，用枪轻轻混匀3-4下。
d)立即将稀释的PolyJetTM试剂加入稀释的DNA溶液中，轻轻吸上下混匀3-4次。(只能PolyJetTM加DNA)
e)室温下孵育10-15min，不能超过20min。
f)将100μl PolyJetTM和DNA混合物逐滴加入6孔板的培养基中，边加边轻轻旋转混匀。
g)培养16h换新的2.5ml DMEM完全培养基，再继续培养36h。
h)准备收病毒的前24h，目的细胞开始种板，使种板24h后密度达到80％左右的种板密度。
i)种板24h的目的细胞提前1h换1ml完全培养基。293T细胞换液培养36h后，收上清于15ml离心管中，2500rpm离心30min，用注射器取上清用0.45μm除菌滤器直接过滤1ml病毒上清至提前1h换液的目的细胞中，并充分混匀后继续培养，剩余病毒上清约1ml收集于冻存管中，冻于-80℃冰箱。
j)感染24h左右，检测转染效率，如带GFP标签可以在荧光显微镜下看荧光。
当转染效率满足大于30％时，则进行后续的药物筛选；反之，则重新转染。
2药物筛选细胞株相关步骤(1)摸索有效药物作用浓度：
a)Beas-2B细胞种板24孔板10个孔，培养条件为含有5％CO2的恒温培养箱；使24h后密度达到70％-80％。
b)24h时加梯度浓度(具体为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0
μg/ml的嘌呤霉素或者具体为0、10、20、50、100、200、500、1000、1500、2000
μg/mlG418)等，放入培养箱培养。培养条件同上。
c)分别24h，48h，72h观察细胞状态，当72h细胞全死的最低药物浓度，作为药物致死浓度。
(2)药物筛选细胞株：
a)细胞转染上带不同抗性的质粒后，可以加对应抗性药物进行筛选。药物筛选起始浓度一般可以是该空细胞的致死浓度。
b)加药物筛选时，一般会采用相同密度的空细胞作为对照组一起加药。
c)细胞转染质粒24h后，开始换液加药，若细胞长满，一般以1:2的量传至两个孔里，细胞少的那个孔，维持低浓度药物浓度留种，细胞多的孔提高药物浓度继续筛选。
d)当高药物浓度细胞长满，则舍去低药物浓度孔，参照上述传代方法继续传代筛选。当对照空细胞全部死亡，或者带GFP标签的细胞，在荧光显微镜下所有细胞都带荧光，则证明细胞筛选成功。结果如图3的A、B所述，敲低PLEKHN1和过表达PLEKHN1的细胞株均构建成功。
3细胞砷染毒相关步骤(1)细胞长期砷染毒处理：
a)上述2药物筛选后鉴定成功的Beas-2B(Nonsense，shPLEKHN1#1，shPLEKHN1#2)，Beas-2B(Vector，GFP-PLEKHN1)每孔10万个细胞进行种板，砷化物0或0.5μM染毒处理。
b)细胞长满就传代，每孔10万个细胞，多余细胞丢弃，维持对应孔的砷化物浓度不变。
c)上述细胞系维持砷处理并持续数月传代(传代培养的条件为含5％的CO2的37℃恒温培养箱)，期间会将细胞冻存几次留种。结果如图3的C、D和图4的A所述，长期砷化物(0或0.5μM)诱导的Beas-2B(Nonsense，shPLEKHN1#1，shPLEKHN1#2)和Beas-2B(Vector，GFP-PLEKHN1)细胞，以及Beas-2B(Nonsense)、Beas-2B(shPLEKHN1#1)、Beas-2B(shPLEKHN1#2)和砷未处理的的Beas-2B(Nonsense)细胞诱导成功。
4软琼脂克隆集落形成实验
(1)铺下层胶：
a)将1.2ml的1.25％琼脂糖溶液与1.8ml的medium加入15ml离心管中，将其充分颠倒混匀后加入6孔板中，铺板时注意不能有气泡且防止胶出现凝固状态。
b)铺好后室温凝固4h。
(2)铺上层胶：
a)制备细胞悬液：将上述3长期砷化物(0或0.5μM)染毒的处于对数生长期的Beas-2B(Nonsense，shPLEKHN1#1，shPLEKHN1#2)和Beas-2B(Vector，GFP-PLEKHN1)细胞使用胰酶消化后，收集至EP管中离心1500rpm，5min。
b)离心结束后，弃掉上清，用1ml的PBS清洗细胞沉淀，重悬并混匀。再次离心1500rpm,5min。弃掉PBS。
c)使用新鲜的DMEM培养基重悬细胞沉淀。充分混合均匀。牛鲍计数板进行计数。取10μl的细胞悬液滴加至牛鲍计数板上，镜下计数。
d)将1×104细胞种于孔中，实验组与对照组一致。
e)将计好数的细胞悬液与736μl的medium充分混匀，后加入264μl 1.25％琼脂糖凝胶，充分混匀后取1ml加入6孔板中，铺板时注意不能有气泡且防止胶出现凝固状态。
f)铺好后室温凝固1-2h后，封口膜将六孔板密封并放入37℃5％CO2培养箱中继续进行培养。
g)观察细胞增殖的情况以及实验组与对照组的差异，后采用显微镜5倍镜拍照并计数含32个细胞以上的克隆，计算细胞集落数形成率并分析结果。结果如图3的C和D所述。据此，可获得以下总结性结论：PLEKHN1会显著促进砷化物长期诱导的Beas-2B细胞克隆集落形成。
实施例4、裸鼠皮下成瘤实验进一步体内验证PLEKHN1能显著促进砷化物长期诱导的肺正常细胞的恶性转化。
裸鼠皮下成瘤实验
a)实验动物通过温州医科大学实验动物中心购买，均为3-4周龄的BALB/C-nu雌性裸鼠，所有动物实验方案均提前通过温州医科大学实验动物伦理委员会的批准，并严格按照方案实行。
b)将24只裸鼠随机分成4组，每组6只，分别注射砷化物(0.5μM)长期诱导72代的Beas-2B(Nonsense)、Beas-2B(shPLEKHN1#1)、Beas-2B(shPLEKHN1#2)和砷未处理的72代Beas-2B(Nonsense)细胞，上述细胞来自于上述实施例3的细胞砷染毒相关步骤中的细胞长期砷染毒处理。每只裸鼠皮下注射800万个相应细胞，构建裸鼠皮下成瘤模型。
c)23天后观察裸鼠背部肿瘤大小，并拍照记录，对取下的肿瘤进行拍照并称重记录。
结果如图4的A、B、C所述，据此，可得知：PLEKHN1能显著促进砷化物长期诱导的肺正常细胞的恶性转化。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 温州医科大学
<120> 预防肺癌靶标PLEKHN1及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccgccaaca agctcttcca ct 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctggacctt ggcgtaatgc ac 22

Claims (3)

1. PLEKHN1表达抑制剂在制备预防肺癌药物中的应用，所述肺癌为砷化物诱发的肺癌，敲低PLEKHN1后可显著抑制砷化物诱发的肺正常细胞的恶变作用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是：所述PLEKHN1表达抑制剂为敲低PLEKHN1质粒。
3.一种预防肺癌的组合物，其特征是：包括PLEKHN1表达抑制剂、药剂学上能够接受的载体；
所述PLEKHN1表达抑制剂为敲低PLEKHN1质粒。
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